JP2004317469A

JP2004317469A - Very thin capillary for nano-spray ionization for mass spectrometric analysis

Info

Publication number: JP2004317469A
Application number: JP2003141177A
Authority: JP
Inventors: Naoyuki Yamada; 尚之山田; Yukihiro Sayama; 行宏佐山; Toshihiko Ando; 敏彦安東; Masayoshi Aoki; 正吉青木; Eiichiro Suzuki; 榮一郎鈴木; Kazuo Hirayama; 和雄平山
Original assignee: EISYO METAL CO Ltd; Ajinomoto Co Inc
Current assignee: EISYO METAL CO Ltd; Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2003-04-10
Filing date: 2003-04-10
Publication date: 2004-11-11

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a very thin capillary for nano-spray ionization including a very thin capillary for nano-electronic-spray ionization for mass spectrometric analysis excellent in physical strength, durability and ionization stability, capable of ionizing stably a sample at a low flow rate, and manufactured stably. <P>SOLUTION: In this very thin capillary for nano-spray ionization for the mass spectrometric analysis having structure wherein an inner tube having 50μm or less of inside diameter comprising a conductive material of metal or a conductive ceramic is coated with an outer tube comprising a material of metal or a conductive ceramic, the inner tube has a shape wherein a taper is provided in an outer wall of one end, and wherein a tip of the taper has 10μm or more of upper end face. In each of the very thin capillary wherein the taper is provided in the outer wall of the one end of the inner tube, and wherein the taper tip forms a tip with the taper and an inside diametric wall, and the very thin capillaries of three embodiments (not shown), a tip of the outer tube is fixed in a point where the taper provided in the outer wall of the inner tube reaches an inner tube diameter, or in a sample-flowing-directional upstream point compared with the point. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、質量分析法で用いられるエレクトロスプレーイオン化およびその他のスプレーイオン化（レーザースプレーイオン化、ソニックスプレーイオン化など）に使用できる細管に関し、強度に優れ、特に、低流量で安定に試料をイオン化することができるナノ・スプレーイオン化用極細管に関する。
【０００２】
【従来の技術】
【特許文献１】ＵＳＰａｔｅｎｔＮｏ．５，７８８，１６６
【非特許文献１】ＧｕｚｚｅｔｔａＡ．ｅｔａｌ；ＲａｐｉｄＣｏｍｍｕｎ．，ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ．，２００２，１６，２０６７−２０７２
【非特許文献２】ＩｓｈｉｈａｍａＹ．ｅｔａｌ；ＲａｐｉｄＣｏｍｍｕｎ．，ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ．，２００２，１６，９１３−９１８
【非特許文献３】山田尚之；Ｊ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，２０００，４８（３），１８７−１９２
【非特許文献４】ＷｅｎＪ．ｅｔａｌ；Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２０００，２１（１），１９１−７
エレクトロスプレーイオン化の原理は、まず、溶媒に溶解した試料を高電位が印加されたキャピラリーから噴霧させることにより、電荷を持った細かな液滴（荷電液滴）を作成し、次いで、この荷電液滴を熱や不活性ガスを用いて脱溶媒することにより、試料分子だけに荷電を移行させて、これをイオン化するというものである。そして、このようにしてイオン化した分子は、質量分析装置へと導かれて質量分析（ＭＳ）に供される。エレクトロスプレーイオン化は、低分子化合物から生体高分子（例えば、タンパク質やＤＮＡなど）までのイオン化法として広く用いられている。特に、このイオン化法は、高い熱をかけたり、高エネルギー粒子を衝突させたりしないため、温和な条件で物質をイオン化できる特徴を持つことから、ペプチド、タンパク質、核酸などの生体高分子を破壊することなしに、多価イオンを生成させることができる、などの特長をもつ。また、溶液試料が対象であるので液体クロマトグラフィー（ＬＣ）と組み合わせたＬＣ／ＭＳやキャピラリー電気泳動（ＣＥ）と組み合わせたＣＥ／ＭＳのイオン化法に利用されている。
【０００３】
一般的なエレクトロスプレーイオン化には、内径１００〜１２０μｍ程度の金属製細管又は内径２０〜１００μｍのシリカ製細管が用いられる。溶液試料の流量は内径により異なるものの実用的には通常１００〜１０，０００ｎｌ／ｍｉｎである。１９９０年代には溶液試料を３０〜５００ｎｌ／ｍｉｎの極微流量でイオン化できるようにした、ナノ・エレクトロスプレーイオン化用細管（ナノ・エレクトロスプレーイオン化法）が登場した（特許文献１）。これは、金属薄膜あるいは導電性高分子薄膜を被覆した内径５〜５０μｍのガラス製あるいはフューズドシリカ製で、流量３０〜３，０００ｎｌ／ｍｉｎでイオン化することが可能であり、溶液試料量を低減できる長所を有していた。内径５０〜１００μｍカラムを用いた流速１００〜３００ｎｌ／ｍｉｎのナノＬＣとこのナノ・エレクトロスプレーイオン化法を組み合わせることにより、極低流量のナノＬＣ／ＭＳを行うことができた。ナノＬＣによる試料の分離と濃縮効果により、試料量の低減、高感度化が図られることから、ナノＬＣ／ＭＳは生体内の極微量タンパク質を解析するプロテオミクスなどのバイオテクノロジー分野で広く活躍している（非特許文献３）。
【０００４】
フューズドシリカ製のナノ・エレクトロスプレーイオン化用細管（チップ）は、数社より、流速に合わせた多くの種類が市販されている（ＮｅｗＯｂｊｅｃｔｉｖｅ社、Ｐｒｏｔａｎａ社、Ｎａｎｏｇｅｎｅｓｙｓ社など）。しかし、ガラス製、フューズドシリカ製共に強度が弱く耐久性に劣ることや流量によってチップを交換しなくてはならないこと等大きな欠点がある。また、金薄膜や導電性ポリマー薄膜も高電界下での耐久性に劣る。通常の測定において、また、特に放電現象が生じた場合には、これらの薄膜は容易に剥離し、長期間安定したイオン化を行うことが困難という問題がある。これらの問題点を克服するために、白金と酸化珪素の多層コーティングした細管が開発されたが、コーティングの寿命が延びただけで根本的な解決にはなっていない。特に、ＬＣ／ＭＳで自動連続測定をする場合には、貴重な試料が損失してしまうため大きな問題となる。また、質量分析装置とイオン化用細管先端の位置と電圧の調整が測定には極めて重要なため、イオン化用細管の交換頻度が高いと測定者の負担が大きくなる。従って、前記のようなイオン化用細管は多数の試料をルーチンに分析するような臨床検査や大規模プロテオミクス・メタボロミクスの分析法として用いるには大きな問題となっている。また、流量により、内径の異なるチップを交換しなくてはならず、ルーチン分析では大きな問題である。
【０００５】
このような物理的耐久性に劣るフューズドシリカ製のものの代わりに、内径が６０μｍのステンレス製細管を用いた例が報告されている（非特許文献１）。この程度の内径では、流速は、十分に下げることができない。さらに、先端をケミカルエッチング法でテーパー加工を施した内径２０〜７０μｍのステンレス製細管を用いた例が報告されている（非特許文献２）。この文献には、テーパー型では４０ｎｌ／ｍｉｎ以上で安定にイオン化できるが、テーパー型でない場合は安定にイオン化できないと記載されている。しかしながら、ケミカルエッチング法による先端テーパー加工は、手間がかかり、歩留まりが悪いといった問題点がある。また、先端が鋭く加工されているため、高電界において、先端の電荷密度が著しく高くなり、かつ金属厚が薄いため、放電が生じた場合、容易に欠損してしまうという欠点がある。このように、先端の形状が変化するとイオン化の条件を再度調整しなくてはならない。更に、ステンレス製細管は、フューズドシリカ製に比べて、曲がりやすいといった欠点も有している。
【０００６】
一方、近年、分析装置のマイクロチップ化が進んでおり、既にマイクロチップ型キャピラリー電気泳動が市販されている（島津製作所製「ＭＣＥ−２０１０」、アジレント・テクノロジー社製「２１００バイオアナライザー」など）。また、マイクロチップ電気泳動装置をＭＳと組み合わせる試みもなされている（非特許文献４）。このような微細加工技術を用いた分離・分析装置を用いるメリットは、高感度・迅速・省試料などが挙げられる。マイクロチップ型の分離装置の流量は、毎分数ナノリットルと極微量なため、これを質量分析装置に接続するためには、耐久性に優れ、安定したナノ・エレクトロスプレーイオン化用細管が必要となる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
かくして、本発明の課題は、物理的強度、耐久性、イオン化の安定性に優れ、低流量で安定に試料をイオン化でき、かつ安定生産が可能な質量分析用のナノ・エレクトロスプレーイオン化用極細管を含むナノ・スプレーイオン化用極細管を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は課題を解決すべく鋭意研究の結果、質量分析用ナノ・スプレーイオン化用極細管を内径５０μｍ以下の、導電性材料からなる内管を金属又は導電性セラミックス材料の外管で被覆した構造（二重細管）とすることにより、物理的な強度をもたせ得ること、さらにまた該内管の一端にテーパーを設けて、かつ、その先端が１０μｍ以上の端面を有するテーパー型の形状とすることにより、放電に対する耐久性を持たせ得ることを見い出し、このような知見に基いて本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、内径５０μｍ以下の金属又はセラミックスの導電性材料の内管を金属又は導電性セラミックスの材料の外管で被覆した構造であることを特徴とする質量分析用ナノ・スプレーイオン化用極細管、このような質量分析用ナノ・スプレーイオン化用極細管であって、内管はその一端の外壁にテーパーが設けられ、かつ、そのテーパー先端が１０μｍ以上端面を有する形状であることを特徴とするもの、これらの質量分析用ナノ・スプレーイオン化用極細管であって、内管はその一端の外壁にテーパーが設けられ、かつそのテーパー先端がテーパーと内径壁とで尖端を形成していることを特徴とするもの、および前記３つの態様の質量分析用ナノ・スプレーイオン化用極細管であって、外管の先端は内管の外壁に設けられたテーパーが内管外径に達する地点又はそれより試料流れ方向の上流地点で固定されていることを特徴とするものに関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の質量分析用ナノ・スプレーイオン化用極細管のうち内管は導電性を有する金属又はセラミックスを用いている。金属としてはステンレス、チタン、金、白金等又はこれらを含む合金が好んで用いられる。内管は試料をスプレーイオン化している間中、高電圧に晒されており、酸化も受けやすい状態であるので、耐蝕性のある金属材料が好んで用いられる。実用性を考えればステンレス製特にＪＩＳＳＵＳ３０４、３１６が好ましい。セラミックスの材質も同様に選択されるがこの導電性は半導体よりも金属の導電性に近い値で決定される。電気抵抗値が１００／１０^−８Ω・ｍ以下あれば実用上支障はない。セラミックスとしては二ホウ化チタンセラミックス、ランタンクロマイト等の導電性多結晶セラミックス等を挙げることができる。これらのセラミックスで製作することにより、化学的に超安定性の高いノズル（細管）を提供することができる。特に、二ホウ化チタンセラミックスは、導電性と機械的強度が金属とほぼ同等であり、用いることができる。内管の肉厚は特に限定されないが、堅牢性を維持する観点から１５μｍ以上、１００μｍ以下が好ましい。
【００１１】
本発明では内管材料自身に導電性材料が好んで使用されるが、その理由は質量分析用のスプレーイオン化に必要な導電性を材料自身に持たせたことでイオン化が安定することである。導電性材料である金属やセラミックス材料は堅牢で少々の振動や接触で破損し難いので耐久性がある。これにより質量分析用ナノ・スプレーイオン化用極細管をより長期間の使用に耐えられるようにしたことである。長期間使用に対しても内管先端部の変形がし難くなり、尖端が長期間使用により丸みを帯びたりする変形や細かな破損を未然に防ぐことができた。本発明は、この内管をさらに外管で被覆し固定することによってこれらの特徴をより優れたものにすることができた。すなわち、振動をより少なくし、耐曲げ性を保有させたことにより、尖端部分の耐久性を増加させることができた。
【００１２】
本発明の一つは内管先端にテーパーを設け、かつ、その先端が１０μｍ以上の端面を有する形状であるので衝撃破損を減少することができた。さらに、高電界による先端形状磨耗を軽減することができた。このため、質量分析装置に供する試料流量を長期間一定に保つことができ、それだけ安定した分析をすることが可能となった。一方、質量分析用ナノ・スプレーイオン化用極細管とすることで測定者が従来行っていたナノ・スプレーイオン化用細管を頻繁に交換していた煩わしを減じることができた。これは質量分析装置が汎用性を広げ、将来血液検査や生体検査等のルーチンワーク的な使用法が開発された場合には偉力を発揮することになる。一方、本発明には内管の一端の外壁にテーパーが設けられ、かつそのテーパー先端がテーパーと内径壁とで尖端を形成している形状の内管も含まれる。この場合にも堅牢性の点ではヒューズドシリカに比べればはるかに問題ないが、従来のステンレス製品に比べても堅牢性を増加した。これは本発明の内管とこれを被覆した外管の二重構造により堅牢性が増しこの結果、振動等により内管に直接与えていた衝撃が内管のみの構成より減少したためと思われる。外径１００μｍ程度の細管は、装置の振動を受けることにより、先端部分が振動する。これにより、電界の状態が不安定となり、分子のイオン化もこれに影響され不安定となる。また、ＭＳのイオン導入部との相対的な位置も変化し、かつ極細管先端からのイオン化分子の発射方向も安定しないので、ＭＳに導入されるイオン化分子の量が不安定となる。本発明は二重構造にすることにより振動を抑えることができたので、先端が尖端を形成している形状の内管の先端部分の欠損や変形が生じにくく、他方、端面を有する形状の場合にはさらにその先端の変形が起りにくくより優れている。以上のような欠点を全て解決し、常に安定した質量分析が行えるようになった。
【００１３】
本発明の質量分析用ナノ・スプレーイオン化用極細管の内管を補強する外管はやはり堅牢性を目的としており、材質は金属製又はセラミックス製である。外管はその内径が内管の外径より僅かに大きい必要がある。内管の先端にテーパーが設けられずに外管の先端と内管の先端とが一致している場合、内管はその先端の端面が異常に広くなり、試料の噴出に影響を及ぼす。試料の焼付きなどの弊害が生じる慮がある。質量分析装置にこれを取り付け電圧をかけた場合にも、先端の電荷密度が低くなるためにイオン化の効率が低下するといった弊害を生じる慮れがある。
【００１４】
外管の先端は内管の外壁に設けられたテーパーが内管外径に達する地点又はそれより試料流れ方向の上流地点で固定されていることが望ましい。これよりさらに上流地点で固定すれば、するほど内管の先端と外管の先端の距離は離れるので外管で内管を補強する目的が薄れてくる。この距離としては１乃至２０ｍｍの範囲であれば差し支えない。
【００１５】
本発明の質量分析用ナノ・スプレーイオン化用極細管の内管は以下のようにして製造することができる。内径３０μｍのステンレス極細管（本発明に関わる内管）をエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）のエミッターとして用いて試験をした。すなわち、質量分析メーカーの純正または、サードパーティー（ＮｅｗＯｂｊｅｃｔｉｖｅ社やＰｒｏｔａｎａ社など）が販売しているのナノＥＳＩ用イオン源に本発明のテーパー型ステンレス極細管を装着して、測定を行ったところ、流速２ｎｌ／ｍｉｎという極低流速に於いてでも安定してイオン化することができた。また、本発明のテーパー型ステンレス極細管は、フューズドシリカ製チップに比べて、強度があることまた、ストレートパイプであることから、早い流速でもイオン化することが可能である。従って、使用可能な流速範囲は、２ｎｌ／ｍｉｎ〜３，０００ｎｌ／ｍｉｎと幅広い。つまり、機械研磨による先端テーパー加工においても、低流量で安定にイオン化することを見出した。更に、低流速条件下では、温度が室温近くでも安定にイオン化が観測された。２０〜５０ｎｌ／ｍｉｎ以下の流量でかつ加熱せずに安定にイオン化することがわかり、熱に不安定な化合物でも、分解せずに質量分析を行うことができる。また、イオン化電圧も通常の２，０００〜４，０００Ｖと比べて、ナノ・エレクトロスプレーイオン化の場合は９００〜１，２００Ｖと低いため、試料物質の分解を抑制する効果に寄与している。これら複数の効果が合わさることにより、非共有結合による複合体を測定することも可能となった。
【００１６】
さらに、このようなステンレス製極細管である内管にその外径よりわずかに大きな内径のステンレス製細管を外管として被覆させる、あるいは、セラミックス製外管で覆うことにより作成した本発明の二重構造のナノ・スプレーイオン化用極細管は、その物理的強度を増すことができた。内管のテーパーについて述べる。テーパーは、外管の内面におよぶことはないので、端面の厚さａが１０μｍ以上、内管肉厚ｂが１５〜１００μｍ、外管先端と内管先端の距離１が１〜２０ｍｍであることから、テーパーは、（ｂ−ａ）／ｌ（式（１））で規定される。これに数値を代入すると、最小値５／２００００、最大値９０／１０００となる。内管の先端が尖端を形成する場合にはａ＝１０であるので最小値は１５／２００００、最大値１００／１０００となる。
【００１７】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に説明する。
【００１８】
実施例１（ステンレス製二重細管の作成）
内管Ａと外管Ｂの素管を冷間伸管法により製作する。製造の概略を第１図に示した。冷間伸管法は、目的とする所定の内径・外径より太い径の管の片端を固定し冷間伸管機にて、もう一方の片端を強制的に引っ張り、徐々に管の内径・外径を細くしていく。これを数回行なうことで、必要とする内管Ａと外管Ｂの素管を得る。内管Ａの外径ＤｇＡと外管Ｂの内径ＤｎＢは、ＤｇＡ＜ＤｎＢの関係に有る。この素管を、目的とする長さにそれぞれ切断する。次いで、内管Ａの一端（電極端）のテーパー加工を行なう。
【００１９】
次に、外管と内管を接合する。外管と内管の接合は、化学的安定と電気的特性を得る為に二種類の接合剤を使用する。化学的に非常に安定した結合を得るために、耐アルカリ耐酸で反応しにくい例えば歯科用セメント（接着剤）を用いる。歯科用セメントは、人体などの生体との適合性も取れた物質である。また、電気動通性を図る為に、外管と内管の接合に導電性接合剤を使用する。
【００２０】
内管Ａの外周部に接合する為の接合剤（接着剤）２種類を、外管Ｂ内径の目的の場所に塗布し所定の温度に加熱（通常は８０〜１２０℃）する。接合剤を反応硬化することにより内管Ａと外管Ｂを接合して二重構造とする。このとき２種類の接合剤の塗布する場所は、歯科用接合剤を２重管の元部分に、導電性接合剤を先部分になるよう塗布する。
【００２１】
このようにして作成されるナノ・スプレーイオン化用細管のサイズ、形状はナノ・エレクトロスプレーイオン源などのナノ・スプレーイオン源のプローブの細管接続部に適合するものとすることは言うまでもない。
【００２２】
その一端がテーパーを付され、かつ、その先端が１０μｍ以上の端面を有するテーパー型の形状である内管の作成は、例えば次にようにして行なうことができる。すなわち、内径５０μｍ以下、好ましくは３０μｍ程度の内径をもつステンレス製極細管の一方を、機械研磨により、テーパー型とする。この時、放電に対する耐久性を持たせるために、先端に１０μｍ以上の端面を残す。機械研磨を用いることにより、ケミカルエッチングではできない微細加工を精度良く、品質の均一なステンレス製極細管を量産することができる。本発明の端面を有するテーパー型内管を第２図（ａ）に、そして従来の端面を有しない細管を同図（ｂ）に示す。この場合のテーパーは、式（１）より、２０／２０００であった。
【００２３】
実施例２（評価：低流速から通常の流速まで、「質量分析計ＬＣＱ」）
本発明の極細管で、内管の内径３０μｍ、外管の外径３００μｍ、長さ３ｃｍのステンレス製極細管（以下、「マイクロメタルチップ」と呼ぶ。）をフューズドシリカ製ナノ・エレクトロスプレーチップ用マウンティングシステム（ＮｅｗＯｂｊｅｃｔｉｖｅ社製ＰｉｃｏＴｉｐマウンティングシステム、サーモフィニガン製「質量分析計ＬＣＱ」用）に装着し、サーモフィニガン製「質量分析計ＬＣＱ」に装備した。試料には、４％酢酸水溶液とメタノールの１：１（容量）混合溶媒に溶解したレセルピン（シグマ・アルドリッチ製）を用いた。ＬＣＱに付属のシリンジポンプを用いて、試料を質量分析計に導入した。脱溶媒用の加熱キャピラリー温度は１００℃、キャピラリー電圧は９００〜１，３００Ｖで測定を行い、マススペクトルは、３０秒間積算した。１ｐｍｏｌ／μＬの濃度のレセルピンを１０ｎｌ／ｍｉｎから３μｌ／ｍｉｎの流速で測定を行った。その結果、１０ｎｌ／ｍｉｎから３μｌ／ｍｉｎの幅広い流速範囲で安定したイオン化が行われ、不純物ピークのない、Ｓ／Ｎ比（シグナルとノイズの比）の高いマススペクトルを得ることができた（第３図（ａ））。
【００２４】
通常サイズ（内径１２０μｍ、外径０．８ｍｍ、長さ１４ｃｍ）のステンレス製細管を用いたイオン源（サーモフィニガン製メタルニードル）を装着し、コンベンショナルなエレクトロスプレーイオン源として上記本発明の場合と比較した。加熱キャピラリー温度は、２００℃、キャピラリー電圧は、２，３００Ｖで測定を行い、マススペクトルは３０秒間積算した。１ｐｍｏｌ／μＬのレセルピンの場合、流速０．５μｌ／ｍｉｎ〜３μｌ／ｍｉｎの間では、イオンを観測することができたが、それ以下では観測することができなかった（第３図（ｂ））。
【００２５】
以上の結果より、マイクロメタルチップの方が低流速でイオン化できることが明確となった。
【００２６】
実施例３（試料濃度、「質量分析計ＬＣＱ」）
本発明の極細管で、内管の内径３０μｍ、外管の外径３００μｍ、長さ３ｃｍのマイクロメタルチップをフューズドシリカ製ナノ・エレクトロスプレーチップ用マウンティングシステム（ＮｅｗＯｂｊｅｃｔｉｖｅ社製ＰｉｃｏＴｉｐマウンティングシステム、サーモフィニガン製「質量分析計ＬＣＱ」用）に装着し、サーモフィニガン製「質量分析計ＬＣＱ」に装備した。試料には、４％酢酸水溶液とメタノールの１：１（容量）混合溶媒に溶解したレセルピン（シグマ・アルドリッチ製）を用いた。「質量分析計ＬＣＱ」に付属のシリンジポンプを用いて、流速５０ｎｌ／ｍｉｎで試料を質量分析計に導入した。脱溶媒用の加熱キャピラリー温度は１００℃、キャピラリー電圧は９００〜１，３００Ｖで測定を行い、マススペクトルは、３０秒間積算した。１ｐｍｏｌ／μＬから１ｆｍｏｌ／μＬのレセルピンを測定したところ、５ｆｍｏｌ／Ｌでもレセルピンの分子関連イオンを検出することができた（第４図（ａ））。
【００２７】
通常サイズ（内径１２０μｍ、外形０．８ｍｍ、長さ１４ｃｍ）のステンレス製細管を用いたイオン源（サーモフィニガン製メタルニードル）を装着し、コンベンショナルなエレクトロスプレーイオン源として上記本発明の場合と比較した。流速１μＬ／ｍｉｎ、加熱キャピラリー温度は、２００℃、キャピラリー電圧は、２，３００Ｖで測定を行い、マススペクトルは３０秒間積算した。１ｐｍｏｌ／μＬおよび１００ｆｍｏｌ／μＬでは、イオンを観測することができたが、それ以下では観測することができなかった（第４図（ｂ））。従って、マイクロメタルチップの方が低濃度でイオン化できることが明確となった。
【００２８】
実施例４（流速および温度、「質量分析計ＦＴＩＣＲ−ＭＳ」）
本発明の極細管で、内管の内径３０μｍ、外管の外径３００μｍ、長さ３ｃｍのマイクロメタルチップをフューズドシリカ製ナノ・エレクトロスプレーチップ用イオン源（ブルカー・ダルトニクス製）に装着し、ブルカー・ダルトニクス製「フーリエ変換イオンサイクロトロン質量分析計ＡｐｅｘＩＩ７テスラー」（質量分析計ＦＴＩＣＲ−ＭＳ）に装備した。試料には、４％酢酸水溶液とメタノールの１：１（容量）混合溶媒に溶解したウシ・インスリン（シグマ・アルドリッチ製）およびウマ・ミオグロビン（シグマ・アルドリッチ製）を用いた。シリンジポンプを用いて、試料を質量分析計に導入した。ドライガスは使用せずに、イオン源周りの温度は室温とした。キャピラリー電圧は、１，０００〜１，４００Ｖで測定を行い、データポイント数５１２Ｋ、８回のＦＩＤ（自由誘電減衰）を積算した後、フーリエ変換によりマススペクトルへ変換した。流速１００ｎｌ／ｍｉｎ、５０ｎｌ／ｍｉｎおよび３３ｎｌ／ｍｉｎで測定を行ったがいずれもＳ／Ｎの良いマススペクトルが得られた。また、室温、３３ｎｌ／ｍｉｎにおいて、生体高分子タンパク質であるミオグロビン（１ｐｍｏｌ／ｍｌ）をイオン化することができた（第５図）。
【００２９】
実施例５（低流速、低濃度、「質量分析計Ｑ−ＴＯＦＭＳ」）
本発明の極細管で、内管の内径３０μｍ、外管の外径３００μｍ、長さ６ｃｍのマイクロメタルチップをフューズドシリカ製ナノ・エレクトロスプレーチップ用イオン源（マイクロマス製）に装着し、マイクロマス製「四重極−飛行時間型質量分析計Ｑ−ＴＯＦＩＩ」（質量分析計Ｑ−ＴＯＦＭＳ）に装備した。試料には、４％酢酸水溶液とメタノールの１：１（容量）混合溶媒に溶解したウシ・インスリンおよびレセルピン（シグマ・アルドリッチ製）を用いた。シリンジポンプを用いて、試料を質量分析計に導入した。脱溶媒用のソースブロック温度は２５℃）キャピラリー電圧は１，２００〜１，６００Ｖ、コーン電圧３０−４０Ｖ、コリジョン電圧１０−２０Ｖで測定を行い、マススペクトルは、３０秒間取り込んだ。１ｐｍｏｌ／μＬ濃度のウシ・インスリンの場合、流速２ｎｌ／ｍｉｎ〜５０ｎｌ／ｍｉｎの間でイオンを観測することができた（第６図）。非常に低流量で測定することができることがわかった。濃度については、流速５０ｎｌ／ｍｉｎの時に、ウシ・インスリンで１０ｆｍｏｌ／μＬ（第７図）、そしてレセルピンで５ｆｍｏｌ／μＬの低濃度で測定することができた（第８図）。
【００３０】
実施例６（ノンコバレント、「質量分析計Ｑ−ＴＯＦＭＳ」）
本発明の極細管で、内管の内径３０μｍ、外管の外径３００μｍ、長さ６ｃｍのマイクロメタルチップをフューズドシリカ製ナノ・エレクトロスプレーチップ用イオン源（マイクロマス製）に装着し、マイクロマス製「四重極−飛行時間型質量分析計Ｑ−ＴＯＦＩＩ」（質量分析計Ｑ−ＴＯＦＭＳ）に装備した。試料には、５０ｐｍｏｌ／μｌ濃度になるように１０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．５）に溶解したアルコール脱水素酵素（シグマ・アルドリッチ社製酵母由来）を用いた。イオン源の温度を２５℃に設定し、流速２００ｎｌ／ｍｉｎでシリンジポンプを用いて試料を質量分析計へ供給した。１分間積算したスペクトルを第９図に示した。アルコール脱水素酵素は、分子量３６７５１のモノマーが４分子非共有結合で結合した分子量１４７００４のホモテトラマーである。測定時に加熱することにより、非共有結合が壊れ、モノマーの質量が観測される。室温で測定することにより、ホモテトラマー由来の分子量関連イオンを観測することができた。
【００３１】
実施例７（キャピラリーＬＣ／ＭＳ／ＭＳ、「質量分析計ＬＣＱ」による連続測定）
本発明の極細管で、内管の内径３０μｍ、外管の外径３００μｍ、長さ３ｃｍのマイクロメタルチップをフューズドシリカ製ナノ・エレクトロスプレーチップ用マウンティングシステム（ＮｅｗＯｂｊｅｃｔｉｖｅ社製ＰｉｃｏＴｉｐマウンティングシステム、サーモフィニガン製「質量分析計ＬＣＱ」用）に装着し、サーモフィニガン製「質量分析計ＬＣＱ」に装備した。ＨＰＬＣシステムは、オートサンプラー（ＬＣパッキングス社「ＦＡＭＯＳ」）、スイッチングバルブシステム（ＬＣパッキングス社「Ｓｗｉｃｈｏｓ」）、低流量グラジエントポンプ（ＡＢＩ社「Ｍｏｄｅｌ１４０Ｂ」）を用い、流速１２０μｌ／ｍｉｎで送液した。その後、マイクロスプリッター（ＬＣパッキングス社「アキュレート」）で３μｌ／ｍｉｎに流速を低下させて、分離カラム（内径０．３ｍｍ、長さ１５０ｍｍ「イナートシルＯＤＳ−３」ＧＬサイエンス社）に導いた。上記、ＨＰＬＣシステムとＭＳ（質量分析計）を組み合わせることにより、キャピラリーＬＣ／ＭＳ／ＭＳの測定を行った。
【００３２】
マイクロテストチューブに秤りとった１１３．５μｇ（１．７ｎｍｏｌ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマアルドリッチ社）を５０μｌの純水に溶解後、６Ｍグアニジン、２ｍＭＥＤＴＡ、０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．１）１５０μｌを添加し、さらに、９２２μｇ（６μｍｏｌ）のジチオスレイトールを加え、容器内を窒素置換後、５０℃で４時間半還元した。続いて、５２．８μｌの０．２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に溶解したモノヨード酢酸２．２ｍｇを添加した。室温で２時間反応させた後、ゲルろ過クロマトグラフィーにより過剰な試薬を除去した。ゲルろ過クロマトグラフィーは、下記第１表に示す条件で行った。
【００３３】
【表１】

【００３４】
タンパク質画分を分取し、減圧遠心濃縮機で溶媒を除去し、乾固させた。
【００３５】
上記のように還元カルボキシメチル化を行ったＢＳＡを４５μｌの５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．９）に溶解し、これに、９μｇのトリプシンを溶解した５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液４５μｌを添加した。続いて、４３８μｌのアセトニトリルを添加後、３７℃で１時間消化した。トリプシン消化後、反応液に１ｍｌの０．１％ＴＦＡ水溶液を添加し、減圧遠心濃縮機にて、２５μｌ程度までに濃縮した。この試料を０．１％ＴＦＡで適宜希釈し、５μｌをキャピラリーＬＣ／ＭＳ／ＭＳに供した。
【００３６】
また、通常サイズ（内径１２０μｍ、外形０．８ｍｍ、長さ１４ｃｍ）のステンレス製細管を用いたイオン源（サーモフィニガン製メタルニードル）を装着し、コンベンショナルなエレクトロスプレーイオン源として、同じＨＰＬＣシステムに接続し、比較した。得られたデータは、タンパク質同定ソフトＳＥＱＵＥＳＴ（サーモフィニガン製）を用いて、スペクトルの帰属を行った。
【００３７】
結果は、本発明の極細管で、内管の内径３０μｍ、外管の外径３００μｍ、長さ３ｃｍのステンレス製細管をイオン源として用いた場合、５０ｆｍｏｌの注入量で良好なマスクロマトグラムを得ることができ、アミノ酸配列の４３％を同定することができた（第１０図（ａ））。コンベンショナルなイオン源は、およそ５００ｆｍｏｌの試料を注入したときに、同様のデータを得ることができた（第１０図（ｂ））。
【００３８】
また、グルカゴンのトリプシン消化物を用いて、１５日間連続測定を実施したが、測定開始と終了後でイオン強度に差異はみられず、耐久性・堅牢性が高いことが示された（第１１図）。
【００３９】
実施例８（ナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳ、「質量分析計ＬＣＱ」）
本発明の極細管で、内管の内径３０μｍ、外管の外径３００μｍ、長さ３ｃｍのステンレス製細管をフューズドシリカ製ナノ・エレクトロスプレーチップ用マウンティングシステム（ＮｅｗＯｂｊｅｃｔｉｖｅ社製「ＰｉｃｏＴｉｐマウンティングシステム」、サーモフィニガン製「質量分析計ＬＣＱ」用）に装着し、サーモフィニガン製「質量分析計ＬＣＱ」に装備した。ＨＰＬＣシステムは、オートサンプラー（ＬＣパッキングス社「ＦＡＭＯＳ」）、スイッチングバルブシステム（ＬＣパッキングス社「Ｓｗｉｃｈｏｓ」）、低流量グラジエントポンプ（ＬＣパッキングス社「Ｕｌｔｉｍａｔｅ」）を用い、ナノカラムは、内径７５μｍ長さ１５０ｍｍのＯＤＳカラム（ＬＣパッキングス社「ＰｅｐＭａｐ」）を、濃縮カラムに内径０．３ｍｍ、長さ１ｍｍのＯＤＳカラムを用いた。上記、ＨＰＬＣシステムと質量分析計を組み合わせることにより、ナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳの測定を行った。およそ５０ｆｍｏｌのミオグロビンのトリプシン消化物を測定した結果、良好なマスクロマトグラムを得ることができた。得られたＣＩＤ（衝突誘起解離）スペクトルから、ミオグロビンの一次配列上、４０％の配列を解析することができた（第１２図）。
【００４０】
【発明の効果】
本発明のナノ・スプレーイオン化用極細管により、溶液試料を極低流量で安定にイオン化を行うことが可能となったことから、内径の小さいカラムを用いたＨＰＬＣであるナノＬＣやキャピラリー電気泳動と接続することにより、連続測定に耐えうる超微量ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムの構築が可能となった。さらに、マイクロチップ電気泳動等の低流量の分離装置との接続が可能になった。また、本発明のナノ・スプレーイオン化用極細管は、強度および耐久性が従来のものに比して格段に向上したことから、多検体をルーチンに分析するような、臨床検査、大規模プロテオミクス・メタボロミクス、環境ホルモン・土壌汚染物質などの環境分析、薬物動態研究、活性物質スクリーニングなどにおける超高感度分析に利用できる。さらに、本発明のナノ・スプレーイオン化用極細管を利用すれば、試料に熱をかけずにイオン化できることから、熱に不安定な化合物の質量分析が可能になった。また、タンパク質−低分子、タンパク質−タンパク質、タンパク質−核酸などの非共有結合による複合体をそのまま測定できるようになった。
【００４１】
さらに、本発明ナノ・スプレーイオン化用極細管はエレクトロスプレーイオン化法のみならず、レーザー照射によるイオン化法であるレーザースプレーイオン化法やソニックスプレーイオン化法にも応用ができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の質量分析用ナノ・スプレーイオン化用極細管の製造の概略を示す（実施例１）。
【図２】本発明の質量分析用ナノ・スプレーイオン化用極細管における内管の構造を示す。（実施例１）。
【図３】本発明の質量分析用ナノ・スプレーイオン化用極細管の評価例（流速）を示す。
【図４】本発明の質量分析用ナノ・スプレーイオン化用極細管の評価例（濃度）を示す。
【図５】本発明の質量分析用ナノ・スプレーイオン化用極細管の使用例（流速）および温度を示す（実施例５）。
【図６】本発明の質量分析用ナノ・スプレーイオン化用極細管の使用例を示す（実施例５）。
【図７】本発明の質量分析用ナノ・スプレーイオン化用極細管の使用例を示す（実施例５）。
【図８】本発明の質量分析用ナノ・スプレーイオン化用極細管の使用例を示す（実施例５）。
【図９】本発明の質量分析用ナノ・スプレーイオン化用極細管の使用例を示す（実施例６）。
【図１０】本発明の質量分析用ナノ・スプレーイオン化用極細管の使用例を示す（実施例７）。
【図１１】本発明の質量分析用ナノ・スプレーイオン化用極細管の使用例を示す（実施例７）。
【図１２】本発明の質量分析用ナノ・スプレーイオン化用極細管の使用例を示す（実施例８）。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a capillary which can be used for electrospray ionization and other spray ionization (laser spray ionization, sonic spray ionization, etc.) used in mass spectrometry, and which has excellent strength, and in particular, stably ionizes a sample at a low flow rate. The present invention relates to an ultrafine tube for nano-spray ionization.
[0002]
[Prior art]
[Patent Document 1] US Patent No. 5,788,166
[Non-Patent Document 1] Guzzetta A. et al; Rapid Commun. , Mass Spectrom. , 2002, 16, 2067-2072.
[Non-Patent Document 2] Ishihama Y. et al; Rapid Commun. , Mass Spectrom. , 2002, 16, 913-918.
[Non-Patent Document 3] Naoyuki Yamada; Mass. Spectrom. Soc. Jpn. , 2000, 48 (3), 187-192.
[Non-Patent Document 4] Wen J. et al; Electrophoresis, 2000, 21 (1), 191-7.
The principle of electrospray ionization is as follows. First, a sample dissolved in a solvent is sprayed from a capillary to which a high potential is applied to create fine droplets (charged droplets) having electric charge. By desolvating the droplet using heat or an inert gas, the charge is transferred only to the sample molecule, and this is ionized. Then, the molecules thus ionized are guided to a mass spectrometer and subjected to mass spectrometry (MS). Electrospray ionization is widely used as an ionization method from low molecular weight compounds to biological macromolecules (eg, proteins and DNA). In particular, this ionization method destroys biopolymers such as peptides, proteins, and nucleic acids because it does not apply high heat or collide with high-energy particles, and has the characteristic of being able to ionize substances under mild conditions. It has features such as the ability to generate multiply charged ions without any problems. In addition, since a solution sample is a target, it is used for an ionization method of LC / MS combined with liquid chromatography (LC) or CE / MS combined with capillary electrophoresis (CE).
[0003]
For general electrospray ionization, a metal thin tube having an inner diameter of about 100 to 120 μm or a silica thin tube having an inner diameter of 20 to 100 μm is used. The flow rate of the solution sample varies depending on the inner diameter, but is practically usually 100 to 10,000 nl / min. In the 1990s, a capillary tube for nano-electrospray ionization (nano-electrospray ionization method), which was capable of ionizing a solution sample at an extremely small flow rate of 30 to 500 nl / min, appeared (Patent Document 1). It is made of glass or fused silica with an inner diameter of 5 to 50 μm coated with a metal thin film or conductive polymer thin film, and can be ionized at a flow rate of 30 to 3,000 nl / min, reducing the amount of solution sample. Had the advantage of being able to. An extremely low flow rate nano LC / MS could be performed by combining this nano electrospray ionization method with nano LC at a flow rate of 100 to 300 nl / min using a 50 to 100 μm inner diameter column. Nano LC / MS is widely used in biotechnology fields such as proteomics for analyzing very small amounts of proteins in living organisms because the separation and concentration effects of samples by nano LC reduce the sample volume and increase sensitivity. (Non-Patent Document 3).
[0004]
Many types of capillary tubes for nanoelectrospray ionization (tips) made of fused silica are commercially available from several companies according to the flow rate (NewObjective, Protana, Nanogenesys, etc.). However, both glass and fused silica have significant disadvantages such as low strength and poor durability, and the necessity of exchanging chips depending on the flow rate. Further, a gold thin film or a conductive polymer thin film also has poor durability under a high electric field. In a normal measurement, and particularly when a discharge phenomenon occurs, there is a problem that these thin films are easily peeled off, and it is difficult to perform stable ionization for a long time. In order to overcome these problems, thin tubes coated with a multilayer coating of platinum and silicon oxide have been developed, but the longevity of the coating has not been a fundamental solution. In particular, when performing automatic continuous measurement by LC / MS, a significant problem occurs because precious samples are lost. In addition, since the position of the mass spectrometer and the position of the tip of the ionization capillary and the adjustment of the voltage are extremely important for the measurement, the frequency of replacement of the ionization capillary increases the burden on the measurer. Therefore, the above-mentioned ionization tubule is a serious problem when used as a clinical test for analyzing a large number of samples on a routine basis or as a large-scale proteomics / metabolomics analysis method. Further, it is necessary to exchange chips having different inner diameters depending on the flow rate, which is a serious problem in routine analysis.
[0005]
There has been reported an example in which a stainless steel thin tube having an inner diameter of 60 μm is used in place of such a material made of fused silica having poor physical durability (Non-Patent Document 1). With such an inside diameter, the flow velocity cannot be reduced sufficiently. Furthermore, there has been reported an example in which a stainless steel thin tube having an inner diameter of 20 to 70 μm whose tip is tapered by a chemical etching method is used (Non-Patent Document 2). This document states that a tapered type can stably ionize at 40 nl / min or more, but a non-tapered type cannot stably ionize. However, there is a problem that the tapering of the tip by the chemical etching method is troublesome and the yield is low. In addition, since the tip is sharply processed, the charge density at the tip becomes extremely high in a high electric field, and the metal thickness is thin. As described above, when the shape of the tip changes, the ionization conditions must be adjusted again. Furthermore, the stainless steel thin tube also has a drawback that it is easily bent as compared with the one made of fused silica.
[0006]
On the other hand, in recent years, microchips in analyzers have been developed, and microchip type capillary electrophoresis has already been marketed ("MCE-2010" manufactured by Shimadzu Corporation, "2100 Bioanalyzer" manufactured by Agilent Technologies). Attempts have also been made to combine a microchip electrophoresis apparatus with MS (Non-Patent Document 4). The advantages of using a separation / analysis device using such a microfabrication technique include high sensitivity, rapidity, and a small sample. Since the flow rate of the microchip type separation device is extremely small, a few nanoliters per minute, connecting it to a mass spectrometer requires a durable and stable nano-electrospray ionization capillary. .
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
Thus, an object of the present invention is to provide an ultrafine tube for nanoelectrospray ionization for mass spectrometry for mass spectrometry that has excellent physical strength, durability, and ionization stability, can stably ionize a sample at a low flow rate, and enables stable production. An object of the present invention is to provide a nano-spray ionization ultrafine tube containing:
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies to solve the problem, and as a result, coated an inner tube made of a conductive material having an inner diameter of 50 μm or less with an outer tube made of a metal or a conductive ceramic material for a nano-spray ionization tube for mass spectrometry. By providing a structure (double thin tube), physical strength can be imparted. Further, one end of the inner tube is provided with a taper, and the end thereof has a tapered shape having an end surface of 10 μm or more. As a result, it has been found that durability against discharge can be provided, and the present invention has been completed based on such findings.
[0009]
That is, the present invention has a structure in which an inner tube of a metal or ceramic conductive material having an inner diameter of 50 μm or less is covered with an outer tube of a metal or conductive ceramic material for mass spectrometry nano spray ionization. Ultrafine tube, such an ultrafine tube for nano-spray ionization for mass spectrometry, wherein the inner tube has a tapered outer wall at one end, and the tapered tip has a shape having an end surface of 10 μm or more. In these ultrafine tubes for nano-spray ionization for mass spectrometry, the inner tube is provided with a taper on the outer wall at one end, and the tapered tip forms a point with the taper and the inner diameter wall. And the nano-spray ionization ultra-fine tube for mass spectrometry according to the above three aspects, wherein a tip of the outer tube is provided on an outer wall of the inner tube. It is characterized in that the par is fixed at a point reaching the outer diameter of the inner tube or at an upstream point in the sample flow direction therefrom.
[0010]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Among the ultrafine tubes for nano-spray ionization for mass spectrometry of the present invention, the inner tube is made of conductive metal or ceramic. As the metal, stainless steel, titanium, gold, platinum or the like or an alloy containing these is preferably used. Since the inner tube is exposed to a high voltage during the spray ionization of the sample and is susceptible to oxidation, a corrosion-resistant metal material is preferably used. Considering practicality, stainless steel, especially JIS SUS304, 316 is preferable. The material of the ceramic is selected in the same manner, but this conductivity is determined by a value closer to the conductivity of the metal than the semiconductor. Electric resistance value is 100/10 ^-8 If it is Ω · m or less, there is no practical problem. Examples of the ceramics include conductive polycrystalline ceramics such as titanium diboride ceramics and lanthanum chromite. By manufacturing with these ceramics, it is possible to provide a nozzle (capillary tube) having high chemical stability. In particular, titanium diboride ceramics have almost the same conductivity and mechanical strength as metals and can be used. The thickness of the inner tube is not particularly limited, but is preferably 15 μm or more and 100 μm or less from the viewpoint of maintaining robustness.
[0011]
In the present invention, a conductive material is preferably used for the inner tube material itself, because the material itself has conductivity required for spray ionization for mass spectrometry, so that ionization is stabilized. Metals and ceramic materials, which are conductive materials, are durable and hard to be damaged by a slight vibration or contact, and therefore have durability. As a result, the nano-spray ionization tube for mass spectrometry can be used for a longer period of time. Deformation of the distal end portion of the inner tube became difficult even for long-term use, and the tip could be prevented from being rounded or minutely damaged due to long-term use. The present invention has been able to improve these features by further covering and fixing the inner tube with an outer tube. That is, the durability of the pointed part can be increased by reducing the vibration and maintaining the bending resistance.
[0012]
One of the present inventions has a taper at the tip of the inner tube, and the tip has a shape having an end surface of 10 μm or more, so that impact damage can be reduced. In addition, the wear of the tip shape due to the high electric field could be reduced. For this reason, the flow rate of the sample supplied to the mass spectrometer can be kept constant for a long period of time, and a stable analysis can be performed accordingly. On the other hand, by using the nano-spray ionization ultra-fine tube for mass spectrometry, the troublesome work of frequently replacing the nano-spray ionization thin tube conventionally performed by the measurer could be reduced. This means that the mass spectrometer will become more versatile, and will prove to be of great use if routine work methods such as blood tests and biological tests are developed in the future. On the other hand, the present invention also includes an inner pipe having a shape in which a taper is provided on the outer wall at one end of the inner pipe, and the tapered tip forms a pointed end with the taper and the inner diameter wall. Even in this case, there is no problem in terms of robustness as compared with fused silica, but the robustness is increased as compared with conventional stainless steel products. This is presumably because the dual structure of the inner tube of the present invention and the outer tube covering the inner tube increases the robustness, and as a result, the impact directly applied to the inner tube due to vibration or the like is reduced as compared with the structure of the inner tube alone. The tip of a thin tube having an outer diameter of about 100 μm vibrates due to the vibration of the device. As a result, the state of the electric field becomes unstable, and the ionization of the molecules is also influenced by this, and becomes unstable. In addition, the relative position of the MS with respect to the ion introducing portion changes, and the direction of emission of the ionized molecules from the tip of the ultrafine tube is not stable, so that the amount of the ionized molecules introduced into the MS becomes unstable. In the present invention, the vibration can be suppressed by the dual structure, so that the tip of the inner tube having a pointed tip is less likely to be damaged or deformed, while the shape having the end face is difficult. Are more resistant to deformation of the tip. All of the above disadvantages have been solved, and stable mass spectrometry can be always performed.
[0013]
The outer tube that reinforces the inner tube of the nano-spray ionization ultrafine tube for mass spectrometry of the present invention is also intended for robustness, and is made of metal or ceramic. The inner diameter of the outer tube must be slightly larger than the outer diameter of the inner tube. If the tip of the inner tube coincides with the tip of the inner tube without providing a taper at the tip of the inner tube, the end face of the inner tube becomes unusually wide, which affects the ejection of the sample. There is a possibility that adverse effects such as seizure of the sample may occur. Even when this is attached to the mass spectrometer and a voltage is applied, there is a possibility that the charge density at the tip becomes low and the efficiency of ionization decreases.
[0014]
It is desirable that the tip of the outer tube be fixed at a point where the taper provided on the outer wall of the inner tube reaches the outer diameter of the inner tube or at an upstream point in the sample flow direction therefrom. If the pipe is further fixed at an upstream point, the distance between the tip of the inner pipe and the tip of the outer pipe increases, so that the purpose of reinforcing the inner pipe with the outer pipe is reduced. This distance may be in the range of 1 to 20 mm.
[0015]
The inner tube of the nano-spray ionization tube for mass spectrometry according to the present invention can be manufactured as follows. The test was performed using a stainless steel microtube having an inner diameter of 30 μm (the inner tube according to the present invention) as an emitter for electrospray ionization (ESI). That is, when the taper type stainless steel ultrafine tube of the present invention was attached to an ion source for nano ESI sold by a genuine mass spectrometer manufacturer or a third party (NewObjective, Protana, etc.), and the measurement was performed. It was possible to stably ionize even at an extremely low flow rate of 2 nl / min. In addition, the tapered stainless steel ultrafine tube of the present invention has a higher strength than a fused silica tip and is a straight pipe, so that it can be ionized even at a high flow rate. Therefore, the usable flow rate range is wide from 2 nl / min to 3,000 nl / min. In other words, it has been found that even in the tip taper processing by mechanical polishing, ionization is performed stably at a low flow rate. Furthermore, under low flow rate conditions, ionization was observed stably even at temperatures near room temperature. It can be seen that ionization is stably performed at a flow rate of 20 to 50 nl / min or less without heating, and mass spectrometry can be performed without decomposing even a thermally unstable compound. In addition, the ionization voltage is 900 to 1,200 V in the case of nanoelectrospray ionization, which is lower than the normal 2,000 to 4,000 V, which contributes to the effect of suppressing the decomposition of the sample substance. The combination of these multiple effects has also made it possible to measure non-covalent complexes.
[0016]
Further, the inner tube, which is such a stainless steel ultrafine tube, is coated with a stainless steel thin tube having an inner diameter slightly larger than its outer diameter as an outer tube, or is formed by covering with a ceramic outer tube. Nano-spray ionization microtubules with a structure could increase their physical strength. The taper of the inner tube will be described. Since the taper does not extend to the inner surface of the outer tube, the thickness a of the end surface is 10 μm or more, the thickness b of the inner tube is 15 to 100 μm, and the distance 1 between the outer tube tip and the inner tube tip is 1 to 20 mm. Therefore, the taper is defined by (ba) / l (formula (1)). Substituting a numerical value into this results in a minimum value of 5 / 20,000 and a maximum value of 90/1000. When the tip of the inner tube forms a point, a = 10 and the minimum value is 15 / 20,000 and the maximum value is 100/1000.
[0017]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be further described with reference to examples.
[0018]
Example 1 (Preparation of double stainless steel tube)
The inner tube of the inner tube A and the outer tube B is manufactured by a cold drawing method. FIG. 1 shows an outline of the production. In the cold drawing method, one end of a pipe having a diameter larger than a predetermined predetermined inner diameter / outer diameter is fixed, and the other end is forcibly pulled by a cold drawing machine, and the inner diameter of the pipe is gradually reduced. Reduce the outer diameter. By performing this several times, the required inner tubes of the inner tube A and the outer tube B are obtained. The outer diameter DgA of the inner tube A and the inner diameter DnB of the outer tube B have a relationship of DgA <DnB. The tube is cut to a desired length. Next, one end (electrode end) of the inner tube A is tapered.
[0019]
Next, the outer tube and the inner tube are joined. The joining of the outer tube and the inner tube uses two kinds of bonding agents to obtain chemical stability and electrical properties. In order to obtain a chemically very stable bond, for example, a dental cement (adhesive) which is resistant to alkali and acid resistance and which does not react is used. Dental cement is a substance that is compatible with living bodies such as the human body. In addition, a conductive bonding agent is used for joining the outer tube and the inner tube in order to improve electric conductivity.
[0020]
Two types of bonding agents (adhesives) for bonding to the outer peripheral portion of the inner tube A are applied to target locations on the inner diameter of the outer tube B and heated to a predetermined temperature (usually 80 to 120 ° C.). The inner tube A and the outer tube B are joined by reaction-hardening the joining agent to form a double structure. At this time, the two types of bonding agents are applied such that the dental bonding agent is applied to the base of the double tube and the conductive bonding agent is applied to the front.
[0021]
It goes without saying that the size and shape of the nano-spray ionization capillary thus formed are compatible with the capillary connection of the probe of the nano-spray ion source such as the nano-electrospray ion source.
[0022]
The inner tube whose one end is tapered and whose tip has a tapered shape having an end surface of 10 μm or more can be produced, for example, as follows. That is, one of the ultrafine stainless steel tubes having an inner diameter of 50 μm or less, preferably about 30 μm, is formed into a tapered shape by mechanical polishing. At this time, an end face of 10 μm or more is left at the tip in order to have durability against discharge. By using mechanical polishing, it is possible to mass-produce stainless steel ultrafine tubes of uniform quality with high precision for fine processing that cannot be performed by chemical etching. FIG. 2 (a) shows a tapered inner tube having an end face according to the present invention, and FIG. 2 (b) shows a conventional thin tube having no end face. The taper in this case was 20/2000 according to equation (1).
[0023]
Example 2 (Evaluation: From low flow rate to normal flow rate, "mass spectrometer LCQ")
In the ultrafine tube of the present invention, a stainless steel ultrafine tube (hereinafter, referred to as a “micro metal chip”) having an inner diameter of an inner tube of 30 μm, an outer diameter of an outer tube of 300 μm, and a length of 3 cm is used as a nanoelectrospray tip made of fused silica. Mounting system (PicoTip mounting system manufactured by NewObjective, for "Mass Spectrometer LCQ" manufactured by Thermofinigan), and equipped to "Mass Spectrometer LCQ" manufactured by Thermofinigan. As a sample, reserpine (manufactured by Sigma-Aldrich) dissolved in a 1: 1 (volume) mixed solvent of a 4% acetic acid aqueous solution and methanol was used. The sample was introduced into the mass spectrometer using the syringe pump attached to the LCQ. The measurement was performed at a heating capillary temperature of 100 ° C. and a capillary voltage of 900 to 1,300 V for solvent removal, and the mass spectrum was integrated for 30 seconds. Reserpine having a concentration of 1 pmol / μL was measured at a flow rate of 10 nl / min to 3 μl / min. As a result, stable ionization was performed in a wide flow rate range of 10 nl / min to 3 μl / min, and a mass spectrum having no impurity peak and a high S / N ratio (ratio of signal to noise) could be obtained (No. 3 (a)).
[0024]
An ion source (thermofinigan metal needle) using a stainless steel thin tube of normal size (inner diameter 120 μm, outer diameter 0.8 mm, length 14 cm) is attached, and compared with the case of the present invention as a conventional electrospray ion source. did. The measurement was performed at a heating capillary temperature of 200 ° C. and a capillary voltage of 2,300 V, and the mass spectrum was integrated for 30 seconds. In the case of 1 pmol / μL reserpine, ions could be observed at a flow rate of 0.5 μl / min to 3 μl / min, but could not be observed below that (FIG. 3 (b)). .
[0025]
From the above results, it was clarified that the micrometal chip can be ionized at a lower flow rate.
[0026]
Example 3 (sample concentration, "mass spectrometer LCQ")
In the ultrafine tube of the present invention, a micro metal chip having an inner diameter of an inner tube of 30 μm, an outer diameter of an outer tube of 300 μm, and a length of 3 cm is mounted on a fused silica nano-electrospray chip mounting system (PicoTip mounting system manufactured by NewObjective, Thermofinigan). (For mass spectrometer LCQ) manufactured by Thermofinigan. As a sample, reserpine (manufactured by Sigma-Aldrich) dissolved in a 1: 1 (volume) mixed solvent of a 4% acetic acid aqueous solution and methanol was used. The sample was introduced into the mass spectrometer at a flow rate of 50 nl / min using a syringe pump attached to the “mass spectrometer LCQ”. The measurement was performed at a heating capillary temperature of 100 ° C. and a capillary voltage of 900 to 1,300 V for solvent removal, and the mass spectrum was integrated for 30 seconds. When reserpine was measured from 1 pmol / μL to 1 fmol / μL, molecular-related ions of reserpine could be detected even at 5 fmol / L (FIG. 4 (a)).
[0027]
An ion source (thermofinigan metal needle) using a stainless steel thin tube of a normal size (inner diameter 120 μm, outer diameter 0.8 mm, length 14 cm) was attached, and compared with the case of the present invention as a conventional electrospray ion source. . The measurement was performed at a flow rate of 1 μL / min, a heating capillary temperature of 200 ° C., a capillary voltage of 2,300 V, and integrated the mass spectrum for 30 seconds. At 1 pmol / μL and 100 fmol / μL, ions could be observed, but below that, no ions could be observed (FIG. 4 (b)). Therefore, it became clear that the micrometal chip can be ionized at a lower concentration.
[0028]
Example 4 (flow rate and temperature, "mass spectrometer FTICR-MS")
In the ultrafine tube of the present invention, a micrometal chip having an inner diameter of the inner tube of 30 μm, an outer diameter of the outer tube of 300 μm, and a length of 3 cm is mounted on an ion source (manufactured by Bruker Daltonics) for a nanoelectrospray tip made of fused silica. It was equipped with a "Fourier transform ion cyclotron mass spectrometer ApexII 7 Tesler" (mass spectrometer FTICR-MS) manufactured by Bruker Daltonics. Bovine insulin (manufactured by Sigma-Aldrich) and horse myoglobin (manufactured by Sigma-Aldrich) dissolved in a 1: 1 (volume) mixed solvent of a 4% acetic acid aqueous solution and methanol were used as samples. The sample was introduced into the mass spectrometer using a syringe pump. Dry gas was not used, and the temperature around the ion source was room temperature. The capillary voltage was measured at 1,000 to 1,400 V, the number of data points was 512 K, and FID (free dielectric decay) eight times was integrated, and then converted to a mass spectrum by Fourier transform. Measurements were performed at flow rates of 100 nl / min, 50 nl / min, and 33 nl / min, and all obtained mass spectra with good S / N. Further, at room temperature and 33 nl / min, myoglobin (1 pmol / ml) as a biopolymer protein could be ionized (FIG. 5).
[0029]
Example 5 (low flow rate, low concentration, "mass spectrometer Q-TOFMS")
In the ultrafine tube of the present invention, a micrometal chip having an inner tube inner diameter of 30 μm, an outer tube outer diameter of 300 μm, and a length of 6 cm is attached to a fused silica nano-electrospray chip ion source (manufactured by Micromass). It was equipped with a mass-produced “quadrupole-time-of-flight mass spectrometer Q-TOF II” (mass spectrometer Q-TOFMS). As a sample, bovine insulin and reserpine (manufactured by Sigma-Aldrich) dissolved in a 1: 1 (volume) mixed solvent of a 4% aqueous acetic acid solution and methanol were used. The sample was introduced into the mass spectrometer using a syringe pump. The source block temperature for desolvation was 25 ° C.) Measurement was performed at a capillary voltage of 1,200 to 1,600 V, a cone voltage of 30 to 40 V, and a collision voltage of 10 to 20 V, and a mass spectrum was captured for 30 seconds. In the case of bovine insulin having a concentration of 1 pmol / μL, ions could be observed at a flow rate of 2 nl / min to 50 nl / min (FIG. 6). It has been found that measurements can be made at very low flow rates. Concentrations could be measured at low flow rates of 10 fmol / μL for bovine insulin (FIG. 7) and 5 fmol / μL for reserpine at a flow rate of 50 nl / min (FIG. 8).
[0030]
Example 6 (non-covalent, “mass spectrometer Q-TOFMS”)
In the ultrafine tube of the present invention, a micrometal chip having an inner tube inner diameter of 30 μm, an outer tube outer diameter of 300 μm, and a length of 6 cm is attached to a fused silica nano-electrospray chip ion source (manufactured by Micromass). It was equipped with a mass-produced “quadrupole-time-of-flight mass spectrometer Q-TOF II” (mass spectrometer Q-TOFMS). Alcohol dehydrogenase (derived from Sigma-Aldrich yeast) dissolved in 10 mM ammonium acetate (pH 6.5) to a concentration of 50 pmol / μl was used as a sample. The temperature of the ion source was set to 25 ° C., and the sample was supplied to the mass spectrometer using a syringe pump at a flow rate of 200 nl / min. The spectrum integrated for one minute is shown in FIG. The alcohol dehydrogenase is a homotetramer having a molecular weight of 147004 in which four molecules of a molecular weight of 36751 are bonded by non-covalent bonds. By heating during the measurement, the non-covalent bond is broken, and the mass of the monomer is observed. By measuring at room temperature, a molecular weight-related ion derived from the homotetramer could be observed.
[0031]
Example 7 (Capillary LC / MS / MS, continuous measurement by "mass spectrometer LCQ")
In the ultrafine tube of the present invention, a micro metal chip having an inner diameter of an inner tube of 30 μm, an outer diameter of an outer tube of 300 μm, and a length of 3 cm is mounted on a fused silica nano-electrospray chip mounting system (PicoTip mounting system manufactured by NewObjective, Thermofinigan). (For mass spectrometer LCQ) manufactured by Thermofinigan. The HPLC system uses an autosampler (“FAMOS” from LC Packings), a switching valve system (“Swichos” from LC Packings), and a low flow gradient pump (“Model140B” from ABI) to deliver liquid at a flow rate of 120 μl / min. did. Thereafter, the flow rate was reduced to 3 μl / min by a micro splitter (LC Packings “Accurate”), and the mixture was led to a separation column (inner diameter 0.3 mm, length 150 mm “Inertsill ODS-3” GL Science). Capillary LC / MS / MS was measured by combining the above-mentioned HPLC system and MS (mass spectrometer).
[0032]
After dissolving 113.5 μg (1.7 nmol) of bovine serum albumin (BSA, Sigma-Aldrich) weighed in a micro test tube in 50 μl of pure water, 6 M guanidine, 2 mM EDTA, 0.5 M Tris-HCl buffer (PH 8.1) 150 μl was added, and 922 μg (6 μmol) of dithiothreitol was further added. After the inside of the vessel was replaced with nitrogen, reduction was carried out at 50 ° C. for 4.5 hours. Subsequently, 2.2 mg of monoiodoacetic acid dissolved in 52.8 μl of a 0.2 N aqueous sodium hydroxide solution was added. After reacting at room temperature for 2 hours, excess reagent was removed by gel filtration chromatography. Gel filtration chromatography was performed under the conditions shown in Table 1 below.
[0033]
[Table 1]

[0034]
The protein fraction was collected, the solvent was removed with a vacuum centrifugal concentrator, and the residue was dried.
[0035]
BSA that had been subjected to reductive carboxymethylation as described above was dissolved in 45 μl of 50 mM ammonium bicarbonate buffer (pH 7.9), and 45 μl of 50 mM ammonium bicarbonate buffer in which 9 μg of trypsin had been dissolved was added. Subsequently, after adding 438 μl of acetonitrile, digestion was performed at 37 ° C. for 1 hour. After trypsin digestion, 1 ml of a 0.1% TFA aqueous solution was added to the reaction solution, and the mixture was concentrated to about 25 μl by a reduced-pressure centrifugal concentrator. This sample was appropriately diluted with 0.1% TFA, and 5 μl was subjected to capillary LC / MS / MS.
[0036]
In addition, an ion source (thermofinigan metal needle) using a stainless steel thin tube of normal size (inner diameter 120 μm, outer diameter 0.8 mm, length 14 cm) is attached and connected to the same HPLC system as a conventional electrospray ion source. And compared. The obtained data was subjected to spectrum assignment using a protein identification software SEQUEST (manufactured by Thermofinigan).
[0037]
As a result, when the stainless steel thin tube having the inner diameter of the inner tube of 30 μm, the outer diameter of the outer tube of 300 μm, and the length of 3 cm is used as the ion source, a good mass chromatogram can be obtained with an injection amount of 50 fmol. As a result, 43% of the amino acid sequence could be identified (FIG. 10 (a)). With the conventional ion source, similar data could be obtained when about 500 fmol of the sample was injected (FIG. 10 (b)).
[0038]
In addition, continuous measurement was performed for 15 days using a tryptic digest of glucagon, and no difference was observed in the ionic strength between the start and end of the measurement, indicating that the durability and robustness were high (No. 11). Figure).
[0039]
Example 8 (nano LC / MS / MS, “mass spectrometer LCQ”)
In the ultrafine tube of the present invention, a stainless steel thin tube having an inner tube having an inner diameter of 30 μm, an outer tube having an outer diameter of 300 μm, and a length of 3 cm was manufactured using a fused silica nano-electrospray tip mounting system (“PicoTip mounting system” manufactured by NewObjective). Thermo mass spectrometer LCQ) and Thermofinigan mass spectrometer LCQ. The HPLC system uses an autosampler (LC Packing's “FAMOS”), a switching valve system (LC Packing's “Swichos”), a low flow gradient pump (LC Packing's “Ultimate”), and the nanocolumn has an inner diameter of 75 μm. An ODS column having a length of 150 mm ("PepMap" manufactured by LC Packings) and an ODS column having an inner diameter of 0.3 mm and a length of 1 mm were used as the concentration column. Nano LC / MS / MS was measured by combining the HPLC system and the mass spectrometer described above. As a result of measuring a tryptic digest of about 50 fmol of myoglobin, a good mass chromatogram could be obtained. From the obtained CID (collision induced dissociation) spectrum, 40% of the primary sequence of myoglobin could be analyzed (FIG. 12).
[0040]
【The invention's effect】
The ultra-fine tube for nano-spray ionization of the present invention makes it possible to stably ionize a solution sample at an extremely low flow rate, so that it can be used for nano-LC or capillary electrophoresis, which is an HPLC using a column with a small inner diameter. The connection makes it possible to construct an ultra-trace LC / MS / MS system that can withstand continuous measurement. Further, connection with a low flow rate separation device such as microchip electrophoresis has become possible. In addition, the nano-spray ionization ultrafine tube of the present invention has significantly improved strength and durability as compared with conventional ones, so that clinical tests, large-scale proteomics, It can be used for ultra-high sensitivity analysis in metabolomics, environmental analysis of environmental hormones and soil pollutants, pharmacokinetic studies, active substance screening, etc. Furthermore, the use of the nano-spray ionization ultrafine tube of the present invention allows the sample to be ionized without applying heat, thereby enabling mass spectrometry of a thermally unstable compound. In addition, it has become possible to directly measure noncovalent complexes such as protein-low molecule, protein-protein, and protein-nucleic acid.
[0041]
Further, the ultrafine tube for nano-spray ionization of the present invention can be applied not only to the electrospray ionization method but also to a laser spray ionization method and a sonic spray ionization method which are ionization methods by laser irradiation.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows an outline of production of a nano-spray ionization tube for nano-spray for mass spectrometry of the present invention (Example 1).
FIG. 2 shows the structure of an inner tube in a nano-spray ionizer for mass spectrometry according to the present invention. (Example 1).
FIG. 3 shows an evaluation example (flow rate) of the ultrafine tube for nano-spray ionization for mass spectrometry of the present invention.
FIG. 4 shows an evaluation example (concentration) of an ultrafine tube for nanospray ionization for mass spectrometry according to the present invention.
FIG. 5 shows an example of use (flow rate) and temperature of the ultrafine tube for nano-spray ionization for mass spectrometry of the present invention (Example 5).
FIG. 6 shows a usage example of the nano-spray ionization tube for mass spectrometry according to the present invention (Example 5).
FIG. 7 shows an example of use of the ultrafine tube for nanospray ionization for mass spectrometry of the present invention (Example 5).
FIG. 8 shows an example of use of the ultrafine tube for nanospray ionization for mass spectrometry of the present invention (Example 5).
FIG. 9 shows an example of using the ultrafine tube for nanospray ionization for mass spectrometry of the present invention (Example 6).
FIG. 10 shows a usage example of the nano-spray ionization tube for mass spectrometry according to the present invention (Example 7).
FIG. 11 shows an example of use of the ultrafine tube for nanospray ionization for mass spectrometry of the present invention (Example 7).
FIG. 12 shows an example of using the ultrafine tube for nano-spray ionization for mass spectrometry of the present invention (Example 8).

Claims

An ultrafine tube for nanospray ionization for mass spectrometry, wherein the inner tube of a metal or ceramic conductive material having an inner diameter of 50 μm or less is covered with an outer tube of a metal or conductive ceramic material.

2. The ultrafine tube for nano-spray ionization for mass spectrometry according to claim 1, wherein the inner tube has a tapered outer wall at one end, and the tapered end has a shape having an end surface of 10 μm or more.

3. The nano-spray ionizer for mass spectrometry according to claim 1, wherein the inner tube has a taper on an outer wall at one end thereof, and a tapered tip forms a point with the taper and the inner diameter wall. Extra fine tube.

The tip of the outer tube is fixed at a point where a taper provided on the outer wall of the inner tube reaches the outer diameter of the inner tube or at an upstream point in the sample flow direction therefrom. The ultrafine tube for nano-spray ionization for mass spectrometry described.