JP2004313025A - Method for inducing change of spiral structure of dna with polycarbazole derivative, and method for utilizing the same - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for inducing the change of the spiral structure of a double-stranded DNA with a polycarbazole derivative and an acid without adding a high concentration acid or an alcohol to the aqueous solution of the double-stranded DNA, and a method for utilizing the same, and the like. <P>SOLUTION: The method for inducing the change of the spiral structure of the double-stranded DNA is characterized by having a process for mixing the double-stranded DNA, a polycarbazole derivative and a substance for receiving an electron from the polycarbazole derivative. Thereby, the spiral structure of the double-stranded DNA can be changed, for example, from a B type DNA structure to a Z type DNA structure. The method for inducing the change of the spiral structure of the double-stranded DNA can be applied to a DNA switching system, a method for detecting a specific base sequence, and the like. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【００２３】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、それぞれ水素原子、炭素数１〜３０のアルコキシル基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、フェニル基またはナフチル基等の芳香族基から選ばれる基を示し、上記アルコキシル基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、フェニル基またはナフチル基等の芳香族基は当該分子中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子、及び／又は硫黄原子で置換されていてもよく、さらに上記アルコキシル基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、フェニル基またはナフチル基等の芳香族基は、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、およびアンモニウム基等から選ばれる置換基を有していてもよく、また、ｎは１以上の正の整数を示す。）
で表される化合物であることが好ましい。なかでも、特に上記ポリカルバゾール誘導体は、下記の化学式（２）、
【００２４】
【化５】

【００２５】
（Ｒ９は、水素原子、メチル基、エチル基のいずれかを示し、ｍ、ｎはそれぞれ１以上の正の整数を示す。）
で表されるアルキルエーテル側鎖ポリカルバゾールであることが好ましい。
【００２６】
また、上記ポリカルバゾール誘導体は、下記の化学式（３）、
【００２７】
【化６】

【００２８】
（ｎは１以上の正の整数を示す。）
で表されるアルキルエーテル側鎖ポリカルバゾールであることがより好ましい。
【００２９】
また、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法は、上記二本鎖ＤＮＡのらせん構造の変化とは、Ｂ型ＤＮＡ構造からＺ型ＤＮＡ構造への変化、またはＺ型ＤＮＡ構造からＢ型ＤＮＡ構造への変化であることを特徴としている。
【００３０】
上記の方法によれば、二本鎖ＤＮＡのらせん構造を、Ｂ型ＤＮＡ構造からＺ型ＤＮＡ構造へと、またはＺ型ＤＮＡ構造からＢ型ＤＮＡ構造へと大きく変化させることができる。
【００３１】
また、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法は、上記二本鎖ＤＮＡは、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列を有していることを特徴としている。
【００３２】
二本鎖ＤＮＡの塩基配列中に、上記の塩基配列を有していれば、確実、かつ効率的に二本鎖ＤＮＡのらせん構造を変化させることができる。
【００３３】
また、本発明にかかるＤＮＡスイッチは、上記のＤＮＡらせん構造変化誘導方法を利用していることを特徴としている。
【００３４】
上記の構成によれば、二本鎖ＤＮＡのらせん構造の変化という現象をスイッチの切換（スイッチのオン−オフ切換）として利用することで、二本鎖ＤＮＡをスイッチとして利用することができる。これによって、本発明にかかるＤＮＡスイッチは、例えば、極微細な構造体であるナノマテリアル、特にナノマテリアル中に生体物質の特徴を利用したナノバイオマテリアルのスイッチングシステムとして利用することができる。
【００３５】
また、本発明にかかる塩基配列検出方法は、上記のＤＮＡらせん構造変化誘導方法を利用することによって、二本鎖ＤＮＡ中の特定の塩基配列を選択的に検出または定量することを特徴としている。また、本発明にかかる塩基配列検出キットは、上記のＤＮＡらせん構造変化誘導方法を利用して、二本鎖ＤＮＡ中の特定の塩基配列を選択的に検出または定量する塩基配列検出キットであって、ポリカルバゾール誘導体とポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質とを含んでいることを特徴としている。
【００３６】
上記の構成によれば、二本鎖ＤＮＡ中に含まれる特定の塩基配列を選択的に検出または定量することが可能である。すなわち、調査対象である二本鎖ＤＮＡにおけるらせん構造の変化の有無、および／または、らせん構造の変化の程度等を指標として、その二本鎖ＤＮＡ中に含まれる特定の塩基配列を選択的に検出・定量することができる。さらに、二本鎖ＤＮＡ中のどの位置に、当該特定の塩基配列がどの程度の鎖長で存在しているのかといった情報も取得することが可能となる。なお、らせん構造の変化の有無や変化の程度を調べるための方法としては、例えば、ＣＤスペクトルまたはＵＶスペクトルを測定する等の従来公知の方法を利用できる。
【００３７】
なお、この「特定の塩基配列」としては、例えば、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列等が挙げられる。
【００３８】
また、本発明にかかる疾患の発症等の判定方法は、上記のＤＮＡらせん構造変化誘導方法を利用して、二本鎖ＤＮＡ中の特定の塩基配列を選択的に検出または定量することにより、疾患の発症または疾患の発症危険性を判定することを特徴としている。また、本発明にかかる疾患の発症等の判定キットは、上記のＤＮＡらせん構造変化誘導方法を利用して、二本鎖ＤＮＡ中の特定の塩基配列を選択的に検出または定量することにより、疾患の発症または疾患の発症危険性を判定する疾患判定キットであって、ポリカルバゾール誘導体とポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質とを含んでいることを特徴としている。
【００３９】
上記の構成によれば、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列等を有することが原因の１つとなって引き起こされる種々の疾患の発症を、または発症の危険性を、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列等を有するか否かを検出することにより、非常に簡便に、判定することができる。
【００４０】
【発明の実施の形態】
本発明は、塩強度依存的あるいはアルコール強度依存的にのみ、らせん構造の変化や構造多型を示すと考えられていた塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡと、アルキルエーテル側鎖ポリカルバゾールとを混合させることによって、該二本鎖ＤＮＡにおけるらせん構造を簡便かつ効率的に変化させることのできる手段を提供するとともに、この手段の利用方法を提案するものである。そこで以下では、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法について説明し、次いでこれらＤＮＡらせん構造変化誘導方法の利用方法について説明することとする。
【００４１】
本発明のＤＮＡらせん構造変化誘導方法、およびその利用方法に関する実施の一形態について図１〜図９に基づいて説明すれば以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４２】
（１）本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法
本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法は、二本鎖ＤＮＡのらせん構造の変化を誘導するためのＤＮＡらせん構造変化誘導方法であって、二本鎖ＤＮＡと、ポリカルバゾール誘導体と、ポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質とを混合させる工程を有していればよく、その他の工程や条件については特に限定されるものではない。
【００４３】
本発明でいう「ポリカルバゾール誘導体」とは、いわゆるポリジベンゾピロール誘導体をいい、炭素原子（Ｃ）と窒素原子（Ｎ）とを分子中に含む複素環式化合物（五員環または六員環構造を含む）の多量体であり、共役二重結合またはこれに近い結合様式を有するものであればよく、特に限定されるものではない。
【００４４】
上記ポリカルバゾール誘導体の構造を下記化学式（１）に示す。
【００４５】
【化７】

【００４６】
上記化学式（１）中のＲ１〜Ｒ７は、それぞれ水素原子、炭素数１〜３０のアルコキシル基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、フェニル基またはナフチル基等の芳香族基から選ばれる基を示し、上記アルコキシル基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、フェニル基またはナフチル基等の芳香族基は当該分子中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子、及び／又は硫黄原子で置換されていてもよく、さらにこれらの基は、水に溶解または分散しやすいように、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、およびアンモニウム基等から選ばれる置換基を有していることが好ましい。また、ｎは１以上の正の整数であればよく、特に限定されるものではない。なお、分子量としては、特に１０００〜数千万の範囲であることが好ましい。
【００４７】
上記ポリカルバゾール誘導体としては、アルキルエーテル側鎖を有するポリカルバゾール誘導体であることが好ましい。例えば、下記化学式（２）、（３）に示す構造を有するアルキルエーテル側鎖ポリカルバゾールが挙げられる。
【００４８】
【化８】

【００４９】
（Ｒ９は、水素原子、メチル基、エチル基のいずれかを示し、ｍ、ｎはそれぞれ１以上の正の整数を示す。）
【００５０】
【化９】

【００５１】
（ｎは１以上の正の整数を示す。）
また、上記ポリカルバゾール誘導体の製造方法としては、後述する実施例に示す合成方法のほか、従来公知の化学合成によって製造することができ、また、市販のものを使用することも可能であり、特に限定されるものではない。
【００５２】
また、本発明でいう「ポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質」とは、ポリカルバゾール誘導体をカチオン化させる物質であればよい。また換言すれば、ポリカルバゾール誘導体の分子中の窒素分子（Ｎ）の非共有電子対と静電的に相互作用し、当該窒素原子をＮＲ_４ ^＋（アンモニウム化合物、Ｒは任意の置換基）構造へと変化させる物質であればよく、特に限定されるものではない。また、「ポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質」とは、ポリカルバゾール誘導体に水素イオン（Ｈ＋）を付与する物質と換言できる。
【００５３】
かかる物質としては、例えば、「酸」が挙げられる。ここでいう「酸」とは、蟻酸、酢酸、クエン酸等の有機酸、塩酸、硫酸、硝酸等の無機酸を含み、特に限定されるものではない。なかでも、特に塩酸が好ましい。
【００５４】
また、本発明に用いられる「二本鎖ＤＮＡ」は、例えばクローニングや化学合成技術またはそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、およびオリゴＤＮＡ等であればよい。また、二本鎖ＤＮＡの鎖長は特に限定されるものではない。
【００５５】
上記二本鎖ＤＮＡは、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列の塩基配列を有していることが好ましい。これは、後述する実施例に示すように、上記の塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡは、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法によって、効率的にらせん構造の変化を誘導することができるためである。なお、「ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列」とは、グアニン（ｄＧ）−シトシン（ｄＣ）配列の２以上の繰り返し配列をいい、単なる（ｄＧ−ｄＣ）・（ｄＧ−ｄＣ）配列をも含むものである。
【００５６】
また、「二本鎖ＤＮＡのらせん構造」には、例えば、図８（ｂ）に示すように、Ｂ型ＤＮＡ構造、Ｚ型ＤＮＡ構造、Ａ型ＤＮＡ構造、Ｃ型ＤＮＡ構造等が挙げられる。
【００５７】
また、「二本鎖ＤＮＡのらせん構造の変化」としては、図８（ｂ）に示すように、上記Ｂ型ＤＮＡ構造からＺ型ＤＮＡ構造、Ａ型ＤＮＡ構造、またはＣ型ＤＮＡ構造への変化、あるいは逆の、Ｚ型ＤＮＡ構造、Ａ型ＤＮＡ構造、またはＣ型ＤＮＡ構造からＢ型ＤＮＡ構造への変化等が挙げられるが、特に、Ｂ型ＤＮＡ構造からＺ型ＤＮＡ構造への変化、またはその逆のＺ型ＤＮＡ構造からＢ型ＤＮＡ構造への変化であることが好ましい。
【００５８】
また、「二本鎖ＤＮＡ、ポリカルバゾール誘導体、およびポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質を混合させる工程」とは、ポリカルバゾール誘導体とポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質とを相互作用させ、ポリカルバゾール誘導体をカチオン化させることにより、アニオンの二本鎖ＤＮＡと上記カチオン化したポリカルバゾール誘導体との複合体を形成させ、二本鎖ＤＮＡとポリカルバゾール誘導体との間に電荷移動を発生させる工程であればよい。
【００５９】
このため、本発明でいう「ポリカルバゾール誘導体」は、例えば、カチオン化することにより、静電的相互作用によって二本鎖ＤＮＡと複合体を形成でき、二本鎖ＤＮＡとの間で電荷移動を行うことができる導電性高分子であると換言できる。なお、「電荷移動を行う」とは、例えば、ポリカルバゾール誘導体から二本鎖ＤＮＡに対して電子が供給される場合でも、逆に、二本鎖ＤＮＡからポリカルバゾール誘導体に対して電子が供給される場合のどちらであってもよい。
【００６０】
また、通常二本鎖ＤＮＡは水溶液に溶解するため、本発明における二本鎖ＤＮＡと、ポリカルバゾール誘導体と、ポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質とを混合する工程も、原則として水溶液中で行われる。しかし、何らかの処理により、二本鎖ＤＮＡおよびポリカルバゾール誘導体が水溶液以外の極性または非極性の有機溶媒に溶解可能となる場合、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法は、極性または非極性の有機溶媒中でも行うことができる。例えば、後述する実施例でも示すように、ポリカルバゾール誘導体を溶解または分散させるためにＴＨＦ（テトラヒドロフラン）等の従来公知の溶媒を用いることもでき、これらの溶媒の下で、またはこれらの溶媒と水溶液とを混合した状態でも本発明のＤＮＡらせん構造変化誘導方法を実施することができる。
【００６１】
さらに、本発明のＤＮＡらせん構造変化誘導方法は、固体フィルム、またはキャストフィルム中でも行うことができる。すなわち、上記ポリカルバゾール誘導体を担体に固定した状態で、ＤＮＡと混合することによっても、本発明を実施することができる。なお、ポリカルバゾール誘導体を担体に固定する方法としては、例えば、カルバゾール誘導体の分子中の側鎖部分等から担体に固定化するための「枝」を伸長させ結合させる等の従来公知の化学的、物理的な方法を利用することができ、特に限定されるものではない。
【００６２】
また、「担体」とは、ポリカルバゾール誘導体をチップ、センサー、またはプレート等の担体（化合物の機能を阻害しないもの）に固定化したもの又は固定化され得るように「枝」をのばした状態の化合物をいう。なお、上記のように、硫黄を含む化合物（例えば、メルカプト基を含む化合物）は、その分子を固定化（例えばチップなどに固定化）するときに、その固定化が容易となる。
【００６３】
また、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法、すなわち、本発明における二本鎖ＤＮＡと、ポリカルバゾール誘導体と、ポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質（例えば、酸）とを混合する工程の条件は、特に限定されるものではない。具体的には、例えば、ポリカルバゾール誘導体と、ポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質（例えば、酸）とが相互作用し、ポリカルバゾール誘導体がカチオン化されることにより、二本鎖ＤＮＡとポリカルバゾール誘導体とが静電的相互作用によって複合体を形成し、二本鎖ＤＮＡとポリカルバゾール誘導体との間で電荷移動が発生するような緩衝液等が含まれていればよい。また、その他の反応条件、例えば、二本鎖ＤＮＡの濃度や種類、ポリカルバゾール誘導体（例えば、アルキルエーテル側鎖ポリカルバゾール等）の濃度や種類、ポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質（例えば、酸）の濃度や種類、混合時の反応温度や反応時間、ｐＨ、塩の濃度（使用するバッファーの種類）等については適宜設定可能であり、特に限定されるものではない。なお、二本鎖ＤＮＡ、ポリカルバゾール誘導体（例えば、アルキルエーテル側鎖ポリカルバゾール）、およびポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質（例えば、塩酸）を混合する比率としては、例えば、後述する実施例に示すように、Ａ２６０＝１．０となるように調製した二本鎖ＤＮＡを２．４ｍｌ、アルキルエーテル側鎖ポリカルバゾール１×１０^−３Ｍ／ＴＨＦを５０μｌ、１ｍＭのＨＣｌを５０μｌ〜３００μｌの範囲で加えることにより、効果的に二本鎖ＤＮＡのらせん構造を変化させることができる。その他にもポリカルバゾール誘導体と、ポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質（例えば、ＨＣｌ）とは、モル比１：０．０１〜１０の範囲で混合することが好ましく、また、ポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質（例えば、ＨＣｌ）と、ＤＮＡとは、モル比１：３０〜９０の範囲で混合することが好ましい。上記のモル比でポリカルバゾール誘導体、ポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質（例えば、ＨＣｌ）ＤＮＡを混合することにより、効果的に二本鎖ＤＮＡのらせん構造を変化させることができる。
【００６４】
さらに、ポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質（例えば、酸）の添加量を変化させることにより、二本鎖ＤＮＡのらせん構造の変化の程度を調整することができる。例えば、後述する実施例に示すように、ポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質として使用している塩酸の添加量を増加させるにつれ、二本鎖ＤＮＡのらせん構造の変化が大きくなっている。したがって、ポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質（例えば、酸）の添加量を調整することにより、二本鎖ＤＮＡのらせん構造の変化を制御でき、用途に応じたらせん構造の変化を誘導できると考えられる。
【００６５】
また、二本鎖ＤＮＡ、ポリカルバゾール誘導体、およびポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質（例えば、酸）を混合させる工程では、ポリカルバゾール誘導体中にカチオンが発生することが非常に好ましく、例えば、酸性領域のｐＨであることが好ましいが、特に限定されるものではない。この他にも、例えば、ポリカルバゾール誘導体がカチオン化する物質を添加剤として用いることによっても、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法を実施することが可能である。
【００６６】
以上のように、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法を用いることによって、塩強度依存的あるいはアルコール強度依存的に構造変化や構造多型を示す塩基配列（例えば、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列等）を有する二本鎖ＤＮＡであっても、塩濃度やアルコール濃度を高めることなく、二本鎖ＤＮＡのらせん構造を簡便かつ効率的に変化させることができる。すなわち、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法を用いることによって、例えば、図１（ａ）に示すように、二本鎖ＤＮＡのらせん構造を、Ｂ−Ｚ転位、Ｚ−Ｂ転位のように変化させることができる。また、その他にも、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法を用いることによって、例えば、二本鎖ＤＮＡのらせん構造をＢ−Ａ転位またはＡ−Ｂ転位のように変化させることもできる可能性がある。
【００６７】
したがって、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法は、以下のように利用することができる。
【００６８】
（２）本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法の利用方法
（２−１）ＤＮＡスイッチ
本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法は、ＤＮＡスイッチとして利用することができる。
【００６９】
すなわち、本発明にかかるＤＮＡスイッチは、上記ＤＮＡらせん構造変化誘導方法を利用していればよく、その他の構成は特に限定されるものではない。
【００７０】
上記の構成によれば、二本鎖ＤＮＡのらせん構造の変化という現象を、スイッチのオン−オフ切換として利用し、ＤＮＡスイッチとして利用することができる。このＤＮＡスイッチとしては、例えば、Ｂ型ＤＮＡ構造をスイッチオフ状態とした場合に、図１（ａ）に示すように、Ｂ型ＤＮＡ構造からＺ型ＤＮＡ構造にＤＮＡのらせん構造が変化した場合にスイッチオン状態に切り替わるＤＮＡスイッチ等を挙げることができるが、この逆も可能であり、これに限定されるものではない。
【００７１】
また、本発明にかかるＤＮＡスイッチは、図１（ａ）に示すように、可逆的なＤＮＡスイッチとして利用することも可能である。すなわち、従来のように塩濃度を高めることによってＢ−Ｚ転位を発生させる場合は可逆的なスイッチングが困難であるが、本発明のようにポリカルバゾール誘導体とポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質（例えば、酸）とを用いてＤＮＡのらせん構造の変化を誘導する場合は、ポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質（例えば、酸）の濃度の変化や、電場等の外部刺激によってもポリカルバゾール誘導体の荷電状態をコントロールすることができるため、ＤＮＡらせん構造を可逆的に変化させることが可能であり、その結果として可逆的なスイッチングが可能となる。
【００７２】
このようなＤＮＡスイッチは、二本鎖ＤＮＡにおけるらせん構造の変化（例えば、Ｂ−Ｚ転位、Ｚ−Ｂ転位、Ｂ−Ａ転位、またはＡ−Ｂ転位等）といった、大きな構造変化をスイッチングシステムとして利用するものである。このため、スイッチのオン−オフを確実に切り換えることが可能である。さらに、上記ＤＮＡスイッチは、非常に微細なスイッチであるため、例えば、本発明にかかるＤＮＡスイッチングシステムは、極微細な構造体であるナノマテリアル、特にナノマテリアル中に生体物質の特徴を利用したナノバイオマテリアルのスイッチングシステムとして利用することができる。
【００７３】
（２−２）塩基配列検出方法、塩基配列検出キット、疾患等の判定方法、及び疾患等の判定キット
また、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法は、塩基配列検出方法および塩基配列検出キットとして利用することもできる。
【００７４】
すなわち、本発明にかかる塩基配列検出方法は、上記ＤＮＡらせん構造変化誘導方法を利用していればよく、その他の工程、条件等は特に限定されるものではない。また、本発明に係る塩基配列検出キットも、上記ＤＮＡらせん構造変化誘導方法を利用していればよく、その他の構成は特に限定されるものではない。
【００７５】
すなわち、本発明にかかる塩基配列検出方法または塩基配列検出キットは、上記ＤＮＡらせん構造変化誘導方法を利用することによって、二本鎖ＤＮＡのらせん構造の変化の有無、および／または、らせん構造の変化の程度等を調べ、その二本鎖ＤＮＡ中に含まれる特定の塩基配列を選択的に検出・定量する方法またはキットであればよい。
【００７６】
具体的には、本発明にかかる塩基配列検出方法または塩基配列検出キットを利用することによって、調査対象となる二本鎖ＤＮＡ中に、特定の塩基配列、例えば、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列が含まれているか否かを選択的に検知、判断することができる。
【００７７】
これは、後述の実施例に示すように、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列は、上記ポリカルバゾール誘導体とポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質（例えば、酸）とともに混合することによって、ＤＮＡのらせん構造を変化させる特性を有しているためである。
【００７８】
したがって、例えば、調査対象となる二本鎖ＤＮＡと上記ポリカルバゾール誘導体とを混合させ、当該二本鎖ＤＮＡのらせん構造がＢ型ＤＮＡ構造からＺ型ＤＮＡ構造に変化する場合は、上記ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列が含まれていると判断できる。逆に、当該二本鎖ＤＮＡのらせん構造が変化しない場合は、上記ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列が含まれていないと判断できる。これは、後述の実施例に示すように、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法によれば、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列は、Ｂ−Ｚ転位またはＺ−Ｂ転位を起すと推測されるためである。
【００７９】
さらに、調査対象である二本鎖ＤＮＡにおけるらせん構造の変化の程度を指標とすることにより、当該二本鎖ＤＮＡ中に特定配列が、どの位置に、どの程度（鎖長、塩基数等）含まれるかを選択的に検出（特定）・定量することも可能である。
【００８０】
すなわち、上記ポリカルバゾール誘導体と特定の塩基配列とを混合した場合、特定の塩基配列がどのような挙動を示すのか、例えば、特定の塩基配列のらせん構造がどの程度変化するのか等の特徴的な情報を予め調べておくことにより、調査対象となる二本鎖ＤＮＡ中に、当該特定配列がどの位置に、どの程度の鎖長の塩基配列として存在するのか調べることが可能となる。なお、特定の塩基配列と上記ポリカルバゾール誘導体とポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質（例えば、酸）とを混合した際に生じる、特定の塩基配列（ＤＮＡ）／ポリカルバゾール誘導体複合体の示す挙動を調べるための方法としては、例えば、後述する実施例に示すように、特定の塩基配列（ＤＮＡ）／ポリカルバゾール誘導体複合体についての円二色信号（ＣＤスペクトル）、または紫外・可視吸収スペクトル（ＵＶ−ｖｉｓスペクトル）を測定する方法等の従来公知の方法が挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００８１】
具体的には、例えば、後述する実施例に示すように、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列と、上記ポリカルバゾール誘導体であるアルキルエーテル側鎖ポリカルバゾールとを混合することによって生じるＤＮＡのらせん構造の変化は、ＵＶスペクトル測定における２９０ｎｍのピークを指標に鋭敏に検出することができるという点で特徴的である。
【００８２】
したがって、本発明の塩基配列検出方法等によれば、例えば、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列を簡便かつ選択的に検出・定量することができる。
【００８３】
ここで、例えば、二本鎖ＤＮＡ中に含まれる（ｄＧ−ｄＣ）配列の量、すなわち（ｄＧ−ｄＣ）塩基配列の含有量は、二本鎖ＤＮＡにおける一塩基多型（ＳＮＰｓ）の発生の主要因の一つと考えられている。この理由の一部として、ＣｐＧジヌクレオチド中のメチル化されたシトシン（ｄＣ）が脱アミノ化を受けてチミン（ｄＴ）に変異する傾向があることが挙げられている。これにより、ＣｐＧジヌクレオチドの変異速度は、他のジヌクレオチドに比べて約１０倍程度高くなっている。
【００８４】
そのため、本発明にかかる塩基配列検出方法、および塩基配列検出キットにより、例えば、二本鎖ＤＮＡ中における（ｄＧ−ｄＣ）塩基配列の含有量を定量的に検出することによって、ＳＮＰｓの発生や、ＳＮＰｓによって引き起こされる遺伝子疾患の簡便な検出方法等を開発できる可能性がある。
【００８５】
さらに、図８（ｂ）に示すような、Ｂ型ＤＮＡ構造やＺ型ＤＮＡ構造をはじめとした構造多型等についての二本鎖ＤＮＡのコンフォメーション情報を得ることができる。
【００８６】
上記二本鎖ＤＮＡのコンフォメーションの一つである、Ｚ型ＤＮＡ構造（左巻きらせんＤＮＡ構造）は、全身性紅斑性狼瘡等の自己免疫疾患に関与していると考えられている。したがって、本発明にかかる塩基配列検出方法、または塩基配列検出キットによって、Ｚ型ＤＮＡ構造になり得る塩基配列を簡便に検出することにより、これらの疾患の早期検出デバイス、早期発見方法、治療方法、および治療剤等の開発に寄与することができる可能性がある。
【００８７】
すなわち、本発明には、上記のＤＮＡらせん構造変化誘導方法を利用して塩基配列を検出または定量することにより、疾患の発症または発症危険性の判定を行う方法や判定デバイス（判定キット等）も含まれる。なお、ここでいう、「疾患」には、上記ＤＮＡらせん構造変化誘導方法によってＤＮＡのらせん構造が変化する特定の塩基配列を有することを指標として、発症を予測できる疾患であればよく、特に限定されるものではない。具体的には、例えば、上述した自己免疫疾患（例えば、全身性紅斑性狼瘡等）、または一塩基多型による種々の遺伝子の機能変化によって引き起こされる疾患（例えば、癌等）が挙げられる。また、本発明でいう「判定キット」とは、疾患の判定等を行うことができる物であればよく、特に限定されるものではない。具体的には、紙、チップ、センサー、またはプレート等の担体（化合物の機能を阻害しないもの）にポリカルバゾール誘導体を固定化したもの、試薬を組み合わせた物等が挙げられる。
【００８８】
なお、「疾患の発症を判定する」とは、疾患が発症しているか否かを検出することをいい、「疾患の発症危険性を判定する」とは、疾患が発症する危険性があるか否か、および／または、その危険性がどの程度あるのかについて判定することをいう。
【００８９】
また、従来、ＤＮＡ中の特定の塩基配列を検出する方法としては、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ法（Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， ２０００， ７２， ｐ３７１７−３７２４）、ＲＩ法、ＰＣＲによる増幅後ＤＮＡシークエンサーによる解読する方法、制限酵素による選択的切断と電気泳動法（野島 博著、「遺伝子工学の基礎」、東京化学同人）、およびマススペクトロメトリー法（質量分析法）（Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， ２００１， ７３， ｐ２１２６−２１３１）等が知られていたが、これらの方法は、いずれも操作等が煩雑、難解であったり、複雑な機器等を利用する必要があったりと、簡便な方法とはいい難いかった。
【００９０】
しかし、本発明にかかる塩基配列検出方法、および塩基配列検出キットは、上述したように、調査対象の二本鎖ＤＮＡと上記ポリカルバゾール誘導体とポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質（例えば、酸）とを混合させ、ＣＤスペクトル、またはＵＶスペクトル等を測定して、ＤＮＡらせん構造の変化の有無、および／または変化の程度等を調べるのみで特定の塩基配列を検出・定量することができる。したがって、本発明にかかる塩基配列検出方法、および塩基配列検出キットは、従来のＤＮＡ中の特定の塩基配列検出方法と比較して、より簡便、かつ容易に、二本鎖ＤＮＡ中に含まれる特定の塩基配列を検出・定量することができるといえる。
【００９１】
以下添付した図面に沿って実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【００９２】
【実施例】
まず、本実施例に用いた二本鎖ＤＮＡ、ポリカルバゾール誘導体、および簡単な実験方法について図２を用いて説明する。
【００９３】
図２に示すように、本実施例では、二本鎖ＤＮＡとして（ｄＧ−ｄＣ）_８を用いた。また、ポリカルバゾール誘導体は、上記化学式（３）に示されるアルキルエーテル側鎖ポリカルバゾールをＴＨＦ（テトラヒドロフラン）と混合し、１×１０^−３Ｍに調整して用いた。
【００９４】
なお、本実施例で用いたアルキルエーテル側鎖ポリカルバゾールの合成方法を図９の合成スキームに従って、以下に簡単に説明する。
【００９５】
まず、１−Ｃｈｌｏｒｏ−３，６，９，１２−ｔｒｅｔｒａｏｘｔｅｔｒａｄｅｃａｎｅを合成した（Ｍ． Ｆｕｊｉｋｉ， Ｓ． Ｔｏｙｏｄａ， Ｃ．−Ｈ． Ｙｕａｎ ａｎｄ Ｈ．Ｔａｋｉｇａｗａ， Ｃｈｉｒａｌｉｔｙ， １０， ６６７−６７５ （１９９８））。続いて、１−Ｂｒｏｍｏ−３，６，９，−ｔｒｉｏｘｏｕｎｄｅｃａｎｅを合成した（Ｃａｒｌ Ｄ． Ｐｅｒｃｈｏｎｏｃｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ２９， １４４２−１４５２ （１９８６））。次に、９−Ｎ−（３’，６’−ｄｉｏｘｏｏｃｔｙｌ）−３，６−ｄｉｂｒｏｍｏｃａｒｂａｚｏｌｅを合成した（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｅ． Ｗｒｉｇｈｔ ａｎｄ Ｍｙｕｎｇ−Ｊｏｎｇ Ｊｉｎ， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， １９８９， ５４， ９６５−９６８）。そして、９−Ｎ−（３’，６’９’−ｔｒｉｏｘｏｎｕｄｅｃｙｌ）−３，６−ｄｉｂｒｏｍｏｃａｒｂａｚｏｌｅを合成した。具体的には、１−Ｂｒｏｍｏ−３，６，９，−ｔｒｉｏｘｏｕｎｄｅｃａｎｅ（２．４１ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（２０ｍＬ）に、Ｋ_２ＣＯ_３（２．００ｇ、１４．５ｍｍｏｌ）と、３，６−ｄｉｂｒｏｍｏｃａｒｂａｚｏｌｅ（３．２５ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）を添加した。上記混合溶液を５０℃まで加温し、２４時間反応させた。室温まで混合溶液を冷却させた後、混合溶液を減圧下で濾過し、溶媒を除去した。残留物をクロマトグラフィーカラム（Ｈｅｘａｎｅ／ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ ｆｒｏｍ ２０ ： １ ｔｏ ３ ： １）にて精製した。
【００９６】
続いて、９−Ｎ−（３’，６’９’−ｔｒｉｏｘｏｎｕｄｅｃｙｌ）−３，６−ｄｉｂｒｏｍｏｃａｒｂａｚｏｌｅをポリマー化させた。具体的には、Ｎｉ（ＣＯＤ）_２（１．００ｇ、３．６４ｍｍｏｌ）、ＣＯＤ（３２８ｍｇ、３．０３ｍｍｏｌ）、およびＢｐｙ（５６９ｍｇ、３．６４ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下、水和ＤＭＦ３０ｍＬに溶解させた。上記混合溶液を０．５時間６０℃にて加温し、非水和ＤＭＦ溶液８ｍＬに溶解させたカルバゾールモノマー（１．３３７ｇ、３．０３ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。反応は、６０℃、２４時間、暗所にて行った。反応生成物は、マグネチックスターラーの入った５００ｍＬのメタノールに添加した。グレーの固形物を減圧濾過にて得て、室温、１晩、バキュームにて乾燥させた。上記生成物は、ＴＨＦ（１００ｍＬ）に溶解させた。透明な黄色液体を得るために、不溶性の固形物は、０．５μｍのポアサイズのメンブレンフィルターにて濾過して除去した。イソプロパノール（５０ｍＬ）を添加後、白色の固形物が沈殿し、上記固形物を遠心分離して、１晩、室温にてバキューム乾燥させて、生成物を得た（Ｚｈ． Ｂ． Ｚｈａｎｇ， Ｍ． Ｆｕｊｉｋｉ， Ｈ． Ｚｈ． Ｔａｎｇ， Ｍ． Ｍｏｔｏｎａｇａ ａｎｄ Ｔｏｒｉｍｉｔｓｕ、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ３５ （６） １９８８ （２００２））。
【００９７】
また、二本鎖ＤＮＡはＳＩＧＭＡ社より購入し、精製は行わずそのまま用いた。ＤＮＡは、Ａ２６０＝１．０になるようにｍｉｌｌｉＱで調整して、ＤＮＡ水溶液として実験に用いた。
【００９８】
また、各実験で行ったＣＤスペクトルは、温度：２５℃、開始波長：５００ｎｍ、終了波長：２００ｎｍ、感度：５０−１００ｍｄｅｇ、データ間隔：０．５ｎｍ、積算回数：５、バンド幅：２．０ｎｍ、レスポンス：１．０ｓｅｃ、走査速度：５０ｎｍ／ｍｉｎの条件で測定した。
【００９９】
また、ＵＶスペクトル（ＵＶ−ｖｉｓスペクトル）は、温度：２５℃、レスポンス：Ｆａｓｔ、バンド幅：５．０ｎｍ、走査速度：２００ｎｍ／ｍｉｎ、開始波長：５００ｎｍ、終了波長：２００ｎｍ、データ間隔：１．０ｎｍ、繰り返し：１の条件で測定した。
【０１００】
以下具体的な実験結果について説明する。
【０１０１】
（１）高塩濃度に伴うＤＮＡのらせん構造の変化の確認
まず、高塩濃度に伴う二本鎖ＤＮＡのＢ−Ｚ転位を確認した。具体的には、（ｄＧ−ｄＣ）_８水溶液２．４ｍｌ中に、ＮａＣｌを５Ｍとなるように加え、ＣＤスペクトル、およびＵＶ−ｖｉｓスペクトルの測定を行った。その結果をそれぞれ図５、図６に示す（図中、（ｄＧ−ｄＣ）_８／ＮａＣｌ ５Ｍで示す線）。なお、コントロールとして、上記ＤＮＡのみの水溶液についてのＣＤスペクトル、およびＵＶ−ｖｉｓスペクトルの測定を行い、その結果も併せて図示する。
【０１０２】
図５に示すように、（ｄＧ−ｄＣ）_８水溶液に５ＭとなるようにＮａＣｌを加えた場合のＣＤスペクトル（図中、（ｄＧ−ｄＣ）_８／ＮａＣｌ ５Ｍで示す）は、（ｄＧ−ｄＣ）_８のみの水溶液のＣＤスペクトル（（ｄＧ−ｄＣ）_８ ｏｎｌｙ）と異なる波形を示すことがわかった。これは、（ｄＧ−ｄＣ）_８水溶液中の塩濃度を５Ｍという高塩濃度に変化させた場合、これらの二本鎖ＤＮＡのらせん構造が変化したことを示している。
【０１０３】
また、図６に示すように、（ｄＧ−ｄＣ）_８／ＮａＣｌ ５Ｍ水溶液のＵＶ−ｖｉｓスペクトルは、（ｄＧ−ｄＣ）_８のみの水溶液のＵＶ−ｖｉｓスペクトルに比べて、約２９０ｎｍ付近にピークを有する。これは、フーグスティン型のスタッキング（図７参照）によるものであり、ＤＮＡのらせん構造の反転（Ｂ−Ｚ転位）がおこったときに出現するものである。
【０１０４】
以上のことから、高塩強度に伴って、（ｄＧ−ｄＣ）_８の塩基配列は、Ｂ型ＤＮＡ構造からＺ型ＤＮＡ構造へと変化することが確認できた。
【０１０５】
（２）アルキルエーテル側鎖ポリカルバゾールの添加によるＤＮＡのらせん構造変化について
次に、アルキルエーテル側鎖ポリカルバゾールと、二本鎖ＤＮＡ（ｄＧ−ｄＣ）_８とを混合した溶液に、ＨＣｌを添加した場合、二本鎖ＤＮＡ（ｄＧ−ｄＣ）_８のらせん構造が変化するか否かを調べた。
【０１０６】
具体的には、上述の方法で合成したアルキルエーテル側鎖ポリカルバゾール１×１０^−３Ｍ／ＴＨＦを５０μｌ添加混合した（ｄＧ−ｄＣ）_８溶液に、ＨＣｌを５０μｌずつ添加していった場合の溶液についてＣＤスペクトル、およびＵＶ−ｖｉｓスペクトルの測定を行った。なお、コントロールとして、上記（ｄＧ−ｄＣ）_８のみの水溶液についてもＣＤスペクトル、およびＵＶ−ｖｉｓスペクトルを測定し、これらの結果も併せて図３、４に示す。また、塩濃度が５ＭとなるようにＮａＣｌを添加した（ｄＧ−ｄＣ）_８水溶液についてのＣＤスペクトル、およびＵＶ−ｖｉｓスペクトルの測定結果（図中、（ｄＧ−ｄＣ）_８／ＮａＣｌ ５Ｍで示す線）を併せて示した図を図５、図６に示す。
【０１０７】
まず、図３および図５に示すように、アルキルエーテル側鎖ポリカルバゾール存在下の（ｄＧ−ｄＣ）_８溶液にＨＣｌを５０μｌずつ３００μｌまで添加していった場合のＣＤスペクトル（（ｄＧ−ｄＣ）_８／ｐｏｌｙＣｚ＋ＨＣｌ量で示す線）は、ＨＣｌの添加量が多くなるにつれ、５ＭとなるようにＮａＣｌを添加した（ｄＧ−ｄＣ）_８水溶液についてのＣＤスペクトル（図中、（ｄＧ−ｄＣ）_８／ＮａＣｌ ５Ｍで示す線）により近い波形を示すことがわかった。
【０１０８】
これは、ＨＣｌとアルキルエーテル側鎖ポリカルバゾールとを添加することにより、ＤＮＡ水溶液を高塩濃度にしなくても、ＨＣｌの濃度依存的に、ＤＮＡらせん構造の変化が誘導されることを示している。すなわち、ＨＣｌとアルキルエーテル側鎖ポリカルバゾールと二本鎖ＤＮＡを混合することにより、ＤＮＡらせん構造の変化が引き起こされることがわかった。
【０１０９】
また、図４および図６に示すように、アルキルエーテル側鎖ポリカルバゾール存在下の（ｄＧ−ｄＣ）_８水溶液にＨＣｌを５０μｌずつ３００μｌまで添加していった場合のＵＶ−ｖｉｓスペクトル（（ｄＧ−ｄＣ）_８／ｐｏｌｙＣｚ＋ＨＣｌ量で示す線）は、ＨＣｌの添加量が多くなるにつれ、５ＭとなるようにＮａＣｌを添加した（ｄＧ−ｄＣ）_８水溶液についてのＵＶ−ｖｉｓスペクトル（図中、（ｄＧ−ｄＣ）_８／ＮａＣｌ ５Ｍで示す線）により近い波形を示すことがわかった。
【０１１０】
すなわち、ＨＣｌとアルキルエーテル側鎖ポリカルバゾールとを添加することにより、ＤＮＡ水溶液を高塩濃度にしなくても、ＨＣｌの濃度依存的に、約２９０ｎｍ付近にピークを有することがわかった。これは、上述したようにフーグスティン型のスタッキング（図８参照）によるものであり、ＤＮＡのらせん構造の反転（Ｂ−Ｚ転位）がおこっていると考えられる。
【０１１１】
さらに、結果は図示しないが、（ｄＧ−ｄＣ）_８と、ＴＨＦと、ＨＣｌとを混合した溶液、およびアルキルエーテル側鎖ポリカルバゾールと、ＨＣｌと、水とを混合した溶液のＣＤスペクトル、ＵＶ−Ｖｉｓスペクトルを測定したが、いずれもＤＮＡの構造変化が認められなかった。
【０１１２】
以上の結果より、（ｄＧ−ｄＣ）_８と、アルキルエーテル側鎖ポリカルバゾールと、ＨＣｌとを混合させることによって、二本鎖ＤＮＡ（ｄＧ−ｄＣ）_８におけるらせん構造がＢ型ＤＮＡ構造からＺ型ＤＮＡ構造へと変化することが明らかとなった。
【０１１３】
【発明の効果】
以上のように、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法によれば、塩濃度やアルコール濃度を高めることなく、ＤＮＡのらせん構造を効率的に変化させることができるという効果を奏する。
【０１１４】
それゆえ、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法は、ＤＮＡスイッチングシステム、塩基配列検出方法、塩基配列検出キット、および疾患または疾患の発生危険性の判定等に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】二本鎖ＤＮＡのらせん構造がＢ型ＤＮＡ構造からＺ型ＤＮＡ構造へ、またＺ型ＤＮＡ構造からＢ型ＤＮＡ構造へ変化する現象を模式的に示した図である。
【図２】本実施の形態における実験にて用いた材料および実験方法を簡単に説明する図である。
【図３】本実施例におけるアルキルエーテル側鎖ポリカルバゾールとＨＣｌとを添加した場合におけるＤＮＡ構造変化をＣＤスペクトル測定にて調べた結果を示す図である。
【図４】本実施例におけるアルキルエーテル側鎖ポリカルバゾールとＨＣｌとを添加した場合におけるＤＮＡ構造変化をＵＶ−ｖｉｓスペクトル測定にて調べた結果を示す図である。
【図５】本実施例における高濃度の塩またはアルキルエーテル側鎖ポリカルバゾールとＨＣｌとを添加した場合におけるＤＮＡ構造変化をＣＤスペクトル測定にて調べた結果を示す図である。
【図６】本実施例における高濃度の塩またはアルキルエーテル側鎖ポリカルバゾールとＨＣｌとを添加した場合におけるＤＮＡ構造変化をＵＶ−Ｖｉｓスペクトル測定にて調べた結果を示す図である。
【図７】二本鎖ＤＮＡ中における塩基のフーグスティン型のスタッキングを示す図である。
【図８】（ａ）は、従来の高塩濃度によるＤＮＡらせん構造の変化を模式的に示す図であり、（ｂ）は、従来のＤＮＡらせん構造の変化を誘導する方法について簡単に説明する図である。
【図９】本実施例におけるポリカルバゾール誘導体の合成スキームを示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for inducing a change in the helical structure of double-stranded DNA using a polycarbazole derivative and an acid, and a method for using the same.
[0002]
[Prior art]
BACKGROUND ART DNA (deoxyribonucleic acid) is known as a substance that carries genetic information in most organisms or organelles.
The viral genome may be composed of single-stranded DNA or single-stranded or double-stranded RNA, but in most organisms, DNA exists as double-stranded.
[0003]
In such double-stranded DNA, the two DNA strands run in opposite directions (antiparallel) and form a double helical structure around each other. This double helical structure of DNA is formed by a specific hydrogen bond between a purine base on one DNA strand and a pyrimidine base on the other DNA strand. That is, according to the Watson-Crick rule, adenine (dA) and thymine (dT) form a pair, and guanine (dG) and cytosine (dC) form a pair, thereby forming a double helix structure of double-stranded DNA. Have been. “D” stands for deoxy.
[0004]
It is known that such a double-stranded DNA exhibits various structural polymorphisms by changing its base sequence, conditions of an aqueous solution, and the like. Among them, in particular, as shown in FIG. 8A, a double-stranded DNA having a repeating sequence of guanine and cytosine (for example, a poly (dG-dC) / poly (dG-dC) sequence) is usually in the right side. Paul et al. Show a spiral structure (B-type DNA structure), but show a left-handed spiral structure (Z-type DNA structure) opposite to a normal right-handed spiral structure (B-type DNA structure) under a high salt atmosphere. (1972) (for example, see Non-Patent Document 1).
[0005]
In addition to the above method, as shown in FIG. 8 (b), as a method for inducing a change in the helical structure of double-stranded DNA, a method of adding an alcohol such as ethanol to an aqueous solution of double-stranded DNA is used. , A method of adding a polyamine, and a method of simply heating an aqueous solution of double-stranded DNA are known (for example, see Non-Patent Document 1).
[0006]
However, the biological significance of the reversal of the helical structure of such double-stranded DNA is not yet well understood, and there is a lively discussion among experts. (For example, see Non-Patent Documents 1 and 2).
[0007]
Thus, although the detailed biological significance of the helical inversion of double-stranded DNA is unknown, DNA helical inversion (for example, change from a B-type DNA structure to a Z-type DNA structure, hereinafter simply referred to as BZ It is considered that the phenomenon called “dislocation” may be applied to a switching system such as a nanobiomaterial (for example, see Non-Patent Document 3).
[0008]
In addition, it has been reported that an alkoxypolythiophene having a quaternary ammonium group at the third position of a side chain forms a complex (polyion complex) by electrostatic interaction with double-stranded DNA (for example, Non-Patent Documents) 4). In this complex, a quaternary ammonium group on the side chain of polythiophene and a phosphate anion of DNA are formed by an electrostatic interaction, thereby detecting DNA.
[0009]
[Non-patent document 1]
Wolfram Senger, Translated by Yoshinori Nishimura, "Nucleic acid structure (below)", Springer Verlag Tokyo, p264-265, p275-278
[0010]
[Non-patent document 2]
Toshio Hakojima, "Reinstatement of Z-DNA-Structural analysis of left-handed Z-DNA binding protein complex and its biological significance-", Protein Nucleic Acid Enzyme Vol. 45, no. 4, (2000), p595-599
[0011]
[Non-Patent Document 3]
Chengde Mao et al., "A nanomechanical device based on the B-Z translation of DNA", Nature, Vol. 397, 14 January 1999, p144-146
[0012]
[Non-patent document 4]
Hoang-Anh Ho et al., "Colorimetric and Fluorometric Detection of Nucleic Acids Using Catic Polythiophene Derivatives," Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 9, pp. 1548-1551
[0013]
[Problems to be solved by the invention]
However, the inversion phenomenon of the double-stranded DNA helical structure such as the BZ rearrangement described above is generally induced only under a high salt concentration atmosphere or a certain concentration, so that practical switching is not possible. There is a problem that it is difficult to apply to a system and it is difficult to construct a reversible switching system.
[0014]
Therefore, development of a method for inducing BZ rearrangement in double-stranded DNA without increasing the salt concentration in the aqueous solution of double-stranded DNA or adding alcohol or the like has been strongly demanded.
[0015]
The present invention has been made in view of the above problems, and an object thereof is to use a polycarbazole derivative and an acid without adding a high-concentration salt or alcohol to an aqueous double-stranded DNA solution. An object of the present invention is to provide a method for inducing a change in the helical structure of double-stranded DNA, and a method for using the same.
[0016]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies in view of the above problems, and found that as an alternative to induction of a change in the helical structure of double-stranded DNA by adding a high concentration of salt or alcohol, a polycarbazole derivative and hydrochloric acid and double-stranded DNA were used. We constructed a switching system utilizing the interaction with and analyzed it in detail, and found that BZ translocation in double-stranded DNA is induced by charge transfer between DNA-polycarbazole derivative complexes. The present inventors have uniquely found the present invention and completed the present invention.
[0017]
That is, the method for inducing a change in the DNA helical structure according to the present invention is a method for inducing a change in the helical structure of a double-stranded DNA, in order to solve the above-mentioned problems. It is characterized by having a step of mixing a polycarbazole derivative and a substance that accepts electrons from the polycarbazole derivative.
[0018]
According to the above method, although the details are unknown, it is considered that the polycarbazole derivative is cationized by the action of a substance that accepts electrons from the polycarbazole derivative. On the other hand, double-stranded DNA is an anion. For this reason, it is considered that the cationized polycarbazole derivative and the double-stranded DNA which is an anion are electrostatically bonded to form a complex between the double-stranded DNA and the polycarbazole derivative. At this time, it is considered that charge transfer occurs between the double-stranded DNA and the polycarbazole derivative, and the helical structure of the double-stranded DNA changes. Therefore, according to the DNA helical structure change induction method of the present invention, the helical structure of double-stranded DNA can be easily and efficiently changed without adding a high concentration of salt or alcohol.
[0019]
Note that whether or not the helical structure of DNA has changed can be easily detected by measuring a circular two-color signal (CD spectrum) or an ultraviolet / visible absorption spectrum (UV-vis spectrum).
[0020]
In the method for inducing a change in the DNA helix structure according to the present invention, the substance that accepts electrons from the polycarbazole derivative is preferably an acid. In particular, the acid is preferably hydrochloric acid.
[0021]
Further, in the method for inducing a DNA helical structure change according to the present invention, the polycarbazole derivative may be represented by the following chemical formula (1):
[0022]
Embedded image

[0023]
(Wherein, R1, R2, R3, R4, R5, R6 and R7 are each a hydrogen atom, an alkoxyl group having 1 to 30 carbon atoms, an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, a phenyl group or an aromatic group such as a naphthyl group) And an aromatic group such as an alkoxyl group, an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, a phenyl group or a naphthyl group, wherein one or more carbon atoms in the molecule are an oxygen atom or a nitrogen atom. And / or a sulfur atom. The aromatic group such as an alkoxyl group, an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, a phenyl group or a naphthyl group may be a halogen atom, a hydroxyl group, an amino group, a carboxyl group. , And an ammonium group, and n is a positive integer of 1 or more.)
It is preferable that the compound is represented by In particular, the polycarbazole derivative is preferably represented by the following chemical formula (2):
[0024]
Embedded image

[0025]
(R9 represents a hydrogen atom, a methyl group, or an ethyl group, and m and n each represent a positive integer of 1 or more.)
Is preferably an alkyl ether side chain polycarbazole represented by
[0026]
The polycarbazole derivative has the following chemical formula (3):
[0027]
Embedded image

[0028]
(N represents a positive integer of 1 or more.)
Is more preferably an alkyl ether side chain polycarbazole represented by
[0029]
In the method for inducing a change in the DNA helical structure according to the present invention, the change in the helical structure of the double-stranded DNA may be defined as a change from a B-type DNA structure to a Z-type DNA structure or a change from the Z-type DNA structure to a B-type DNA structure. It is characterized by the change to.
[0030]
According to the above method, the helical structure of double-stranded DNA can be significantly changed from a B-type DNA structure to a Z-type DNA structure, or from a Z-type DNA structure to a B-type DNA structure.
[0031]
Further, the method for inducing a DNA helical structure change according to the present invention is characterized in that the double-stranded DNA has a poly (dG-dC) .poly (dG-dC) sequence.
[0032]
If the base sequence of the double-stranded DNA has the above base sequence, the helical structure of the double-stranded DNA can be changed reliably and efficiently.
[0033]
Further, a DNA switch according to the present invention is characterized by utilizing the above-described method for inducing a change in the DNA helix structure.
[0034]
According to the above configuration, the double-stranded DNA can be used as a switch by using the phenomenon of a change in the helical structure of the double-stranded DNA as switching (switching on / off). As a result, the DNA switch according to the present invention can be used, for example, as a switching system for nanomaterials, which are microstructures, and in particular, for nanobiomaterials utilizing characteristics of biological materials in nanomaterials.
[0035]
Further, the method for detecting a base sequence according to the present invention is characterized in that a specific base sequence in double-stranded DNA is selectively detected or quantified by utilizing the above-described method for inducing a change in the DNA helix structure. Further, the base sequence detection kit according to the present invention is a base sequence detection kit for selectively detecting or quantifying a specific base sequence in double-stranded DNA using the above-described method for inducing a change in the DNA helix structure. , A polycarbazole derivative and a substance that accepts electrons from the polycarbazole derivative.
[0036]
According to the above configuration, it is possible to selectively detect or quantify a specific base sequence contained in the double-stranded DNA. That is, a specific base sequence contained in the double-stranded DNA is selectively used as an index based on the presence or absence of a change in the helical structure of the double-stranded DNA to be investigated and / or the degree of the change in the helical structure. It can be detected and quantified. Further, it is also possible to obtain information such as at which position in the double-stranded DNA the length of the specific base sequence is present. As a method for examining the presence or absence of a change in the helical structure and the degree of the change, a conventionally known method such as measuring a CD spectrum or a UV spectrum can be used.
[0037]
The “specific base sequence” includes, for example, a poly (dG-dC) / poly (dG-dC) sequence and the like.
[0038]
Further, the method for determining the onset of a disease or the like according to the present invention comprises selectively detecting or quantifying a specific base sequence in double-stranded DNA using the above-described DNA helical structure change inducing method. Is characterized by determining the onset of the disease or the risk of developing the disease. Further, the kit for determining the onset of a disease or the like according to the present invention provides a disease by selectively detecting or quantifying a specific nucleotide sequence in double-stranded DNA using the above-described DNA helical structure change inducing method. A disease determination kit for determining the onset of or the risk of developing a disease, comprising a polycarbazole derivative and a substance that accepts electrons from the polycarbazole derivative.
[0039]
According to the above configuration, the onset or risk of onset of various diseases caused by having a poly (dG-dC) .poly (dG-dC) sequence or the like is one of the causes. By detecting whether or not it has a (dG-dC) .poly (dG-dC) sequence or the like, the determination can be made very easily.
[0040]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The present invention mixes a double-stranded DNA having a base sequence thought to show a change in helical structure or a structural polymorphism only with a salt strength dependence or an alcohol strength dependence with an alkyl ether side chain polycarbazole. This provides a means for easily and efficiently changing the helical structure of the double-stranded DNA, and proposes a method of using this means. Therefore, in the following, the method for inducing a change in the DNA helix structure according to the present invention will be described, and then the method of using the method for inducing a change in DNA helix structure will be described.
[0041]
One embodiment of the method for inducing a change in the DNA helical structure of the present invention and the method for using the same will be described below with reference to FIGS. Note that the present invention is not limited to this.
[0042]
(1) Method for inducing DNA helical structure change according to the present invention
The method for inducing a change in the helical structure of a DNA according to the present invention is a method for inducing a change in the helical structure of a double-stranded DNA, the method comprising inducing a double-stranded DNA, a polycarbazole derivative, and a polycarbazole derivative. It is only necessary to have a step of mixing the substance with a substance that accepts electrons, and other steps and conditions are not particularly limited.
[0043]
The “polycarbazole derivative” in the present invention refers to a so-called polydibenzopyrrole derivative, and is a heterocyclic compound containing a carbon atom (C) and a nitrogen atom (N) in a molecule (a five-membered or six-membered ring structure). Is not limited, as long as it has a conjugated double bond or a bonding mode similar thereto.
[0044]
The structure of the polycarbazole derivative is shown in the following chemical formula (1).
[0045]
Embedded image

[0046]
R1 to R7 in the chemical formula (1) each represent a group selected from a hydrogen atom, an aromatic group such as an alkoxyl group having 1 to 30 carbon atoms, an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, a phenyl group or a naphthyl group. The above-mentioned aromatic group such as an alkoxyl group, an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, a phenyl group or a naphthyl group has one or more carbon atoms in the molecule represented by an oxygen atom, a nitrogen atom, and / or a sulfur atom. These groups may be substituted, and these groups may have a substituent selected from a halogen atom, a hydroxyl group, an amino group, a carboxyl group, and an ammonium group so as to be easily dissolved or dispersed in water. preferable. Further, n may be a positive integer of 1 or more, and is not particularly limited. The molecular weight is particularly preferably in the range of 1,000 to tens of millions.
[0047]
The polycarbazole derivative is preferably a polycarbazole derivative having an alkyl ether side chain. For example, an alkyl ether side chain polycarbazole having a structure represented by the following chemical formulas (2) and (3) may be mentioned.
[0048]
Embedded image

[0049]
(R9 represents a hydrogen atom, a methyl group, or an ethyl group, and m and n each represent a positive integer of 1 or more.)
[0050]
Embedded image

[0051]
(N represents a positive integer of 1 or more.)
In addition, as a method for producing the polycarbazole derivative, in addition to the synthesis method described in Examples described later, it can be produced by a conventionally known chemical synthesis, and a commercially available product can also be used. It is not limited.
[0052]
The “substance that accepts electrons from the polycarbazole derivative” in the present invention may be any substance that can cationize the polycarbazole derivative. In other words, the nitrogen atom (N) in the molecule of the polycarbazole derivative electrostatically interacts with the lone pair of electrons, and the nitrogen atom is converted to NR₄ ⁺(Ammonium compound, R is an arbitrary substituent) Any substance may be used as long as it changes the structure, and is not particularly limited. Further, “a substance that accepts electrons from a polycarbazole derivative” can be rephrased as a substance that imparts hydrogen ions (H +) to a polycarbazole derivative.
[0053]
Such substances include, for example, "acids". The term “acid” used herein includes organic acids such as formic acid, acetic acid, and citric acid, and inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, and nitric acid, and is not particularly limited. Of these, hydrochloric acid is particularly preferred.
[0054]
The “double-stranded DNA” used in the present invention may be, for example, cDNA, genomic DNA, oligo DNA, or the like, which can be obtained by cloning or chemical synthesis techniques or a combination thereof. The length of the double-stranded DNA is not particularly limited.
[0055]
The double-stranded DNA preferably has a poly (dG-dC) .poly (dG-dC) base sequence. This is because double-stranded DNA having the above-mentioned base sequence can efficiently induce a change in the helical structure by the DNA helical structure change inducing method according to the present invention, as shown in Examples described later. It is. The “poly (dG-dC) · poly (dG-dC) sequence” refers to a sequence of two or more guanine (dG) -cytosine (dC) sequences, and is simply (dG-dC) · (dG- dC) sequences.
[0056]
The “helical structure of double-stranded DNA” includes, for example, a B-type DNA structure, a Z-type DNA structure, an A-type DNA structure, and a C-type DNA structure as shown in FIG. 8B.
[0057]
The “change in the helical structure of the double-stranded DNA” is, as shown in FIG. 8B, a change from the B-type DNA structure to a Z-type DNA structure, an A-type DNA structure, or a C-type DNA structure. And vice versa, such as a change from a Z-type DNA structure, an A-type DNA structure, or a C-type DNA structure to a B-type DNA structure, particularly, a change from a B-type DNA structure to a Z-type DNA structure, or Preferably, the reverse is the change from the Z-type DNA structure to the B-type DNA structure.
[0058]
Further, the “step of mixing a double-stranded DNA, a polycarbazole derivative, and a substance that accepts electrons from the polycarbazole derivative” means that the polycarbazole derivative interacts with a substance that accepts electrons from the polycarbazole derivative, By cationizing the carbazole derivative, a complex is formed between the double-stranded DNA of the anion and the cationized polycarbazole derivative, and a charge transfer occurs between the double-stranded DNA and the polycarbazole derivative. I just need.
[0059]
Therefore, the “polycarbazole derivative” referred to in the present invention can form a complex with double-stranded DNA by electrostatic interaction, for example, by cationization, and transfer charge between the double-stranded DNA. In other words, it is a conductive polymer that can be used. Note that “performs charge transfer” means that, for example, even when electrons are supplied to a double-stranded DNA from a polycarbazole derivative, conversely, electrons are supplied to the polycarbazole derivative from the double-stranded DNA. Either case may be used.
[0060]
Further, since double-stranded DNA is usually dissolved in an aqueous solution, the step of mixing the double-stranded DNA of the present invention, a polycarbazole derivative, and a substance that accepts electrons from the polycarbazole derivative is also performed in principle in an aqueous solution. Is However, when the double-stranded DNA and the polycarbazole derivative can be dissolved in a polar or non-polar organic solvent other than an aqueous solution by some treatment, the method for inducing a DNA helical structure change according to the present invention uses a polar or non-polar organic solvent. It can be performed in a solvent. For example, as shown in Examples described later, a conventionally known solvent such as THF (tetrahydrofuran) can be used for dissolving or dispersing the polycarbazole derivative. The method for inducing a change in the DNA helical structure of the present invention can be carried out even in a state in which is mixed.
[0061]
Furthermore, the method for inducing a change in the DNA helix structure of the present invention can be performed even in a solid film or a cast film. That is, the present invention can also be practiced by mixing the DNA with the polycarbazole derivative fixed on a carrier. As a method for immobilizing the polycarbazole derivative on the carrier, for example, a conventionally known chemical method such as extending and bonding a `` branch '' for immobilization to the carrier from a side chain portion or the like in the molecule of the carbazole derivative, A physical method can be used and is not particularly limited.
[0062]
The term “carrier” refers to a substance in which a polycarbazole derivative is immobilized on a carrier (a substance that does not inhibit the function of the compound) such as a chip, a sensor, or a plate, or a state in which “branches” are extended so as to be immobilized. Of the compound. As described above, a compound containing sulfur (for example, a compound containing a mercapto group) can be easily immobilized when the molecule is immobilized (for example, immobilized on a chip or the like).
[0063]
Further, the method for inducing a DNA helical structure change according to the present invention, that is, the conditions for the step of mixing the double-stranded DNA of the present invention, a polycarbazole derivative, and a substance (for example, an acid) that accepts electrons from the polycarbazole derivative, is used. Is not particularly limited. Specifically, for example, a polycarbazole derivative interacts with a substance (for example, an acid) that accepts an electron from the polycarbazole derivative, and the polycarbazole derivative is cationized, so that the double-stranded DNA and the polycarbazole derivative are cationized. It is sufficient that a buffer or the like that forms a complex with the derivative by electrostatic interaction and causes charge transfer between the double-stranded DNA and the polycarbazole derivative is included. Further, other reaction conditions, such as the concentration and type of double-stranded DNA, the concentration and type of polycarbazole derivative (for example, alkyl ether side-chain polycarbazole, etc.), and a substance that accepts electrons from the polycarbazole derivative (for example, acid) ), The reaction temperature during the mixing, the reaction time, the pH, the concentration of the salt (the type of buffer used), and the like can be appropriately set, and are not particularly limited. The mixing ratio of the double-stranded DNA, the polycarbazole derivative (for example, alkylether side-chain polycarbazole), and the substance that accepts electrons (for example, hydrochloric acid) from the polycarbazole derivative is, for example, as described in Examples described later. As shown, 2.4 ml of double-stranded DNA prepared so that A260 = 1.0, and 1 × 10 2 alkylether side-chain polycarbazole^-3By adding 50 μl of M / THF and 50 μl to 300 μl of 1 mM HCl, the helical structure of the double-stranded DNA can be changed effectively. In addition, the polycarbazole derivative and a substance that accepts electrons from the polycarbazole derivative (eg, HCl) are preferably mixed in a molar ratio of 1: 0.01 to 10; Is preferably mixed with a substance that accepts (e.g., HCl) in a molar ratio of 1:30 to 90. The helical structure of double-stranded DNA can be effectively changed by mixing the polycarbazole derivative and a substance (for example, HCl) DNA which accepts electrons from the polycarbazole derivative in the above molar ratio.
[0064]
Furthermore, the degree of change in the helical structure of the double-stranded DNA can be adjusted by changing the amount of a substance (for example, an acid) that accepts electrons from the polycarbazole derivative. For example, as shown in the examples described below, the change in the helical structure of double-stranded DNA increases as the amount of hydrochloric acid used as a substance that accepts electrons from a polycarbazole derivative increases. Therefore, by adjusting the addition amount of a substance (for example, an acid) that accepts electrons from the polycarbazole derivative, it is possible to control the change in the helical structure of the double-stranded DNA and to induce the change in the helical structure according to the application. Conceivable.
[0065]
In the step of mixing a double-stranded DNA, a polycarbazole derivative, and a substance (for example, an acid) that accepts electrons from the polycarbazole derivative, it is highly preferable that a cation is generated in the polycarbazole derivative. The pH is preferably in the range, but is not particularly limited. In addition, the method for inducing a change in the DNA helical structure according to the present invention can be performed by using, as an additive, a substance that cationizes a polycarbazole derivative, for example.
[0066]
As described above, by using the method for inducing a DNA helical structure change according to the present invention, a nucleotide sequence (for example, poly (dG-dC) · Even with a double-stranded DNA having a poly (dG-dC) sequence or the like, the helical structure of the double-stranded DNA can be easily and efficiently changed without increasing the salt concentration or the alcohol concentration. That is, by using the method for inducing DNA helix structure change according to the present invention, for example, as shown in FIG. 1 (a), the helix structure of double-stranded DNA is changed to BZ rearrangement or ZB rearrangement. Can be changed. In addition, by using the method for inducing a change in the DNA helix structure according to the present invention, for example, the helix structure of double-stranded DNA may be changed like a BA translocation or an AB transposition. There is.
[0067]
Therefore, the method for inducing a change in the DNA helix structure according to the present invention can be used as follows.
[0068]
(2) Use of the DNA helical structure change induction method according to the present invention
(2-1) DNA switch
The DNA helical structure change induction method according to the present invention can be used as a DNA switch.
[0069]
That is, the DNA switch according to the present invention only needs to use the above-described method for inducing a change in the DNA helix structure, and other configurations are not particularly limited.
[0070]
According to the above configuration, the phenomenon of the change in the helical structure of the double-stranded DNA can be used as on / off switching of the switch and used as a DNA switch. As the DNA switch, for example, when the B-type DNA structure is switched off, as shown in FIG. 1A, when the DNA helical structure changes from the B-type DNA structure to the Z-type DNA structure. A DNA switch that switches to a switch-on state can be cited, but the reverse is also possible, and the present invention is not limited to this.
[0071]
Further, the DNA switch according to the present invention can be used as a reversible DNA switch as shown in FIG. That is, when the BZ rearrangement is generated by increasing the salt concentration as in the related art, it is difficult to perform reversible switching. However, as in the present invention, a polycarbazole derivative and a substance that accepts electrons from the polycarbazole derivative ( For example, when an acid is used to induce a change in the helical structure of DNA, a change in the concentration of a substance (for example, an acid) that accepts electrons from the polycarbazole derivative or an external stimulus such as an electric field can cause the polycarbazole derivative. Can control the charge state of DNA, so that the DNA helical structure can be reversibly changed, and as a result, reversible switching becomes possible.
[0072]
Such a DNA switch uses a large structural change such as a change in the helical structure in double-stranded DNA (for example, BZ rearrangement, ZB rearrangement, BA rearrangement, or AB rearrangement) as a switching system. To use. Therefore, it is possible to reliably switch on and off the switch. Furthermore, since the above-mentioned DNA switch is a very fine switch, for example, the DNA switching system according to the present invention uses nanomaterials, which are microstructures, in particular, nanobios utilizing characteristics of biological materials in nanomaterials. It can be used as a material switching system.
[0073]
(2-2) Base sequence detection method, base sequence detection kit, disease etc. determination method, disease etc. determination kit
In addition, the method for inducing a change in the DNA helix structure according to the present invention can also be used as a base sequence detection method and a base sequence detection kit.
[0074]
That is, the method for detecting a base sequence according to the present invention may be any method as long as the method for inducing a change in the DNA helix is used, and other steps and conditions are not particularly limited. Further, the kit for detecting a nucleotide sequence according to the present invention may also use the method for inducing a change in the DNA helix structure, and other configurations are not particularly limited.
[0075]
That is, the method for detecting a nucleotide sequence or the kit for detecting a nucleotide sequence according to the present invention utilizes the above-described method for inducing a change in the helical structure of a double-stranded DNA, and / or a change in the helical structure. Any method or kit may be used as long as it examines the degree and the like and selectively detects and quantifies a specific base sequence contained in the double-stranded DNA.
[0076]
Specifically, by using the nucleotide sequence detection method or the nucleotide sequence detection kit according to the present invention, a specific nucleotide sequence, for example, poly (dG-dC) · poly is contained in the double-stranded DNA to be investigated. Whether or not the (dG-dC) sequence is included can be selectively detected and determined.
[0077]
This is because the poly (dG-dC) .poly (dG-dC) sequence is mixed with the above polycarbazole derivative and a substance (for example, an acid) that accepts electrons from the polycarbazole derivative, as shown in Examples described later. This is because they have the property of changing the helical structure of DNA.
[0078]
Therefore, for example, when the double-stranded DNA to be investigated is mixed with the polycarbazole derivative, and the helical structure of the double-stranded DNA changes from a B-type DNA structure to a Z-type DNA structure, the poly (dG -DC) .Poly (dG-dC) sequence can be determined. Conversely, when the helical structure of the double-stranded DNA does not change, it can be determined that the poly (dG-dC) .poly (dG-dC) sequence is not included. This is because the poly (dG-dC) .poly (dG-dC) sequence has a BZ translocation or a ZB This is because it is presumed that dislocation occurs.
[0079]
Further, by using the degree of change in the helical structure of the double-stranded DNA to be investigated as an index, the specific sequence is included in the double-stranded DNA at which position (length, number of bases, etc.). It is also possible to selectively detect (specify) and quantify whether or not it is removed.
[0080]
That is, when the above polycarbazole derivative and a specific base sequence are mixed, what kind of behavior the specific base sequence shows, for example, how much the helical structure of the specific base sequence changes is characteristic. By examining the information in advance, it becomes possible to examine the position of the specific sequence and the length of the base sequence in the double-stranded DNA to be investigated. The behavior of the specific base sequence (DNA) / polycarbazole derivative complex generated when a specific base sequence is mixed with the above polycarbazole derivative and a substance (for example, an acid) that accepts electrons from the polycarbazole derivative. As a method for examining, for example, as shown in Examples described later, a circular dichroic signal (CD spectrum) for a specific base sequence (DNA) / polycarbazole derivative complex, or an ultraviolet / visible absorption spectrum ( Conventionally known methods such as a method for measuring a UV-vis spectrum) are mentioned, but are not particularly limited.
[0081]
Specifically, for example, by mixing a poly (dG-dC) .poly (dG-dC) sequence with an alkyl ether side chain polycarbazole, which is the above polycarbazole derivative, as shown in Examples described later. The resulting change in the helical structure of DNA is characteristic in that it can be detected sharply using the peak at 290 nm in the UV spectrum measurement as an index.
[0082]
Therefore, according to the base sequence detection method and the like of the present invention, for example, a poly (dG-dC) / poly (dG-dC) sequence can be easily and selectively detected and quantified.
[0083]
Here, for example, the amount of the (dG-dC) sequence contained in the double-stranded DNA, that is, the content of the (dG-dC) base sequence is determined by the occurrence of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the double-stranded DNA. It is considered one of the main factors. Part of the reason is stated that methylated cytosine (dC) in CpG dinucleotides tends to undergo deamination and mutate to thymine (dT). Thereby, the mutation rate of the CpG dinucleotide is about 10 times higher than other dinucleotides.
[0084]
Therefore, the method for detecting a nucleotide sequence and the kit for detecting a nucleotide sequence according to the present invention quantitatively detect the content of the (dG-dC) nucleotide sequence in double-stranded DNA, thereby generating SNPs, There is a possibility that a simple method for detecting a genetic disease caused by SNPs or the like can be developed.
[0085]
Further, as shown in FIG. 8B, it is possible to obtain conformation information of double-stranded DNA for structural polymorphisms such as B-type DNA structure and Z-type DNA structure.
[0086]
A Z-shaped DNA structure (left-handed helical DNA structure), which is one of the double-stranded DNA conformations, is considered to be involved in autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus. Therefore, by the method for detecting a base sequence according to the present invention or the base sequence detection kit, a base sequence capable of forming a Z-shaped DNA structure can be easily detected, and thus an early detection device, an early detection method, a treatment method, and the like for these diseases are provided. And may contribute to the development of therapeutic agents and the like.
[0087]
That is, the present invention also includes a method for determining the onset or risk of onset of a disease by detecting or quantifying a base sequence using the above-described method for inducing a change in the DNA helix structure, and a determination device (e.g., a determination kit). included. Here, the term "disease" may be any disease as long as its onset can be predicted using, as an index, the presence of a specific nucleotide sequence in which the helical structure of DNA is changed by the method for inducing DNA helical structure change, and is particularly limited. It is not done. Specific examples include the above-described autoimmune diseases (eg, systemic lupus erythematosus) and diseases caused by changes in the functions of various genes due to single nucleotide polymorphisms (eg, cancer, etc.). The “determination kit” in the present invention is not particularly limited as long as it can determine a disease or the like. Specifically, a carrier in which a polycarbazole derivative is immobilized on a carrier such as paper, a chip, a sensor, or a plate (which does not inhibit the function of the compound), a carrier in which a reagent is combined, and the like are exemplified.
[0088]
In addition, "determining the onset of the disease" means detecting whether or not the disease has developed, and "determining the risk of developing the disease" means whether there is a risk of developing the disease. No and / or to determine the degree of danger.
[0089]
Conventionally, as a method for detecting a specific base sequence in DNA, for example, molecular beacon method (Anal. Chem., 2000, 72, p3717-3724), RI method, amplification by PCR, and decoding by DNA sequencer are used. Methods, Selective Cleavage with Restriction Enzymes and Electrophoresis (Hiroshi Nojima, "Basics of Genetic Engineering", Tokyo Kagaku Dojin), and Mass Spectrometry (Mass Spectrometry) (Anal. Chem., 2001, 73, p2126). -2131), etc., but these methods are not easy to use because the operations and the like are complicated and difficult, or complicated devices and the like need to be used. .
[0090]
However, as described above, the method for detecting a base sequence and the kit for detecting a base sequence according to the present invention use a double-stranded DNA to be investigated, the above polycarbazole derivative, and a substance that accepts electrons (for example, acid) from the polycarbazole derivative. The specific base sequence can be detected and quantified only by examining the presence or absence of a change in the DNA helical structure and / or the degree of the change by measuring the CD spectrum or the UV spectrum or the like. Therefore, the method for detecting a base sequence and the kit for detecting a base sequence according to the present invention are simpler and easier than the conventional method for detecting a specific base sequence in DNA. Can be detected and quantified.
[0091]
Hereinafter, embodiments will be described with reference to the accompanying drawings, and embodiments of the present invention will be described in further detail. Of course, the present invention is not limited to the following examples, and it goes without saying that various aspects are possible in detail. Furthermore, the present invention is not limited to the above-described embodiment, and various changes can be made within the scope shown in the claims, and embodiments obtained by appropriately combining the disclosed technical means are also described. It is included in the technical scope of the invention.
[0092]
【Example】
First, the double-stranded DNA, the polycarbazole derivative, and a simple experimental method used in this example will be described with reference to FIG.
[0093]
As shown in FIG. 2, in this example, (dG-dC) was used as double-stranded DNA.₈Was used. The polycarbazole derivative is obtained by mixing the alkyl ether side chain polycarbazole represented by the chemical formula (3) with THF (tetrahydrofuran),^-3M was used.
[0094]
The method for synthesizing the alkyl ether side chain polycarbazole used in this example is briefly described below according to the synthesis scheme of FIG.
[0095]
First, 1-Chloro-3,6,9,12-tretrooxtetradecane was synthesized (M. Fujiki, S. Toyoda, C.-H. Yuan and H. Takagawa, Chirality, 10, 667-675 (1998)). Subsequently, 1-Bromo-3,6,9, -trioxounddecane was synthesized (Carl D. Perchonock, et al., J. Med. Chem., 29, 1442-1452 (1986)). Next, 9-N- (3 ′, 6′-dioxooctyl) -3,6-dibromocarbazole was synthesized (Michael E. Wright and Myung-Jong Jin, J. Org. Chem., 1989, 54, 965-96). ). Then, 9-N- (3 ', 6'9'-trioxonudecyl) -3,6-dibromocarbazole was synthesized. Specifically, KMF was added to a DMF solution (20 mL) of 1-Bromo-3,6,9, -trioxounddecane (2.41 g, 10.0 mmol).₂CO₃(2.00 g, 14.5 mmol) and 3,6-dibromocarbazole (3.25 g, 10.0 mmol) were added. The mixed solution was heated to 50 ° C. and reacted for 24 hours. After allowing the mixed solution to cool to room temperature, the mixed solution was filtered under reduced pressure to remove the solvent. The residue was purified by a chromatography column (Hexane / ethyl acetate from 20: 1 to 3: 1).
[0096]
Subsequently, 9-N- (3 ', 6'9'-trioxonudecyl) -3,6-dibromocarbazole was polymerized. Specifically, Ni (COD)₂(1.00 g, 3.64 mmol), COD (328 mg, 3.03 mmol), and Bpy (569 mg, 3.64 mmol) were dissolved in 30 mL of hydrated DMF under a nitrogen atmosphere. The mixed solution was heated at 60 ° C. for 0.5 hour, and carbazole monomer (1.337 g, 3.03 mmol) dissolved in 8 mL of non-hydrated DMF solution was slowly added. The reaction was performed at 60 ° C. for 24 hours in a dark place. The reaction product was added to 500 mL of methanol with a magnetic stirrer. A gray solid was obtained by vacuum filtration and dried in vacuo at room temperature overnight. The above product was dissolved in THF (100 mL). Insoluble solids were removed by filtration through a 0.5 μm pore size membrane filter to obtain a clear yellow liquid. After the addition of isopropanol (50 mL), a white solid precipitated and the solid was centrifuged and vacuum dried overnight at room temperature to give the product (ZhB Zhang, M.M. Fujiki, H. Zh. Tang, M. Motonaga and Torimitsu, Macromolecules, 35 (6) 1988 (2002)).
[0097]
The double-stranded DNA was purchased from SIGMA and used without purification. DNA was adjusted with milliQ so that A260 = 1.0, and used in the experiment as an aqueous DNA solution.
[0098]
Further, the CD spectrum performed in each experiment was as follows: temperature: 25 ° C., start wavelength: 500 nm, end wavelength: 200 nm, sensitivity: 50-100 mdeg, data interval: 0.5 nm, number of integrations: 5, band width: 2.0 nm. , Response: 1.0 sec, and scanning speed: 50 nm / min.
[0099]
The UV spectrum (UV-vis spectrum) was as follows: temperature: 25 ° C., response: Fast, bandwidth: 5.0 nm, scanning speed: 200 nm / min, start wavelength: 500 nm, end wavelength: 200 nm, data interval: 1. The measurement was performed under the following conditions: 0 nm, repetition:
[0100]
Hereinafter, specific experimental results will be described.
[0101]
(1) Confirmation of change in helical structure of DNA due to high salt concentration
First, BZ translocation of double-stranded DNA due to high salt concentration was confirmed. Specifically, (dG-dC)₈NaCl was added to 2.4 ml of the aqueous solution to a concentration of 5 M, and the CD spectrum and the UV-vis spectrum were measured. The results are shown in FIGS. 5 and 6, respectively ((dG-dC) in the figures).₈/ NaCl 5M). As a control, a CD spectrum and a UV-vis spectrum of the aqueous solution containing only the DNA were measured, and the results are also shown in the drawing.
[0102]
As shown in FIG. 5, (dG-dC)₈CD spectrum when NaCl was added to the aqueous solution to be 5M ((dG-dC) in the figure)₈/ NaCl 5M) is (dG-dC)₈Spectrum of only aqueous solution ((dG-dC)₈  (only). This is (dG-dC)₈This shows that when the salt concentration in the aqueous solution was changed to a high salt concentration of 5 M, the helical structure of these double-stranded DNAs changed.
[0103]
Also, as shown in FIG. 6, (dG−dC)₈The UV-vis spectrum of a 5M aqueous solution of NaCl / NaCl is (dG-dC)₈It has a peak at about 290 nm as compared to the UV-vis spectrum of the aqueous solution of the pure water alone. This is due to Hoogsteen type stacking (see FIG. 7) and appears when the helical structure of DNA is inverted (BZ transposition).
[0104]
From the above, with the high salt strength, (dG-dC)₈Was confirmed to change from a B-type DNA structure to a Z-type DNA structure.
[0105]
(2) Helix structure change of DNA by addition of alkyl ether side chain polycarbazole
Next, an alkyl ether side chain polycarbazole and double-stranded DNA (dG-dC)₈When HCl is added to the solution obtained by mixing the double-stranded DNA (dG-dC)₈It was examined whether the helical structure changed.
[0106]
Specifically, alkyl ether side chain polycarbazole 1 × 10^-350 μl of M / THF was added and mixed (dG-dC)₈The CD spectrum and the UV-vis spectrum were measured for the solution obtained by adding 50 μl of HCl to the solution. As a control, the above (dG-dC)₈The CD spectrum and the UV-vis spectrum were measured for the aqueous solution alone, and the results are also shown in FIGS. In addition, NaCl was added so that the salt concentration became 5M (dG-dC).₈Measurement results of CD spectrum and UV-vis spectrum of the aqueous solution ((dG-dC) in the figure)₈/ NaCl 5M) are shown in FIGS. 5 and 6.
[0107]
First, as shown in FIGS. 3 and 5, (dG-dC) in the presence of an alkyl ether side chain polycarbazole₈CD spectrum when HCl was added to the solution up to 300 μl in 50 μl increments ((dG-dC)₈/ PolyCz + HCl amount line) NaCl was added to 5 M as the amount of HCl added increased (dG-dC).₈CD spectrum of aqueous solution ((dG-dC) in the figure)₈/ NaCl 5M line).
[0108]
This indicates that the addition of HCl and an alkyl ether side chain polycarbazole induces a change in the DNA helical structure in a concentration-dependent manner of HCl even without increasing the aqueous DNA solution to a high salt concentration. . That is, it was found that mixing of HCl, alkylether side-chain polycarbazole and double-stranded DNA caused a change in the DNA helical structure.
[0109]
Further, as shown in FIGS. 4 and 6, (dG-dC) in the presence of an alkyl ether side chain polycarbazole was used.₈UV-vis spectrum ((dG-dC) when HCl was added to the aqueous solution up to 300 μl in 50 μl increments.₈/ PolyCz + HCl amount line) NaCl was added to 5 M as the amount of HCl added increased (dG-dC).₈UV-vis spectrum of the aqueous solution ((dG-dC) in the figure)₈/ NaCl 5M line).
[0110]
That is, it was found that by adding HCl and an alkyl ether side chain polycarbazole, the DNA aqueous solution had a peak at about 290 nm depending on the HCl concentration without increasing the salt concentration. This is due to Hoogsteen type stacking (see FIG. 8) as described above, and it is considered that the helical structure of the DNA is inverted (BZ transposition).
[0111]
Further, although the result is not shown, (dG-dC)₈, THF, and HCl, and a solution in which an alkyl ether side chain polycarbazole, HCl, and water were mixed, the CD spectrum and the UV-Vis spectrum were measured. I was not able to admit.
[0112]
From the above results, (dG-dC)₈, An alkyl ether side-chain polycarbazole, and HCl to form a double-stranded DNA (dG-dC).₈Was found to change the helical structure from a B-type DNA structure to a Z-type DNA structure.
[0113]
【The invention's effect】
As described above, according to the method for inducing a change in the DNA helical structure according to the present invention, there is an effect that the helical structure of the DNA can be efficiently changed without increasing the salt concentration or the alcohol concentration.
[0114]
Therefore, the method for inducing a change in the DNA helix structure according to the present invention can be used for a DNA switching system, a method for detecting a base sequence, a kit for detecting a base sequence, and determination of a disease or a risk of developing a disease.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram schematically showing a phenomenon in which the helical structure of double-stranded DNA changes from a B-type DNA structure to a Z-type DNA structure, and from a Z-type DNA structure to a B-type DNA structure.
FIG. 2 is a diagram briefly explaining materials and an experimental method used in an experiment in the present embodiment.
FIG. 3 is a diagram showing a result of examining a change in DNA structure by CD spectrum measurement when an alkyl ether side chain polycarbazole and HCl are added in this example.
FIG. 4 is a diagram showing a result of examining a change in DNA structure by UV-vis spectrum measurement when an alkyl ether side chain polycarbazole and HCl are added in this example.
FIG. 5 is a diagram showing a result of examining a change in DNA structure by CD spectrum measurement when a high concentration of a salt or an alkyl ether side chain polycarbazole and HCl are added in this example.
FIG. 6 is a diagram showing a result of examining a change in DNA structure by UV-Vis spectrum measurement when a high concentration of salt or alkyl ether side chain polycarbazole and HCl are added in this example.
FIG. 7 is a diagram showing Hoogstein-type stacking of bases in double-stranded DNA.
FIG. 8 (a) is a diagram schematically showing a conventional change in DNA helical structure due to a high salt concentration, and FIG. 8 (b) briefly describes a conventional method for inducing a change in DNA helical structure. FIG.
FIG. 9 is a diagram showing a synthesis scheme of a polycarbazole derivative in this example.

Claims (13)

In a method for inducing a change in the helical structure of a double-stranded DNA,
A method for inducing a change in DNA helical structure, comprising a step of mixing a double-stranded DNA, a polycarbazole derivative, and a substance that accepts electrons from the polycarbazole derivative. 2. The method according to claim 1, wherein the substance accepting electrons from the polycarbazole derivative is an acid. 3. The method according to claim 2, wherein the acid is hydrochloric acid. The polycarbazole derivative has the following chemical formula (1):

(Wherein R1, R2, R3, R4, R5, R6 and R7 are each a hydrogen atom, an alkoxyl group having 1 to 30 carbon atoms, an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, a phenyl group or an aromatic group such as a naphthyl group) And an aromatic group such as an alkoxyl group, an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, a phenyl group or a naphthyl group, wherein one or more carbon atoms in the molecule are an oxygen atom or a nitrogen atom. And / or an aromatic group such as an alkoxy group, an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, a phenyl group or a naphthyl group may be substituted with a halogen atom, a hydroxyl group, an amino group, a carboxyl group. , And a substituent selected from ammonium groups and the like, and n represents a positive integer of 1 or more.)
The method for inducing a DNA helical structure change according to any one of claims 1 to 3, wherein the compound is a compound represented by the formula: The polycarbazole derivative has the following chemical formula (2):

(R9 represents a group selected from a hydrogen atom, a methyl group, and an ethyl group, and m and n each represent a positive integer of 1 or more.)
The method for inducing a change in the DNA helix structure according to any one of claims 1 to 4, wherein the alkyl ether side chain polycarbazole is represented by the following formula: The polycarbazole derivative has the following chemical formula (3):

(N represents a positive integer of 1 or more.)
The method for inducing a DNA helical structure change according to any one of claims 1 to 5, wherein the alkyl helical side chain polycarbazole is represented by the following formula: The change in the helical structure of the double-stranded DNA is a change from a B-type DNA structure to a Z-type DNA structure, or a change from a Z-type DNA structure to a B-type DNA structure. 7. The method for inducing a change in the DNA helix structure according to any one of 6. The method for inducing a DNA helical structure change according to any one of claims 1 to 7, wherein the double-stranded DNA has a poly (dG-dC) .poly (dG-dC) sequence. . A DNA switch using the method for inducing a change in the DNA helix structure according to any one of claims 1 to 8. A base sequence detection method for selectively detecting or quantifying a specific base sequence in double-stranded DNA by using the DNA helix structure change induction method according to any one of claims 1 to 8. A base sequence detection kit for selectively detecting or quantifying a specific base sequence in double-stranded DNA using the method for inducing DNA helix structure change according to any one of claims 1 to 8, A base sequence detection kit comprising a polycarbazole derivative and a substance that accepts electrons from the polycarbazole derivative. Use of the method for inducing DNA helical structure change according to any one of claims 1 to 8 to selectively detect or quantify a specific base sequence in double-stranded DNA, thereby producing disease or disease. A method for determining the risk of developing a disease. Use of the method for inducing DNA helical structure change according to any one of claims 1 to 8 to selectively detect or quantify a specific base sequence in double-stranded DNA, thereby producing disease or disease. What is claimed is: 1. A disease determination kit for determining the risk of the onset of a disease, comprising: a polycarbazole derivative; and a substance that accepts electrons from the polycarbazole derivative.

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