JP2004313022A - Endoglucanase mte1 and cellulase preparation containing the same - Google Patents
Endoglucanase mte1 and cellulase preparation containing the same Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004313022A JP2004313022A JP2003107958A JP2003107958A JP2004313022A JP 2004313022 A JP2004313022 A JP 2004313022A JP 2003107958 A JP2003107958 A JP 2003107958A JP 2003107958 A JP2003107958 A JP 2003107958A JP 2004313022 A JP2004313022 A JP 2004313022A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- cellulose
- polynucleotide
- cellulase preparation
- endoglucanase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Abstract
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エンドグルカナーゼＭＴＥ１およびそれを含んでなるセルラーゼ調製物、並びにそれらを利用したセルロース含有繊維の処理方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
セルロース含有繊維に所望の特性を与えるために、セルロース含有繊維をセルラーゼで処理することが行われている。例えば、繊維業界においては、セルロース含有繊維の肌触りおよび外観を改善するために、あるいは着色されたセルロース含有繊維にその色の局所的な変化を提供する「ストーンウオッシュ」の外観を与えるために、セルラーゼによる処理が行われている［欧州特許第３０７，５６４号明細書（特許文献１）］。
【０００３】
現在、デニム染めセルロース含有繊維へのストーンウオッシュ外観の付与、肌触りの改善用途には、木材不朽菌であるトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）やフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）由来のセルラーゼが使用されている。これらセルラーゼは複数のセルラーゼ成分の混合物である。それらの実用化は、セルロース含有繊維に対して所望の効果を奏するには多量のセルラーゼ調製物を使用する必要から生じる困難性によって妨げられてきた。上記のセルラーゼ調製物の短所は、多量のエンドグルカナーゼを含む調製物によって改善されつつある。例えば、エンドグルカナーゼ活性を増強したセルラーゼ調製物は、国際公開第８９／０９２５９号パンフレット（特許文献２）、国際公開第９１／１７２４３号パンフレット（特許文献３）、国際公開第９８／０３６４０号パンフレット（特許文献４）、および国際公開第９４／２１８０１号パンフレット（特許文献５）で公表されている。また、フミコーラ由来のエンドグルカナーゼ成分であるＮＣＥ４（以下「ＮＣＥ４」と略記することもある）［国際公開第９８／０３６４０号パンフレット（特許文献４）］が、従来公知の複数のセルラーゼ成分の混合物であるセルラーゼ調製物の２５倍のジーンズ脱色活性、１００倍ものリヨセル毛羽除去活性を有することが開示されている。
【０００４】
【特許文献１】
欧州特許第３０７，５６４号明細書
【特許文献２】
国際公開第８９／０９２５９号パンフレット
【特許文献３】
国際公開第９１／１７２４３号パンフレット
【特許文献４】
国際公開第９８／０３６４０号パンフレット
【特許文献５】
国際公開第９４／２１８０１号パンフレット
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
デニム染めセルロース含有繊維へのストーンウオッシュ外観の付与、肌触りの改善のために上記セルラーゼによる処理がおこなわれていたが、その場合、処理工程中で衣料にインジゴ染料の一部が再付着または逆染色、すなわち白場汚染してしまう等の問題が発生している。また、セルラーゼを洗剤中に配合した場合、界面活性剤により安定性が損なわれ、十分な効果が生じない問題点がある。
【０００６】
汚染の度合いを低める試みには、セルラーゼ処理液中に界面活性剤等の試薬を添加し、インジゴ染料を分散させる方法がある。しかしながら、この方法は追加の化学品の経費を生じ、廃液の環境負荷を増大させるという問題がある。したがって、デニム染めセルロース含有繊維への処理において、高活性でありながら白場汚染の度合いが低いセルラーゼが所望されていた。また、洗剤用としては、界面活性剤中での安定性の高いセルラーゼが望まれていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、今般、糸状菌であるミリオコッカム・サーモフィラム（Ｍｙｒｉｏｃｏｃｃｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）より、セルロース繊維を崩壊する高い活性を有する新規のエンドグルカナーゼＭＴＥ１およびその遺伝子を見出し、これらを提供するものである。
【０００８】
また、本発明のエンドグルカナーゼＭＴＥ１をペニシリウム・シンプリシシマム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｉｍｐｌｉｃｉｓｓｉｍｕｍ）を宿主として発現させて得た調製物を用いたデニム染めセルロース含有繊維への処理において、白場汚染の程度がＮＣＥ４と比較して著しく低いという有利な性質を有することを見出した。また、市販洗剤中での安定性が高く、洗剤用酵素としての非常に高い有用性を示した。本発明によるタンパク質によれば、デニム染めセルロース含有繊維への処理における、界面活性剤等の化学品の添加量を低減し、その結果、コストの低減化を実用化し、環境への負荷への低減を達成しうる。また、市販洗剤中での安定性が高く、綿繊維の毛羽発生抑制および毛羽除去を効率的にできることから、この点からもコストの低減化、環境への負荷低減を達成することができる。
【０００９】
したがって、本発明は、デニム染めセルロース含有繊維への処理において白場汚染の度合いが低く、市販洗剤中での安定性が高いエンドグルカナーゼ活性を有する新規なタンパク質およびその遺伝子を提供するものである。また、本発明は、その遺伝子によって形質転換された宿主細胞、および当該宿主細胞を培養して目的タンパク質を採取する方法を提供するものである。さらに、本発明のタンパク質を含有し、良好な特性を有するセルラーゼ調製物およびそれを用いたセルロース含有繊維の効率的で安価な処理法を提供するものである。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）以下の（Ａ）および（Ｂ）の特性を有する、タンパク質：
（Ａ）エンドグルカナーゼ活性を有し、
（Ｂ）Ｎ末端のアミノ酸配列が配列番号３で表わされる配列である。
（２）下記からなる群より選択される、タンパク質：
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含んでなる、タンパク質、
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含んでなり、かつエンドグルカナーゼ活性を有する改変タンパク質、および
（ｃ）前記（ａ）のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつエンドグルカナーゼ活性を有する相同タンパク質。
（３）ミリオコッカム属（Ｍｙｒｉｏｃｏｃｃｕｍ）に属する糸状菌由来である、（１）または（２）に記載のタンパク質。
（４）ミリオコッカム・サーモフィラム（Ｍｙｒｉｏｃｏｃｃｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）に属する糸状菌由来である、（３）に記載のタンパク質。
（５）（１）〜（４）のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
（６）ＤＮＡであることを特徴とする（５）に記載の、ポリヌクレオチド。
（７）下記からなる群より選択される、ポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号１で表わされる塩基配列を含んでなる、ポリヌクレオチド、
（ｉｉ）前記（ｉ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドの少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列からなり、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）前記（ｉ）の塩基配列において１個もしくは複数個の塩基が置換、欠失、付加もしくは挿入された塩基配列からなり、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
（ｉｖ）前記（ｉ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
（８） （７）（ｉｉ）が、（７）（ｉ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％の相同性を有する塩基配列からなる、（７）に記載のポリヌクレオチド。
（９） （７）（ｉｉ）が、（７）（ｉ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９５％の相同性を有する塩基配列からなる、（７）に記載のポリヌクレオチド。
（１０） （１）〜（９）のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含んでなる組換えベクター。
（１１） （１０）に記載の組換えベクターにより形質転換された、宿主細胞。
（１２）宿主細胞が酵母または糸状菌である（１１）に記載の宿主細胞。
（１３）酵母が、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属またはピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属に属するものである、（１２）に記載の宿主細胞。
（１４）酵母が、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である（１３）に記載の宿主細胞。
（１５）糸状菌が、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）またはアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属に属するものである、（１２）に記載の宿主細胞。
（１６）糸状菌が、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）もしくはアスペルギルス・オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）、フザリウム・オキシスポーラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、ペニシリウム・シンプリシシマム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｉｍｐｌｉｃｉｓｓｉｍｕｍ）またはアクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）である、（１５）に記載の宿主細胞。
（１７） （１１）〜（１６）のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養し、その宿主および／またはその培養物から（１）〜（４）のいずれか一項に記載のタンパク質を採取する工程を含んでなる、（１）〜（４）のいずれか一項に記載のタンパク質の製造法。
（１８） （１７）に記載の方法で生産された、タンパク質。
（１９） （１）〜（４）および（１８）のいずれか一項に記載のタンパク質を含んでなる、セルラーゼ調製物。
（２０）セルロース含有繊維の処理方法であって、セルロース含有繊維を、（１）〜（４）および（１８）のいずれか一項に記載のタンパク質、または（１９）に記載のセルラーゼ調製物と接触させる工程を含んでなる、方法。
（２１）セルロース含有繊維が毛羽立ち始める速度を低減するかまたはセルロース含有繊維の毛羽立ちを低減させる方法であって、セルロース含有繊維を、（１）〜（４）および（１８）のいずれか一項に記載のタンパク質、または（１９）に記載のセルラーゼ調製物と接触させる工程を含んでなる、方法。
（２２）セルロース含有繊維の肌触りおよび外観の改善を目的として減量加工する方法であって、セルロース含有繊維を、（１）〜（４）および（１８）のいずれか一項に記載のタンパク質、または（１９）に記載のセルラーゼ調製物と接触させる工程を含んでなる、方法。
（２３）着色されたセルロース含有繊維の色を澄明化する方法であって、着色されたセルロース含有繊維を、（１）〜（４）および（１８）のいずれか一項に記載のタンパク質、または（１９）に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含んでなる、方法。
（２４）着色されたセルロース含有繊維の色の局所的な変化を提供する方法であって、着色されたセルロース含有繊維を、（１）〜（４）および（１８）のいずれか一項に記載のタンパク質、または（１９）に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含んでなる、方法。
（２５）セルロース含有繊維がごわ付き始める速度を低減するかまたはセルロース含有繊維のごわ付きを低減する方法であって、セルロース含有繊維を、（１）〜（４）および（１８）のいずれか一項に記載のタンパク質、または（１９）に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含んでなる、方法。
（２６）繊維の処理がその繊維の浸漬、洗濯、またはすすぎを通じて行われる、（２０）〜（２５）のいずれか一項に記載の方法。
（２７） （１）〜（４）および（１８）のいずれか一項に記載のタンパク質、または（１９）に記載のセルラーゼ調製物を、飛散性のない顆粒状または安定化された液体状で含有してなる、洗剤添加物。
（２８） （１）〜（４）および（１８）のいずれか一項に記載のタンパク質、または（１９）に記載のセルラーゼ調製物を含んでなる、洗剤組成物。
（２９）古紙を脱インキ薬品により処理して脱インキを行なう工程において、（１）〜（４）および（１８）のいずれか一項に記載のタンパク質、または（１９）に記載のセルラーゼ調製物を用いることを特徴とする古紙の脱インキ方法。
（３０）紙パルプのろ水性の改善方法であって、紙パルプを、（１）〜（４）および（１８）のいずれか一項に記載のタンパク質、または（１９）に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含んでなる、方法。
（３１）動物飼料の消化能を改善する方法であって、セルロース含有繊維を、（１）〜（４）および（１８）のいずれか一項に記載のタンパク質、または（１９）に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含んでなる、方法。
【発明の実施の形態】
【００１１】
エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質
本明細書において「エンドグルカナーゼ」とは、エンドグルカナーゼ活性を有する酵素、すなわちエンド−１，４−β−グルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４）を意味し、当該酵素は、β−１，４−グルカンのβ−１，４−グルコピラノシル結合を加水分解する。また、本明細書の「エンドグルカナーゼ活性」とは、ＣＭＣアーゼ活性を意味する。さらに、「ＣＭＣアーゼ活性」とは、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ、東京化成工業株式会社製）を加水分解する活性を意味し、被験タンパク質とＣＭＣ溶液を一定時間インキュベーションした後に遊離してくる還元糖量を測定して、１分間に１μｍｏｌのグルコース相当の還元糖を生成する酵素量を１単位と定義する。
【００１２】
エンドグルカナーゼ活性は、例えば、次のような手順により測定することができる。まず、被験タンパク質を含む溶液０．５ｍＬを、２％のＣＭＣを溶解させた５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）０．５ｍＬに添加し、５０℃で３０分間インキュベーションする。次いで、得られる反応液の生成還元糖濃度を、３，５−ジニトロサリチル酸法（ＤＮＳ法）で定量する。すなわち、反応３０分後の反応液１．０ｍＬ中にＤＮＳ試薬３．０ｍＬを添加し、沸騰水浴中で５分間インキュベーションした後、蒸留水８．０ｍＬで希釈し、５４０ｎｍの吸光度を測定する。段階的に希釈したグルコース溶液を用いて検量線を作成し、酵素反応液中の生成還元糖量をグルコース換算で決定する。１分間に１μｍｏｌのグルコース相当の還元糖を生成する酵素量を１単位として活性を算出する。なお、ＤＮＳ試薬は文献（例えば、「生物化学実験法１−還元糖の定量法」、ｐ．１９〜２０、福井作蔵著、学会出版センター）の記載に従って調製することができるが、例えば、次のような手順で調製することができる。まず、４．５％水酸化ナトリウム水溶液３００ｍＬに、１％３，５−ジニトロサリチル酸溶液８８０ｍＬ、およびロッセル塩２５５ｇを添加する（溶液Ａ）。別に、１．０％水酸化ナトリウム水溶液２２ｍＬに結晶フェノール１０ｇを加え、さらに水を加えて溶解して１００ｍＬとする（溶液Ｂ）。溶液Ｂ６９ｍＬに炭酸水素ナトリウム６．９ｇを加えて溶解させ、溶液Ａを注いでロッセル塩が十分に溶解するまで攪拌混合し、２日間放置した後に濾過する。
【００１３】
本発明によるタンパク質は糸状菌類、具体的にはミリオコッカム（Ｍｙｒｉｏｃｏｃｃｕｍ）属、例えばミリオコッカム・サーモフィラム（Ｍｙｒｉｏｃｏｃｃｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）、より好ましくはミリオコッカム・サーモフィラム（Ｍｙｒｉｏｃｏｃｃｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）ＦＥＲＧＵＳＭＢＬ２８８３（ＦＥＲＭ Ｐ−１８８４１）またはその変異株の微生物から得ることができる。
【００１４】
さらに、本発明によるタンパク質は、典型的には、そのＮ末端のアミノ酸配列が配列番号３で表わされる配列を有する。Ｎ末端のアミノ酸配列は、例えば後述の実施例２で示した方法により決定することができる。
【００１５】
本発明によれば、ミリオコッカム（Ｍｙｒｉｏｃｏｃｃｕｍ）属由来の、下記の特性を有するタンパク質が提供される：
（Ａ）エンドグルカナーゼ活性を有し、
（Ｂ）Ｎ末端のアミノ酸配列が配列番号３で表わされる配列である。
【００１６】
本発明の別の態様では、配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、並びにその改変タンパク質またはその相同タンパク質が提供される。
【００１７】
「配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質」には、配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、および、配列番号２で表わされるアミノ酸配列において、シグナルペプチドと考えられる１〜２０番目のアミノ酸配列が切断され、２１〜２６６番目の配列を有するタンパク質が含まれる。
【００１８】
本発明における「改変タンパク質」とは、配列番号２のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含んでなり、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質である。ここで、「置換、欠失、付加もしくは挿入」などの改変に係るアミノ酸の数は、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜６個である。
【００１９】
さらに、改変タンパク質には、配列番号２で表わされるアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、保存的置換されたアミノ酸配列を含んでなり、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を包含する。ここで、「保存的置換」とは、タンパク質の活性を実質的に改変しないように１個もしくは複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸で置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような保存的置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体的には、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン等が挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システイン等が挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジン等が挙げられる。また、負電荷（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。
【００２０】
本発明における「相同タンパク質」とは、配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質と少なくとも８０％、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％、さらに好ましくは９８％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質である。ここで示した相同性の数値は、当業者に公知の相同性検索プログラムであるＦＡＳＴＡ３〔Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２７， １４３５−１４４１ （１９８５）；Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８５， ２４４４−２４４８ （１９８８）；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｅ−ｍａｉｌ／ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｊ．ｈｔｍｌ〕においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて算出される数値を示す。
【００２１】
なお、本発明のタンパク質は、例えば実施例１に記載のように微生物から単離、精製することにより得ることができる。また、後述のように遺伝子組換え技術により本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを適当な宿主において発現させ、生産されたタンパク質を単離、精製することによっても得ることができる。
【００２２】
エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
本発明によれば、配列番号２に記載されるアミノ酸配列、その改変タンパク質およびその相同タンパク質（以下、単に「本発明のタンパク質」という）をコードするポリヌクレオチドが提供される。タンパク質のアミノ酸配列が与えられれば、それをコードするＤＮＡ配列は容易に定まり、よって、本発明のタンパク質をコードする種々のポリヌクレオチドを選択することができる。なお、本明細書において、用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方が含まれ、ＤＮＡが好ましい。
【００２３】
本発明のポリヌクレオチドは、典型的には、下記からなる群より選択されるものである：
（ｉ）配列番号１で表わされる塩基配列を含んでなる、ポリヌクレオチド、
（ｉｉ）前記（ｉ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドの少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列からなり、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）前記（ｉ）の塩基配列において１個もしくは複数個の塩基が置換、欠失、付加もしくは挿入された塩基配列からなり、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
（ｉｖ）前記（ｉ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【００２４】
前記（ｉ）の塩基配列において１個もしくは複数個の塩基が置換、欠失、付加もしくは挿入されてもよい塩基の数は、具体的には１〜６０個、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１８個、さらに好ましくは１〜９個、である。
【００２５】
ここで、前記（ｉｖ）における「ストリンジェントな条件下」とは、配列番号１で表わされる塩基配列を含んでなるプローブと、相同タンパク質をコードするポリヌクレオチドとがハイブリダイズする一方で、このプローブが、ミリオコッカム（Ｍｙｒｉｏｃｏｃｃｕｍ）由来の２０ｋＤａセルラーゼ（米国特許第６１８４０１９号明細書）とはハイブリダイズしない程度に制御された条件を意味する。
【００２６】
より具体的には、例えばプローブとして標識化したエンドグルカナーゼＭＴＥ１のアミノ酸配列をコードする塩基配列の全長を有するものを用い、ハイブリダイゼーションの条件は、基本的にＨｙｂｏｎｄＴＭ−Ｎ（Ａｍａｓｈａｍ社製）に添付された説明書の方法に従って行なうことが挙げられる。具体的には、まず、プレハイブリダイゼーション溶液（２０倍のＳＳＰＥ溶液６．２５ｍｌ、１００倍のデンハードＶｓ溶液１．２５ｍｌ、１０％ＳＤＳ溶液１．２５ｍｌを水で２５ｍｌにフィルアップしたもの）を調製する。超音波処理したＤＮＡ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）０．５ｍｌを１００℃にて５分間保温する。その後、氷上で冷却し、ナイロンメンブレン（ＨｙｂｏｎｄＴＭ−Ｎ）とプレハイブリダイゼション溶液を入れたハイブリダイゼーションバッグに添加する。続いて、６５℃で１時間処理し、ディネイチャーした（１００℃にて５分処理）ラベル（Ｐ３２）したプローブをプレハイブリダイゼーションバッグに添加する。ここでプローブの濃度は２０ｎｇ／ｍｌを超えないようにする。そして、６５℃で１２時間インキュベートした後、メンブレンを取り出し、２倍のＳＳＰＥおよび０．１％のＳＤＳ溶液中で１０分間リンスする。この操作を２回繰り返す。溶液を１倍のＳＳＰＥ、０．１％のＳＤＳに変更し、６５℃にて１５分間処理する。さらに溶液を０．１倍のＳＳＰＥ、０．１％のＳＤＳに変更し、６５℃にて１０分間処理する。
【００２７】
本発明によるポリヌクレオチドは、天然由来のものであっても、全合成したものであってもよく、また、天然由来のものの一部を利用して合成を行ったものでもよい。本発明によるポリヌクレオチドの典型的な取得方法としては、ミリオコッカム・サーモフィラムのｃＤＮＡライブラリーから遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例えば部分アミノ酸配列の情報を基にして作製した適当なＤＮＡプローブを用いて、スクリーニングを行う方法などが挙げられる。
【００２８】
本発明による、エンドグルカナーゼＭＴＥ１のアミノ酸配列をコードする典型的配列は、配列番号１に記載されるポリヌクレオチドの一部または全部を有するものである。配列番号１に記載されるポリヌクレオチドは、１〜３番目のＡＴＧで始まり、７９９〜８０１番目のＴＡＡで終了するオープンリーディングフレームを有する。また、６１〜６３番目のポリヌクレオチドは２４６残基のアミノ酸配列からなる前記成熟タンパク質のＮ末端アミノ酸に対応する。
【００２９】
発現ベクターおよび形質転換された微生物
本発明においては、前記の本発明のタンパク質をコードする塩基配列（以下、単に「本発明によるポリヌクレオチド」という）を、宿主微生物内で複製可能で、かつ、そのポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現可能な状態で含んでなる発現ベクターが提供される。本発現ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない、例えば、プラスミドを基本に構築することができる。また、本発現ベクターは、宿主微生物に導入されたとき、その宿主微生物のゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。本発明によるベクター構築の手順および方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。
【００３０】
本発明による発現ベクターは、これを実際に宿主微生物に導入して所望の活性を有するタンパク質を発現させるために、前記の本発明によるポリヌクレオチドの他に、その発現を制御するポリヌクレオチドや形質転換体を選択するための遺伝子マーカー等を含んでいるのが望ましい。発現を制御するポリヌクレオチドとしては、プロモーター、ターミネーターおよびシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列等がこれに含まれる。プロモーターは宿主微生物において転写活性を示すものであれば特に限定されず、宿主微生物と同種若しくは異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子の発現を制御するＤＮＡ配列として得ることができる。また、シグナルペプチドは、宿主微生物において、タンパク質の分泌に寄与するものであれば特に限定されず、宿主微生物と同種若しくは異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子から誘導されるＤＮＡ配列より得ることができる。また、本発明における遺伝子マーカーは、形質転換体の選択の方法に応じて適宜選択されてよいが、例えば薬剤耐性をコードする遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子を利用することができる。
【００３１】
更に、本発明によれば、この発現ベクターによって形質転換された微生物が提供される。この宿主−ベクター系は特に限定されず、例えば大腸菌、放線菌、酵母、糸状菌などを用いた系、およびそれらを用いた他のタンパク質との融合タンパク質発現系などを用いることができる。また、この発現ベクターによる微生物の形質転換も、この分野で慣用されている方法に従い実施することができる。
【００３２】
更に、この形質転換体を適当な培地で培養し、その培養物から上記の本発明のタンパク質を単離して得ることができる。したがって、本発明の別の態様によれば、前記の本発明のタンパク質の製造方法が提供される。形質転換体の培養およびその条件は、使用する微生物についてのそれと本質的に同等であってよい。また、形質転換体を培養した後、目的のタンパク質を回収する方法は、この分野で慣用されているものを用いることができる。
【００３３】
また、本発明における好ましい態様によれば、本発明によるＤＮＡ配列によってコードされるエンドグルカナーゼを発現させ得る酵母細胞が提供される。本発明における酵母細胞としては、例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、またはピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属に属する微生物、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられる。
【００３４】
本発明における宿主糸状菌は、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属またはアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属に属するものであることができる。さらにそれらの好ましい例としては、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）若しくはアスペルギルス・オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、またはトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）、フザリウム・オキシスポーラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、ペニシリウム・シンプリシシマム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｉｍｐｌｉｃｉｓｓｉｍｕｍ）またはアクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）が挙げられる。
【００３５】
微生物の寄託
ミリオコッカム・サーモフィラム（Ｍｙｒｉｏｃｏｃｃｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）ＦＥＲＧＵＳ ＭＢＬ２８８３は、平成１４（２００２）年４月２６日付で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ Ｐ−１８８４１である。
エンドグルカナーゼＭＴＥ１遺伝子を含むプラスミドｐＥＭＴで形質転換された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株は、平成１４（２００２）年４月２６日付で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ Ｐ−１８８４０である。
【００３６】
セルラーゼの用途／セルラーゼ調製物
本発明は、本発明のタンパク質、および本発明の宿主細胞を培養することにより得られるタンパク質（以下「本発明のタンパク質等」という）を含んでなるセルラーゼ調製物に関する。
本発明によるセルラーゼ調製物は、本発明のタンパク質等に、他のセルラーゼ、例えばセロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼおよび本発明以外のエンドグルカナーゼを含めてもよく、更にセルラーゼ調製物に一般的に含まれる成分、例えば賦形剤（例えば、乳糖、塩化ナトリウム、ソルビトール等）、界面活性剤、防腐剤等とともに混合され製造されてもよい。また、本発明におけるセルラーゼ調製物はいずれか適当な形状、例えば粉末または液体状に調製することができる。
【００３７】
更に本発明によれば、着色セルロース含有繊維の澄明化をもたらす方法であって、上記タンパク質等または上記セルラーゼ調製物で着色セルロース含有繊維を処理する工程を含んでなる方法、並びに、着色セルロース含有繊維の色の局所的な変化をもたらす方法、すなわち、着色セルロース含有繊維にストーンウオッシュの外観を与える方法が提供される。そして、この方法は、上記タンパク質等または上記セルラーゼ調製物により着色セルロース含有繊維を処理する工程を含んでなる。
【００３８】
本発明による上記方法は、洗濯中にセルロース含有繊維を処理することにより実施できる。しかしながら、繊維の処理は、場合によって、ソーキングまたはすすぎ中に、繊維が浸漬されているかまたは浸漬されうる水に、上記タンパク質等または上記セルラーゼ調製物を添加することによって実施されてもよい。
【００３９】
更に本発明によれば、セルロース含有繊維の毛羽立ち始める速度を低減するか、毛羽立ちを低減するか、肌触りが悪くなる速度を低減するか、またはごわ付きを低減する方法が提供される。この方法は、上記タンパク質等または上記セルラーゼ調製物によりセルロース含有繊維を処理する工程を含んでなる。
【００４０】
接触温度、上記タンパク質等または上記セルラーゼ調製物の添加量などの条件は、他の種々の条件を勘案して適宜決定されてよいが、例えば、セルロース含有繊維の肌触りおよび外観の改善を目的とした減量加工の場合、５０〜６０℃程度の温度で、１〜１００ｍｇ／Ｌのタンパク濃度の上記タンパク質等または上記セルラーゼ調製物を使用することにより処理することができる。更に、着色セルロース含有繊維の色の局所的な変化をもたらす場合、５０〜６０℃程度の温度で、２〜５０ｍｇ／Ｌのタンパク濃度の上記タンパク質等または上記セルラーゼ調製物を使用することにより処理することができる。
【００４１】
また、セルロース含有繊維の毛羽立ち始める速度を低減するかまたは毛羽立ちを低減する場合、５０〜６０℃程度の温度で、０．０５〜１０ｍｇ／Ｌのタンパク濃度の上記タンパク質等または上記セルラーゼ調製物を使用することにより処理することができる。
【００４２】
また、本発明のタンパク質等またはセルラーゼ調製物を洗剤組成物中で用いることにより、粒質土壌除去、色彩澄明化、脱毛羽立ち、脱ピリングおよび手粗さ軽減に関し、それらを改善することができる。本発明が定義する洗剤組成物は、界面活性剤（アニオン性、ノニオン性、カチオン性、両性または双性イオン性あるいはそれらの混合物であり得る）をも含有し得る。
【００４３】
更に、本発明の洗剤組成物は、当分野で既知の他の洗剤成分、例えば、ビルダー、漂白剤、漂白活性剤、腐食防止剤、金属イオン封鎖剤、汚れ解離ポリマー、香料、他の酵素（プロテアーゼ、リパーゼ、アミラ−ゼなど）、酵素安定剤、製剤化補助剤、蛍光増白剤、発泡促進剤等をも含有し得る。代表的なアニオン性界面活性剤は直鎖状アルキルベンゼンスルホネート（ＬＡＳ）、アルキルスルフェート（ＡＳ）、アルファーオレフィンスルホネート（ＡＯＳ）、アルコールエトキシスルフェート（ＡＥＳ）および天然脂肪酸のアルカリ金属塩等がある。ノニオン性界面活性剤の例としてはポリオキシエチレンアルキルエーテル（ＡＥ）、アルキルポリエチレングリコールエーテル、ノニルフェノールポリエチレングリコールエーテル、スクロース、およびグルコースの脂肪酸エステル、並びにポリエトキシル化アルキルグルコシドのエステル等がある。
【００４４】
本発明のタンパク質等またはセルラーゼ調製物は古紙に作用させることにより、脱インキが可能である。これにより、古紙から再生紙をつくる過程において本発明によるエンドグルカナーゼによる処理で有意に改善できる。本発明に用いられる古紙は、一般に言われる古紙は全て用いることができ、例えば機械パルプ、化学パルプを配合した新聞古紙、雑誌古紙、下級〜中級印刷古紙、化学パルプよりなる上質古紙、これらの塗工紙等の印刷古紙が含まれる。
【００４５】
また、本発明に言う脱インキ薬品は、一般に古紙の脱インキに用いられる薬品をいい、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウムなどのアルカリ、硅酸ソーダ、過酸化水素、燐酸塩、それにアニオン系、ノニオン系の界面活性剤、オレイン酸等の補集材、助剤としてｐＨ安定剤、キレート剤、分散剤等が挙げられる。
【００４６】
また、本発明によれば、紙パルプのろ水性が、強度の著しい低下を伴うことなく、本発明のタンパク質等またはセルラーゼ調製物による処理で有意に改善できるものと考えられる。したがって、本発明によれば、パルプのろ水性の改善方法であって、本発明のタンパク質等またはセルラーゼ調製物で紙パルプを処理する工程を含んでなる方法が提供される。本発明で処理できるパルプの例としては、古紙パルプ、再循環板紙パルプ、クラフトパルプ、亜硫酸パルプまたは加工熱処理および他の高収率パルプが挙げられる。
【００４７】
さらに、本発明は、動物飼料の消化能を改善する方法に関し、動物飼料を、本発明のタンパク質等または本発明のセルラーゼ調製物で処理する工程を含む。 該方法によれば、動物飼料中のグルカンが適度に低分子化されるため、動物飼料の消化能を改善することができる。
【００４８】
さらに、本発明のタンパク質等を動物飼料中で用いることにより、飼料中のグルカンの消化能を改善することができる。したがって、本発明によれば、動物飼料の消化能を改善する方法であって、本発明のタンパク質等または本発明のセルラーゼ調製物で動物飼料を処理する工程を含んでなる方法が提供される。
【００４９】
【実施例】
本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はその要旨を越えない限り以下の実施例に限定されるものではない。
【００５０】
〔実施例１〕ミリオコッカム・サーモフィラム（Ｍｙｒｉｏｃｏｃｃｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）からのエンドグルカナーゼ成分の単離精製
ミリオコッカム・サーモフィラム（Ｍｙｒｉｏｃｏｃｃｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）ＦＥＲＧＵＳ ＭＢＬ２８８３（ＦＥＲＭ Ｐ−１８８４１）を、ＰＤＡ培地（２０％馬鈴薯浸出液、２．０％ブドウ糖、ｐＨ５．６）に植菌し、２５℃で振とう培養した。７日間培養の後、培養液を吸引濾過により菌体を除き、得られた培養上清液を限外濾過濃縮、凍結乾燥を経て、粗精製セルラーゼ調製物とした。
【００５１】
この粗精製セルラーゼ調製物を、常法に従い、硫安塩析し、脱塩後０．０２５ｍｏｌ／ｌのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて平衡化し、ｍｏｎｏＰカラムに供しｐＨ７．５からｐＨ４．３で溶出した。溶出されたフラクションのＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）アーゼ活性（ｐＨ５．０、５０℃）を測定したところ、フラクション６〜フラクション１０に活性が認められた。
【００５２】
全てのフラクションをデニム洗浄試験に供した。ラウンダーメーターに１０ｃｍ×１０ｃｍのデニム小片を入れ、ＣＭＣアーゼとして５Ｕ／ｍｌとなるよう分画した酵素を加え、ｐＨ５．０、５０℃にて６０分間処理をした。その結果、フラクション１０が他のフラクションに比べデニムの強い脱色を示した。
【００５３】
また、各フラクションの酵素のＣＭＣアーゼ活性を５０℃、ｐＨ５．０、ｐＨ７．０，ｐＨ９．０にて測定した。その結果、フラクション１０がｐＨ９．０で、相対的に高い活性を示した。
【００５４】
更に、フラクション１０のエンドグルカナーゼを洗剤に多く使用される代表的なアニオン界面活性剤であるＬＡＳが２．５ｇ／ｌ存在する条件で、５０℃にてｐＨ５．０およびｐＨ７．０での残存活性を調べた結果、１２０分までの処理時間において非常に高い残存活性を示した。
【００５５】
ここで、得られた活性画分のうち６ｍｌ分を５０ｍｍｏｌ／ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）になるように調製した後、あらかじめ５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で平衡化させた、ＭｏｎｏＳ ５／５ＨＲカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）流速１ｍｌ／ｍｉｎでアプライした。次に５０ ｍｍｏｌ／ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）から５０ｍｍｏｌ／ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中１ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウムに対して、直線勾配溶出法により流速１ｍｌ／ｍｉｎで溶出し、分画した。このうち、塩化ナトリウム濃度が約０．１ｍｏｌ／ｌのときに得られた画分の一部に綿毛羽除去活性が強く認められた。そこで、この画分１〜３ｍｌを分取した。この画分をエンドグルカナーゼＭＴＥ１として単離した。このエンドグルカナーゼＭＴＥ１はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて単一なバンドを示した。ここまでのＭＴＥ１の精製の工程を５０回繰り返し、精製サンプルを大量に得た。
【００５６】
〔実施例２〕 エンドグルカナーゼＭＴＥ１の部分アミノ酸配列
（１）Ｎ末端アミノ酸配列の同定
フラクション１０をｍｏｎｏＰカラムに供し、クロマトフォーカシングを実施した。これにより単一タンパク質にまで精製された。このタンパク質のＣＭＣａｓｅ活性を測定したところ、ｐＨ５．０で２８Ｕ／ｍｇ、ｐＨ７．０で１５Ｕ／ｍｇであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定される分子量は約２８ｋＤａであった。このタンパク質をアセトン沈殿法により回収し、Ｎ末端のアミノ酸を測定したところ、次の配列が得られた。
【００５７】
エンドグルカナーゼＭＴＥ１のＮ末端アミノ酸配列
ＡＡＤＧＫＳＴＲＹＷＤＣＣＫＰＳＣＳＷ（配列番号３）
【００５８】
〔実施例３〕 エンドグルカナーゼＭＴＥ１遺伝子のクローニング
本発明のエンドグルカナーゼＭＴＥ１の遺伝子を単離するため、ミリオコッカム・サーモフィラム（Ｍｙｒｉｏｃｏｃｃｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）ＦＥＲＧＵＳ ＭＢＬ２８８３から常法に従ってゲノムＤＮＡを単離・精製した。
続いて、配列番号４および配列番号５に記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとし、ゲノムＤＮＡを鋳型として常法に従ってＰＣＲを実施した。
【００５９】
５’−ＡＡＧＡＡＴＴＣＴＧＹＧＣＮＴＧＧＣＣＮＡＡＲ−３（配列番号４）５’−ＡＡＲＣＴＧＡＣＣＡＡＲＧＴＹＴＴＲＣＧＣＣＴＡＧＧＡＡ−３（配列番号５）
【００６０】
増幅された生成物をアガロースゲル電気泳動的に供した結果、ほぼ単一であり、その断片をｐＵＣ１２９（Ｋｅｅｍ Ｎ．Ｔ．， Ｔａｍａｋｉ Ｓ．， Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｄ．， Ｔｒｏｌｌｉｎｇｅｒ Ｄ． Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂｒｏａｄ−ｈｏｓｔ−ｒａｎｇｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｆｏｒ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｉｎ ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ． Ｇｅｎｅ， １９８８ ｖ．７０， ｐｐ．１９１−１９７）にサブクローニングした。
【００６１】
ミリオコッカム・サーモフィラム（Ｍｙｒｉｏｃｏｃｃｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）ＦＥＲＧＵＳ ＭＢＬ２８８３の全ゲノムを制限酵素（ＰｓｔＩ、ＳｐｈＩ、ＳａｌＧＩ、ＣｌａＩ、ＳａｃＩ、ＸｂａＩ、ＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩ）にてそれぞれ消化した後、上述のｐＵＣ１２９にサブクローニングしたＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションの条件は、基本的にＨｙｂｏｎｄＴＭ−Ｎ（Ａｍａｓｈａｍ社製）に添付された説明書の方法に従った。まず、プレハイブリダイゼーション溶液（２０倍のＳＳＰＥ溶液６．２５ｍｌ、１００倍のデンハードＶｓ溶液１．２５ｍｌ、１０％ＳＤＳ溶液１．２５ｍｌを水で２５ｍｌにフィルアップしたもの）を調製した。超音波処理したＤＮＡ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）０．５ｍｌを１００℃にて５分間保温した。その後、氷上で冷却し、ナイロンメンブレン（ＨｙｂｏｎｄＴＭ−Ｎ）とプレハイブリダイゼション溶液を入れたハイブリダイゼーションバッグに添加した。続いて、６５℃で１時間処理し、ディネイチャーした（１００℃にて５分処理）ラベル（Ｐ３２）したプローブをプレハイブリダイゼーションバッグに添加した。プローブの濃度は２０ｎｇ／ｍｌを超えないようにした。そして６５℃で１２時間インキュベートした。続いて、メンブレンを２倍のＳＳＰＥおよび０．１％のＳＤＳ溶液中で１０分間リンスし、この操作を２回繰り返した。溶液を１倍のＳＳＰＥ、０．１％のＳＤＳに変更し、６５℃にて１５分間処理した。さらに溶液を０．１倍のＳＳＰＥ、０．１％のＳＤＳに変更し、６５℃にて１０分間処理した。
【００６２】
その結果、ＮｄｅＩ、ＣｌａＩおよびＸｂａＩ消化においては１０ｋｂよりも大きなＤＮＡ断片にハイブリダイズすることを見いだした。また、ＳｐｈＩで８ｋｂ、ＳａｃＩＩで８ｋｂ、ＨｉｎｄＩＩＩで６ｋｂ、ＳａｌＧＩで５ｋｂ、ＥｃｏＲＩで４ｋｂ、ＸｈｏＩで３．７ｋｂ、ＳａｃＩで１ｋｂ付近の分子量の断片にハイブリダイズすることがわかった。
【００６３】
〔実施例４〕 エンドグルカナーゼＭＴＥ１遺伝子の遺伝子配列の決定
実施例３に記載したミリオコッカム・サーモフィラム（Ｍｙｒｉｏｃｏｃｃｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）ＦＥＲＧＵＳ ＭＢＬ２８８３のゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＩ断片（４ｋｂ）を環状化した後、得られた環状物の直接ＰＣＲ反応を下記のプライマーを用いて行った。
【００６４】
５’−ＣＣＣＡＧＡＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＧＡＣＧＧ−３’ （配列番号６）
５’−ＴＣＡＡＧＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＡＧＴＧＧＣ−３’ （配列番号７）
【００６５】
続いて、得られたＰＣＲ生成物をＥｃｏＲＩで消化し、ＥｃｏＲＩとＥｃｏＲＶで消化したｐＵＣ１２９へ、常法に従いクローニングした。プラスミドＤＮＡの単離を行い、この挿入したＰＣＲ生成物の塩基配列を常法に従って決定した。この際、ｐＵＣベクター用の標準的なプライマーとともに以下のプライマーを使用した。
【００６６】
５’−ＴＧＣＡＧＧＣＧＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣ−３’ （配列番号８）
５’−ＣＧＣＣＧＡＧＴＴＣＡＴＣＴＴＣＡＣＣ−３’（配列番号９）
５’−ＴＧＣＣＣＧＧＣＧＡＧＣＣＣＧＡＣＣ−３’ （配列番号１０）
５’−ＡＧＡＣＣＴＡＣＧＡＡＴＡＣＧＧＣＡ−３’ （配列番号１１）
５’−ＣＡＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＴＧＣＧＡ−３’ （配列番号１２）
５’−ＣＧＣＡＴＴＣＴＧＴＧＧＧＧＧＴＣＴ−３’ （配列番号１３）
【００６７】
この配列を解析したところ７９８ｂｐからなるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在し、この配列から予測されるタンパク質は、２６６アミノ酸残基、約２８ｋＤａであり、エンドグルカナーゼと相同性を示すことが明らかとなった。また、最も高い相同性を示したタンパク質は、Ａｒｊａ Ｍｉｅｔｔｉｎｅｎ−Ｏｉｎｏｎｅｎらによるミリオコッカム（Ｍｙｒｉｏｃｏｃｃｕｍ）の２０ｋＤａセルラーゼ（米国特許第６１８４０１９号明細書）であり、その相同性は７５％であった。このように単離した本発明のエンドグルカナーゼＭＴＥ１遺伝子のＯＲＦの塩基配列を配列表の配列番号１に、またそのアミノ酸配列を配列番号２に示した。Ｎ末端のアミノ酸配列は実施例２で調べた配列番号３と一致した。また、ポリヌクレオチドとエンドグルカナーゼ遺伝子のコード領域のアミノ酸配列は、長さ６７ｂｐおよび５７ｂｐの２つのイントロンで遮断されていた。
【００６８】
次に常法に従い、ミリオコッカム・サーモフィラムの遺伝子ライブラリーをＥＭＢＬ３で作成し、完全長のエンドグルカナーゼＭＴＥ１遺伝子を含むファージをスクリーニングした。その後、エンドグルカナーゼＭＴＥ１遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片（３．２ｋｂ）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳベクターにクローニングし、プラスミドｐＥＭＴ（ＦＥＲＭ Ｐ−１８８４０）を単離した。
【００６９】
〔実施例５〕 エンドグルカナーゼＭＴＥ１遺伝子のペニシリウム・シンプリシシマム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｉｍｐｌｉｃｉｓｓｉｍｕｍ）での発現
実施例４により単離したエンドグルカナーゼＭＴＥ１遺伝子を鋳型として、以下に記載するプライマーを用いてＰＣＲにて増幅させ、エンドグルカナーゼＭＴＥ１遺伝子配列内にＡｐａＩ制限酵素部位を導入した。このことにより、ペニシリウム・シンプリシシマム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｉｍｐｌｉｃｉｓｓｉｍｕｍ）の発現用プラスミドに導入することを可能とした。
【００７０】
５’−ＴＣＧＣＡＴＣＣＧＧＧＧＣＣＣＡＡＧＧＣＡＡＧＴＣＴＡ−３’ （配列番号１４）
５’−ＧＡＧＣＧＣＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＣ−３’ （配列番号１５）
【００７１】
ＰＣＲ断片はＡｐａＩで消化して、プラスミドｐＰｒＥＧのＡｐａＩ部位に挿入した。プラスミドｐＰｒＥＧはペニシリウム・カネスセンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｎｅｓｃｅｎｓ）由来の成熟β−ガラクトシダーゼ（ｂｇａＳ遺伝子）のプロモーター領域から同遺伝子のターミネーター領域を有するプラスミドである。ｐＰｒＥＧのＡｐａＩ部位は、ペニシリウム・カネスセンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｎｅｓｃｅｎｓ）由来β−ガラクトシダーゼのリーダーペプチドをコードする領域の直下流に存在しており、ＰＣＲ断片を翻訳フレームが合う様にクローニングした。
【００７２】
次に得られたプラスミドを制限酵素ＳｔｕＩとＮｏｔＩで二重消化し、ペニシリウム・カネスセンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｎｅｓｃｅｎｓ）由来の成熟β−ガラクトシダーゼをコードする領域を除去した。制限部位ＳｔｕＩとＮｏｔＩで境界の定まった残りのエンドグルカナーゼＭＴＥ１遺伝子をコードする領域は、このコンストラクトにフレームで融合した。
【００７３】
従って、得られたプラスミドｐＰｒＥＧ５にはペニシリウム・カネスセンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｎｅｓｃｅｎｓ）由来ｂｇａＳ遺伝子のプロモーター領域、ペニシリウム・カネスセンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｎｅｓｃｅｎｓ）由来β−ガラクトシダーゼのリーダーペプチドをコードする領域、ミリオコッカム・サーモフィラム（Ｍｙｒｉｏｃｏｃｃｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ ）由来のエンドグルカナーゼＭＴＥ１の翻訳領域とターミネーター領域、およびペニシリウム・シンプリシシマム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｉｍｐｌｉｃｉｓｓｉｍｕｍ）由来ｂｇａＳ遺伝子のターミネーター領域を含んでいた。
【００７４】
ｎｉａＤ遺伝子に突然変異のあるペニシリウム・シンプリシシマム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｉｍｐｌｉｃｉｓｓｉｍｕｍ）菌株を、同時形質転換の受容菌株として用いた。約５×１０８個のプロトプラストを、プラスミドｐＳＴＡ１０（ｎｉａＤ）とｐＰｒＥＧ５の混合物で同時形質転換した。ＮｉａＤ＋表現型を示した形質転換体について、次にエンドグルカナーゼ産生性を分析した。
【００７５】
この形質転換体をＣＭＣを含む寒天培地で培養した後にコンゴレッド染色して、コロニー周囲へのハロ形成能を調べた。その結果、試験した形質転換体のうちの、エンドグルカナーゼ陽性体の割合は約２０％であった。顕著なハロを示した形質転換体を選び、液体培地中での酵素産生性を調べた。具体的には２つの独立した形質転換実験で得た２種類の陽性形質転換体を調べた。
【００７６】
これらの形質転換体はいずれも非形質転換体と比較して７〜８倍高いエンドグルカナーゼ活性を示した。一方、液体培地中でのペニシリウム・シンプリシシマム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｉｍｐｌｉｃｉｓｓｉｍｕｍ）宿主に由来する酵素分泌活性には変化はなかった。液体培地のタンパク質についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったところ、いずれの形質転換体［（１−１６）株、（２−２１）株］にも新しいバンドが認められた。
【００７７】
〔実施例６〕 ｐＭＴＥ１の形質転換体の培養および特性解析
２つの形質転換体［（１−１６）株、（２−２１）株］を１０ｌのファーメンターにて実施例１記載の培養液を用いて培養した。培養後、濾過、ＵＦ膜による濃縮を経て最終的に凍結乾燥を行った。得られた凍結乾燥物のＣＭＣアーゼ （セルラーゼ）、β−グルコシダーゼ、キシラナーゼ、ポリガラクチュロナーゼ、マンナナーゼ、アミラーゼ、リパーゼ（以上ｐＨ５．０）、プロテアーゼ（ｐＨ５．０の基質はヘモグロビン、ｐＨ７．０およびｐＨ９．０の基質はカゼインを使用した）を測定した。その結果を以下の第１表、第２表、第３表に示す。
【００７８】
【表１】
【表２】
【表３】
〔実施例７〕 ペニシリウム・シンプリシシマム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｉｍｐｌｉｃｉｓｓｉｍｕｍ）で発現させたＭＴＥ１によるデニム染めセルロース含有繊維の脱色活性評価
１０ｃｍ×１０ｃｍのデニムを５００ｍｌ容のステンレスシリンダーに入れ、メタルボールを添加した。１０Ｕ／ｍｌの（１−１６）株、（２−２１）株およびフミコーラ由来のＮＣＥ４（国際公開第９８／０３６４０号パンフレット）を含む０．１ｍｏｌ／ｌの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）１００ｍｌを添加し、５０℃でシェーカーにて６０分間、２００ｒｐｍにて攪拌した。続いてデニムを取り出し、５分間蒸留水で水洗し、一夜乾燥させた。デニムの色の分析は、ＪＰＥＧデータとして取り込んだ後、ｌｅｖｅｌ ３０（Ｐ３０）値を計算した。
【００８２】
また、白場汚染は 白綿布（１０ｃｍ×１０ｃｍ）を５００ｍｌ容のステンレスシリンダーに入れ、１０Ｕ／ｍｌの（１−１６）株、（２−２１）株およびフミコーラ由来のＮＣＥ４（国際公開第９８／０３６４０号パンフレット）を含む０．１ｍｏｌ／ｌの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）および１ｍｇ／ｍｌのインジゴを含む溶液１００ｍｌを添加し、５０℃でシェーカーにて６０分間２００ｒｐｍにて攪拌した。続いて白綿布を取り出し、５分間蒸留水で水洗し、一夜乾燥させた着色度の分析は、ＪＰＥＧデータとして取り込んだ後、ｌｅｖｅｌ １１０（Ｐ１１０）の値を用いた。
【００８３】
その結果、デニムの脱色は（１−１６）株で３２．９、（２−２１）株で３５．１およびフミコーラ由来のＮＣＥ４で３１．４とほぼ同等であったのに対し、白場汚染は（１−１６）株で１．０、（２−２１）株で０．５およびフミコーラ由来のＮＣＥ４で３４．６となり、ＭＴＥ１はＮＣＥ４に比べ著しく白場汚染が低いことが示された。
【００８４】
〔実施例８〕ＭＴＥ１の界面活性剤中での安定性
（１−１６）株、（２−２１）株およびフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）由来のＮＣＥ４（国際公開第９８／０３６４０号パンフレット）のセルラーゼ溶液を、５ｇ／ｌのノニオン界面活性剤であるネオノール（オキシエチルノニルフェノール）中で５０℃において、ｐＨ５．０（０．１ｍｏｌ／ｌ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液）、ｐＨ７．０（０．１ｍｏｌ／ｌクエン酸−リン酸緩衝液）およびｐＨ９．０（０．１ｍｏｌ／ｌ炭酸−炭酸ナトリウム緩衝液）での安定性を調べた。３時間保温した後の残存活性を界面活性剤の無添加と比べた結果、ｐＨ５．０およびｐＨ７．０では（１−１６）株、（２−２１）株およびフミコーラ由来のＮＣＥ４とも約８０％の残存活性を示した。一方ｐＨ９．０では、（１−１６）株が約８０％、（２−２１）株が約９０％およびフミコーラ由来のＮＣＥ４が約８０％の残存活性を示した。
【００８５】
同様にして、アニオン界面活性剤であるＬＡＳ（リニアーアルキルベンゼンスルフォネート）５ｇ／ｌ中での安定性を測定した。ｐＨ５．０において（１−１６）株が約６０％、（２−２１）株が約５０％の残存活性を、フミコーラ由来のＮＣＥ４は約３５〜４０％の残存活性を示した。ｐＨ７．０およびｐＨ９．０では、全てのサンプルでほぼ１００％活性がなかった。
【００８６】
さらに、市販の洗剤を用いて安定性を測定した。のＴＩＤＥ（Ｐ＆Ｇ社製）を５ｇ／ｌの濃度に調製し、同様にして安定性を測定した。（１−１６）株および（２−２１）株は約８０〜９０％の残存活性を示したのに対し、ＮＣＥ４は３０％の残存活性であった。
【００８７】
【発明の効果】
本発明のエンドグルカナーゼＭＴＥ１は、洗剤組成物に使用される他、古紙の脱インキ、紙パルプのろ水性の改善、並びにセルロース含有繊維の毛羽立ちの低減、肌触りおよび外観の改善、色の澄明化、色の局所的変化、ごわつきの低減等に有用である。
【００８８】
【配列表】
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to an endoglucanase MTE1, a cellulase preparation containing the same, and a method for treating a cellulose-containing fiber using the same.
[0002]
[Prior art]
In order to impart desired properties to cellulose-containing fibers, the cellulose-containing fibers have been treated with cellulase. For example, in the textile industry, cellulase is used to improve the feel and appearance of cellulose-containing fibers, or to give colored cellulose-containing fibers the appearance of a "stone wash" that provides a localized change in color. [European Patent No. 307,564 (Patent Document 1)].
[0003]
At present, for the application of stone wash appearance to denim-dyed cellulose-containing fiber and improvement of touch, Trichoderma (wood enduring fungus)Trichoderma) And Humicola (Humicola) Is used. These cellulases are mixtures of a plurality of cellulase components. Their practical use has been hindered by the difficulties arising from the need to use large amounts of cellulase preparations to achieve the desired effect on cellulose-containing fibers. The disadvantages of the above cellulase preparations are being improved by preparations containing high amounts of endoglucanases. For example, cellulase preparations having enhanced endoglucanase activity are disclosed in WO 89/09259 (Patent Document 2), WO 91/17243 (Patent Document 3), and WO 98/03640 ( Patent Document 4) and WO 94/21801 (Patent Document 5). In addition, NCE4 (hereinafter sometimes abbreviated as “NCE4”), which is an endoglucanase component derived from Humicola, [International Patent Publication WO 98/03640 (Patent Document 4)] is a mixture of a plurality of conventionally known cellulase components. It is disclosed to have 25 times the jeans decolorizing activity and 100 times the lyocell fluff removing activity of a cellulase preparation.
[0004]
[Patent Document 1]
European Patent No. 307,564
[Patent Document 2]
International Publication No. 89/09259 pamphlet
[Patent Document 3]
International Publication No. 91/17243 pamphlet
[Patent Document 4]
WO 98/03640 pamphlet
[Patent Document 5]
International Publication No. 94/21801 Pamphlet
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
The treatment with the above cellulase was performed for the purpose of imparting a stone wash appearance to denim-dyed cellulose-containing fibers and improving the feel, but in that case, a part of the indigo dye was re-attached or reverse-dyed to the clothing during the treatment process That is, problems such as white field contamination occur. In addition, when cellulase is incorporated into a detergent, there is a problem that the stability is impaired by the surfactant and a sufficient effect is not produced.
[0006]
As an attempt to reduce the degree of contamination, there is a method in which a reagent such as a surfactant is added to the cellulase-treated solution to disperse the indigo dye. However, this method has the problem of increasing the cost of additional chemicals and increasing the environmental burden of the waste liquid. Therefore, in processing denim-dyed cellulose-containing fibers, a cellulase having high activity and low degree of white spot contamination has been desired. For detergents, cellulases having high stability in surfactants have been desired.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have now reported that the filamentous fungus Myriocockum thermophilum (Myriococcum thermophilum), A novel endoglucanase MTE1 having a high activity of disintegrating cellulose fibers and its gene have been found and provided.
[0008]
In addition, the endoglucanase MTE1 of the present invention was prepared using Penicillium simplicisimum (Penicillium simplecissimumIn the treatment of denim-dyed cellulose-containing fibers with a preparation obtained by expressing) as a host, it has been found to have the advantageous property that the degree of white spot contamination is significantly lower than that of NCE4. In addition, it has high stability in commercial detergents, and has shown extremely high usefulness as an enzyme for detergents. According to the protein of the present invention, in the treatment of denim-dyed cellulose-containing fibers, the amount of addition of chemicals such as surfactants is reduced, and as a result, the cost reduction is put into practical use and the burden on the environment is reduced. Can be achieved. In addition, the stability in a commercially available detergent is high, and the generation of fluff of cotton fibers can be effectively suppressed and the fluff can be efficiently removed. From this point of view, it is possible to reduce costs and reduce the burden on the environment.
[0009]
Accordingly, the present invention provides a novel protein having endoglucanase activity and a gene thereof, which have a low degree of white spot contamination and a high stability in a commercially available detergent in treating denim-dyed cellulose-containing fibers. The present invention also provides a host cell transformed with the gene, and a method for culturing the host cell to collect a target protein. Further, the present invention provides a cellulase preparation containing the protein of the present invention and having good properties, and an efficient and inexpensive method for treating cellulose-containing fibers using the same.
[0010]
That is, the present invention includes the following inventions.
(1) a protein having the following properties (A) and (B):
(A) having endoglucanase activity,
(B) The amino acid sequence at the N-terminus is the sequence represented by SEQ ID NO: 3.
(2) a protein selected from the group consisting of:
(A) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2,
(B) a modified protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been substituted, deleted, added or inserted in the amino acid sequence of (a), and which has endoglucanase activity; and
(C) A homologous protein comprising an amino acid sequence having at least 80% homology with the protein comprising the amino acid sequence of (a), and having endoglucanase activity.
(3) Myriocockum (MyriococcumThe protein according to (1) or (2), which is derived from a filamentous fungus belonging to (1).
(4) Milliocockham Thermofilum (Myriococcum thermophilumThe protein according to (3), which is derived from a filamentous fungus belonging to (3).
(5) A polynucleotide that encodes the protein according to any one of (1) to (4).
(6) The polynucleotide according to (5), which is a DNA.
(7) a polynucleotide selected from the group consisting of:
(I) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(Ii) a polynucleotide consisting of a base sequence having at least 80% homology to the polynucleotide consisting of the base sequence of (i) and encoding a protein having endoglucanase activity;
(Iii) a polynucleotide comprising a base sequence in which one or more bases are substituted, deleted, added or inserted in the base sequence of (i), and which encodes a protein having endoglucanase activity; and
(Iv) a polynucleotide that hybridizes with the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of (i) under stringent conditions and encodes a protein having endoglucanase activity.
(8) The polynucleotide according to (7), wherein (7) (ii) comprises a nucleotide sequence having at least 90% homology with the polynucleotide comprising the nucleotide sequence of (7) (i).
(9) The polynucleotide according to (7), wherein (7) (ii) comprises a nucleotide sequence having at least 95% homology with the polynucleotide comprising the nucleotide sequence of (7) (i).
(10) A recombinant vector comprising the polynucleotide according to any one of (1) to (9).
(11) A host cell transformed with the recombinant vector according to (10).
(12) The host cell according to (11), wherein the host cell is a yeast or a filamentous fungus.
(13) The yeast is Saccharomyces (SaccharomycesGenus, Hansenula (Hansenula) Or Pichia (Pichia) The host cell according to (12), which belongs to the genus.
(14) The yeast is Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae(13) The host cell according to (13).
(15) The filamentous fungus is Humicola (Humicola) Genus, Aspergillus (Aspergillus) Genus, Trichoderma (Trichoderma) Genus, Fusarium (Fusarium), Penicillium (Penicillium) Or acremonium (Acremonium) The host cell according to (12), which belongs to the genus.
(16) The filamentous fungus is Humicola Insolens (Humicola insolens), Aspergillus niger (Aspergillus niger) Or Aspergillus oryzae (Aspergillus oryzae), Trichoderma billide (Trichoderma viride), Fusarium oxysporum (Fusarium oxysporum), Penicillium SimplicityPenicillium simplecissimum) Or Acremonium cellulolyticus (Acremonium cellulolyticusThe host cell according to (15), which is).
(17) The host cell according to any one of (11) to (16) is cultured, and the protein according to any one of (1) to (4) is cultured from the host and / or the culture thereof. The method for producing a protein according to any one of (1) to (4), comprising a step of collecting the protein.
(18) A protein produced by the method according to (17).
(19) A cellulase preparation comprising the protein according to any one of (1) to (4) and (18).
(20) A method for treating a cellulose-containing fiber, wherein the cellulose-containing fiber is mixed with the protein according to any one of (1) to (4) and (18) or the cellulase preparation according to (19). A method comprising the step of contacting.
(21) A method for reducing the rate at which the cellulose-containing fiber starts fluffing or reducing the fluffing of the cellulose-containing fiber, wherein the cellulose-containing fiber is any one of (1) to (4) and (18). A method comprising contacting with a protein according to claim 1 or a cellulase preparation according to (19).
(22) A method for performing weight reduction processing for the purpose of improving the feel and appearance of the cellulose-containing fiber, wherein the cellulose-containing fiber is a protein according to any one of (1) to (4) and (18), or A method comprising contacting with the cellulase preparation according to (19).
(23) A method for clarifying the color of a colored cellulose-containing fiber, wherein the colored cellulose-containing fiber is a protein according to any one of (1) to (4) and (18), or A method comprising treating with the cellulase preparation according to (19).
(24) A method for providing a local change in the color of a colored cellulose-containing fiber, wherein the colored cellulose-containing fiber is described in any one of (1) to (4) and (18). Or a treatment with the cellulase preparation of (19).
(25) A method for reducing the rate at which the cellulose-containing fiber starts to stiffen or reducing the stiffness of the cellulose-containing fiber, wherein the cellulose-containing fiber is any one of (1) to (4) and (18). Or a cellulase preparation according to (19).
(26) The method according to any one of (20) to (25), wherein the treatment of the fiber is performed through dipping, washing, or rinsing the fiber.
(27) The protein according to any one of (1) to (4) and (18), or the cellulase preparation according to (19), in the form of non-dispersible granules or a stabilized liquid. Detergent additive comprising.
(28) A detergent composition comprising the protein according to any one of (1) to (4) and (18), or the cellulase preparation according to (19).
(29) The protein according to any one of (1) to (4) and (18) or the cellulase preparation according to (19) in the step of treating the used paper with a deinking chemical to deink. A method for deinking waste paper, characterized by using
(30) A method for improving the drainage of paper pulp, wherein the paper pulp is the protein according to any one of (1) to (4) and (18), or the cellulase preparation according to (19). A method comprising the step of:
(31) A method for improving digestibility of animal feed, wherein the cellulose-containing fiber is a protein according to any one of (1) to (4) and (18), or a cellulase according to (19). A method comprising treating with a preparation.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
[0011]
Protein having endoglucanase activity
As used herein, “endoglucanase” refers to an enzyme having endoglucanase activity, that is, endo-1,4-β-glucanase (EC 3.2.1.4), and the enzyme is β-1,4. -Hydrolyzes the β-1,4-glucopyranosyl bond of glucan. In addition, “endoglucanase activity” in the present specification means CMCase activity. Further, “CMCase activity” means an activity of hydrolyzing carboxymethylcellulose (CMC, manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), and the amount of reducing sugar released after incubating a test protein and a CMC solution for a certain period of time. The amount of the enzyme which measures and produces 1 μmol of glucose-equivalent reducing sugar per minute is defined as one unit.
[0012]
The endoglucanase activity can be measured, for example, by the following procedure. First, 0.5 mL of a solution containing a test protein is added to 0.5 mL of 50 mmol / L acetic acid-sodium acetate buffer (pH 6.0) in which 2% CMC is dissolved, and the mixture is incubated at 50 ° C. for 30 minutes. Next, the produced reducing sugar concentration of the obtained reaction solution is quantified by the 3,5-dinitrosalicylic acid method (DNS method). That is, 3.0 mL of the DNS reagent is added to 1.0 mL of the reaction solution 30 minutes after the reaction, incubated for 5 minutes in a boiling water bath, diluted with 8.0 mL of distilled water, and the absorbance at 540 nm is measured. A calibration curve is prepared using the glucose solution diluted stepwise, and the amount of reducing sugars produced in the enzyme reaction solution is determined in terms of glucose. The activity is calculated based on the amount of enzyme that produces 1 μmol of reducing sugar equivalent to glucose per minute as one unit. The DNS reagent can be prepared according to the description in the literature (for example, “Biochemical Experiment Method 1—Quantitative Determination of Reducing Sugars”, pp. 19-20, by Sakuzo Fukui, Gakkai Shuppan Center). Can be prepared by the following procedure. First, 880 mL of a 1% 3,5-dinitrosalicylic acid solution and 255 g of Rossel's salt are added to 300 mL of a 4.5% aqueous sodium hydroxide solution (solution A). Separately, crystalline phenol (10 g) is added to a 1.0% aqueous sodium hydroxide solution (22 mL), and water is further added to dissolve the solution to 100 mL (solution B). 6.9 g of sodium hydrogen carbonate is added to and dissolved in 69 mL of the solution B, and the solution A is poured, and the mixture is stirred and mixed until the Rossell salt is sufficiently dissolved.
[0013]
The protein according to the present invention is a filamentous fungus, specifically, myriocockum (Myriococcum) Genus, such as myriocockham thermophilum (Myriococcum thermophilum), More preferably Milliocockham thermophilum (Myriococcum thermophilum) FERGUSMBL2883 (FERM P-18841) or a mutant strain thereof.
[0014]
Further, the protein according to the present invention typically has the amino acid sequence at the N-terminal thereof represented by SEQ ID NO: 3. The N-terminal amino acid sequence can be determined, for example, by the method described in Example 2 below.
[0015]
According to the present invention, the miriocock (MyriococcumA) a protein of the genus having the following properties is provided:
(A) having endoglucanase activity,
(B) The amino acid sequence at the N-terminus is the sequence represented by SEQ ID NO: 3.
[0016]
In another aspect of the present invention, there is provided a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and a modified protein thereof or a homologous protein thereof.
[0017]
The "protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2" includes a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and 1 to 20 which are considered to be signal peptides in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. The protein having the 21st to 266th amino acid sequence is included.
[0018]
The “modified protein” in the present invention refers to a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been substituted, deleted, added or inserted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and which has endoglucanase activity. It is. Here, the number of amino acids involved in modification such as “substitution, deletion, addition or insertion” is preferably 1 to 30, more preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and further preferably 1 ~ 6.
[0019]
Further, the modified protein includes a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in which one or more amino acid residues have a conservatively substituted amino acid sequence and having endoglucanase activity. . Here, “conservative substitution” means replacing one or more amino acid residues with another chemically similar amino acid so as not to substantially alter the activity of the protein. For example, a case where a certain hydrophobic residue is replaced with another hydrophobic residue, a case where a certain polar residue is replaced with another polar residue having the same charge, and the like can be mentioned. Functionally similar amino acids that can make such conservative substitutions are known in the art for each amino acid. Specifically, non-polar (hydrophobic) amino acids include alanine, valine, isoleucine, leucine, proline, tryptophan, phenylalanine, methionine and the like. Examples of polar (neutral) amino acids include glycine, serine, threonine, tyrosine, glutamine, asparagine, and cysteine. Examples of (basic) amino acids having a positive charge include arginine, histidine, lysine and the like. Examples of the negatively charged (acidic) amino acid include aspartic acid and glutamic acid.
[0020]
“Homologous protein” in the present invention refers to a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 at least 80%, more preferably 85%, more preferably 90%, more preferably 95%, and still more preferably 98%. A protein comprising an amino acid sequence having homology and having endoglucanase activity. The homology numerical values shown here are based on FASTA3 [Science, 227, 1435-1441 (1985); a homology search program known to those skilled in the art; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2444-2448 (1988); http: // www. ddbj. nig. ac. jp / E-mail / homology-j. [html] using the default (initial setting) parameters.
[0021]
The protein of the present invention can be obtained by, for example, isolating and purifying from a microorganism as described in Example 1. Alternatively, it can also be obtained by expressing a polynucleotide encoding the protein of the present invention in a suitable host by a gene recombination technique as described below, and isolating and purifying the produced protein.
[0022]
Polynucleotide encoding a protein having endoglucanase activity
According to the present invention, there is provided a polynucleotide encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, its modified protein and its homologous protein (hereinafter, simply referred to as “protein of the present invention”). Given the amino acid sequence of a protein, the DNA sequence encoding it can be easily determined, and thus various polynucleotides encoding the protein of the present invention can be selected. In this specification, the term “polynucleotide” includes both DNA and RNA, and DNA is preferable.
[0023]
The polynucleotide of the invention is typically one selected from the group consisting of:
(I) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(Ii) a polynucleotide consisting of a base sequence having at least 80% homology to the polynucleotide consisting of the base sequence of (i) and encoding a protein having endoglucanase activity;
(Iii) a polynucleotide comprising a base sequence in which one or more bases are substituted, deleted, added or inserted in the base sequence of (i), and which encodes a protein having endoglucanase activity; and
(Iv) a polynucleotide that hybridizes with the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of (i) under stringent conditions and encodes a protein having endoglucanase activity.
[0024]
The number of bases in which one or more bases may be substituted, deleted, added or inserted in the base sequence (i) is specifically 1 to 60, preferably 1 to 40, The number is preferably 1 to 30, more preferably 1 to 18, and still more preferably 1 to 9.
[0025]
Here, the “stringent conditions” in the above (iv) means that a probe comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a polynucleotide encoding a homologous protein hybridize while But Mirio Cockham (Myriococcum) (US Pat. No. 6,184,019) means conditions that are controlled to such an extent that they do not hybridize.
[0026]
More specifically, for example, a probe having a full-length nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of labeled endoglucanase MTE1 is used, and the hybridization conditions are basically the same as those of Hybond.TM-N (manufactured by Amasham) according to the method described in the instruction manual. Specifically, first, a prehybridization solution (6.25 ml of a 20-fold SSPE solution, 1.25 ml of a 100-fold Denhardt Vs solution, and 1.25 ml of a 10% SDS solution filled up to 25 ml with water) is prepared. I do. 0.5 ml of the sonicated DNA solution (1 mg / ml) is kept at 100 ° C. for 5 minutes. Thereafter, the mixture is cooled on ice and a nylon membrane (HybondTM-N) and the pre-hybridization solution. Subsequently, the label (P) treated at 65 ° C. for 1 hour and subjected to denaturation (treated at 100 ° C. for 5 minutes)32) Probe is added to the pre-hybridization bag. Here, the concentration of the probe should not exceed 20 ng / ml. Then, after incubating at 65 ° C. for 12 hours, the membrane is taken out and rinsed in a 2 × SSPE and 0.1% SDS solution for 10 minutes. This operation is repeated twice. The solution is changed to 1x SSPE, 0.1% SDS and treated at 65 ° C for 15 minutes. Further, the solution is changed to 0.1 times SSPE and 0.1% SDS, and treated at 65 ° C. for 10 minutes.
[0027]
The polynucleotide according to the present invention may be of natural origin, may be totally synthesized, or may be synthesized by utilizing a part of naturally occurring polynucleotide. As a typical method for obtaining the polynucleotide according to the present invention, a method commonly used in the field of genetic engineering from a cDNA library of Myriocockum thermophilum, for example, a suitable DNA probe prepared based on partial amino acid sequence information is used. And a method for screening.
[0028]
A typical sequence encoding the amino acid sequence of endoglucanase MTE1 according to the present invention is one having part or all of the polynucleotide set forth in SEQ ID NO: 1. The polynucleotide set forth in SEQ ID NO: 1 has an open reading frame beginning with ATG at positions 1 to 3 and ending with TAA at positions 799 to 801. The 61st to 63rd polynucleotides correspond to the N-terminal amino acids of the mature protein having an amino acid sequence of 246 residues.
[0029]
Expression vector and transformed microorganism
In the present invention, the nucleotide sequence encoding the protein of the present invention (hereinafter, simply referred to as “polynucleotide according to the present invention”) is capable of replicating in a host microorganism and expressing the protein encoded by the polynucleotide. An expression vector comprising a possible condition is provided. The expression vector can be constructed on the basis of a self-replicating vector, that is, an extrachromosomal independent entity, the replication of which does not depend on chromosomal replication, for example, a plasmid. In addition, when the present expression vector is introduced into a host microorganism, it may be integrated into the genome of the host microorganism and replicated together with the chromosome in which it has been integrated. The procedure and method for constructing a vector according to the present invention may be those commonly used in the field of genetic engineering.
[0030]
The expression vector according to the present invention is, in addition to the above-described polynucleotide according to the present invention, a polynucleotide for controlling the expression and a transformant, in order to actually introduce the vector into a host microorganism to express a protein having a desired activity. It preferably contains a genetic marker or the like for selecting a body. Polynucleotides that control expression include promoters, terminators, DNA sequences encoding signal peptides, and the like. The promoter is not particularly limited as long as it exhibits transcription activity in the host microorganism, and can be obtained as a DNA sequence that controls the expression of a gene encoding a protein of the same or different type as the host microorganism. The signal peptide is not particularly limited as long as it contributes to the secretion of the protein in the host microorganism, and may be obtained from a DNA sequence derived from a gene encoding any of the same or different proteins as the host microorganism. it can. The gene marker in the present invention may be appropriately selected depending on the method for selecting a transformant. For example, a gene encoding drug resistance and a gene complementing auxotrophy can be used.
[0031]
Further, according to the present invention, there is provided a microorganism transformed with the expression vector. The host-vector system is not particularly limited, and for example, a system using Escherichia coli, actinomycetes, yeast, filamentous fungi and the like, and a fusion protein expression system with other proteins using them can be used. The transformation of a microorganism with the expression vector can also be performed according to a method commonly used in this field.
[0032]
Further, the transformant can be cultured in an appropriate medium, and the above-mentioned protein of the present invention can be isolated from the culture and obtained. Therefore, according to another aspect of the present invention, there is provided a method for producing the above-mentioned protein of the present invention. The culture of the transformant and its conditions may be essentially equivalent to that of the microorganism used. After culturing the transformant, a method commonly used in this field can be used to recover the target protein.
[0033]
According to a preferred embodiment of the present invention, there is provided a yeast cell capable of expressing an endoglucanase encoded by the DNA sequence of the present invention. As the yeast cell in the present invention, for example, Saccharomyces (SaccharomycesGenus, Hansenula (Hansenula) Or Pichia (Pichia), Such as Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae).
[0034]
In the present invention, the host filamentous fungus is Humicola (Humicola) Genus, Aspergillus (AspergillusGenus or Trichoderma (Trichoderma) Genus, Fusarium (Fusarium) Genus, penicillium (Penicillium) Or Acremonium (Acremonium) Genus. Further, as preferred examples thereof, Humicola Insolens (Humicola insolens), Aspergillus niger (Aspergillus niger) Or Aspergillus oryzae (Aspergillus oryzae) Or Trichoderma bilide (Trichoderma viride), Fusarium oxysporum (Fusarium oxysporum), Penicillium SimplicityPenicillium simplecissimum) Or Acremonium cellulolyticus (Acremonium cellulolyticus).
[0035]
Microbial deposit
Mirio Cockham Thermofilum (Myriococcum thermophilum) FERGUS MBL2883 was deposited on April 26, 2002 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary (Central No. 6, Higashi 1-1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan 305-8566, Japan). Was. The accession number is FERM P-18841.
E. coli transformed with plasmid pEMT containing the endoglucanase MTE1 gene (Escherichia coli) JM109 strain was deposited on April 26, 2002 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary (Central No. 6, Higashi 1-1-chome, Tsukuba, Ibaraki 305-8566, Japan). Was. The accession number is FERM P-18840.
[0036]
Cellulase Applications / Cellulase Preparations
The present invention relates to a cellulase preparation comprising the protein of the present invention and a protein obtained by culturing the host cell of the present invention (hereinafter, referred to as “the protein of the present invention”).
The cellulase preparation according to the present invention may contain other cellulases, such as cellobiohydrolase, β-glucosidase and endoglucanase other than the present invention, in the protein or the like of the present invention, and are generally included in the cellulase preparation. It may be manufactured by mixing with components such as excipients (eg, lactose, sodium chloride, sorbitol, etc.), surfactants, preservatives and the like. In addition, the cellulase preparation of the present invention can be prepared in any suitable form, for example, a powder or liquid.
[0037]
Furthermore, according to the present invention, a method for clarifying a colored cellulose-containing fiber, comprising a step of treating the colored cellulose-containing fiber with the protein or the like or the cellulase preparation, and a colored cellulose-containing fiber To provide a local change in the color of the cellulose fibers, i.e., to give the colored cellulose-containing fibers the appearance of a stonewash. Then, the method comprises a step of treating the colored cellulose-containing fiber with the protein or the like or the cellulase preparation.
[0038]
The method according to the invention can be carried out by treating the cellulose-containing fibers during washing. However, the treatment of the fibers may optionally be carried out during soaking or rinsing by adding the protein or the like or the cellulase preparation to the water in which the fibers are or can be soaked.
[0039]
Further, according to the present invention, there is provided a method for reducing the speed at which the cellulose-containing fiber starts fluffing, reducing the fluffing, reducing the speed at which the skin feels poor, or reducing stiffness. The method comprises the step of treating the cellulose-containing fiber with the protein or the like or the cellulase preparation.
[0040]
The conditions such as the contact temperature, the amount of the protein or the like or the amount of the cellulase preparation to be added may be appropriately determined in consideration of other various conditions, for example, for the purpose of improving the feel and appearance of the cellulose-containing fiber. In the case of weight reduction processing, the treatment can be performed at a temperature of about 50 to 60 ° C. by using the above protein or the like or the above cellulase preparation having a protein concentration of 1 to 100 mg / L. Further, when a local change in the color of the colored cellulose-containing fiber is caused, the treatment is carried out at a temperature of about 50 to 60 ° C. by using the protein or the cellulase preparation having a protein concentration of 2 to 50 mg / L. be able to.
[0041]
When the speed at which fluffing of the cellulose-containing fiber starts to be reduced or the fluffing is reduced, the above protein or the like or the above cellulase preparation having a protein concentration of 0.05 to 10 mg / L at a temperature of about 50 to 60 ° C is used. Can be processed.
[0042]
In addition, by using the protein or the like or the cellulase preparation of the present invention in a detergent composition, it is possible to improve the removal of granular soil, the clarification of color, the removal of fluff, the removal of pilling, and the reduction of hand roughness. The detergent compositions defined by the present invention may also contain surfactants, which may be anionic, nonionic, cationic, amphoteric or zwitterionic or mixtures thereof.
[0043]
In addition, the detergent compositions of the present invention may contain other detergent components known in the art, such as builders, bleaches, bleach activators, corrosion inhibitors, sequestrants, soil release polymers, fragrances, other enzymes ( Protease, lipase, amylase, etc.), enzyme stabilizer, formulation aid, optical brightener, foaming accelerator and the like. Representative anionic surfactants include linear alkyl benzene sulfonates (LAS), alkyl sulfates (AS), alpha-olefin sulfonates (AOS), alcohol ethoxy sulfates (AES) and alkali metal salts of natural fatty acids. Examples of nonionic surfactants include fatty acid esters of polyoxyethylene alkyl ether (AE), alkyl polyethylene glycol ether, nonylphenol polyethylene glycol ether, sucrose, and glucose, and esters of polyethoxylated alkyl glucoside.
[0044]
The protein or the like or the cellulase preparation of the present invention can be deinked by acting on waste paper. Thereby, in the process of producing recycled paper from waste paper, the treatment with the endoglucanase according to the present invention can significantly improve. As the waste paper used in the present invention, all the commonly used waste papers can be used.For example, mechanical pulp, newspaper waste paper containing chemical pulp, magazine waste paper, low- to intermediate-grade printing waste paper, high-quality waste paper made of chemical pulp, and coatings thereof. Used printing paper such as industrial paper is included.
[0045]
The deinking chemicals referred to in the present invention generally refer to chemicals used for deinking used paper, and include alkalis such as sodium hydroxide and sodium carbonate, sodium silicate, hydrogen peroxide, phosphate, and anionic and nonionic chemicals. Surfactants, collecting materials such as oleic acid, and auxiliary agents such as pH stabilizers, chelating agents, and dispersants.
[0046]
Further, according to the present invention, it is considered that the drainage of paper pulp can be significantly improved by treatment with the protein or the like or the cellulase preparation of the present invention without a significant decrease in strength. Thus, according to the present invention, there is provided a method for improving the drainage of pulp, comprising the step of treating paper pulp with a protein or the like or a cellulase preparation of the present invention. Examples of pulp that can be treated with the present invention include waste paper pulp, recycled paperboard pulp, kraft pulp, sulfite pulp, or thermomechanical and other high yield pulp.
[0047]
Furthermore, the present invention relates to a method for improving the digestibility of animal feed, comprising the step of treating the animal feed with the protein or the like of the present invention or the cellulase preparation of the present invention. According to the method, glucan in the animal feed is appropriately reduced in molecular weight, so that the digestibility of the animal feed can be improved.
[0048]
Furthermore, by using the protein or the like of the present invention in animal feed, the digestibility of glucan in the feed can be improved. Thus, according to the present invention, there is provided a method for improving the digestibility of an animal feed, comprising the step of treating the animal feed with the protein or the like of the present invention or the cellulase preparation of the present invention.
[0049]
【Example】
The present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples unless it exceeds the gist.
[0050]
[Example 1]Isolation and purification of endoglucanase component from Myriococcum thermophilum
Mirio Cockham Thermofilum (Myriococcum thermophilum) FERGUS MBL2883 (FERM P-18841) was inoculated into a PDA medium (20% potato leachate, 2.0% glucose, pH 5.6) and cultured with shaking at 25 ° C. After culturing for 7 days, the culture solution was subjected to suction filtration to remove cells, and the obtained culture supernatant was concentrated by ultrafiltration and lyophilized to obtain a crudely purified cellulase preparation.
[0051]
The crudely purified cellulase preparation was subjected to ammonium sulfate salting-out according to a conventional method, and after desalting, equilibrated with a 0.025 mol / l imidazole-hydrochloric acid buffer solution (pH 7.0), and applied to a monoP column to give a pH of 7.5 to 4. Eluted at 0.3. When the CMC (carboxymethyl cellulose) ase activity (pH 5.0, 50 ° C.) of the eluted fraction was measured, the activity was observed in fractions 6 to 10.
[0052]
All fractions were subjected to a denim wash test. A 10 cm × 10 cm denim piece was placed in a rounder meter, an enzyme fractionated as 5 U / ml as CMCase was added, and the mixture was treated at pH 5.0 and 50 ° C. for 60 minutes. As a result, fraction 10 showed strong denim bleaching compared to the other fractions.
[0053]
Further, the CMCase activity of the enzyme in each fraction was measured at 50 ° C., pH 5.0, pH 7.0, and pH 9.0. As a result, fraction 10 showed a relatively high activity at pH 9.0.
[0054]
Furthermore, the residual activity at pH 5.0 and pH 7.0 at 50 ° C. in the presence of 2.5 g / l of LAS, which is a typical anionic surfactant whose endoglucanase in fraction 10 is frequently used in detergents, is described. As a result, extremely high residual activity was shown in the treatment time up to 120 minutes.
[0055]
Here, 6 ml of the obtained active fraction was adjusted to 50 mmol / l acetate buffer (pH 4.0), and then equilibrated in advance with 50 mM acetate buffer (pH 4.0). A 5/5 HR column (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) was applied at a flow rate of 1 ml / min. Next, from 50 mmol / l acetate buffer (pH 4.0) to 1 mol / l sodium chloride in 50 mmol / l acetate buffer (pH 5.0), elution was performed at a flow rate of 1 ml / min by a linear gradient elution method. Painted. Among these, a part of the fraction obtained when the concentration of sodium chloride was about 0.1 mol / l had strong fluff removal activity. Therefore, 1 to 3 ml of this fraction was collected. This fraction was isolated as endoglucanase MTE1. This endoglucanase MTE1 showed a single band on SDS-PAGE. The process of purification of MTE1 so far was repeated 50 times, and a large amount of purified samples were obtained.
[0056]
[Example 2]Partial amino acid sequence of endoglucanase MTE1
(1) Identification of N-terminal amino acid sequence
Fraction 10 was applied to a monoP column and chromatofocusing was performed. This resulted in purification to a single protein. When the CMCase activity of this protein was measured, it was 28 U / mg at pH 5.0, 15 U / mg at pH 7.0, and the molecular weight measured by SDS-PAGE was about 28 kDa. The protein was recovered by the acetone precipitation method, and the N-terminal amino acid was measured. As a result, the following sequence was obtained.
[0057]
N-terminal amino acid sequence of endoglucanase MTE1
AADGKSTRYWDCCKPSCSW (SEQ ID NO: 3)
[0058]
[Example 3]Cloning of endoglucanase MTE1 gene
In order to isolate the gene of the endoglucanase MTE1 of the present invention, a myriococcum thermophilum (Myriococcum thermophilum) Genomic DNA was isolated and purified from FERGUS MBL2883 according to a conventional method.
Subsequently, PCR was performed according to a conventional method using the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 4 and 5 as primers and genomic DNA as a template.
[0059]
5'-AAGAATTCTGYGCNTGGCCNAAR-3 (SEQ ID NO: 4) 5'-AARCTGTCCAARGTYTTTRGCCCTAGGAA-3 (SEQ ID NO: 5)
[0060]
As a result of subjecting the amplified product to agarose gel electrophoresis, the fragment was almost single, and the fragment was pUC129 (Keem NT, Tamaki S., Kobayashi D., Trolllinger D. Improved broad-host-range). Plasmid for DNA cloning in gram-negative bacteria. Gene, 1988 v. 70, pp. 191-197).
[0061]
Mirio Cockham Thermofilum (Myriococcum thermophilum) The entire genome of FERGUS MBL2883 is restricted with a restriction enzyme (PstI,SphI,SalGI,ClaI,SacI,XbaI,NdeI,EcoRI,SacII,HindIII,XhoI andBamAfter digestion with HI), hybridization was performed using the DNA fragment subcloned in pUC129 described above as a probe. Hybridization conditions are basically HybondTM-N (manufactured by Amasham) according to the method described in the instructions attached thereto. First, a prehybridization solution (6.25 ml of a 20-fold SSPE solution, 1.25 ml of a 100-fold Denhardt Vs solution, and 1.25 ml of a 10% SDS solution filled up to 25 ml with water) was prepared. 0.5 ml of the sonicated DNA solution (1 mg / ml) was kept at 100 ° C. for 5 minutes. Thereafter, the mixture is cooled on ice and a nylon membrane (HybondTM-N) and a pre-hybridization solution. Subsequently, the label (P) treated at 65 ° C. for 1 hour and subjected to denaturation (treated at 100 ° C. for 5 minutes)32) Was added to the pre-hybridization bag. The concentration of the probe did not exceed 20 ng / ml. Then, the mixture was incubated at 65 ° C. for 12 hours. Subsequently, the membrane was rinsed in a 2 × SSPE and 0.1% SDS solution for 10 minutes, and this operation was repeated twice. The solution was changed to 1x SSPE, 0.1% SDS and treated at 65 ° C for 15 minutes. Furthermore, the solution was changed to 0.1 times SSPE and 0.1% SDS, and treated at 65 ° C. for 10 minutes.
[0062]
as a result,NdeI,ClaI andXbaIt was found that I digestion hybridized to a DNA fragment larger than 10 kb. Also,Sph8kb at I,Sac8 kb in II,Hin6 kb in dIII,Sal5kb in GI,Eco4 kb in RI,Xho3.7kb at I,SacI was found to hybridize to a fragment having a molecular weight of about 1 kb.
[0063]
[Example 4]Determination of gene sequence of endoglucanase MTE1 gene
Milliocockham thermophilum described in Example 3 (Myriococcum thermophilum) After circularizing the EcoRI fragment (4 kb) of the genomic DNA of FERGUS MBL2883, a direct PCR reaction of the obtained circular product was carried out using the following primers.
[0064]
5'-CCCAGACCACGAGCACGACGG-3 '(SEQ ID NO: 6)
5'-TCAAGCCTGGCTGCCAGTGGC-3 '(SEQ ID NO: 7)
[0065]
Subsequently, the obtained PCR product isEcoDigested with RI,EcoWith RIEcoIt was cloned into pUC129 digested with RV according to a conventional method. Plasmid DNA was isolated, and the nucleotide sequence of the inserted PCR product was determined according to a conventional method. At this time, the following primers were used together with standard primers for the pUC vector.
[0066]
5'-TGCAGGCGCGACGACGAC-3 '(SEQ ID NO: 8)
5'-CGCCGAGTTTCATTCTCACC-3 '(SEQ ID NO: 9)
5'-TGCCCGGGGAGCCGACC-3 '(SEQ ID NO: 10)
5'-AGACCCTGAATATACGGCA-3 '(SEQ ID NO: 11)
5'-CATCGGCGGGCGATGCGA-3 '(SEQ ID NO: 12)
5'-CGCATTCTGGTGGGGGTCT-3 '(SEQ ID NO: 13)
[0067]
Analysis of this sequence revealed an open reading frame (ORF) of 798 bp. The protein predicted from this sequence was 266 amino acid residues, approximately 28 kDa, and was found to show homology to endoglucanase. Was. In addition, the protein showing the highest homology was myriocockum (Arja Miettinen-Oinonen et al.).Myriococcum) 20 kDa cellulase (US Pat. No. 6,184,019), with a homology of 75%. The nucleotide sequence of the ORF of the endoglucanase MTE1 gene of the present invention thus isolated is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and its amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2. The N-terminal amino acid sequence was identical to SEQ ID NO: 3 examined in Example 2. The amino acid sequences of the polynucleotide and the coding region of the endoglucanase gene were interrupted by two 67-bp and 57-bp introns.
[0068]
Next, according to a conventional method, a gene library of myriocockam thermophilum was prepared using EMBL3, and phages containing the full-length endoglucanase MTE1 gene were screened. Thereafter, an EcoRI-EcoRI fragment (3.2 kb) containing the endoglucanase MTE1 gene was cloned into the pBluescript II KS vector, and the plasmid pEMT (FERM P-18840) was isolated.
[0069]
[Example 5]Expression of endoglucanase MTE1 gene in Penicillium simplicissimum
Using the endoglucanase MTE1 gene isolated in Example 4 as a template, amplification was performed by PCR using the following primers, and an ApaI restriction enzyme site was introduced into the endoglucanase MTE1 gene sequence. As a result, Penicillium SimplicityPenicillium simplecissimum)).
[0070]
5'-TCGCATCCGGGGCCCAAGGCAAGTCTA-3 '(SEQ ID NO: 14)
5'-GAGCGCATAACAAATTTCACACAGC-3 '(SEQ ID NO: 15)
[0071]
The PCR fragmentApaAnd inserted into the ApaI site of plasmid pPrEG. Plasmid pPrEG contains Penicillium canes sense (Penicillium canescens) Is a plasmid having a promoter region from a mature β-galactosidase (bgaS gene) derived from the promoter region of the gene. The ApaI site of pPrEG contains a Penicillium canes sense (Penicillium canescens) The PCR fragment that was present immediately downstream of the region encoding the leader peptide of derived β-galactosidase was cloned so that the translation frame matched.
[0072]
Next, the obtained plasmid isStuI andNotI and double digested with Penicillium canessense (Penicillium canescens), The region encoding mature β-galactosidase was removed. Restriction siteStuI andNotThe region encoding the remaining endoglucanase MTE1 gene, delimited by I, was fused in frame to this construct.
[0073]
Therefore, the obtained plasmid pPrEG5 contains Penicillium canes sense (Penicillium canescens) -Derived bgaS gene promoter region, Penicillium canes sense (Penicillium canescens) -Derived β-galactosidase leader peptide-encoding region, myriocockum thermophilum (Myriococcum thermophilum) -Derived endoglucanase MTE1 translation region and terminator region, and Penicillium simplicisimum (Penicillium simplecissimum) Originated bgaS gene.
[0074]
penicillium simplicisimam with a mutation in the niaD gene (Penicillium simplecissimum) The strain was used as recipient strain for co-transformation. About 5 × 108Protoplasts were co-transformed with a mixture of plasmids pSTA10 (niaD) and pPrEG5. Transformants showing a NiaD + phenotype were then analyzed for endoglucanase productivity.
[0075]
The transformant was cultured on an agar medium containing CMC and stained with Congo red to examine the ability to form halos around colonies. As a result, the ratio of endoglucanase-positive ones among the tested transformants was about 20%. A transformant showing a remarkable halo was selected, and the enzyme productivity in a liquid medium was examined. Specifically, two types of positive transformants obtained in two independent transformation experiments were examined.
[0076]
All of these transformants showed 7 to 8 times higher endoglucanase activity than the non-transformants. On the other hand, penicillium simplicisimum (Penicillium simplecissimum) There was no change in the enzyme secretion activity derived from the host. When SDS-PAGE was performed on the protein in the liquid medium, a new band was observed in each of the transformants [(1-16) strain and (2-21) strain].
[0077]
[Example 6]Culture and characterization of transformants of pMTE1
Two transformants [strains (1-16) and (2-21)] were cultured in a 10 l fermenter using the culture solution described in Example 1. After the culture, the mixture was filtered and concentrated by a UF membrane, and finally freeze-dried. CMCase (cellulase), β-glucosidase, xylanase, polygalacturonase, mannanase, amylase, lipase (above pH 5.0) and protease (pH 5.0 substrates are hemoglobin, pH 7.0 and pH 9.0 substrate was casein). The results are shown in Tables 1, 2 and 3 below.
[0078]
[Table 1]
[Table 2]
[Table 3]
[Example 7]Evaluation of decolorizing activity of denim-dyed cellulose-containing fiber by MTE1 expressed in Penicillium simplicissimum
A 10 cm × 10 cm denim was placed in a 500 ml stainless steel cylinder, and a metal ball was added. 100 ml of a 0.1 mol / l acetate buffer (pH 5.5) containing 10 U / ml of the (1-16) strain, the (2-21) strain, and Humicola-derived NCE4 (WO 98/03640). The mixture was added and stirred at 200 rpm on a shaker at 50 ° C. for 60 minutes. Subsequently, the denim was taken out, washed with distilled water for 5 minutes, and dried overnight. For denim color analysis, level 30 (P30) values were calculated after import as JPEG data.
[0082]
In addition, for white field contamination, a white cotton cloth (10 cm × 10 cm) was put into a 500 ml stainless steel cylinder, and 10 U / ml of the (1-16) strain, the (2-21) strain, and NCE4 derived from Humicola (International Publication No. 98/98). (Patent No. 03640) was added, and 100 ml of a solution containing 0.1 mol / l acetate buffer (pH 5.5) and 1 mg / ml indigo was added, followed by stirring at 50 ° C. for 60 minutes on a shaker at 200 rpm. Subsequently, the white cotton cloth was taken out, washed with distilled water for 5 minutes, and dried overnight. For the analysis of the degree of coloring, the value of level 110 (P110) was used after taking in as JPEG data.
[0083]
As a result, the decolorization of denim was 32.9 in the (1-16) strain, 35.1 in the (2-21) strain, and almost equal to 31.4 in the NCE4 derived from Humicola, whereas the white spot was contaminated. Was 1.0 for the (1-16) strain, 0.5 for the (2-21) strain, and 34.6 for NCE4 derived from Humicola, indicating that MTE1 has significantly lower white field contamination than NCE4.
[0084]
Example 8Stability of MTE1 in surfactant
(1-16) strains, (2-21) strains and Humicola (Humicola) From cellulase solution of NCE4 (WO 98/03640) at 5O 0 C in 5 g / l of nonon surfactant neonor (oxyethyl nonylphenol) at pH 5.0 (0.1 mol / l). The stability at acetic acid-sodium acetate buffer), pH 7.0 (0.1 mol / l citrate-phosphate buffer) and pH 9.0 (0.1 mol / l carbonate-sodium carbonate buffer) was examined. As a result of comparing the residual activity after incubation for 3 hours with no addition of the surfactant, at pH 5.0 and pH 7.0, the (1-16) strain, the (2-21) strain, and the NCE4 derived from Humicola were about 80%. Showed residual activity. On the other hand, at pH 9.0, the (1-16) strain showed about 80%, the (2-21) strain about 90%, and the Humicola-derived NCE4 showed about 80% residual activity.
[0085]
Similarly, the stability in LAS (linear alkylbenzene sulfonate) 5 g / l as an anionic surfactant was measured. At pH 5.0, the (1-16) strain exhibited about 60% residual activity, and the (2-21) strain exhibited about 50% residual activity, and Humicola-derived NCE4 exhibited about 35-40% residual activity. At pH 7.0 and pH 9.0, there was almost 100% activity in all samples.
[0086]
Furthermore, the stability was measured using a commercially available detergent. Was prepared at a concentration of 5 g / l, and the stability was measured in the same manner. The (1-16) strain and the (2-21) strain showed about 80 to 90% of the remaining activity, whereas NCE4 had 30% of the remaining activity.
[0087]
【The invention's effect】
The endoglucanase MTE1 of the present invention is used in a detergent composition, and is also used for deinking of waste paper, improving drainage of paper pulp, and reducing fluffing of cellulose-containing fibers, improving touch and appearance, clarifying color, It is useful for local change of color and reduction of stiffness.
[0088]
[Sequence list]
Claims (31)
（Ａ）エンドグルカナーゼ活性を有し、
（Ｂ）Ｎ末端のアミノ酸配列が配列番号３で表わされる配列である。A protein having the following properties (A) and (B):
(A) having endoglucanase activity,
(B) The amino acid sequence at the N-terminus is the sequence represented by SEQ ID NO: 3.
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含んでなる、タンパク質、
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含んでなり、かつエンドグルカナーゼ活性を有する改変タンパク質、および
（ｃ）前記（ａ）のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつエンドグルカナーゼ活性を有する相同タンパク質。A protein selected from the group consisting of:
(A) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2,
(B) a modified protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been substituted, deleted, added or inserted in the amino acid sequence of (a), and which has endoglucanase activity; and (c) A homologous protein comprising an amino acid sequence having at least 80% homology with the protein comprising the amino acid sequence of (a), and having endoglucanase activity.
（ｉ）配列番号１で表わされる塩基配列を含んでなる、ポリヌクレオチド、
（ｉｉ）前記（ｉ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドの少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列からなり、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）前記（ｉ）の塩基配列において１個もしくは複数個の塩基が置換、欠失、付加もしくは挿入された塩基配列からなり、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
（ｉｖ）前記（ｉ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。A polynucleotide selected from the group consisting of:
(I) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(Ii) a polynucleotide consisting of a base sequence having at least 80% homology to the polynucleotide consisting of the base sequence of (i) and encoding a protein having endoglucanase activity;
(Iii) a polynucleotide comprising a base sequence in which one or more bases have been substituted, deleted, added or inserted in the base sequence of (i), and encoding a protein having endoglucanase activity; and (iv) A) a polynucleotide that hybridizes with the polynucleotide comprising the nucleotide sequence of (i) under stringent conditions and encodes a protein having endoglucanase activity.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003107958A JP2004313022A (en) | 2003-04-11 | 2003-04-11 | Endoglucanase mte1 and cellulase preparation containing the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003107958A JP2004313022A (en) | 2003-04-11 | 2003-04-11 | Endoglucanase mte1 and cellulase preparation containing the same |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004313022A true JP2004313022A (en) | 2004-11-11 |
Family
ID=33469654
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003107958A Pending JP2004313022A (en) | 2003-04-11 | 2003-04-11 | Endoglucanase mte1 and cellulase preparation containing the same |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2004313022A (en) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008111613A1 (en) * | 2007-03-12 | 2008-09-18 | Meiji Seika Kaisha, Ltd. | Endoglucanase ppce and cellulase preparation containing the same |
| JP2014239698A (en) * | 2014-09-16 | 2014-12-25 | Ｍｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａファルマ株式会社 | Novel cellulase gene |
| US10053679B2 (en) | 2010-03-31 | 2018-08-21 | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | Cellulase gene |
| JP2021518492A (en) * | 2018-03-15 | 2021-08-02 | バックマン ラボラトリーズ インターナショナル，インコーポレイティド | Methods and systems for producing market pulp and their products |
| WO2023225459A2 (en) | 2022-05-14 | 2023-11-23 | Novozymes A/S | Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections |
-
2003
- 2003-04-11 JP JP2003107958A patent/JP2004313022A/en active Pending
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008111613A1 (en) * | 2007-03-12 | 2008-09-18 | Meiji Seika Kaisha, Ltd. | Endoglucanase ppce and cellulase preparation containing the same |
| US8257955B2 (en) | 2007-03-12 | 2012-09-04 | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | Endoglucanase PPCE and cellulase preparation containing the same |
| JP5193997B2 (en) * | 2007-03-12 | 2013-05-08 | Ｍｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａファルマ株式会社 | Endoglucanase PPCE and cellulase preparation comprising the same |
| US10053679B2 (en) | 2010-03-31 | 2018-08-21 | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | Cellulase gene |
| US10774318B2 (en) | 2010-03-31 | 2020-09-15 | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | Cellulase gene |
| JP2014239698A (en) * | 2014-09-16 | 2014-12-25 | Ｍｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａファルマ株式会社 | Novel cellulase gene |
| JP2021518492A (en) * | 2018-03-15 | 2021-08-02 | バックマン ラボラトリーズ インターナショナル，インコーポレイティド | Methods and systems for producing market pulp and their products |
| WO2023225459A2 (en) | 2022-05-14 | 2023-11-23 | Novozymes A/S | Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4547335B2 (en) | Endoglucanase STCE and cellulase preparation containing the same | |
| JP5193997B2 (en) | Endoglucanase PPCE and cellulase preparation comprising the same | |
| EP1683860B1 (en) | Novel endoglucanases | |
| JP4230149B2 (en) | Endoglucanase enzyme NCE5 and cellulase preparation comprising the same | |
| JP4017824B2 (en) | Endoglucanase enzyme and cellulase preparation comprising the same | |
| JP5745411B2 (en) | Novel protein having β-glucosidase activity and use thereof | |
| WO2002050245A2 (en) | Novel cellulase producing actinomycetes, cellulase produced therefrom and method of producing same | |
| JP2001513993A (en) | Mutant cellulase of the genus Thermomonospora | |
| JP2009065975A (en) | Chrysosporium cellulase and methods for using the same | |
| EP1994148A1 (en) | Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same | |
| CA2675592A1 (en) | Modified endoglucanase ii and methods of use | |
| JP3970770B2 (en) | Endoglucanase enzyme from zygote lacking the cellulose binding region | |
| JP2004313022A (en) | Endoglucanase mte1 and cellulase preparation containing the same | |
| CN111699252A (en) | Endoglucanase compositions and methods | |
| EP1571207A1 (en) | Novel cellulase tolerant to surfactants | |
| JP2003507039A (en) | Alkaline xyloglucanase from Malbranchea spp. | |
| JP4272995B2 (en) | Cellulase preparation containing reducing agent and fiber processing method | |
| AU4437002A (en) | Cellulase producing actinomycetes, cellulase produced therefrom and method of producing same |