JP2004305207A - Method for detection of mycoplasma - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、マイコプラズマの検出方法、該検出方法に使用するDNA、および該微生物の検出試薬キットに関する。 The present invention relates to a method for detecting mycoplasma, DNA used for the detection method, and a reagent kit for detecting the microorganism.
マイコプラズマの検出法としては、分離培養法、DNA 蛍光染色法、およびPCR法等が一般に知られている。分離培養法およびDNA 蛍光染色法は、数日から数週間の培養が必要であり、測定時間が長い、観察に経験を要する等の問題点がある。またPCR法として販売されているキットにおいては、感度をあげるために Nested PCR（２段階PCR）を採用しており、PCRを２度行い、さらにゲルに流して染色を行い判定するという手順を行うためかなりの時間を要する。
このキットには増幅産物の長さによってマイコプラズマ種が同定できるという利点があるが、２度のPCRを終えた時点では増幅鎖長が同じものがあり、確実に種を特定するためには制限酵素での切断が必要となる。これにはさらに時間と手間を要し、種の同定が必要でない場合にはこれらの利点は不要である。その他にも16S rRNA 領域を用いてプライマーを作り、PCR を行う方法が一般に知られているが、増幅する鎖長が長く増幅に時間がかかり、ゲルに流し染色を行うため時間と手間を要する。また16S rRNA 領域は大腸菌等の原核生物のそれとも相同性が高いため、マイコプラズマに対する特異性が低くなる場合がある。
As a method for detecting mycoplasma, a separation culture method, a DNA fluorescent staining method, a PCR method and the like are generally known. The separation culture method and the DNA fluorescence staining method require several days to several weeks of culture, and have problems such as a long measurement time and experience for observation. Also, kits sold as PCR methods use nested PCR (two-step PCR) to increase sensitivity, and perform the procedure of performing PCR twice, further running on a gel, and staining for determination. It takes a considerable amount of time.
This kit has the advantage that the mycoplasma species can be identified based on the length of the amplification product, but the amplification chain length is the same at the end of the two PCRs. Cutting is required. This requires additional time and effort, and these advantages are unnecessary if species identification is not required. In addition, a method of making a primer using the 16S rRNA region and performing PCR is generally known, but the length of the chain to be amplified is long and it takes time to amplify. In addition, the 16S rRNA region has high homology to that of prokaryotes such as Escherichia coli, and thus may have low specificity for mycoplasma.
一方、リアルタイムPCR によりマイコプラズマを検出するものとして、蛍光標識プローブを用いる試験キットが市販されているが、該蛍光標識プローブは高価であり、これを使用する試験キットも当然高価となるほか、さらにこのキットは、リアルタイムPCRの系としての最適化がなされておらず、従来の16S rRNA 領域のプライマーを用いていると考えられる。そのため増幅に要する時間が長い、マイコプラズマだけでなく大腸菌のDNA 等も検出してしまう、感度が悪い等の問題点があった。 On the other hand, a test kit using a fluorescent-labeled probe is commercially available for detecting mycoplasma by real-time PCR.However, the fluorescent-labeled probe is expensive, and a test kit using the probe is naturally expensive. The kit has not been optimized as a real-time PCR system, and it is considered that primers of the conventional 16S rRNA region are used. Therefore, there are problems such as a long time required for amplification, detection of not only mycoplasma but also DNA of Escherichia coli and poor sensitivity.
本発明の課題は、上記従来技術の問題点を解決し、煩雑な操作を必要とせず、迅速、安価にマイコプラズマを検出するための手段を提供しようとするものである。 An object of the present invention is to solve the above-mentioned problems of the prior art and to provide a means for quickly and inexpensively detecting mycoplasma without requiring complicated operations.
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究の結果、マイコプラズマに特異的なDNA配列部分をプライマーとして用いて、被験試料から得られるDNAを鋳型としてPCR反応を行うとともに、該反応系に２本鎖DNAにインターカレートする蛍光試薬を含有せしめることにより、煩雑な操作を必要とせず安価に、かつリアルタイムでマイコプラズマを検出できることを見いだし、本発明を完成するに至ったものである。 The present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result of performing a PCR reaction using DNA obtained from a test sample as a template using a DNA sequence portion specific to mycoplasma as a primer, The inventors have found that mycoplasma can be detected in real time at low cost without complicated operations by incorporating a fluorescent reagent that intercalates into double-stranded DNA, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１３）に係るものである。
（１） マイコプラズマに特異的なDNA配列部分をプライマーとして用いて、被験試料から得られるDNAを鋳型としてPCR反応を行うとともに、該反応系に２本鎖DNAにインターカレートする蛍光試薬を含有せしめることを特徴とする、マイコプラズマの検出方法。
（２） プライマーのうち少なくとも一方が、複数種のマイコプラズマに共通するDNA配列部分からなるものである、（１）に記載のマイコプラズマの検出方法。
（３） マイコプラズマに特異的なDNA配列部分が、マイコプラズマの23S rRNA領域由来の配列部分である（１）又は（２）のいずれかに記載のマイコプラズマの検出方法。
（４） 配列表の配列番号１〜４で表されるDNAのいずれか一種と、配列番号５で示されるDNAをプライマーとして用いることを特徴とする、（１）〜（３）のいずれかに記載のマイコプラズマの検出方法。
（５） マイコプラズマが、培養細胞に感染するものである（４）に記載のマイコプラズマの検出方法。
（６） 配列表の配列番号１で表されるDNA、およびこれと相補的配列を有するDNAまたはRNA。
（７） 配列表の配列番号２で表されるDNA、およびこれと相補的配列を有するDNAまたはRNA。
（８） 配列表の配列番号３で表されるDNA、およびこれと相補的配列を有するDNAまたはRNA。
（９） 配列表の配列番号４で表されるDNA、およびこれと相補的配列を有するDNAまたはRNA。
（１０） 配列表の配列番号５で表されるDNA、およびこれと相補的配列を有するDNAまたはRNA。
（１１） 配列表の配列番号１〜４で表されるDNAのいずれか一種以上と、同配列番号５で表されるDNAを含むことを特徴とする、マイコプラズマを検出するために用いるPCRプライマー試薬キット。
（１２） マイコプラズマに特異的なDNA配列部分を含むプライマー、および２本鎖DNAにインターカレートする蛍光試薬を含むことを特徴とする、マイコプラズマの検出試薬キット。
（１３） 配列表の配列番号１〜４で表されるDNAのいずれか一種以上と、同配列番号５で表されるDNAを含み、かつ２本鎖DNAにインターカレートする蛍光試薬を含むことを特徴とする、マイコプラズマの検出試薬キット。
That is, the present invention relates to the following (1) to (13).
(1) Using a DNA sequence portion specific to mycoplasma as a primer, a PCR reaction is performed using DNA obtained from a test sample as a template, and the reaction system contains a fluorescent reagent that intercalates into double-stranded DNA. A method for detecting mycoplasma, comprising:
(2) The method for detecting mycoplasma according to (1), wherein at least one of the primers comprises a DNA sequence portion common to a plurality of types of mycoplasmas.
(3) The method for detecting a mycoplasma according to any one of (1) and (2), wherein the DNA sequence specific to mycoplasma is a sequence derived from the 23S rRNA region of mycoplasma.
(4) Any one of (1) to (3), wherein any one of the DNAs represented by SEQ ID NOS: 1 to 4 in the sequence listing and the DNA represented by SEQ ID NO: 5 are used as primers. The method for detecting mycoplasma according to the above.
(5) The method for detecting mycoplasma according to (4), wherein the mycoplasma infects cultured cells.
(6) DNA represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and DNA or RNA having a sequence complementary thereto.
(7) DNA represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and DNA or RNA having a sequence complementary thereto.
(8) DNA represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, and DNA or RNA having a sequence complementary thereto.
(9) DNA represented by SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, and DNA or RNA having a sequence complementary thereto.
(10) DNA represented by SEQ ID NO: 5 in the sequence listing, and DNA or RNA having a sequence complementary thereto.
(11) A PCR primer reagent used for detecting mycoplasma, comprising any one or more of the DNAs represented by SEQ ID NOS: 1 to 4 in the sequence listing and the DNA represented by the same SEQ ID NO: 5 kit.
(12) A mycoplasma detection reagent kit, comprising: a primer containing a DNA sequence specific to mycoplasma; and a fluorescent reagent intercalating into double-stranded DNA.
(13) The DNA contains any one or more of the DNAs represented by SEQ ID NOs: 1 to 4 in the sequence listing and the fluorescent reagent containing the DNA represented by the same SEQ ID NO: 5 and intercalating into double-stranded DNA A mycoplasma detection reagent kit, characterized in that:
本発明のマイコプラズマの検出法によれば、検出に要する時間は、以下に示す融解曲線を得る時間まで含めてPCR開始から終了までが110分程度であり、極めて迅速にマイコプラズマの検出を行うことができる。さらに特異性の高いプライマー２（下記実施例３参照）を用いれば、融解曲線解析が不必要なため、75分程度で検出を行うことが出来る。この検出までの経過はコンピュータによってリアルタイムに可視化され、ゲルでの電気泳動などの手間を必要としない。
また、本発明ではプローブを用いないため蛍光標識されたプローブに係る費用も要しない。したがって、これらのことから企業や細胞バンクなどで業務として大量の細胞の検査を行う場合などにも本発明は極めて有効な手段である。
According to the method for detecting mycoplasma of the present invention, the time required for detection is about 110 minutes from the start to the end of PCR including the time to obtain the following melting curve, and it is possible to detect mycoplasma very quickly. it can. If
Further, in the present invention, since no probe is used, the cost for the fluorescently labeled probe is not required. Therefore, the present invention is an extremely effective means even in a case where a large number of cells are examined as a business in a company or a cell bank.
本発明は、マイコプラズマの検出法、検出試薬等に係り、本明細書でマイコプラズマとは、一般に呼称されるマイコプラズマを指し、学術名でいえば、マイコプラズマタレス目に属する微生物群を指し、さらに具体的にはマイコプラズマ属、アコレプラズマ属等に属する微生物をいう。 The present invention relates to a method for detecting mycoplasma, a detection reagent, and the like.In this specification, mycoplasma refers to a mycoplasma generally called, and in a scientific name, refers to a group of microorganisms belonging to the order Mycoplasma thalass, and more specifically. Refers to microorganisms belonging to the genus Mycoplasma, the genus Acoleplasma and the like.
まず、本発明の検出原理について説明する。
本発明においては、マイコプラズマのDNA中、マイコプラズマに特異的な配列を有する領域部分をプライマーとし、被験試料から得られた全DNAを鋳型としてPCRを行う。このとき被験試料がマイコプラズマを含んでいれば、これから得られたDNA中にはマイコプラズマDNAが含まれ、マイコプラズマDNA中の上記プライマー間に対応する領域が増幅され、この領域に対応する２本鎖DNAが多量に形成される。
First, the detection principle of the present invention will be described.
In the present invention, PCR is performed using, as a primer, a region having a sequence specific to mycoplasma in mycoplasma DNA, and using as a template all DNA obtained from a test sample. At this time, if the test sample contains mycoplasma, the DNA obtained from this contains mycoplasma DNA, the region corresponding to the region between the primers in the mycoplasma DNA is amplified, and the double-stranded DNA corresponding to this region is amplified. Are formed in large quantities.
一方、DNA分子は相補的な塩基対をもつ２重らせん構造をとるため塩基対のスタッキング間に平面構造を有する分子が挿入される。これをインターカレートするといい、本発明においてはインターカレートする蛍光試薬を使用する。この蛍光試薬は、２本鎖DNAにインターカレートして蛍光を発する。したがって、PCR反応系にこの蛍光色素を含有させておくことにより、上記PCR反応によりマイコプラズマDNA中の上記プライマー間に対応する領域が増幅されていくにつれ、蛍光強度が増大する。 On the other hand, since a DNA molecule has a double helix structure having complementary base pairs, a molecule having a planar structure is inserted between the base pair stacking. This is called intercalation, and in the present invention, an intercalating fluorescent reagent is used. This fluorescent reagent emits fluorescence by intercalating into double-stranded DNA. Therefore, by including this fluorescent dye in the PCR reaction system, the fluorescence intensity increases as the region corresponding to the region between the primers in the mycoplasma DNA is amplified by the PCR reaction.
このインターカレートはDNAの塩基配列に対して非特異的である。
しかし、上記PCR反応において使用するプライマーは、マイコプラズマに特異的な配列であるため、マイコプラズマ以外のDNAとは塩基対を形成せず、マイコプラズマ以外のDNAがPCR反応系に含まれていても、増幅されない。
したがって、PCR反応のサイクルが進むにつれ、蛍光強度が増大していけば、マイコプラズマ由来のDNAが含まれていたことになり、この蛍光強度の増大をグラフ化することにより、被験試料中のマイコプラズマを検出できる。すなわち、本発明はリアルタイムPCR法により被験試料中のマイコプラズマを検出するものである。
This intercalate is non-specific for the DNA base sequence.
However, since the primer used in the PCR reaction has a sequence specific to mycoplasma, it does not form a base pair with DNA other than mycoplasma, and amplification is performed even when DNA other than mycoplasma is contained in the PCR reaction system. Not done.
Therefore, as the PCR reaction cycle progresses, if the fluorescence intensity increases, it means that DNA derived from mycoplasma was included, and by graphing this increase in fluorescence intensity, the mycoplasma in the test sample was reduced. Can be detected. That is, the present invention is to detect mycoplasma in a test sample by a real-time PCR method.
上記プライマーは、例えばマイコプラズマの特定の種のみ検出したいときには、その種に特異的なDNA配列領域を選び合成する。また、マイコプラズマの複数種を検出しようとする場合には、これらマイコプラズマDNAに共通する配列を選び合成してもよく、また、これら各種ごとに特異的な配列を合成し、得られたプライマーを混合してPCR反応を行ってもよい。また、この場合、マイコプラズマに共通するDNA配列領域をセンスあるいはアンチセンスプライマーとし、特定種に特異的なDNA配列領域をアンチセンスあるいはセンスプライマーとして混合使用してもよい。これにより一方のプライマー合成の手間を省くことが可能になる。すなわち、マイコプラズマDNA一般に共通する配列を合成しておけば、一対のプライマーのうち検出したいマイコプラズマDNAに特異的配列のみを合成すればよく、簡便である。当然この場合にも一方のプライマーとして、複数種のマイコプラズマに特異的なDNA配列領域を合成しこれらを混合使用すれば、これら複数種のマイコプラズマを検出することができる。 For example, when it is desired to detect only a specific species of mycoplasma, the primer is synthesized by selecting a DNA sequence region specific to that species. When multiple types of mycoplasma are to be detected, sequences common to these mycoplasma DNAs may be selected and synthesized, or specific sequences may be synthesized for each of these types, and the resulting primers may be mixed. And then perform a PCR reaction. In this case, a DNA sequence region common to mycoplasma may be used as a sense or antisense primer, and a DNA sequence region specific to a particular species may be used as an antisense or sense primer. This makes it possible to save the labor of synthesizing one primer. That is, if a sequence common to mycoplasma DNA is generally synthesized, only a sequence specific to the mycoplasma DNA to be detected among a pair of primers may be synthesized, which is convenient. Naturally, also in this case, by synthesizing a DNA sequence region specific to a plurality of types of mycoplasmas as one primer and mixing and using them, it is possible to detect these types of mycoplasmas.
さらに本発明を具体的に説明する。
本発明において、PCRのプライマーとして用いるDNAとしては、例えば配列番号１〜５の塩基配列を有するDNAが挙げられる。
これらプライマーは、培養細胞に感染することが確認されている代表的なマイコプラズマ7種およびアコレプラズマ１種を迅速に、特異的に検出することを目的として設計したものである。すなわち、上記混合プライマーを用い、被験試料から得られるDNAを鋳型とし、２本鎖DNAにインターカレートする蛍光試料を用いてリアルタイムPCR を行う。本発明においてはプローブを用いない。
Further, the present invention will be specifically described.
In the present invention, examples of the DNA used as a primer for PCR include DNAs having the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 to 5.
These primers were designed for the purpose of quickly and specifically detecting seven typical mycoplasmas and one acholeplasma that have been confirmed to infect cultured cells. That is, real-time PCR is performed using the mixed primers, a DNA obtained from a test sample as a template, and a fluorescent sample intercalating into double-stranded DNA. No probe is used in the present invention.
上記プライマーは、センスプライマー４種、アンチセンスプライマー１種によって構成されている。本発明実施の際は、センスプライマー４種のうち３種（配列番号１又は２、および３、４）とアンチセンスプライマー１種（配列番号５）を混合して用いる。これらのプライマーは、培養細胞に汚染することが確認されているマイコプラズマ７種 およびアコレプラズマ１種に特異的であり、かつリアルタイム PCR に適することを条件とし作製したものである。
16s rRNA 領域は核酸配列がデータベースに一般公開されているため、プライマーの作製が容易であるが、同じく培養細胞に汚染する可能性の高い大腸菌等の原核生物との共通配列が多いので、マイコプラズマに特異性の高い核酸領域を23S rRNA 領域から見いだしたものである。
The primer is composed of four types of sense primers and one type of antisense primer. In the practice of the present invention, three of the four sense primers (SEQ ID NOS: 1 or 2, and 3, 4) and one antisense primer (SEQ ID NO: 5) are used in combination. These primers were prepared under the conditions that they are specific to seven types of Mycoplasma and one type of Acoreplasma that have been confirmed to contaminate cultured cells, and that they are suitable for real-time PCR.
Since the nucleic acid sequence of the 16s rRNA region is publicly available in the database, it is easy to prepare primers.However, since there are many common sequences with prokaryotes such as Escherichia coli that are likely to contaminate cultured cells, A highly specific nucleic acid region was found from the 23S rRNA region.
上記プライマーに用いる核酸配列の決定には各マイコプラズマの
“16S-23S rRNA intergenic spacer complete sequence and 23S rRNA gene, partial sequence” (The Entrez Nucleotides database) を用いた。ただしM.salivariumとM.pirum については同領域の核酸配列は不明である。配列番号１又は２で示される核酸配列は,６種のマイコプラズマ ( M.arginini, M.fermentans, M.hominis, M.hyorhinis, M.orale,
M.salivarium ) に共通の配列である。図 1の（１）に示される、５種のマイコプラズマ（ M.arginini, M.fermentans, M.hominis, M.hyorhinis, M.orale, ）に共通であることを確認したセンスプライマー（配列表の配列番号１又は２）とアンチセンスプライマー（配列表の配列番号５）でマイコプラズマ７種及びアコレプラズマ１種のDNAについてPCRを行ったところ、M.salivarium は検出されたため、同様の配列を有すると考えられた。M.pirum, A.laidlawiiについては検出されなかった。
The nucleic acid sequence used for the primers was determined using "16S-23S rRNA intergenic spacer complete sequence and 23S rRNA gene, partial sequence" (The Entrez Nucleotides database) of each mycoplasma. However, the nucleic acid sequence of the same region is unknown for M. salivarium and M. pirum. The nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 contains six types of mycoplasmas (M. arginini, M. fermentans, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale,
M.salivarium). Sense primers (M. arginini, M. fermentans, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale) shown in (1) of FIG. When PCR was performed on 7 types of Mycoplasma and 1 type of Acoreplasma DNA using SEQ ID NO: 1 or 2) and an antisense primer (SEQ ID NO: 5 in the sequence listing), M. salivarium was detected. it was thought. M.pirum and A.laidlawii were not detected.
そこで、A.laidlawii については、同領域の核酸配列からA.laidlawiiに特異的な配列（同配列番号３）を個別に用いた（図1の（２））。 また、M.pirum については23S rRNA領域の配列が不明のため独自に配列解析を行った。 “M. pirum DNA, 16S - 23S rRNA intergenic spacer region”(The Entrez Nucleotides database) よりM.pirum用のセンスプライマーを作製し、図１のアンチセンスプライマー（プライマー５）と共にPCR を行った。増幅された領域の配列解析を行った結果より、M. pirum 23S rRNA 領域にM.pirum 特異的な配列を見いだし、プライマー４（同配列番号４）とした（図１の（３））。
これらの結果を総合して、５種のプライマー１〜５を決定した（同配列番号１〜５）。
Therefore, for A.laidlawii, a sequence specific to A.laidlawii (SEQ ID NO: 3) was used individually from the nucleic acid sequence of the same region ((2) in FIG. 1). In addition, since the sequence of the 23S rRNA region of M.pirum was unknown, sequence analysis was independently performed. A sense primer for M. pirum was prepared from "M. pirum DNA, 16S-23S rRNA intergenic spacer region" (The Entrez Nucleotides database), and PCR was performed together with the antisense primer (primer 5) in FIG. From the result of sequence analysis of the amplified region, a sequence specific to M. pirum was found in the M. pirum 23S rRNA region, which was designated as primer 4 (SEQ ID NO: 4) ((3) in FIG. 1).
Based on these results, five types of
以下に、上記５種のプライマーの塩基配列を示す
プライマー１： TCTGAAT(C/T)TGCCGGGACC
プライマー２： TCTGAAT(C/T)TGCCGGGACCACC
プライマー３： GGAATCCCGTTTGAAGATAGGA
プライマー４： GGAAAATGTTATTTTGACGGAACCT
プライマー５： CTTTCC(A/C)TCAC(G/T)GTACT(A/G)GTTCACT
The base sequences of the above five primers are shown below.
Primer 1: TCTGAAT (C / T) TGCCGGGACC
Primer 2: TCTGAAT (C / T) TGCCGGGACCACC
Primer 3: GGAATCCCGTTTGAAGATAGGA
Primer 4: GGAAAATGTTATTTTGACGGAACCT
Primer 5: CTTTCC (A / C) TCAC (G / T) GTACT (A / G) GTTCACT
プライマーの設計はソフトウェア「Primer Express version 1.5」( Applied Biosystems)を用いて行った。リアルタイムPCR用プライマーの設計ガイドラインに従ってプライマーを作成した。
このプライマーによってリアルタイムPCRを行ったが、培養細胞に汚染する可能性の高い大腸菌、また人の疾患に関与すると言われるM.pneumoniae, M.genitalium, M.gallisepticum のDNA は検出されなかった。
上記５種のプライマーのうち４種（プライマー１、３、４、５、又はプライマー２、３、４、５）を同時に用いることで、培養細胞に汚染することが確認されているマイコプラズマ７種及びアコレプラズマ1種の検出を特異的に、迅速に行うことが可能となる。プライマー２はプライマー１に３塩基付加することで、マイコプラズマに対する特異性をより向上させたもので、通常混合プライマーとしては１又は２、および３、４、５を混合して用いる。またM.pirum, A.laidlawii におけるプライマー３（同配列番号３）、およびプライマー４（同配列番号４）は、これら各マイコプラズマに特異的DNA配列を用いているため、これら各プライマーをプライマー５とともに個別に用いることで種の同定も可能である。
The primers were designed using software “Primer Express version 1.5” (Applied Biosystems). Primers were prepared according to the guidelines for designing primers for real-time PCR.
When real-time PCR was performed using these primers, Escherichia coli, which is likely to contaminate cultured cells, and DNA of M. pneumoniae, M. genitalium, and M. gallisepticum, which are considered to be involved in human diseases, were not detected.
By simultaneously using four of the five primers (
このように、本発明においては、検出しようとするマイコプラズマの範囲に合わせて、プライマーの塩基配列を設計することにより、種々の被験試料に対して適用することが可能である。したがって、被験試料としては、動物細胞培養上清、培養細胞、もしくは凍結チューブの細胞または生体試料等が挙げられるがこれらに特に限定されない。
これらの試料から、DNAの調製のための通常の方法によりDNAを得ることができる。具体的には、細胞を遠心により回収し、Proteinase Kによって融解し、その希釈液をそのままPCR用試料として用いたり、DNAを精製したものを蒸留水（またはT/E）に溶かしたりする方法がある。
Thus, the present invention can be applied to various test samples by designing the base sequence of the primer in accordance with the range of mycoplasma to be detected. Therefore, examples of the test sample include, but are not particularly limited to, animal cell culture supernatant, cultured cells, cells in a cryotube, and biological samples.
From these samples, DNA can be obtained by a usual method for preparing DNA. Specifically, cells are collected by centrifugation, thawed with Proteinase K, and the diluted solution is used as it is as a PCR sample, or the purified DNA is dissolved in distilled water (or T / E). is there.
本検出方法におけるリアルタイムPCR は、試料から得られるDNA を鋳型とし、特定のプライマー対を使用する以外は、通常のプローブを用いない、２本鎖DNAにインターカレートする蛍光試料を用いるリアルタイムPCRの方法に従って行うことができる。
本発明において使用するインターカレート蛍光試薬としては、例えば
エチジウムブロマイド( EtBr )、YO-PRO-I、及びSYBR Green I等が挙げられる。
Real-time PCR in this detection method uses real-time PCR, which uses DNA obtained from the sample as a template and does not use a normal probe except for a specific primer pair, and uses a fluorescent sample that intercalates into double-stranded DNA. It can be done according to the method.
Examples of the intercalating fluorescent reagent used in the present invention include ethidium bromide (EtBr), YO-PRO-I, and SYBR Green I.
被験試料から得られたDNA中に検出すべきマイコプラズマ由来のDNAが存在すれば、PCRによって２本鎖のDNAが増幅され、量依存的に蛍光強度を増し、その蛍光試料の波長を検出するフィルターを設置したリアルタイムPCR装置を用いて目的の増幅産物を検出することができる。
一方、プローブを用いるリアルタイムPCRと比較しての問題点として、非特異的増幅による２本鎖DNAも検出してしまうことがあげられるが、目的とする増幅産物とこれらの非特異的増幅産物における２本鎖DNAとは、通常、融解温度（Tm値）が異なる場合が多いので、融解曲線を描かせることで区別が容易につく。この原理を説明する。
If DNA derived from mycoplasma to be detected is present in the DNA obtained from the test sample, the double-stranded DNA is amplified by PCR, the fluorescence intensity is increased in a dose-dependent manner, and a filter for detecting the wavelength of the fluorescent sample is used. A target amplification product can be detected by using a real-time PCR device equipped with a.
On the other hand, a problem in comparison with real-time PCR using a probe is that double-stranded DNA due to non-specific amplification is also detected. Usually, the melting temperature (Tm value) is often different from that of the double-stranded DNA. Therefore, it can be easily distinguished by drawing a melting curve. This principle will be described.
PCR 終了後、PCR 産物はすべて２本鎖なので、高い蛍光値を示すが、温度を徐々に上昇させると、２本鎖DNAは解離していくため、蛍光値は下がっていく。
各PCR 産物のTm 値に達した時、２本鎖DNAは１本鎖となり、急激に蛍光値が下がる。Tm 値は各PCR 産物の GC 含有量や鎖長等によって決定される。
目的の増幅産物と非特異的増幅産物は、増幅される領域、長さ共に異なると考えられるので、Tm 値も異なると考えられる。したがって、温度に対する蛍光強度変化を示すことで各 PCR 産物の Tm 値を求めることができ、それにより両者を区別することができる。本検出方法においても、目的の増幅産物と非特異的増幅産物における２本鎖DNAの融解温度（Tm値）が異なることを確認している。
以下に、実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
After completion of PCR, all the PCR products are double-stranded, so they show a high fluorescence value. However, when the temperature is gradually increased, the double-stranded DNA dissociates and the fluorescence value decreases.
When the Tm value of each PCR product is reached, the double-stranded DNA becomes single-stranded, and the fluorescence value drops rapidly. The Tm value is determined by the GC content and chain length of each PCR product.
Since the target amplification product and the non-specific amplification product are considered to be different in both the amplified region and the length, the Tm values are also considered to be different. Therefore, the Tm value of each PCR product can be obtained by indicating the change in the fluorescence intensity with respect to the temperature, whereby the two can be distinguished. Also in this detection method, it has been confirmed that the melting temperature (Tm value) of the double-stranded DNA between the target amplification product and the non-specific amplification product is different.
Examples are shown below, but the present invention is not limited to these examples.
以下に示す実施例１、実施例３、比較例１、比較例２においては、市販品のマイコプラズマDNAを用いて行ったものであり、実施例２および実施例４においては、実際にマイコプラズマに汚染された動物培養細胞を用いたものである。
また、すべての例においてはリアルタイムPCR 解析機能の付属したPCR 機器 I Cycler iQ (Bio-Rad社)を用いたため、測定時間に関与する加熱速度、冷却速度は一定である。
〔実施例１〕
In Examples 1 and 3, Comparative Example 1 and Comparative Example 2 shown below, the experiments were performed using commercially available mycoplasma DNA. In Examples 2 and 4, contamination with mycoplasma was actually performed. Using cultured animal cells.
In all cases, since the PCR device I Cycler iQ (Bio-Rad) equipped with a real-time PCR analysis function was used, the heating rate and cooling rate involved in the measurement time were constant.
[Example 1]
（１）M.arginini (23838D), M.fermentans (19989D), M.hyorhinis (17981D), M.orale (23714D), M.pirum (25960D)については American Type Culture Collection （以下ATCCと略する） より、M.salivarium (010113), A.laidlawii (010116) についてはMinerva Biolabs Gmbh より Total DNAをそれぞれ入手し、M.hominis については NBRC（生物遺伝資源センター）より入手した菌株（NBRC 14850）を培養し、通常の方法によりDNAを精製し、Total DNAを得た。大腸菌 (E.coli)についてはTaKaRaよりTotal DNAを入手した。上記マイコプラズマ、アコレプラズマのDNA溶液を 0.2 ng/μlに調製して被験試料溶液とした。またコントロールとして大腸菌DNA溶液0.2 ng/μlおよびDNAを含まない溶液（蒸留水）も用意した。 (1) American Type Culture Collection (hereinafter abbreviated as ATCC) for M.arginini (23838D), M.fermentans (19989D), M.hyorhinis (17981D), M.orale (23714D), and M.pirum (25960D) For M. salivarium (010113) and A.laidlawii (010116), total DNA was obtained from Minerva Biolabs Gmbh, and for M. hominis, a strain (NBRC 14850) obtained from NBRC (Biological Resource Center) was cultured. Then, the DNA was purified by an ordinary method to obtain Total DNA. For E. coli, Total DNA was obtained from TaKaRa. The DNA solution of Mycoplasma and Acoreplasma was prepared at 0.2 ng / μl to prepare a test sample solution. Further, 0.2 ng / μl of an E. coli DNA solution and a solution containing no DNA (distilled water) were also prepared as controls.
一方、インターカレートする蛍光試薬としてSYBR Green Iを用い、また、配列表の配列番号１，３，４，５の塩基配列からなるプライマー１，３，４，５（図１参照）の混合プライマーを用いて、マスターミクスチャー ( iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad社) 25μl, Primers mix ( 2.5 μM each ) 6μl, water 14μl )を調製した。このマスターミクスチャー45μl に、上記DNA を含有する各被験試料溶液、コントロール溶液 5μl を加えて、それぞれ、95℃ 3分を1サイクル、95℃ 15秒＋60℃ 30秒を40サイクルの条件でリアルタイム PCRを行った。PCR は96穴プレートを用いて行い、10個の穴にマスターミクスチャーを45μlずつ分注し、それぞれの穴に各被験試料溶液（マイコプラズマ及びアコレプラズマDNA ８種）およびコントロール溶液 （大腸菌DNA溶液及びDNA の含まれない蒸留水 ）各5μl を加えて同時に検出を行った。図２−１（１）に、各PCR反応過程の蛍光強度グラフを示す。これによれば、実験に用いたDNA量は各1 ngであるが、マイコプラズマ７種及びアコレプラズマ１種共にPCR 反応のみで十分に検出されている。
また、この際要する時間は反応開始から終了まで約75分であった。
On the other hand, SYBR Green I was used as a fluorescent reagent for intercalation, and a mixed primer of
The time required at this time was about 75 minutes from the start to the end of the reaction.
（２）次いで、上記（１）のPCR操作の後、各試料について、それぞれ95℃ 1分、55℃ 1分でそれぞれ１サイクルPCRを行い、その後55℃から95℃まで10秒ごとに0.5℃ずつ上昇させながら、リアルタイムで蛍光強度を測定し、各試験試料の融解曲線を得た。図２−２（２）にその結果を示す。
これによれば、目的増幅物のTm 値は80.5〜81.5、非特異的増幅物のTm値は76.5〜77.5である。また図４に示されるように、大腸菌DNAは検出されず、その他のマイコプラズマのDNA（例えば、M.pneumoniae, M.genitalium, M.gallisepticum等）も検出されないことを確認した。
〔実施例２〕
(2) Next, after the PCR operation of (1) above, each sample was subjected to one cycle PCR at 95 ° C. for 1 minute and 55 ° C. for 1 minute, and then 0.5 ° C. every 55 seconds from 55 ° C. to 95 ° C. The fluorescence intensity was measured in real time while gradually increasing, and a melting curve of each test sample was obtained. FIG. 2-2 (2) shows the result.
According to this, the Tm value of the target amplification product is 80.5 to 81.5, and the Tm value of the non-specific amplification product is 76.5 to 77.5. Further, as shown in FIG. 4, it was confirmed that E. coli DNA was not detected, and other mycoplasma DNA (eg, M. pneumoniae, M. genitalium, M. gallisepticum, etc.) was not detected.
[Example 2]
M.hyorhinis に汚染したマウス細胞凍結チューブ、M.fermentansに汚染したマウス細胞凍結チューブ、汚染していないマウス細胞凍結チューブをそれぞれ融解し、各5 X 105個の細胞から以下の方法によりDNAを抽出した。各5 X 105個の細胞を1 mlチューブに移し、13000 g, 10分の遠心を行った。上清を取り除き、細胞塊をLysis Buffer ( 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA ) 100μlに懸濁した。10% SDS溶液を1μl加え、250μg/ml の濃度でProteinase K を加えた。55℃で１時間インキュベートした後、酵素の働きを止めるため95℃で10分インキュベートした。その後、500μl の滅菌蒸留水を加えた。この各溶液を試験溶液として以下に用いた。 Thaw mouse cell cryotubes contaminated with M. hyorhinis, mouse cell cryotubes contaminated with M. fermentans, and mouse cell cryotubes that are not contaminated, and extract DNA from 5 x 10 5 cells by the following method. Extracted. Each 5 × 10 5 cells were transferred to a 1 ml tube and centrifuged at 13000 g for 10 minutes. The supernatant was removed, and the cell mass was suspended in 100 μl of Lysis Buffer (150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA). 1 μl of 10% SDS solution was added, and Proteinase K was added at a concentration of 250 μg / ml. After incubating at 55 ° C for 1 hour, the mixture was incubated at 95 ° C for 10 minutes to stop the action of the enzyme. Thereafter, 500 μl of sterile distilled water was added. Each of these solutions was used below as a test solution.
実施例１と同様に、マスターミクスチャー ( iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad社) 25μl, Primers mix (2.5μM each) 6 μl, water 14 μl ) 45μl に上記各試料溶液5μl を加えて、95℃ 3分を1サイクル、95℃ 15秒＋60℃ 30秒を40サイクルの条件でリアルタイムPCR を行った。さらに95℃ 1分、55℃ 1分をそれぞれ１サイクル、55℃から95℃まで10秒ごとに0.5℃ずつ上昇させるという条件で融解曲線を得た。結果を図３に示す。図３（１）および（２）によれば、マウス細胞を汚染しているM.hyorhinis及びM.fermentansは明瞭に検出されており、汚染のない細胞ではマイコプラズマ様の増幅産物は全く確認されない。その他にも、ヒト、ラット、ハムスター、サル由来の汚染のない細胞で擬陽性が検出されないことも確認した。
〔実施例３〕
As in Example 1, 5 μl of each of the above sample solutions was added to 45 μl of the master mixture (iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) 25 μl, Primers mix (2.5 μM each) 6 μl,
[Example 3]
実施例１で用いたプライマー１の替わりに配列表の配列番号２の塩基配列からなるプライマー２を用いて、プライマー２，３，４，５の混合プライマーとし、マスターミクスチャー( iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad社) 25μl, Primers mix (2.5μM each) 6μl, water 14μl )を調整した。プライマー２はプライマー１に３塩基付加することで、マイコプラズマに対する特異性をより高めたものである。これにより非特異的増幅は起こりにくくなり、融解曲線による目的増幅物の判別という手順が省略され、実施例１と比較し、検出時間が短縮される。
Instead of the
このマスターミクスチャー45μl に、実施例１で用いたDNA を含有する各被験試料溶液、コントロール溶液 5μl を加えて、それぞれ、95℃ 3分を1サイクル、95℃ 15秒＋65℃ 30秒を40サイクルの条件でリアルタイム PCRを行った。PCR は96穴プレートを用いて行い、10個の穴にマスターミクスチャーを45μlずつ分注し、それぞれの穴に各被験試料溶液（マイコプラズマ及びアコレプラズマDNA ８種）及びコントロール溶液 （大腸菌DNA溶液及びDNA の含まれない蒸留水 ）各5μl を加えて同時に検出を行った。図３に、各PCR反応過程の蛍光強度グラフを示す。実験に用いたDNA量は各1 ngである。この際要する時間は反応開始から終了まで約75分であった。図４に示されるように、コントロール溶液において非特異的増幅が見られないため、融解曲線解析は行わなかった。
〔実施例４〕
To 45 μl of this master mixture, 5 μl of each test sample solution containing the DNA used in Example 1 and 5 μl of a control solution were added, and each cycle was performed at 95 ° C. for 3 minutes and at 95 ° C. for 15 seconds + 65 ° C. for 30 seconds for 40 cycles. Real-time PCR was performed under the conditions. PCR was performed using a 96-well plate, and 45 μl of the master mixture was dispensed into 10 wells, and each test sample solution (8 types of mycoplasma and acholeplasma DNA) and a control solution (E. coli DNA solution and DNA solution) were placed in each well. 5 μl of distilled water which does not contain) was added and the detection was performed simultaneously. FIG. 3 shows a fluorescence intensity graph in each PCR reaction process. The amount of DNA used in the experiment is 1 ng each. The time required at this time was about 75 minutes from the start to the end of the reaction. As shown in FIG. 4, no non-specific amplification was observed in the control solution, and thus no melting curve analysis was performed.
[Example 4]
M.hyorhinis に汚染したマウス細胞凍結チューブ、M.fermentansに汚染したマウス細胞凍結チューブ、汚染していないマウス細胞凍結チューブをそれぞれ融解し、各5 X 105個の細胞から以下の方法によりDNAを抽出した。各5 X 105個の細胞を1 mlチューブに移し、13000 g, 10分の遠心を行った。上清を取り除き、細胞塊をLysis Buffer ( 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA ) 100μlに懸濁した。10% SDS溶液を1μl加え、250μg/ml の濃度でProteinase K を加えた。55℃で１時間インキュベートした後、酵素の働きを止めるため95℃で10分インキュベートした。その後、500μl の滅菌蒸留水を加えた。この各溶液を試験溶液として以下に用いた。 Thaw mouse cell cryotubes contaminated with M. hyorhinis, mouse cell cryotubes contaminated with M. fermentans, and mouse cell cryotubes that are not contaminated, and extract DNA from 5 x 10 5 cells by the following method. Extracted. Each 5 × 10 5 cells were transferred to a 1 ml tube and centrifuged at 13000 g for 10 minutes. The supernatant was removed, and the cell mass was suspended in 100 μl of Lysis Buffer (150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA). 1 μl of 10% SDS solution was added, and Proteinase K was added at a concentration of 250 μg / ml. After incubating at 55 ° C for 1 hour, the mixture was incubated at 95 ° C for 10 minutes to stop the action of the enzyme. Thereafter, 500 μl of sterile distilled water was added. Each of these solutions was used below as a test solution.
実施例３と同様に、マスターミクスチャー ( iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad社) 25μl, Primers mix (2.5μM each) 6 μl, water 14μl ) 45μl に上記各試料溶液5μl を加えて、95℃ 3分を1サイクル、95℃ 15秒＋65℃ 30秒を40サイクルの条件でリアルタイムPCR を行った。融解曲線解析は行わなかった。結果を図５に示す。マウス細胞を汚染しているM.hyorhinis及びM.fermentansは明瞭に検出されており、汚染のない細胞ではマイコプラズマ様の増幅産物は全く確認されなかった。その他にも、ヒト、ラット、ハムスター、サル由来の汚染のない細胞で擬陽性が検出されないことも確認した。
〔比較例１〕
As in Example 3, 5 μl of each of the above sample solutions was added to 45 μl of the master mixture (iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) 25 μl, Primers mix (2.5 μM each) 6 μl,
[Comparative Example 1]
以下の比較例は、Nested PCR（２段階PCR）を採用した市販キットを用い、その使用マニュアルにしたがい、実施例１の被験試料についてマイコプラズマの検出を行ったものである。
実施例１と同様にして各DNAを含有する被験試料溶液およびコントロール溶液をそれぞれ調製した。
マスターミクスチャー ( 1st stage Primers 1 μl, Taq Polymerase Buffer 45 μl, Taq Polymerase 1unit ) のうち45μl に上記各試料溶液及びコントロール溶液をそれぞれ５μl 加えて、94℃ 2分を１サイクル、94 ℃ 30秒＋ 55 ℃ 30秒＋72℃ 1分を30サイクルの条件で1回目の増幅反応を行った。この際要する時間は反応の開始から終了まで約100分であった。さらに1回目の増幅産物を用いて２回目の増幅反応を行った。1st stage primers の代わりに2nd stage primers を加えたマスターミクスチャー 45μl に1回目PCR 反応液を5 μl加えて１回目と同条件で増幅反応を行った。この際も要する時間は約100分であった。２回目の増幅反応終了後、アガロースゲルを用いて増幅物の電気泳動を行った。この泳動に要する時間は約３０分から４０分であった。さらに、ゲルの染色を（約１５分）行い、UV 照射装置でバンドの有無、サイズを確認した。これらを含めて検出過程に要する時間における時間は、最短でも４時間以上であった。
In the following comparative examples, a commercially available kit employing nested PCR (two-step PCR) was used, and mycoplasma was detected in the test sample of Example 1 according to the instruction manual.
A test sample solution and a control solution containing each DNA were prepared in the same manner as in Example 1.
To 45 μl of the master mixture (
また、初回PCRの増幅産物を２回目のPCRに使用すること、電気泳動を行うこと等作業手順が多く煩雑で、サンプル数が増えることによりさらに時間を要した。図６に上記電気泳動写真を示す。このキットは増幅産物サイズの違いでマイコプラズマ種を同定できる特色があるが、ほぼ同サイズの増幅産物を呈するマイコプラズマも存在し、確実な判定には増幅産物を濃縮して、制限酵素で切断して電気泳動を行うという手順を要する。
〔比較例２〕
In addition, the operation procedure, such as using the amplification product of the first PCR for the second PCR and performing electrophoresis, is complicated and complicated, and more time is required due to an increase in the number of samples. FIG. 6 shows the above electrophoresis photograph. Although this kit has the characteristic that the mycoplasma species can be identified by the difference in the amplification product size, some mycoplasmas exhibiting amplification products of almost the same size exist.For reliable determination, the amplification product is concentrated and cut with restriction enzymes. It requires a procedure of performing electrophoresis.
[Comparative Example 2]
この比較例は、リアルタイムPCR用のキットとして、蛍光プローブを使用する試験キットを用いて、該キットの使用マニュアルにしたがって、実施例１の被験試料についてマイコプラズマの検出を行ったものである。
実施例１と同様にして各DNAを含有する被験試料溶液およびコントロール溶液をそれぞれ調製した。
次いで、マスターミクスチャー( water 12.1μl, 10 X reaction buffer 2.5μl, primer/mucleotide mix 2.5 μl, internal control probe 2.5 μl, internal control 2.5 μl, Taq Polymerase 1unit, UNG 0.2 unit ) 22.5 μlに、上記各DNA含有試料溶液 2.5 μlを加えて、95℃ 10分を１サイクル、95 ℃ 30秒＋55 ℃ 30秒＋60 ℃ 30秒を45サイクルの条件（本キット説明書記載条件）でリアルタイムPCR を行った。この際要した時間は反応開始から終了まで約130分であった。
In this comparative example, a test kit using a fluorescent probe was used as a kit for real-time PCR, and mycoplasma was detected in the test sample of Example 1 according to the instruction manual for the kit.
A test sample solution and a control solution containing each DNA were prepared in the same manner as in Example 1.
Then, 22.5 μl of master mixture (water 12.1 μl, 10 X reaction buffer 2.5 μl, primer / mucleotide mix 2.5 μl, internal control probe 2.5 μl, internal control 2.5 μl,
図７に反応過程の蛍光強度グラフを示す。これによれば、M.arginini, M.fermentans, M.hyorhinisに関しては蛍光強度がThreshold lineを越えておらず、検出されていないことが明らかである。その他のマイコプラズマに関してもすべてThreshold cycleが38 以上と高い値を示す。これは感度が低いことを示す。反応開始から終了までに要する時間もリアルタイムPCR
の系としては長いと思われる。このキットに関しては論文が示されておらず、説明書にも詳細は記載されていないが、リアルタイムPCR としての条件の最適化が不十分であると考えられる。また、図７に示すように、大腸菌DNAが検出されており、マイコプラズマ特異的検出法としては不十分な結果が生じた。
FIG. 7 shows a fluorescence intensity graph during the reaction process. According to this, it is clear that the fluorescence intensity of M.arginini, M.fermentans, and M.hyorhinis did not exceed the Threshold line and was not detected. The threshold cycle of all other mycoplasmas is as high as 38 or more. This indicates that the sensitivity is low. The time required from the start to the end of the reaction is also real-time PCR
It seems to be a long system. Although no paper has been published for this kit and the details have not been described in the instruction manual, the optimization of the conditions for real-time PCR is considered to be insufficient. In addition, as shown in FIG. 7, Escherichia coli DNA was detected, resulting in insufficient results for a mycoplasma-specific detection method.
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