JP2004305049A

JP2004305049A - Gene encoding glucosyltransferase and its utilization

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Publication number: JP2004305049A
Application number: JP2003100692A
Authority: JP
Inventors: Hiroyuki Yoshida; 洋之吉田; Yoshihiro Koseki; 良宏小関; Yoshihisa Ito; 佳央伊藤
Original assignee: Japan Tobacco Inc; Tokyo University of Agriculture and Technology NUC
Current assignee: Japan Tobacco Inc; Tokyo University of Agriculture and Technology NUC
Priority date: 2003-04-03
Filing date: 2003-04-03
Publication date: 2004-11-04
Anticipated expiration: 2023-04-03
Also published as: JP4270370B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a chalcone 2'-O-glucosyltransferase (Ch 2'GT) gene, to provide a method for utilizing the same, especially a method for changing the flower color of a plant. <P>SOLUTION: All RNAs were extracted from flower petals in the flower buds of Dianthus caryophyllus [A66] putting forth yellow flowers and Dianthus caryophyllus [8358-01] putting forth orange color flowers, and mRNAs were prepared. Further, cDNAs were synthesized. cDNAs as candidates for the Ch 2'GT were isolated by PCR screening treatment using a degeneracy primer. Subsequently, the activities of encoded proteins were measured from the cDNAs. As the result, it was found that there were two kinds of the cDNAs for producing a chalconnaringenin glucoside from chalconnaringenin as a substrate. The flower color of a plant can be changed by the utilization of the DNAs encoding the Ch 2'GT. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グルコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子およびその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
花の色や果実の色などに見られるように、自然界には多くの植物性色素が存在するが、これらは化学構造によってカロチノイド、ベタシアニン及びフラボノイドに分類できる。その中でも多種多様な花の色のうち、赤色、赤紫色、紫色、青色のほとんどはフラボノイドの一種であるアントシアニンにより発色していることが古くより知られている。アントシアニンは花や紅葉に存在する赤色色素で植物界に最も広く分布し、現在では食品添加物としても広く用いられており、最近、抗酸化効果等の生理的機能を有することも報告されている（非特許文献１および２）。
【０００３】
アントシアニンの生合成は、主にペチュニアやキンギョソウ等を用いて研究されてきた（非特許文献３〜５）。アントシアニンは一次代謝系におけるフェニルアラニンをその原料とし、フェニルプロパノイド合成系とそれに続くフラボノイド（アントシアニン）合成系を通じて生成される。このアントシアニン生合成経路の解明により、従来の交配育種の手法や新規遺伝子導入などの分子生物学的な手法を用いて、新しい花色を有する新規花品種の育成がなされている（非特許文献６）。
【０００４】
黄色や橙色の花色を呈する色素は、カロチノイド、ベタキサンチン、そしてカルコン類やオーロン類を中心とする黄色フラボノイド色素、の三つのグループに分類される。しかし黄色フラボノイド色素を除き、その生合成経路には未だ不明な点が多く、遺伝学的知見はもちろん、化学合成的知見も未だ得られていない。一方、黄色フラボノイド色素は、アントシアニンの生合成経路における中間代謝産物として知られ、特にカルコン類については強い黄色を呈すこと及びアントシアニンと共存することで橙色を示すことから（非特許文献７）、新規な黄色または橙色花品種の育成への利用が有望視されている（非特許文献８）。またペチュニアにおいては、カルコン還元酵素を用いてカルコンから６’−デゾキシカルコンへのフラボノイド生合成を変化させることで黄色の花が作出されている（非特許文献９）。しかし、これまでカルコン類を利用した分子生物学的手法による黄色品種または橙色品種の作出に成功した例は知られていない。
【０００５】
カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）は植物学的分類上、中心子目ナデシコ科ナデシコ属に属する。カーネーションにおいては黄色の花を持つ品種は限られているが、黄色の花を持つカーネーションの花弁細胞の液胞には、主要黄色フラボノイド色素としてカルコノナリンゲニン２’−Ｏ−グルコシド（Ｃｈａｌｃｏｎｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ２’−Ｏ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ；以下Ｃｈ２’Ｇと称する）が含まれている（非特許文献１０）。アントシアニン生合成経路の中間産物であるｐ−クマロイル−ＣｏＡと、マロニル−ＣｏＡを基質としてＣＨＳ（ｃｈａｌｃｏｎｓｙｎｔａｓｅ）によりカルコン（４，２’，４’，６’−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙｃｈａｌｃｏｎ；以下カルコンと称する）が合成され、その後、配糖体化酵素（ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；以下ＧＴと称する）であるカルコン２’−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ（Ｃｈａｌｃｏｎ２’−Ｏ−ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（以下、Ｃｈ２’ＧＴと称する）によってカルコンの２’位が配糖化されてＣｈ２’Ｇとなり、液胞に運搬され蓄積されると考えられている（非特許文献１１および１２）。しかし、Ｃｈ２’ＧＴの存在は未だ確認されていない。
【０００６】
黄色カーネーションの種類が少ないのは、カーネーションではそのアントシアニン生合成経路において、カルコンがＣＨＩ（ｃｈａｌｃｏｎｅｉｓｏｍｅｒａｓｅ）遺伝子やＤＦＲ（ｄｉｈｙｄｒｏｆｌａｖｏｎｏｌ４−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）遺伝子の作用を受け、最終的にアントシアニンが生成される経路が主経路であるためと考えられる。従ってカーネーションの花が黄色を呈するためには、ＣＨＩ遺伝子並びにＤＦＲ遺伝子にトランスポゾン（ｄＴｄｉｃ１）が挿入されるといった理由により遺伝子破壊が生じなければならず、さらにこれによって過剰に余った中間産物であるカルコンがＣｈ２’ＧＴによって配糖体化されることが必要だと想定される（非特許文献８）。配糖体化が必要である理由のひとつとして”解毒”ということがあげられる。カルコンは元々油溶性物質であり、さらにこれが配糖体化されないままでは植物の生育、花の形成にとっては有害であるためである。つまり、このカルコンに配糖体化する酵素が存在しない花においては、黄色を呈しない、もしくは花が形成されないと考えられている。このことからＣｈ２’ＧＴを利用することができれば、黄色花を持つ新品種の作出に有効であると考えられているがこれまでのところ実現には至っていない。
【０００７】
一般に、ＧＴはフラボノイド生合成経路において大きな役割を果たす。ＧＴは基質分子の水酸基がＵＤＰ−グルコース（ｕｒｉｄｉｎｅ−５’−ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｓｅ）へと転移する反応を触媒する働きを持つ。３−デオキシ型を除くすべてのアントシアニジンは、３−水酸基の位置で配糖体化され、さらに多くの場合５−水酸基の位置で配糖体化された後、アントシアニンとなる。アントシアニジンを配糖体化するアントシアニングルコシルトランスフェラーゼ（ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）は、多くの植物種に存在することがわかっている（例えば、非特許文献１３〜１５）。
【０００８】
ＧＴをコードする遺伝子に関しては、３−水酸基を配糖体化する酵素、３ＧＴをコードする３ＧＴ遺伝子が、Ａｃと呼ばれるトランスポゾンタギングによってトウモロコシ（Ｚｅａｍａｙｓ）から初めて単離され（非特許文献１６）、続いてその他の植物種からも単離が行なわれている（例えば、非特許文献１７および１８）。一方、アントシアニン５ＧＴ遺伝子がディファレンシャルスクリーニング法によって、シソ（Ｐｅｒｉｌｌａｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）から最初に単離された（非特許文献１９）。またフラボノイド生合成経路の中間産物であるケンフェロール、クェルセチンに配糖化するフラボノイドグルコシルトランスフェラーゼ（ｆｌａｖｏｎｏｉｄｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子も単離されている（非特許文献２０）。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）のゲノム内には、約１１０の個別のＧＴ配列を含むことが示されており、機能的に特徴付けされたのはごくわずかである（非特許文献２１および２２）ことからも配糖化酵素の機能が多岐にわたっていることが示唆される。そしてこれまでに、アントシアニン生合成経路の中間産物であるカルコンの２’位を配糖体化するＣｈ２’ＧＴをコードする遺伝子は単離されていない。
【０００９】
尚、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
【非特許文献１】Ｉｇａｒａｓｈｉら、ＮｉｐｐｏｎＳｈｏｋｕｈｉｎＫｏｇｙｏＧａｋｋａｉｓｈｉ，３６（１０）：８５２，１９８９
【非特許文献２】Ｔａｍｕｒａら、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．ＦｏｏｄＣｈｅｍ．，４２：１６１２，１９９４
【非特許文献３】Ｍａｒｔｉｎら、ＰｌａｎｔＪ，１：３７−４９，１９９１
【非特許文献４】ｖａｎｄｅｒＫｒｏｌら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，２：２９１−２９９，１９９０
【非特許文献５】Ｈｏｌｔｏｎら、ＰｌａｎｔＪ，４：１００３−１０１０，１９９３
【非特許文献６】ＦｏｒｋｍａｎｎａｎｄＭａｒｔｅｎｓ、ＣｕｒｒＯｐｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１２（２）：１５５−６０，２００１
【非特許文献７】北川ら、園学雑，７０別２：２０５，２００１
【非特許文献８】Ｉｔｏｈら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ，４３：５７８−５８５，２００２
【非特許文献９】Ｄａｖｉｓら、ＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌ１３（２）：２５９−２６６Ｊａｎ．，１９９８
【非特許文献１０】ＦｏｒｋｍａｎｎａｎｄＤａｎｇｅｌｍａｙｒ、ＢｉｏｃｈｅｍＧｅｎｅｔ，１８（５−６）：５１９−２７，１９８０
【非特許文献１１】ＧｏｎｇＺら、ＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ，３５（６）：９１５−２７，１９９７
【非特許文献１２】ＮａｋａｙａｍａＭら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５５（８）：９３７−９，２０００
【非特許文献１３】Ｄｏら、ＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，１１２：４３−５１，１９９５
【非特許文献１４】Ｏｇａｔａら、Ｊ．ＰｌａｎｔＲｅｓ，１１１：２１３−２１６，１９９８
【非特許文献１５】Ｏｇａｔａら、Ｊ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ，１５８：７０９−７１４，２００１
【非特許文献１６】Ｆｅｄｏｒｏｆｆら、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂＳｙｍｐＱｕａｎｔＢｉｏｌ，４９：３３９−４５，１９８４
【非特許文献１７】Ｔａｎａｋａら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ，３７：７１１−７１６，１９９６
【非特許文献１８】Ｆｏｒｄら、ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２７３：９２２４−９２３３，１９９８
【非特許文献１９】Ｙａｍａｚａｋｉら、ＪＢｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７４：７４０５−７４１１，１９９９
【非特許文献２０】Ｍａｔｏら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ，３９（１１）：１１４５−５５，１９９８
【非特許文献２１】Ｊａｃｋｓｏｎら、ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２７６：４３５０−４３５６，２００１
【非特許文献２２】Ｌｉｍら、ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２７６：４３４４−４３４９，２００１
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、Ｃｈ２’ＧＴをコードする遺伝子とその利用方法、特に植物の花色を改変する方法を提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、黄花をつけるカーネーション「Ａ６６」および橙色花をつけるカーネーション「８３５８−０１」の花蕾中の花弁より全ＲＮＡを抽出した後、ｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成した。Ｃｈ２’ＧＴ遺伝子の候補となるｃＤＮＡは、縮重プライマーによるＰＣＲスクリーニングによって単離した。得られたＰＣＲ産物をベクターに導入した後、シークエンス解析を行なった。その結果、遺伝子の相同性からＧＴをコードすると思われるｃＤＮＡを２６種類単離した。次いで、この全長を５’および３’ＲＡＣＥによって単離した。これらをベクターにクローニングした後、大腸菌に導入し、培養した後、ホモジナイザーで破砕した。これを遠心し、上澄み液を酵素液として活性の測定に用いた。その際反応基質としてはアントシアニンの生合成経路の中間代謝産物などを用いた。この酵素液について、ＴＬＣ分析、ＨＰＬＣおよび^１４ＣＵＤＰ−グルコースを用いた液体シンチレーターによる分析を行った。その結果、カルコノナリンゲニンを基質とし、Ｃｈ２’Ｇを生成するＣｈ２’ＧＴは二種類存在することがわかった。よって、これらのＣｈ２’ＧＴをコードするＤＮＡを利用することで、植物の花を改変できる。
【００１２】
即ち、本発明は、以下の〔１〕〜〔２１〕を提供するものである。
〔１〕以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のグルコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：１または３に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｄ）配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
〔２〕グルコシルトランスフェラーゼが、カルコン２’−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼである、〔１〕に記載のＤＮＡ。
〔３〕カーネーション由来である、〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡ。
〔４〕植物においてカルコン２’−Ｏ−グルコシドを生産させるために用いる、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のＤＮＡ。
〔５〕植物の花色を改変するために用いる、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のＤＮＡ。
〔６〕植物の花色を黄色〜橙色に改変するために用いる、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のＤＮＡ。
〔７〕〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のＤＮＡからコードされるタンパク質。〔８〕〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクター。
〔９〕〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のＤＮＡ、または〔８〕に記載のベクターを保持する形質転換植物細胞。
〔１０〕〔９〕に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
〔１１〕花色が改変した、〔１０〕に記載の形質転換植物体。
〔１２〕花色が黄色〜橙色に改変した、〔１０〕に記載の形質転換植物体。
〔１３〕〔１０〕〜〔１２〕のいずれかに記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
〔１４〕〔１０〕〜〔１３〕のいずれかに記載の形質転換植物体の繁殖材料。
〔１５〕〔１０〕〜〔１３〕のいずれかに記載の形質転換植物体の切り花。
〔１６〕〔１０〕〜〔１２〕のいずれかに記載の形質転換植物体の製造方法であって、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のＤＮＡまたは〔８〕に記載のベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法。
〔１７〕形質転換植物体が、花色が改変した形質転換植物体である、〔１６〕に記載の方法。
〔１８〕形質転換植物体が、花色が黄色〜橙色に改変した形質転換植物体である、〔１６〕に記載の方法。
〔１９〕〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のＤＮＡを植物体の細胞内で発現させることを特徴とする、植物の花色を改変する方法。
〔２０〕〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のＤＮＡを植物体の細胞内で発現させることを特徴とする、植物の花色を黄色〜橙色に改変する方法。
〔２１〕植物がカーネーションである、〔１６〕〜〔２０〕のいずれかに記載の方法。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、新規な２つのグルコシルトランスフェラーゼ（ＤｃＧＴ２（Ｄ）およびＤｃＧＴ３（Ｈ）と命名）を単離した。本発明で単離されたＤｃＧＴ２（Ｄ）およびＤｃＧＴ３（Ｈ）のｃＤＮＡ配列をそれぞれ配列番号：１および３に、これらのＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：２および４に示す。
【００１４】
本発明者らが単離したＤｃＧＴ２（Ｄ）およびＤｃＧＴ３（Ｈ）は、カルコンからＣｈ２’Ｇへの変換反応を触媒する（図１）。さらに、ＤｃＧＴ２（Ｄ）は、シアニジンからシアニジン３−Ｏ−グルコシドへの変換反応およびシアニジン５−Ｏ−グルコシドへの変換反応、シアニジン３−Ｏ−グルコシドからシアニジン３，５−Ｏ−グルコシドへの変換反応を触媒する。
【００１５】
すなわち、本発明者らが単離したＤｃＧＴ２（Ｄ）およびＤｃＧＴ３（Ｈ）は、Ｃｈ２’ＧＴとしての活性を有し、ＤｃＧＴ２（Ｄ）は、シアニジン３−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼおよびシアニジン５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼとしての活性も有する。
【００１６】
本発明は、以上の知見に基づき、これら２つのグルコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子およびその利用法を提供するものである。
【００１７】
本発明において、グルコシルトランスフェラーゼとは、カルコン、アントシアニジン骨格あるいはアントシアニン骨格を持つ化合物を配糖体化する酵素を意味する。
【００１８】
本発明のグルコシルトランスフェラーゼを利用することで、Ｃｈ２’Ｇ、またはアントシアニジン骨格を有する化合物の、３−Ｏ−グルコシド化合物および５−Ｏ−グルコシド化合物が合成できる。本発明のグルコシルトランスフェラーゼを利用して合成された化合物は、着色剤として利用できる。
【００１９】
また、本発明のグルコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを使用することによって、植物においてＣｈ２’Ｇを生産できる。Ｃｈ２’Ｇは、植物の花色を黄色に発色させる色素であるから、本発明のグルコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを使用することで、植物の花色を黄色に改変できる。またＣｈ２’Ｇは、その他の色素の共存下において、植物の花色を様々な色に発色させる。例えばＣｈ２’Ｇは、アントシアニンの共存下において、植物の花色を橙色に発色させる。よって、本発明のグルコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを利用することで、植物の花色を改変することができる。改変後の色の色相としては、好ましくは黄色〜橙色の範囲の色相、より好ましくは黄色または橙色が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、改変後の色の明度および彩度は特に制限されるものではない。
【００２０】
本発明におけるグルコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡとしては、例えば配列番号：１または３に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡや配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００２１】
また、本発明は、配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを包含する。このようなＤＮＡの配列は、配列番号：１または３に記載の塩基配列と、配列全体で少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を示す。
また、このようなＤＮＡからコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列と、配列全体で少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を示す。
【００２２】
配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡが由来する生物種としては、特に制限はないが、好ましくは植物である。該植物としては、例えばカーネーション、ボタン、ダリア、アスター、アサガオ、ムギワラギク、シクラメンなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と構造的に類似したタンパク質（被検タンパク質）が、配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質であるか否かは、例えば、被検タンパク質がカルコンからＣｈ２’Ｇへの変換反応を触媒するか否か、または、被検タンパク質をコードするＤＮＡが導入された植物の花色が改変する（好ましくは黄色〜橙色、より好ましくは黄色または橙色に改変する）か否か、を検討することで確認できる。また、被検タンパク質が、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質であるか否かは、例えば、被検タンパク質がアントシアニジンからアントシアニン３−Ｏ−グルコシドおよびアントシアニン５−Ｏ−グルコシドへの変換反応を触媒するか否かを検討することで確認できる。
【００２４】
配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡには、例えば、配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする変異体、誘導体、アリル、バリアントおよびホモログが含まれる。このようなアミノ酸の変異は自然界においても生じうる。変異するアミノ酸数は、アミノ酸が付加、欠失もしくは置換されるアミノ酸残基の部位などによって異なるが、好ましくは１２０個以内、より好ましくは３〜５０個、さらに好ましくは３〜３０個程度である。
【００２５】
また、変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。
【００２６】
あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸の置換により修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質がその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２−５６６６、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．＆Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）１０，６４８７−６５００、Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２４，１４３１−１４３３、Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９，６４０９−６４１３、Ｂｏｗｉｅｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２４７，１３０６−１３１０）。
【００２７】
また、あるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を調製するための、当業者によく知られた方法としては、タンパク質に変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．ｅｔａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ１５２，２７１−２７５、Ｚｏｌｌｅｒ，ＭＪ，ａｎｄＳｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８３）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１００，４６８−５００、Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ｅｔａｌ．（１９８４）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１２，９４４１−９４５６、ＫｒａｍｅｒＷ，ａｎｄＦｒｉｔｚＨＪ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３５０−３６７、Ｋｕｎｋｅｌ，ＴＡ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２，４８８−４９２、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８８）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．８５，２７６３−２７６６）などを使用できる。
【００２８】
配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列に複数個のアミノ酸残基が付加されたタンパク質には、これらタンパク質を含む融合タンパク質が含まれる。融合タンパク質は、これらタンパク質と他のタンパク質とが融合したものであり、本発明に含まれる。融合タンパク質を作製するには、例えば、配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡと他のタンパク質をコードするＤＮＡをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよい。
【００２９】
本発明のタンパク質との融合に付される他のタンパク質としては、特に制限はない。また、本発明のタンパク質との融合に付される他のペプチドとしては、例えば、ＦＬＡＧ（Ｈｏｐｐ，Ｔ．Ｐ．ｅｔａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６，１２０４−１２１０）、６個のＨｉｓ（ヒスチジン）残基からなる６×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ、インフルエンザ凝集素（ＨＡ）、ヒトｃ−ｍｙｃの断片、ＶＳＶ−ＧＰの断片、ｐ１８ＨＩＶの断片、Ｔ７−ｔａｇ、ＨＳＶ−ｔａｇ、Ｅ−ｔａｇ、ＳＶ４０Ｔ抗原の断片、ｌｃｋｔａｇ、α−ｔｕｂｕｌｉｎの断片、Ｂ−ｔａｇ、ＰｒｏｔｅｉｎＣの断片等の公知のペプチドを使用することができる。また、本発明のタンパク質との融合に付される他のタンパク質としては、例えば、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、ＨＡ（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）等が挙げられる。市販されているこれらタンパク質をコードするＤＮＡを本発明のタンパク質をコードするＤＮＡと融合させ、これにより調製された融合ＤＮＡを発現させることにより、融合タンパク質を調製することができる。
【００３０】
配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを調製するために、当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（ＳｏｕｔｈｅｒｎＥＭ：Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３，１９７５）やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（ＳａｉｋｉＲＫ，ｅｔａｌ：Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０：１３５０，１９８５、ＳａｉｋｉＲＫ，ｅｔａｌ：Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：４８７，１９８８）を利用する方法が挙げられる。すなわち、本発明のグルコシルトランスフェラーゼのｃＤＮＡの塩基配列（配列番号：１または３）、または、その一部をプローブとして、また、配列番号：１または３に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、カーネーションや他の植物からグルコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡと高い相同性を有するＤＮＡを単離することは、当業者にとって通常行い得ることである。このように、ハイブリダイゼーション技術やＰＣＲ技術によって単離し得るグルコシルトランスフェラーゼと同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡもまた、本発明のグルコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡに含まれる。
【００３１】
このようなＤＮＡを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明のハイブリダイゼーション反応においては、さまざまな程度のストリンジェントな条件を用いることができる。条件を厳しくするほど、二本鎖形成に必要とする相補性が高くなる。好ましくは、標準的方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験マニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）」、第三版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ニューヨーク（２００１））において説明されているような当技術分野において周知の技術によって、ストリンジェントな条件の下でハイブリダイゼーションを行う。
【００３２】
本発明の目的に適した「低ストリンジェントな条件」は、例えば５ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳ、４２℃でのハイブリダイゼーション、それに続く１ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳ、４２℃での洗浄である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば２ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５５℃でのハイブリダイゼーション、それに続く１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５５℃での洗浄である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃でのハイブリダイゼーション、それに続く０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃での洗浄である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られると期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。ここで、「高い相同性」とは、ＤＮＡ配列全体で少なくとも５０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上、最も好ましくは９８％以上の配列の同一性を指す。
【００３３】
また、配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡは、本発明のＤＮＡを有する植物や植物細胞に変異処理を行い、該植物や細胞から、例えば配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを選択することによっても得ることができる。
【００３４】
また、たとえ塩基配列が変異していても、その変異がタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わないこと（縮重変異）があるが、このような縮重変異ＤＮＡも本発明のグルコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡに含まれる。
【００３５】
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：２２６４−２２６８，１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３，１９９３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（ＡｌｔｓｃｈｕｌＳＦ，ｅｔａｌ：ＪＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３，１９９０）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。
【００３６】
本発明のＤＮＡには、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび化学合成ＤＮＡが含まれる。ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの調製は、当業者にとって常套手段により行うことが可能である。ゲノムＤＮＡは、例えば、カーネーションからゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣなどが利用できる）を作製し、これを展開して、本発明のグルコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ（例えば、配列番号：１または３）を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことで調製できる。また、本発明のグルコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ（例えば、配列番号：１または３）に特異的なプライマーを作製し、これを利用したＰＣＲを行って調製することも可能である。ｃＤＮＡは、例えば、カーネーションから抽出したｍＲＮＡを基にｃＤＮＡを合成し、これをλＺＡＰなどのベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作製し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことで、またＰＣＲを行うことにより調製できる。
【００３７】
本発明のグルコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを使用することによって、植物の花色を改変する（好ましくは黄色〜橙色、より好ましくは黄色または橙色に改変する）ことが可能である。例えば、該ＤＮＡを発現または発現誘導可能なベクターに連結して、後述する方法で、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させることによって、植物の花色を改変できる。
【００３８】
本発明のＤＮＡを導入することにより、花色を改変することが可能な植物としては、特に制限はなく、例えばカーネーション、ペチュニア、バラ、アサガオなどアントシアニン色素を発色する花を持つ植物全てが挙げられる。
【００３９】
本発明は、本発明のＤＮＡを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む形質転換植物体の製造方法を提供する。
【００４０】
本発明において、植物細胞の形質転換に用いられるベクターは、該細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はないが、挿入遺伝子を過剰発現させることが可能なベクターであることが好ましい。例えば、植物細胞内で恒常的に遺伝子を発現させるためのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター）を有するベクターや、外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることもできる。例えば、バイナリーベクターｐＢＩ１０１（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら１９８７）などこれらの改変ベクターを使用することができる。
【００４１】
また、上記「植物細胞」には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。
【００４２】
植物細胞へのベクターの導入には、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法など、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。
【００４３】
形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。例えば、高等植物において形質転換植物体を作出する手法については、組織からプロトプラストを単離し、最適培養密度に調整した後に、植物ホルモンを添加したＭＳ培地でカルスを誘導し、これを脱分化させることによって植物体を再生させる方法など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
【００４４】
ゲノム内に本発明のＤＮＡが導入された形質転換植物体がいったん得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることができる。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなど）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。
【００４５】
また、本発明の形質転換植物体やその子孫あるいはクローンから切り花を生産することも可能である。本発明は、このような切り花もまた提供するものである。切り花とは、一般的には枝や茎のついたまま切りとった花を指すが、本発明における切り花には、枝や茎のついていない花も含む。
【００４６】
【実施例】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔１〕植物材料
カーネーションのうち、濃桃色花をつける「シンフォニーローズ（ＳｙｍｐｈｏｎｙＲｏｓｅ）」、色素分析によりＣｈ２’Ｇを含有していることが確認された、黄色花をつける「Ａ６６」並びに橙色花をつける「８３５８−０１」を、長野県の農場で栽培し、４つの発育段階で葉、茎、根および花弁に分離した。組織を秤量し、液体窒素中で凍結して、使用するまで−８０℃で保存した。
【００４７】
〔２〕ＧＴのクローニング
全ＲＮＡは、改良グアニジニウムチオシアネート−ＣｓＣｌ超遠心法を用いて、上記品種の第二段階の閉じた蕾の赤色花弁（Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏらの図５Ａ、ＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈ，１７：３２５−３２９，２０００）より調製した（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、１９７９）。ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡは、ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞（ＴａＫａＲａＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、日本）を用いて、供給者によるマニュアルに記載されているように全ＲＮＡから調製した。第一鎖ｃＤＮＡは、ＦｉｒｓｔｓｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて、上記品種の花弁から調製したポリ（Ａ）^＋ＲＮＡにより合成し、ＰＣＲのテンプレートとして使用した。全長ｃＤＮＡは、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ^ＴＭＫｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、オランダ）を用いて調製した。カーネーションｃＤＮＡをテンプレートとして用いたＰＣＲ増幅には、以前に報告された種々のＧＴによる保存アミノ酸配列に基づいて設計した縮重プライマーを使用した。その配列は以下に示す。リバースプライマー、５’‐ＧＴＢＲＴＷＮＴＳＡＡＹＷＳＹＴＴＹＫＡＫＧＡＲＹＴＫＧＡ‐３’（配列番号：５）および５’‐ＡＡＲＳＭＭＲＲＷＴＣＭＧＴＫＧＴＫＴＡＹＶＴＮＷＧＴＴＴＹＧＧＭＡ‐３’（配列番号：６）、フォワードプライマー、５’‐ＴＮＧＡＲＴＴＣＣＡＮＣＣＲＣＡＲＴＧＨＧＴＮＡＣＲＡＡ‐３’（配列番号：７）および５’‐ＲＴＧＭＫＣＭＡＲＲＡＴＹＷＳＨＡＮＹＴＧＧＧＧＷＧＣＣＣＡ‐３’（配列番号：８）。
【００４８】
ｃＤＮＡ混合物１μｌとプライマー４ｐｍｏｌを含むＬＡ−ＰＣＲ混合物（１０μｌ）を、供給者の推奨に従って調製した。混合物は９２℃にて１分間インキュベートし、その後０．５ｕｎｉｔのＴａＫａＲａＬＡ−ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加えた。ＰＣＲは４０回の増幅サイクルを実施した（９２℃にて３０秒；５５℃にて４５秒；７２℃にて１分）。増幅した断片をｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔＳＫ中にクローニングして、ＡｌｏｋａＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅｒｍｏｄｅｌ４０００ＬとともにＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ（ｕｓｂ）を使用して配列決定を行った。配列データに基づいて、特異性ＧＴフォワードおよびリバースプライマーを作成した。ＧＴ５’上流および３’下流領域は、カーネーションｃＤＮＡをＰＣＲのテンプレートとして、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’プライマーおよび特異性ＧＴリバースプライマー、並びにＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’プライマーおよび特異性ＧＴリバースプライマーを用いて単離した。ＤｃＧＴ２（Ｄ）に関し５’上流および３’下流領域はプライマー、５’‐ＡＴＣＣＴＴＧＡＧＧＣＡＡＣＡＧＴＴＣＴＴＣＡＣＣＧＴ‐３’（配列番号：９）およびプライマー、５’‐ＴＣＧＧＡＡＧＴＡＣＡＧＣＡＣＡＣＴＡＴＧＣＡＣＣＣＧＣＴ‐３’（配列番号：１０）、ＤｃＧＴ３（Ｈ）に関し５’上流および３’下流領域はプライマー、５’‐ＡＴＴＡＧＣＣＡＧＴＣＣＣＣＡＧＧＣＡＡＴＣＴＣＧＡＣＡ‐３’（配列番号：１１）およびプライマー、５’‐ＡＧＣＡＣＴＣＧＧＣＡＴＣＣＴＣＡＡＣＣＡＣＡＡＧＣＡＴＡ‐３’（配列番号：１２）をそれぞれ用いた。増幅された断片を、上述と同様の方法でクローニングした。全長カーネーションＧＴｃＤＮＡは、配列データを基に構築したプライマーを使用し、カーネーションｃＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行い、増幅された断片を上述と同様の方法でクローニングした。
【００４９】
〔３〕ノーザンブロット解析
第１、２、３および４段階の花弁、根、茎、葉からの全ＲＮＡ（１０μｇ）は、Ｎｙｔｒａｎｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｅｆｉｌｔｅｒｓ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）上にブロットし、α^３２ＰｄＣＴＰ−ラベルＧＴ断片を用いて探索した。ブロットは、ストリンジェントな条件下で洗浄し、−８０℃でＸ線フィルム（Ｋｏｄａｋ）を使用して感光させた。
【００５０】
〔４〕ｒＧＴの発現および酵素アッセイ
ｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔＳＫベクターを使用して、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＤＨ５α内でＧＴ全長ｃＤＮＡを発現させた。ｃＤＮＡインサートは、プラスミド内の誘導性Ｔ７プロモーターのもとで調節される。ｒＧＴタンパク質を発現する形質転換体を、２ＹＴ＋Ａｍｐ５ｍｌの培地中で培養した。収集した細胞を５０ｍＭＫ−Ｐｉ緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄し、遠心分離（１０，０００ｘｇ、３０秒）にかけた。ペレットに５０ｍＭＫ−Ｐｉ緩衝液（ｐＨ７．０）および１４ｍＭ２−ＭＥを加えて、超音波処理した（ＴＯＭＹＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣＤＩＳＲＵＰＴＯＲＵＤ−２０１）。遠心分離（１２，０００ｘｇ、２０分、４℃）の後、粗酵素抽出物が得られた。タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ（１９７６）の方法により、ウシ血清アルブミンを基準タンパク質として用いて決定した。形質転換されたインサートなしのｐＢｒｕｓｃｒｉｐｔＳＫを対照酵素として使用した。
【００５１】
〔５〕フラボノイドＧＴ活性の決定
ｒＧＴのアッセイ用の標準反応混合物（総体積５０μｌ）は、酵素溶液２０μｌ、ｐＨ７．５の５０ｍＭＫ−ｐｉ中のフラボノイドまたはベタニジン２５ｎｍｏｌおよび２５ｎｍｏｌＵＤＰ−グルコース（ＵＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ）（９２５ＢｑＵＤＰ−Ｄ−［Ｕ−^１４Ｃ］ｇｌｕｃｏｓｅ）より構成された。混合物を３０℃にて１５分間インキュベートした。ＣＨ_３Ｃｌ／ＣＨ_３ＯＨ、２：１（Ｖ／Ｖ；プラス５％ＨＣＯＯＨ）からなる停止溶液５０μｌを加えて、反応を終了させ、次に混合物を３，０００ｘｇにて３分間遠心分離にかけた。上清２０μｌを薄層クロマトグラフィープレートに付し、次いで同じ場所に標品のアントシアニンを加えて、ＡＡＨ−ＩＩ（ＨＯＡｃ：ＨＣｌ：Ｈ_２Ｏ、１５：３：８２）中で展開した。クロマトグラムの放射能は、バイオイメージアナライザー（ｂｉｏｉｍａｇｅａｎａｌｙｚｅｒ（ＢＡＳ１５００、ＦｕｊｉＰｈｏｔｏｆｉｌｍ））によって走査した。基質としてのアントシアニンとベタレインを除くフラボノイド化合物の反応混合物は、１０％ＨＣＯＯＨ２０μｌを加えて停止させ、反応生成物は酢酸エチル２００μｌで抽出した。有機相のアリコート１００μｌをシンチレーションバイアルに移し、トルエンベースのシンチレーション液中で放射能を測定した。カルコンは、ＭｏｕｓｔａｆａａｎｄＷｏｎｇ（１９６７）の方法に従って、ナリンゲニン（Ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ）より合成した（ＭｏｕｓｔａｆａａｎｄＷｏｎｇ、ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ，６：６２５−６３２，１９６７）。
【００５２】
〔６〕カーネーションｒＧＴの反応生成物の同定
停止溶液によって終了させた反応混合物の上清中の反応生成物は、ＡＡＨ−ＩＩおよびｎ−ＢｕＯＨ−ＨＯＡｃ−Ｈ_２Ｏ（４：１：２、ｖ／ｖ）の溶媒系を用いて、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）（ＡｖｉｃｅｌＳＦ．Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ、日本）中の標品のフラボノイドのＲｆ値との比較によって同定した。さらに、逆相カラム（内径４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ、５Ｃ１８ＡＲ）を備えたＨＰＬＣ（ＢｅｃｋｍａｎＳｙｓｔｅｍＧｏｌｄ）によって、標品のフラボノイドの保持時間と比較して同定した。［分析条件移動相Ａ液：１．５％Ｈ_３ＰＯ_４，移動相Ｂ液：８０％ＭｅＯＨ、移動流量（１ｍｌ／ｍｉｎ）２０分間のＢ液２０→８０のグラジエント溶出、検出波長：５２０、３６０または２８０ｎｍ］。
【００５３】
［実施例１］
本発明者らは、数種の全長カーネーションＧＴｃＤＮＡをクローニングした（表１）。
【００５４】
【表１】

【００５５】
これらのカーネーションＧＴを大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）中で発現させ生成した組換えタンパク質に対し、その酵素活性および基質特異性を決定するため、種々のフラボノイドを使用し、ＴＬＣ分析、ＨＰＬＣおよび^１４ＣＵＤＰ−グルコースを用いた液体シンチレーターによる分析を行った。
【００５６】
図２および図３に示すように、生成した組換えタンパク質であるＤｃＧＴ３（Ｈ）及びＤｃＧＴ２（Ｄ）について、ＴＬＣ分析を行なった。その結果、ＤｃＧＴ３（Ｈ）では^１４Ｃでラベルされたカルコンおよびナリンゲニンが検出された（図２Ａ）。一方ＤｃＧＴ２（Ｄ）では^１４Ｃでラベルされたカルコン配糖体が検出された（図２Ｂ）。またＤｃＧＴ２（Ｄ）では、クェルセチンを基質としたとき、いくつかのスポットが確認され、そのうち一つはクェルセチン３−Ｏ−グルコシドであることが判明した。またナリンゲニンを基質としたとき、ＤｃＧＴ３（Ｈ）と同様に配糖化していることがわかった。
【００５７】
また、カルコンを基質としてＤｃＧＴ３（Ｈ）、ＤｃＧＴ２（Ｄ）と反応させ、ＨＰＬＣにて分析を行なった。その結果、ＤｃＧＴ２（Ｄ）により生成された生成物については、いくつかのスペクトルが確認され、これらの吸収波長がカルコンと同一もしくは類似していることから、カルコン配糖体であることがわかった。またこのカルコン配糖体とＣｈ２’Ｇの標準色素のリテンションタイムが完全一致した。このことから、このカルコン配糖体は２’の位置に配糖体化されていることが明らかになった。一方ＤｃＧＴ３（Ｈ）においても同様なスペクトルが見られ、標準色素と同じリテンションタイムに微量ではあるがＣｈ２’Ｇのスペクトルが見られた。
【００５８】
これらの結果から、ＤｃＧＴ２（Ｄ）とＤｃＧＴ３（Ｈ）は、カルコノナリンゲニンを基質とし、Ｃｈ２’Ｇを生成する酵素Ｃｈ２’ＧＴであることが判明した。これよりＣｈ２’ＧＴをコードするｃＤＮＡは二種類存在することがわかった。ＤｃＧＴ２（Ｄ）のアミノ酸配列は、ドロテアンサス属のベタニジン５ＧＴに対して６０％の同一性を示した（Ｖｏｇｔら、ＰｌａｎｔＪ，１９：５０９−５１９，１９９９）。
【００５９】
アントシアニン配糖化酵素は一般的にその基質特異性が広いと言われているが、ＤｃＧＴ２（Ｄ）に対してシアニジンを基質として反応させたときにはシアニジン３−Ｏ−グルコシドとシアニジン５−Ｏ−グルコシドの両方が生成した。これに対し、ＤｃＧＴ３（Ｈ）はシアニジンを配糖化しなかった。この結果、ＤｃＧＴ２（Ｄ）はシアニジン、シアニジン３−Ｏ−グルコシド、クェルセチンなどのフラボノールなど様々なアントシアニンの生合成経路の中間代謝産物を配糖体化するのに対し、ＤｃＧＴ３（Ｈ）はカルコンナリンゲニンを特異的に配糖体化することが判明した。またこれら二種類のｃＤＮＡの間には顕著な相同性はみられず、また酵素の至適ｐＨや至適温度も異なることが判明した（データは示さず）。
【００６０】
ＤｃＧＴ２（Ｄ）およびＤｃＧＴ３（Ｈ）のｃＤＮＡが単離できたことから、植物においてこれらが発現していることは明らかであるが、ノーザンレベルでは確認できなかった。このことは、これらの酵素活性が非常に高いこと、また、ごく微量の発現で植物の花色を改変できることを示唆する。
【００６１】
以上の結果は、遺伝子技術によりＤｃＧＴ２（Ｄ）またはＤｃＧＴ３（Ｈ）の遺伝子を導入することにより、花色が、例えば黄色〜橙色に改変された花を作成することが可能であることを示している。
【００６２】
【発明の効果】
本発明によって、Ｃｈ２’Ｇ、アントシアニジン３−Ｏ−グルコシド、およびアントシアニジン５−Ｏ−グルコシド等が製造できるようになった。また、本発明のＤＮＡを利用することで、植物の花色を改変できる。花に対する消費者ニーズが年々拡大、多様化しており、最近のガーデニングブームなどの影響もあって、家庭用の手軽で安価な切り花に人気が移りつつある。本発明のＤＮＡを利用して新規な花色を有する植物体を作出することで、このニーズに応えることができる。
【００６３】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】カーネーションによるナデシコ属Ｃｈ２’ＧＴによって触媒されたグルコシル転移を示す図である。
【図２】反応混合物中のナデシコ属Ｃｈ２’ＧＴによる反応生成物としてのカルコングルコシド、ナリンゲニングルコシドのＴＬＣ上での放射能の走査パターンを示す写真である。
【図３】反応混合物中のナデシコ属Ｃｈ２’ＧＴによる反応生成物としてのＣｈ２’ＧのＴＬＣ上での放射能の走査パターンを示す写真である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a gene encoding glucosyltransferase and its use.
[0002]
[Prior art]
As seen in the colors of flowers and fruits, there are many plant pigments in nature, which can be classified into carotenoids, betacyanines and flavonoids according to their chemical structures. Among them, it has long been known that, among various colors of flowers, most of red, magenta, purple and blue are colored by anthocyanins which are a kind of flavonoids. Anthocyanins are red pigments present in flowers and autumn leaves, are the most widely distributed in the plant world, are now widely used as food additives, and have recently been reported to have physiological functions such as antioxidant effects. (Non-Patent Documents 1 and 2).
[0003]
The biosynthesis of anthocyanins has been studied mainly using petunia, snapdragon and the like (Non-Patent Documents 3 to 5). Anthocyanins are produced from phenylalanine in the primary metabolic system as a raw material through a phenylpropanoid synthesis system and a subsequent flavonoid (anthocyanin) synthesis system. By elucidating this anthocyanin biosynthetic pathway, a new flower variety having a new flower color has been cultivated by using a conventional crossbreeding technique or a molecular biological technique such as introduction of a novel gene (Non-Patent Document 6). .
[0004]
Pigments exhibiting yellow or orange flower color are classified into three groups: carotenoids, betaxanthin, and yellow flavonoid pigments centered on chalcones and aurons. However, except for the yellow flavonoid pigment, the biosynthetic pathway is still largely unknown, and genetic and chemical synthesis information has not yet been obtained. On the other hand, the yellow flavonoid pigment is known as an intermediate metabolite in an anthocyanin biosynthetic pathway. Particularly, chalcone has a strong yellow color and shows orange when coexisting with anthocyanin (Non-Patent Document 7). Promising use for breeding of various yellow or orange flower varieties is promising (Non-Patent Document 8). In petunia, yellow flowers are produced by changing flavonoid biosynthesis from chalcone to 6′-desoxychalcone using chalcone reductase (Non-Patent Document 9). However, there has been no known case of successfully producing a yellow variety or an orange variety by a molecular biological technique using chalcone.
[0005]
The carnation (Dianthus caryophyllus) belongs to the genus Nadesico, which belongs to the genus Coleoptera, in terms of botany. Although the variety of carnations having yellow flowers is limited in carnations, the vacuoles of petals of carnations having yellow flowers have chalconanaringenin 2′- as a major yellow flavonoid pigment. O-glucoside; hereinafter referred to as Ch 2′G) (Non-Patent Document 10). Chalcone (4,2 ′, 4 ′, 6′-tetrahydroxychalcone; hereinafter referred to as chalcone) is synthesized by p-coumaroyl-CoA, an intermediate product of the anthocyanin biosynthetic pathway, and CHS (chalcon synthase) using malonyl-CoA as a substrate. After that, chalcone 2′-O-glucosyltransferase (Chalcon 2′-O-glucosyltransferase) which is a glycosyltransferase (hereinafter referred to as GT) (hereinafter referred to as GT) is used to form chalcone 2 ′. It is considered that glycosylation at the 'position results in Ch2'G, which is transported and accumulated in vacuoles (Non-Patent Documents 11 and 12). However, the existence of Ch2'GT has not been confirmed yet.
[0006]
There are few types of yellow carnations. In carnation, in the anthocyanin biosynthesis pathway, chalcone is affected by the CHI (chalconone isomerase) gene or the DFR (dihydroflavonol 4-reductase) gene, and the pathway in which anthocyanin is finally generated is determined. Probably because it is the main route. Therefore, in order for the carnation flower to have a yellow color, gene disruption must occur due to the insertion of a transposon (dTdic1) into the CHI gene and the DFR gene, and this also results in excessive surplus intermediate product, chalcone. Is required to be glycosylated by Ch 2′GT (Non-Patent Document 8). One of the reasons that glycosylation is necessary is "detoxification". Chalcone is originally an oil-soluble substance, and if it is not glycosylated, it is harmful to plant growth and flower formation. In other words, it is considered that a flower in which there is no glycosidating enzyme in the chalcone does not exhibit yellow or no flower is formed. From this, it is considered that if Ch 2′GT can be used, it is effective for producing a new variety having a yellow flower, but it has not been realized so far.
[0007]
In general, GT plays a major role in the flavonoid biosynthetic pathway. GT has a function of catalyzing a reaction in which a hydroxyl group of a substrate molecule is transferred to UDP-glucose (uridine-5'-diphosphoglucose). All anthocyanidins except the 3-deoxy form are glycosylated at the 3-hydroxyl position and more often glycosidate at the 5-hydroxyl position before becoming anthocyanins. Anthocyanin glucosyltransferase, which glycosylate anthocyanidin, is known to be present in many plant species (for example, Non-Patent Documents 13 to 15).
[0008]
Regarding the gene encoding GT, an enzyme that glycosylates a 3-hydroxyl group, the 3GT gene encoding 3GT was first isolated from maize (Zea mays) by transposon tagging called Ac (Non-Patent Document 16), Subsequently, isolation has also been performed from other plant species (for example, Non-Patent Documents 17 and 18). On the other hand, the anthocyanin 5GT gene was first isolated from perilla (Perilla flutescens) by the differential screening method (Non-Patent Document 19). In addition, a flavonoid glucosyltransferase gene that is glycosylated into kaempferol and quercetin, which are intermediate products of the flavonoid biosynthetic pathway, has also been isolated (Non-patent Document 20). The genome of Arabidopsis thaliana has been shown to contain approximately 110 distinct GT sequences, with only a few functionally characterized (21 and 22). This suggests that the functions of glycosidases are diverse. So far, no gene encoding Ch2'GT that glycosifies the 2'-position of chalcone, an intermediate product of the anthocyanin biosynthetic pathway, has been isolated.
[0009]
Prior art document information related to the invention of the present application is shown below.
[Non-Patent Document 1] Igarashi et al., Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi, 36 (10): 852, 1989.
[Non-Patent Document 2] Tamura et al. Agric. Food Chem. , 42: 1612, 1994.
[Non-Patent Document 3] Martin et al., Plant J, 1: 37-49, 1991.
[Non-Patent Document 4] van der Kroll et al., Plant Cell, 2: 291-299, 1990.
[Non-Patent Document 5] Holton et al., Plant J, 4: 1003-1010, 1993.
[Non-Patent Document 6] Forkmann and Martins, Curr Opin Biotechnol, 12 (2): 155-60, 2001
[Non-Patent Document 7] Kitagawa et al., Garden Science, 70, 2: 205, 2001
[Non-Patent Document 8] Itoh et al., Plant Cell Physiol, 43: 578-585, 2002.
[Non-Patent Document 9] Davis et al., Plant Journal 13 (2): 259-266 Jan. , 1998
[Non-Patent Document 10] Forkmann and Dangelmayr, Biochem Genet, 18 (5-6): 519-27, 1980
[Non-Patent Document 11] Gong Z et al., Plant MoI Biol, 35 (6): 915-27, 1997.
[Non-Patent Document 12] Nakayama M et al., Phytochemistry, 55 (8): 937-9, 2000.
[Non-Patent Document 13] Do et al., Plant Science, 112: 43-51, 1995
[Non-Patent Document 14] Ogata et al. Plant Res, 111: 213-216, 1998
[Non-Patent Document 15] Ogata et al. Plant Physiol, 158: 709-714, 2001.
[Non-Patent Document 16] Fedoroff et al., Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 49: 339-45, 1984.
[Non-Patent Document 17] Tanaka et al., Plant Cell Physiol, 37: 711-716, 1996.
[Non-Patent Document 18] Ford et al., J Biol Chem, 273: 9224-9233, 1998.
[Non-Patent Document 19] Yamazaki et al., J Biol. Chem, 274: 7405-7411, 1999.
[Non-Patent Document 20] Mato et al., Plant Cell Physiol, 39 (11): 1145-55, 1998.
[Non-Patent Document 21] Jackson et al., J Biol Chem, 276: 4350-4356, 2001.
[Non-Patent Document 22] Lim et al., J Biol Chem, 276: 4344-4349, 2001.
[0010]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made in view of such circumstances, and an object of the present invention is to provide a gene encoding Ch2'GT and a method of using the same, particularly a method of modifying the flower color of a plant.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors extracted total RNA from petals in flower buds of carnation “A66” for yellow flower and “8358-01” for orange flower, prepared mRNA, and synthesized cDNA. CDNA as a candidate for the Ch 2′GT gene was isolated by PCR screening using degenerate primers. After introducing the obtained PCR product into a vector, sequence analysis was performed. As a result, 26 types of cDNAs which seemed to encode GT were isolated from the homology of the genes. This full length was then isolated by 5 'and 3' RACE. These were cloned into a vector, introduced into Escherichia coli, cultured, and then disrupted with a homogenizer. This was centrifuged, and the supernatant was used as an enzyme solution for activity measurement. At that time, an intermediate metabolite of an anthocyanin biosynthetic pathway was used as a reaction substrate. About this enzyme solution, TLC analysis, HPLC and ¹⁴ Analysis with a liquid scintillator using CUDP-glucose was performed. As a result, it was found that there are two types of Ch 2 ′ GT that generate Ch 2 ′ G using chalcona naringenin as a substrate. Therefore, the flower of a plant can be modified by using the DNA encoding these Ch2'GTs.
[0012]
That is, the present invention provides the following [1] to [21].
[1] A DNA encoding a glucosyltransferase according to any one of the following (a) to (d):
(A) DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4.
(B) DNA containing the coding region of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3.
(C) DNA encoding a protein having an amino acid sequence in which one or more amino acids have been substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4.
(D) a DNA which hybridizes with a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3 under stringent conditions.
[2] the DNA of [1], wherein the glucosyltransferase is chalcone 2'-O-glucosyltransferase;
[3] the DNA of [1] or [2], which is derived from carnation;
[4] The DNA according to any one of [1] to [3], which is used for producing chalcone 2'-O-glucoside in a plant.
[5] The DNA according to any one of [1] to [3], which is used for modifying a flower color of a plant.
[6] the DNA of any one of [1] to [3], which is used for changing the flower color of a plant from yellow to orange;
[7] A protein encoded from the DNA of any one of [1] to [3]. [8] A vector containing the DNA of any one of [1] to [3].
[9] A transformed plant cell that carries the DNA of any one of [1] to [3] or the vector of [8].
[10] A transformed plant comprising the transformed plant cell according to [9].
[11] The transformed plant of [10], wherein the flower color has been modified.
[12] The transformed plant of [10], wherein the flower color has been changed from yellow to orange.
[13] A transformed plant, which is a progeny or a clone of the transformed plant according to any of [10] to [12].
[14] A propagation material for the transformed plant according to any of [10] to [13].
[15] A cut flower of the transformed plant according to any of [10] to [13].
[16] The method for producing a transformed plant according to any one of [10] to [12], wherein the DNA according to any one of [1] to [3] or the vector according to [8] is used. A method comprising the step of introducing into a plant cell and regenerating a plant from the plant cell.
[17] the method of [16], wherein the transformed plant is a transformed plant whose flower color has been modified;
[18] the method of [16], wherein the transformed plant is a transformed plant whose flower color has been changed from yellow to orange;
[19] A method for modifying the flower color of a plant, comprising expressing the DNA according to any one of [1] to [3] in cells of the plant.
[20] A method for changing the flower color of a plant from yellow to orange, comprising expressing the DNA according to any one of [1] to [3] in cells of a plant.
[21] the method of any one of [16] to [20], wherein the plant is a carnation;
[0013]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The present inventors have isolated two new glucosyltransferases (designated DcGT2 (D) and DcGT3 (H)). The cDNA sequences of DcGT2 (D) and DcGT3 (H) isolated in the present invention are shown in SEQ ID NOs: 1 and 3, respectively, and the amino acid sequences of the proteins encoded by these DNAs are shown in SEQ ID NOs: 2 and 4, respectively.
[0014]
DcGT2 (D) and DcGT3 (H) isolated by the present inventors catalyze the conversion reaction of chalcone to Ch 2′G (FIG. 1). Furthermore, DcGT2 (D) converts cyanidin to cyanidin 3-O-glucoside and cyanidin 5-O-glucoside, and converts cyanidin 3-O-glucoside to cyanidin 3,5-O-glucoside. Catalyze the reaction.
[0015]
That is, DcGT2 (D) and DcGT3 (H) isolated by the present inventors have an activity as Ch 2′GT, and DcGT2 (D) is composed of cyanidin 3-O-glucosyltransferase and cyanidin 5-O It also has activity as a glucosyltransferase.
[0016]
The present invention provides a gene encoding these two glucosyltransferases and a method for using the same based on the above findings.
[0017]
In the present invention, glucosyltransferase refers to an enzyme that converts a compound having a chalcone, an anthocyanidin skeleton or an anthocyanin skeleton into a glycoside.
[0018]
By using the glucosyltransferase of the present invention, a 3-O-glucoside compound and a 5-O-glucoside compound of a compound having a Ch 2′G or an anthocyanidin skeleton can be synthesized. The compound synthesized using the glucosyltransferase of the present invention can be used as a coloring agent.
[0019]
In addition, Ch 2′G can be produced in plants by using the DNA encoding the glucosyltransferase of the present invention. Since Ch2'G is a pigment that causes the flower color of a plant to develop yellow, the flower color of the plant can be changed to yellow by using the DNA encoding the glucosyltransferase of the present invention. Ch 2′G causes the flower color of a plant to develop various colors in the presence of other pigments. For example, Ch 2′G causes the flower color of a plant to develop orange in the presence of anthocyanins. Therefore, the flower color of a plant can be modified by using the DNA encoding the glucosyltransferase of the present invention. The hue of the color after modification preferably includes a hue in the range of yellow to orange, more preferably yellow or orange, but is not limited thereto. Further, the lightness and chroma of the color after modification are not particularly limited.
[0020]
Examples of the DNA encoding the glucosyltransferase in the present invention include a DNA containing the coding region of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3, and a DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4. No.
[0021]
The present invention also includes a DNA encoding a protein functionally equivalent to the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4. Such a DNA sequence is at least 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, further preferably 90% or more, and more preferably at least 50% or more of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3. More preferably, it shows a homology of 95% or more, most preferably 98% or more.
Further, the amino acid sequence of the protein encoded by such a DNA is at least 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, as compared with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4. The homology is more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and most preferably 98% or more.
[0022]
The species of organism from which DNA encoding a protein functionally equivalent to the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4 is not particularly limited, but is preferably a plant. Examples of the plant include, but are not limited to, carnation, button, dahlia, aster, morning glory, wheat ragweed, cyclamen and the like.
[0023]
A protein (test protein) structurally similar to the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4 is a protein functionally equivalent to the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4. For example, whether or not the test protein catalyzes a conversion reaction from chalcone to Ch2'G, or the flower color of a plant into which DNA encoding the test protein has been modified (preferably) Is changed to yellow to orange, more preferably yellow or orange). Whether the test protein is a protein functionally equivalent to the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is determined by, for example, determining whether the test protein is from anthocyanidin to anthocyanin 3-O-glucoside and anthocyanin 5 It can be confirmed by examining whether or not to catalyze the conversion reaction to -O-glucoside.
[0024]
DNA encoding a protein functionally equivalent to the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4, for example, has one or more amino acids substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4, Includes variants, derivatives, alleles, variants and homologs encoding proteins consisting of deleted, added and / or inserted amino acid sequences. Such amino acid mutations can also occur in nature. The number of amino acids to be mutated varies depending on the position of the amino acid residue at which the amino acid is added, deleted or substituted, but is preferably within 120, more preferably 3 to 50, and still more preferably about 3 to 30. .
[0025]
In addition, the amino acid residue to be mutated is desirably mutated to another amino acid in which the properties of the amino acid side chain are conserved. For example, the properties of amino acid side chains include hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, W, Y, V) and hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), amino acids having aliphatic side chains (G, A, V, L, I, P), amino acids having hydroxyl group-containing side chains (S, T, Y), sulfur atom-containing side chains (C, M) having amino acids, amino acids (D, N, E, Q) having carboxylic acid and amide-containing side chains, amino separation (R, K, H) having base-containing side chains, and aromatic-containing side chains (H, F, Y, W) having the following (all brackets represent one letter of amino acids).
[0026]
It is already known that a protein having an amino acid sequence modified by deletion or addition of one or more amino acid residues to one amino acid sequence and / or substitution of another amino acid maintains its biological activity. (Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666, Zoller, MJ & Smith, M. Nucleic Acids Research, 1984- 1987). 6500, Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433, Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413, Bo. al., Science (1990) 247, 1306-1310).
[0027]
As a method well known to those skilled in the art for preparing a protein functionally equivalent to a certain protein, a method of introducing a mutation into a protein is known. For example, those skilled in the art will appreciate that site-specific mutagenesis (Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468). -500, Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W, and Fritz HJ (1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367, Kunkel, TA. Natl.Acad.Sci.USA 82, 488-492, Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85,2763-2766).
[0028]
Proteins in which a plurality of amino acid residues are added to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4 include fusion proteins containing these proteins. A fusion protein is a fusion of these proteins with other proteins and is included in the present invention. In order to prepare a fusion protein, for example, a DNA encoding a protein functionally equivalent to a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4 is matched with a DNA encoding another protein such that the frames match. It may be ligated, introduced into an expression vector, and expressed in a host.
[0029]
Other proteins to be fused with the protein of the present invention are not particularly limited. Other peptides to be fused with the protein of the present invention include, for example, FLAG (Hopp, TP et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210), and six His (histidine) ) Consisting of 6 × His, 10 × His, influenza agglutinin (HA), human c-myc fragment, VSV-GP fragment, p18 HIV fragment, T7-tag, HSV-tag, E-tag, SV40T Known peptides such as antigen fragments, lck tags, α-tubulin fragments, B-tags, and Protein C fragments can be used. Other proteins to be fused with the protein of the present invention include, for example, GST (glutathione-S-transferase), HA (influenza agglutinin), immunoglobulin constant region, β-galactosidase, MBP (maltose binding) Protein). A fusion protein can be prepared by fusing a commercially available DNA encoding the protein with a DNA encoding the protein of the present invention and expressing the fusion DNA prepared thereby.
[0030]
Other methods well known to those skilled in the art for preparing a DNA encoding a protein functionally equivalent to the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4 include hybridization techniques (Southern EM). : J. Mol. Biol. 98: 503, 1975) and polymerase chain reaction (PCR) technology (Saiki RK, et al: Science 230: 1350, 1985, Saiki RK, et al: Science 239: 487, 1988). Method. That is, the nucleotide sequence of the glucosyltransferase cDNA of the present invention (SEQ ID NO: 1 or 3) or a part thereof is used as a probe, and an oligonucleotide that specifically hybridizes to SEQ ID NO: 1 or 3 is used as a primer. The isolation of DNA having high homology to DNA encoding glucosyltransferase from carnations and other plants is routine for those skilled in the art. Thus, a DNA encoding a protein having a function equivalent to that of a glucosyltransferase that can be isolated by a hybridization technique or a PCR technique is also included in the DNA encoding the glucosyltransferase of the present invention.
[0031]
In order to isolate such DNA, a hybridization reaction is preferably performed under stringent conditions. In the hybridization reaction of the present invention, various degrees of stringent conditions can be used. The more stringent the conditions, the higher the complementarity required for duplex formation. Preferably, in the art as described in standard methods (Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Third Edition, Cold Spring Harbor, New York (2001)). Hybridization is performed under stringent conditions by well-known techniques.
[0032]
"Low stringency conditions" suitable for the purposes of the present invention are, for example, 5x SSC, 1% SDS, hybridization at 42 ° C, followed by 1x SSC, 1% SDS, washing at 42 ° C. The “moderately stringent conditions” include, for example, hybridization at 2 × SSC, 0.5% SDS at 55 ° C., and subsequent washing at 1 × SSC, 0.1% SDS at 55 ° C. “High stringency conditions” are, for example, hybridization at 1 × SSC, 0.1% SDS, 65 ° C., followed by washing at 0.1 × SSC, 0.1% SDS, 65 ° C. Under these conditions, it can be expected that DNA with higher homology can be obtained more efficiently as the temperature is increased. However, factors that affect the stringency of hybridization include a plurality of factors such as temperature, probe concentration, probe length, ionic strength, time, and salt concentration, and those skilled in the art should appropriately select these factors. Can achieve similar stringency. Here, “high homology” means at least 50% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, even more preferably 97% or more, most preferably the entire DNA sequence. Refers to 98% or more sequence identity.
[0033]
DNA encoding a protein functionally equivalent to the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4 is obtained by subjecting a plant or plant cell having the DNA of the present invention to mutation treatment, For example, it can be obtained by selecting a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4.
[0034]
Even if the nucleotide sequence is mutated, the mutation may not accompany the amino acid mutation in the protein (degenerate mutation). Such a degenerate mutant DNA also encodes the glucosyltransferase of the present invention. Included in DNA.
[0035]
The identity of an amino acid sequence or nucleotide sequence can be determined by an algorithm BLAST by Carlin and Arthur (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873, 1993). Can be determined using Programs called BLASTN and BLASTX based on the BLAST algorithm have been developed (Altschul SF, et al: J Mol. Biol. 215: 403, 1990). When a base sequence is analyzed using BLASTN, parameters are set to, for example, score = 100 and wordlength = 12. When analyzing an amino acid sequence using BLASTX, parameters are set to, for example, score = 50 and wordlength = 3. When using BLAST and Gapped BLAST programs, the default parameters of each program are used. Specific methods of these analysis methods are known (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
[0036]
The DNA of the present invention includes genomic DNA, cDNA and chemically synthesized DNA. Preparation of genomic DNA and cDNA can be performed by a person skilled in the art by conventional means. For genomic DNA, for example, genomic DNA is extracted from carnation, a genomic library (for example, a plasmid, phage, cosmid, BAC, PAC, or the like can be used as a vector) is prepared and developed, and the present invention is developed. Can be prepared by performing colony hybridization or plaque hybridization using a probe prepared based on DNA encoding glucosyltransferase (for example, SEQ ID NO: 1 or 3). Alternatively, it can be prepared by preparing a primer specific to the DNA encoding the glucosyltransferase of the present invention (for example, SEQ ID NO: 1 or 3) and performing PCR using the primer. For example, cDNA is synthesized based on mRNA extracted from carnation, and inserted into a vector such as λZAP to prepare a cDNA library, which is developed and subjected to colony hybridization or plaque as described above. It can be prepared by performing hybridization and by performing PCR.
[0037]
By using the DNA encoding the glucosyltransferase of the present invention, it is possible to modify the flower color of the plant (preferably to yellow to orange, more preferably to yellow or orange). For example, the DNA of the plant is modified by linking the DNA to a vector capable of expressing or inducing expression, introducing the DNA into a plant cell by the method described below, and regenerating the transformed plant cell obtained thereby. it can.
[0038]
Plants whose flower color can be modified by introducing the DNA of the present invention are not particularly limited, and include, for example, all plants having a flower that develops an anthocyanin pigment, such as carnation, petunia, rose, and morning glory.
[0039]
The present invention provides a method for producing a transformed plant, which comprises a step of introducing the DNA of the present invention into a plant cell and regenerating the plant from the plant cell.
[0040]
In the present invention, the vector used for the transformation of a plant cell is not particularly limited as long as it can express the inserted gene in the cell, and is a vector capable of overexpressing the inserted gene. Preferably, there is. For example, use of a vector having a promoter for constantly expressing a gene in a plant cell (for example, the cauliflower mosaic virus 35S promoter) or a vector having a promoter that is inducibly activated by an external stimulus You can also. For example, these modified vectors such as the binary vector pBI101 (Jefferson et al. 1987) can be used.
[0041]
The above-mentioned "plant cells" include various forms of plant cells, for example, suspension culture cells, protoplasts, leaf sections, calli, and the like.
[0042]
Various methods known to those skilled in the art, such as a polyethylene glycol method, an electroporation method (electroporation method), an Agrobacterium-mediated method, a particle gun method, and a microinjection method, are used for introducing a vector into a plant cell. be able to.
[0043]
Regeneration of a plant from the transformed plant cell can be performed by a method known to those skilled in the art depending on the type of the plant cell. For example, a technique for producing a transformed plant in a higher plant involves isolating protoplasts from a tissue, adjusting the culture density to an optimal level, and then inducing callus in an MS medium supplemented with a plant hormone to dedifferentiate the callus. Some techniques have already been established, such as a method for regenerating a plant, and are widely used in the technical field of the present invention. In the present invention, these methods can be suitably used.
[0044]
Once a transformed plant in which the DNA of the present invention has been introduced into the genome is obtained, progeny can be obtained from the plant by sexual or asexual reproduction. It is also possible to obtain a propagation material (for example, seeds, fruits, cuttings, tubers, tubers, roots, strains, calli, protoplasts, etc.) from the plant, its progeny or clones, and mass-produce the plant based on them. It is possible.
[0045]
Further, it is also possible to produce cut flowers from the transformed plant of the present invention, its progeny or clones. The present invention also provides such cut flowers. Cut flowers generally refer to flowers cut with branches and stems, but cut flowers in the present invention also include flowers without branches and stems.
[0046]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
[1] Plant material
Among the carnations, "Symphony Rose" which gives deep pink flowers, "A66" which gives yellow flowers and "8358" which gives orange flowers, which are confirmed to contain Ch2'G by pigment analysis, -01 "was grown on a farm in Nagano Prefecture and separated into leaves, stems, roots and petals at four stages of development. Tissues were weighed, frozen in liquid nitrogen and stored at -80 C until use.
[0047]
[2] Cloning of GT
Total RNA was obtained from the second stage closed bud red petals (Yoshimoto et al., FIG. 5A, Plant Biotech, 17: 325-329, 2000) using a modified guanidinium thiocyanate-CsCl ultracentrifugation method. Prepared (Chirgwin et al., 1979). Poly (A) ⁺ RNA was prepared from total RNA using oligotex-dT30 <Super> (TaKaRa Biochemicals, Japan) as described in the supplier's manual. The first-strand cDNA was prepared from poly (A) prepared from the petals of the above varieties using First Strand cDNA Synthesis Kit (Takara). ⁺ It was synthesized by RNA and used as a template for PCR. Full-length cDNA is available from GeneRacer ^TM Prepared using Kit (Invitrogen, Netherlands). For PCR amplification using carnation cDNA as a template, degenerate primers designed based on various previously reported conserved amino acid sequences by GT were used. The sequence is shown below. Reverse primer, 5'-GTBRTWNTSAAYWSYTYTYKAKGARYTKGA-3 '(SEQ ID NO: 5) and 5'-AARSMMRRWTCMGTKKGTKTAYVTTNWGTTTYGGMA-3' (SEQ ID NO: 6), forward primer, 5'-TNGARTTCANCARTCANCARTCANCARTCANCARTCANCACRTCARTCANCACRTCARTCANCACRATCANCACRTCARTCANCACRTCARTCANCACRTCARTCANCACRATCANCACRATCANCACRTCANCARTACRTCANCARTCARGARTCANCACRATCARGARTCANCACRTCACRATCAGRATCCANCRATCACRATCACRTCACRTCACRTCANCRTCAGCRATCACRATCACRTCACRTCAGRATCANCRTCANCRTCARCARTCRRCRTCARTCRRCRTCRTCRTACRATCACRATC -RTGMKCMARRATYWSHANYTGGGGGWGCCCA-3 '(SEQ ID NO: 8).
[0048]
An LA-PCR mixture (10 μl) containing 1 μl of the cDNA mixture and 4 pmol of primer was prepared according to the supplier's recommendations. The mixture was incubated at 92 ° C. for 1 minute, after which 0.5 units of TaKaRa LA-Taq DNA polymerase were added. The PCR performed 40 amplification cycles (92 ° C. for 30 seconds; 55 ° C. for 45 seconds; 72 ° C. for 1 minute). The amplified fragment was cloned into pBluescript SK and sequenced using the Thermo Sequenase Cycle Sequencing Kit (usb) together with Aloka DNA Sequencer model 4000L. Specific GT forward and reverse primers were created based on the sequence data. The GT5 ′ upstream and 3 ′ downstream regions were isolated using the Genenation 5 ′ primer and the specific GT reverse primer, and the GeneRacer 3 ′ primer and the specific GT reverse primer using the carnation cDNA as a template for PCR. For DcGT2 (D), the 5 ′ upstream and 3 ′ downstream regions are primers 5′-ATCCTTGAGGCAACAGTCTTTCACCGT-3 ′ (SEQ ID NO: 9) and primers 5′-TCGGAAGTACAGCACACTATGCACCCGCT-3 ′ (SEQ ID NO: 10), DcGT3 (H) For the 5 ′ upstream and 3 ′ downstream regions, the primers 5′-ATTAGCCAGTCCCCAGGCAATTCCGACA-3 ′ (SEQ ID NO: 11) and the primers 5′-AGCACTCGGGCATCCTCAACCCACAAGCATA-3 ′ (SEQ ID NO: 12) were used, respectively. The amplified fragment was cloned in the same manner as described above. The full-length carnation GT cDNA was subjected to PCR using primers constructed based on the sequence data and using the carnation cDNA as a template, and the amplified fragment was cloned in the same manner as described above.
[0049]
[3] Northern blot analysis
Total RNA (10 μg) from petals, roots, stems, leaves of stages 1, 2, 3 and 4 was blotted onto Nytran supercharger filters (Schleicher & Schuell) and α ³² The search was performed using a PdCTP-labeled GT fragment. Blots were washed under stringent conditions and exposed at -80 C using X-ray film (Kodak).
[0050]
[4] rGT expression and enzyme assay
The GT full-length cDNA was expressed in E. coli DH5α using the pBluescript SK vector. The cDNA insert is regulated under an inducible T7 promoter in the plasmid. The transformant expressing the rGT protein was cultured in a medium of 2YT + Amp 5 ml. The collected cells were washed with 50 mM K-Pi buffer (pH 7.0) and centrifuged (10,000 × g, 30 seconds). The pellet was added with 50 mM K-Pi buffer (pH 7.0) and 14 mM 2-ME, and sonicated (TOMY ULTRASONIC DISRUPTOR UD-201). After centrifugation (12,000 × g, 20 minutes, 4 ° C.), a crude enzyme extract was obtained. Protein concentration was determined by the method of Bradford (1976) using bovine serum albumin as a reference protein. Transformed pBrushscript SK without insert was used as a control enzyme.
[0051]
[5] Determination of flavonoid GT activity
The standard reaction mixture (50 μl total volume) for the assay of rGT consists of 25 nmol and 25 nmol flavonoids or betanidine and 25 nmol UDP-glucose (UDP-glucose) (925 Bq UDP-D- [) in 20 μl enzyme solution, 50 mM K-pi, pH 7.5. U- ¹⁴ C] glucose). The mixture was incubated at 30 ° C. for 15 minutes. CH ₃ Cl / CH ₃ The reaction was terminated by adding 50 μl of a stop solution consisting of OH, 2: 1 (V / V; plus 5% HCOOH), and the mixture was then centrifuged at 3,000 × g for 3 minutes. 20 μl of the supernatant was applied to a thin-layer chromatography plate, and a standard anthocyanin was added in the same place to give AAH-II (HOAc: HCl: H ₂ O, 15: 3: 82). The radioactivity of the chromatogram was scanned by a bioimage analyzer (BAS 1500, Fuji Photofilm). The reaction mixture of flavonoid compounds excluding anthocyanin and betalain as substrates was stopped by adding 20 μl of 10% HCOOH, and the reaction product was extracted with 200 μl of ethyl acetate. A 100 μl aliquot of the organic phase was transferred to a scintillation vial and the radioactivity was measured in a toluene-based scintillation fluid. Chalcone was synthesized from Naringenin according to the method of Moustafa and Wong (1967) (Moustafa and Wong, phytochem, 6: 625-632, 1967).
[0052]
[6] Identification of reaction product of carnation rGT
The reaction products in the supernatant of the reaction mixture terminated by the stop solution were AAH-II and n-BuOH-HOAc-H ₂ O (4: 1: 2, v / v) solvent system was identified by comparison with the Rf value of a standard flavonoid in thin layer chromatography (TLC) (Avicel SF. Funakoshi, Japan). Furthermore, the sample was identified by HPLC (Beckman System Gold) equipped with a reversed-phase column (4.6 mm id x 250 mm, Wakosil-II, 5C18 AR) in comparison with the retention time of the standard flavonoid. [Analysis conditions Mobile phase A solution: 1.5% H ₃ PO ₄ , Mobile phase B liquid: 80% MeOH, gradient elution of liquid B 20 → 80 for 20 minutes at a moving flow rate (1 ml / min), detection wavelength: 520, 360 or 280 nm].
[0053]
[Example 1]
We have cloned several full-length carnation GT cDNAs (Table 1).
[0054]
[Table 1]

[0055]
To determine the enzyme activity and substrate specificity of the recombinant protein produced by expressing these carnation GTs in E. coli, various flavonoids were used, TLC analysis, HPLC and ¹⁴ Analysis with a liquid scintillator using CUDP-glucose was performed.
[0056]
As shown in FIGS. 2 and 3, TLC analysis was performed on the produced recombinant proteins DcGT3 (H) and DcGT2 (D). As a result, in DcGT3 (H) ¹⁴ Chalcone and naringenin labeled with C were detected (FIG. 2A). On the other hand, in DcGT2 (D) ¹⁴ Chalcone glycoside labeled C was detected (FIG. 2B). In DcGT2 (D), when quercetin was used as a substrate, several spots were confirmed, and one of them was found to be quercetin 3-O-glucoside. When naringenin was used as a substrate, it was found that glycosylation was performed in the same manner as DcGT3 (H).
[0057]
The reaction was carried out with DcGT3 (H) and DcGT2 (D) using chalcone as a substrate, and analyzed by HPLC. As a result, for the product produced by DcGT2 (D), several spectra were confirmed, and the absorption wavelength was the same or similar to that of chalcone, indicating that it was a chalcone glycoside. . In addition, the retention times of this chalcone glycoside and the standard dye of Ch 2′G completely matched. This revealed that this chalcone glycoside was glycosylated at the 2 ′ position. On the other hand, a similar spectrum was observed in DcGT3 (H), and a small amount of Ch 2′G spectrum was observed at the same retention time as the standard dye.
[0058]
From these results, it was found that DcGT2 (D) and DcGT3 (H) are enzymes Ch 2′GT that use Chalcononaringenin as a substrate and generate Ch 2′G. This indicates that there are two types of cDNAs encoding Ch2'GT. The amino acid sequence of DcGT2 (D) showed 60% identity to Droteanthus betanidine 5GT (Vogt et al., Plant J, 19: 509-519, 1999).
[0059]
Anthocyanin glycosylase is generally said to have a wide substrate specificity. However, when DcGT2 (D) is reacted with cyanidin as a substrate, cyanidin 3-O-glucoside and cyanidin 5-O-glucoside are reacted. Both generated. In contrast, DcGT3 (H) did not glycosylate cyanidin. As a result, DcGT2 (D) glycosides intermediate metabolites of various anthocyanin biosynthetic pathways such as flavonols such as cyanidin, cyanidin 3-O-glucoside, and quercetin, whereas DcGT3 (H) chalconalingenin Was specifically glycosylated. No remarkable homology was found between these two types of cDNAs, and it was also found that the optimum pH and the optimum temperature of the enzyme were different (data not shown).
[0060]
From the fact that DcGT2 (D) and DcGT3 (H) cDNAs could be isolated, it was clear that they were expressed in plants, but could not be confirmed at the Northern level. This suggests that these enzymatic activities are very high and that the flower color of the plant can be modified with very little expression.
[0061]
The above results indicate that the introduction of DcGT2 (D) or DcGT3 (H) gene by genetic technology makes it possible to create a flower whose flower color is changed from yellow to orange, for example. .
[0062]
【The invention's effect】
According to the present invention, Ch 2′G, anthocyanidin 3-O-glucoside, anthocyanidin 5-O-glucoside, and the like can be produced. In addition, the flower color of a plant can be modified by using the DNA of the present invention. Consumer needs for flowers are expanding and diversifying year by year, and due to the effects of the recent gardening boom and the like, the popularity of easy and inexpensive cut flowers for home use is shifting. This need can be met by producing a plant having a novel flower color using the DNA of the present invention.
[0063]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows glucosyl transfer catalyzed by Nadesico Ch 2 ′ GT by carnation.
FIG. 2 is a photograph showing a scanning pattern of radioactivity on TLC of chalcone glucoside and naringenin glucoside as reaction products of Nadesico Ch2′GT in a reaction mixture.
FIG. 3 is a photograph showing a scanning pattern of radioactivity on TLC of Ch 2′G as a reaction product of Nadesico Ch 2 ′ GT in a reaction mixture.

Claims

A DNA encoding the glucosyltransferase according to any one of the following (a) to (d):
(A) DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4.
(B) DNA containing the coding region of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3.
(C) DNA encoding a protein having an amino acid sequence in which one or more amino acids have been substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4.
(D) a DNA which hybridizes with a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3 under stringent conditions.

The DNA according to claim 1, wherein the glucosyltransferase is chalcone 2'-O-glucosyltransferase.

The DNA according to claim 1 or 2, which is derived from carnation.

The DNA according to any one of claims 1 to 3, which is used for producing chalcone 2'-O-glucoside in a plant.

The DNA according to any one of claims 1 to 3, which is used for modifying a flower color of a plant.

The DNA according to any one of claims 1 to 3, which is used for changing the flower color of a plant from yellow to orange.

A protein encoded from the DNA according to claim 1.

A vector comprising the DNA according to claim 1.

A transformed plant cell that carries the DNA according to any one of claims 1 to 3 or the vector according to claim 8.

A transformed plant comprising the transformed plant cell according to claim 9.

The transformed plant according to claim 10, wherein the flower color has been modified.

The transformed plant according to claim 10, wherein the flower color has been changed from yellow to orange.

A transformed plant, which is a progeny or a clone of the transformed plant according to any one of claims 10 to 12.

A propagation material for the transformed plant according to any one of claims 10 to 13.

A cut flower of the transformed plant according to any one of claims 10 to 13.

A method for producing a transformed plant according to any one of claims 10 to 12, wherein the DNA according to any one of claims 1 to 3 or the vector according to claim 8 is introduced into a plant cell. A method comprising a step of regenerating a plant from a plant cell.

17. The method according to claim 16, wherein the transformed plant is a transformed plant having a modified flower color.

The method according to claim 16, wherein the transformed plant is a transformed plant whose flower color has been changed from yellow to orange.

A method for modifying the flower color of a plant, comprising expressing the DNA according to claim 1 in cells of a plant.

A method for changing the flower color of a plant from yellow to orange, comprising expressing the DNA according to any one of claims 1 to 3 in a cell of the plant.

The method according to any one of claims 16 to 20, wherein the plant is a carnation.