【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸を分離精製する方法、核酸の分離精製装置、及びこれらを用いた核酸の分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
核酸は、様々な分野で種々の形態で使用されている。例えば、組換え核酸技術の領域においては、核酸をプローブ、ゲノム核酸、およびプラスミド核酸の形状で用いることを要求する。
【０００３】
診断分野においても、核酸は種々の方法で用いられている。例えば、核酸プローブは、ヒトの病原体の検出および診断に日常的に用いられている。同様に核酸は遺伝障害の検出に用いられている。核酸はまた食品汚染物質の検出にも用いられている。さらに、核酸は遺伝地図の作製からクローニングおよび組換え発現におよぶ種々の理由により、興味ある核酸の位置確認、同定および単離において日常的に用いられている。
【０００４】
多くの場合、核酸は極めて少量でしか入手できず、そして単離および精製操作が煩雑で時間を要する。このしばしば時間を消費する煩雑な操作は核酸の損失に結びつきやすい。血清、尿およびバクテリアのカルチャーから得られた試料の核酸の精製においては、コンタミネーションおよび疑陽性の結果が生じるという危険性も加わる。
【０００５】
広く知られた精製方法の一つに、核酸を二酸化珪素、シリカポリマー、珪酸マグネシウム等の表面に吸着させ、引き続く洗浄、脱着等の操作によって精製する方法がある（例えば、特公平７−５１０６５号公報）。この方法は、分離性能としては優れているが、同一性能の吸着媒体の工業的大量生産が困難であり、かつ取扱いが不便で、種々の形状に加工しがたい等の問題点がある。
【０００６】
また、核酸の吸着媒体としてガラスフィルターを用いる核酸の精製方法が知られている。しかしながら、ガラスフィルターを用いる核酸の精製方法では、差圧で核酸の抽出を行うと、ガラスフィルターの空隙が大きくかつ厚いため、ガラスフィルター全体に均一に圧力がかからず、その結果、ガラスフィルター内に液残りが発生するという問題があった。従って、ガラスフィルターを用いる核酸の精製方法においては、装置全体を遠心分離操作にかける必要があった。
【０００７】
【特許文献１】
特公平７−５１０６５号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、ガラスフィルターを用いる核酸の精製方法において、ガラスフィルター全体に均一に圧力をかけて、ガラスフィルター内に液残りが発生することを防止する手段を提供することを解決すべき課題とした。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、核酸を吸着及び脱着させるためのガラスフィルターの下に多孔膜を設けることによって二層構造を形成し、この二層構造を用いて核酸の分離精製を行うことにより、上記課題を解決できることを見出した。本発明はこの知見に基づいて完成したものである。
【００１０】
即ち、本発明によれば、核酸を吸着及び脱着させるためのガラスフィルターの下に多孔膜を設けることにより形成されたガラスフィルターと多孔膜とから構成される二層構造を用いて、該ガラスフィルターに核酸を吸着及び脱着させる工程を含む、核酸の分離精製方法が提供される。
好ましくは、多孔膜は有機高分子多孔膜である。
【００１１】
好ましくは、多孔膜は、核酸を吸着しない多孔膜である。
好ましくは、多孔膜は、ナイロン又はポリスルホンの多孔膜である。
好ましくは、多孔膜のポアサイズは０．１〜１０μｍである。
【００１２】
好ましくは、試料溶液中の核酸を吸着及び脱着させる。
好ましくは、試料溶液は、細胞又はウイルスを含む検体を核酸可溶化試薬で処理して得られた溶液に水溶性有機溶媒を添加した溶液である。
好ましくは、核酸可溶化試薬は、グアニジン塩、界面活性剤およびタンパク質分解酵素である。
【００１３】
好ましくは、ガラスフィルターに核酸を吸着させた後、核酸洗浄バッファを用いてガラスフィルターを洗浄し、次いでガラスフィルターに吸着した核酸を脱着せしめうる液を用いてガラスフィルターに吸着した核酸を脱着させる工程を含む核酸の分離精製方法が提供される。
【００１４】
好ましくは、核酸洗浄バッファは、メタノール、エタノール、イソプロパノール又はｎ−プロパノールを２０〜１００重量％含む溶液である。
好ましくは、ガラスフィルターに吸着した核酸を脱着せしめうる液は、塩濃度が０．５Ｍ以下の溶液である。
【００１５】
好ましくは、少なくとも２個の開口を有する容器内に、核酸を吸着及び脱着させるためのガラスフィルターの下に多孔膜を設けることにより形成されたガラスフィルターと多孔膜とから構成される二層構造が収容されている核酸の分離精製装置を用いて、核酸の吸着及び脱着を行う。
【００１６】
好ましくは、（ａ） 核酸を吸着及び脱着させるためのガラスフィルターの下に多孔膜を設けることにより形成されたガラスフィルターと多孔膜とから構成される二層構造、（ｂ） 前記二層構造を収容する、少なくとも２個の開口を有する容器、及び（ｃ） 前記容器の一の開口に結合された圧力差発生装置を含む核酸の分離精製装置を用いて核酸の吸着及び脱着を行う。
【００１７】
本発明の別の側面によれば、少なくとも２個の開口を有する容器内に、核酸を吸着及び脱着させるためのガラスフィルターの下に多孔膜を設けることにより形成されたガラスフィルターと多孔膜とから構成される二層構造が収容されている、核酸の分離精製装置が提供される。
【００１８】
好ましくは、（ａ） 核酸を吸着及び脱着させるためのガラスフィルターの下に多孔膜を設けることにより形成されたガラスフィルターと多孔膜とから構成される二層構造、
（ｂ） 前記二層構造を収容する、少なくとも２個の開口を有する容器、及び
（ｃ） 前記容器の一の開口に結合された、圧力差発生装置、
を含む核酸の分離精製装置が提供される。
【００１９】
好ましくは、前記圧力差発生装置は、前記容器の一の開口に着脱可能に結合されている。
好ましくは、前記圧力差発生装置は注射器、ピペッタ又はポンプである。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
（１）本発明の核酸の分離精製方法
本発明の核酸の分離精製方法は、核酸を吸着及び脱着させるためのガラスフィルターの下に多孔膜（好ましくは、有機高分子多孔膜）を設けることにより形成されたガラスフィルターと多孔膜とから構成される二層構造を用いて、該ガラスフィルターに核酸を吸着及び脱着させる工程を含む方法である。
【００２１】
本発明においては、ガラスフィルターの下に多孔膜を設けることにより、フィルター全体に均一に圧力がかかるようになり、その結果、遠心分離を行うことなく差圧のみで再現性よく核酸の分離精製を行うことが可能になった。
本発明において「核酸」は一本鎖、二本鎖のいずれでもよく、また、分子量の制限も無い。
【００２２】
核酸を吸着及び脱着させるためのガラスフィルターとしては、ガラス繊維フィルターを使用することができる。具体的には、ワットマン社製ＧＦ／Ｂ、ＧＦ／Ｃ、ＧＦ／Ｄ及びＧＦ／Ｆ、アドバンテック社製ＧＡ−１００、ＧＡ−２００、ＧＣ−５０、ＧＦ−７５、ＧＢ−１４０、ＱＲ−１００等が挙げられる。また、ガラス繊維フィルターは、複数枚を積層して用いることもできる。ガラス繊維フィルターの厚さは特に限定されないが一般的には０．１〜１０ｍｍ程度、好ましくは０．５〜８ｍｍ程度である。
【００２３】
多孔膜は、好ましくは有機高分子多孔膜であり、さらに好ましくは、親水化処理していない多孔膜であり、核酸を吸着しない膜である。
多孔膜の具体例としては、ナイロン又はポリスルホンの多孔膜を使用することができる。
多孔膜のポアサイズは特に限定されないが、好ましくは０．１〜１０μｍである。
【００２４】
本発明では、核酸を吸着及び脱着させるためのガラスフィルターの下に多孔膜を設けることにより、ガラスフィルター内に圧力が均一にかかるようになり、これにより、液を加圧してガラスフィルターを通して容器の外に排出する際に、ガラスフィルター内に液残りが発生することを防止することができる。
【００２５】
本発明の核酸の分離精製方法では、好ましくは、少なくとも２個の開口を有する容器内に、核酸を吸着及び脱着させるためのガラスフィルターの下に多孔膜を設けることにより形成されたガラスフィルターと多孔膜とから構成される二層構造を収容した核酸の分離精製装置を用いて核酸の吸着及び脱着を行うことができる。
【００２６】
さらに好ましくは、（ａ） 核酸を吸着及び脱着させるためのガラスフィルターの下に多孔膜を設けることにより形成されたガラスフィルターと多孔膜とから構成される二層構造、（ｂ） 前記二層構造を収容する、少なくとも２個の開口を有する容器、及び（ｃ） 前記容器の一の開口に結合された圧力差発生装置を含む核酸の分離精製装置を用いて核酸の吸着及び脱着を行うことができる。
【００２７】
本発明の核酸の分離精製方法は、例えば、以下の工程を含むことができる。
（ａ） 検体を用いて核酸を含む試料溶液を調製し、核酸の分離精製装置の一の開口に上記の核酸を含む試料溶液を注入する工程、
（ｂ） 核酸の分離精製装置の上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、注入した核酸を含む試料溶液を、他の開口より排出することによって、ガラスフィルターに接触させる工程、
（ｃ） 核酸の分離精製装置の上記一の開口に核酸洗浄バッファを注入する工程、
（ｄ） 核酸の分離精製装置の上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、注入した核酸洗浄バッファを上記他の開口より排出することによって、ガラスフィルターに接触させる工程、
（ｅ） 核酸の分離精製装置の上記一の開口に、ガラスフィルターに吸着された核酸を脱着せしめうる液を注入する工程、
（ｆ） 核酸の分離精製装置の上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、注入した核酸を脱着せしめうる液を上記他の開口より排出させることによって、ガラスフィルターに吸着された核酸を脱着させ、容器外に排出する工程。
【００２８】
本発明による核酸の分離精製方法についてさらに具体的に説明する。本発明では、好ましくは、核酸を含む試料溶液を、核酸を吸着及び脱着させるためのガラスフィルターの下に多孔膜を設けることにより形成されたガラスフィルターと多孔膜とから構成される二層構造に接触させることにより試料溶液中の核酸をガラスフィルターに吸着させ、次いで、ガラスフィルターに吸着させた核酸を、以下に説明する好適な溶液を用いてガラスフィルターから脱着させる。さらに好ましくは、核酸を含む試料溶液は、細胞又はウイルスを含む検体を細胞膜及び核膜を溶解する溶液で処理することにより核酸を液中に分散させた溶液に水溶性有機溶媒を添加した溶液である。
【００２９】
本発明において使用できる核酸を含む試料溶液に制限はないが、例えば診断分野においては、検体として採取された全血、血漿、血清、尿、便、精液、唾液等の体液、あるいは植物（又はその一部）、動物（またはその一部）など、あるいはそれらの溶解物およびホモジネートなどの生物材料から調製された溶液が対象となる。
【００３０】
最初にこれらの検体を、細胞膜を溶解して核酸を可溶化する試薬を含む水溶液で処理する。これにより細胞膜および核膜が溶解されて、核酸が水溶液内に分散する。
細胞膜の溶解および核酸の可溶化のためには、例えば、対象となる試料が全血の場合、▲１▼赤血球の除去、▲２▼各種タンパク質の除去、及び▲３▼白血球の溶解及び核膜の溶解が必要となる。▲１▼赤血球の除去および▲２▼各種タンパク質の除去は、ガラスフィルターへの非特異吸着および多孔膜の目目詰まりを防ぐために、▲３▼白血球の溶解及び核膜の溶解は、抽出の対象である核酸を可溶化させるためにそれぞれ必要となる。特に、▲３▼白血球の溶解及び核膜の溶解は重要な工程であり、本発明の方法では、この工程で核酸を可溶化することが必要である。本明細書中以下に記載の実施例では、塩酸グアニジン、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、プロテアーゼＫ（ＳＩＧＭＡ製）を添加した状態で６０℃で１０分インキュベートすることによって上記の▲１▼、▲２▼及び▲３▼を同時に達成している。
【００３１】
本発明で用いる核酸可溶化試薬としては、グアニジン塩、界面活性剤およびタンパク質分解酵素を含む溶液が挙げられる。
グアニジン塩としては、塩酸グアニジンが好ましいが、他のグアニジン塩（イソチオシアン酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン）を使用することもできる。グアニジン塩の溶液中の濃度は、０．５Ｍ以上６Ｍ以下 好ましくは １Ｍ以上５Ｍ以下である。
【００３２】
界面活性剤としてはＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を使用することができるが、この他にも、ＳＤＳ、コール酸ナトリウム又はサルコシンナトリウム等の陰イオン性界面活性剤、Ｔｗｅｅｎ２０又はメガファック等のノニオン性界面活性剤、その他各種両性界面活性剤を使用することもできる。本発明では、ポリオキシエチレンオキチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）等のノニオン性界面活性剤を使用することが好ましい。界面活性剤の溶液中の濃度は、通常０．０５重量％〜１０重量％ 特に好ましくは０．１重量％〜５重量％である。
【００３３】
タンパク質分解酵素としては、プロテアーゼＫを使用することはできるが、他のプロテアーゼでも同様の効果を得ることができる。プロテアーゼは酵素であるため加温するのが好ましく、３７℃〜７０℃で使用することが好ましく、特に５０℃〜６５℃で使用することが好ましい。
【００３４】
このように核酸が分散した水溶液中に、水溶性有機溶媒を添加して、核酸を吸着及び脱着させるためのガラスフィルターの下に多孔膜を設けることにより形成されたガラスフィルターと多孔膜とから構成される二層構造と接触させる。この操作により、試料溶液中の核酸がガラスフィルターに吸着される。本明細書中上記した操作で可溶化された核酸を、ガラスフィルターに吸着させるためには、可溶化した核酸混合液に水溶性有機溶媒を混合することと、得られた核酸混合液中に塩が存在することが必要である。
【００３５】
即ち、核酸の周りに存在する水分子の水和構造を破壊することにより、核酸は不安定な状態で可溶化することになる。この状態の核酸を、ガラスフィルターと接触させると、核酸表面上の極性基とガラスフィルター面の極性基間で相互作用し、核酸はガラスフィルター上に吸着するものと考えられる。本発明の方法では、可溶化した核酸混合液に水溶性有機溶媒を混合することと、得られた核酸混合液中に塩が存在することによって、核酸を不安定な状態にさせることができる。
【００３６】
ここで用いる水溶性有機溶媒としては、エタノール、イソプロパノール又はプロパノールなどが挙げられ、中でもエタノールが好ましい。水溶性有機溶媒の濃度は、好ましくは５重量％〜９０重量％であり、さらに好ましくは２０重量％〜６０重量％である。エタノールの添加濃度は、擬集物を生じない程度でできるだけ高くすることが特に好ましい。
【００３７】
得られた核酸混合液中に存在する塩としては、各種カオトロピック物質（グアニジウム塩、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム）や塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化カルシウム、臭化アンモニウム等が好ましい。特にグアニジウム塩は、細胞膜の溶解および核酸の可溶化の効果を併有するので特に好ましい。
【００３８】
次いで、この核酸が吸着したガラスフィルターを、核酸洗浄バッファ溶液に接触させる。この溶液は核酸と一緒にガラスフィルターに吸着した試料溶液中の不純物を洗い流す機能を有する。従って、ガラスフィルターから核酸は脱着させないが不純物は脱着させる組成を有する必要がある。核酸洗浄バッファ溶液は主剤と緩衝剤、及び必要に応じて界面活性剤を含む水溶液からなる。主剤としてはメタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−イソプロパノール、ブタノール、アセトン等の約１０〜１００重量％（好ましくは約２０〜１００重量％、さらに好ましくは約４０〜８０重量％）の水溶液が、緩衝剤及び界面活性剤としては、既述の緩衝剤及び界面活性剤が挙げられる。これらの内では、エタノール、Ｔｒｉｓ及びＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む溶液が好ましい。Ｔｒｉｓ及びＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の好ましい濃度は、それぞれ１０〜１００ｍＭ、及び０．１〜１０重量％である。
【００３９】
次に、ガラスフィルターに吸着した核酸を脱着せしめうる溶液に、上記洗浄後のガラスフィルターを接触させる。この溶液には目的とする核酸が含まれているので、これを回収し、後に続く操作、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）による核酸の増幅に提供する。核酸を脱着せしめうる溶液としては、塩濃度が低いことが好ましく、特に好ましくは０．５Ｍ以下の塩濃度の溶液を使用する。この溶液としては、精製蒸留水、ＴＥバッファ等が使用できる。
【００４０】
（２）本発明の核酸の分離精製装置
本発明の核酸の分離精製装置は、少なくとも２個の開口を有する装置であって、核酸を吸着及び脱着させるためのガラスフィルターの下に多孔膜を設けることにより形成されたガラスフィルターと多孔膜とから構成される二層構造を収容した核酸の分離精製装置である。
【００４１】
容器の材料に特別な限定はなく、ガラスフィルターと多孔膜とから構成される二層構造が収容でき、かつ少なくとも２個の開口を設けることができればよいが、製造の容易性からプラスチックが好ましい。例えば、ポリスチレン、ポリメタアクリル酸エステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ナイロン、ポリカーボネート等の透明あるいは不透明の樹脂を用いるのが好ましい。
【００４２】
容器の概念図を図１に示す。基本的には、ガラスフィルターと多孔膜とから構成される二層構造（固相）の収容部を持ち、収容部に上記二層構造を収容でき、二層構造が試料液等の吸引及び排出時に収容部の外へは出ることがなく、開口に圧力差発生装置、例えば注射器を接合できればよい。このためには、容器が当初は二つの部分に分かれており、二層構造を収容した後で一体化できることが好ましい。また、二層構造が収容部から外へでることを避ける為には、二層構造の上下にＤＮＡを汚染しない材料で作成されたメッシュを置くことができる。
【００４３】
上記容器に収容される、ガラスフィルターと多孔膜とから構成される二層構造の形状にも特別な限定は無く、円形、正方形、長方形、楕円などの任意の形状で良い。
【００４４】
本発明の核酸の分離精製装置は、（ａ）核酸を吸着及び脱着させるためのガラスフィルターの下に多孔膜を設けることにより形成されたガラスフィルターと多孔膜とから構成される二層構造、（ｂ） 前記二層構造を収容する、少なくとも２個の開口を有する容器、及び（ｃ） 前記容器の一の開口に結合された圧力差発生装置、を含むものであることが好ましい。以下、この核酸の分離精製装置について説明する。
【００４５】
容器は、通常、ガラスフィルターと多孔膜とから構成される二層構造を収容する本体と、蓋体に分けた態様で作製され、いずれにも少なくとも１個の開口が設けられている。一方は核酸を含有する試料溶液、核酸洗浄バッファ溶液及びガラスフィルターに吸着された核酸を脱着せしめうる液（以下、「試料溶液等」と記す。）の入口及び出口として使用され、他方は容器内を減圧又は加圧状態にせしめうる圧力差発生装置に接続される。本体の形状に特に限定はないが、製造が容易で、試料溶液等が二層構造の全面に拡散し易くするには、断面を円形にすることが好ましい。断面を四角形にすることも、ガラスフィルターや多孔膜の裁断屑を発生させないために好ましい。
【００４６】
上記蓋は、圧力差発生装置によって容器内部を減圧及び加圧状態にできるように本体に接合されている必要があるが、この状態が達成できれば、接合方法は任意に選択できる。例えば、接着剤の使用、ねじ込み、はめ込み、ネジ止め、超音波加熱による融着等が挙げられる。
【００４７】
容器の内容積は処理すべき試料溶液の量のみによって決められるが、通常、収容される二層構造の体積で表す。即ち、厚さが約１ｍｍ以下（例えば、５０〜５００μｍ程度）で、直径が約２ｍｍ〜２０ｍｍのガラスフィルターおよび多孔膜を２枚〜６枚程度収容する大きさとすることが好ましい。
二層構造の端面は、試料溶液等が通過しない程度に、容器の内壁面に密着させることが好ましい。
【００４８】
試料溶液等の入り口に使用される開口に対向する二層構造の下は、容器の内壁に密着させずに空間を設け、試料溶液等が二層構造の全面にできるだけ均等に拡散する構造にする。
【００４９】
他の一の開口、即ち圧力差発生装置に結合される開口に対向する二層構造の上には、ほぼ中央に穴を穿った部材を設けることが好ましい。この部材は、二層構造を押さえると共に、試料溶液等を効率よく排出する効果を有するものであり、液が中央の穴に集まる様に、漏斗状あるいはお椀状等の斜面を有する形状にすることが好ましい。この穴の大きさ、斜面の角度、部材の厚さは、処理する試料溶液等の量や二層構造を収容する容器の大きさ等を考慮して、当業者が適宜定めることができる。この部材と当該開口の間には、オーバーフローした試料溶液等を溜めて、圧力差発生装置内に吸引されることを防ぐための空間を設けることが好ましい。この空間の大きさも当業者が適宜選択することができる。なお、核酸を効率良く集めるためには、二層構造の全体が浸る以上の量の核酸を含む試料溶液を吸引することが好ましい。
【００５０】
また、吸引している開口の真下の部分にのみ試料溶液等が集中することを防いで、試料溶液等が二層構造内を比較的均一に通過できるようにするため、二層構造とこの部材の間にも空間を設けることが好ましい。このためには、当該部材から二層構造に向けて複数の突起物を設けることが好ましい。突起物の大きさや数は当業者が適宜選択することができるが、空間を保持しながら二層構造の開口面積をできる限り大きく保つことが好ましい。
【００５１】
なお、容器に３以上の開口を設けた場合には、減圧及び加圧操作に伴う液の吸引及び排出を可能にすべく、余分の開口を一時的に封鎖する必要があることはいうまでもない。
【００５２】
圧力差発生装置は、まず二層構造を収容した容器内を減圧にして核酸を含む試料溶液を吸引する。圧力差発生装置としては、注射器、ピペッタ、あるいはペリスタポンプのような吸引及び加圧が可能なポンプ等が挙げられる。これらの内、手動操作には注射器が、自動操作にはポンプが適している。また、ピペッタは片手操作が容易にできるという利点を有する。好ましくは、圧力差発生装置は、前記容器の一の開口に着脱可能に結合されている。
【００５３】
図２は、本発明の核酸の分離精製装置の一例の断面図である。但し圧力差発生装置は図示していない。二層構造を収容する容器１は、本体１０と蓋２０から成り、透明なポリスチレンで形成されている。本体１０は二層構造３０を収容している。また、試料溶液等を吸引する開口１０１を有する。開口から続いている底面１０２は漏斗状に形成され、二層構造３０との間に空間１２１が設けられている。二層構造３０を支えて空間１２１を保つために、底面１０２と一体となった枠１０３が設けられている。
【００５４】
本体は、内径が２０．１ｍｍ、深さが５．９ｍｍ、底面１０２から開口１０１までの長さは約７０ｍｍである。また、内蔵されている二層構造３０の直径は２０．０ｍｍ、一枚の厚さは約５０〜５００μｍであり、厚さの一例としては１００μｍである。
【００５５】
図２において、二層構造の上部には漏斗状の押さえ部材１３が設けられている。押さえ部材１３の中央には穴１３１があり、かつ下方に一群の突起１３２が設けられ、二層構造３０との間に空間１２２が設けられている。二層構造３０と本体１０の壁１０４の間から試料溶液等が漏れにくい様に、壁１０４の上部の直径は二層構造の直径より大きく作成され、段差１０５の上に押さえ部材１３の端が乗っている。
【００５６】
蓋２０は本体１０と超音波加熱により接合されている。蓋２０のほぼ中央部には、圧力差発生装置を結合する開口２１が設けられている。蓋２０と押さえ部材１３の間には、穴１３１から流出する試料溶液等を保持する空間１２３が設けられている。空間１２３の容積は約０．１ｍｌである。
【００５７】
（３）本発明の利用
本発明の方法により分離精製した核酸の利用法は特に限定されないが、例えば、以下の（１）〜（３）の工程を含む核酸の分析方法に利用することができる。
（１）上記した本発明の方法によりターゲット核酸断片を含む核酸断片を分離精製する工程；
（２）前記ターゲット核酸断片、前記ターゲット核酸断片の一部と相補的な少なくとも一種のプライマー、少なくとも一種のデオキシヌクレオシド３リン酸、及び少なくとも一種のポリメラーゼを反応させ、前記ターゲット核酸断片を鋳型にした前記プライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ伸長反応を行う工程；及び、
（３）ポリメラーゼ伸長反応の進行の有無を検出するか、又はポリメラーゼ伸長反応産物と他の核酸とのハイブリダイゼーションの有無を検出する工程：
を含むことを特徴とするものである。
【００５８】
好ましい態様によれば、ポリメラーゼ伸長反応に伴って生成するピロ燐酸を検出することによりポリメラーゼ伸長反応の進行の有無を検出する。
さらに好ましい態様は、ピロ燐酸の分析を比色法を用いて行う方法であり、より好ましくは、ピロ燐酸の検出を乾式分析素子を用いて行う方法である。本発明による核酸の分析方法では、ターゲット核酸断片の存在または存在量を検出したり、あるいはターゲット核酸断片の塩基配列を検出することができる。なお、ここで言う存在量の検出とは、ターゲット核酸断片の定量を含む概念である。ターゲット核酸断片の塩基配列の検出の具体例としては、ターゲット核酸断片の変異または多型の検出などが挙げられる。
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５９】
【実施例】
実施例１
（１）容器の作成
内径７ｍｍ、厚さ２ｍｍの核酸吸着用の二層構造を収容する部分を持つ、核酸の分離精製装置用容器を、ハイインパクトポリスチレンで作成した。
【００６０】
（２）核酸の分離精製装置の作成
本発明の核酸分離精製装置用として、膜厚６００μｍのガラスフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ社製のＧＦ／Ｄ）と膜厚１００μｍのポリスルホン膜（富士写真フイルム社製のＳＥＨ−２００）を使用して、ガラスフィルターの下にポリスルホン膜を設けることによって二層構造を作成した。また、比較用としては、上記した膜厚６００μｍのガラスフィルターを単独で使用した。これらを、上記（１）で作成した容器の収容部に収容して、核酸の分離精製装置を作成した。
【００６１】
（３）核酸吸着バッファ溶液及び洗浄バッファ溶液の調製
表１に示す処方の核酸吸着バッファ溶液及び洗浄バッファ溶液を調製した。
【００６２】
【表１】
核酸吸着バッファー
塩酸グアニジン（ライフテクノロジー製）３８２ｇ
Ｔｒｉｓ（ライフテクノロジー製） １２．１ｇ
Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（ＩＣＮ製） １０ｇ
蒸留水 １０００ｍｌ
洗浄バッファー
１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ６５％エタノール
【００６３】
（４）核酸精製操作
ヒト全血２００μｌを真空採血管を用いて採血した。これに、表１に示した処方の核酸吸着バッファ溶液２００μｌとプロテアーゼＫ２０μｌ添加して、６０℃で１０分間インキュベートした。インキュベート後、エタノール２００μｌを添加して攪拌した。攪拌後、上記の様に処理した全血試料溶液を、（２）で作成した核酸の分離精製装置の上部の開口から注入した。次いで、容器内を１５秒かけて０ｋｐａから６０ｋｐａに加圧して、容器内の液を排出させた。
【００６４】
排出後直ちに、核酸洗浄バッファ溶液１ｍｌを、装置の上部の開口から注入し、上記と同様に容器内を１５秒かけて０ｋｐａから６０ｋｐａに加圧して、容器内の液を排出して、容器の内部を洗浄した。洗浄後、２００μｌの精製蒸留水を、装置の上部の開口から注入し、上記と同様に容器内を１５秒かけて０ｋｐａから６０ｋｐａに加圧して、蒸留水を排出して、この排出液を回収した。
【００６５】
（５）核酸の回収量の定量及び純度の決定
上記回収した排出液の吸光度を測定して、核酸の回収量及び純度を定量した。回収量は波長２６０ｎｍの光吸収測定により定量され、また、核酸の純度は２６０ｎｍ及び２８０ｎｍでの光吸収の比率により決定され、この比率が１．８以上であれば純度は良好であると判断される。結果を表２に示す。表２の結果から、本発明の二層構造を用いることによりＤＮＡの回収量が良好であり、かつ純度も高いことが判る。
【００６６】
【表２】
表２：核酸の回収量及び純度
【００６７】
【発明の効果】
本発明によれば、ガラスフィルターを用いる核酸の精製方法において、ガラスフィルター全体に均一に圧力をかけて、ガラスフィルター内に液残りが発生することを防止することができる。従って、本発明の核酸の分離精製方法を用いることにより、試料溶液から核酸を高収率かつ高純度で単離精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の核酸の分離精製装置の概念図である。
【図２】図２は、本発明の核酸の分離精製装置の一例である。但し、開口２１に結合されるべき圧力差発生装置は図示していない。図２において、１は容器、１０は本体、１０１は開口、１０２は底面、１０３は枠、１０４は壁、１０５は段差、１２１は空間、１２２は空間、１２３は空間、１３は押さえ部材、１３１は穴、１３２は突起、２０は蓋、２１は開口、３０は固相を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for separating and purifying nucleic acid, an apparatus for separating and purifying nucleic acid, and a method for analyzing nucleic acid using them.
[0002]
[Prior art]
Nucleic acids are used in various forms in various fields. For example, in the area of recombinant nucleic acid technology, it is required to use nucleic acids in the form of probes, genomic nucleic acids, and plasmid nucleic acids.
[0003]
In the diagnostic field, nucleic acids are used in various ways. For example, nucleic acid probes are routinely used for detection and diagnosis of human pathogens. Similarly, nucleic acids are used to detect genetic disorders. Nucleic acids are also used to detect food contaminants. In addition, nucleic acids are routinely used in the localization, identification and isolation of nucleic acids of interest for a variety of reasons ranging from genetic mapping to cloning and recombinant expression.
[0004]
In many cases, nucleic acids are available only in very small amounts, and the isolation and purification operations are cumbersome and time consuming. This often time-consuming and cumbersome operation tends to lead to the loss of nucleic acids. The purification of sample nucleic acids from serum, urine and bacterial cultures also adds the risk of contamination and false positive results.
[0005]
As one of the widely known purification methods, there is a method in which a nucleic acid is adsorbed on the surface of silicon dioxide, silica polymer, magnesium silicate, etc. and purified by subsequent operations such as washing and desorption (for example, Japanese Patent Publication No. 7-51065). Publication). Although this method is excellent in separation performance, there are problems such as difficulty in industrial mass production of adsorption media having the same performance, inconvenience in handling, and difficulty in processing into various shapes.
[0006]
In addition, a nucleic acid purification method using a glass filter as the nucleic acid adsorption medium is known. However, in the nucleic acid purification method using a glass filter, when the nucleic acid is extracted at a differential pressure, the glass filter has a large and thick void, so that no pressure is uniformly applied to the entire glass filter. There was a problem that liquid residue was generated. Therefore, in the nucleic acid purification method using a glass filter, the entire apparatus has to be subjected to a centrifugal separation operation.
[0007]
[Patent Document 1]
Japanese Patent Publication No. 7-51065 [0008]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to solve the above-described problems of the prior art. That is, the present invention provides a method for solving a nucleic acid purification method using a glass filter by providing means for uniformly applying pressure to the entire glass filter to prevent liquid residue from being generated in the glass filter. It was.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have formed a two-layer structure by providing a porous film under a glass filter for adsorbing and desorbing nucleic acids, and using this two-layer structure, It has been found that the above-mentioned problems can be solved by separating and purifying nucleic acids. The present invention has been completed based on this finding.
[0010]
That is, according to the present invention, using a two-layer structure comprising a glass filter formed by providing a porous membrane under a glass filter for adsorbing and desorbing nucleic acids and a porous membrane, the glass filter There is provided a method for separating and purifying nucleic acid, comprising the steps of adsorbing and desorbing nucleic acid on the surface.
Preferably, the porous membrane is an organic polymer porous membrane.
[0011]
Preferably, the porous membrane is a porous membrane that does not adsorb nucleic acids.
Preferably, the porous membrane is a porous membrane of nylon or polysulfone.
Preferably, the pore size of the porous membrane is 0.1 to 10 μm.
[0012]
Preferably, the nucleic acid in the sample solution is adsorbed and desorbed.
Preferably, the sample solution is a solution obtained by adding a water-soluble organic solvent to a solution obtained by treating a specimen containing cells or viruses with a nucleic acid solubilizing reagent.
Preferably, the nucleic acid solubilizing reagent is a guanidine salt, a surfactant and a proteolytic enzyme.
[0013]
Preferably, after the nucleic acid is adsorbed on the glass filter, the glass filter is washed using a nucleic acid washing buffer, and then the nucleic acid adsorbed on the glass filter is desorbed using a solution capable of desorbing the nucleic acid adsorbed on the glass filter. There is provided a method for separating and purifying a nucleic acid comprising
[0014]
Preferably, the nucleic acid washing buffer is a solution containing 20 to 100% by weight of methanol, ethanol, isopropanol or n-propanol.
Preferably, the solution capable of desorbing the nucleic acid adsorbed on the glass filter is a solution having a salt concentration of 0.5 M or less.
[0015]
Preferably, a two-layer structure comprising a glass filter and a porous membrane formed by providing a porous membrane under a glass filter for adsorbing and desorbing nucleic acids in a container having at least two openings. Nucleic acid is adsorbed and desorbed by using an apparatus for separating and purifying nucleic acid contained therein.
[0016]
Preferably, (a) a two-layer structure composed of a glass filter and a porous film formed by providing a porous film under a glass filter for adsorbing and desorbing nucleic acids, and (b) the two-layer structure Nucleic acid is adsorbed and desorbed using a container having at least two openings to be accommodated, and (c) a nucleic acid separation and purification apparatus including a pressure difference generator coupled to one opening of the container.
[0017]
According to another aspect of the present invention, a glass filter and a porous membrane formed by providing a porous membrane under a glass filter for adsorbing and desorbing nucleic acids in a container having at least two openings. An apparatus for separating and purifying nucleic acid is provided, in which the constituted two-layer structure is accommodated.
[0018]
Preferably, (a) a two-layer structure composed of a glass filter and a porous membrane formed by providing a porous membrane under a glass filter for adsorbing and desorbing nucleic acids,
(B) a container having at least two openings for accommodating the two-layer structure, and (c) a pressure difference generator coupled to one opening of the container,
An apparatus for separating and purifying a nucleic acid containing is provided.
[0019]
Preferably, the pressure difference generator is detachably coupled to one opening of the container.
Preferably, the pressure difference generating device is a syringe, a pipetter or a pump.
[0020]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Embodiments of the present invention will be described below.
(1) Method for separating and purifying nucleic acid according to the present invention The method for separating and purifying nucleic acid according to the present invention comprises a porous membrane (preferably an organic polymer porous membrane) under a glass filter for adsorbing and desorbing nucleic acids. The method includes a step of adsorbing and desorbing nucleic acid on the glass filter using a two-layer structure composed of a glass filter and a porous membrane formed by providing the glass filter.
[0021]
In the present invention, by providing a porous membrane under the glass filter, a uniform pressure is applied to the entire filter, and as a result, separation and purification of nucleic acids can be performed with high reproducibility using only the differential pressure without centrifugation. It became possible to do.
In the present invention, the “nucleic acid” may be either single-stranded or double-stranded, and there is no molecular weight limitation.
[0022]
A glass fiber filter can be used as a glass filter for adsorbing and desorbing nucleic acids. Specifically, Whatman GF / B, GF / C, GF / D and GF / F, Advantech GA-100, GA-200, GC-50, GF-75, GB-140, QR-100 Etc. Moreover, a glass fiber filter can also be used by laminating | stacking several sheets. The thickness of the glass fiber filter is not particularly limited, but is generally about 0.1 to 10 mm, preferably about 0.5 to 8 mm.
[0023]
The porous membrane is preferably an organic polymer porous membrane, more preferably a porous membrane that has not been hydrophilized and does not adsorb nucleic acids.
As a specific example of the porous membrane, a porous membrane of nylon or polysulfone can be used.
The pore size of the porous membrane is not particularly limited, but is preferably 0.1 to 10 μm.
[0024]
In the present invention, by providing a porous membrane under the glass filter for adsorbing and desorbing nucleic acids, pressure is uniformly applied in the glass filter, whereby the liquid is pressurized and the container is passed through the glass filter. When discharging outside, it is possible to prevent liquid residue from being generated in the glass filter.
[0025]
In the method for separating and purifying nucleic acid of the present invention, preferably, a glass filter formed by providing a porous membrane under a glass filter for adsorbing and desorbing nucleic acid in a container having at least two openings and a porous Nucleic acid can be adsorbed and desorbed using a nucleic acid separation and purification apparatus containing a two-layer structure composed of a membrane.
[0026]
More preferably, (a) a two-layer structure comprising a glass filter and a porous film formed by providing a porous film under a glass filter for adsorbing and desorbing nucleic acids, and (b) the two-layer structure And (c) performing nucleic acid adsorption and desorption using a nucleic acid separation and purification apparatus including a pressure difference generator connected to one opening of the container. it can.
[0027]
The nucleic acid separation and purification method of the present invention can include, for example, the following steps.
(A) preparing a sample solution containing a nucleic acid using a specimen, and injecting the sample solution containing the nucleic acid into one opening of the nucleic acid separation and purification apparatus;
(B) The container is pressurized using the pressure difference generator connected to the one opening of the nucleic acid separation and purification apparatus, and the sample solution containing the injected nucleic acid is discharged from the other opening, A step of contacting the glass filter;
(C) a step of injecting a nucleic acid washing buffer into the one opening of the nucleic acid separation and purification apparatus,
(D) By using a pressure difference generator coupled to the one opening of the nucleic acid separation and purification apparatus, the container is pressurized, and the injected nucleic acid washing buffer is discharged from the other opening, whereby a glass filter is obtained. Contacting with,
(E) Injecting a liquid capable of desorbing the nucleic acid adsorbed on the glass filter into the one opening of the nucleic acid separation and purification apparatus,
(F) By using a pressure difference generator coupled to the one opening of the nucleic acid separation and purification apparatus, the container is pressurized, and a liquid capable of desorbing the injected nucleic acid is discharged from the other opening. The process of desorbing the nucleic acid adsorbed on the glass filter and discharging it out of the container.
[0028]
The method for separating and purifying nucleic acid according to the present invention will be described more specifically. In the present invention, preferably, a sample solution containing nucleic acid is formed into a two-layer structure composed of a glass filter and a porous film formed by providing a porous film under a glass filter for adsorbing and desorbing nucleic acid. By contacting, the nucleic acid in the sample solution is adsorbed on the glass filter, and then the nucleic acid adsorbed on the glass filter is desorbed from the glass filter using a suitable solution described below. More preferably, the sample solution containing nucleic acid is a solution obtained by adding a water-soluble organic solvent to a solution obtained by dispersing a nucleic acid in a solution by treating a specimen containing cells or viruses with a solution that dissolves cell membranes and nuclear membranes. is there.
[0029]
The sample solution containing the nucleic acid that can be used in the present invention is not limited, but in the diagnostic field, for example, whole blood collected as a specimen, plasma, serum, urine, stool, semen, saliva and other body fluids, or plants (or their) Particular), animals (or parts thereof), etc., or solutions prepared from biological materials such as lysates and homogenates thereof.
[0030]
First, these specimens are treated with an aqueous solution containing a reagent that dissolves the cell membrane and solubilizes the nucleic acid. As a result, the cell membrane and the nuclear membrane are dissolved, and the nucleic acid is dispersed in the aqueous solution.
For cell membrane lysis and nucleic acid solubilization, for example, when the target sample is whole blood, (1) removal of red blood cells, (2) removal of various proteins, and (3) lysis of white blood cells and nuclear membrane Must be dissolved. (1) Removal of red blood cells and (2) removal of various proteins are performed in order to prevent non-specific adsorption to the glass filter and clogging of the porous membrane. (3) Lysis of leukocytes and nuclear membranes are subject to extraction. Are required to solubilize the nucleic acids. In particular, (3) lysis of leukocytes and lysis of the nuclear membrane are important steps. In the method of the present invention, it is necessary to solubilize nucleic acids in this step. In the examples described below in the present specification, the above (1), (2) and 3 ▼ is achieved at the same time.
[0031]
Examples of the nucleic acid solubilizing reagent used in the present invention include a solution containing a guanidine salt, a surfactant and a proteolytic enzyme.
As the guanidine salt, guanidine hydrochloride is preferable, but other guanidine salts (guanidine isothiocyanate, guanidine thiocyanate) can also be used. The concentration of the guanidine salt in the solution is 0.5M or more and 6M or less, preferably 1M or more and 5M or less.
[0032]
As the surfactant, Triton-X100 can be used, but in addition to this, an anionic surfactant such as SDS, sodium cholate or sarcosine sodium, a nonionic surfactant such as Tween 20 or MegaFac, Various other amphoteric surfactants can also be used. In the present invention, it is preferable to use a nonionic surfactant such as polyoxyethylene octylphenyl ether (Triton-X100). The concentration of the surfactant in the solution is usually 0.05% to 10% by weight, particularly preferably 0.1% to 5% by weight.
[0033]
Protease K can be used as the proteolytic enzyme, but the same effect can be obtained with other proteases. Since protease is an enzyme, it is preferable to warm it, it is preferable to use it at 37 ° C to 70 ° C, particularly 50 ° C to 65 ° C.
[0034]
It is composed of a glass filter and a porous membrane formed by adding a water-soluble organic solvent to the aqueous solution in which nucleic acids are dispersed in this manner, and providing a porous membrane under the glass filter for adsorbing and desorbing nucleic acids. In contact with the two-layer structure. By this operation, the nucleic acid in the sample solution is adsorbed on the glass filter. In order to adsorb the nucleic acid solubilized by the operation described above in this specification to the glass filter, a water-soluble organic solvent is mixed with the solubilized nucleic acid mixture, and a salt is contained in the obtained nucleic acid mixture. Must exist.
[0035]
That is, by destroying the hydration structure of water molecules present around the nucleic acid, the nucleic acid is solubilized in an unstable state. When the nucleic acid in this state is brought into contact with the glass filter, it is considered that the polar group on the nucleic acid surface interacts with the polar group on the glass filter surface, and the nucleic acid is adsorbed on the glass filter. In the method of the present invention, the nucleic acid can be brought into an unstable state by mixing a water-soluble organic solvent with the solubilized nucleic acid mixture and the presence of a salt in the obtained nucleic acid mixture.
[0036]
Examples of the water-soluble organic solvent used here include ethanol, isopropanol, and propanol. Among them, ethanol is preferable. The concentration of the water-soluble organic solvent is preferably 5% by weight to 90% by weight, and more preferably 20% by weight to 60% by weight. The concentration of ethanol added is particularly preferably as high as possible without causing pseudo-collects.
[0037]
Salts present in the resulting nucleic acid mixture include various chaotropic substances (guanidinium salts, sodium iodide, sodium perchlorate), sodium chloride, potassium chloride, ammonium chloride, sodium bromide, potassium bromide, bromide. Calcium, ammonium bromide and the like are preferred. In particular, a guanidinium salt is particularly preferable because it has the effects of cell membrane lysis and nucleic acid solubilization.
[0038]
Next, the glass filter on which the nucleic acid has been adsorbed is brought into contact with the nucleic acid washing buffer solution. This solution has a function of washing out impurities in the sample solution adsorbed on the glass filter together with the nucleic acid. Therefore, it is necessary to have a composition that does not desorb nucleic acids from glass filters but desorbs impurities. The nucleic acid washing buffer solution is composed of an aqueous solution containing a main agent, a buffering agent, and, if necessary, a surfactant. As the main agent, an aqueous solution of about 10 to 100% by weight (preferably about 20 to 100% by weight, more preferably about 40 to 80% by weight) such as methanol, ethanol, isopropanol, n-isopropanol, butanol, and acetone is used as a buffering agent. Examples of the surfactant include the above-described buffer and surfactant. Among these, a solution containing ethanol, Tris and Triton-X100 is preferable. Preferred concentrations of Tris and Triton-X100 are 10 to 100 mM and 0.1 to 10% by weight, respectively.
[0039]
Next, the glass filter after washing is brought into contact with a solution capable of desorbing nucleic acids adsorbed on the glass filter. Since the target nucleic acid is contained in this solution, it is recovered and provided for subsequent operation, for example, amplification of the nucleic acid by PCR (polymerase chain reaction). The solution capable of desorbing nucleic acids preferably has a low salt concentration, and particularly preferably a solution having a salt concentration of 0.5 M or less. As this solution, purified distilled water, TE buffer or the like can be used.
[0040]
(2) Apparatus for separating and purifying nucleic acid of the present invention The apparatus for separating and purifying nucleic acid of the present invention is an apparatus having at least two openings, and is provided under a glass filter for adsorbing and desorbing nucleic acids. This is an apparatus for separating and purifying nucleic acid containing a two-layer structure composed of a glass filter and a porous membrane formed by providing a porous membrane.
[0041]
There is no particular limitation on the material of the container, and it is sufficient that a two-layer structure composed of a glass filter and a porous film can be accommodated and at least two openings can be provided. However, plastic is preferable from the viewpoint of ease of manufacture. For example, it is preferable to use a transparent or opaque resin such as polystyrene, polymethacrylic ester, polyethylene, polypropylene, polyester, nylon, and polycarbonate.
[0042]
A conceptual diagram of the container is shown in FIG. Basically, it has a two-layer structure (solid phase) containing part that consists of a glass filter and a porous membrane, and the two-layer structure can be contained in the containing part. It is only necessary that a pressure difference generating device such as a syringe can be joined to the opening without sometimes going out of the housing. For this purpose, it is preferred that the container is initially divided into two parts and can be integrated after the two-layer structure is accommodated. Moreover, in order to avoid that a two-layer structure goes out of a storage part, the mesh created with the material which does not contaminate DNA can be put on the upper and lower sides of a two-layer structure.
[0043]
There is no particular limitation on the shape of the two-layer structure composed of the glass filter and the porous film housed in the container, and any shape such as a circle, a square, a rectangle, and an ellipse may be used.
[0044]
The nucleic acid separation and purification apparatus of the present invention comprises: (a) a two-layer structure comprising a glass filter and a porous membrane formed by providing a porous membrane under a glass filter for adsorbing and desorbing nucleic acids; It is preferable that the container includes b) a container having at least two openings that accommodates the two-layer structure, and (c) a pressure difference generator coupled to one opening of the container. Hereinafter, this nucleic acid separation and purification apparatus will be described.
[0045]
The container is usually produced in a manner divided into a main body that houses a two-layer structure composed of a glass filter and a porous membrane, and a lid, each of which is provided with at least one opening. One is used as an inlet and an outlet for a sample solution containing nucleic acid, a nucleic acid washing buffer solution, and a solution that can desorb nucleic acid adsorbed on a glass filter (hereinafter referred to as “sample solution etc.”), and the other is in a container. Is connected to a pressure difference generator capable of causing the pressure to be reduced or increased. The shape of the main body is not particularly limited, but it is preferable to make the cross section circular in order to facilitate the manufacture and to facilitate the diffusion of the sample solution and the like over the entire surface of the two-layer structure. It is also preferable to make the cross section quadrangular in order not to generate glass filter or porous film cutting waste.
[0046]
The lid needs to be joined to the main body so that the inside of the container can be depressurized and pressurized by the pressure difference generator, but if this state can be achieved, the joining method can be arbitrarily selected. For example, use of an adhesive, screwing, fitting, screwing, fusion by ultrasonic heating and the like can be mentioned.
[0047]
The internal volume of the container is determined only by the amount of the sample solution to be processed, but is usually represented by the volume of the two-layer structure accommodated. That is, it is preferable to have a size that accommodates about 2 to 6 glass filters and porous membranes having a thickness of about 1 mm or less (for example, about 50 to 500 μm) and a diameter of about 2 mm to 20 mm.
The end surface of the two-layer structure is preferably in close contact with the inner wall surface of the container so that the sample solution or the like does not pass through.
[0048]
Under the two-layer structure facing the opening used for the inlet of the sample solution etc., a space is provided without being in close contact with the inner wall of the container so that the sample solution etc. diffuses as evenly as possible over the entire surface of the two-layer structure. .
[0049]
It is preferable to provide a member having a hole in the center on the two-layer structure facing the other opening, that is, the opening coupled to the pressure difference generator. This member suppresses the two-layer structure and has the effect of efficiently discharging the sample solution and the like, and has a funnel-shaped or bowl-shaped inclined surface so that the liquid collects in the central hole. Is preferred. The size of the hole, the angle of the inclined surface, and the thickness of the member can be appropriately determined by those skilled in the art in consideration of the amount of the sample solution to be processed, the size of the container containing the two-layer structure, and the like. It is preferable to provide a space between the member and the opening for storing the overflowed sample solution or the like and preventing the sample solution from being sucked into the pressure difference generator. The size of this space can also be appropriately selected by those skilled in the art. In order to efficiently collect nucleic acids, it is preferable to aspirate a sample solution containing nucleic acid in an amount more than the entire two-layer structure is immersed.
[0050]
In addition, in order to prevent the sample solution and the like from concentrating only in the part directly under the suction opening, and to allow the sample solution and the like to pass through the two-layer structure relatively uniformly, the two-layer structure and this member It is preferable to provide a space between them. For this purpose, it is preferable to provide a plurality of protrusions from the member toward the two-layer structure. The size and number of the protrusions can be appropriately selected by those skilled in the art, but it is preferable to keep the opening area of the two-layer structure as large as possible while maintaining the space.
[0051]
Needless to say, when the container is provided with three or more openings, it is necessary to temporarily block the extra openings in order to enable suction and discharge of the liquid accompanying the decompression and pressurization operations. Absent.
[0052]
The pressure difference generator first sucks a sample solution containing nucleic acid by reducing the pressure in the container containing the two-layer structure. Examples of the pressure difference generating device include a pump capable of suction and pressurization such as a syringe, a pipetter, or a peristaltic pump. Of these, a syringe is suitable for manual operation, and a pump is suitable for automatic operation. Also, the pipetter has the advantage that it can be easily operated by one hand. Preferably, the pressure difference generator is detachably coupled to one opening of the container.
[0053]
FIG. 2 is a cross-sectional view of an example of the nucleic acid separation and purification apparatus of the present invention. However, the pressure difference generator is not shown. A container 1 containing a two-layer structure is composed of a main body 10 and a lid 20 and is made of transparent polystyrene. The main body 10 contains a two-layer structure 30. Further, an opening 101 for sucking a sample solution or the like is provided. The bottom surface 102 continuing from the opening is formed in a funnel shape, and a space 121 is provided between the two-layer structure 30. In order to support the two-layer structure 30 and maintain the space 121, a frame 103 integrated with the bottom surface 102 is provided.
[0054]
The main body has an inner diameter of 20.1 mm, a depth of 5.9 mm, and a length from the bottom surface 102 to the opening 101 of about 70 mm. The built-in two-layer structure 30 has a diameter of 20.0 mm, a thickness of about 50 to 500 μm, and an example of the thickness is 100 μm.
[0055]
In FIG. 2, a funnel-shaped pressing member 13 is provided on the upper part of the two-layer structure. A hole 131 is provided at the center of the pressing member 13, a group of protrusions 132 are provided below, and a space 122 is provided between the two-layer structure 30. The diameter of the upper part of the wall 104 is made larger than the diameter of the two-layer structure so that the sample solution or the like is less likely to leak from between the two-layer structure 30 and the wall 104 of the main body 10. I'm riding.
[0056]
The lid 20 is joined to the main body 10 by ultrasonic heating. An opening 21 that couples the pressure difference generator is provided in a substantially central portion of the lid 20. Between the lid 20 and the pressing member 13, a space 123 for holding a sample solution or the like flowing out from the hole 131 is provided. The volume of the space 123 is about 0.1 ml.
[0057]
(3) Utilization of the present invention The utilization method of the nucleic acid separated and purified by the method of the present invention is not particularly limited. For example, it is utilized in a nucleic acid analysis method including the following steps (1) to (3). can do.
(1) A step of separating and purifying a nucleic acid fragment containing a target nucleic acid fragment by the above-described method of the present invention;
(2) The target nucleic acid fragment, at least one primer complementary to a part of the target nucleic acid fragment, at least one deoxynucleoside triphosphate, and at least one polymerase are reacted, and the target nucleic acid fragment is used as a template. Performing a polymerase extension reaction starting from the 3 ′ end of the primer; and
(3) A step of detecting the presence or absence of progress of the polymerase extension reaction or detecting the presence or absence of hybridization between the polymerase extension reaction product and another nucleic acid:
It is characterized by including.
[0058]
According to a preferred embodiment, the presence or absence of progress of the polymerase extension reaction is detected by detecting pyrophosphoric acid produced in association with the polymerase extension reaction.
In a more preferred embodiment, pyrophosphoric acid is analyzed using a colorimetric method, and more preferably, pyrophosphoric acid is detected using a dry analytical element. In the nucleic acid analysis method according to the present invention, the presence or abundance of the target nucleic acid fragment can be detected, or the base sequence of the target nucleic acid fragment can be detected. Here, the detection of the abundance is a concept including quantification of the target nucleic acid fragment. Specific examples of detection of the base sequence of the target nucleic acid fragment include detection of mutation or polymorphism of the target nucleic acid fragment.
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention is not limited to these.
[0059]
【Example】
Example 1
(1) Preparation of container A container for a nucleic acid separation and purification apparatus having a portion for accommodating a two-layer structure for nucleic acid adsorption having an inner diameter of 7 mm and a thickness of 2 mm was prepared from high impact polystyrene.
[0060]
(2) Preparation of nucleic acid separation and purification apparatus For the nucleic acid separation and purification apparatus of the present invention, a glass filter with a film thickness of 600 μm (GF / D manufactured by Whatman) and a polysulfone film with a film thickness of 100 μm (SEH manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.) -200) was used to create a bilayer structure by providing a polysulfone membrane under the glass filter. For comparison, the above glass filter having a film thickness of 600 μm was used alone. These were accommodated in the container accommodating part prepared in the above (1) to prepare a nucleic acid separation and purification apparatus.
[0061]
(3) Preparation of nucleic acid adsorption buffer solution and washing buffer solution Nucleic acid adsorption buffer solution and washing buffer solution having the formulation shown in Table 1 were prepared.
[0062]
[Table 1]
Nucleic acid adsorption buffer
382 g guanidine hydrochloride (Life Technology)
Tris (Life Technology) 12.1g
Triton-X100 (ICN) 10g
1000ml distilled water
Wash buffer
10 mM Tris-HCl 65% ethanol
[0063]
(4) Nucleic acid purification operation 200 μl of human whole blood was collected using a vacuum blood collection tube. To this, 200 μl of a nucleic acid adsorption buffer solution having a formulation shown in Table 1 and 20 μl of protease K were added and incubated at 60 ° C. for 10 minutes. After incubation, 200 μl of ethanol was added and stirred. After stirring, the whole blood sample solution treated as described above was injected from the upper opening of the nucleic acid separation and purification apparatus prepared in (2). Subsequently, the inside of the container was pressurized from 0 kpa to 60 kpa over 15 seconds, and the liquid in the container was discharged.
[0064]
Immediately after the discharge, 1 ml of the nucleic acid washing buffer solution is injected from the upper opening of the apparatus, the inside of the container is pressurized from 0 kpa to 60 kpa over 15 seconds in the same manner as described above, and the liquid in the container is discharged. The inside was washed. After washing, 200 μl of purified distilled water is injected from the upper opening of the apparatus, and the inside of the container is pressurized from 0 kpa to 60 kpa over 15 seconds in the same manner as described above. The distilled water is discharged, and this discharged liquid is recovered. did.
[0065]
(5) Determination of nucleic acid recovery amount and determination of purity The absorbance of the recovered effluent was measured to determine the nucleic acid recovery amount and purity. The amount recovered is quantified by light absorption measurement at a wavelength of 260 nm, and the purity of the nucleic acid is determined by the ratio of light absorption at 260 nm and 280 nm. If this ratio is 1.8 or more, the purity is judged to be good. The The results are shown in Table 2. From the results shown in Table 2, it can be seen that the amount of recovered DNA is good and the purity is high by using the two-layer structure of the present invention.
[0066]
[Table 2]
Table 2: Nucleic acid recovery and purity
[0067]
【The invention's effect】
According to the present invention, in the method for purifying nucleic acid using a glass filter, it is possible to uniformly apply pressure to the entire glass filter and prevent liquid residue from occurring in the glass filter. Therefore, by using the method for separating and purifying nucleic acid of the present invention, the nucleic acid can be isolated and purified from the sample solution with high yield and high purity.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a conceptual diagram of a nucleic acid separation and purification apparatus of the present invention.
FIG. 2 is an example of the nucleic acid separation and purification apparatus of the present invention. However, the pressure difference generator to be coupled to the opening 21 is not shown. In FIG. 2, 1 is a container, 10 is a main body, 101 is an opening, 102 is a bottom surface, 103 is a frame, 104 is a wall, 105 is a step, 121 is a space, 122 is a space, 123 is a space, 13 is a pressing member, 131 Indicates a hole, 132 indicates a protrusion, 20 indicates a lid, 21 indicates an opening, and 30 indicates a solid phase.
