JP2004301529A

JP2004301529A - Sensor

Info

Publication number: JP2004301529A
Application number: JP2003091692A
Authority: JP
Inventors: Hiroaki Suzuki; 博章鈴木; Hiroshi Abe; 弘阿部; Kazuyoshi Yamamoto; 一喜山本; Tetsuya Ishii; 徹哉石井
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 2003-03-28
Filing date: 2003-03-28
Publication date: 2004-10-28

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a sensor capable of measuring quickly and simply a chemical substance, especially a biorelated substance in blood, saliva or urine. <P>SOLUTION: In this sensor, a diaphragm capable of transmitting a biochemical stimulator and a passage are arranged through stimulus responsive gel whose volume is changed by biochemical stimulus, comprising an N-isopropyl acrylamide-acrylic acid copolymer, N-isopropyl acrylamide-1-vinyl imidazole-acrylic acid copolymer and water. The sensor is characterized by forming the passage so that the indication marker can be moved therein, arranging one end of an indication marker in contact with the stimulus responsive gel, and moving the indication marker in the passage by a volume change of the stimulus responsive gel. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、化学物質、特に、血液中、唾液中、尿中等の生体関連物を迅速且つ簡単に測定することのできるセンサであり、特にディスポーザブルなセンサに関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、幾つかの化学物質を定量できるバイオセンサが実用化されている（例えば、特許文献１及び特許文献２参照。）。そのうち最も広く使われているのは、グルコースセンサである。グルコースセンサの主な用途は医療用途であり、糖尿病患者の診断に広く用いられている。
【０００３】
【特許文献１】
特開２００３−１４６８７号公報
【特許文献２】
特開平１０−２６２６４５号公報
【０００４】
血糖値の測定は糖尿病の診断に非常に重要であるため、ディスポーザブル血糖値センサを装着できる携帯型血糖測定器が既に実用化され、これは一般のユーザーも容易に入手することができるものである。
【０００５】
ディスポーザブル血糖値センサとしては主に光学的なものと電気化学的なものとが実用化されている。光学的なものは、酵素反応の前後での反応・生成物の吸光度や発光度を測定することによる。また、電気化学的なものとしては、例えば、下記式に示す反応で生成する過酸化水素を測定し、グルコース濃度を求めるものが挙げられる。
β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ＋Ｏ_２→Ｄ−ｇｌｕｃｏｎｏ−δ−ｌａｃｔｏｎｅ＋Ｈ_２Ｏ_２
【０００６】
今後、このようなバイオセンサの需要はますます増大することが予想されるが、これに伴い、より安価に入手可能なものが求められると予想される。上記の市販されている携帯型血糖値測定器では、血糖値を測定するための上記ディスポーザブルバイオセンサの他、この信号を増幅して処理するためのアンプが必要である。
【０００７】
センサチップ自体は比較的安価に入手することができるが、アンプは必ずしもそうではない。このため、アンプを必要とせず、チップだけで機能するものが得られれば、全体として格段の低価格化が実現でき、例えば血糖のみならず尿糖の測定等にも気軽に使えるようになると思われる。
【０００８】
化学センサ、バイオセンサは、医療、環境、食品等の多くの分野で用いられており、その重要性は今後ますます高まりつつある。このうち、特に医療関係では、ヘルスケア、在宅医療の関係で、今後ますますその需要が増大するものと思われる。
【０００９】
当該分野では、特に一般家庭のユーザーが、例えば血糖値又は尿糖値を測定するために、煩雑な操作を必要とせずに簡便に使用でき、しかも安価に入手できることが求められる。同様のことは、環境、食品分野でも要求されている。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、化学物質、特に血液中、唾液中又は尿中の生体関連物質を迅速かつ簡便に測定することのできるセンサを提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載のセンサは、（生）化学的刺激により体積変化する刺激応答性ゲルを介して、（生）化学的刺激物を透過しうる隔膜と通路が配置されたセンサであって、通路は指示標識が移動可能になされており、指示標識は一端部が刺激応答性ゲルに接するように通路内に配置されており、刺激応答性ゲルの体積変化により指示標識が通路内を移動するようになされていることを特徴とする。
【００１２】
上記（生）化学的刺激により体積変化する刺激応答性ゲルとは、ｐＨ、グルコース、化学物質の吸脱着、酸化・還元等の生化学的又は化学的刺激を受けた際に体積変化するゲルである。
【００１３】
上記（生）化学的刺激に対して体積が変化するゲルは、水又は電解質水溶液とポリマーとからなり、ポリマーの網目状構造体中に水又は電解質水溶液を取り込んでなるものであり、（生）化学的刺激に応じて、水を取り込んで膨潤し、水を放出して収縮するゲルである。
【００１４】
上記ｐＨ変化に対して体積が変化するポリマーとしては、例えば、ポリ（メタ）アクリル酸の架橋物やその金属塩、（メタ）アクリル酸と（メタ）アクリルアミド、Ｎ置換（メタ）アクリルアミド誘導体、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリル酸アルキルエステルなどとの共重合体の架橋物やその金属塩、マレイン酸と（メタ）アクリルアミド、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリル酸アルキルエステルなどとの共重合体の架橋物やその金属塩、ポリビニルスルホン酸の架橋物やビニルスルホン酸と（メタ）アクリルアミド、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリル酸アルキルエステルなどとの共重合体の架橋物、ポリビニルベンゼンスルホン酸の架橋物やその金属塩、ビニルベンゼンスルホン酸と（メタ）アクリルアミド、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリル酸アルキルエステルなどとの共重合体の架橋物やその金属塩、ポリアクリルアミドアルキルスルホン酸の架橋物やその金属塩、アクリルアミドアルキルスルホン酸と（メタ）アクリルアミド、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリル酸アルキルエステルなどとの共重合体の架橋物やその金属塩、ポリジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミドの架橋物やその４級塩、ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミドと（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリルアミド、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリル酸アルキルエステルなどとの共重合体の架橋物やその金属塩や４級塩、ポリジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミドとポリビニルアルコールとの複合体の架橋物やその４級塩、ポリビニルアルコールとポリ（メタ）アクリル酸との複合体の架橋物やその金属塩、カルボキシアルキルセルロース金属塩の架橋物、ポリ（メタ）アクリロニトリルの架橋物の部分加水分解物やその金属塩などが挙げられ、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとアクリル酸との共重合体及びＮ−イソプロピルアクリルアミドとアクリル酸と１−ビニルイミダゾールとの共重合体が好ましい。
【００１５】
上記Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとアクリル酸との共重合体からなるゲルは、中性領域で膨潤状態にあり、酸性領域で収縮する。一方、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとアクリル酸と１−ビニルイミダゾールとの共重合体からなるゲルは、中性領域で収縮状態にあり、酸性領域、アルカリ性領域で膨潤する。
【００１６】
又、ポリ（メタ）アクリル酸とポリ（メタ）アクリルアミドの相互侵入網目状高分子（ＩＰＮ）もｐＨ変化に対して体積が変化するので使用可能である（例えば、特許文献３、４参照。）。
【００１７】
【特許文献３】
米国特許第５４０３８９３号
【特許文献４】
米国特許第５５８０９２９号
【００１８】
上記グルコースによって体積が変化するポリマーとしては、例えば、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとアクリル酸の共重合体を架橋した網目状高分子鎖中にグルコースオキシダーゼを包括固定したケモメカニカル材料が知られている（例えば、非特許文献１参照。）。
【００１９】
レクチンや免疫グロブリン等の生体分子をリガンドとした生体分子インプリント法により、上記ｐＨ変化に対して体積が変化するポリマーに固定した、糖や抗原により体積変化をするポリマーが知られている（例えば、非特許文献２参照。）。
【００２０】
【非特許文献１】
第４３回高分子学会年次大会予稿集１２１３頁（１９９４年）
【非特許文献２】
関西大学先端科学技術シンポジウム講演集（Ｖｏｌ．６ｔｈ、３３〜３８頁、２００２年）
【００２１】
上記化学物質の吸脱着によって体積が変化するポリマーとしては、強イオン性高分子ゲルが好ましく、例えば、ポリビニルスルホン酸の架橋物やビニルスルホン酸と（メタ）アクリルアミド、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリル酸アルキルエステルなどとの共重合体の架橋物、ポリビニルベンゼンスルホン酸の架橋物やビニルベンゼンスルホン酸と（メタ）アクリルアミド、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリル酸アルキルエステルなどとの共重合体の架橋物、ポリアクリルアミドアルキルスルホン酸の架橋物やアクリルアミドアルキルスルホン酸と（メタ）アクリルアミド、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリル酸アルキルエステルなどとの共重合体の架橋物などが挙げられ、これらとｎ−ドデシルピリジニウムクロライドなどのアルキルピリジニウム塩、アルキルアンモニウム塩、フェニルアンモニウム塩、テトラフェニルホスホニウムクロライドなどのホスホニウム塩などカチオン性界面活性剤とを組み合わせることで使用される。
【００２２】
上記酸化・還元によって体積が変化するポリマーとしては、カチオン性高分子ゲルが挙げられ、電子受容性化合物と組み合わせてＣＴ錯体（電荷移動錯体）として好ましく使用される。カチオン性高分子ゲルとしては、例えば、ポリジメチルアミノプロピルアクリルアミドなどポリアミノ置換（メタ）アクリルアミドの架橋物、ポリジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ポリジエチルアミノエチル（メタ）アクリレートやポリジメチルアミノプロピル（メタ）アクリレートなどのポリ（メタ）アクリル酸アミノ置換アルキルエステルの架橋物、ポリスチレンの架橋物、ポリビニルピリジンの架橋物、ポリビニルカルバゾールの架橋物、ポリジメチルアミノスチレンの架橋物などが挙げられる。また、電子受容性化合物としてベンゾキノン、７，７，８，８−テトラシアノキノジメタン（ＴＣＮＱ）、過塩素酸テトラブチルアンモニウム、テトラシアノエチレン、クロラニル、トリニトロベンゼン、無水マレイン酸やヨウ素などが挙げられる。
【００２３】
刺激応答性ゲルと検体が直接接触すると、検体中の測定対象物以外の物が刺激応答性ゲルに接触して刺激応答性ゲルの体積が変化することがあるので、刺激応答性ゲルと検体が直接接触せず、刺激応答性ゲルは検体中の（生）化学的刺激物だけと接触するように、（生）化学的刺激物を透過しうる隔膜が配置される。即ち、刺激応答性ゲルの通路と接触しない部位に、（生）化学的刺激物を透過しうる隔膜が配置されている。
【００２４】
上記（生）化学的刺激物を透過しうる隔膜とは、ｐＨ、グルコース、化学物質の吸脱着、酸化・還元等の（生）化学的刺激を与えうる（生）化学的刺激物を透過しうる隔膜であり、一般に微細な連通孔を有する高分子樹脂フィルムが使用される。
【００２５】
上記（生）化学的刺激物を透過しうる隔膜には、（生）化学的刺激反応に関与する受容体が固定されていてもよい。こうすることで、検体中の（生）化学的刺激物を受容体が捕捉し（生）化学的刺激変換反応を行い、刺激応答性ゲルが体積変化するのに適した（生）化学的刺激物に変換することができ、バイオセンサが得られる。
【００２６】
上記受容体としては、検体中の（生）化学的刺激物を捕捉し（生）化学的刺激反応を行い、刺激応答性ゲルが体積変化するのに適した（生）化学的刺激物への変換反応に関与することができる従来公知の任意の受容体が使用できる。
【００２７】
例えば、ｐＨ変化に対して体積が変化する刺激応答性ゲルを使用する場合は、ｐＨ変化を伴う反応を触媒する受容体が挙げられ、例えば、酵素、微生物、抗原、抗体、抗体断片、レクチン、レセプター、イオノフォア、プロトンポンプ、生体膜、人工生体素子、ポリペプチド、ＤＮＡの分子、ＲＮＡの分子、タンパク質、糖鎖、糖タンパク質、メタロプロティンよりなる群から選ばれた１種もしくはこれらの混合物が挙げられる（例えば、非特許文献３参照。）。
【００２８】
【非特許文献３】
バイオセンサー（軽部征夫監修、株式会社シーエムシー出版、２００２年５月２７日普及版第一刷発行）
【００２９】
上記酵素としては、測定対象物質がグルコースである場合はグルコースオキシダーゼ等が用いられるが、この場合、更に、グルコースオキシダーゼとグルコノラクトナーゼとが併用されることが好ましい。グルコースオキシダーゼとグルコノラクトナーゼとが併用されることにより、Ｄ−グルコノ−δ−ラクトンからＤ−グルコン酸への加水分解反応がより促進される。
【００３０】
測定対象物質が尿素である場合はウレアーゼが用いられる。尿素がウレアーゼに触媒されてアンモニアが生じｐＨが上昇し、ゲルの体積変化が起こる。
グルコースセンサを基礎として、グルコースまたはグルコース前駆体を生成する種々の生体反応物質もしくは生体活性を測ることもできる。例えば、本発明のグルコースセンサに水溶性デンプンとα−グルコシダーゼを包括固定化した多孔膜を積層すると、α−アミラーゼ活性センサを構成できる。
【００３１】
ｐＨを変化させる生体酵素反応やグルコースまたはグルコース前駆体を生成する生体酵素反応はこのほかにも多数知られている（例えば、非特許文献４参照。）。
【００３２】
【非特許文献４】
ＳｐｒｉｎｇｅｒＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｎｚｙｍｅｓ（全２５巻）、シュプリンガー出版
【００３３】
上記微生物として、硝化菌を使用した場合は、アンモニアセンサが得られ、大腸菌を使用した場合は、グルタミン酸センサが得られる。
【００３４】
上記受容体として抗原や抗体を選ぶときには、酵素修飾した抗体によるサンドイッチ法で、受容体にｐＨ変化またはグルコース生成を起こさせる機能を持たせることができ、任意の抗体もしくは抗原を検出することができる。
【００３５】
上記抗体断片とは、少なくともひとつのＦａｂフラグメントを含む抗体断片であって、Ｆａｂフラグメントは免疫グロブリンを酵素のパパインによってＹ形分子の枝の根元から切断することによって得られる。Ｆａｂフラグメントが、脂質の頭部群、炭化水素鎖、両機能形成架橋可能な分子及び膜タンパク質からなる群から選択される支持部に共有結合によって連結されたものが好ましい。
又、レクチンとは、糖鎖を特異的に認識して結合、架橋形成するタンパク質
の総称である。
【００３６】
上記（生）化学的刺激物を透過しうる隔膜としては、特定の（生）化学的刺激物のみを透過しうる（生）化学的刺激物選択透過性隔膜が好ましい。
【００３７】
炭酸ガスを選択的に透過しうる選択透過性隔膜としては、例えば、ポリイミド膜、酢酸セルロース膜、ポリスルホン膜等が挙げられる。グルコース及びその他の多くの分子は透過しうるが、血球や細胞は透過できない選択透過性隔膜としては、例えば、パーフルオロスルフォン酸の重合体膜（例えば、デュポン社製、商品名「ナフィオン」）が知られている。
【００３８】
又、水、イオン及び乳酸塩は透過しうるが、グルコースは透過できないように特定の大きさの細孔を設けた膜も知られている。これは、直径０．６〜０．７４ｎｍの細孔を形成した膜であって、グルコースに対して半透性であると言われている。又、直径０．９ｎｍ台の細孔を形成した、グルコース分子がぎりぎり透過しうる膜も知られている。これらの細孔径を制御する方法としては、ロブスラリーヤン法により非対称膜を作成する方法が確立されている。
【００３９】
刺激応答性ゲルがグルコース感応型刺激応答性ゲルである場合は、（生）化学的刺激物選択透過性隔膜が、グルコース透過性隔膜であることが好ましい。
【００４０】
又、刺激応答性ゲルに、（生）化学的刺激変換反応を引き起こす受容体が固定されていてもよい。この場合、刺激応答性ゲルだけに受容体が固定されていてもよいし、刺激応答性ゲルと上記隔膜の両方に受容体が固定されていてもよい。特に、下記式に示すように検体中の（生）化学的刺激物を捕捉し２段階で（生）化学的刺激反応を行い、刺激応答性ゲルが体積変化するのに適した（生）化学的刺激物に変換する場合には刺激応答性ゲルと隔膜の両方に受容体が固定されているのが好ましい。
【００４１】
【化１】

【００４２】
上記受容体としては、前述の受容体が使用可能である他に、（生）化学的刺激物を内包するマイクロカプセルに結合しており、検出対象物と受容体が結合するとマイクロカプセルが崩壊するようになされて、固定されている受容体も好適に使用され、マイクロカプセルがリポソームであり、（生）化学的刺激物が酵素であり、受容体が抗体であって、補体と共に固定されているのが好ましい。
【００４３】
上記リポソームは、リン脂質等の人工的に合成された脂質膜小胞を意味し、リン脂質としては、動物や微生物などの細胞膜に広く存在するリン脂質、例えば、ホスファチジルエタノールアミン類、ホスファチジルコリン類、ホスファチジルセリン類、スフィンゴミエリン類；天然の卵黄、牛脳や大豆などから得られるホスファチジルコリン等が挙げられる。
【００４４】
上記補体は、補体は動物血清中に含まれる成分で、一般に用いられるモルモット、ウサギ、ブタ、牛、馬などの新鮮血清あるいは人間の血清などあらゆる動物の血清が挙げられが、力価が高く、希釈倍率を著しく高くすることができ（１００〜２００倍）、経済的であるモルモット補体が好ましい。
【００４５】
上記抗体結合リポソームの製造方法は、従来より種々提案されており（例えば、特許文献５参照。）、これら公知の任意の製造方法で製造されればよい。
【００４６】
【特許文献５】
特公平３−１０７５３６号公報
【００４７】
上記抗体結合リポソームは、フリーな抗体と検体とを共存させると、検体中の抗原と、リポソームに結合している抗体と、フリーな抗体とでサンドイッチ型の抗原抗体複合体を形成する。この複合体にて補体が活性化されて、捕体がリポソームを特異的に攻撃破壊する。破壊されたリポソームからは多量の（生）化学的刺激物が流出する。この流出した多量の（生）化学的刺激物が刺激応答性ゲルの体積を変化させるので、検体の検出感度が高くなる。更に、個々のリポソームに内包される（生）化学的刺激物の量の分散値が小さければ、比例性を確保でき検出精度も高くできる。
【００４８】
リポソームに内包する（生）化学的刺激物としては、ゲルが直接応答する（生）化学的刺激物であってもよいし、ゲルが直接応答する（生）化学的刺激物を生成する刺激変換反応に関与する酵素であってもよい。
【００４９】
例えば、グルコース感応型の刺激応答性ゲルに対し、抗体結合リポソームにグルコースを内包することもできるし、抗体結合リポソームにアミラーゼを内包しておいて、グルコース感応型のゲルとデンプンと共に用いてもよい。リポソームにグルコースオキシダーゼを内包しておき、ｐＨ感応型の刺激応答性ゲルとグルコースと共に用いることもできる。検体に対する検出感度の点からは、酵素を内包する方法の方が、酵素反応による増感効果が同時に期待できるので好ましい。
【００５０】
尚、抗体結合リポソームは、立体障害によりホモジニアスな測定系となるので既反応物と未反応物とを分離する洗浄操作、所謂Ｂ／Ｆ分離が不要である。
ウサギ由来の抗体はリポソーム表面に結合させた場合に非特異反応の原因となるために、リポソームに結合させる抗体としてヤギＩｇＧ抗体を且つフリーな抗体としてウサギＩｇＧ抗体を使用する方法が知られている。
【００５１】
しかし，コストの点からは、ウサギ抗体断片Ｆａｂ’をリポソームに結合させ且つフリーな抗体としてウサギＩｇＧ抗体を用いる方法、又は、マウスのモノクローナル抗体断片Ｆａｂ’をリポソームに結合させる抗体として且つフリーな抗体として前記のモノクローナル抗体とは抗原決定認識部位の異なるマウスモノクローナル抗体若しくはウサギＩｇＧ抗体を用いる方法の方が好ましい。
【００５２】
上記リポソームの破壊の理由については明らかでないが、抗原と抗体の複合体が補体を活性化させ、これが連鎖反応を起こすことにより破壊されるものと推定される。
【００５３】
尚、受容体をゲル中又は隔膜に固定化する方法としては、従来公知の任意の方法が採用されてよく、例えば、物理的吸着法、包括固定化法、イオン結合法、共有結合法（架橋法）及びこれらを複数を組み合わせた方法等が挙げられる。
【００５４】
上記指示標識は、一端部が刺激応答性ゲルに接するように通路内に配置されており、刺激応答性ゲルの体積変化により指示標識が通路内を移動するようになされている。
【００５５】
指示標識は通路内を移動しうるものであれば、特に限定されず、金属、合成樹脂、木材、ガラス等の針状体や液体が挙げられるが、精度よく移動し、液柱として視認できる液体が好ましい。尚、液体を使用する場合は、通路の端部の刺激応答性ゲルに接する部分に液溜まりが形成されているのが好ましい。
【００５６】
上記液体としては、例えば、水、アルコール、流動パラフィン、シリコンオイル、油脂、水銀等が上げられ、この液体が刺激応答性ゲルに接触している場合は、刺激応答性ゲルに接触しても刺激応答性ゲルの体積変化をもたらさない液体であることが必要である。
【００５７】
上記液体は、肉眼による検知が容易なように着色されていてもよいし、液体の先端に油相が添付され先端の油相のみが着色されていてもよい。又、屈折率の差により、液体の先端が視認できるように、通路の断面形状が円形や三角形になされていてもよいし、通路の下面に凹凸が形成されていたり、印刷が施されていてもよい。
【００５８】
上記液体が刺激応答性ゲルに接触すると、液体が刺激応答性ゲルに浸潤して体積変化する場合は、刺激応答性ゲルと液体が、ダイヤフラムで隔離されていることが必要である。尚、刺激応答性ゲルに接触しても刺激応答性ゲルの体積変化をもたらさない液体を使用する場合も、刺激応答性ゲルと液体が、ダイヤフラムで隔離されているのが好ましい。
【００５９】
上記ダイヤフラムは、刺激応答性ゲルと指示標識とを隔て、刺激応答性ゲルの体積変化を指示標識に伝える作用を有するものであるので、刺激応答性ゲルの体積変化前面に沿って変位する移動可能なダイヤフラム、弾性を有するダイヤフラム、又は可撓性を有するダイヤフラムが好適に用いられ、例えば、シリコーンゴム膜、ポリウレタン膜、アルミニウム薄膜等が挙げられる。
【００６０】
本発明のセンサの実施形態としては、上記構成要件を満足していれば、特に限定されないが、好ましい実施形態としては、請求項１３記載のセンサが挙げられる。
【００６１】
請求項１３に記載のセンサは、検出対象物を収容する貫通区画が形成された基板（ａ）、貫通区画に（生）化学的刺激物を透過しうる隔膜が嵌合された基板（ｂ）、貫通区画に（生）化学的刺激により体積変化する刺激応答性ゲルが嵌合された基板（ｃ）及び液溜り用凹部とそれに繋がる略直線状の凹部が形成された基板（ｄ）が、各貫通区画と液溜り用凹部が略同一直線上になるように、この順に積層され、基板（ｃ）及び基板（ｄ）により液溜りとそれに繋がる略直線状の通路が形成され、液溜り及び通路に液体が充填されていることを特徴とする。
【００６２】
上記センサを図面を参照して説明する。図１は上記センサの１例を示す分解図であり、図２はセンサの刺激応答性ゲルが膨張した状態（Ａ）と収縮した状態（Ｂ）を示す断面図である。
【００６３】
図中１は、検出対象物を収容する貫通区画１１が形成された基板（ａ）である。２は（生）化学的刺激物を透過しうる隔膜であり、３は隔膜嵌合用の貫通区画３１が形成された基板（ｂ）である。隔膜２は基板（ｂ）の貫通区画３１に嵌合されている。
【００６４】
図中４は、（生）化学的刺激により体積変化する刺激応答性ゲルである。５は刺激応答性ゲル嵌合用の貫通区画５１が形成された基板（ｃ）であり、刺激応答性ゲル４は基板（ｃ）の貫通区画５１に嵌合されている。
【００６５】
６は液溜り用凹部６１とそれに繋がる略直線状の通路用凹部６２が形成された基板（ｄ）である。基板（ａ）、基板（ｂ）、基板（ｃ）及び基板（ｄ）は各貫通区画１１、３１、５１と液溜り用凹部６１が略同一直線上になるように、この順に積層されている。
【００６６】
基板（ｃ）と基板（ｄ）を積層することにより、液溜り用凹部６１の部分に液溜り７が形成され、それに繋がる略直線状の通路用凹部６２の部分に略直線状の通路８が形成される。液溜り７及び通路８には液体９が充填されている。
【００６７】
上記各基板は、紙、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、メチルメタクリレ−ト樹脂、ホトレジスト、ガラス、セラミックス、シリコンウエハ、金属等任意の材料で構成されてよいが、基板（ｄ）は透明性のガラス又は合成樹脂で構成されるのが好ましい。
【００６８】
【作用】
本発明のセンサの構成は上述の通りであるから、全血、リンパ液、血漿、血清、唾液、尿、大便、汗、粘液、涙、髄液、鼻分泌液、頸部または膣の分泌液、精液、胸膜液、羊水、腹水、中耳液、関節液、胃吸引液等の如き生体液を含む殆どの液体試料の分析に利用できる。
又、固体試料又は乾燥試料は、分析に適した液体混合物を与えるのに適した溶媒に溶解して分析できることは当然である。
【００６９】
【実施の形態】
次に、本発明の実施例を説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００７０】
（実施例１）
基板（ｄ）の形成
５００μｍ厚のガラス基板を、加熱した３１％過酸化水素：２９％アンモニア：純水＝１：１：４溶液中及び加熱した純水中で洗浄し、乾燥した後、ポリイミドプレポリマー（東芝ケミカル社製、ＣＴ−４７００）を５００ｒｐｍで３０秒、続けて６０００ｒｐｍで３０秒スピンコーティングし、次いで、オーブン８０℃で１５分間ベーク後、マスクアライナーで９０秒間露光してガラス基板上にポリイミド層を形成した。
【００７１】
ポリイミド層の上に、厚膜フォトレジスト（マイクロケム社製、ＳＵ−８）をスピンコーティングし、９５℃で遮光して５時間ベーキングした後、液溜まりと流路のパターンを描いたフォトマスクを通し、マスクアライナーで３０分露光した。次いで、現像、リンスを行い、液体を充填する液溜り用凹部とそれに繋がる略直線状の通路用凹部が形成されたガラス基板を得た。得られたガラス基板をダイシングソーでチップ状にダイシングし、８ｍｍ×２８ｍｍの大きさに切断して基板（ｄ）を得た。
【００７２】
基板（ｃ）の形成と、基板（ｃ）と基板（ｄ）の積層
厚さ０．５ｍｍのアクリル板を、ダイシングソーで８ｍｍ×２８ｍｍの大きさに切断し、電動ドリルで直径２ｍｍの貫通孔をあけゲル嵌合用の貫通区画を形成して基板（ｃ）を得た。貫通区画の位置は基板（ｄ）の液溜り用凹部と同じ位置にした。
基板（ｂ）上にシリコーンゴム（信越化学工業社製、ＫＥ３４７５Ｔ）を滴下し、４０００ｒｐｍで５秒間スピンコーティングし、基板（ｄ）と重ね合わせて接着し、基板（ｃ）と基板（ｄ）の積層体を得た。
【００７３】
刺激応答性ゲルの作製
５０ｍｌビーカーに純水４０ｍｌを満たし、そこに、モノマーであるＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）を３．５７ｇ、アクリル酸（ＡＡｃ）を２５３ｍｇ、架橋剤としてメチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡＡｍ）を６７．５ｍｇ、促進剤としてテトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＥＤＡ）を２５０μｌ加え、攪拌しながら、このゲル前駆体溶液を窒素置換し、溶存酸素を取り除いた。
【００７４】
酵素（グルコースオキシダーゼ）を５ｍｇ（８００ｕｎｉｔ）とり、５００μｌの純水に溶かした酵素溶液に、上記ゲル前駆体溶液を５００μｌ加え、全体で１ｍｌの溶液とし、少し攪拌した後、０℃で１０分程冷却した。
【００７５】
冷却後、重合開始剤として、ペルオキソニ硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）１ｍｇを加え、更に０℃で２０分程冷却して刺激応答性ゲルを得た。得られた刺激応答性ゲルは５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）中に浸漬し、冷蔵庫（４℃）で保存した。
【００７６】
基板（ｂ）の作成
０．３ｍｍのアクリル板を、ダイシングソーで８ｍｍ×２８ｍｍの大きさに切断し、電動ドリルで直径４ｍｍ程度の貫通孔をあけ、この貫通孔に（生）化学的刺激物選択透過性膜として、パーフルオロスルフォン酸の重合体膜（デュポン社製、商品名「ナフィオン」）を接着剤で固定して貫通孔に（生）化学的刺激物選択透過性膜が嵌合された基板（ｂ）を得た。（生）化学的刺激物選択透過性膜形成部の位置は、実施例で得られた基板（ｄ）の液溜り用凹部と同じ位置にした。
【００７７】
刺激応答性ゲルの封入と基板（ｂ）と積層体の積層
得られた積層体のゲル嵌合用の貫通区画ゲルに、得られた刺激応答性ゲルを嵌合し、基板（ｂ）の一面にシリコーンゴム（信越化学工業社製、ＫＥ３４７５Ｔ）を滴下し、４０００ｒｐｍで５秒間スピンコーティングし、基板（ｂ）と重ね合わせて接着することにより、基板（ｂ）、基板（ｃ）及び基板（ｄ）の３層積層体を得た。
【００７８】
基板（ａ）の作成
厚さ０．３ｍｍのアクリル板のチップに電動ドリルで直径０．６ｍｍの貫通孔を１０〜１６個あけ、検出対象物を収容する貫通区画を形成した。貫通区画の形成位置は、基板（ｄ）の液溜り用凹部と同じ位置にした。
【００７９】
基板（ａ）と３層積層体の積層
基板（ａ）の一面にシリコーンゴム（信越化学工業社製、ＫＥ３４７５Ｔ）を滴下し、４０００ｒｐｍで５秒間スピンコーティングし、基板（ｂ）と重ね合わせて接着し、液溜り７及び通路８に流動パラフィンを注入することにより、本発明のグルコースセンサを得た。
【００８０】
上記刺激応答性ゲルに固定したグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）は、下記式に示すグルコースの酸化反応に触媒作用をおよぼす酵素である。
【００８１】
【化２】

【００８２】
ＧＯＤを包括固定化した刺激応答性ゲルがグルコース溶液に触れると、グルコースが刺激応答性ゲル内に浸透し、上記のような反応をおこす。そして、刺激応答性ゲル内にグルコン酸が生じて溶媒のｐＨが下がる。そのことにより、解離していた高分子鎖のカルボキシル基がプロトン化され、ＮＩＰＡＡｍ鎖間の疎水性相互作用による引力が支配的になり、刺激応答性ゲルが収縮する。
【００８３】
中性の状態で膨潤させておいた刺激応答性ゲルを、グルコースを含むサンプル溶液に接触させると、上記の反応により刺激応答性ゲルは収縮し、この変化は流路内の液体の液柱の変化としてとらえることができるため、この変化からグルコース濃度を求めることができる。尚、ここでは温度を一定にコントロールする必要があるが、これを行うには、センサの刺激応答性ゲル付近を手でつまみ、人間の体温を利用する等の手段が採りうる。
【００８４】
刺激応答性ゲルの収縮挙動は、図３に示したように、忠実に流路中の液柱の変化としてとらえることができる。収縮過渡状態においては、グルコース濃度によりその変化率の明瞭な差が認められるため、時間を定めて液柱の長さを測定すれば、これからグルコース濃度を求めることもできる。
【００８５】
【発明の効果】
本発明のセンサの構成は上述の通りであり、化学物質、特に、血液中、唾液中又は尿中の生体関連物質を迅速かつ簡便に測定することができる。又、小型化でき安価に大量に生産できるのでディスポーザブルセンサとして好適に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のセンサの１例を示す分解図である。
【図２】本発明のセンサの刺激応答性ゲルが膨張した状態（Ａ）と収縮した状態（Ｂ）を示す断面図である。
【図３】濃度の異なる３種類のグルコースを含むサンプル溶液を、実施例１で得られたセンサを用いて測定した、時間と液柱の収縮状態を示すグラフである。
【符号の説明】
１基板（ａ）
１１検出対象物を収容する貫通区画
２（生）化学的刺激物選択透過性膜
３基板（ｂ）
３１（生）化学的刺激物選択透過性膜嵌合用の貫通区画
４刺激応答性ゲル
５基板（ｃ）
５１刺激応答性ゲル嵌合用の貫通区画
６基板（ｄ）
７液溜り
８通路
９液体[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a sensor capable of quickly and easily measuring a biological substance such as blood, saliva, urine, etc., and particularly to a disposable sensor.
[0002]
[Prior art]
Currently, biosensors capable of quantifying some chemical substances have been put to practical use (for example, see Patent Documents 1 and 2). The most widely used of these is the glucose sensor. The main use of glucose sensors is in medical applications, which are widely used for diagnosing diabetic patients.
[0003]
[Patent Document 1]
JP 2003-14687 A
[Patent Document 2]
JP-A-10-262645
[0004]
Since the measurement of blood glucose is very important for the diagnosis of diabetes, a portable blood glucose meter that can be equipped with a disposable blood glucose sensor has already been put into practical use, and this can be easily obtained by ordinary users. .
[0005]
As the disposable blood sugar level sensor, mainly an optical sensor and an electrochemical sensor have been put to practical use. The optical method is based on measuring the absorbance and luminescence of the reaction product before and after the enzymatic reaction. Examples of the electrochemical type include a type in which hydrogen peroxide generated by a reaction represented by the following formula is measured to determine a glucose concentration.
β-D-glucose + O₂→ D-glucono-δ-lactone + H₂O₂
[0006]
In the future, the demand for such a biosensor is expected to increase more and more, and accordingly, it is expected that a more affordable one can be obtained. The commercially available portable blood glucose meter requires the disposable biosensor for measuring blood glucose and an amplifier for amplifying and processing this signal.
[0007]
The sensor chip itself can be obtained relatively inexpensively, but the amplifier is not necessarily so. For this reason, if an amplifier that does not require an amplifier and functions only with a chip can be obtained, the overall price will be significantly lower, and it will be easier to use not only for measuring blood glucose but also urine glucose, for example. It is.
[0008]
Chemical sensors and biosensors are used in many fields such as medicine, the environment, and food, and their importance is increasing more and more in the future. Of these, especially in the medical field, the demand for healthcare and home care is expected to increase in the future.
[0009]
In this field, it is required that users of ordinary households can easily use and measure the blood sugar level or urine sugar level without any complicated operation, and can obtain it at low cost. The same is required in the environmental and food fields.
[0010]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a sensor capable of quickly and easily measuring a chemical substance, particularly a biological substance in blood, saliva or urine.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
The sensor according to claim 1, wherein a diaphragm and a passage are disposed through which a (bio) chemical stimulus can pass through a stimuli-responsive gel that changes in volume by a (bio) chemical stimulus. The indicator is movable in the passage so that one end of the indicator is in contact with the stimuli-responsive gel, and the indicator is moved in the passage by the volume change of the stimuli-responsive gel. It is characterized in that it has been made.
[0012]
The stimulus-responsive gel that changes its volume by the (bio) chemical stimulus is a gel that changes its volume when subjected to biochemical or chemical stimuli such as pH, glucose, adsorption and desorption of chemical substances, and oxidation and reduction. is there.
[0013]
The gel whose volume changes in response to the (bio) chemical stimulus is composed of water or an aqueous electrolyte solution and a polymer, and is obtained by incorporating water or an aqueous electrolyte solution into a polymer network structure. A gel that swells by taking in water and releases and contracts water in response to chemical stimuli.
[0014]
Examples of the polymer that changes in volume in response to the pH change include a crosslinked product of poly (meth) acrylic acid and a metal salt thereof, (meth) acrylic acid and (meth) acrylamide, an N-substituted (meth) acrylamide derivative, hydroxy Crosslinked products of copolymers with ethyl (meth) acrylate, alkyl (meth) acrylate, etc. and their metal salts, maleic acid and (meth) acrylamide, hydroxyethyl (meth) acrylate, alkyl (meth) acrylate, etc. And metal salts thereof, and cross-linked products of polyvinyl sulfonic acid and copolymers of vinyl sulfonic acid with (meth) acrylamide, hydroxyethyl (meth) acrylate, alkyl (meth) acrylate, etc. Cross-linked products, cross-linked products of polyvinyl benzene sulfonic acid and metal salts thereof, vinyl A crosslinked product of a copolymer of benzenesulfonic acid and (meth) acrylamide, hydroxyethyl (meth) acrylate, an alkyl (meth) acrylate, or a metal salt thereof; a crosslinked product of polyacrylamide alkylsulfonic acid or a metal salt thereof; A crosslinked product of a copolymer of acrylamide alkyl sulfonic acid and (meth) acrylamide, hydroxyethyl (meth) acrylate, alkyl (meth) acrylate or the like, a metal salt thereof, a crosslinked product of polydimethylaminopropyl (meth) acrylamide, A crosslinked product of a quaternary salt such as dimethylaminopropyl (meth) acrylamide and (meth) acrylic acid, (meth) acrylamide, hydroxyethyl (meth) acrylate, alkyl (meth) acrylate, or a metal thereof. Salt, quaternary salt, polydim A crosslinked product of a complex of ruaminopropyl (meth) acrylamide and polyvinyl alcohol and a quaternary salt thereof, a crosslinked product of a complex of polyvinyl alcohol and poly (meth) acrylic acid and a metal salt thereof, and a metal salt of carboxyalkylcellulose Examples thereof include crosslinked products, partially hydrolyzed products of crosslinked products of poly (meth) acrylonitrile and metal salts thereof, and copolymers of N-isopropylacrylamide and acrylic acid, and N-isopropylacrylamide, acrylic acid and 1-vinylimidazole Is preferred.
[0015]
The gel composed of the copolymer of N-isopropylacrylamide and acrylic acid is swollen in a neutral region and contracts in an acidic region. On the other hand, a gel composed of a copolymer of N-isopropylacrylamide, acrylic acid and 1-vinylimidazole is in a contracted state in a neutral region and swells in an acidic region and an alkaline region.
[0016]
Also, an interpenetrating network polymer (IPN) of poly (meth) acrylic acid and poly (meth) acrylamide can be used because its volume changes with a change in pH (for example, see Patent Documents 3 and 4). .
[0017]
[Patent Document 3]
U.S. Pat. No. 5,403,893
[Patent Document 4]
U.S. Pat. No. 5,580,929
[0018]
As the polymer whose volume is changed by the glucose, for example, a chemomechanical material in which glucose oxidase is entrapped and immobilized in a network polymer chain obtained by crosslinking a copolymer of N-isopropylacrylamide and acrylic acid is known (for example, , Non-Patent Document 1.).
[0019]
A polymer that changes its volume by a sugar or an antigen and is fixed to a polymer whose volume changes with the above-mentioned pH change by a biomolecular imprinting method using a biomolecule such as lectin or immunoglobulin as a ligand is known (for example, , Non-Patent Document 2).
[0020]
[Non-patent document 1]
Proceedings of the 43rd Annual Meeting of the Society of Polymer Science, 1213 pages (1994)
[Non-patent document 2]
Kansai University Symposium on Advanced Science and Technology (Vol.6th, pp.33-38, 2002)
[0021]
As the polymer whose volume changes due to the adsorption and desorption of the chemical substance, a strong ionic polymer gel is preferable. For example, a crosslinked product of polyvinyl sulfonic acid, vinyl sulfonic acid and (meth) acrylamide, hydroxyethyl (meth) acrylate, ( Cross-linked products of copolymers with alkyl (meth) acrylates, cross-linked products of polyvinyl benzene sulfonic acid and vinyl benzene sulfonic acid with (meth) acrylamide, hydroxyethyl (meth) acrylate, alkyl (meth) acrylate, etc. Cross-linked products of polyacrylamide alkyl sulfonic acid and cross-linked products of acrylamide alkyl sulfonic acid and (meth) acrylamide, hydroxyethyl (meth) acrylate, alkyl (meth) acrylate, etc. Etc. Is, alkyl pyridinium salts, such as those with n- dodecyl pyridinium chloride, alkyl ammonium salts, phenyl ammonium salts, are used by combining a cationic surfactant such as phosphonium salts such as tetraphenylphosphonium chloride.
[0022]
Examples of the polymer whose volume changes by oxidation / reduction include a cationic polymer gel, which is preferably used as a CT complex (charge transfer complex) in combination with an electron accepting compound. Examples of the cationic polymer gel include a crosslinked product of polyamino-substituted (meth) acrylamide such as polydimethylaminopropylacrylamide, polydimethylaminoethyl (meth) acrylate, polydiethylaminoethyl (meth) acrylate, and polydimethylaminopropyl (meth). A crosslinked product of an amino-substituted alkyl ester of poly (meth) acrylic acid such as acrylate, a crosslinked product of polystyrene, a crosslinked product of polyvinylpyridine, a crosslinked product of polyvinylcarbazole, a crosslinked product of polydimethylaminostyrene, and the like. Examples of the electron-accepting compound include benzoquinone, 7,7,8,8-tetracyanoquinodimethane (TCNQ), tetrabutylammonium perchlorate, tetracyanoethylene, chloranil, trinitrobenzene, maleic anhydride and iodine. Can be
[0023]
When the stimulus-responsive gel and the sample come into direct contact, an object other than the measurement target in the sample may come into contact with the stimulus-responsive gel and change the volume of the stimulus-responsive gel. The diaphragm which can penetrate the (bio) chemical stimulus is arranged so that the stimulus-responsive gel does not come into direct contact with the (bio) chemical stimulus in the specimen alone. That is, a diaphragm that can penetrate a (bio) chemical stimulus is disposed at a site that does not contact the passage of the stimuli-responsive gel.
[0024]
The above-mentioned diaphragm which can transmit the (bio) chemical stimulant means the (bio) chemical stimulus which can give the (bio) chemical stimulus such as pH, glucose, adsorption and desorption of the chemical substance, and oxidation / reduction. A polymer film having fine communication holes is generally used.
[0025]
A receptor involved in the (bio) chemical stimulus reaction may be immobilized on the septum permeable to the (bio) chemical stimulus. In this way, the receptor captures the (bio) chemical stimulus in the sample and performs a (bio) chemical stimulus conversion reaction, so that the stimulus-responsive gel changes in volume suitable for the (bio) chemical stimulus. Can be converted into an object, and a biosensor can be obtained.
[0026]
As the receptor, a (bio) chemical stimulus in a sample is captured and a (bio) chemical stimulus reaction is performed, and a stimulus-responsive gel is converted into a (bio) chemical stimulus suitable for volume change. Any conventionally known receptor that can participate in the conversion reaction can be used.
[0027]
For example, when using a stimuli-responsive gel that changes in volume in response to a change in pH, a receptor that catalyzes a reaction involving a change in pH may be mentioned, for example, an enzyme, a microorganism, an antigen, an antibody, an antibody fragment, a lectin, A receptor, an ionophore, a proton pump, a biological membrane, an artificial biological device, a polypeptide, a DNA molecule, an RNA molecule, a protein, a sugar chain, a glycoprotein, a metalloprotein, or a mixture thereof. (For example, see Non-Patent Document 3).
[0028]
[Non-Patent Document 3]
Biosensor (supervised by Masao Karube, CMC Publishing Co., Ltd., first edition of the popular edition published on May 27, 2002)
[0029]
When the substance to be measured is glucose, glucose oxidase or the like is used as the enzyme. In this case, it is preferable that glucose oxidase and gluconolactonase are used in combination. The combined use of glucose oxidase and gluconolactonase further promotes the hydrolysis reaction of D-glucono-δ-lactone to D-gluconic acid.
[0030]
When the substance to be measured is urea, urease is used. Urea is catalyzed by urease to produce ammonia, which raises the pH and changes the volume of the gel.
Based on the glucose sensor, it is also possible to measure various bioreactive substances or biological activities that produce glucose or glucose precursors. For example, by laminating a porous membrane in which water-soluble starch and α-glucosidase are immobilized on the glucose sensor of the present invention, an α-amylase activity sensor can be constituted.
[0031]
Many other bioenzymatic reactions that change pH and bioenzymatic reactions that produce glucose or a glucose precursor are also known (for example, see Non-Patent Document 4).
[0032]
[Non-patent document 4]
Springer Handbook of Enzymes (25 volumes), Springer Publishing
[0033]
When nitrifying bacteria are used as the microorganisms, an ammonia sensor is obtained, and when Escherichia coli is used, a glutamic acid sensor is obtained.
[0034]
When an antigen or an antibody is selected as the receptor, the receptor can have a function of causing a change in pH or producing glucose by a sandwich method using an enzyme-modified antibody, and any antibody or antigen can be detected. .
[0035]
The antibody fragment is an antibody fragment containing at least one Fab fragment, and the Fab fragment is obtained by cleaving an immunoglobulin from the base of a branch of a Y-shaped molecule with the enzyme papain. Preferably, the Fab fragment is covalently linked to a support selected from the group consisting of lipid head groups, hydrocarbon chains, bifunctional crosslinkable molecules and membrane proteins.
Lectins are proteins that specifically recognize sugar chains and bind and crosslink.
Is a generic term for
[0036]
The above-mentioned (bio) chemical stimulus-permeable diaphragm is preferably a (bio) chemical stimulus-selective permeable diaphragm which is permeable only to a specific (bio) chemical stimulus.
[0037]
Examples of the selectively permeable diaphragm capable of selectively permeating carbon dioxide include a polyimide membrane, a cellulose acetate membrane, and a polysulfone membrane. Examples of permselective membranes that are permeable to glucose and many other molecules but impermeable to blood cells and cells include, for example, perfluorosulfonic acid polymer membranes (eg, DuPont, trade name “Nafion”). Are known.
[0038]
Also known are membranes provided with pores of a specific size so that water, ions and lactate are permeable but glucose is not permeable. This is a membrane in which pores having a diameter of 0.6 to 0.74 nm are formed, and is said to be semi-permeable to glucose. Further, a membrane which has pores having a diameter on the order of 0.9 nm and through which glucose molecules can be barely transmitted is also known. As a method of controlling these pore diameters, a method of forming an asymmetric membrane by the Rosbrillian method has been established.
[0039]
When the stimulus-responsive gel is a glucose-sensitive stimulus-responsive gel, the (bio) chemical stimulus selectively permeable diaphragm is preferably a glucose permeable diaphragm.
[0040]
Further, a receptor that causes a (bio) chemical stimulus conversion reaction may be immobilized on the stimulus-responsive gel. In this case, the receptor may be immobilized only on the stimuli-responsive gel, or the receptor may be immobilized on both the stimuli-responsive gel and the diaphragm. In particular, as shown in the following formula, the (bio) chemical stimulant in the sample is captured, and the (bio) chemical stimulus reaction is performed in two steps, and the (bio) chemical suitable for the stimulus-responsive gel to change in volume. When converting to a stimulus, it is preferable that the receptor is fixed to both the stimuli-responsive gel and the diaphragm.
[0041]
Embedded image

[0042]
As the above-mentioned receptor, in addition to the above-mentioned receptor being usable, the microcapsule is bound to a microcapsule containing a (bio) chemical stimulant. Thus, an immobilized receptor is also preferably used, wherein the microcapsules are liposomes, the (bio) chemical stimulant is an enzyme, the receptor is an antibody, and the immobilized with complement is Is preferred.
[0043]
The liposome refers to artificially synthesized lipid membrane vesicles such as phospholipids, and as phospholipids, phospholipids widely present in cell membranes such as animals and microorganisms, for example, phosphatidylethanolamines, phosphatidylcholines, Phosphatidylserines and sphingomyelins; natural egg yolk, phosphatidylcholine obtained from bovine brain, soybean, and the like.
[0044]
The above-mentioned complement is a component contained in animal serum, and includes serum of any animal such as fresh serum of generally used guinea pigs, rabbits, pigs, cows, horses, etc. or human serum. Guinea pig complement is preferred, which is high and can increase the dilution factor significantly (100-200 times) and is economical.
[0045]
Various methods for producing the antibody-bound liposome have been conventionally proposed (see, for example, Patent Document 5), and the method may be produced by any known production method.
[0046]
[Patent Document 5]
Japanese Patent Publication No. 3-107536
[0047]
When the free antibody and the specimen coexist, the antibody-bound liposome forms a sandwich-type antigen-antibody complex with the antigen in the specimen, the antibody bound to the liposome, and the free antibody. The complex activates complement, and the trap specifically attacks and destroys the liposome. A large amount of (bio) chemical stimulant escapes from the disrupted liposomes. A large amount of the (bio) chemical stimulus that has flowed out changes the volume of the stimuli-responsive gel, so that the detection sensitivity of the analyte is increased. Furthermore, if the dispersion value of the amount of (bio) chemical stimulant contained in each liposome is small, the proportionality can be secured and the detection accuracy can be increased.
[0048]
The (bio) chemical stimulant encapsulated in the liposome may be a (bio) chemical stimulus to which the gel directly responds, or a stimulus conversion to generate a (bio) chemical stimulus to which the gel directly responds. It may be an enzyme involved in the reaction.
[0049]
For example, for a glucose-sensitive stimuli-responsive gel, glucose may be encapsulated in the antibody-bound liposome, or amylase may be encapsulated in the antibody-bound liposome and used together with the glucose-sensitive gel and starch. . The liposome may contain glucose oxidase and be used together with a pH-sensitive stimulus-responsive gel and glucose. From the viewpoint of the detection sensitivity for the sample, the method including the enzyme is preferable because the sensitizing effect by the enzyme reaction can be expected at the same time.
[0050]
In addition, since the antibody-bound liposome becomes a homogeneous measurement system due to steric hindrance, a washing operation for separating a reacted substance and an unreacted substance, so-called B / F separation, is unnecessary.
Since a rabbit-derived antibody causes a non-specific reaction when bound to the liposome surface, a method using a goat IgG antibody as an antibody to be bound to the liposome and a rabbit IgG antibody as a free antibody is known. .
[0051]
However, from the viewpoint of cost, a method of binding rabbit antibody fragment Fab ′ to liposome and using rabbit IgG antibody as a free antibody, or a method of binding mouse monoclonal antibody fragment Fab ′ to liposome and free antibody It is more preferable to use a mouse monoclonal antibody or a rabbit IgG antibody having a different antigenic recognition site from the above-mentioned monoclonal antibody.
[0052]
Although the reason for the disruption of the liposome is not clear, it is presumed that the complex of the antigen and the antibody activates complement, which is destroyed by causing a chain reaction.
[0053]
As a method for immobilizing the receptor in the gel or on the diaphragm, any conventionally known method may be employed, for example, a physical adsorption method, an inclusive immobilization method, an ionic bonding method, a covalent bonding method (crosslinking method). Method) and a method combining a plurality of these methods.
[0054]
The indicator is disposed in the passage such that one end thereof is in contact with the stimuli-responsive gel, and the indicator is moved in the passage by a change in volume of the stimuli-responsive gel.
[0055]
The indication sign is not particularly limited as long as it can move in the passage, and examples thereof include needles and liquids such as metal, synthetic resin, wood, and glass. Is preferred. When a liquid is used, it is preferable that a liquid pool is formed at the end of the passage in contact with the stimuli-responsive gel.
[0056]
Examples of the liquid include water, alcohol, liquid paraffin, silicone oil, oil and fat, and mercury. The liquid must not cause a volume change of the responsive gel.
[0057]
The liquid may be colored for easy detection by the naked eye, or an oil phase may be attached to the tip of the liquid and only the oil phase at the tip may be colored. Also, depending on the difference in refractive index, the cross-sectional shape of the passage may be circular or triangular so that the tip of the liquid can be visually recognized, or the lower surface of the passage may be formed with irregularities or printed. Is also good.
[0058]
When the liquid comes into contact with the stimuli-responsive gel and the liquid permeates the stimuli-responsive gel and changes in volume, it is necessary that the stimulus-responsive gel and the liquid be separated by a diaphragm. When a liquid that does not bring about a change in volume of the stimuli-responsive gel even when it comes into contact with the stimuli-responsive gel is used, it is preferable that the stimulus-responsive gel and the liquid are separated by a diaphragm.
[0059]
Since the diaphragm has a function of transmitting the volume change of the stimulus-responsive gel to the indicator marker by separating the stimulus-responsive gel and the indicator marker, the diaphragm can be displaced along the front surface of the volume change of the stimulator-responsive gel. A suitable diaphragm, a diaphragm having elasticity, or a diaphragm having flexibility is suitably used, and examples thereof include a silicone rubber film, a polyurethane film, and an aluminum thin film.
[0060]
An embodiment of the sensor of the present invention is not particularly limited as long as it satisfies the above constitutional requirements, but a preferred embodiment includes a sensor according to claim 13.
[0061]
The sensor according to claim 13, wherein a substrate (a) having a penetrating section for accommodating an object to be detected, and a substrate (b) fitted with a diaphragm capable of transmitting a (bio) chemical stimulus in the penetrating section. A substrate (c) in which a stimulus-responsive gel whose volume changes due to a (bio) chemical stimulus is fitted in the penetrating compartment, and a substrate (d) in which a liquid reservoir recess and a substantially linear recess connected thereto are formed. The through-sections and the recess for liquid pool are stacked in this order so as to be substantially on the same straight line, and the substrate (c) and the substrate (d) form a liquid pool and a substantially linear passage connected to the liquid pool. The passage is filled with a liquid.
[0062]
The sensor will be described with reference to the drawings. FIG. 1 is an exploded view showing one example of the sensor, and FIG. 2 is a cross-sectional view showing a state in which the stimulus-responsive gel of the sensor is expanded (A) and contracted (B).
[0063]
In the figure, reference numeral 1 denotes a substrate (a) on which a through section 11 for accommodating a detection target is formed. Reference numeral 2 denotes a diaphragm that can transmit a (bio) chemical stimulus, and reference numeral 3 denotes a substrate (b) on which a through-section 31 for fitting the diaphragm is formed. The diaphragm 2 is fitted in the through section 31 of the substrate (b).
[0064]
In the figure, reference numeral 4 denotes a stimulus-responsive gel whose volume changes due to (bio) chemical stimulus. Reference numeral 5 denotes a substrate (c) on which a penetration section 51 for fitting a stimulus-responsive gel is formed, and the stimulation-responsive gel 4 is fitted into the penetration section 51 of the substrate (c).
[0065]
Reference numeral 6 denotes a substrate (d) in which a liquid reservoir recess 61 and a substantially linear passage recess 62 connected thereto are formed. The substrate (a), the substrate (b), the substrate (c), and the substrate (d) are laminated in this order such that the through

sections

11, 31, and 51 and the recess 61 for liquid pool are substantially on the same straight line. .
[0066]
By laminating the substrate (c) and the substrate (d), the liquid reservoir 7 is formed at the liquid reservoir concave portion 61, and the substantially linear passage 8 is formed at the substantially linear passage concave portion 62 connected thereto. It is formed. A liquid 9 is filled in the liquid reservoir 7 and the passage 8.
[0067]
Each of the above substrates may be made of any material such as paper, polyethylene resin, polypropylene resin, methyl methacrylate resin, photoresist, glass, ceramics, silicon wafer, and metal, but the substrate (d) is made of transparent glass. Or it is preferable to be composed of a synthetic resin.
[0068]
[Action]
Since the configuration of the sensor of the present invention is as described above, whole blood, lymph, plasma, serum, saliva, urine, stool, sweat, mucus, tears, spinal fluid, nasal secretion, cervical or vaginal secretion, It can be used to analyze most liquid samples including biological fluids such as semen, pleural fluid, amniotic fluid, ascites fluid, middle ear fluid, synovial fluid, gastric aspirate and the like.
Of course, a solid or dried sample can be dissolved in a solvent suitable for providing a liquid mixture suitable for analysis and analyzed.
[0069]
Embodiment
Next, examples of the present invention will be described, but the present invention is not limited to the following examples.
[0070]
(Example 1)
Formation of substrate (d)
A glass substrate having a thickness of 500 μm is washed in a heated 31% hydrogen peroxide: 29% ammonia: pure water = 1: 1: 4 solution and in heated pure water, dried, and then dried with a polyimide prepolymer (Toshiba Chemical Co., Ltd.). Co., Ltd., CT-4700) was spin-coated at 500 rpm for 30 seconds, and subsequently at 6000 rpm for 30 seconds, then baked in an oven at 80 ° C. for 15 minutes, and exposed to a mask aligner for 90 seconds to form a polyimide layer on a glass substrate. .
[0071]
A thick-film photoresist (SU-8, manufactured by MicroChem) is spin-coated on the polyimide layer, baked at 95 ° C. in a light-shielded state for 5 hours, and then a photomask depicting a pattern of a liquid pool and a flow path is formed. Then, exposure was performed for 30 minutes with a mask aligner. Next, development and rinsing were performed to obtain a glass substrate in which a recess for filling a liquid and a substantially straight recess for a passage connected to the recess were formed. The obtained glass substrate was diced into chips using a dicing saw and cut into a size of 8 mm × 28 mm to obtain a substrate (d).
[0072]
Formation of substrate (c) and lamination of substrate (c) and substrate (d)
An acrylic plate having a thickness of 0.5 mm was cut into a size of 8 mm × 28 mm with a dicing saw, a through hole having a diameter of 2 mm was formed with an electric drill, and a through section for gel fitting was formed to obtain a substrate (c). . The position of the penetrating section was the same as the position of the liquid pool recess of the substrate (d).
Silicone rubber (KE3475T, manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) was dropped on the substrate (b), spin-coated at 4000 rpm for 5 seconds, superposed and adhered to the substrate (d), and the substrate (c) and the substrate (d) were adhered. A laminate was obtained.
[0073]
Preparation of stimuli-responsive gel
A 50 ml beaker is filled with 40 ml of pure water, into which 3.57 g of a monomer, N-isopropylacrylamide (NIPAAm), 253 mg of acrylic acid (AAc), and 67.5 mg of methylene bisacrylamide (MBAAm) as a crosslinking agent are promoted. 250 μl of tetramethylethylenediamine (TMEDA) was added as an agent, and while stirring, this gel precursor solution was replaced with nitrogen to remove dissolved oxygen.
[0074]
5 mg (800 units) of an enzyme (glucose oxidase) was taken, and 500 μl of the above gel precursor solution was added to an enzyme solution dissolved in 500 μl of pure water to make a 1 ml solution as a whole. After stirring a little, the mixture was stirred at 0 ° C. for about 10 minutes. Cool.
[0075]
After cooling, 1 mg of ammonium peroxodisulfate (APS) was added as a polymerization initiator, and the mixture was further cooled at 0 ° C. for about 20 minutes to obtain a stimuli-responsive gel. The obtained stimuli-responsive gel was immersed in a 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0) and stored in a refrigerator (4 ° C.).
[0076]
Preparation of substrate (b)
An acrylic plate of 0.3 mm is cut into a size of 8 mm x 28 mm with a dicing saw, and a through hole having a diameter of about 4 mm is formed with an electric drill. A polymer membrane of perfluorosulfonic acid (trade name “Nafion” manufactured by DuPont) is fixed with an adhesive, and the substrate (b) in which the (bio) chemical stimulant selective permeable membrane is fitted in the through hole is used. Obtained. The position of the (bio) chemical stimulus selective permeable membrane forming portion was the same as the position of the liquid reservoir recess of the substrate (d) obtained in the example.
[0077]
Encapsulation of stimuli-responsive gel and lamination of substrate (b) and laminate
The obtained stimulus-responsive gel was fitted to the gel for gel penetration of the obtained laminate, and silicone rubber (manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd., KE3475T) was dropped on one surface of the substrate (b) to 4000 rpm. For 5 seconds, and superimposed on and bonded to the substrate (b) to obtain a three-layer laminate of the substrate (b), the substrate (c) and the substrate (d).
[0078]
Preparation of substrate (a)
10 to 16 through-holes having a diameter of 0.6 mm were drilled in a chip of an acrylic plate having a thickness of 0.3 mm with an electric drill to form a penetration section for accommodating the detection target. The formation position of the penetrating section was the same position as the liquid pool recess of the substrate (d).
[0079]
Lamination of substrate (a) and three-layer laminate
Silicone rubber (KE3475T, manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) is dropped on one surface of the substrate (a), spin-coated at 4000 rpm for 5 seconds, superposed and adhered to the substrate (b), and liquid paraffin is added to the liquid reservoir 7 and the passage 8. Was injected to obtain a glucose sensor of the present invention.
[0080]
Glucose oxidase (GOD) immobilized on the stimulus-responsive gel is an enzyme that catalyzes an oxidation reaction of glucose represented by the following formula.
[0081]
Embedded image

[0082]
When the stimulus-responsive gel on which GOD is immobilized and immobilized comes into contact with the glucose solution, glucose permeates into the stimulus-responsive gel and causes the above-described reaction. Then, gluconic acid is generated in the stimuli-responsive gel, and the pH of the solvent drops. As a result, the carboxyl group of the polymer chain that has been dissociated is protonated, the attractive force due to the hydrophobic interaction between the NIPAAm chains becomes dominant, and the stimulus-responsive gel contracts.
[0083]
When the stimuli-responsive gel that has been swollen in a neutral state is brought into contact with a sample solution containing glucose, the stimuli-responsive gel contracts due to the above reaction, and this change is caused by the liquid column of the liquid in the flow channel. Since the change can be regarded as a change, the glucose concentration can be obtained from the change. Here, it is necessary to control the temperature to be constant. To do this, it is possible to take a means such as grasping the vicinity of the stimulus-responsive gel of the sensor by hand and utilizing the human body temperature.
[0084]
The shrinkage behavior of the stimuli-responsive gel can be faithfully grasped as a change in the liquid column in the flow channel, as shown in FIG. In the contraction transient state, a clear difference in the rate of change is recognized depending on the glucose concentration. Therefore, if the time is determined and the length of the liquid column is measured, the glucose concentration can be determined from this.
[0085]
【The invention's effect】
The configuration of the sensor of the present invention is as described above, and it is possible to quickly and easily measure a chemical substance, particularly, a biological substance in blood, saliva, or urine. Further, since it can be miniaturized and mass-produced at low cost, it can be suitably used as a disposable sensor.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an exploded view showing an example of a sensor according to the present invention.
FIG. 2 is a cross-sectional view showing the stimulus-responsive gel of the sensor of the present invention in an expanded state (A) and in a contracted state (B).
FIG. 3 is a graph showing time and a contraction state of a liquid column, which are measured using a sensor obtained in Example 1 for a sample solution containing three kinds of glucoses having different concentrations.
[Explanation of symbols]
1 Substrate (a)
11 Penetration section that accommodates detection target
2 (bio) chemical stimulant permselective membrane
3 Substrate (b)
31 Penetration compartment for fitting of (bio) chemical stimulus permselective membrane
4 Stimuli-responsive gel
5 Substrate (c)
51 Penetrating compartment for fitting stimuli-responsive gel
6. Substrate (d)
7 pool
8 passage
9 liquid

Claims

A sensor in which a (bio) chemical stimulus is permeated through a stimuli-responsive gel that changes in volume by a (bio) chemical stimulus and a passage is arranged, and the passage is provided with a movable indicator. The indicator is arranged in the passage such that one end thereof is in contact with the stimuli-responsive gel, and the indicator is moved in the passage by a change in volume of the stimuli-responsive gel. Sensor.

2. The sensor according to claim 1, wherein the stimulus-responsive gel is composed of N-isopropylacrylamide-acrylic acid copolymer or N-isopropylacrylamide-1-vinylimidazole-acrylic acid copolymer and water.

The sensor according to claim 1, wherein the indication marker is a liquid that does not cause a change in volume of the stimuli-responsive gel even when the indicator contacts the stimuli-responsive gel.

The sensor according to claim 3, wherein the liquid is colored.

The stimulus-responsive gel and the indicator are separated by a movable diaphragm, an elastic diaphragm, or a flexible diaphragm displaced along the volume-changing front surface of the stimulus-responsive gel. Item 5. The sensor according to any one of Items 1 to 4.

The sensor according to any one of claims 1 to 5, wherein a receptor involved in a (bio) chemical stimulus conversion reaction is immobilized on the diaphragm.

The sensor according to claim 1, wherein the diaphragm is a (bio) chemical stimulus permselective diaphragm.

The sensor according to claim 7, wherein the (bio) chemical stimulus selectively permeable diaphragm is a glucose permeable diaphragm, and the stimuli-responsive gel is a glucose-sensitive stimuli-responsive gel.

The sensor according to any one of claims 1 to 8, wherein a receptor involved in a (bio) chemical stimulus conversion reaction is immobilized on the stimulus-responsive gel.

The receptor is bound to a microcapsule containing a (bio) chemical stimulus, and the microcapsule is disintegrated and fixed when the detection target binds to the receptor. Item 10. The sensor according to Item 9.

11. The sensor according to claim 10, wherein the microcapsules are liposomes, the (bio) chemical stimulant is an enzyme, the receptor is an antibody, and is fixed together with complement.

Receptors are enzymes, microorganisms, antigens, antibodies, antibody fragments, lectins, receptors, ionophores, proton pumps, biological membranes, artificial bioelements, DNA molecules, RNA molecules, proteins, sugar chains, glycoproteins, metalloproteins The sensor according to claim 6, 9 or 10, wherein the sensor is one selected from the group consisting of: or a mixture thereof.

A substrate (a) having a penetrating section for accommodating an object to be detected, a substrate (b) fitted with a diaphragm capable of transmitting a (bio) chemical stimulus in the penetrating section, and a (bio) chemical in the penetrating section. A substrate (c) fitted with a stimuli-responsive gel whose volume changes due to stimulation and a substrate (d) formed with a recess for liquid pool and a substantially linear recess connected thereto are formed by each of the through-sections and the recess for liquid pool. The layers are stacked in this order so as to be substantially on the same straight line, and a liquid reservoir and a substantially linear passage connected thereto are formed by the substrate (c) and the substrate (d), and the liquid is filled in the liquid reservoir and the passage. A sensor characterized by the above-mentioned.