JP2004298159A

JP2004298159A - Ribosome reproduction inhibitory factor and composition containing the same as active ingredient

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Publication number: JP2004298159A
Application number: JP2003098332A
Authority: JP
Inventors: Yuji Kobayashi; 祐次小林
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2003-04-01
Filing date: 2003-04-01
Publication date: 2004-10-28

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a ribosome reproduction inhibitory factor and its derivative maintaining such characteristics, acting as an inhibitor of the ribosome regeneration, capable of inhibiting the growth of bacteria and exhibiting the damaging effect against the living or propagation of procaryotes, and a composition containing the same as an active ingredient, having less adverse effects to human beings, etc., and characterized by enabling various forms or administering methods by containing medicinal components. SOLUTION: This inhibitory factor is a mutant of the ribosome regenerating factor and is characterized by having a regeneration inhibitory activity against the ribosome of the procaryotes. COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、リボソーム再生阻害因子に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、原核生物の生存または増殖に障害効果を奏するリボソーム再生阻害因子を有効成分とする組成物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
リボソーム再生因子（ＲＲＦ）は、伸長因子Ｇ（ＥＦ−Ｇ）とともにリボソーム再生過程において中心的な役割を果たす分子量２１ｋＤａのタンパク質であり、タンパク質の生合成装置であるリボソームに作用して、使用済みリボソームを分解・再生する役割を果たしていることが知られている。ＲＲＦはタンパク質生合成の終結反応後には、７０Ｓリボソーム、脱アシル化ＲＮＡおよびｍＲＮＡからなるポストターミネーションコンプレックスが残っている。ＲＲＦは次のタンパク質生合成サイクルにむけてそれを解離・再生するために必須である。なお、図７に上記のリボソーム再生の過程を模式的に例示した。
【０００３】
また、図８に、Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓＲＲＦのアミノ酸配列と公知である他菌種のＲＲＦのアミノ酸配列との比較を例示した。この図８に例示したとおり、いずれのＲＲＦにおいても、約１８５個のアミノ酸残基を含んでおり、全てのＲＲＦと高い相同性も有している。
【０００４】
そして、このＲＲＦは古細菌を除く全ての生物に存在しており、特に細菌類の生存には必須である。このことから、ＲＲＦの作用を阻害する薬剤は新しい抗菌剤や抗生物質になる可能性がある。特に、このＲＲＦについては、ヒトなどの真核生物に副作用を及ぼさず、バクテリア（原核細菌）にのみ自殺的に働く薬剤を設計し、スクリーニングするための標的分子になることが注目されている。
【０００５】
以上のようなＲＲＦについては、その構造の解明が大きな課題であったが、最近、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｍａｒｉｔｉｍａ（高度好熱菌）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（大腸菌）、Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（好熱菌）、およびＡｑｕｉｆｅｘａｅｏｌｉｃｕｓ（高度好熱菌）由来ＲＲＦの立体構造が、Ｘ線結晶構造解析法およびＮＭＲ法によって決定された。その結果、ＲＲＦは、αヘリックスバンドルからなるドメインＩと、β／α／βサンドイッチのβシート構造からなるドメインＩＩとの２種類のドメインからなっていることが判明した。その模式図を図９および図１０に例示した。図９は、Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓＲＲＦ構造の模式図である。図１０は、Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＡ．ａｅｏｌｉｃｕｓの各菌種由来のＲＲＦ構造をそれぞれ比較例示した模式図である。図１０に例示したとおり、各菌種由来のＲＲＦの立体構造は相互に類似しており、機能等においても類似することが推測される。このように、立体構造が明らかになったことから、その情報に基づいてＲＲＦと特異的に結合し、ＲＲＦの機能を阻害する物質の設計、創出や探索に試みられてきたが、未だその成功例は報告されていない。
【０００６】
そこで、この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、ＲＲＦの機能を阻害するリボソーム再生阻害因子を設計・創出し、このリボソーム再生阻害因子を有効成分とすることを特徴とする原核生物の生存または増殖に障害効果を奏する組成物を提供することを課題としている。
【０００７】
またこの出願の発明は、薬学的成分を含有することにより様々な形状、投与方法が可能とすることを特徴とする前記の組成物を提供する。
【０００８】
【非特許文献１】
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら著、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、１９８９
【非特許文献２】
Ｋｕｒｏｓａｗａ，Ｋ．ら著、ＧｅｎｏｍｅＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、ｖｏｌ．９、ｐ１６４−１６５、１９９８
【非特許文献３】
Ｈｉｒａｓｈｉｍａ，Ａ．およびＫａｊｉ，Ａ．著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、ｖｏｌ６５、ｐ４６−５８、１９７２
【非特許文献４】
Ｎａｖａｚａ，Ｊ著、ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、Ａ５０、ｐ１５７−１６３、１９９４
【非特許文献５】
Ｎａｋａｎｏ，Ｈ．ら著、ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、Ｄ５８、ｐ１２４−１２６、２００２
【非特許文献６】
Ｂｒｕｎｇｅｒ，Ａ．Ｔ．、Ｘ−ＰＬＯＲＶｅｒｓｉｏｎ３．１、ＡＳｙｓｔｅｍｆｏｒＸ−ｒａｙＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙａｎｄＮＭＲ、ＹａｌｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、１９９２
【非特許文献７】
Ｂｒｕｎｇｅｒ，Ａ．Ｔ．ら著、ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、Ｄ５０、ｐ７６０−７６３、１９９４
【非特許文献８】
Ｃａｍｂｉｌｌａｕ，Ｃ．ら著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈ．、ｖｏｌ２、ｐ５３−５４、１９８４
【０００９】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、前記の課題を解決するための第１の発明として、リボソーム再生因子の変異体であって、原核生物のリボソームに対して再生阻害活性を有することを特徴とするリボソーム再生阻害因子を、第２には、リボソーム再生因子が、ドメインＩ（Ａ）−ドメインＩＩ−ドメインＩ（Ｂ）からなるリボソーム再生阻害因子を提供する。
【００１０】
またこの出願の発明は、第３には、変異体が、ドメインＩＩの一部または全部を欠失しているリボソーム再生阻害因子を提供し、第４には、変異体が、ドメインＩＩの一部または全部を１個以上のアミノ酸残基に置換しているリボソーム再生阻害因子を、第５には、アミノ酸残基が、１から５個のグリシン残基からなるリボソーム再生阻害因子を提供する。
【００１１】
さらにこの出願の発明は、第６には、配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を、第７には、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ断片を提供し、第８には、前記第１の発明から第５の発明のいずれかのリボソーム再生阻害因子コード配列を有する発現カセットを備えたリボソーム再生阻害因子発現ベクターを、第９には、前記第６の発明のＤＮＡ断片を有する発現カセットを備えたリボソーム再生阻害因子発現ベクターを、第１０には、前記第７の発明のＤＮＡ断片を有する発現カセットを備えたリボソーム再生阻害因子発現ベクターを提供し、第１１には、前記第８の発明から第１０の発明のいずれかの発現ベクターによって発現されるリボソーム再生阻害因子を提供する。
【００１２】
第１２には、原核生物の生存または増殖に障害効果を奏する組成物であって、前記第１の発明から第５の発明のいずれか、または第１１の発明のリボソーム再生阻害因子を有効成分として含む組成物を、第１３には、原核生物が、細菌類である組成物を、第１４には、薬学的成分を含む組成物を提供する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について説明する。
【００１４】
リボソーム再生因子（以下、ＲＲＦとする）は、リボソーム再生過程において中心的な役割を果たすタンパク質である。タンパク質の生合成装置であるリボソームに作用して、使用済みリボソームを分解・再生する役割を果たしており、特に原核生物（細菌類等）の生存に必須である。そのため、細菌類に対する生存・増殖の阻害効果が期待できるＲＲＦのリボソーム再生活性を阻害するＲＲＦ変異体を作製した。この出願の発明におけるＲＲＦは、αへリックスバンドル構造からなるドメインＩとβ／α／β構造からなるドメインＩＩとの２種類のドメイン構造から構成されているものが好ましい。発明者らは、このＲＲＦのドメインＩが有する特異的なαヘリックスバンドル構造に注目した。ＲＲＦは１８５残基のアミノ酸からなるが、ドメインＩはアミノ酸配列上Ｎ末端から３０残基（領域Ｉ−Ｎ）とＣ末端から８０残基（領域Ｉ−Ｃ）の２つの離れた領域から形成され、この２つのドメインＩ間にドメインＩＩが存在している（すなわち、ドメインＩ（Ａ）−ドメインＩＩ−ドメインＩ（Ｂ）の構造）。したがって、アミノ酸配列上の特定の領域を切断したり、部分的に合成したりする方法では、ドメインＩの部分を取り出すことは、現時点では困難である。なお、この出願の発明における、「ドメインＩ（Ａ）」とは、前記領域Ｉ−Ｎを、「ドメインＩ（Ｂ）」とは、前記領域Ｉ−Ｃをそれぞれ示す。また、天然由来のＲＲＦの構造は、前記のとおりドメインＩ（Ａ）−ドメインＩＩ−ドメインＩ（Ｂ）の構造を形成しているが、たとえば、ドメインＩ（Ａ）−ドメインＩ（Ｂ）−ドメインＩＩ、あるいはドメインＩＩ−ドメインＩ（Ａ）−ドメインＩ（Ｂ）等のような構造を有したＲＲＦを人工的に作製し、この出願の発明に用いてもよい。
【００１５】
そこで、発明者らは、ドメインＩの領域Ｉ−Ｎ（ドメインＩ（Ａ））のＣ末端部分と領域Ｉ−Ｃ（ドメインＩ（Ｂ））のＮ末端部分が空間的に近い（約１０Å）ことに着眼して、ドメインＩ（Ａ）およびドメインＩ（Ｂ）の両者を連結するため、ドメインＩＩの一部または全部を１個以上のアミノ酸残基で置換したアミノ酸配列を設計し、リボソーム再生因子の変異体を作製した。このアミノ酸残基の種類や長さ等は、この出願の発明の効果を発揮することができるのであれば、適宜に選択・改変することができるが、３個のグリシン残基が特に好ましい。もちろん、この出願の発明は、ドメインＩＩの一部または全部を欠失させた変異体とすることやドメインＩＩの任意箇所に１個以上のアミノ酸残基を付加させた変異体としてもよいが、前記のような置換変異体が好ましい。また、これら変異体は、この出願の発明の効果であるリボソームとの親和性およびリボソームの再生阻害効果を有するのであれば、ドメインＩ（Ａ）（Ｂ）の一部を欠失または置換させた変異体としてもよい。
【００１６】
なお、上記のようないずれの付加変異体または置換変異体においての付加物質または、置換物質はアミノ酸に限定されない。
【００１７】
これら変異体（すなわち、リボソーム再生阻害因子（以下、ＲＲＦ−ＤＩとする））は、ＲＲＦ−ＤＩをコードするＤＮＡ断片（たとえば、配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片や配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ断片）を有した発現カセットを備えた発現ベクターを大腸菌等に導入することによって、大量、かつ、簡便に製造することができる。しかも、菌体から回収したこのＲＲＦ−ＤＩは高純度で収率良く、精製することができる。得られたＲＲＦ−ＤＩは、円偏光二色性測定（ＣＤ）によって、ＲＲＦ−ＤＩは、野生型ＲＲＦのドメインＩと同様の立体構造を保持していることが確認され、またＲＲＦ−ＤＩのリボソーム再生活性およびリボソーム結合能を、ポリソーム分解アッセイおよび表面プラスモン共鳴センサーにより測定したところ、ＲＲＦ−ＤＩは野生型ＲＲＦと同様にリボソームと結合できることが確認された。その一方で、ＲＲＦ−ＤＩはリボソーム再生活性が失われていた。すなわち、ＲＲＦ−ＤＩは野生型ＲＲＦと競合的にリボソームと結合し、ＲＲＦの活性を妨害すると考えられた。実際、ＲＲＦ−ＤＩの共存下において野生型ＲＲＦのリボソーム結合およびリボソーム再生活性を阻害することを確認した。
【００１８】
この出願の発明における「発現ベクター」は、リボソーム再生阻害因子コード配列を有する発現カセットをベースベクター内に挿入結合することによって作製することができる。したがって、発現カセットは、ベースベクターの任意のクローニングサイトに対応した制限酵素配列を有することが好ましい。「ベースベクター」は、たとえば動物細胞用ベクター、昆虫細胞用ベクター、酵母用ベクター、大腸菌用ベクター、また酵母・大腸菌等といった複数種用のシャトルベクター等の種々のベースベクターがあるが、これらベースベクターは宿主細胞や目的に応じて適宜に選択することができる。また、適当な宿主細胞で外来タンパク質を発現させるための既存のベクターＤＮＡを一部改変して使用することもできる。たとえば、宿主細胞として大腸菌等の微生物を利用する場合には、オリジン、プロモータ、ターミネータ等を有するｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩやｐＥＴ系システム等が使用することができる。
【００１９】
原核生物は、上記のとおり生存や成長、増殖にＲＲＦの作用が必要であるため、リボソーム再生活性を阻害する効果を有するＲＲＦ−ＤＩは、原核生物の生存や成長、増殖に対しての障害効果が期待できる。すなわち、ＲＲＦ−ＤＩを有効成分として含有させた組成物は、抗菌剤や抗生物質として利用することができる。
【００２０】
「原核生物」とは、細菌類等が例示できる。この出願の発明のＲＲＦ−ＤＩは、特に細菌類のＲＲＦの阻害活性が高いため、標的対象は細菌類であることが好ましい。また「細菌類」とは、マイコプラズマや光合成細菌、大腸菌をはじめ、Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓやＡ．ａｅｏｌｉｃｕｓ等が例示できる。そして、ＲＲＦは、真核生物の細胞質におけるタンパク質合成には関与していないため、この出願の発明のＲＲＦ−ＤＩによる真核生物に対する影響は少ないと考えられる。すなわち、ＲＲＦ−ＤＩを有効成分とし、かつ、薬学的成分を含ませた組成物は、薬剤（抗菌剤、抗生物質）としてヒト等に投与しても副作用が少ないことが期待できる。
【００２１】
「薬学的成分」とは、一般に薬剤製造に利用される各種の担体であり、担体は薬剤の種類や注射や経口等の投与形態等に応じて、適宜に選択できる。たとえば、懸濁剤やシロップ剤等のような経口液体状の薬剤は、水、シュクロース等の糖類、ポリエチレングリコール等のグリコール類、ごま油や大豆油等の油類、その他、防腐剤、ペパーミント等の各種フレーバー類等を使用して製造することができる。また、散剤や丸剤、カプセル剤および錠剤は、ラクトース、グルコース、シュクロース等の賦形剤、デンプン等の崩壊剤、マグネシウムステアレート等の潤沢剤、また各種結合剤や表面活性剤、可塑剤等を用いて製剤化することができる。
【００２２】
以下に実施例（Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ由来のＲＲＦからＲＲＦ−ＤＩを作製）を示し、さらに詳しくこの出願の発明について説明する。もちろん、以下の例によってこの出願の発明が限定されることはない。すなわち、Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ以外の菌種由来（たとえば、Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓやＡ．ａｅｏｌｉｃｕｓ等）のＲＲＦからでもＲＲＦ−ＤＩを作製することができる。
【００２３】
【実施例】
（実施例１）大腸菌株、プラスミドおよび培養条件
Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ株ＫＸＶ２３７（Ｏ３：Ｋ６）をモレキュラークローニングに用いた。大腸菌株ＤＨ５αは、クローニングしたプラスミドＤＮＡの宿主菌株として用いた。大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）は、タンパク質発現に利用した。Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地（Ｎａｋａｌａｉｔｅｓｑｕｅ社）は、細菌培養の液体培地および１．５％の寒天培地に使用し、培養した。なお、これら培地には、１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを添加した。
（実施例２）モレキュラークローニング
Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓＲＲＦＤＮＡ（ｆｒｒ）クローンを選択するため、大腸菌ｆｒｒ断片の一部をＤＮＡプローブとして用いた。このＤＮＡプローブの標識にＤＩＧシステム（Ｒｏｃｈｅ社）を利用した。プライマー（配列番号５および配列番号６）を用いたＰＣＲにて、大腸菌ＲＲＦのＭｅｔ１３−Ｇｌｕ１７９残基をコードするＤＮＡ断片を設計・増幅させた。大腸菌ｆｒｒを保有しているｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を、このＰＣＲにおける鋳型として用いた。
【００２４】
Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓＫＸＶ２３７のゲノムＤＮＡにおけるＮｏｔＩ断片は、前記のプローブとハイブリダイズした。ＩＩｄａ，Ｔ．らによって、以前に報告された、ゲル電気泳動法を行い、次いでサザンブロッティングハイブリダイゼーション法を利用した。約１６８ｋｂｐの発光断片を収集し、ＰｓｔＩで酵素処理を行った。酵素処理を行って得られた試料は、アガロースゲル（０．８％）による電気泳動法に用いられ、再びハイブリダイゼーションを行った。４．１ｋｂｐのＰｓｔＩ断片を収集し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（−）（Ｔｏｙｏｂｏ社）のＰｓｔＩサイトに挿入した。
【００２５】
４．１ｋｂｐＰｓｔＩ断片の制限地図は、公知の方法（非特許文献１）にしたがって作成した。１．２ｋｂｐの断片のＳｐｅＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩサイト間には、ｆｒｒ遺伝子が含まれている。この断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（−）ベクター内に組込み、再構築し、シークエンシングを行った。ＤＮＡシークエンシングには、蛍光色素プライマー法を用いて、自動ＤＮＡシークエンサー（Ｓｈｉｍａｄｚｕ社）によって行った。ＤＮＡ配列は、ＧｅｎｅＷｅｂＩＩプログラム（非特許文献２）にて解析し、目的のＤＮＡ配列であることが確認することができた。
【００２６】
このＶ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓｆｒｒを含んだ１．２ｋｂｐあるＳｐｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片は、一つの大きなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のみを有しており、またこの断片のＯＲＦの上流にはプリブナウ配列、−３５エレメントおよびＳＤ配列も含まれていた。このＯＲＦは、１８５アミノ酸で構成されるタンパク質をコードする５５５ｂｐで構成されていた。分子量は、２０５７０．４５であった。Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓと大腸菌ＲＲＦ間での相同性はアミノ酸レベルで７０．１％であった。なお、Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓｆｒｒのＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｕｍｂｅｒＡＢ０６４３１９）にて、データベース化されており、公知である。
（実施例３）ＲＲＦ−ＤＩ（大腸菌ドメインＩ）の構築
ＲＲＦのドメインＩの役割を明らかにするため、発明者らは、大腸菌ＲＲＦ、すなわちドメインＩに相当する、Ｍｅｔ１−Ｇｌｙ３０の領域およびＴｈｒ１０６−Ｐｈｅ１８５の領域からなる組換えタンパク質をコードする発現ベクターを構築した。この２つの領域は、グリシン残基によって構成された柔軟性を有するリンカーによって、連結されている。大腸菌Ｒ１３２Ｇ変異体における予備試験の結果では、Ｇｌｙ３０およびＴｈｒ１０６間の距離は、９．８Åであった。そのため、前記の２つの領域を連結するためには、３つのグリシン残基を用いた。発現ベクター（（１−３０）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−（１０６−１８５））は、大腸菌ＲＲＦを保有したプラスミドｐＥＴ２２ｂ（＋）を鋳型として用いて、ＰＣＲによって合成された。２種類のオリゴヌクレオチド（配列番号３および配列番号４）をプライマーとして用いた。このドメインＩを連結した試料を「ＲＲＦ−ＤＩ」とした。なお、タンパク質発現を行う前に、ＲＲＦ−ＤＩのＤＮＡ配列を解析した結果、ＲＲＦ−ＤＩであることが確認することができた。
【００２７】
図１は、この出願の発明のＲＲＦ−ＤＩの模式図であり、ドメインＩ（Ａ）（Ｂ）間を連結させている３つのグリシン残基を模式的に例示した。また、図２は、ＲＲＦ−ＤＩの発現プラスミドの作製手順の概略を例示した模式図である。
【００２８】
ほとんどのＲＲＦは、前記の図８に例示したとおり、１８５のアミノ酸を含んでいる。そして、このアミノ酸残基は他菌種において保存されているものは、Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓＲＲＦにおいても保存されており、全てのＲＲＦと高い相同性を有している（たとえば、大腸菌では７０．１％、緑膿菌では６３．２％、黄色ブドウ球菌では４５．４％、高度好熱菌では４２．７％）。このような高い相同性は、各菌種由来のＲＲＦは類似した三次構造を呈することを強く示唆する。
（実施例４）タンパク質の発現およびその精製
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（−）ベクターを鋳型として用いて、ＲＲＦ配列をコードするＶ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓのＤＮＡ断片をＰＣＲで合成した。ＰＣＲプライマーでは、クローン配列のＧＴＧ開始コドンはＡＴＧに変換した。得られたＰＣＲ産物をｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクターに組込んだ。これを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換した。この形質転換体を３７℃で培養した。６６０ｎｍにおいて、培養物の吸光度が０．６に達した時、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを加えて、タンパク質発現を誘導させた。誘導から３時間の培養後、菌体を収集し、緩衝液Ａ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭＭｇＣｌ_２、２ｍＭ２−メルカプトエタノールおよび１ｍＭＰＭＳＦ）中でソニケーションにて菌体を粉砕した。ホモゲナイズ後の遠心は、３００，０００×ｇで３時間行い、緩衝液Ａによって平衡化した５ｍｌＨｉ−ＴｒａｐＱカラム（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に上清液を加えた。この流出通過したＲＲＦを含んだ分留物を緩衝液Ｂ（２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、１０ｍＭＮＨ_４Ｃｌおよび６ｍＭ２−メルカプトエタノール）で透析を行った。そして、緩衝液Ｂで平衡化した、５ｍｌＨｉ−ＴｒａｐＳＰカラム（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に加えた。得られたＲＲＦを含んだ抽出分留物をＣｅｎｔｒｉｃｏｎＹＭ−１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）にて濃縮し、さらにこの濃縮物を、３００ｍＭの酢酸ナトリウムを含んだ緩衝液Ａにて平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇカラム（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にて精製した。この生産物の均質性をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認し、また分子量をマトリックス支援レーザー脱離／イオン化ＴＯＦ質量分析法（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）によって確認した。
【００２９】
ＲＲＦ−ＤＩの発現と精製は、以下のとおりに行った。すなわち、ＲＲＦ−ＤＩを保有するプラスミドを大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ）に形質転換し、この形質転換体を最初は５ｍｌ、次に１ｌの１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃で、培養した。６６０ｎｍにおいて、培養物の吸光度が０．６に達した時に、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを加えて、タンパク質発現を誘導させ、３時間の培養した。菌体を収集し、緩衝液Ｃ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）および６ｍＭ２−メルカプトエタノール）中でソニケーションにて菌体を粉砕した。ホモゲナイズ後の遠心は、１４，０００×ｇで３０分間行い、緩衝液Ｃによって平衡化した５ｍｌＨｉ−ＴｒａｐＱカラム（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に上清液を加えた。このＲＲＦを含んだ抽出分留物をＣｅｎｔｒｉｃｏｎＹＭ−３（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）にて濃縮し、またこの濃縮物を、１５０ｍＭの酢酸ナトリウムを含んだ緩衝液Ｃにて平衡化した、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇカラム（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にて精製した。図には示していないが、ＲＲＦ−ＤＩの精製の均質性（＞９８％）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて判断した。
（実施例５）円偏光二色性（ＣＤ）測定
大腸菌ＲＲＦおよびＲＲＦ−ＤＩにおける円偏光二色性スペクトルは、各試料５μＭを緩衝液（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ３．６および５０ｍＭＮａＣｌ）に入れ、波長１ｍｍおよび温度１０℃の条件下で、ＡＶＩＶモデル２０２分光光度計（ＡＶＩＶ）を使用して測定した。
【００３０】
結果は、図３に示したとおりである。大腸菌野生型ＲＲＦとＲＲＦ−ＤＩとの間で、ほぼ同じパターンが観察され、高い相同性を有することが確認できた。
（実施例６）ＲＲＦの機能解析
各々精製済の組換えＶ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓＲＲＦ、大腸菌ＲＲＦおよびＲＲＦ−ＤＩをピューロマイシン処理済ポリソームを基質として、解析した。公知文献（非特許文献３）にあるように、このポリソーム分留物は、大腸菌Ｑ１３株より調整し、ポストターミネーション複合体ＲＲＦによる分解反応に用いた。この反応混合物（１５０μｌ）は、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、８．２ｍＭＭｇＣｌ_２、８０ｍＭＮＨ_４Ｃｌ、１ｍＭＤＴＴ、０．１６ｍＭＧＴＰ、０．０５ｍＭピューロマイシン、１．３Ａ_２６０のポリソーム、１．６μＭＥＦ−Ｇおよび任意な量のＲＲＦを含有する。この混合物を３０℃で２０分間で反応させ、次いで５〜４５％の範囲のショ糖による密度勾配超遠心（２５０，０００×ｇ、４℃、４５分間）によって、ポリソームとモノソームに分離させた。解離物の定量測定は、吸光度２６０ｎｍの条件下でＰｉｓｔｏｎＧｒａｄｉｅｎｔＦｒａｃｔｉｏｎａｔｅｒ（ＢｉｏｃｏｍｐＩｎｃ．社）を用いて測定した。大腸菌ＲＲＦの再生活性に対するＲＲＦ−ＤＩの阻害効果は、１μＭの大腸菌ＲＲＦに対して過剰量のＲＲＦ−ＤＩを添加することによって、証明した。
【００３１】
図４、図５および図６は、ＲＲＦ−ＤＩのリボソーム再生活性、野生型ＲＲＦ阻害活性を示した図である。図４は野生型ＲＲＦの場合を、図５は野生型ＲＲＦが１に対してＲＲＦ−ＤＩが５０含む場合を、図６はＲＲＦ−ＤＩの場合をそれぞれ示した。図４において、特に７０Ｓの部分では、野生型ＲＲＦは高い波形データを示していたが、図５および図６においては、ＲＲＦ−ＤＩの存在下ではコントロール（ＲＲＦを含まない、ネガティブコントロール）とほぼ同じ波形データが確認された。このことは、ＲＲＦ−ＤＩは、ＲＲＦとしての機能を有さないことを示している。
（実施例７）結晶化およびデータ集積
Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓＲＲＦの結晶は、４℃の条件で懸垂滴下気化拡散法を利用して結晶化させた。液滴は、２μｌの保存溶液（５０ｍＭＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．２）、２００ｍＭ酢酸ナトリウムおよび２３〜２５％ｗ／ｖの範囲のＰＥＧ８０００）と２μｌのタンパク質溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）から構成されている。この液滴に最終濃度０．７５ｍＭのフシジン酸および最終濃度５ｍＭのＧＴＰをそれぞれ添加した。この条件で、複数の結晶が１日ほどで生産され、また最大サイズ（典型的なサイズとして、０．２ｍｍ×０．２ｍｍ×０．２ｍｍ）の結晶は約３日で得られる。この結晶を、５０ｍＭＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．２）、２００ｍＭ酢酸ナトリウム、２５％ｗ／ｖのＰＥＧ８０００、１５％ｖ／ｖ２−ｍｅｔｈｙｌ−２，４−ｐｅｎｔａｎｅｄｉｏｌおよび５％ｖ／ｖ２−ｐｒｏｐａｎｏｌを含む細胞保護剤内に移し、液化窒素で瞬間凍結した。高エネルギー加速器研究機関（筑波、日本）の放射光研究施設に設置されたＢＬ１８Ｂにて、２．２Åの解像度でＸ線回折データを、結晶と検出器間の距離４３０ｍｍの条件でのシンクロトロン放射で集積した。データは、ワイセンベルグ型カメラと高分子結晶構造解析に用いるイメージングプレートを使用して集積した。このデータの解析には、ＨＫＬパッケージのＤＥＮＺＯおよびＳＣＡＬＥＰＡＣＫプログラムによって行った。Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓＲＲＦの結晶は、ユニットセルパラメータ、ａ＝ｂ＝８４．８０およびｃ＝１２４．７３Åにおいて三方晶系間のグループＲ３２に属する。仮に１分子につき不均一な単位において、計算したＭａｔｔｈｅｗｓ係数Ｖ_Ｍ値は、２．４０Å^３／Ｄａである。そのため、結晶の溶媒内容物は、４８．８％と算出された。表１に集積したデータ統計を示した。
【００３２】
なお、表１において、括弧内の数値は、最大解像シェルである。Ｒ_{ｍｅｒｇｅ}＝Σ_ｈΣ_ｊ｜＜Ｉ（ｈ）＞−Ｉ（ｈ）_ｊ｜Σ_ｈΣ_ｊの＜Ｉ（ｈ）＞は、対称相当反射平均強度を示している。
【００３３】
【表１】

【００３４】
（実施例８）構造決定および精査
Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓＲＲＦにおける分子置換予測には、ＣＣＰ４組中のプログラムＡｎｏＲｅ（非特許文献４）を利用した。探索モデルとして、公知の大腸菌ＲＲＦ変異体（Ｒ１３２Ｇ）（非特許文献５）の結晶構造を用いた。探索モデルを生成する際に、配列間で同一でない残基はＡｌａ残基と置換された。その結果、唯一の解決は、翻訳機能予測の後に、０．３１６の相関係数および５５．２％（８．０−４．０Å）のＲ因子により発見した。この解決の正確さを改善するため、この合成構造は８．０〜３．０Åの解像度からのデータを使用して、厳正な主部分精査を４０サイクル行った。Ｒ因子は、４６．２％までに精練した。
【００３５】
構造の精練には、プログラムＸ−ＰＬＯＲ（非特許文献６）、ＣＮＳ（非特許文献７）およびＴＯＭ（非特許文献８）を利用して行った。モデルの適合性および精査の多くのサイクル後、ほとんど全ての分子をトレースすることが可能だった。このステップでは、アラニンに置換された残基は、オリジナルのアミノ酸残基に戻された。その後、精査ステップは、グループ化された温度要因あるいは個々の温度要因の精査を含んでいた。モデルのチェックのためオミットマップを用いた。ＣＮＳプログラム中のｗａｔｅｒｐｉｃｋ手順を利用することにより、水分子を識別した。
【００３６】
最終モデルは、１８５アミノ酸および２２７水分子の全てを含んでいた。結晶化の状況下での溶液には、フシジン酸およびＧＴＰが含有している。これら化合物は、Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓＲＲＦの結晶化に必須と考えられているにもかかわらず、電子密度地図において、タンパク質および水分子のみが観察された。最終的なＲ因子は、２０．３％、Ｒ_ｆｒｅｅは２７．３％であった。なお、平均位置エラー値は０．２４１Åであった。このモデルは、プログラムのＰＲＯＣＨＥＣＫにて評価した場合、優れた立体化学性を有していた。Ｒａｍａｎｃｈａｎｄｒａｎプロットにおいて、非グリシン残基の９４．７％は、最も適した領域にある。また、どの残基においても大量に許容領域および非許容領域にない。化学結合における長さおよび角度の二乗平均平方根偏差（ｒｍｓｄ）は、長さは０．００５Å、角度は１．０７８°である。表２にこの構造精査における統計結果をまとめて、示した。最終調整したものおよび構造データは、ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋに登録・蓄積した（ＰＤＢ ♯１ＩＳ１）。
【００３７】
なお、表２におけるＲｆａｃｔｏｒ＝Σ｜｜Ｆ_ｏｂｓ｜−｜Ｆ_ｃａｌｃ｜｜／Σ｜Ｆ_ｏｂｓのＦ_ｏｂｓは、構造要因の観察値を、またＦ_ｃａｌｃは、構造要因の計算値をそれぞれ示している。Ｒ_ｆｒｅｅ値は、データのおよそ５％を用いて計算され、二乗平均平方根はＥｎｇｈとＨｕｂｅｒパラメータと関連している。
【００３８】
【表２】

【００３９】
（実施例９）リボソーム結合試験
質的にＲＲＦへの７０Ｓリボソームあるいはそのサブユニットの結合を検討するため、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００バイオセンサー・システム（ＢｉａｃｏｒｅＡＢ社）を用いて、表面のプラスモン共鳴実験を２５℃の条件で実行した。ＣＭ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ社）上のＲＲＦ固定には、アミン・カップリング方法（蛋白質はリシンε−アミノグループによって、Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＮＨＳ）−塩基化学で共有結合によって固定される）を利用し、メーカーの標準プロトコルに従って実行した。酢酸緩衝液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５））を流速１０μｌ／ｍｉｎ．でランニング緩衝液として用いた。ＣＭ５センサーチップのフロー・セル１上にＲＲＦ−ＤＩを固定化するために、２４分間隔でＲＲＦ−ＤＩ（０．１ｍｇ／ｍｌ）を注入した。ＲＲＦ−ＤＩの固定化レベルは、おおよそ５０００共鳴単位（ＲＵ）だった。ブランクのセルを準備するため、フロー・セル２も活性化されたが、ランニング緩衝液だけ注入した。上記２種のセルにおいての未反応のＮＨＳグループは、エタノールアミンハイドロクロライドによって阻害された。
【００４０】
相互作用のモニタリングのため、全ての手順を自動化にすることによって、試料の注入および再生を反復サイクルとした。濃度が６０〜９００ｎＭの範囲を超えたリボソームは、セル１およびセル２に同時に注入された。次に、セル２からの反応（すなわち、センサーチップ上のリボソームとデキストラン・マトリックス間の非特異的な相互作用）分を減じることによって、セル１からの反応を集積した。ＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭＮＨ_４Ｃｌ、８．２ｍＭＭｇ（ＯＡｃ）_２、１ｍＭＤＴＴおよび０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０）を試料の希釈および流速１０μｌ／ｍｉｎ．で、ランニング緩衝液に利用した。
【００４１】
ＲＲＦ−ＤＩによる、野生型ＲＲＦと５０Ｓサブユニットとの結合阻害を検討するため、各種濃度のＲＲＦ−ＤＩ（０．０５〜３μＭの範囲）を調整し、５０Ｓサブユニットとともにプレインキュベートした。次に、この混合物をＣＭ５センサーチップに注入した。この実験において、野生型大腸菌ＲＲＦのセンサーチップに固定には、上記と同様の方法で行った。
【００４２】
ＲＲＦ−ＤＩと７０Ｓリボソーム、またはそのサブユニットとの結合は、フィルター技術を用いて測定した。０．２５μＭのリボソームを含む４０μｌのＴｒｉｓ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、８．２ｍＭＭｇＳＯ_４、５０ｍＭＮＨ_４Ｃｌ、１ｍＭＤＴＴおよび０．３ｍＭＥＤＴＡ）とともにＲＲＦ−ＤＩを３０℃、１０分間インキュベートした。次いで、この混合物をＭｉｃｒｏｃｏｎＹＭ−１００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に入れ、３０００×ｇで５分間の遠心して、リボソームと結合したＲＲＦ−ＤＩを取得した。４０μｌの上記と同じ緩衝液をカラムに入れて、３０００×ｇで１０分間の遠心により、未結合ＲＲＦ−ＤＩを洗い出した。この洗浄操作を２回繰り返した。そして、フィルターを４０μｌの緩衝液とともに室温で１分間、インキュベートした。リボソーム結合ＲＲＦ−ＤＩは、遠心によって収集した。回収したＲＲＦ−ＤＩは、抗大腸菌ＲＲＦウサギ抗体（１：１００００希釈）を用いたウェスタン・ブロッティングによって検出した。結合ＲＲＦ−ＤＩは、既知量の標準ＲＲＦ−ＤＩとのブロッティングによって定量した。ＲＲＦ−ＤＩとフィルター装置との非特異的結合の定量のため、コントロール実験（リボソームを含まない）を行った。野生型ＲＲＦと７０Ｓリボソームまたはそのサブユニットとの結合の測定も同様に行った。
【００４３】
なお、表３は、ＲＲＦ−ＤＩおよび野生型ＲＲＦのリボソームおよびそのサブユニットからの解離定数を示した表である。
【００４４】
【表３】

【００４５】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、ＲＲＦ−ＤＩおよびその特性を維持した誘導体は、リボソーム再生因子の阻害剤として働き、したがって細菌の細胞内に導入することによって、細菌の生育を抑制することができ、またこのリボソーム再生阻害因子を有効成分とすることを特徴とする原核生物の生存または増殖に障害効果を奏する組成物が提供される。
【００４６】
またこの出願の発明は、薬学的成分を含有することにより様々な形状、投与方法が可能とすることを特徴とする、ヒト等に対して副作用の少ない前記の組成物が提供される。
【００４７】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】この出願の発明のＲＲＦ−ＤＩの構造を例示した模式図である。
【図２】図１に例示したＲＲＦ−ＤＩの発現プラスミドの作製手順を例示した模式図である。
【図３】大腸菌野生型ＲＲＦとＲＲＦ−ＤＩのＣＤスペクトルの結果を示したグラフ図である。
【図４】野生型ＲＲＦにおけるリボソーム再生活性を示したグラフ図である。
【図５】野生型ＲＲＦが１に対して、ＲＲＦ−ＤＩが５０におけるリボソーム再生活性を示したグラフ図である。
【図６】ＲＲＦ−ＤＩにおけるリボソーム再生活性を示したグラフ図である。
【図７】リボソームの再生過程を例示した模式図である。
【図８】各菌種のＲＲＦのアミノ酸配列を比較例示した図である。
【図９】Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓのＲＲＦの構造を例示した模式図である。
【図１０】各菌種のＲＲＦの構造を比較例示した模式図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The invention of this application relates to a ribosome regeneration inhibitor. More specifically, the invention of this application relates to a composition containing, as an active ingredient, a ribosome regeneration inhibitory factor that exerts a disturbing effect on the survival or growth of prokaryotes.
[0002]
[Prior art and its problems]
Ribosome regeneration factor (RRF) is a protein with a molecular weight of 21 kDa that plays a central role in the process of ribosome regeneration together with elongation factor G (EF-G). It is known that it plays a role of decomposing and reproducing. After termination of the biosynthesis of RRF, a post-termination complex consisting of 70S ribosome, deacylated RNA and mRNA remains. RRF is essential to dissociate and regenerate it for the next protein biosynthesis cycle. FIG. 7 schematically illustrates the process of ribosome regeneration.
[0003]
FIG. The comparison of the amino acid sequence of R. parahaemolyticus RRF with the amino acid sequences of RRFs of other known bacterial species is exemplified. As illustrated in FIG. 8, each RRF contains about 185 amino acid residues and has high homology to all RRFs.
[0004]
This RRF is present in all organisms except archaebacteria, and is especially essential for the survival of bacteria. Thus, drugs that inhibit the action of RRF may be new antibacterial agents and antibiotics. In particular, it has been noted that this RRF is a target molecule for designing and screening a drug that does not cause side effects on eukaryotes such as humans and acts only suicide on bacteria (prokaryotes).
[0005]
The elucidation of the structure of the RRF as described above has been a major issue, but recently, Thermotoga maritima (a highly thermophilic bacterium), Escherichia coli (Escherichia coli), Thermus thermophilus (a thermophilic bacterium), and Aquifex aeolicus (an advanced thermophilic bacterium) The three-dimensional structure of the RRF derived from a thermophile was determined by X-ray crystal structure analysis and NMR. As a result, it was found that the RRF was composed of two types of domains, a domain I composed of an α-helix bundle and a domain II composed of a β / α / β sandwich β-sheet structure. The schematic diagram is illustrated in FIGS. 9 and 10. FIG. FIG. 2 is a schematic diagram of a parahaemolyticus RRF structure. FIG. parahaemolyticus, T.P. maritima, T .; thermophilus and A. It is the schematic diagram which compared and exemplified the RRF structure derived from each bacterial species of aeolicus. As illustrated in FIG. 10, the three-dimensional structures of the RRFs derived from each bacterial species are similar to each other, and it is presumed that their functions and the like are similar. Since the three-dimensional structure has been elucidated in this way, attempts have been made to design, create and search for substances that specifically bind to RRF and inhibit the function of RRF based on the information. No examples have been reported.
[0006]
Accordingly, the invention of this application has been made in view of the circumstances described above, and is intended to design and create a ribosome regeneration inhibitor that inhibits the function of RRF, and to use this ribosome regeneration inhibitor as an active ingredient. It is an object of the present invention to provide a composition having a disturbing effect on the survival or growth of prokaryotes, characterized by the following.
[0007]
The invention of this application also provides the above-mentioned composition characterized in that it can be formed into various forms and administration methods by containing a pharmaceutical ingredient.
[0008]
[Non-patent document 1]
Sambrook, J .; Et al., Molecular Cloning, 1989.
[Non-patent document 2]
Kurosawa, K .; Et al., Genome Informatics, vol. 9, p164-165, 1998
[Non-Patent Document 3]
Hirashima, A .; And Kaji, A .; Author, J. et al. Mol. Biol. , Vol65, p46-58, 1972
[Non-patent document 4]
Navaza, J, Acta Crystallogr. , A50, p157-163, 1994
[Non-Patent Document 5]
Nakano, H .; Et al., Acta Crystallogr. , D58, p124-126, 2002
[Non-Patent Document 6]
Brunger, A .; T. , X-PLOR Version 3.1, A System for X-ray Crystallography and NMR, Yale University, 1992.
[Non-Patent Document 7]
Brunger, A .; T. Et al., Acta Crystallogr. , D50, p760-763, 1994
[Non-Patent Document 8]
Cambillau, C.I. J. et al. Mol. Graph. , Vol2, p53-54, 1984
[0009]
[Means for Solving the Problems]
The invention of this application is a first invention for solving the above-mentioned problem, which is a mutant of a ribosome regeneration factor, which has a ribosome regeneration inhibitory activity on prokaryotic ribosomes. Secondly, the ribosome regeneration factor provides a ribosome regeneration inhibitor consisting of domain I (A) -domain II-domain I (B).
[0010]
Thirdly, the invention of this application provides a ribosome regeneration inhibitor wherein the mutant lacks part or all of domain II, and fourth, the mutant comprises one of domain II. The present invention provides a ribosome regeneration inhibitor in which part or all of the ribosome regeneration inhibitor is substituted with one or more amino acid residues, and fifthly, a ribosome regeneration inhibitor in which the amino acid residues consist of 1 to 5 glycine residues.
[0011]
The invention of the present application further provides, sixthly, a DNA fragment encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, seventhly, a DNA fragment comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and eighthly, a DNA fragment comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. A ribosome regeneration inhibitor expression vector comprising an expression cassette having a ribosome regeneration inhibitor coding sequence according to any one of the first to fifth inventions, and a ninth expression vector comprising the DNA fragment of the sixth invention. A ribosome regeneration inhibitor expression vector comprising a cassette, a tenth ribosome regeneration inhibitor expression vector comprising an expression cassette having the DNA fragment of the seventh invention is provided, and an eleventh ribosome regeneration inhibitor expression vector is provided. The present invention provides a ribosome regeneration inhibitor expressed by the expression vector according to any one of the inventions according to the tenth to tenth aspects.
[0012]
A twelfth aspect is a composition which exerts a disturbing effect on the survival or proliferation of a prokaryote, wherein any one of the first to fifth aspects or the ribosome regeneration inhibitor of the eleventh aspect is used as an active ingredient. Thirteenth, a composition wherein the prokaryote is a bacterium, and fourteenth, a composition comprising a pharmaceutical ingredient.
[0013]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The invention of this application has the features as described above, and embodiments thereof will be described below.
[0014]
Ribosome regeneration factor (hereinafter referred to as RRF) is a protein that plays a central role in the ribosome regeneration process. It acts on ribosomes, which are protein biosynthesis devices, to decompose and regenerate spent ribosomes, and is particularly essential for the survival of prokaryotes (such as bacteria). Therefore, an RRF mutant that inhibits the ribosome regeneration activity of RRF, which is expected to have an inhibitory effect on the survival and growth of bacteria, was prepared. The RRF in the invention of this application is preferably composed of two types of domain structures, domain I having an α-helix bundle structure and domain II having a β / α / β structure. The inventors focused on the specific α-helix bundle structure of domain I of the RRF. RRF consists of 185 amino acids, while domain I consists of two separate regions, 30 residues from the N-terminus (region IN) and 80 residues from the C-terminus (region IC) in the amino acid sequence. The domain II exists between the two domains I (that is, the structure of domain I (A) -domain II-domain I (B)). Therefore, it is currently difficult to remove the domain I portion by a method of cutting a specific region on the amino acid sequence or partially synthesizing the same. In the invention of the present application, “domain I (A)” indicates the region IN, and “domain I (B)” indicates the region IC. The structure of the naturally occurring RRF forms the structure of domain I (A) -domain II-domain I (B) as described above. For example, domain I (A) -domain I (B)- An RRF having a structure such as domain II or domain II-domain I (A) -domain I (B) may be artificially produced and used in the invention of this application.
[0015]
Therefore, the present inventors have found that the C-terminal portion of domain IN (domain I (A)) of domain I and the N-terminal portion of region IC (domain I (B)) are spatially close (about 10 °). In particular, in order to link both domain I (A) and domain I (B), an amino acid sequence in which part or all of domain II is substituted with one or more amino acid residues is designed, and ribosome regeneration is performed. Mutants of the factor were generated. The type and length of the amino acid residue can be appropriately selected and modified as long as the effects of the invention of this application can be exhibited, but three glycine residues are particularly preferable. Of course, the invention of this application may be a mutant in which part or all of domain II is deleted, or a mutant in which one or more amino acid residues are added at any position in domain II, Substitution variants as described above are preferred. In addition, if these mutants have the effects of the invention of this application such as affinity with ribosome and ribosome regeneration inhibitory effect, a part of domain I (A) (B) was deleted or substituted. It may be a mutant.
[0016]
The addition substance or substitution substance in any of the above addition mutants or substitution mutants is not limited to amino acids.
[0017]
These mutants (i.e., ribosome regeneration inhibitory factor (hereinafter referred to as RRF-DI)) include a DNA fragment encoding RRF-DI (for example, a DNA fragment encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a base fragment of SEQ ID NO: 1). By introducing an expression vector having an expression cassette having a DNA fragment comprising a sequence) into Escherichia coli or the like, large-scale and simple production can be achieved. Moreover, the RRF-DI recovered from the cells can be purified with high purity and high yield. The obtained RRF-DI was confirmed by circular dichroism measurement (CD) to have the same three-dimensional structure as domain I of wild-type RRF, and the RRF-DI When the ribosome regeneration activity and ribosome binding ability were measured by a polysome degradation assay and a surface plasmon resonance sensor, it was confirmed that RRF-DI could bind to ribosomes in the same manner as wild-type RRF. On the other hand, RRF-DI had lost ribosome regeneration activity. That is, it was considered that RRF-DI binds to ribosomes competitively with wild-type RRF and interferes with RRF activity. In fact, it was confirmed that in the presence of RRF-DI, ribosome binding and ribosome regeneration activity of wild-type RRF were inhibited.
[0018]
The “expression vector” in the invention of this application can be prepared by inserting and binding an expression cassette having a ribosome regeneration inhibitor coding sequence into a base vector. Therefore, the expression cassette preferably has a restriction enzyme sequence corresponding to any cloning site of the base vector. Examples of the "base vector" include various base vectors such as animal cell vectors, insect cell vectors, yeast vectors, Escherichia coli vectors, and shuttle vectors for multiple species such as yeast and Escherichia coli. Can be appropriately selected depending on the host cell and purpose. In addition, existing vector DNA for expressing a foreign protein in an appropriate host cell can be partially modified and used. For example, when a microorganism such as Escherichia coli is used as a host cell, a pUC system having an origin, a promoter, a terminator, and the like, pBluescript II, a pET system, and the like can be used.
[0019]
Since prokaryotes require the action of RRF for survival, growth and proliferation as described above, RRF-DI, which has the effect of inhibiting ribosome regeneration activity, has an inhibitory effect on survival, growth and proliferation of prokaryotes. Can be expected. That is, a composition containing RRF-DI as an active ingredient can be used as an antibacterial agent or an antibiotic.
[0020]
"Prokaryotes" include bacteria and the like. Since the RRF-DI of the invention of the present application has a particularly high RRF inhibitory activity for bacteria, it is preferable that the target is a bacteria. "Bacteria" includes mycoplasmas, photosynthetic bacteria, E. coli, parahaemolyticus, T.P. maritima, T .; thermophilus and A. aeolicus and the like. Since the RRF is not involved in protein synthesis in the eukaryotic cytoplasm, it is considered that the effect of the RRF-DI of the present invention on eukaryotes is small. That is, a composition containing RRF-DI as an active ingredient and containing a pharmaceutical ingredient can be expected to have few side effects even when administered to a human or the like as a drug (antibacterial or antibiotic).
[0021]
“Pharmaceutical ingredients” are various carriers generally used in the production of drugs, and the carriers can be appropriately selected according to the type of drug, the dosage form such as injection and oral administration, and the like. For example, oral liquid drugs such as suspending agents and syrups include water, sugars such as sucrose, glycols such as polyethylene glycol, oils such as sesame oil and soybean oil, other preservatives, peppermint and the like. Can be produced by using various flavors and the like. In addition, powders, pills, capsules and tablets are excipients such as lactose, glucose, sucrose, disintegrants such as starch, lubricants such as magnesium stearate, various binders, surfactants, and plasticizers. Can be formulated.
[0022]
Hereinafter, examples (preparation of RRF-DI from RRF derived from V. parahaemolyticus) will be shown, and the invention of this application will be described in more detail. Of course, the invention of this application is not limited by the following examples. That is, V. RRF-DI can also be prepared from an RRF derived from a bacterial species other than parahaemolyticus (for example, T. maritima, T. thermophilus, A. aeolicus, etc.).
[0023]
【Example】
(Example 1) E. coli strain, plasmid and culture conditions
V. Parahaemolyticus strain KXV237 (O3: K6) was used for molecular cloning. E. coli strain DH5α was used as the host strain for the cloned plasmid DNA. E. coli strain BL21 (DE3) was used for protein expression. Luria-Bertani (LB) medium (Nakalaitesque) was used as a liquid medium for bacterial culture and a 1.5% agar medium and cultured. In addition, 100 mg / ml ampicillin was added to these media.
(Example 2) Molecular cloning
V. In order to select a parahaemolyticus RRF DNA (frr) clone, a part of the E. coli frr fragment was used as a DNA probe. A DIG system (Roche) was used for labeling the DNA probe. A DNA fragment encoding the Met 13-Glu 179 residue of Escherichia coli RRF was designed and amplified by PCR using primers (SEQ ID NOs: 5 and 6). The pET22b (+) plasmid (Novagen) carrying E. coli frr was used as a template in this PCR.
[0024]
V. The NotI fragment in the genomic DNA of parahaemolyticus KXV237 hybridized with the probe described above. IIda, T .; Performed gel electrophoresis, as previously reported by the authors, and then utilized the Southern blotting hybridization method. A luminescent fragment of about 168 kbp was collected and treated with PstI. The sample obtained by the enzyme treatment was used for electrophoresis on an agarose gel (0.8%), and was subjected to hybridization again. A 4.1 kbp PstI fragment was collected and inserted into the PstI site of pBluescript II KS (-) (Toyobo).
[0025]
A restriction map of the 4.1 kbp PstI fragment was created according to a known method (Non-patent Document 1). The frr gene is contained between the SpeI site and the HindIII site of the 1.2 kbp fragment. This fragment was integrated into a pBluescript II KS (-) vector, reconstructed, and sequenced. DNA sequencing was performed by an automatic DNA sequencer (Shimadzu) using the fluorescent dye primer method. The DNA sequence was analyzed by the Gene WebII program (Non-Patent Document 2), and it was confirmed that the DNA sequence was the target DNA sequence.
[0026]
This V. The 1.2 kbp SpeI-HindIII fragment containing parahaemolyticus frr has only one large open reading frame (ORF), and also has a Pribnow sequence, -35 element and SD sequence upstream of the ORF of this fragment. Was included. This ORF was composed of 555 bp encoding a protein composed of 185 amino acids. The molecular weight was 20570.45. V. The homology between parahaemolyticus and E. coli RRF was 70.1% at the amino acid level. In addition, V. The DNA sequence of parahaemolyticus frr is known as a database at GenBank / EMBL / DDBJ (Accession Number AB064319).
(Example 3) Construction of RRF-DI (E. coli domain I)
To elucidate the role of domain I in the RRF, we encode E. coli RRF, a recombinant protein consisting of the region of Met 1-Gly 30 and the region of Thr 106-Phe 185, corresponding to domain I. An expression vector was constructed. The two regions are connected by a flexible linker constituted by glycine residues. Preliminary results on the E. coli R132G mutant showed that the distance between Gly 30 and Thr 106 was 9.8 °. Therefore, three glycine residues were used to join the two regions. The expression vector ((1-30) -Gly-Gly-Gly- (106-185)) was synthesized by PCR using plasmid pET22b (+) carrying Escherichia coli RRF as a template. Two oligonucleotides (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4) were used as primers. The sample to which this domain I was linked was designated as "RRF-DI". In addition, as a result of analyzing the DNA sequence of RRF-DI before performing protein expression, it was confirmed that it was RRF-DI.
[0027]
FIG. 1 is a schematic diagram of the RRF-DI of the invention of this application, and schematically illustrates three glycine residues connecting domains I (A) and (B). FIG. 2 is a schematic view illustrating the outline of the procedure for preparing an RRF-DI expression plasmid.
[0028]
Most RRFs contain 185 amino acids, as illustrated in Figure 8 above. Those amino acid residues that are conserved in other strains are described in It is also conserved in the parahaemolyticus RRF and has high homology to all RRFs (eg, 70.1% in E. coli, 63.2% in Pseudomonas aeruginosa, 45.4% in S. aureus, 45.4% 42.7% for thermophiles). Such high homology strongly suggests that the RRFs from each strain exhibit similar tertiary structures.
(Example 4) Expression of protein and purification thereof
Using the pBluescript II KS (-) vector as a template, a V. p. A DNA fragment of parahaemolyticus was synthesized by PCR. For the PCR primers, the GTG start codon of the clone sequence was converted to ATG. The obtained PCR product was integrated into a pET22b (+) plasmid vector. This was transformed into E. coli strain BL21 (DE3). This transformant was cultured at 37 ° C. When the absorbance of the culture at 660 nm reached 0.6, a final concentration of 1 mM IPTG was added to induce protein expression. After culturing for 3 hours from the induction, the cells were collected, and buffer A (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM MgCl 2 ₂ , The cells were sonicated in sonication in 2 mM 2-mercaptoethanol and 1 mM PMSF). Centrifugation after homogenization was performed at 300,000 × g for 3 hours, and the supernatant was added to a 5 ml Hi-Trap Q column (Amersham Biosciences) equilibrated with buffer A. The fraction containing the RRF that passed through the effluent was buffer B (20 mM sodium acetate (pH 5.0), 10 mM NH 4 ₄ Dialysis was performed against Cl and 6 mM 2-mercaptoethanol). Then, the mixture was added to a 5 ml Hi-Trap SP column (Amersham Biosciences) equilibrated with buffer B. The obtained extract fraction containing RRF was concentrated using Centricon YM-10 (Millipore), and the concentrate was further equilibrated with a buffer A containing 300 mM sodium acetate in a Superdex 75 pg column. (Amersham Biosciences). The homogeneity of the product was confirmed by SDS-PAGE, and the molecular weight was confirmed by matrix-assisted laser desorption / ionization TOF mass spectrometry (Applied Biosystems).
[0029]
Expression and purification of RRF-DI were performed as follows. That is, the plasmid carrying RRF-DI was transformed into Escherichia coli strain BL21 (DE), and the transformant was cultured at 37 ° C. in LB medium containing 5 ml and then 1 l of 100 μg / ml ampicillin at first. At 660 nm, when the absorbance of the culture reached 0.6, a final concentration of 1 mM IPTG was added to induce protein expression and the cells were cultured for 3 hours. The cells were collected and sonicated in buffer C (20 mM Tris-HCl (pH 7.4) and 6 mM 2-mercaptoethanol). Centrifugation after homogenization was performed at 14,000 × g for 30 minutes, and the supernatant was added to a 5 ml Hi-Trap Q column (Amersham Biosciences) equilibrated with buffer C. The extract fraction containing the RRF was concentrated using Centricon YM-3 (Millipore), and the concentrate was equilibrated with a buffer C containing 150 mM sodium acetate. A Superdex 75 pg column ( (Amersham Biosciences). Although not shown, the homogeneity of purification of RRF-DI (> 98%) was determined by SDS-PAGE.
(Example 5) Circular dichroism (CD) measurement
Circular dichroism spectra in E. coli RRF and RRF-DI were obtained by placing 5 μM of each sample in a buffer solution (20 mM sodium acetate, pH 3.6 and 50 mM NaCl) under the conditions of 1 mm wavelength and 10 ° C. in the AVIV model 202. Measured using a spectrophotometer (AVIV).
[0030]
The results are as shown in FIG. Almost the same pattern was observed between Escherichia coli wild-type RRF and RRF-DI, confirming high homology.
(Example 6) Function analysis of RRF
Each of the purified recombinant V. Parahaemolyticus RRF, Escherichia coli RRF and RRF-DI were analyzed using puromycin-treated polysome as a substrate. As described in the known literature (Non-Patent Document 3), this polysome fraction was prepared from Escherichia coli strain Q13 and used for the degradation reaction by the post-termination complex RRF. The reaction mixture (150 μl) was mixed with 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 8.2

mM MgCl

2 ₂ , 80 mM NH ₄ Cl, 1 mM DTT, 0.16 mM GTP, 0.05 mM puromycin, 1.3 A ₂₆₀ Of polysomes, 1.6 μM EF-G and any amount of RRF. The mixture was reacted at 30 ° C. for 20 minutes and then separated into polysomes and monosomes by density gradient ultracentrifugation (250,000 × g, 4 ° C., 45 minutes) with sucrose in the range of 5-45%. Quantitative measurement of the dissociated product was performed using a Piston Gradient Fractionator (Biocomp Inc.) under the condition of an absorbance of 260 nm. The inhibitory effect of RRF-DI on the regenerating activity of E. coli RRF was demonstrated by adding an excess amount of RRF-DI to 1 μM E. coli RRF.
[0031]
FIG. 4, FIG. 5, and FIG. 6 are diagrams showing ribosome regeneration activity and wild-type RRF inhibitory activity of RRF-DI. 4 shows the case of wild-type RRF, FIG. 5 shows the case of 1 wild-type RRF and 50 cases of RRF-DI, and FIG. 6 shows the case of RRF-DI. In FIG. 4, the wild-type RRF showed high waveform data especially in the portion of 70S, but in FIGS. 5 and 6, in the presence of RRF-DI, almost the same as the control (negative control without RRF). The same waveform data was confirmed. This indicates that RRF-DI does not have a function as RRF.
(Example 7) Crystallization and data integration
V. The crystal of parahaemolyticus RRF was crystallized at 4 ° C. using a hanging drop vaporization diffusion method. The droplets consisted of 2 μl of the stock solution (50 mM MES-NaOH (pH 6.2), 200 mM sodium acetate and PEG 8000 in the range of 23-25% w / v) and 2 μl of the protein solution (10 mg / ml). I have. Fusic acid at a final concentration of 0.75 mM and GTP at a final concentration of 5 mM were added to the droplets. Under this condition, a plurality of crystals are produced in about one day, and a crystal having a maximum size (typically 0.2 mm × 0.2 mm × 0.2 mm) can be obtained in about 3 days. The crystals were prepared using 50 mM MES-NaOH (pH 6.2), 200 mM sodium acetate, 25% w / v PEG 8000, 15% v / v 2-methyl-2,4-pentanediol and 5% v / v 2-propanol. And snap-frozen in liquefied nitrogen. X-ray diffraction data with a resolution of 2.2 mm was obtained at the BL18B installed at the Synchrotron Radiation Research Facility of the High Energy Accelerator Research Organization (Tsukuba, Japan). Accumulated in. Data were collected using a Weissenberg camera and an imaging plate used for polymer crystal structure analysis. Analysis of this data was performed by the DENZO and SCALEPACK programs of the HKL package. V. The crystals of the parahaemolyticus RRF belong to the trigonal group R32 at the unit cell parameters a = b = 84.80 and c = 124.73 °. The calculated Matthews coefficient V in a non-uniform unit per molecule _M The value is 2.40 ° ³ / Da. Therefore, the solvent content of the crystals was calculated to be 48.8%. Table 1 shows the accumulated data statistics.
[0032]
In Table 1, the numerical value in parentheses is the maximum resolution shell. R _merge = Σ _h Σ _j | -I (h) _j ｜ Σ _h Σ _j indicates the symmetric equivalent reflection average intensity.
[0033]
[Table 1]

[0034]
(Example 8) Structure determination and scrutiny
V. For the prediction of molecular replacement in parahaemolyticus RRF, the program AnoRe (Non-Patent Document 4) in the CCP4 set was used. As a search model, the crystal structure of a known Escherichia coli RRF mutant (R132G) (Non-Patent Document 5) was used. In generating the search model, residues that were not identical between sequences were replaced with Ala residues. As a result, the only solution was found after translation function prediction with a correlation coefficient of 0.316 and an R-factor of 55.2% (8.0-4.0．). To improve the accuracy of this solution, the composite structure used 40 cycles of rigorous main part scrutiny using data from a resolution of 8.0-3.0 °. The R factor was refined to 46.2%.
[0035]
The structure was refined using the programs X-PLOR (Non-Patent Document 6), CNS (Non-Patent Document 7) and TOM (Non-Patent Document 8). After many cycles of model fit and scrutiny, almost all molecules could be traced. In this step, the residue substituted for alanine was changed back to the original amino acid residue. Thereafter, the scrutiny step included a scrutiny of the grouped or individual temperature factors. Omit maps were used for model checking. Water molecules were identified by utilizing the waterpick procedure in the CNS program.
[0036]
The final model contained all of 185 amino acids and 227 water molecules. The solution under crystallization conditions contains fusidic acid and GTP. These compounds are described in Although considered essential for the crystallization of parahaemolyticus RRF, only protein and water molecules were observed in the electron density map. The final R factor is 20.3%, R _free Was 27.3%. The average position error value was 0.241 °. This model had excellent stereochemistry as assessed by the program PROCHECK. In the Ramanchandran plot, 94.7% of the non-glycine residues are in the most suitable region. Also, none of the residues are in large amounts in the permissive and non-permissive regions. The root mean square deviation (rmsd) of the length and angle in the chemical bond is 0.005 ° in length and 1.078 ° in angle. Table 2 summarizes and shows the statistical results of this structural inspection. The final adjustment and the structural data were registered and accumulated in the Protein Data Bank (PDB # 1IS1).
[0037]
Note that R factor = Σ || F in Table 2 _obs |-| F _calc || / Σ | F _obs F _obs Gives the observed values of the structural factors and F _calc Indicates the calculated values of the structural factors. R _free Values are calculated using approximately 5% of the data, and root mean square is related to the Engh and Huber parameters.
[0038]
[Table 2]

[0039]
(Example 9) Ribosome binding test
In order to qualitatively examine the binding of 70S ribosome or its subunit to RRF, a plasmon resonance experiment on the surface was performed at 25 ° C. using a Biacore 2000 biosensor system (Biacore AB). For the RRF immobilization on the CM5 sensor chip (Biacore), an amine coupling method (a protein is covalently immobilized by N-hydroxysuccinimide (NHS) -base chemistry by lysine ε-amino group) is used, Performed according to the manufacturer's standard protocol. An acetate buffer (10 mM sodium acetate (pH 4.5)) was supplied at a flow rate of 10 μl / min. Was used as a running buffer. RRF-DI (0.1 mg / ml) was injected at 24 minute intervals to immobilize RRF-DI on flow cell 1 of a CM5 sensor chip. The immobilization level of RRF-DI was approximately 5000 resonance units (RU). To prepare a blank cell, flow cell 2 was also activated, but only running buffer was injected. Unreacted NHS groups in the two cells were inhibited by ethanolamine hydrochloride.
[0040]
Sample injection and regeneration were repeated cycles by automating all procedures for interaction monitoring. Ribosomes at concentrations above the range of 60-900 nM were injected simultaneously into cell 1 and cell 2. Next, the reaction from cell 1 was integrated by reducing the amount of reaction from cell 2 (ie, non-specific interaction between the ribosome on the sensor chip and the dextran matrix). HEPES buffer (10 mM HEPES-NaOH (pH 7.4), 50 mM NH ₄ Cl, 8.2 mM Mg (OAc) ₂ , 1 mM DTT and 0.005% Tween 20) were used for sample dilution and flow at 10 μl / min. And used as a running buffer.
[0041]
To examine the inhibition of binding of wild-type RRF to the 50S subunit by RRF-DI, various concentrations of RRF-DI (in the range of 0.05 to 3 μM) were adjusted and pre-incubated with the 50S subunit. Next, this mixture was injected into a CM5 sensor chip. In this experiment, wild-type E. coli RRF was immobilized on the sensor chip in the same manner as described above.
[0042]
Binding of RRF-DI to the 70S ribosome, or a subunit thereof, was measured using a filter technique. 40 μl of Tris buffer containing 0.25 μM ribosome (10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 8.2 mM MgSO ₄ , 50 mM NH ₄ RRF-DI was incubated for 10 minutes at 30 ° C. with Cl, 1 mM DTT and 0.3 mM EDTA). Next, the mixture was placed in Microcon YM-100 (Millipore) and centrifuged at 3000 × g for 5 minutes to obtain RRF-DI bound to ribosome. Unbound RRF-DI was washed out by placing 40 μl of the same buffer in the column and centrifuging at 3000 × g for 10 minutes. This washing operation was repeated twice. The filters were then incubated with 40 μl buffer for 1 minute at room temperature. Ribosome-bound RRF-DI was collected by centrifugation. The recovered RRF-DI was detected by Western blotting using an anti-Escherichia coli RRF rabbit antibody (diluted at 1: 10000). Bound RRF-DI was quantified by blotting with a known amount of standard RRF-DI. Control experiments (without ribosomes) were performed to quantify non-specific binding between RRF-DI and the filter device. The measurement of the binding between the wild-type RRF and the 70S ribosome or a subunit thereof was similarly performed.
[0043]
Table 3 shows the dissociation constants of RRF-DI and wild-type RRF from ribosomes and their subunits.
[0044]
[Table 3]

[0045]
【The invention's effect】
As described in detail above, according to the invention of this application, RRF-DI and derivatives maintaining its properties act as inhibitors of ribosome regeneration factor, and thus suppress bacterial growth by being introduced into bacterial cells. And a composition having an inhibitory effect on the survival or growth of prokaryotes, characterized by comprising the ribosome regeneration inhibitory factor as an active ingredient.
[0046]
In addition, the invention of this application provides the above-mentioned composition having few side effects on humans and the like, characterized in that various forms and administration methods become possible by containing a pharmaceutical ingredient.
[0047]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic view illustrating the structure of an RRF-DI of the invention of this application.
FIG. 2 is a schematic diagram illustrating a procedure for preparing an RRF-DI expression plasmid illustrated in FIG.
FIG. 3 is a graph showing the results of CD spectra of Escherichia coli wild-type RRF and RRF-DI.
FIG. 4 is a graph showing ribosome regeneration activity in a wild-type RRF.
FIG. 5 is a graph showing ribosome regeneration activity when the wild type RRF is 1 and the RRF-DI is 50.
FIG. 6 is a graph showing ribosome regeneration activity in RRF-DI.
FIG. 7 is a schematic view illustrating the process of ribosome regeneration.
FIG. 8 is a diagram comparing and exemplifying the amino acid sequence of RRF of each bacterial species.
FIG. FIG. 3 is a schematic view illustrating the structure of R. parahaemolyticus.
FIG. 10 is a schematic diagram comparing and exemplifying the structure of RRF of each bacterial species.

Claims

A ribosome regeneration factor mutant, which has a regeneration inhibitory activity on prokaryotic ribosomes.

The ribosome regeneration inhibitor according to claim 1, wherein the ribosome regeneration factor comprises domain I (A) -domain II-domain I (B).

3. The ribosome regeneration inhibitor according to claim 2, wherein the mutant lacks part or all of domain II.

3. The ribosome regeneration inhibitor according to claim 2, wherein the mutant has part or all of domain II substituted with one or more amino acid residues.

5. The ribosome regeneration inhibitor according to claim 4, wherein the amino acid residue consists of 1 to 5 glycine residues.

A DNA fragment encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

A DNA fragment consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.

A ribosome regeneration inhibitor expression vector comprising an expression cassette having the ribosome regeneration inhibitor coding sequence according to any one of claims 1 to 5.

A ribosome regeneration inhibitor expression vector comprising an expression cassette having the DNA fragment of claim 6.

A ribosome regeneration inhibitor expression vector comprising an expression cassette having the DNA fragment of claim 7.

A ribosome regeneration inhibitory factor expressed by the expression vector according to any one of claims 8 to 10.

A composition which exerts a disturbing effect on the survival or proliferation of prokaryotes, wherein the composition comprises any one of claims 1 to 5 or 11 as a ribosome regeneration inhibitor.

13. The composition of claim 12, wherein the prokaryote is a bacterium.

14. The composition of claim 12 or claim 13 comprising a pharmaceutical ingredient.