JP2004298157A

JP2004298157A - Method for catching cell

Info

Publication number: JP2004298157A
Application number: JP2003098239A
Authority: JP
Inventors: Yukiaki Saeki; 享昭佐伯; Yoshihiro Hatanaka; 美博畑中
Original assignee: Asahi Kasei Corp
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 2003-04-01
Filing date: 2003-04-01
Publication date: 2004-10-28

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method and a device for catching cells simply in a short time on detecting a definite specific type group of the cells from a living body-derived material to be detected, and especially a method suitable for detecting stem cells or precursor cells differentiating to Langerhans islands or insulin-expressing cells, from the pancreas. <P>SOLUTION: This method for catching the cells used in the detection of the cells is to catch cells used for detecting a specific type group cells contained in the living body-derived material, and is provided by preparing cell suspension by separating the cells containing such cells from the living body-derived material, dripping it on a water-absorbing substrate catching the cells of the specific type group to absorb the water content of the cell suspension and also catch the cells. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、膵臓等の生物由来材料から必要な細胞を検出する際に、短時間に、かつ、簡便に捕捉する方法およびそれに用いられる装置に関する。特に、本発明は、酵素等によって膵臓器等を消化した後、遊離させた組織または細胞懸濁液を吸水性基材に滴下し、ランゲルハンス島等の特定の細胞型群を検出する際の捕捉方法及びその装置に関する。
本発明により捕捉される細胞型群は、ランゲルハンス島に限らず、癌細胞を捕捉、検出することによる癌の診断等にも適用が可能である。
【０００２】
【従来の技術】
糖尿病は、日本のみならず世界的に広がっている深刻な疾病である。１９９７年に旧厚生省が行った調査では、「糖尿病が強く疑われる人」が約６９０万人存在し、この値に「糖尿病の可能性を否定できない人」６８０万人を加えると、約１３７０万人がリスク群と推定されている。ＷＨＯの推定する全世界の糖尿病人口は、２０００年で１億５千万人あまりであり、２０２５年には約３億人に達するものと予測されている。
【０００３】
近年、糖尿病の根治的治療法として、膵島移植が注目を浴びるようになってきている。膵島移植は、生理的な血糖コントロールを可能とし、手技も簡単で、ハイリスク例にも応用できる、優れた糖尿病治療法として期待されている。
膵島移植は、糖代謝の改善による糖尿病性二次病変の進行阻止または改善を目的としているが、強化インスリン療法やインスリン持続皮下注入療法でも血糖コントロールの難しいインスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）は、まさに膵島移植のよい適応であると考えられている。
【０００４】
膵島移植は局所麻酔で可能なほどで、手術侵襲が極めて小さいため、糖尿病患者にとってより安全であり、血管吻合の必要がないため血管病変の進行により膵（臓器）移植の適応外になった患者でも実施可能である。また、門脈循環にインスリンが放出されるため生理学的にも有利である。さらに、分離膵島の凍結保存によるいわゆるｂａｎｋｉｎｇも可能である等、膵（臓器）移植と比較して多くの利点を有している。
【０００５】
インスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）臨床の実際では、積極的にインスリン療法が用いられている。これは、インスリンを投与することにより患者自身の膵島β細胞を休息させ、それによりβ細胞の機能が回復してくるのを待つという考え方からであり、近年、積極的に導入され、好結果が報告されている。
このことは、ＮＩＤＤＭにおいても膵島移植によって治療可能であることを示しており、ＮＩＤＤＭ例のβ細胞機能が低下してきている時期に膵島を移植すれば、再びβ細胞機能が回復し、ＮＩＤＤＭの悪化を防止できる可能性も考えられている。
【０００６】
実験的医療の段階から始まった膵島移植は、当初、成績が芳しくなかったが、１９９９年３月よりカナダのエドモントン（Ｅｄｍｏｎｔｏｎ）にあるアルバータ（Ａｌｂｅｒｔａ）大学において、新しい画期的なエドモントン・プロトコール（ＥｄｍｏｎｔｏｎＰｒｏｔｏｃｏｌ）が実施され、膵島移植施行７例全例がインスリン離脱（ｉｎｓｕｌｉｎｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）したということが報告され（非特許文献１参照）、このプロトコールによる多施設共同トライアルも準備されている。
【０００７】
このように、膵島移植の臨床研究までに発展した理由としては、大動物膵よりの大量膵島分離法の研究がなされ、１９８４年、Ｒｉｃｏｒｄｉらは、独自の自動膵島分離装置を考案し、ブタ、ヒト膵よりの大量膵島分離に成功したことが大きい。
膵島移植に利用される膵島の分離、調製には、一般的に次のような大量膵島分離に関する技術が知られている。すなわち、特許文献１および非特許文献２に代表される文献に記載されている技術である。
【０００８】
具体的な膵島の一般的な単離操作は、以下の工程で行われる。
まず、ヒトまたはブタの膵臓の膵管に、コラゲナーゼ含有媒体の注入または灌流によって膵臓を低温で消化し、その後、コラゲナーゼ含有媒体を注入した膵臓を専用の消化チャンバー内に入れる。
第２に、プロテアーゼの有効な作用を可能にすべく、チャンバー中の媒体の温度を上げて、膵臓を含有する消化チャンバー中にプロテアーゼ含有媒体を加え、適切な撹拌を行いながら；
第３に、消化チャンバー内の膵臓からのランゲルハンス島の流出をジチゾン（ジフェニルチオカルバゾン）染色により顕微鏡等で直接検出した後；
第４に、新たな低温媒体を消化チャンバー内に導入して、消化チャンバーから流出してきた細胞を回収器中に流出させ回収する。
【０００９】
最後に、回収フラスコからの細胞懸濁液にフィコール等の比重液による勾配を与え、遠心分離してランゲルハンス島細胞を含有する精製画分を回収する。
上記のように、消化チャンバーからのランゲルハンス島流出の検出は、実施者の目視による検鏡作業であることから操作が煩雑であり、実施者に負担を強いる、検出に時間を要するといった欠点があった。また、流出するランゲルハンス島の濃度が低い状態では、正確な計数のためにより多くのサンプルを検鏡する必要があり、したがって、より広い範囲を検鏡することとなるため、実施者にさらなる負担を課す。そのため、流出したランゲルハンス島を捕捉し、簡便に検出する方法の確立が望まれていた。
【００１０】
非特許文献３には、孔径１００μｍのナイロンメッシュである、セルストレイナー（商標、ＢＤバイオサイエンス社製）に膵臓消化液を注ぎ、５０ｍｌのＨＢＳＳですすいだ後、ペトリ皿に本セルストレイナーを逆さに置き、２０ｍｌのＨＢＳＳで洗い流してペトリ皿に回収するという細胞の分離、回収方法が記載されている。しかし、これは細胞の回収を目的としたものであり、フィルター上に捕捉した細胞の検出についての記載は一切無い。
特許文献２には、微生物をフィルター上に保持し、死細胞を染色後、生細胞のＤＮＡを解離させ、インターカレータで染色することにより生細胞の検出を行っているが、この方法によると、複数回の染色が必要であることから操作が煩雑であり、それに伴い、検出に要する時間も増大するという問題点を有する。
【００１１】
特許文献３には、一定量の血液を、シリンジ内にセットされたｇｌａｓｓｍｉｃｒｏｆｉｂｅｒｆｉｌｔｅｒ上に乗せ、顆粒球計測を阻害する成分を予め除去するために、血液中の顆粒球は破壊しないように水を加え、赤血球を溶血させた後、サンプル内の溶解成分を吸引洗浄（ｐｒｅｓｓｕｒｅｗａｓｈ）する。その後、溶解されなかった顆粒球を含むｇｌａｓｓｆｉｂｅｒｆｉｌｔｅｒを乾燥させ、そのｆｉｌｔｅｒに対して０．００５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、３０ｍＭ３−ａｍｉｎｏ−１，２，４ｔｒｉａｚｏｌｅ、０．０００５％Ｈ_２Ｏ_２、および０．５ｍｇ／ｍｌｏ−ｔｏｌｉｄｉｎｅを含む５０ｍＭリン酸バッファーを滴下する。そして、顆粒球から溶出されたミエロペルオキシダーゼの作用により青色に染色されたスポットを顆粒球として計測する方法が記載されている。この方法も、操作が非常に煩雑であり、また細胞を破壊するため、フィルターに捕捉した細胞の形状や状態を観察することができないという問題点がある。
【００１２】
目的細胞の検出方法としては、特許文献４に、フィルターを用いてレジオネラ菌を検出する方法が記載されているが、フィルターを培地に重ね培養し、コロニーを形成後にフィルターを分離し、菌体を破壊し、抗体を用いてコロニーを検出するという極めて煩雑な操作を行い、かつ、著しく操作のための時間を要する等の問題点がある。
特許文献５には、フィルター上に捕捉した微生物のＤＮＡに標識抗ＤＮＡ抗体を結合させることにより検出を行う方法が記載されているが、検出結果が得られるまでに数十分から数日を要し、速やかな検出が求められる場においては適用不可能である。
【００１３】
特許文献６には、フィルターによって濃縮し、蛍光ラベル化することにより生存細菌及び白血球を計数する方法が記載されている。この方法によると、計数をフローサイトメーターまたはレーザースキャン血球計算器で行うために、その装置を持たない施設での検出は不可能であり、また、検出に前処理だけでも数十分を要することから、迅速な検出には不適当である。
特許文献７には、ポリマー膜フィルター上に保持した細胞に対して、標識核酸プローブをＤＮＡに結合させ、検出する方法が記載されているが、核酸プローブとのインキュベーションに一晩を要する等、迅速な検出には程遠いものである。
【００１４】
特許文献８には、フィルター上に保持した細胞を緩衝界面活性溶液により破砕し、ハイブリダイゼーションにより検出する方法が記載されているが、処理に時間を要し、迅速な検出は不可能である。
特許文献９には、フィルター上に保持した微生物を蛍光によって検出する方法が記載されているが、蛍光で検出するための励起光源が必要であり、検出のための装置が高価となるという問題点を有している。
また、いずれにおいても生体由来材料からの特定細胞型群検出について記載は一切無い。
すなわち、これまで膵臓器から分離したランゲルハンス島を検出する際に効率的に捕捉する方法は知られていなかった。
【００１５】
【非特許文献１】
ＳｈａｐｉｒｏＡＭ，ＬａｋｅｙＪＲＴ，ＲｙａｎＥＡ，ＫｏｒｂｕｔｔＧＳ，ＴｏｔｈＥ，ＷａｒｎｏｃｋＧＬ，ＫｎｅｔｅｍａｎＮＭ，ＲａｊｏｔｔｅＲＶ：ＮＥｎｇＪＭｅｄ，３４３，２３０−２３８（２０００）
【非特許文献２】
ＲｉｃｏｒｄｉＣ，ＬａｃｙＰＥ，ＦｉｎｋｅＥＨ，ＯｌａｃｋＢＪ，ＳｃｈａｒｐＤＷ：Ｄａｉｂｅｔｅｓ，３７，４１３−４２０（１９８８）
【非特許文献３】
ＰａｏｌｏＲ．Ｏ．Ｓａｌｖａｌａｇｇｉｏ，ｅｔａｌ：Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，７４，８７７−９００，２００２
【特許文献１】
特表平２−５０４２２２２号公報（米国特許第５０７９１６０号明細書に対応）
【特許文献２】
国際公開第９０／０３４４０号パンフレット
【特許文献３】
国際公開第９３／０１３０６号パンフレット
【特許文献４】
特開平６−２１３８９４号公報
【特許文献５】
特開平８−２８９７８０号公報
【特許文献６】
特開平９−１１９９２６号公報
【特許文献７】
特表平１０−５０１４１９号公報（国際公開第９５／３４６８５号パンフレットに対応）
【特許文献８】
特表平１１−５０９１０４号公報（国際公開第９７／４２３４９号パンフレットに対応）
【特許文献９】
特開平２００２−２９１４９９号公報
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、生物由来材料からの細胞の一定の特定型群を検出する際に、短時間に、かつ、簡便に捕捉する方法およびそれに用いる装置を提供することを目的とする。とりわけ、本発明は、膵臓器からのランゲルハンス島やインスリン産生細胞へと分化する幹細胞や前駆細胞を検出する際に、短時間に、かつ、簡便に捕捉することができる方法および装置を提供することにある。
さらに本発明は、捕捉された細胞を検出するための方法を提供するものである。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）生物由来材料に含まれる特定型群の細胞検出に用いる細胞を捕捉する方法であって、生物由来材料から該細胞を含む細胞を遊離させて細胞懸濁液を調製し、これを特定型群の細胞を捕捉する吸水性基材上に滴下することにより細胞懸濁液の水分を吸収させると共に、基材に該細胞を捕捉することを特徴とする細胞検出に用いる細胞捕捉方法。
【００１８】
（２）生物由来材料が、臓器、器官および組織から選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする（１）に記載の細胞検出に用いる細胞捕捉方法。
（３）生物由来材料が膵臓であることを特徴とする（１）に記載の細胞検出に用いる細胞捕捉方法。
（４）特定型群の細胞が、幹細胞、前駆細胞およびランゲルハンス島から選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする（１）に記載の細胞検出に用いる細胞捕捉方法。
（５）吸水性基材が不織布で構成されていることを特徴とする（１）に記載の細胞検出に用いる細胞捕捉方法。
【００１９】
（６）特定型群の細胞含む細胞懸濁液を、吸水性基材に滴下する前または滴下した後に該細胞を染色することを特徴とする（１）に記載の細胞検出に用いる細胞捕捉方法。
（７）（６）に記載の方法により染色された特定型群の細胞を、肉眼で確認または計数することを特徴とする特定型群の細胞検出方法。
（８）（６）に記載の方法により染色された特定型群の細胞の画像をコンピュータに取り込み、取り込まれた画像の色信号を計測して細胞数を求めることを特徴とする特定型群の細胞検出方法。
【００２０】
（９）生物由来材料に含まれる特定型群の細胞を検出する際に該細胞を捕捉する装置であって、
（Ａ）該細胞を含む細胞懸濁液の水分を吸収することにより該細胞を捕捉する吸水性基材、
（Ｂ）該基材を支持する支持体であって、該支持体には、（Ａ）で調整された細胞懸濁液を吸水性基材に供給するための開口部が設けられ、吸水性材料の色と、それとは異なる色とを識別することのできる透明な部分を有する支持体、
を備えた細胞検出に用いる細胞捕捉装置。
（１０）吸水性基材が不織布で構成されていることを特徴とする請求項９記載の細胞検出に用いる細胞捕捉装置。
【００２１】
本発明により、特定型群の細胞を細胞懸濁液より短時間に、かつ簡便に濃縮し、検出することができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
図１は、本発明に用いられる装置の一例を示す模式図である。生物由来材料から特定型群の細胞を含む細胞を遊離させて細胞懸濁液を調製し、これを特定型群の細胞を捕捉する吸水性基材３上に滴下する。この吸水性基材３は、支持基板１と支持基板２からなる支持体によって挟まれており、細胞懸濁液に含まれる水分を吸収することにより細胞を濃縮すると共に、吸水性基材に捕捉された細胞を検出手段６により検出する。
【００２２】
支持基板１には、図１に示すように、穴４を開け、その穴より細胞懸濁液を滴下してもよい。細胞懸濁液を滴下する手段として、マイクロピペッター５のように定量的に滴下できる装置を用いることにより、捕捉された特定型群の細胞を、計測手段６を用いて計数し、その結果から細胞懸濁液中での濃度を計算することができる。マイクロピペッターとは、ピペットマン（登録商標、ギルソン社製）に代表されるような、液体を少量、定量的に分取することのできる装置のことである。支持基板は、吸水性材料の色と、それとは異なる色とを識別することのできる透明な部分を有することが好ましい。
【００２３】
生物由来材料から特定型群の細胞を含む細胞を遊離させて細胞懸濁液を調製する手段としては、例えば、チャンバーに該生物由来材料とそれを消化する酵素を生理的媒体とともに入れ、一定時間後に生理的媒体をピペット等によって回収する方法、超音波、ホモジナイザー等を用いて生物由来材料を破砕する方法等が挙げられる。用いられる生物由来材料及び目的とする特定型群の細胞の種類に応じて、調整手段を選択することが望ましい。遊離させる際に、生物由来材料を含む容器を撹拌または振盪することにより遊離を促進することが好ましい。
【００２４】
調製した細胞懸濁液を基材に滴下する方法として、スポイトやピペット等を用いて一定量滴下する方法、自動分注装置等を用いて自動で滴下する方法などが挙げられる。滴下する細胞懸濁液の数によって適宜選択して使用する。
本明細書に記載されている、生物由来材料とは、円口類、棘魚類、板皮類、軟骨魚類、硬骨魚類、両性類、爬虫類、鳥類、哺乳類に属する動物由来の、個体、器官、臓器、組織のことをいう。生物由来材料の例として、動物個体、胎児、脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、副腎、脾臓、胆のう、胎盤、食道、胃、腸、大腸、十二指腸、皮膚、骨、骨髄、軟骨、目、角膜、羊膜、筋肉、胆管、血管、神経等が挙げられる。とりわけ、近年の膵島移植や再生医療の発展を鑑み、膵臓、肝臓、胎盤、十二指腸、胆管が好適に用いられ、近年の膵島移植の劇的な成績の向上を考慮すると、膵臓がより好適に用いられる。
【００２５】
本発明に記載の、特定型群の細胞とは、細胞または細胞クラスターがもつ特徴的な、ある種の性質を有する細胞の集団および細胞クラスターの集団として定義される。細胞または細胞クラスターが持つ特徴的な性質とは、細胞または細胞クラスターのサイズ、比重、内容物、表面マーカー、分泌タンパク、化学物質による染色性等を指し、それらのうち、同一の性質を有する細胞または細胞クラスターの集団が細胞の特定型群である。細胞は正常なものに限定されず、腫瘍細胞等も含まれる。例えば、ランゲルハンス島や膵臓由来のインスリン産生細胞へ分化する幹細胞または前駆細胞は、密度勾配遠心分離によって同一の比重をもった細胞の特定型群として分離される。なかでも、ランゲルハンス島は量的にも多く採取することができる。
【００２６】
本発明に記載の、幹細胞とは、種々の細胞に分化する能力を有する細胞のことを指し、通常、組織や臓器中に存在する成人幹細胞、前駆細胞等も含まれる。例えば、インスリンを産生するβ細胞へ分化する幹細胞（または前駆細胞）は、膵臓の場合、膵管に存在するという報告や肝臓細胞にも存在するということが知られている。
本発明に記載の、特定型群の細胞を捕捉する吸水性基材とは、多孔質体からなる構造物で、一方の面から他方の面に連通する多数の微細な孔を有し、水分を吸収し、かつ、特定型群の細胞を選択的に分離除去できる平均孔径または親和性を有する基材を意味する。
【００２７】
多孔質体とは、微細な孔を多数有する基材のことをいい、その材質、厚さ、形状、寸法等は限定されない。多孔質体の材質としては、有機材料、無機材料、または有機材料と無機材料からなる複合材料であってもよい。その中でも、有機材料、とりわけ、有機高分子材料は、切断等の加工性に優れるため好ましい素材である。有機高分子としては、例えば、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、ポリエステル、ポリアミド、ポリスチレン、ポリスルホン、セルロース、セルロースアセテート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフッ化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリトリフルオロクロロビニル、フッ化ビニリデン−テトラフルオロエチレン共重合体、ポリエーテルスルホン、ポリ（メタ）アクリレート、ブタジエン−アクリロニトリルコポリマー、ポリエーテル−ポリアミドブロツクコポリマー、エチレン−ビニルアルコールコポリマー等が挙げられるが、本発明の多孔質体はこれらに限定されるものではない。
【００２８】
多孔質体の形状は、細胞を捕捉できる細孔を有するものであればよく、平板状、球状、棒状、繊維状、中空状等のいずれの形態であってもよい。このような例として、メッシュ、フィルム、シート、膜、板、不織布、濾紙、スポンジ、織物、編物、塊、糸、中空糸、粒子等が挙げられる。細胞を捕捉するにあたって、操作を行いやすいように細胞を捕捉する孔の大きさを簡単に制御できることや、基材作製の容易さ及びコスト等を考慮すると、メッシュ、フィルム、シート、濾紙、膜、板、不織布、スポンジ、中空糸および粒子が好ましく、より好ましくは、メッシュ、フィルム、シート、濾紙、膜、不織布およびスポンジである。
【００２９】
多孔質体の孔の大きさには限定はないが、細胞を選択的に捕捉できるようにすることを考慮すると、平均孔径が０．１μｍ以上５００μｍ以下であることが好ましく、１μｍ以上４００μｍ以下がより好ましく、最も好ましくは５μｍ以上２００μｍ以下である。細胞の選択的捕捉を容易にするためには、上記多孔質体を複数重ね合わせて使用してもよい。
本発明における多孔質体の平均孔径とは、水銀ポロシメーターで測定される値である。水銀ポロシメーターで測定する場合は、細孔径分布曲線における最大のピークを示す細孔径（直径）が本発明でいう平均孔径である。したがって、多孔質体の平均孔径よりも大きい直径を有する粒子は入り難いという径を表わすものであって、これ以上の直径の粒子は絶対に入らないというものではない。
【００３０】
不織布とは、編織によらずに繊維または糸の集合体が、化学的、熱的または機械的に結合された布状のものである。繊維と繊維とが互いに接触して、摩擦によりまたは互いにもつれあうことにより一定の形状を保っている場合、これも、機械的に結合された、ということができる。織布とは、縦糸と横糸とが交錯してできた布地を意味する。
【００３１】
上記の多孔質体は、細胞の接着性を向上させるために、多孔質体の孔を塞がない程度に、高分子物質により表面コーティング処理を施されていてもよい。高分子物質は、天然高分子物質、半合成高分子物質、合成高分子物質の３つに大きく分類することができ、本発明においていずれの高分子物質も使用することができる。例えば、天然高分子物質としては、マイカ（雲母）、アスベスト（石綿）、グラファイト（石墨）、ダイアモンド、でんぷん、セルロース、アルギン酸等に代表される糖類及びゼラチン、コラーゲン、ラミニン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、フィブリノーゲン等に代表されるタンパク質やペプチド等が挙げられる。半合成高分子物質としては、ガラス、硝酸セルロース、酢酸セルロース、塩酸ゴム、カルボキシメチルセルロース等が挙げられる。合成高分子物質としては、ポリカーボネート、ポリホスホニトリルクロライド、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、ポリエチレンテレフタレート、ポリスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリジメチルアミノエチルメタクリレート及びヒドロキシエチルメタクリレートとジメチルアミノエチルメタクリレートの共重合体に代表されるような２種類以上の合成単量体からなる共重合体等が挙げられる。
【００３２】
コーティング処理のし易さを考慮すると、有機高分子物質が好ましく、タンパク質やペプチドおよび有機合成高分子物質がより好ましい。また、グラフト及び電子線や放射線照射等による、何らかの表面処理を施されていてもよい。
吸水性基材は、支持基板により支持されていることが取り扱いの容易さの点から好ましく、基材を挟み込んで支持することにより、特定型群の生物由来粒子を含む懸濁液添加後に基材をより詳細に観察する場合に取り出しが容易であるので好ましい。また、基材が取り扱いに十分な強度または硬度を持つ場合には基材が支持体を兼ねるものとする。
【００３３】
吸水性基材へ特定型群の生物由来粒子を含む懸濁液を添加するための導入部を支持基板上に設けることにより、検出操作が簡便になるので好ましい。この導入部は、支持基板上に特定型群の生物由来粒子を含む懸濁液を添加した際に、懸濁液が展開するのに十分な面積の開口部であることが好ましいが、基材が吸水性である場合は、開口部の面積は必ずしも懸濁液が展開する面積よりも大きい必要はなく、展開する面積を限定する場合には開口部の面積を小さくすることが好ましい。
吸水性基材を支持する材料としては、有機材料、無機材料及び有機材料と無機材料からなる複合材料であってもよい。その中でも有機材料、とりわけ、有機高分子は、切断等の加工性に優れるため好ましい素材である。
【００３４】
有機高分子としては、例えば、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、ポリエステル、ポリアミド、ポリスチレン、ポリスルホン、セルロース、セルロースアセテート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフッ化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリトリフルオロクロロビニル、フッ化ビニリデン−テトラフルオロエチレン共重合体、ポリエーテルスルホン、ポリ（メタ）アクリレート、ブタジエン−アクリロニトリルコポリマー、ポリエーテル−ポリアミドブロツクコポリマー、エチレン−ビニルアルコールコポリマー等が挙げられる。
【００３５】
無機材料としてはガラス、シリコン、金属、石英、セラミック等が挙げられる。その中でも容易な検出のためには、支持材料は透明性に優れていることが好ましく、透明性に優れた支持材料としては、プラスチック、ガラス、石英等が挙げられる。
繰り返し使用せずに、臨床の際や実験毎に使い捨てにするためには、安価、かつ、加工性に優れたプラスチックで作製された支持材料が必要である。具体的には、ポリメチルメタクリレート、塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、アクリロニトリルースチレン共重合体、アクリロニトリルーブタジエン共重合体、ポリクロルフルオロエチレン、ポリカーボネート、ポリアセタール、ポリフェニレンオキシド、グリプタル樹脂等の素材が挙げられる。好ましくは、ポリメチルメタクリレート、塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネートであるが、本発明の支持材料は上記例示に限定されるものではない。
【００３６】
吸水性基材上に捕捉された特定型群の細胞、例えば、ランゲルハンス島、インスリン産生細胞へ分化する幹細胞または前駆細胞を検出する手段として、顕微鏡による検鏡、肉眼による目視での確認、基材上に捕捉された細胞の画像をコンピュータに取り込むことによる色信号の計測等が挙げられる。定性的な検出の他、必要に応じて、定量的に計数・計測を行ってもよい。染色した目的細胞の画像をコンピュータに取り込み、コンピュータ上で解析し、取り込んだ画像の色信号を計測することにより計数を行うことは、検出の自動化を可能にすることから好ましい。
【００３７】
吸水性基材上に濃縮されたランゲルハンス島やインスリン産生細胞へ分化する幹細胞または前駆細胞は、染色試薬により染色することにより検出を容易に行うことができる。染色試薬として、例えば、ランゲルハンス島を特異的に染色するジチゾンのように、目的細胞のみを染色する試薬を用いることがより簡便な検出のためには好ましい。染色は吸水性基材に滴下する前に行ってもよいが、吸水性基材に滴下し、捕捉した後に染色試薬を滴下してもよい。
以上に述べたように、本発明の方法によって、生体由来材料から遊離された細胞懸濁液から、ランゲルハンス島やインスリン産生細胞へと分化する幹細胞または前駆細胞を、迅速に、かつ、簡便に捕捉することができる。
【００３８】
捕捉されたヒトの膵臓から得られるランゲルハンス島は、当然のことながら、適当な免疫抑制剤を用いることによって、そのまま膵島移植に使用できる。また、後ほどの使用のため、適当な材料中に封入することによって保存できる。このようなカプセル化により免疫応答が抑制され、その結果、異種移植への使用も可能となる。例えば、ブタ等のランゲルハンス島をヒトに移植することができる。また、ランゲルハンス島のみならずインスリン細胞へ分化することができる幹細胞や前駆細胞も調製することができるので、調製したそれらの細胞を適当な条件下で培養することによって、インスリン産生細胞へ分化、増殖させ、得られたインスリン産生細胞も移植療法に用いることができる。
また、癌細胞を捕捉、検出することにより診断に用いることもできる。
【００３９】
【発明の実施の形態】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
【００４０】
【実施例１】
ブタ膵臓の消化とセルストレイナー（商標、ＢＤバイオサイエンス社製）を用いたランゲルハンス島の捕捉、検出
屠殺場にてブタ膵臓摘出後、直ちに氷冷し、細切した。ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ緩衝液）にコラゲナーゼ（商標、新田ゼラチン社製、ｔｙｐｅＳ−１）を１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解した液１０ｍｌに細切したブタ膵臓１０ｇを入れ、３７℃に加熱した恒温槽にて数分おきに撹拌しながら２０分間加温した。
【００４１】
未消化の膵臓片を除き、残った消化液をジチゾン溶液によって染色した後、スライドガラス上に、顕微鏡視野内に拡大像が収まる上限である１μｌずつ滴下し、ランゲルハンス島を計数した。次に、染色した消化液を、セルストレイナー（商標、ＢＤバイオサイエンス社製）に５μｌ分取し、余剰の水分を裏面よりウェスを用いて除いた。検出手段として顕微鏡を用いて、分離ランゲルハンス島細胞の状態を観察し、計数を行った。
【００４２】
図２は、セルストレイナー（商標、ＢＤバイオサイエンス社製）７に捕捉されたランゲルハンス島８ａを撮像した写真であり、これよりランゲルハンス島をその色および形状により容易に検出することができることが確認された。図３は、ランゲルハンス島をスライドグラスに滴下する方法と本発明の方法で計数した結果を比較したグラフである。このグラフから、セルストレイナー（商標、ＢＤバイオサイエンス社製）を用いた方法により標準偏差が小さくなり、ほぼ同一の検鏡面積において、より正確にランゲルハンス島数を計測できることが確認された。本発明は同様の捕捉・検出を一つの装置上で行うものである。
【００４３】
【実施例２】
ブタ膵臓の消化と不織布を用いたランゲルハンス島の捕捉、検出
実施例１と同様に調整し、ジチゾン染色したブタ膵臓消化液を実施例１と同様にスライドグラスに滴下し計数した。次に、スライドグラス上に滴下された消化液１μｌ分の直径に相当する、直径６ｍｍの穴を有するアクリル板とスライドガラスで挟んだ平均孔径１２μｍの不織布に染色した消化液を５μｌ滴下し、ランゲルハンス島を分離した。
【００４４】
検出手段として顕微鏡を用いて、分離したランゲルハンス島細胞の状態を観察した。図４は、不織布９に捕捉されたランゲルハンス島８ｂを撮像した写真であり、これよりランゲルハンス島をその色並びに形状により容易に検出することができることが確認された。図５は、ランゲルハンス島をスライドグラスに滴下する方法と本発明の方法とで計数した結果を比較しグラフである。このグラフによると、不織布を用いた本発明の方法により標準偏差が小さくなり、本発明の方法を用いてランゲルハンス島を捕捉することで、ほぼ同一の検鏡面積において、より正確にランゲルハンス島数を計測できることが確認された。
【００４５】
【発明の効果】
本発明によれば、ランゲルハンス島やインスリン分泌細胞に分化する幹細胞や前駆細胞を迅速に、かつ、簡便に濃縮、検出できるので、膵島移植のためのランゲルハンス島検出工程の時間が短縮され、その作業も容易になる。
本発明により捕捉、検出後、分離精製されたランゲルハンス島は、次いで、糖尿病患者内にインスリンを生成させるため、糖尿病患者に移植することができる。また、生物由来材料から幹細胞や前駆細胞を捕捉、検出した場合は、それを分離精製後、培養してインスリン産生細胞に分化、増殖させて糖尿病患者に移植することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の細胞捕捉装置の一例を示す概略図。
【図２】実施例１におけるセルストレイナー（商標、ＢＤバイオサイエンス社製）に捕捉されたランゲルハンス島の顕微鏡写真。
【図３】実施例１におけるランゲルハンス島を計数した結果の比較を示したグラフ。
【図４】実施例２における不織布に捕捉されたランゲルハンス島の顕微鏡写真。
【図５】実施例２におけるランゲルハンス島を計数した結果の比較を示したグラフ。[0001]
[Industrial applications]
The present invention relates to a method for easily and quickly capturing necessary cells from biologically derived materials such as a pancreas and a device used therefor. In particular, the present invention provides a method for detecting a specific cell type group such as islets of Langerhans by dropping a released tissue or cell suspension onto a water-absorbing substrate after digesting a pancreatic organ or the like with an enzyme or the like. The present invention relates to a method and an apparatus therefor.
The cell type group captured by the present invention is not limited to the islets of Langerhans, and can be applied to cancer diagnosis and the like by capturing and detecting cancer cells.
[0002]
[Prior art]
Diabetes is a serious disease that is spreading not only in Japan but also worldwide. According to a survey conducted by the former Ministry of Health and Welfare in 1997, there were approximately 6.90 million "people who are strongly suspected of having diabetes," and when adding 6.8 million "people who cannot deny the possibility of diabetes," about 13.7 million People are estimated to be at risk. The WHO estimates that the worldwide diabetic population will be more than 150 million in 2000 and will reach about 300 million by 2025.
[0003]
In recent years, islet transplantation has been receiving attention as a curative treatment for diabetes. Pancreatic islet transplantation is expected as an excellent treatment for diabetes, which enables physiological control of blood sugar, is easy to perform, and can be applied to high-risk patients.
Islet transplantation is aimed at preventing or improving the progression of diabetic secondary lesions by improving glucose metabolism. It is considered a good indication for transplantation.
[0004]
Pancreatic islet transplantation is possible with local anesthesia and is minimally invasive, making it safer for diabetics. Patients who are not eligible for pancreatic (organ) transplantation due to progression of vascular lesions because vascular anastomosis is not required But it is possible. Also, insulin is released into the portal circulation, which is physiologically advantageous. Furthermore, it has many advantages as compared with pancreatic (organ) transplantation, such as so-called banking by cryopreservation of isolated islets.
[0005]
In the practice of non-insulin dependent diabetes mellitus (NIDDM) clinical practice, insulin therapy is actively used. This is based on the idea that insulin is administered to rest the patient's own pancreatic islet β-cells, thereby waiting for the β-cells to recover their functions. It has been reported.
This indicates that NIDDM can also be treated by islet transplantation, and if islet transplantation is performed during the period in which β-cell function in NIDDM patients is decreasing, β-cell function is restored again, and NIDDM is deteriorated. There is also a possibility that this can be prevented.
[0006]
Islet transplantation, which began at the experimental medical stage, initially performed poorly, but since March 1999 at the University of Alberta in Edmonton, Canada, a new groundbreaking Edmonton Protocol ( Edmonton Protocol) was performed, and it was reported that all seven cases of pancreatic islet transplantation had insulin withdrawal (see Insulin Independent) (see Non-Patent Document 1). A multicenter trial using this protocol is also being prepared.
[0007]
As described above, the reason for the development of clinical studies on islet transplantation was that a study was conducted on a method for separating large-scale islets from large animal pancreas. In 1984, Ricordi et al. Devised a unique automatic islet separation apparatus, The major success in separating large-scale islets from the human pancreas was significant.
For the isolation and preparation of pancreatic islets used for islet transplantation, the following techniques relating to the isolation of large-scale islets are generally known. That is, it is a technique described in documents represented by Patent Document 1 and Non-Patent Document 2.
[0008]
A typical general operation for isolating pancreatic islets is performed in the following steps.
First, the pancreas of the human or porcine pancreas is digested at a low temperature by injecting or perfusing a collagenase-containing medium into the pancreatic duct, and then the pancreas injected with the collagenase-containing medium is placed in a dedicated digestion chamber.
Second, to allow for the effective action of the protease, increase the temperature of the medium in the chamber and add the protease-containing medium into the digestion chamber containing the pancreas, with appropriate agitation;
Third, after the outflow of the islets of Langerhans from the pancreas in the digestion chamber is directly detected by dithizone (diphenylthiocarbazone) staining by a microscope or the like;
Fourth, a new low-temperature medium is introduced into the digestion chamber, and the cells that have flowed out of the digestion chamber are drained into the collector and collected.
[0009]
Finally, a gradient with a specific gravity solution such as Ficoll is applied to the cell suspension from the recovery flask, and centrifuged to collect a purified fraction containing Langerhans islet cells.
As described above, the detection of Langerhans islet outflow from the digestion chamber is a complicated operation because it is a microscopic work performed visually by the practitioner, and has the disadvantages of imposing a burden on the practitioner and requiring time for detection. Was. In addition, when the concentration of the outflowing islets of Langerhans is low, more samples need to be examined for accurate counting, and therefore, a larger area is examined, which places an additional burden on the practitioner. impose. Therefore, it has been desired to establish a method for capturing and easily detecting the escaping Langerhans island.
[0010]
In Non-Patent Document 3, the pancreatic digestive juice is poured into a cell strainer (trademark, manufactured by BD Biosciences), which is a nylon mesh having a pore size of 100 μm, rinsed with 50 ml of HBSS, and the cell strainer is inverted in a Petri dish. A method for separating and collecting cells is described in which the cells are placed, washed with 20 ml of HBSS, and collected in a Petri dish. However, this is for the purpose of recovering cells, and there is no description about the detection of cells captured on a filter.
Patent Literature 2 discloses detecting live cells by holding microorganisms on a filter, staining dead cells, dissociating live cell DNA, and staining with an intercalator. Since a plurality of stainings are required, the operation is complicated, and accordingly, there is a problem that the time required for detection also increases.
[0011]
Patent Literature 3 discloses that a fixed amount of blood is placed on a glass microfiber filter set in a syringe, and in order to remove components that inhibit granulocyte measurement in advance, water is applied so that granulocytes in blood are not destroyed. Is added to lyse the red blood cells, and then the lysed components in the sample are suction-washed. Thereafter, the glass fiber filter containing the undissolved granulocytes was dried, and the filter was subjected to 0.005% Triton X-100, 30 mM 3-amino-1,2,4 triazole, 0.0005% H ₂ O ₂ And a 50 mM phosphate buffer containing 0.5 mg / ml o-tollidine are added dropwise. A method is described in which a spot stained blue by the action of myeloperoxidase eluted from granulocytes is measured as granulocytes. This method also has a problem that the operation is very complicated and the cells are destroyed, so that the shape and state of the cells captured by the filter cannot be observed.
[0012]
As a method for detecting target cells, Patent Document 4 describes a method for detecting Legionella using a filter. The filter is overlaid on a medium, a filter is separated after colonies are formed, and the cells are separated. There is a problem in that extremely complicated operations such as destruction and detection of a colony using an antibody are performed, and the operation requires a significant amount of time.
Patent Document 5 describes a method of performing detection by binding a labeled anti-DNA antibody to DNA of a microorganism captured on a filter, but it takes tens of minutes to several days to obtain a detection result. However, it is not applicable in a case where prompt detection is required.
[0013]
Patent Document 6 describes a method for counting viable bacteria and leukocytes by concentrating with a filter and performing fluorescent labeling. According to this method, since counting is performed by a flow cytometer or a laser scanning cytometer, detection at a facility that does not have the device is not possible, and detection requires only tens of minutes even with pretreatment alone. Therefore, it is not suitable for rapid detection.
Patent Literature 7 describes a method of binding a labeled nucleic acid probe to DNA and detecting the cells held on a polymer membrane filter, but such a method is required that incubation with a nucleic acid probe requires overnight, for example. It is far from a simple detection.
[0014]
Patent Literature 8 describes a method in which cells held on a filter are crushed with a buffered surfactant solution and detected by hybridization, but the processing requires time and rapid detection is not possible.
Patent Document 9 describes a method for detecting microorganisms held on a filter by fluorescence. However, an excitation light source for detecting the fluorescence is required, and the detection apparatus becomes expensive. have.
In addition, there is no description in any case regarding detection of a specific cell type group from a biological material.
That is, a method for efficiently capturing the islets of Langerhans separated from pancreatic organs has not been known so far.
[0015]
[Non-patent document 1]
Shapiro AM, Lakey JRT, Ryan EA, Korbutt GS, Toth E, Warnock GL, Kneteman NM, Rajotte RV: N EngJ Med, 343, 230-238 (2000)
[Non-patent document 2]
Ricordi C, Lacy PE, Finke EH, Olac BJ, Sharp DW: Daibetes, 37, 413-420 (1988).
[Non-Patent Document 3]
Paolo R. O. Salvalaggio, et al: Transplantation, 74, 877-900, 2002.
[Patent Document 1]
Japanese Patent Publication No. 2-50442222 (corresponding to U.S. Pat. No. 5,079,160)
[Patent Document 2]
International Publication No. 90/03440 pamphlet
[Patent Document 3]
WO 93/01306 pamphlet
[Patent Document 4]
JP-A-6-213894
[Patent Document 5]
JP-A-8-289780
[Patent Document 6]
JP-A-9-119926
[Patent Document 7]
Japanese Patent Publication No. 10-501419 (corresponding to International Publication No. 95/34685 pamphlet)
[Patent Document 8]
Japanese Patent Publication No. 11-509104 (corresponding to International Publication No. 97/42349)
[Patent Document 9]
JP-A-2002-291499
[0016]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method for easily and quickly capturing a specific group of cells from a biological material in a short time, and an apparatus used for the method. In particular, the present invention provides a method and a device that can be captured in a short time and easily when detecting stem cells or progenitor cells that differentiate from pancreatic organs into islets of Langerhans or insulin-producing cells. It is in.
The present invention further provides a method for detecting captured cells.
[0017]
[Means for Solving the Problems]
That is, the present invention is as follows.
(1) A method of capturing cells used for detecting a specific type of cells contained in a biological material, which comprises releasing cells containing the cells from the biological material to prepare a cell suspension, and identifying the cell suspension. A cell-capturing method used for cell detection, characterized by absorbing water in a cell suspension by dropping the cells on a water-absorbing substrate for capturing cells of a type group, and capturing the cells on the substrate.
[0018]
(2) The method of capturing cells according to (1), wherein the biological material is at least one selected from an organ, an organ, and a tissue.
(3) The method for capturing cells according to (1), wherein the biological material is pancreas.
(4) The method according to (1), wherein the specific type of cells is at least one selected from stem cells, progenitor cells, and islets of Langerhans.
(5) The method according to (1), wherein the water-absorbing substrate is formed of a nonwoven fabric.
[0019]
(6) The method of capturing cells according to (1), wherein the cells are stained before or after dropping a cell suspension containing cells of a specific type on a water-absorbing substrate. .
(7) A method for detecting cells of a specific type group, wherein the cells of the specific type group stained by the method according to (6) are confirmed or counted with the naked eye.
(8) An image of a specific type group, which is obtained by capturing an image of cells of the specific type group stained by the method described in (6) into a computer, measuring a color signal of the captured image, and calculating the number of cells. Cell detection method.
[0020]
(9) An apparatus for capturing cells of a specific type contained in a biological material, when the cells are detected,
(A) a water-absorbing substrate that captures the cells by absorbing the water of a cell suspension containing the cells;
(B) a support for supporting the substrate, wherein the support is provided with an opening for supplying the cell suspension prepared in (A) to the water-absorbent substrate; A support having a transparent portion capable of distinguishing between the color of the material and a different color,
A cell capturing device used for cell detection, comprising:
(10) The cell capturing device according to claim 9, wherein the water-absorbing substrate is formed of a nonwoven fabric.
[0021]
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the cell of a specific type group can be concentrated and detected more simply and simply than a cell suspension.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
FIG. 1 is a schematic diagram illustrating an example of an apparatus used in the present invention. A cell suspension containing cells of a specific type is released from a biological material to prepare a cell suspension, and the suspension is dropped on a water-absorbent substrate 3 for capturing cells of a specific type. The water-absorbing substrate 3 is sandwiched between supports composed of the supporting substrate 1 and the supporting substrate 2, and condenses cells by absorbing water contained in the cell suspension and captures the cells in the water-absorbing substrate. The detected cells are detected by the detection means 6.
[0022]
As shown in FIG. 1, a hole 4 may be formed in the support substrate 1, and the cell suspension may be dropped from the hole. As a means for dropping the cell suspension, a device of a specific type, such as a micropipettor 5, is used to count the captured cells of a specific type group using the measuring means 6, and from the result, the cells are counted. The concentration in the suspension can be calculated. A micropipettor is a device such as a Pipetman (registered trademark, manufactured by Gilson) that can quantitatively separate a small amount of liquid. The support substrate preferably has a transparent portion that can distinguish the color of the water-absorbing material from the color different from the color.
[0023]
Means for preparing a cell suspension by releasing cells containing cells of a specific type from a biological material include, for example, placing the biological material and an enzyme that digests it in a chamber together with a physiological medium, Later, a method of collecting a physiological medium with a pipette or the like, a method of crushing a biological material using an ultrasonic wave, a homogenizer, or the like can be used. It is desirable to select the adjusting means according to the biological material to be used and the type of cells of the specific type group desired. When releasing, the release is preferably promoted by stirring or shaking the container containing the biological material.
[0024]
Examples of a method of dropping the prepared cell suspension onto a substrate include a method of dropping a predetermined amount using a dropper or a pipette, and a method of dropping automatically using an automatic dispensing device or the like. It is appropriately selected and used depending on the number of cell suspensions to be dropped.
The biological material described in the present specification includes conifers, spines, plateworms, cartilaginous fish, teleosts, amphibians, reptiles, birds, animals, animals, individuals, organs, Organs and tissues. Examples of biological materials include animal individuals, fetus, brain, heart, lung, liver, kidney, pancreas, adrenal gland, spleen, gallbladder, placenta, esophagus, stomach, intestine, large intestine, duodenum, skin, bone, bone marrow, cartilage, The eye, cornea, amniotic membrane, muscle, bile duct, blood vessel, nerve and the like can be mentioned. In particular, in view of the recent development of islet transplantation and regenerative medicine, the pancreas, liver, placenta, duodenum, and bile duct are preferably used, and in view of the dramatic improvement in islet transplantation in recent years, the pancreas is more preferably used. Can be
[0025]
According to the present invention, a specific type of cells is defined as a population of cells and a population of cell clusters having certain characteristics characteristic of the cells or cell clusters. The characteristic properties of cells or cell clusters refer to the size, specific gravity, contents, surface markers, secreted proteins, staining properties of chemicals, etc., of cells or cell clusters, and cells having the same properties among them. Alternatively, a population of cell clusters is a specific group of cells. Cells are not limited to normal ones, and include tumor cells and the like. For example, stem cells or progenitor cells that differentiate into insulin-producing cells derived from islets of Langerhans or pancreas are separated by density gradient centrifugation as a specific group of cells having the same specific gravity. Above all, Langerhans Island can be collected in large quantities.
[0026]
The stem cells described in the present invention refer to cells capable of differentiating into various cells, and usually include adult stem cells, progenitor cells, and the like present in tissues and organs. For example, in the case of pancreas, stem cells (or progenitor cells) that differentiate into insulin-producing β cells are reported to be present in the pancreatic duct and are also known to be present in liver cells.
According to the present invention, the water-absorbing substrate that captures cells of a specific type of group is a structure made of a porous material, and has a large number of fine holes communicating from one surface to the other surface, And a substrate having an average pore diameter or affinity capable of selectively separating and removing cells of a specific type of group.
[0027]
The porous body refers to a substrate having a large number of fine pores, and its material, thickness, shape, dimensions, and the like are not limited. The material of the porous body may be an organic material, an inorganic material, or a composite material including an organic material and an inorganic material. Among them, organic materials, particularly organic polymer materials, are preferable materials because of their excellent workability such as cutting. Examples of the organic polymer include polycarbonate, polyurethane, polyacrylonitrile, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetal, polyester, polyamide, polystyrene, polysulfone, cellulose, cellulose acetate, polyethylene, polypropylene, polyvinyl fluoride, polyvinylidene fluoride, and polytrifluoroethylene. Examples include chlorovinyl, vinylidene fluoride-tetrafluoroethylene copolymer, polyether sulfone, poly (meth) acrylate, butadiene-acrylonitrile copolymer, polyether-polyamide block copolymer, ethylene-vinyl alcohol copolymer, etc. The porous body is not limited to these.
[0028]
The shape of the porous body may be any as long as it has pores capable of capturing cells, and may be in any form such as a flat plate, a sphere, a rod, a fiber, and a hollow. Such examples include meshes, films, sheets, membranes, plates, nonwoven fabrics, filter papers, sponges, woven fabrics, knits, chunks, threads, hollow fibers, particles and the like. When capturing cells, considering that the size of the pores for capturing cells can be easily controlled so that the operation can be easily performed, and considering the ease and cost of fabricating the base material, meshes, films, sheets, filter papers, membranes, Plates, nonwovens, sponges, hollow fibers and particles are preferred, and more preferred are meshes, films, sheets, filter papers, membranes, nonwovens and sponges.
[0029]
The pore size of the porous body is not limited, but considering that cells can be selectively captured, the average pore diameter is preferably from 0.1 μm to 500 μm, and preferably from 1 μm to 400 μm. More preferably, it is most preferably 5 μm or more and 200 μm or less. In order to facilitate the selective capture of cells, a plurality of the above-mentioned porous bodies may be used in an overlapping manner.
The average pore diameter of the porous body in the present invention is a value measured by a mercury porosimeter. When measured with a mercury porosimeter, the pore diameter (diameter) showing the maximum peak in the pore diameter distribution curve is the average pore diameter in the present invention. Therefore, particles having a diameter larger than the average pore diameter of the porous body represent a diameter that is difficult to enter, and particles having a diameter larger than this do not mean that particles will never enter.
[0030]
A nonwoven fabric is a cloth in which an aggregate of fibers or yarns is chemically, thermally, or mechanically connected regardless of knitting or weaving. If the fibers and the fibers are in contact with each other and maintain a certain shape by friction or entanglement with each other, this can also be said to be mechanically connected. The woven fabric means a fabric formed by interlacing warp yarns and weft yarns.
[0031]
The above-mentioned porous body may be subjected to a surface coating treatment with a polymer substance so as not to block the pores of the porous body in order to improve the adhesiveness of cells. Polymer substances can be broadly classified into three groups: natural polymer substances, semi-synthetic polymer substances, and synthetic polymer substances, and any of the polymer substances can be used in the present invention. For example, natural polymer substances include mica (mica), asbestos (asbestos), graphite (graphite), diamond, starch, cellulose, sugars and gelatins represented by alginic acid, collagen, laminin, vitronectin, fibronectin, fibrinogen, etc. And proteins, peptides, and the like. Examples of the semi-synthetic polymer include glass, cellulose nitrate, cellulose acetate, rubber hydrochloride, carboxymethyl cellulose, and the like. Synthetic polymer substances include polycarbonate, polyphosphonitrile chloride, polyethylene, polyvinyl chloride, polyamide, polyethylene terephthalate, polysulfone, polyacrylonitrile, polyvinyl alcohol, polymethyl methacrylate, polyhydroxyethyl methacrylate, polydimethylaminoethyl methacrylate and hydroxyethyl Copolymers composed of two or more kinds of synthetic monomers typified by a copolymer of methacrylate and dimethylaminoethyl methacrylate are exemplified.
[0032]
Considering the ease of coating treatment, organic polymer substances are preferable, and proteins, peptides and organic synthetic polymer substances are more preferable. In addition, some surface treatment such as grafting, electron beam irradiation, or radiation irradiation may be performed.
The water-absorbing substrate is preferably supported by a supporting substrate from the viewpoint of ease of handling, and by supporting the substrate by sandwiching the substrate, the substrate containing a specific type of biologically-derived particles is added to the substrate. Is preferable because it is easy to take out when observing in more detail. When the substrate has sufficient strength or hardness for handling, the substrate also serves as the support.
[0033]
It is preferable to provide an introduction portion for adding a suspension containing biological particles of a specific type to the water-absorbent substrate on the support substrate, since the detection operation is simplified. The introduction portion is preferably an opening having a sufficient area for the suspension to expand when the suspension containing the biological particles of a specific type is added to the support substrate. When the suspension is water-absorbing, the area of the opening does not necessarily need to be larger than the area where the suspension spreads. When the area where the suspension spreads is limited, it is preferable to reduce the area of the opening.
The material for supporting the water-absorbing substrate may be an organic material, an inorganic material, or a composite material including an organic material and an inorganic material. Among them, organic materials, particularly organic polymers, are preferable materials because of their excellent workability such as cutting.
[0034]
Examples of the organic polymer include polycarbonate, polyurethane, polyacrylonitrile, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetal, polyester, polyamide, polystyrene, polysulfone, cellulose, cellulose acetate, polyethylene, polypropylene, polyvinyl fluoride, polyvinylidene fluoride, and polytrifluorochloro. Examples include vinyl, vinylidene fluoride-tetrafluoroethylene copolymer, polyether sulfone, poly (meth) acrylate, butadiene-acrylonitrile copolymer, polyether-polyamide block copolymer, and ethylene-vinyl alcohol copolymer.
[0035]
Examples of the inorganic material include glass, silicon, metal, quartz, and ceramic. Among them, for easy detection, the support material preferably has excellent transparency, and examples of the support material having excellent transparency include plastic, glass, and quartz.
In order to be disposable at the time of clinical use or each experiment without repeated use, a support material made of a plastic which is inexpensive and has excellent workability is required. Specifically, materials such as polymethyl methacrylate, vinyl chloride, polypropylene, polystyrene, polyethylene, acrylonitrile styrene copolymer, acrylonitrile butadiene copolymer, polychlorofluoroethylene, polycarbonate, polyacetal, polyphenylene oxide, and glyptal resin are used. No. Preferably, polymethyl methacrylate, vinyl chloride, polypropylene, polystyrene, polyethylene, and polycarbonate are used, but the support material of the present invention is not limited to the above examples.
[0036]
As a means for detecting a specific type of cells captured on the water-absorbent substrate, for example, islets of Langerhans, stem cells or progenitor cells that differentiate into insulin-producing cells, microscopy with a microscope, visual confirmation with the naked eye, substrate Measurement of a color signal by capturing an image of the cell captured above into a computer, and the like. In addition to qualitative detection, counting and measurement may be performed quantitatively as necessary. It is preferable to take an image of the stained target cell into a computer, analyze the image on the computer, and measure the color signal of the taken image to perform counting, since this enables automation of detection.
[0037]
Stem cells or progenitor cells differentiated into Langerhans islets or insulin-producing cells concentrated on a water-absorbent substrate can be easily detected by staining with a staining reagent. As a staining reagent, for example, a reagent that stains only target cells, such as dithizone that specifically stains islets of Langerhans, is preferably used for simpler detection. Dyeing may be performed before dropping on the water-absorbing substrate, or may be dropped on the water-absorbing substrate and the dyeing reagent may be dropped after capturing.
As described above, according to the method of the present invention, stem cells or progenitor cells that differentiate into islets of Langerhans or insulin-producing cells can be quickly and easily captured from a cell suspension released from a biological material. can do.
[0038]
The islets of Langerhans obtained from the captured human pancreas can, of course, be directly used for islet transplantation by using an appropriate immunosuppressant. It can also be preserved by encapsulating it in a suitable material for later use. Such an encapsulation suppresses the immune response, thereby allowing its use in xenografts. For example, islets of Langerhans such as pigs can be transplanted into humans. In addition, since stem cells and progenitor cells capable of differentiating into insulin cells as well as the islets of Langerhans can be prepared, by culturing the prepared cells under appropriate conditions, differentiation and proliferation into insulin-producing cells can be performed. The resulting insulin-producing cells can also be used for transplantation therapy.
In addition, it can be used for diagnosis by capturing and detecting cancer cells.
[0039]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
[0040]
Embodiment 1
Digestion of pig pancreas and capture and detection of islets of Langerhans using Cell Strainer (trademark, manufactured by BD Biosciences)
Immediately after excision of the pig pancreas at the slaughterhouse, it was ice-cooled and minced. 10 g of porcine pancreas is added to 10 ml of a solution of collagenase (trademark, type S-1 manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd.) at a concentration of 1 mg / ml in HBSS (Hank buffer), and heated to 37 ° C. The mixture was heated for 20 minutes in a constant temperature bath with stirring every few minutes.
[0041]
Undigested pancreas pieces were removed, and the remaining digestive juice was stained with a dithizone solution, and then dropped on a slide glass in an amount of 1 μl, which is the upper limit of an enlarged image within the visual field of the microscope, to count the islets of Langerhans. Next, 5 μl of the stained digested solution was dispensed into a cell strainer (trade name, manufactured by BD Biosciences), and excess water was removed from the back surface using a waste cloth. The state of the isolated islets of Langerhans cells was observed using a microscope as a detection means, and counted.
[0042]
FIG. 2 is a photograph of the Langerhans Island 8a captured by the cell strainer (trademark, manufactured by BD Biosciences) 7. It was confirmed that the Langerhans Island can be easily detected by its color and shape. Was. FIG. 3 is a graph comparing the results obtained by counting the method of dropping the islets of Langerhans onto a slide glass and the method of the present invention. From this graph, it was confirmed that the standard deviation was reduced by a method using a cell strainer (trademark, manufactured by BD Biosciences), and that the number of Langerhans islands could be measured more accurately at almost the same speculum area. In the present invention, the same capture / detection is performed on one device.
[0043]
Embodiment 2
Digestion of pig pancreas and capture and detection of islets of Langerhans using nonwoven fabric
Digestion-stained swine pancreatic digestive juice prepared in the same manner as in Example 1 was dropped on a slide glass and counted in the same manner as in Example 1. Next, 5 μl of a digested solution stained on a nonwoven fabric having an average pore diameter of 12 μm, which is sandwiched between an acrylic plate having a hole of 6 mm in diameter and a slide glass, corresponding to a diameter of 1 μl of the digested solution dropped on the slide glass, was dropped. Island isolated.
[0044]
The state of the separated islets of Langerhans cells was observed using a microscope as a detection means. FIG. 4 is a photograph of the Langerhans Island 8b captured by the nonwoven fabric 9, and it was confirmed that the Langerhans Island can be easily detected by its color and shape. FIG. 5 is a graph comparing the results of counting by the method of dropping Langerhans islands onto a slide glass and the method of the present invention. According to this graph, the standard deviation is reduced by the method of the present invention using a nonwoven fabric, and by capturing the Langerhans islands using the method of the present invention, the number of Langerhans islands can be more accurately determined at almost the same microscopic area. It was confirmed that measurement was possible.
[0045]
【The invention's effect】
According to the present invention, stem cells and progenitor cells that differentiate into islets of Langerhans and insulin-secreting cells can be rapidly and easily concentrated and detected. Will also be easier.
After capture and detection according to the present invention, the isolated and purified islets of Langerhans can then be transplanted into diabetic patients to produce insulin in the diabetic patients. When stem cells or progenitor cells are captured and detected from a biological material, they can be separated and purified, cultured, differentiated and expanded into insulin-producing cells, and transplanted to a diabetic patient.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of the cell capturing device of the present invention.
FIG. 2 is a micrograph of a Langerhans island captured by a cell strainer (trademark, manufactured by BD Biosciences) in Example 1.
FIG. 3 is a graph showing a comparison of the results of counting Langerhans islands in Example 1.
FIG. 4 is a micrograph of a Langerhans island captured in a nonwoven fabric in Example 2.
FIG. 5 is a graph showing a comparison of the results of counting Langerhans islands in Example 2.

Claims

A method for capturing cells used for detection of a specific type of cells contained in a biological material, which comprises releasing cells containing the cells from the biological material to prepare a cell suspension, A cell-capturing method for use in cell detection, wherein the cell-absorbing substrate absorbs the water of the cell suspension by dropping the cell suspension onto the cell, and captures the cells on the substrate.

2. The method according to claim 1, wherein the biological material is at least one selected from an organ, an organ and a tissue.

2. The method according to claim 1, wherein the biological material is pancreas.

2. The method according to claim 1, wherein the specific type of cells is at least one selected from stem cells, progenitor cells and islets of Langerhans.

2. The method according to claim 1, wherein the water-absorbing substrate is made of a nonwoven fabric.

2. The method according to claim 1, wherein the cell suspension is stained before or after the cell suspension containing the cells of the specific type is dropped on the water-absorbent substrate.

A method for detecting cells of a specific group, wherein the cells of the specific group stained by the method according to claim 6 are confirmed or counted with the naked eye.

A method for detecting cells of a specific type group, wherein an image of cells of the specific type group stained by the method according to claim 6 is taken into a computer, and a color signal of the taken image is measured to determine the number of cells.

An apparatus for capturing cells of a specific type group contained in a biological material, the cells being detected,
(A) a water-absorbing substrate that captures the cells by absorbing the water of a cell suspension containing the cells;
(B) a support for supporting the substrate, wherein the support is provided with an opening for supplying the cell suspension prepared in (A) to the water-absorbent substrate; A support having a transparent portion capable of distinguishing between the color of the material and a different color,
A cell capturing device used for cell detection, comprising:

The cell-capturing device used for cell detection according to claim 9, wherein the water-absorbing substrate is made of a nonwoven fabric.