【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、検体中の細菌を測定する方法及び装置に関し、特に桿菌を特異的かつ高感度に検出する方法及び装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
臨床検査、食品検査、環境水質検査などの様々な分野で、細菌の検査が行われている。細菌は必要に応じて、グラム染色性（グラム陽性菌・陰性菌）や形態上の特徴（球菌・桿菌・らせん菌）により分類される。
【０００３】
検体中の桿菌を検出する検査方法としては、寒天培地を用いた方法が知られている。細菌を培養して増殖させることにより、培地上にコロニーが形成される。このコロニーを顕微鏡で観察して菌種を判定する。またコロニー数を数えて菌数をカウントする。しかしこれらの方法は、コロニーとして肉眼で判別できるようになるまで細菌が増殖するのに１〜２日程度の時間を要し、またコロニーの観察、カウントは手間がかかり労力を要する。
【０００４】
近年、粒子分析装置を用いて細菌を自動測定することが試みられている。粒子分析装置では、試料液中に夾雑物が混入していると、それを測定対象の粒子として誤検知してしまう恐れがある。細菌は通常０．５〜５μｍ前後の大きさであり、その大きさの夾雑物、特に小さな夾雑物全てを除去することは困難な場合が多い。試料液中に細菌と同程度の大きさの夾雑物が存在していると、夾雑物を検出した信号と細菌を検出した信号の区別がつかず、細菌の正確な測定が難しい。
【０００５】
夾雑物の影響を低減させて粒子分析装置で細菌を測定する技術としては次のようなものがある。
（１）培養前・培養後の試料をフローサイトメータで測定し、両測定結果の差をとることにより試料中の夾雑物の影響による誤測定を防止する微生物の測定方法及び装置（例えば、特許文献１参照）。
（２）ｐＨ２．０〜４．５において細菌を含む試料にカチオン性界面活性剤を作用させて細菌の色素透過性を亢進させ、細菌の染色性を高めることにより、試料中に夾雑物が存在しても細菌が発する蛍光を検出することにより夾雑物から分離して計数する方法（例えば、特許文献２参照）。
【０００６】
上記のように粒子分析装置を用いると、比較的短時間で細菌を測定できるが、このような方法においてさらに検体中の桿菌を特異的、高感度に検出する方法は提案されていない。
【０００７】
【特許文献１】
米国特許第６１６５７４０号明細書
【特許文献２】
特開２００１−２５８５９０号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、夾雑物が存在していても、検体中の桿菌を特異的、高感度に検出する細菌分析方法及び装置を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記課題に鑑み本発明は、細菌を含む検体を桿菌の細胞壁合成を阻害する抗生剤の存在下で培養することにより試料液を調製し、粒子分析装置を用いて試料液中の各粒子から大きさ情報を検出し、検出した大きさ情報に基づき試料液中の桿菌を検出する細菌分析方法を提供する。
【００１０】
また本発明は、細菌を含む検体を桿菌の細胞壁合成を阻害する抗生剤の存在下で培養し、培養後の検体に、細菌を特異的に蛍光染色する蛍光染色剤を添加することにより試料液を調製し、粒子分析装置を用いて試料液中に含まれる各粒子から蛍光情報と大きさ情報を検出し、検出した蛍光情報に基づき細菌を弁別し、弁別された細菌の大きさ情報に基づき桿菌を検出する細菌分析方法を提供する。
【００１１】
また本発明は、細菌を含む検体を桿菌の細胞壁合成を阻害する抗生剤の存在下でインキュベートするためのインキュベータ、インキュベート後の検体を試料液としてサンプリングするサンプリング部、サンプリングされた試料液に含まれる各粒子から大きさ情報を検出する検出器を有する測定部、測定部で検出された大きさ情報に基づき桿菌を検出する分析部、を備える細菌分析装置を提供する。
【００１２】
また本発明は、細菌を含む検体を桿菌の細胞壁合成を阻害する抗生剤の存在下でインキュベートするためのインキュベータと、インキュベート後の検体に、細菌を特異的に蛍光染色する蛍光染色剤を添加するための染色処理部と、染色処理後の検体を試料液としてサンプリングするサンプリング部と、試料液に含まれる各粒子から蛍光情報を検出する第一の検出器、各粒子から大きさ情報を検出する第二の検出器を有する測定部と、検出された蛍光情報に基づき細菌を弁別し、弁別された細菌の大きさ情報に基づき桿菌を検出する分析部とを備えた細菌分析装置を提供する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
原理
実施例に先立ち、本発明の原理について説明する。
【００１４】
本発明では、抗生剤の存在下で細菌を培養処理することにより桿菌の形態を変化させて試料液を調製する。抗生剤は、細菌に対する作用の仕方から細胞壁合成阻害剤、核酸代謝阻害剤、蛋白合成阻害剤などに分類されるが、このうち細胞壁合成阻害剤を用いる。抗生剤による処理は、抗生剤を添加した培地で細菌を所定時間培養することにより行う。
【００１５】
細胞壁合成阻害剤の存在下で培養された桿菌の形態について説明する。図１４は、細胞壁合成阻害剤の一種であるＰｉｐｅｒａｃｉｌｌｉｎ ｓｏｄｉｕｍ（以下、「ＰＩＰＣ」と呼ぶ。これはペニシリン系の抗生剤である。）添加前の通常の桿菌の形態と、ＰＩＰＣを添加して培養した後の、形態変化を生じた桿菌の形態を模式的に示す図である。ＰＩＰＣの影響により、桿菌は増殖しても細胞分裂時に細胞壁が正常に合成されず、正常に分裂できなくなるため、細長く大きくなってゆく。細長く形態変化した桿菌は、通常の細菌と比べ、明らかに大きな大きさ情報を有することになる。本発明は、抗生剤存在下での培養により桿菌の形態が大きく変化することに着目したものである。
【００１６】
試料液中の各粒子から大きさ情報を検出するために、粒子分析装置を用いる。粒子分析装置としては電気抵抗式又は光学式のものを用いることができる。光学式粒子分析装置としては、各粒子にレーザ光を照射して生じた散乱光を信号として検出する分析装置を用いる。フローサイトメータがその代表的装置である。散乱光をパルス状の電気信号として検出し、その信号波形を解析して得られる散乱光強度や散乱光発光時間により、粒子の大きさや形態を詳細に分析できる。
【００１７】
図１５に、検出した前方散乱光信号の波形を例示する。縦軸は信号強度を、横軸は時間を表わす。図中、ノイズ除去のために閾値が設定されており、信号強度が所定の閾値を越えている部分が、粒子を検出している部分とみなされる。ここで前方散乱光強度（以下、「Ｆｓｃ」という）は、粒子の大きさを反映し、前方散乱光発光時間（以下、「Ｆｓｃｗ」という）は検出領域を通過する粒子の長さを反映する。いずれも粒子の大きさに関係する情報であり、散乱光から粒子の大きさに関する情報を得ることができる。
【００１８】
検出する信号としては、散乱光の他、種々の波長の蛍光の信号が適宜用いられる。測定対象の粒子を予め蛍光染色しておき、粒子から蛍光を検出することで、より詳細な粒子の情報を得ることができる。電気抵抗式粒子分析装置を用いる場合は、測定対象となる粒子を含む試料液を流す細孔と、細孔を挟むように配置された電極を有し、細孔を粒子が通過する際の電気抵抗変化をパルス状の電気信号として検出する分析装置を用いる。コールターカウンターがその代表的な装置である。
【００１９】
図１６は、抗生剤で処理せず培養した桿菌を含む試料液▲１▼、抗生剤としてＰＩＰＣを作用させて培養した桿菌を含む試料液▲２▼、をそれぞれフローサイトメータで測定した場合に得られるスキャッタグラムを模式的に表わしたものである。横軸にはＦｓｃｗ、縦軸にはＦｓｃをとっている。横軸においては、右へ行くほどＦｓｃｗの値が大きくなる。縦軸においては、上へ行くほどＦｓｃ値が大きくなる。試料液▲１▼では、桿菌がＦｓｃｗ・Ｆｓｃの値の小さな位置に出現しているが、同様のサイズの夾雑物が存在すると弁別できない。一方、試料液▲２▼では、夾雑物はＦｓｃｗの値の小さな位置に出現しているが、形態が細長く変化した桿菌は極端にＦｓｃｗ値の大きな位置に出現している。抗生剤で処理されていない細菌や夾雑物は、このようにＦｓｃｗ値の大きな位置には通常出現しない。
【００２０】
このように、通常の細菌よりＦｓｃｗ値が大きな位置に粒子が出現していることを確認すれば、桿菌の存在を検出できる。また形態変化した桿菌は通常の細菌や夾雑物が出現しない位置に出現するため、夾雑物の影響を受けずに検出されやすくなり、検出感度が向上する。
【００２１】
さらに夾雑物の影響を低減するために、細菌のみを特異的に蛍光染色する蛍光染色剤を用いて染色処理を施すことができる。特異的に染色された細菌は大きな蛍光強度を有するが、夾雑物は染色されないために蛍光強度をほとんど有しない。そこで、検出した粒子のデータのうち、一定以上の蛍光強度を有するものだけを細菌を検出したデータとして抽出し、そのデータを対象に大きさ情報に基づく分析を行えば、夾雑物の影響を排除した上で桿菌の検出を行うことができる。
【００２２】
なお、抗生剤を添加する前に既に死んでいる菌は細胞分裂をしないため、抗生剤による形態変化を生じない。よって形態変化を生じた桿菌を検出することで、生きた桿菌のみを検出することが可能になる。また、蛍光標識した抗体を細菌の表面抗原と反応させて菌種を分析する方法と、本発明の方法を組み合わせると、細菌が大きくなることにより表面抗原が増えることにより、検出される蛍光信号のＳ／Ｎ比が向上する。
【００２３】
【実施例】
以下、本発明にかかる自動細菌分析装置につき説明する。この自動細菌分析装置で分析対象とする検体としては、菌を寒天培地で培養し、形成されたコロニーから釣菌し、液体培地に混釈させたものを用いる。また試薬として、桿菌を形態変化させる抗生剤であるＰＩＰＣが用いられる。
【００２４】
自動細菌分析装置
図１は自動細菌分析装置１の外観を実線で、装置内部の概略構成を破線で示したものである。装置の最前面には実線で示すように、各種設定入力を行ったり、また測定結果を表示出力するための液晶タッチパネル１１、検体セット部カバー１２、試薬セット部カバー１３、スタートスイッチ１４を備えている。また破線で示す装置の内部構成において、上部には、装置の動作や分析処理を司る制御部４が配置されている。下部の手前側には、試料液を調製するための試料調製部２が配置されている。下部の奥側には試料液から信号を検出するための測定部３が配置されている。
【００２５】
試料調製部の構成
図２は試料調製部２を示す説明図である。試料調製部２は、検体セット部２１、試薬セット部２２、インキュベータ２３、分注装置２４を含む。前記図１の検体セット部カバー１２を開けることにより、検体セット部２１に検体の入った検体容器２５を、インキュベータ２３に微量試験管２７・２８をセットするようになっている。また前記図１の試薬セット部カバー１３を開けることにより、試薬セット部２２に、測定用試薬として用いるＰＩＰＣの入った試薬容器２６をセットするようになっている。インキュベータ２３は、セットされた微量試験管の中の液体を、所定の温度に保ちながら振盪撹拌する。分注装置２４は、その先端から所定量の液体を吸引・吐出するようになっており、また図示しない駆動装置によって上下左右に移動可能となっている。
【００２６】
測定部の構成
図３は測定部３を示す説明図である。図３に示すように、シースフローセル３０７は、試料液をオリフィス３１１に向かって上方へ噴射するノズル３１３と、シース液供給口３１０と、排液口３１４を備える。シースフローセル３０７の近傍には、レーザ光源３１７、コンデンサレンズ３１８、ビームストッパ３１９、コレクタレンズ３２０、ピンホール３２１を有する遮光版３３０、ダイクロイックミラー３２２、ホトダイオード３２５が設けられている。
【００２７】
シース液供給口３１０には陽圧ポンプ３４７で加圧されたシース液容器３０９がバルブ３０５を介して接続される。排液口３１４は図示しない廃液チャンバーに接続される。ノズル３１３は、バルブ３０１を介して陰圧ポンプ３４８に接続され、流路３３９のバルブ３０２側にシリンジポンプ３３３が接続されている。
【００２８】
制御部４の構成
図４は制御部４の構成、および制御部４と装置各部との関係を示すブロック図である。制御部４は、中央演算装置（ＣＰＵ）やＲＯＭ・ＲＡＭ等の記憶装置を有するマイクロコンピュータ、測定部３から送られた信号を処理する回路などを有する。制御部４は、格納部４１、分析部４２、動作制御部４３としての機能を果たす。格納部４１は、試料中の粒子から得た信号の分析に関する分析プログラムや、装置各部の動作を制御する制御プログラムを格納している。また測定部３で検出された信号のデータや、分析プログラムによる処理結果を記憶する。分析部４２は、試料液を測定して測定部３で検出された信号を処理し、処理後の信号を分析する。分析部４２での分析結果は、液晶タッチパネル１１に出力される。動作制御部４３は、格納部４１に格納されている制御プログラムに基づき、装置各部の動作を制御する。
【００２９】
図５は、制御プログラムによる自動細菌分析装置１の全体制御を示すフローチャートである。操作者がスタートスイッチ１４を押すと、制御プログラムが起動し、ステップＳ１（試料調製部制御）、ステップＳ２（測定部制御）、ステップＳ３（分析部制御）が順次実行される。これにより、試料調製部２、測定部３、分析部４２が制御され、自動細菌分析装置１の一連の動作が自動的に行われる。上記ステップＳ１、Ｓ２、Ｓ３による装置各部の動作を以下に説明する。
【００３０】
ステップＳ１（試料調製部制御）
試料調製部制御による試料調製部２の動作を、図２を用いて説明する。まず分注装置２４が、検体セット部２１にセットされている検体容器２５から検体を吸引し、インキュベータ２３にセットされている微量試験管２７および２８に、１ｍｌずつを分注する。次に分注装置２４は試薬セット部２２からＰＩＰＣを吸引して微量試験管２７に０．２ｍｌを分注し、検体にＰＩＰＣを添加する。この後インキュベータ２３が、ＰＩＰＣの添加された検体が入っている微量試験管２７、および検体のみが入っている微量試験管２８を、温度３７℃に保ちながら１２０分間振盪撹拌することでインキュベートする。これにより、微量試験管２７においてはＰＩＰＣ存在下で培養処理された試料（第一の試料液）が、微量試験管２８においては、ＰＩＰＣを添加せずに培養処理された対照試料液（第二の試料液）が、それぞれ調製される。
【００３１】
試料液が調製されると、分注装置２４が、微量試験管２７から第一の試料液を所定量吸引（サンプリング）し、試料容器３１２に吐出して供給する。試料容器３１２に供給された第一の試料液は、測定部３のシースフローセルに流される。次に、分注装置２４が、微量試験管２９から第二の試料液を所定量吸引（サンプリング）し、試料容器３１２に吐出する。吐出された試料液は、測定部３のシースフローセルに流される。
【００３２】
ステップＳ２（測定部制御）
測定部制御による測定部３の動作を、図３を用いて説明する。前記の通り試料容器３１２に第一の試料液が供給されると、まず陰圧ポンプ３４８を駆動する。バルブ３０１・３０２を所定時間開け、陰圧によって試料液をバルブ３０１とバルブ３０２の間の流路３３９に満たす。次にシリンジポンプ３３３が一定流量で流路３３９の試料液をノズル３１３へ押し出すことにより、ノズル３１３から試料液がシースフローセル３０７に吐出される。それと同時にバルブ３０５を開けることによりシース液容器３０９からシース液供給口３１０を介してシース液がシースフローセル３０７に供給される。
【００３３】
これによって試料液は、シースフローセル３０７内でシース液に包まれ、更にオリフィス３１１によって細く絞られて流れる。試料液の流れを、粒子径と同程度まで絞り込むことにより、試料液に含まれた粒子を一列に整列させてオリフィス３１１に流すことができる。
【００３４】
オリフィス３１１を流れる試料流３２６へ、レーザ光源３１７から出射されたレーザ光がコンデンサレンズ３１８で絞られて照射される。試料中の粒子に当たらずそのままフローセル３０７を透過したレーザ光はビームストッパ３１９で遮光される。レーザ光を受けた粒子から発せられる前方散乱光はコレクタレンズ３２０により集光され、遮光板３３０のピンホール３２１を通過する。そしてダイクロイックッミラー３２２に到達する。ダイクロイックミラー３２２で反射された前方散乱光は、ホトダイオード３２５で受光、光電変換されて前方散乱光信号３２８として出力される。前方散乱光信号３２８は、制御部４へ送られ、粒子毎のデータとして格納部４１に記憶される。
【００３５】
試料容器３１２に供給された第一の試料液がシースフローセル３０７に流され、前方散乱光信号が検出されると、前記の通り第二の試料液が試料容器３１２に供給される。そして第一の試料液と同様に、第二の試料液がシースフローセル３０７に流されて前方散乱光信号３２８が検出される。前方散乱光信号３２８は制御部４へ送られ、粒子毎のデータとして格納部４１に記憶される。
【００３６】
ステップＳ３（分析部制御）
分析部制御の詳細について、図６のフローチャートを用いて説明する。フローチャートの各ステップは以下の通りである。
【００３７】
ステップＳ１１：第一の試料液から検出された前方散乱光信号のデータを、格納部４１から読み出す。続いてステップＳ１２へ進む。
ステップＳ１２：第一の試料液中の各粒子から得られた前方散乱光信号に基づき、前方散乱光発光時間（Ｆｓｃｗ）、及び前方散乱光強度（Ｆｓｃ）を算出する。続いてステップＳ１３へ進む。
ステップＳ１３：ステップＳ１２で算出した粒子毎のＦｓｃｗ・Ｆｓｃをパラメータとしたスキャッタグラムを作成する。続いてステップＳ１４へ進む。
ステップＳ１４：ステップＳ１３で作成された第一の試料液のスキャッタグラムを格納部４１に記憶する。続いてステップＳ１５へ進む。
ステップＳ１５：第二の試料液から検出された前方散乱光信号のデータを、格納部４１から読み出す。続いてステップＳ１６へ進む。
ステップＳ１６：第二の試料液中の各粒子から得られた前方散乱光信号に基づき、前方散乱光発光時間（Ｆｓｃｗ）、及び前方散乱光強度（Ｆｓｃ）を算出する。続いてステップＳ１７へ進む。
ステップＳ１７：ステップＳ１６で算出した粒子毎のＦｓｃｗ・Ｆｓｃをパラメータとしたスキャッタグラムを作成する。続いてステップＳ１８へ進む。
ステップＳ１８：ステップＳ１７で作成された第二の試料液のスキャッタグラムを格納部４１に記憶する。続いてステップＳ１９へ進む。
ステップＳ１９：第一の試料液、および第二の試料液から得られたスキャッタグラムを格納部４１から読み出す。続いてステップＳ２０へ進む。
ステップＳ２０：読み出したスキャッタグラムを液晶タッチパネル１１に出力する。
【００３８】
液晶タッチパネル１１には、第一の試料液および第二の試料液から得られた二つのスキャッタグラムが同時に表示される。その画面例を図７に示す。画面右側に第一の試料液から得られたスキャッタグラムが、画面左側に第二の試料液から得られたスキャッタグラムが表示され、両者を一目で比較することができるようになっている。
【００３９】
分析結果の例
上記に説明してきた自動細菌分析装置１を用いて検体を分析した結果の例を示す。検体は以下の通り調製したものを用いた。まずＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）寒天培地にグラム陰性桿菌であるＥ．ｃｏｌｉを添加し一晩培養し、培地に形成されたコロニーから釣菌したものをミューラーヒントン（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ）液体培地に混釈して５分間振盪した後、フローサイトメータによって菌数を測定し、６×１０５／ｍｌ濃度の菌液を調製した。これをＥ．ｃｏｌｉ含有検体とした。また、グラム陰性桿菌であるＥ．ｃｌｏａｃａｅについても同様の作業にて菌液を調製し、これをＥ．ｃｌｏａｃａｅ含有検体とした。また試薬としては、濃度６４μｇ／ｍｌのＰＩＰＣを用いた。
【００４０】
本装置により前記Ｅ．ｃｏｌｉ含有検体を分析して得られたスキャッタグラムを図８に、Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ含有検体を分析して得られたスキャッタグラムを図９に示す。いずれのスキャッタグラムも、横軸にＦｓｃｗ、縦軸にＦｓｃをとっている。横軸においては、右へ行くほどＦｓｃｗの値が大きくなる。縦軸においては、上へ行くほどＦｓｃ値が大きくなる。
【００４１】
図８のスキャッタグラムのうちＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ含有検体にＰＩＰＣを添加せずに培養処理して調製した対照試料液を測定した結果である。Ｂは、Ｅ．ｃｏｌｉ含有菌液にＰＩＰＣを添加して培養処理して調製した試料液を測定した結果である。Ａ（ＰＩＰＣ無し）ではＦｓｃｗ値、Ｆｓｃ値共に小さな位置に粒子が出現している。この位置は、正常に増殖して形態変化していない桿菌や、他の細菌である球菌の出現位置と重なる位置である。Ｂ（ＰＩＰＣ有り）では図中、破線で囲んだ位置に形態変化したＥ．ｃｏｌｉが出現している。形態変化したＥ．ｃｏｌｉの出現位置はＦｓｃｗ値が大きく、弁別が容易である。
【００４２】
図９のスキャッタグラムのうちＡは、Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ含有菌液にＰＩＰＣを添加せずに培養処理して調製した対照試料液を測定した結果である。Ｂは、Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ含有菌液にＰＩＰＣを添加して培養処理して調製した試料液を測定した結果である。Ａ（ＰＩＰＣ無し）ではＦｓｃｗ値、Ｆｓｃ値共に小さな位置に粒子が出現している。この位置は、正常に増殖して形態変化していない桿菌や、他の細菌である球菌の出現位置と重なる位置である。Ｂ（ＰＩＰＣ有り）では図中、破線で囲んだ位置に形態変化したＥ．ｃｌｏａｃａｅが出現している。形態変化したＥ．ｃｌｏａｃａｅの出現位置はＦｓｃｗ値が大きく、弁別が容易である。
【００４３】
このようにスキャッタグラム上で、通常は細菌や夾雑物が出現しないようなＦｓｃｗの値の大きな位置に粒子が出現していることを確認することにより、試料液中に桿菌が存在しているとわかる。
【００４４】
変形例
測定前に、試料液をフィルタで濾過するといった処理を行わない場合、通常の細菌よりも大きな夾雑物が試料液に混入する場合がある。このような場合、抗生剤により形態変化した桿菌と夾雑物の大きさが重なり、桿菌検出の感度が低下する恐れがある。そこで、細菌を予め蛍光染色し、試料液中の粒子から蛍光を検出することによって、細菌と夾雑物の弁別がより確実なものとなる。
【００４５】
以下、前記実施例の変形例として、細菌を蛍光染色して桿菌の検出を行う自動細菌分析装置につき説明する。なおこの変形例における自動細菌分析装置は、前記実施例で用いた自動細菌分析装置１とほぼ共通の構成を有するので、対応する部位については同じ符号を用いて説明する。装置外観および装置内部の概略構成は図１に示したものと同様であり、また全体制御のフローは図５に示したものと同様である。試料調製部２、測定部３の構成および動作、分析部４１における分析制御のフローについて、以下に説明する。
【００４６】
図１０は試料調製部２を示す図である。前記図２に示した構成との違いは、試薬セット部２２に、ＰＩＰＣの入った試薬容器２６とは別に蛍光染色剤の入った試薬容器２９をセットできるようになっている点である。
【００４７】
この変形例の細菌分析装置で分析対象となる検体、および使用されるＰＩＰＣは、前記実施例と同様である。蛍光染色剤は、エチレングリコール１リットルに以下の構造式を有するポリメチン系色素４０ｍｇを溶解させたものを用いる。この色素は細菌の核酸と特異的に結合する性質を有するため、この色素を含む染色剤により、夾雑物を染色することなく細菌のみを特異的に染色することが可能である。
【００４８】
【化１】
【００４９】
検体の入った検体容器２５、微量試験管２７・２８、ＰＩＰＣの入った試薬容器２６、蛍光染色剤の入った試薬容器２９をセットした後、試料調製部２は以下のように動作する。まず分注装置２４が、検体セット部２１にセットされている検体容器２５から検体を吸引し、インキュベータ２３にセットされている微量試験管２７および２８に１ｍｌずつを分注する。次に分注装置２４は試薬容器２６からＰＩＰＣを吸引して微量試験管２７に０．２ｍｌを分注し、検体にＰＩＰＣを添加する。この後インキュベータ２３が、ＰＩＰＣの添加された検体が入っている微量試験管２７、および検体のみが入っている微量試験管２８を、温度３７℃に保ちながら１２０分間振盪撹拌することでインキュベートする。続いて分注装置２４は試薬容器２９から蛍光染色剤を吸引して微量試験管２７および２８に０．２ｍｌずつを分注する。この後インキュベータ２３が、微量試験管２７および２８を、温度４２℃に保ちながら１０秒間振盪撹拌して蛍光染色処理を施す。これにより、微量試験管２７においてはＰＩＰＣ存在下で培養処理され、かつ蛍光染色処理の施された試料液（第一の試料液）が調製される。微量試験管２８においては、ＰＩＰＣを添加せずに培養処理され、かつ蛍光染色処理の施された対照試料液（第二の試料液）が、それぞれ調製される。
【００５０】
調製された第一の試料液、第二の試料液が分注装置２４によってサンプリングされて試料容器３１２に供給され、測定部３のシースフローセル３０７へ流されるまでの動作は前記実施例と同様である。
【００５１】
図１１は、この変形例における測定部３の構成を示す図である。図３に示した前記実施例の測定部３と比較すると、フィルタ３２３およびホトマルチプライヤチューブ３２４を有し、試料液中の粒子から前方散乱光信号に加え蛍光信号を検出する機能を有する点で異なる。試料液からの前方散乱光信号の検出は前記実施例と同様に行われる。蛍光信号の検出は以下のように行われる。レーザ光を照射された試料液中の粒子から発せられた蛍光は、コレクタレンズ３２０により集光され、遮光板３３０のピンホール３２１を通過する。そしてダイクロイックッミラー３２２に到達する。前方散乱光よりも波長の長い蛍光は、ダイクロイックミラー３２２をそのまま透過し、フィルタ３２３で更に散乱光が除かれた後にホトマルチプライヤチューブ３２４で受光、光電変換されて蛍光信号３２７として出力される。蛍光信号３２７は、制御部４へ送られる。検出された前方散乱光も前記実施例と同様、前方散乱光信号３２８として制御部４へ送られる。
【００５２】
第一の試料液、第二の試料液から検出された蛍光信号３２７および前方散乱光信号３２８は、検出された粒子毎に対応付けられたデータとして制御部４の格納部４１に記憶される。そして分析部４２は、分析プログラムにより、各試料液から検出された粒子毎の蛍光信号３２７および前方散乱光信号３２８のデータを分析する。以下、図１２のフローチャートを用いて分析部制御の詳細を説明する。
【００５３】
ステップＳ２１：第一の試料液から検出された粒子のデータ（蛍光信号・前方散乱光信号のデータを含む）を、格納部４１から読み出す。続いてステップＳ２２へ進む。
ステップＳ２２：第一の試料液中の各粒子から得られた蛍光信号に基づき、蛍光強度（Ｆｌ）を算出する。続いてステップＳ２３へ進む。
ステップＳ２３：ステップＳ２２で算出したＦｌに基づき、Ｆｌが所定値以上の粒子のデータのみを抽出する。続いてステップＳ２４へ進む。
ステップＳ２４：ステップＳ２３で抽出された粒子のデータに関し、前方散乱光信号３２８に基づいて前方散乱光発光時間（Ｆｓｃｗ）、及び前方散乱光強度（Ｆｓｃ）を算出する。続いてステップＳ２５へ進む。
ステップＳ２５：ステップＳ２４で算出した粒子毎のＦｓｃｗ・Ｆｓｃをパラメータとしたスキャッタグラムを作成する。続いてステップＳ２６へ進む。
ステップＳ２６：ステップＳ２５で作成された第一の試料液のスキャッタグラムを格納部４１に記憶する。続いてステップＳ２７へ進む。
ステップＳ２７：第二の試料液から検出された粒子のデータ（蛍光信号・前方散乱光信号のデータを含む）を、格納部４１から読み出す。続いてステップＳ２８へ進む。
ステップＳ２８：第二の試料液中の各粒子から得られた蛍光信号に基づき、蛍光強度（Ｆｌ）を算出する。続いてステップＳ２９へ進む。
ステップＳ２９：ステップＳ２８で算出したＦｌに基づき、Ｆｌが所定値以上の粒子のデータのみを抽出する。続いてステップＳ３０へ進む。
ステップＳ３０：ステップＳ２９で抽出された粒子のデータに関し、前方散乱光信号３２８に基づいて前方散乱光発光時間（Ｆｓｃｗ）、及び前方散乱光強度（Ｆｓｃ）を算出する。続いてステップＳ３１へ進む。
ステップＳ３１：ステップＳ３０で算出した粒子毎のＦｓｃｗ・Ｆｓｃをパラメータとしたスキャッタグラムを作成する。続いてステップＳ３２へ進む。
ステップＳ３２：ステップＳ３１で作成された第二の試料液のスキャッタグラムを格納部４１に記憶する。続いてステップＳ３３へ進む。
ステップＳ３３：第一の試料液、および第二の試料液から得られたスキャッタグラムを格納部４１から読み出す。続いてステップＳ３４へ進む。
ステップＳ３４：読み出したスキャッタグラムを液晶タッチパネル１１に出力する。
【００５４】
蛍光染色処理により、試料液中の細菌のみが特異的に蛍光染色されているため、上記ステップＳ２３およびＳ２９においては一定以上のＦｌを有する粒子を細菌として抽出し、夾雑物を検出したデータを分析対象から除去することができる。図１３は、第一の試料液から得られたスキャッタグラムの一例を模式図として示したものであり、形態変化した桿菌のみがＦｓｃｗ値の大きな位置に出現している。この変形例では、スキャッタグラムを作成する前に、粒子から検出されるＦｌに基づき細菌と夾雑物が弁別される。そして弁別の結果、細菌として抽出されたデータのみについて、大きさ情報をパラメータとしたスキャッタグラムが作成される。そのためスキャッタグラム上には夾雑物のデータが出現せず、細菌のみが出現する。
【００５５】
【発明の効果】
本発明では、桿菌を抗生剤により形態変化させ、夾雑物や他の種類の菌とは明らかに異なる大きさ情報を持たせるようにすることで、形態変化をしていない場合には出現位置が重なってしまっていた球菌や夾雑物との弁別を容易にし、桿菌検出の特異度が向上する。また形態変化した桿菌は通常の細菌や夾雑物が出現しない位置に出現するため、夾雑物の影響を受けずに検出されやすくなり、検出感度が向上する。ここで、細菌を特異的に染色する蛍光染色剤により細菌を予め蛍光染色し、試料液中の粒子から蛍光を検出すれば、細菌と夾雑物の弁別がより確実なものとなる。
【００５６】
さらに、形態変化を生じるのは、添加前において生きていた桿菌であり、添加の時点で死んでいる菌は細胞分裂をしないため形態変化を生じない。よって形態変化を生じた桿菌を検出することで、試料中の桿菌における生菌のみを検出することが可能になる。また、蛍光標識した抗体を細菌の表面抗原と反応させて菌種を分析する方法と、本発明の方法を組み合わせると、細菌が大きくなることにより表面抗原が増え、検出される蛍光信号のＳ／Ｎ比が向上する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の自動細菌分析装置の装置構成を示す図である。
【図２】本発明の自動細菌分析装置の試料調製部を示す図である。
【図３】本発明の自動細菌分析装置の測定部を示す図である。
【図４】本発明の自動細菌分析装置の制御部と装置各部との関係を示すブロック図である。
【図５】本発明の自動細菌分析装置の全体制御のフローを示す図である。
【図６】本発明の自動細菌分析装置における分析部制御のフローを示す図である。
【図７】本発明の自動細菌分析装置の液晶タッチパネルに表示される画面の一例である。
【図８】本発明の自動細菌分析装置により作成されたスキャッタグラムの一例である。
【図９】本発明の自動細菌分析装置により作成されたスキャッタグラムの一例である。
【図１０】変形例における試料調製部を示す図である。
【図１１】変形例における測定部を示す図である。
【図１２】変形例における分析部制御のフローを示す図である。
【図１３】変形例の自動細菌分析装置により作成されたスキャッタグラムの一例を示す模式図である。
【図１４】桿菌の形態変化前、形態変化後の様子を示す模式図である。
【図１５】粒子から検出される信号波形について説明する図である。
【図１６】形態変化前の桿菌、形態変化後桿菌をそれぞれ測定して得られるスキャッタグラムの一例を示す模式図である。
【符号の説明】
１ 自動細菌分析装置
２ 試料調製部
３ 測定部
４ 制御部
５ 出力部
６ 入力部
１１ 液晶タッチパネル
１２ 検体セット部カバー
１３ 試薬セット部カバー
１４ スタートスイッチ
４１ 格納部
４２ 分析部
４３ 動作制御部[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method and an apparatus for measuring bacteria in a sample, and particularly to a method and an apparatus for detecting bacilli specifically and with high sensitivity.
[0002]
[Prior art]
Bacteria tests are performed in various fields such as clinical tests, food tests, and environmental water quality tests. Bacteria are classified by gram staining (Gram-positive bacteria / negative bacteria) and morphological characteristics (cocci, bacilli, spirals) as necessary.
[0003]
As a test method for detecting bacilli in a sample, a method using an agar medium is known. By culturing and growing the bacteria, colonies are formed on the medium. This colony is observed under a microscope to determine the bacterial species. The number of colonies is counted and the number of bacteria is counted. However, these methods require about 1-2 days for the bacteria to grow until they can be visually discriminated as colonies, and the observation and counting of the colonies are laborious and labor intensive.
[0004]
In recent years, attempts have been made to automatically measure bacteria using a particle analyzer. In the particle analyzer, if impurities are mixed in the sample liquid, there is a possibility that the impurities are erroneously detected as particles to be measured. Bacteria are usually about 0.5-5 μm in size, and it is often difficult to remove contaminants of that size, especially all small contaminants. If the sample solution contains foreign matter having a size similar to that of bacteria, it is difficult to distinguish between a signal from which the foreign matter is detected and a signal from which the bacteria are detected, making accurate measurement of the bacteria difficult.
[0005]
Techniques for measuring bacteria with a particle analyzer by reducing the effects of impurities are as follows.
(1) Samples before and after culturing are measured with a flow cytometer, and the difference between the two measurement results is taken to prevent erroneous measurement due to the influence of contaminants in the sample. Reference 1).
(2) At pH 2.0 to 4.5, a cationic surfactant is applied to a sample containing bacteria to enhance the dye permeability of the bacteria and enhance the stainability of the bacteria, so that impurities are present in the sample. However, a method of counting by separating from contaminants by detecting fluorescence emitted by bacteria (for example, see Patent Document 2).
[0006]
Bacteria can be measured in a relatively short time by using a particle analyzer as described above. However, in such a method, a method for detecting bacilli in a sample specifically and with high sensitivity has not been proposed.
[0007]
[Patent Document 1]
U.S. Pat. No. 6,165,740
[Patent Document 2]
JP 2001-258590 A
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method and an apparatus for analyzing bacteria that specifically and highly sensitively detect bacilli in a sample even when contaminants are present.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
In view of the above problems, the present invention provides a sample solution by culturing a sample containing bacteria in the presence of an antibiotic that inhibits the cell wall synthesis of bacilli, and prepares a large sample from each particle in the sample solution using a particle analyzer. Provided is a bacteria analysis method for detecting bacillus information in a sample solution based on the detected size information.
[0010]
Further, the present invention provides a method for culturing a sample containing bacteria in the presence of an antibiotic that inhibits the cell wall synthesis of bacilli, and adding a fluorescent stain that specifically fluorescently stains the bacteria to the sample after the culture. Is prepared, fluorescence information and size information are detected from each particle contained in the sample solution using a particle analyzer, bacteria are discriminated based on the detected fluorescence information, and based on the size information of the discriminated bacteria. Provided is a bacterial analysis method for detecting bacilli.
[0011]
Further, the present invention includes an incubator for incubating a specimen containing bacteria in the presence of an antibiotic that inhibits the cell wall synthesis of bacilli, a sampling section for sampling the specimen after incubation as a sample liquid, and a sampled sample liquid. Provided is a bacterium analyzer including a measurement unit having a detector for detecting size information from each particle, and an analysis unit for detecting bacilli based on the size information detected by the measurement unit.
[0012]
The present invention also provides an incubator for incubating a sample containing bacteria in the presence of an antibiotic that inhibits the cell wall synthesis of bacilli, and adding a fluorescent stain that specifically fluorescently stains bacteria to the sample after incubation. A staining section for sampling, a sampling section for sampling a sample after the staining process as a sample liquid, a first detector for detecting fluorescence information from each particle included in the sample liquid, and detecting size information from each particle Provided is a bacterium analyzer, comprising: a measurement unit having a second detector; and an analysis unit that discriminates bacteria based on detected fluorescence information and detects bacilli based on size information of the discriminated bacteria.
[0013]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
principle
Prior to the embodiment, the principle of the present invention will be described.
[0014]
In the present invention, the bacterium is cultured in the presence of an antibiotic to change the form of the bacillus to prepare a sample solution. Antibiotics are classified into cell wall synthesis inhibitors, nucleic acid metabolism inhibitors, protein synthesis inhibitors, and the like according to the manner of action on bacteria. Among them, cell wall synthesis inhibitors are used. The treatment with the antibiotic is performed by culturing the bacteria in a medium to which the antibiotic is added for a predetermined time.
[0015]
The form of bacilli cultured in the presence of a cell wall synthesis inhibitor will be described. FIG. 14 shows a normal bacillus form before addition of Piperacillin sodium (hereinafter, referred to as “PIPC”, a penicillin-based antibiotic) which is a kind of a cell wall synthesis inhibitor, and culture with addition of PIPC. It is a figure which shows typically the form of the bacillus which gave the morphological change after performing. Due to the effect of PIPC, even if the bacillus proliferates, the cell wall is not synthesized normally at the time of cell division, and the bacillus becomes unable to divide normally. Elongated morphologically altered bacilli will have significantly larger size information than normal bacteria. The present invention focuses on the fact that the morphology of bacilli changes significantly when cultured in the presence of antibiotics.
[0016]
A particle analyzer is used to detect size information from each particle in the sample liquid. As the particle analyzer, an electric resistance type or an optical type can be used. As the optical particle analyzer, an analyzer that irradiates each particle with laser light and detects scattered light generated as a signal is used. A flow cytometer is a typical device. The size and shape of the particles can be analyzed in detail by detecting the scattered light as a pulsed electric signal and analyzing the signal waveform to obtain the scattered light intensity and the scattered light emission time.
[0017]
FIG. 15 illustrates a waveform of the detected forward scattered light signal. The vertical axis represents signal strength, and the horizontal axis represents time. In the figure, a threshold value is set for noise removal, and a portion where the signal strength exceeds a predetermined threshold value is regarded as a particle detection portion. Here, the forward scattered light intensity (hereinafter, referred to as “Fsc”) reflects the size of the particles, and the forward scattered light emission time (hereinafter, referred to as “Fscw”) reflects the length of the particles passing through the detection region. . Each is information related to the size of the particles, and information about the size of the particles can be obtained from the scattered light.
[0018]
As signals to be detected, fluorescence signals of various wavelengths other than scattered light are appropriately used. More detailed particle information can be obtained by pre-fluorescent staining the particles to be measured and detecting fluorescence from the particles. When an electric resistance type particle analyzer is used, it has pores through which a sample liquid containing particles to be measured flows, and electrodes arranged so as to sandwich the pores, and the electric power when the particles pass through the pores An analyzer that detects a change in resistance as a pulsed electric signal is used. A Coulter counter is a typical device.
[0019]
FIG. 16 shows a case where a sample solution containing bacilli (1) cultured without treatment with an antibiotic and a sample solution (2) containing bacilli cultured with PIPC acting as an antibiotic were measured using a flow cytometer. It is a diagram schematically showing the obtained scattergram. The horizontal axis represents Fscw, and the vertical axis represents Fsc. On the horizontal axis, the value of Fscw increases toward the right. On the vertical axis, the Fsc value increases as going upward. In the sample liquid (1), the bacilli appear at positions where the value of Fscw · Fsc is small, but they cannot be discriminated if contaminants of the same size are present. On the other hand, in the sample liquid (2), the contaminant appears at a position where the value of Fscw is small, but the bacillus whose morphology has changed to an elongated shape appears at a position where the value of Fscw is extremely large. Bacteria and contaminants that have not been treated with an antibiotic do not usually appear at such a position where the Fscw value is large.
[0020]
Thus, if it is confirmed that particles appear at a position where the Fscw value is larger than that of normal bacteria, the presence of bacilli can be detected. In addition, since the transformed bacilli appear at positions where normal bacteria and foreign substances do not appear, they are easily detected without being affected by the foreign substances, and the detection sensitivity is improved.
[0021]
In order to further reduce the influence of impurities, a staining treatment can be performed using a fluorescent stain that specifically fluorescently stains only bacteria. Bacteria that are specifically stained have high fluorescence intensity, but have little fluorescence intensity because contaminants are not stained. Therefore, among the data of the detected particles, only those with a fluorescence intensity above a certain level are extracted as bacteria detection data, and the data is analyzed based on size information to eliminate the effects of impurities. After the detection, the bacilli can be detected.
[0022]
Bacteria that have already died before the addition of the antibiotic do not undergo cell division, and thus do not undergo morphological changes due to the antibiotic. Therefore, by detecting a bacillus having a morphological change, only a living bacillus can be detected. In addition, when the method of the present invention is combined with a method of analyzing a bacterial species by reacting a fluorescently labeled antibody with a bacterial surface antigen and the method of the present invention, the surface antigen increases due to an increase in the size of the bacterium. The S / N ratio is improved.
[0023]
【Example】
Hereinafter, an automatic bacteria analyzer according to the present invention will be described. As the specimen to be analyzed by the automatic bacteria analyzer, a culture obtained by culturing bacteria on an agar medium, picking up bacteria from the formed colonies, and pouring the mixture into a liquid medium is used. As a reagent, PIPC which is an antibiotic that changes the form of bacilli is used.
[0024]
Automatic bacteria analyzer
FIG. 1 shows the appearance of the automatic bacteria analyzer 1 by a solid line, and the schematic configuration inside the device by a broken line. A liquid crystal touch panel 11, a sample setting unit cover 12, a reagent setting unit cover 13, and a start switch 14 for inputting various settings and displaying and outputting the measurement results are provided at the forefront of the apparatus, as indicated by solid lines. I have. In the internal configuration of the device indicated by a broken line, a control unit 4 that controls the operation of the device and analysis processing is disposed at the top. A sample preparation unit 2 for preparing a sample liquid is arranged on the lower front side. A measuring unit 3 for detecting a signal from the sample liquid is disposed on the lower rear side.
[0025]
Structure of sample preparation section
FIG. 2 is an explanatory diagram showing the sample preparation unit 2. The sample preparation unit 2 includes a sample setting unit 21, a reagent setting unit 22, an incubator 23, and a dispensing device 24. By opening the sample setting section cover 12 of FIG. 1, the sample container 25 containing the sample is set in the sample setting section 21 and the minute test tubes 27 and 28 are set in the incubator 23. By opening the reagent set cover 13 shown in FIG. 1, a reagent container 26 containing PIPC used as a measurement reagent is set in the reagent set 22. The incubator 23 shakes and stirs the liquid in the set micro test tube while maintaining the liquid at a predetermined temperature. The dispensing device 24 suctions and discharges a predetermined amount of liquid from its tip, and can be moved up, down, left, and right by a driving device (not shown).
[0026]
Configuration of measurement unit
FIG. 3 is an explanatory diagram showing the measuring unit 3. As shown in FIG. 3, the sheath flow cell 307 includes a nozzle 313 for injecting the sample liquid upward toward the orifice 311, a sheath liquid supply port 310, and a drain port 314. In the vicinity of the sheath flow cell 307, a laser light source 317, a condenser lens 318, a beam stopper 319, a collector lens 320, a light shielding plate 330 having a pinhole 321, a dichroic mirror 322, and a photodiode 325 are provided.
[0027]
A sheath liquid container 309 pressurized by a positive pressure pump 347 is connected to the sheath liquid supply port 310 via a valve 305. The drain port 314 is connected to a waste liquid chamber (not shown). The nozzle 313 is connected to the negative pressure pump 348 via the valve 301, and the syringe pump 333 is connected to the flow path 339 on the valve 302 side.
[0028]
Configuration of control unit 4
FIG. 4 is a block diagram showing the configuration of the control unit 4 and the relationship between the control unit 4 and each unit of the device. The control unit 4 includes a microcomputer having a central processing unit (CPU) and a storage device such as a ROM and a RAM, a circuit for processing a signal transmitted from the measurement unit 3, and the like. The control unit 4 functions as a storage unit 41, an analysis unit 42, and an operation control unit 43. The storage unit 41 stores an analysis program for analyzing a signal obtained from particles in a sample and a control program for controlling the operation of each unit of the apparatus. In addition, it stores the data of the signal detected by the measurement unit 3 and the processing result by the analysis program. The analysis unit 42 measures the sample liquid, processes the signal detected by the measurement unit 3, and analyzes the processed signal. The analysis result of the analysis unit 42 is output to the liquid crystal touch panel 11. The operation control unit 43 controls the operation of each unit of the device based on the control program stored in the storage unit 41.
[0029]
FIG. 5 is a flowchart showing the overall control of the automatic bacteria analyzer 1 by the control program. When the operator presses the start switch 14, the control program is started, and step S1 (sample preparation unit control), step S2 (measurement unit control), and step S3 (analysis unit control) are sequentially executed. Thereby, the sample preparation unit 2, the measurement unit 3, and the analysis unit 42 are controlled, and a series of operations of the automatic bacteria analyzer 1 are automatically performed. The operation of each unit of the apparatus in steps S1, S2 and S3 will be described below.
[0030]
Step S1 (control of sample preparation unit)
The operation of the sample preparation unit 2 under the control of the sample preparation unit will be described with reference to FIG. First, the dispensing device 24 aspirates a sample from the sample container 25 set in the sample setting unit 21 and dispense 1 ml at a time into the micro test tubes 27 and 28 set in the incubator 23. Next, the dispensing device 24 aspirates PIPC from the reagent setting section 22, dispenses 0.2 ml into the micro test tube 27, and adds PIPC to the sample. Thereafter, the incubator 23 incubates the micro test tube 27 containing the sample to which PIPC is added and the micro test tube 28 containing only the sample by shaking and stirring for 120 minutes while maintaining the temperature at 37 ° C. As a result, the sample (first sample solution) cultured in the presence of PIPC in the micro test tube 27, and the control sample solution (second sample solution) cultured without PIPC in the micro test tube 28. Are prepared respectively.
[0031]
When the sample liquid is prepared, the dispensing device 24 aspirates (samples) a predetermined amount of the first sample liquid from the minute amount test tube 27 and discharges and supplies the first sample liquid to the sample container 312. The first sample liquid supplied to the sample container 312 flows into the sheath flow cell of the measuring section 3. Next, the dispensing device 24 aspirates (samples) the second sample liquid by a predetermined amount from the minute amount test tube 29 and discharges it to the sample container 312. The discharged sample liquid flows into the sheath flow cell of the measuring unit 3.
[0032]
Step S2 (measurement unit control)
The operation of the measuring unit 3 under the control of the measuring unit will be described with reference to FIG. As described above, when the first sample liquid is supplied to the sample container 312, first, the negative pressure pump 348 is driven. The valves 301 and 302 are opened for a predetermined time, and the sample liquid fills the flow path 339 between the valves 301 and 302 by negative pressure. Next, the syringe pump 333 pushes the sample liquid in the flow path 339 to the nozzle 313 at a constant flow rate, so that the sample liquid is discharged from the nozzle 313 to the sheath flow cell 307. At the same time, the sheath liquid is supplied from the sheath liquid container 309 to the sheath flow cell 307 via the sheath liquid supply port 310 by opening the valve 305.
[0033]
As a result, the sample liquid is wrapped in the sheath liquid in the sheath flow cell 307 and further narrowed down by the orifice 311 to flow. By narrowing the flow of the sample liquid to the same level as the particle diameter, the particles contained in the sample liquid can be aligned in a line and flow to the orifice 311.
[0034]
The laser beam emitted from the laser light source 317 is narrowed by the condenser lens 318 and applied to the sample stream 326 flowing through the orifice 311. Laser light that has passed through the flow cell 307 as it is without hitting particles in the sample is shielded by the beam stopper 319. Forward scattered light emitted from the particles receiving the laser light is collected by the collector lens 320 and passes through the pinhole 321 of the light shielding plate 330. Then, the light reaches the dichroic mirror 322. The forward scattered light reflected by the dichroic mirror 322 is received by the photodiode 325, photoelectrically converted, and output as a forward scattered light signal 328. The forward scattered light signal 328 is sent to the control unit 4 and stored in the storage unit 41 as data for each particle.
[0035]
When the first sample liquid supplied to the sample container 312 flows into the sheath flow cell 307 and a forward scattered light signal is detected, the second sample liquid is supplied to the sample container 312 as described above. Then, similarly to the first sample liquid, the second sample liquid flows through the sheath flow cell 307, and the forward scattered light signal 328 is detected. The forward scattered light signal 328 is sent to the control unit 4 and stored in the storage unit 41 as data for each particle.
[0036]
Step S3 (analysis unit control)
Details of the control of the analysis unit will be described with reference to the flowchart of FIG. Each step of the flowchart is as follows.
[0037]
Step S11: The data of the forward scattered light signal detected from the first sample liquid is read from the storage unit 41. Subsequently, the process proceeds to step S12.
Step S12: The forward scattered light emission time (Fscw) and the forward scattered light intensity (Fsc) are calculated based on the forward scattered light signal obtained from each particle in the first sample liquid. Subsequently, the process proceeds to step S13.
Step S13: Create a scattergram using Fscw · Fsc for each particle calculated in step S12 as a parameter. Subsequently, the process proceeds to step S14.
Step S14: The scattergram of the first sample liquid created in step S13 is stored in the storage unit 41. Subsequently, the process proceeds to step S15.
Step S15: The data of the forward scattered light signal detected from the second sample liquid is read from the storage unit 41. Subsequently, the process proceeds to step S16.
Step S16: The forward scattered light emission time (Fscw) and the forward scattered light intensity (Fsc) are calculated based on the forward scattered light signal obtained from each particle in the second sample liquid. Then, the process proceeds to step S17.
Step S17: Create a scattergram using Fscw · Fsc for each particle calculated in step S16 as a parameter. Subsequently, the process proceeds to step S18.
Step S18: The scattergram of the second sample liquid created in step S17 is stored in the storage unit 41. Subsequently, the process proceeds to step S19.
Step S19: The scattergram obtained from the first sample solution and the second sample solution is read from the storage unit 41. Subsequently, the process proceeds to step S20.
Step S20: The read scattergram is output to the liquid crystal touch panel 11.
[0038]
On the liquid crystal touch panel 11, two scattergrams obtained from the first sample liquid and the second sample liquid are simultaneously displayed. FIG. 7 shows an example of the screen. The scattergram obtained from the first sample liquid is displayed on the right side of the screen, and the scattergram obtained from the second sample liquid is displayed on the left side of the screen, so that the two can be compared at a glance.
[0039]
Example of analysis results
The example of the result of having analyzed the sample using the automatic bacteria analyzer 1 described above is shown. The specimen used was prepared as follows. First, E. coli gram-negative rods were placed on LB (Luria-Bertani) agar medium. E. coli was added thereto, cultured overnight, and the cells picked up from the colonies formed in the medium were mixed with a Mueller-Hinton liquid medium, shaken for 5 minutes, and the number of cells was measured by a flow cytometer. , 6 × 10 5 A bacterial solution having a concentration of / ml was prepared. This is called E. coli-containing specimen. Moreover, E. coli which is a gram-negative bacillus is used. For cloacae, a bacterial solution was prepared in the same manner. The specimen was a cloacae-containing specimen. As a reagent, PIPC having a concentration of 64 μg / ml was used.
[0040]
The above-described E.C. The scattergram obtained by analyzing the E. coli-containing sample is shown in FIG. The scattergram obtained by analyzing the cloacae-containing sample is shown in FIG. In each of the scattergrams, Fscw is plotted on the horizontal axis and Fsc is plotted on the vertical axis. On the horizontal axis, the value of Fscw increases toward the right. On the vertical axis, the Fsc value increases as going upward.
[0041]
A in the scattergram of FIG. It is the result of measuring a control sample solution prepared by culturing the E. coli-containing specimen without adding PIPC. B. It is the result of measuring a sample solution prepared by adding PIPC to an E. coli-containing bacterial solution and performing a culture treatment. In A (without PIPC), particles appear at small positions in both the Fscw value and the Fsc value. This position is a position that overlaps with the appearance position of a bacillus that has grown normally and has not changed its form, or a coccus that is another bacterium. B (with PIPC), the morphology changed to the position surrounded by the broken line in FIG. coli has appeared. E. transformed The appearance position of E. coli has a large Fscw value and is easy to discriminate.
[0042]
In the scattergram of FIG. It is a result of measuring a control sample solution prepared by culturing a cloacae-containing bacterial solution without adding PIPC. B. It is the result of measuring a sample solution prepared by adding PIPC to a cloacae-containing bacterial solution and performing a culture treatment. In A (without PIPC), particles appear at small positions in both the Fscw value and the Fsc value. This position is a position that overlaps with the appearance position of a bacillus that has grown normally and has not changed form, or a coccus that is another bacterium. B (with PIPC), the morphology changed to the position surrounded by the broken line in FIG. cloacae has appeared. E. transformed The appearance position of cloacae has a large Fscw value, and discrimination is easy.
[0043]
In this way, by confirming that particles appear at large Fscw values such that bacteria and contaminants do not usually appear on the scattergram, the presence of bacilli in the sample solution is confirmed. Understand.
[0044]
Modified example
If a process such as filtering the sample solution through a filter is not performed before the measurement, impurities larger than ordinary bacteria may be mixed into the sample solution. In such a case, the size of the bacillus whose form has been changed by the antibiotic and the contaminant may overlap, and the sensitivity of bacillus detection may be reduced. Therefore, the bacteria are stained in advance with fluorescence, and the fluorescence is detected from the particles in the sample solution, whereby the discrimination between the bacteria and the contaminants becomes more reliable.
[0045]
Hereinafter, as a modified example of the above-described embodiment, an automatic bacteria analyzer that detects bacteria by fluorescently staining bacteria will be described. It should be noted that the automatic bacteria analyzer in this modification has almost the same configuration as the automatic bacteria analyzer 1 used in the above embodiment, and the corresponding parts will be described using the same reference numerals. The external appearance of the apparatus and the schematic configuration inside the apparatus are the same as those shown in FIG. 1, and the overall control flow is the same as that shown in FIG. The configuration and operation of the sample preparation unit 2 and the measurement unit 3 and the flow of analysis control in the analysis unit 41 will be described below.
[0046]
FIG. 10 is a diagram illustrating the sample preparation unit 2. The difference from the configuration shown in FIG. 2 is that a reagent container 29 containing a fluorescent stain can be set in the reagent setting section 22 separately from a reagent container 26 containing PIPC.
[0047]
The sample to be analyzed in the bacteria analyzer of this modified example and the PIPC used are the same as those in the above embodiment. As the fluorescent dye, a solution prepared by dissolving 40 mg of a polymethine dye having the following structural formula in 1 liter of ethylene glycol is used. Since this dye has a property of specifically binding to bacterial nucleic acid, it is possible to specifically stain only bacteria without staining impurities with a dye containing this dye.
[0048]
Embedded image
[0049]
After setting the sample container 25 containing the sample, the trace test tubes 27 and 28, the reagent container 26 containing the PIPC, and the reagent container 29 containing the fluorescent stain, the sample preparation unit 2 operates as follows. First, the dispensing device 24 aspirates a sample from the sample container 25 set in the sample setting unit 21 and dispense 1 ml each to the micro test tubes 27 and 28 set in the incubator 23. Next, the dispensing device 24 aspirates PIPC from the reagent container 26, dispenses 0.2 ml into the micro test tube 27, and adds PIPC to the specimen. Thereafter, the incubator 23 incubates the micro test tube 27 containing the sample to which PIPC is added and the micro test tube 28 containing only the sample by shaking and stirring for 120 minutes while maintaining the temperature at 37 ° C. Subsequently, the dispensing device 24 aspirates the fluorescent dye from the reagent container 29 and dispenses 0.2 ml each to the micro test tubes 27 and 28. Thereafter, the incubator 23 shakes and agitates the micro test tubes 27 and 28 for 10 seconds while maintaining the temperature at 42 ° C. to perform the fluorescent staining process. As a result, a sample solution (first sample solution) is cultured in the micro test tube 27 in the presence of PIPC and has been subjected to fluorescent staining. In the micro test tube 28, a control sample solution (second sample solution) that has been cultured without adding PIPC and has been subjected to a fluorescent staining process is prepared.
[0050]
The operations from the prepared first sample liquid and second sample liquid being sampled by the dispensing device 24 to being supplied to the sample container 312 and flowing to the sheath flow cell 307 of the measuring section 3 are the same as those in the above-described embodiment. is there.
[0051]
FIG. 11 is a diagram showing a configuration of the measuring section 3 in this modification. Compared to the measuring unit 3 of the embodiment shown in FIG. 3, the filter unit 323 and the photomultiplier tube 324 have a function of detecting a fluorescence signal in addition to a forward scattered light signal from particles in a sample solution. different. The detection of the forward scattered light signal from the sample liquid is performed in the same manner as in the above embodiment. The detection of the fluorescence signal is performed as follows. The fluorescent light emitted from the particles in the sample liquid irradiated with the laser light is collected by the collector lens 320 and passes through the pinhole 321 of the light shielding plate 330. Then, the light reaches the dichroic mirror 322. The fluorescent light having a longer wavelength than the forward scattered light passes through the dichroic mirror 322 as it is, and after the scattered light is further removed by the filter 323, is received by the photomultiplier tube 324, photoelectrically converted, and output as a fluorescent light signal 327. The fluorescence signal 327 is sent to the control unit 4. The detected forward scattered light is also sent to the control unit 4 as a forward scattered light signal 328 as in the above embodiment.
[0052]
The fluorescence signal 327 and the forward scattered light signal 328 detected from the first sample liquid and the second sample liquid are stored in the storage unit 41 of the control unit 4 as data associated with each detected particle. Then, the analysis unit 42 analyzes the data of the fluorescence signal 327 and the forward scattered light signal 328 for each particle detected from each sample solution by the analysis program. Hereinafter, the control of the analysis unit will be described in detail with reference to the flowchart of FIG.
[0053]
Step S21: Data of the particles detected from the first sample solution (including data of the fluorescence signal and the forward scattered light signal) is read from the storage unit 41. Subsequently, the process proceeds to step S22.
Step S22: Calculate the fluorescence intensity (Fl) based on the fluorescence signal obtained from each particle in the first sample solution. Subsequently, the process proceeds to step S23.
Step S23: Based on Fl calculated in step S22, only data of particles whose Fl is equal to or more than a predetermined value is extracted. Subsequently, the process proceeds to step S24.
Step S24: For the data of the particles extracted in step S23, a forward scattered light emission time (Fscw) and a forward scattered light intensity (Fsc) are calculated based on the forward scattered light signal 328. Subsequently, the process proceeds to step S25.
Step S25: Create a scattergram using Fscw · Fsc for each particle calculated in step S24 as a parameter. Subsequently, the process proceeds to step S26.
Step S26: The scattergram of the first sample liquid created in step S25 is stored in the storage unit 41. Then, the process proceeds to step S27.
Step S27: Data of the particles detected from the second sample liquid (including data of the fluorescence signal and the forward scattered light signal) is read from the storage unit 41. Subsequently, the process proceeds to step S28.
Step S28: The fluorescence intensity (Fl) is calculated based on the fluorescence signal obtained from each particle in the second sample solution. Then, the process proceeds to step S29.
Step S29: Based on Fl calculated in step S28, only data of particles whose Fl is equal to or more than a predetermined value is extracted. Subsequently, the process proceeds to step S30.
Step S30: For the data of the particles extracted in step S29, a forward scattered light emission time (Fscw) and a forward scattered light intensity (Fsc) are calculated based on the forward scattered light signal 328. Subsequently, the process proceeds to step S31.
Step S31: Create a scattergram using Fscw · Fsc for each particle calculated in step S30 as a parameter. Subsequently, the process proceeds to step S32.
Step S32: The scattergram of the second sample liquid created in step S31 is stored in the storage unit 41. Subsequently, the process proceeds to step S33.
Step S33: The scattergram obtained from the first sample solution and the second sample solution is read from the storage unit 41. Then, the process proceeds to step S34.
Step S34: The read scattergram is output to the liquid crystal touch panel 11.
[0054]
Since only the bacteria in the sample solution are specifically fluorescently stained by the fluorescent staining treatment, in steps S23 and S29, particles having a certain or more Fl are extracted as bacteria and data obtained by detecting impurities are analyzed. Can be removed from the subject. FIG. 13 is a schematic diagram showing an example of a scattergram obtained from the first sample solution, in which only the bacillus having changed form appears at a position where the Fscw value is large. In this modification, bacteria and contaminants are distinguished based on Fl detected from particles before creating a scattergram. Then, as a result of the discrimination, a scattergram with size information as a parameter is created only for the data extracted as bacteria. Therefore, the data of the contaminants does not appear on the scattergram, and only bacteria appear.
[0055]
【The invention's effect】
In the present invention, the bacillus is changed in form by an antibiotic to give size information clearly different from contaminants and other types of bacteria, so that the appearance position is not changed when the form is not changed. It facilitates discrimination from cocci and contaminants that have overlapped, and improves the specificity of bacillus detection. In addition, since the transformed bacilli appear at positions where normal bacteria and foreign substances do not appear, they are easily detected without being affected by the foreign substances, and the detection sensitivity is improved. Here, if the bacteria are stained in advance with a fluorescent stain that specifically stains the bacteria, and the fluorescence is detected from the particles in the sample solution, the bacteria can be more reliably distinguished from contaminants.
[0056]
Furthermore, it is the bacilli that lived before the addition that caused the morphological change, and the bacteria that died at the time of the addition did not undergo cell division and thus did not undergo the morphological change. Therefore, by detecting a bacillus having a morphological change, it becomes possible to detect only viable bacilli in the bacillus in the sample. When the method of the present invention is combined with a method of analyzing a bacterial species by reacting a fluorescently labeled antibody with a bacterial surface antigen and the method of the present invention, the surface antigen increases due to the increase in bacteria, and the S / The N ratio is improved.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a device configuration of an automatic bacteria analyzer of the present invention.
FIG. 2 is a diagram showing a sample preparation section of the automatic bacteria analyzer of the present invention.
FIG. 3 is a view showing a measuring unit of the automatic bacteria analyzer of the present invention.
FIG. 4 is a block diagram showing a relationship between a control unit and each unit of the automatic bacteria analyzer of the present invention.
FIG. 5 is a diagram showing a flow of overall control of the automatic bacteria analyzer of the present invention.
FIG. 6 is a diagram showing a flow of control of an analyzer in the automatic bacteria analyzer of the present invention.
FIG. 7 is an example of a screen displayed on a liquid crystal touch panel of the automatic bacteria analyzer of the present invention.
FIG. 8 is an example of a scattergram created by the automatic bacteria analyzer of the present invention.
FIG. 9 is an example of a scattergram created by the automatic bacteria analyzer of the present invention.
FIG. 10 is a diagram showing a sample preparation unit according to a modification.
FIG. 11 is a diagram illustrating a measurement unit according to a modification.
FIG. 12 is a diagram illustrating a flow of control of an analysis unit according to a modification.
FIG. 13 is a schematic diagram showing an example of a scattergram created by an automatic bacteria analyzer of a modified example.
FIG. 14 is a schematic view showing a state before and after a morphological change of a bacillus.
FIG. 15 is a diagram illustrating a signal waveform detected from a particle.
FIG. 16 is a schematic diagram showing an example of a scattergram obtained by measuring a bacillus before a morphological change and a bacillus after a morphological change.
[Explanation of symbols]
1 automatic bacteria analyzer
2 Sample preparation section
3 Measurement section
4 control unit
5 Output section
6 Input section
11 LCD touch panel
12 Sample set cover
13 Reagent set cover
14 Start switch
41 Storage
42 Analysis unit
43 Operation control unit
