【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸の高次構造の崩壊、特に加熱や酵素により行われる核酸の２本鎖らせん構造の解消・巻き戻し活性や、１本鎖核酸特異的結合性タンパク質の能力を測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
核酸のハイブリダイゼーションによる２本鎖形成や変性による２本鎖の１本鎖への巻き戻し状態を測定する方法においては、電気泳動的手法が一般的である。また、２本鎖核酸の酵素的分解に関しては蛍光偏光消失や蛍光共鳴エネルギー転移を用いた手法が存在し広く用いられている。
【０００３】
蛍光共鳴エネルギー転移（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）とは蛍光発光に関わる現象であって、１つの発蛍光団の蛍光スペクトルが他の発色団の励起スペクトルと重複する場合で、かつ発蛍光団同士が近接する位置にある場合においては、１つの発蛍光団の励起エネルギーが他の発蛍光団の蛍光発光を誘導し、それに伴い元の発蛍光団自身はエネルギーを失ってその蛍光強度が減少するという現象を意味する（例えば、非特許文献１、２参照）。本現象は発蛍光団同士の距離に極めて鋭敏であることが知られており、一般的には両者の距離の１０−６に比例する。これらのことから、蛍光共鳴エネルギー転移現象は、分子生物学や細胞生物学における微視的な研究に広く利用されている（例えば、特許文献１、２参照）。
【０００４】
一方、ＤＮＡヘリカーゼのようなＤＮＡの２本鎖を巻き戻して１本鎖化する酵素の活性測定の場合には、基質と該酵素の反応後遊離された１本鎖ＤＮＡを電気泳動的手法により測定するというエンド ポイント アッセイが主流であり、長時間を要する上に操作が煩雑で定量性にも乏しいものである。また、ストップド フローによる蛍光測定法は速度的解析に適したものではあるが、特殊な測定機器を用いるという点で不利である（例えば、非特許文献３、４参照）。
【０００５】
以上のように、酵素的な２重らせん構造の解消を測定する場合には煩雑で定量値に乏しいか、または測定に複雑な手順を要する手法しか存在しないため、簡便かつ再現性良く定量できる測定方法の開発が望まれている。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｌ． Ｓｔｒｙｅｒ：Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４７， ８１９−８４６，（１９７８）
【非特許文献２】
Ｔａｙｌｏｒら：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ Ｌｉｖｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｐａｒｔ Ｂ、
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２２０−２４５，（１９８９）
【非特許文献３】
Ｏｃｈｅｍら：Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７２， ２９９１９−２９９２６，（１９９７）
【非特許文献４】
Ｂｊｏｒｎｓｏｎら：Ｂｉｏｃｈｍｉｓｔｒｙ、３３， １４３０６ −１４３１６，（１９９４）
【特許文献１】
特開平１１−５６３９８号公報
【特許文献２】
特開平１１−１７８６００号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、核酸の高次構造の崩壊、特に加熱や酵素により行われる核酸の２本鎖らせん構造の解消や巻き戻し活性、あるいは１本鎖核酸特異的結合タンパク質の能力を測定する新規な測定方法を提供することを課題としている。また、本発明は上記測定方法を応用した簡便で、かつ定量性と再現性に優れた測定キットを提供することを課題としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題の解決を目指して鋭意検討を行った結果、蛍光共鳴エネルギー転移（以下、ＦＲＥＴと言う）を利用した簡便かつ定量性の高い新規な２本鎖核酸の１本鎖化測定法を見い出し、本発明を完成した。
【０００９】
本発明におけるＦＲＥＴ現象とは蛍光発光に係る現象であって、１つのエネルギー供与性の発蛍光団（以下、エネルギー供与体、または単にドナーと言う）の蛍光スペクトルが、他のエネルギー受容性の発蛍光団（以下、エネルギー受容体、または単にアクセプターと言う）の励起スペクトルと重なる場合で、かつドナーとアクセプターとが接近する位置にある場合においては、ドナーの励起がアクセプターの蛍光を誘導し、それに伴いドナー自身の蛍光強度は減少するという現象を意味する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を図面に基づいて具体的に説明する。図１は、本発明の測定方法の概略を示した図である。本発明によるＦＲＥＴ体は、図１に示したように蛍光エネルギーの供与体（Ｄ）を結合した１本鎖ドナープローブと、さらに蛍光エネルギーの受容体（Ａ）を結合した１本鎖アクセプタープローブとをハイブリダイズさせた２本鎖ハイブリダイズ体である。すなわち、２種類の１本鎖核酸プローブで構成され、少なくとも、（１）ＦＲＥＴ現象を利用するためのドナー（Ｄ）及びアクセプター（Ａ）を該プローブの末端部に有し、（２）該プローブと相補する末端同士がＤ−Ａ別々の蛍光色素でラベルされている。また、（３）該２本のプローブのハイブリダイゼーションにより２本鎖が形成された場合、ドナー（Ｄ）からアクセプター（Ａ）へのＦＲＥＴが可能となるような空間配置をとり得るように設計されている。したがって、この２本鎖の段階でドナー（Ｄ）の励起波長の光を照射してもＦＲＥＴ現象によるエネルギー転移により、観察される蛍光スペクトルはアクセプター（Ａ）のものとなる。次いで、２分子間でハイブリダイズ体を形成した２本鎖プローブが、被測定タンパク質（例えばＤＮＡヘリカーゼ）による反応で１本鎖となった場合、Ｄ−Ａ間の距離が離れる為にＦＲＥＴ現象が解除されることにより、ドナー（Ｄ）の蛍光スペクトルが測定できることになる。一方、互いに相補的な１本鎖核酸は溶液中では室温でも自然にアニーリングすることが知られている。しかしながら、系内に充分量のラベルされていない相補鎖核酸等を存在させることで、アクセプタープローブがトラッピングされてＦＲＥＴ現象は継続的に解除される。そのため、上記ヘリカーゼ等による２本鎖核酸の巻き戻し反応の活性を好適に測定することが可能である。
【００１１】
本発明の測定方法において、使用可能なエネルギー供与体（ドナー）およびエネルギー受容体（アクセプター）は、ＦＲＥＴを利用することが可能な組み合わせならば特に制限されない。したがって、種々の発蛍光団を有する色素が使用可能であるが、例えばフルオレセイン系、ローダミン系の色素等が好適に使用可能である。本発明においては、特にドナーとしてフルオレセイン発蛍光団を有する色素、およびアクセプターとしてローダミン発色蛍光団を有する色素を用いることが好ましい。フルオレセインは４９２ ｎｍで励起した場合に５１８ ｎｍに蛍光のピークを示し、ローダミンは５７０ ｎｍで励起した場合に５９０ ｎｍに蛍光ピークを示す。また、Ｃｙ３は５５２ ｎｍで励起した場合に５６５ ｎｍに蛍光ピークを示す。ここで、例えばフルオレセインとローダミンがＦＲＥＴを生じるに十分な距離に近接した場合、ドナーとしてのフルオレセインからのアクセプターとしてのローダミンへの蛍光共鳴エネルギー転移に伴い、フルオレセインからの５１８ ｎｍの蛍光強度は減少し、ローダミンに基づく５９０ ｎｍの蛍光強度が増加することになる。
【００１２】
すなわち、本発明の測定方法において使用可能な２種類の１本鎖核酸プローブは図１に模擬的に示されるように、少なくとも片側の末端にそれぞれドナー（Ｄ）およびアクセプター（Ａ）を結合したものであって、さらに相補性を有する両者のハイブリダイズにより２本鎖を形成させることが可能である。この場合、相補鎖の末端はＦＲＥＴ現象が利用できるように、それぞれの逆鎖末端に（Ａ）及び（Ｄ）を結合したものである。このような核酸プローブは通常のハイブリダイズ条件により２本鎖構造を形成し、その結果プローブ両末端に結合した（Ｄ）及び（Ａ）はその空間配置が接近して、ＦＲＥＴ現象を生じるに充分な位置となる。この場合、（Ｄ）に対して光励起するとその励起エネルギーが共鳴的に（Ａ）に転移して、特徴的な蛍光スペクトルを与えることになる。
【００１３】
また、本発明の測定方法においては２種の１本鎖核酸プローブには鎖長の制限は無く、数ｂｐから数ｋｂｐのものが好適に使用可能である。また、ドナーおよびアクセプターをヌクレオチド鎖の５’末端、または３’末端に導入する方法も特に制限されず、一般の有機合成法または酵素反応で結合させて合成可能である。すなわち、一方の１本鎖核酸プローブの５’末端にフルオレセイン発色蛍光団を、それに相補するもう一方の１本鎖核酸プローブの３’末端にローダミン発色蛍光団またＣｙ３系発色蛍光団を、化学合成法か酵素反応で結合させて合成することが可能である。また、同様にしてその逆の配置も合成可能である。
【００１４】
さらに、本発明の測定方法において２種の１本鎖核酸プローブの塩基配列は、使用の目的に応じて適宜選択可能であり特に制限されない。すなわち、これらは互いに相補的であること以外に塩基配列の制限はなく、したがってナンセンスな配列も好適に使用可能である。
【００１５】
本発明の測定キットにおいては、２種の１本鎖核酸プローブを溶液中で適当な温度条件の下でハイブリダイズさせた２本鎖核酸プローブを使用する。この際、１本鎖核酸プローブの濃度が若干異なる場合では、いずれかの１本鎖核酸プローブが残留する場合がある。残留する１本鎖核酸プローブは、使用前に除去しておくことが望ましい。そのためには、アクリルアミドゲルによる電気泳動的分離手法、ゲルろ過のような物理的分離手法、および陰イオン交換カラムなどによる静電的分離手法を用いることができる。本発明の測定キットにおいては、上記のように調製した２本鎖核酸プローブを３〜６００ ｎＭの濃度で使用する。
【００１６】
熱処理または酵素的処理により解離した１本鎖核酸プローブが測定中に再び結合しないようにすることは、本発明の測定方法の簡便性と信頼性を向上させるのに有効な方法である。この方法として、（１）該１本鎖核酸プローブのいずれかと相補的な蛍光ラベルされていない１本鎖核酸をトラッピング鎖として測定系中に添加する、（２）１本鎖核酸特異的結合性タンパク質をトラッピング剤として測定系中に添加する、（３）ペプチド骨格を有する核酸類似の構造を持つ非天然の化合物（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ、以下ＰＮＡと言う）をトラッピング鎖として測定系中に添加する、のいずれかの方法を用いることができる。（１）においては、解離したいずれかの１本鎖核酸プローブと該トラッピング鎖が結合し、プローブ鎖同士の再結合を防止する。（２）における１本鎖核酸特異的結合性タンパク質は生物由来のタンパク質であり、１本鎖核酸に特異的に結合して安定化させ、立体障害的に２本鎖への再結合を阻害する。（３）におけるＰＮＡはペプチド骨格を有しており、リン酸基による負電荷の反発がないため１本鎖核酸とより強くハイブリダイズするため、該プローブ同士の再結合を好適に防止することが可能である。（１）〜（３）のいずれの場合も、トラッピング鎖またはトラッピング剤を、対応する１本鎖核酸プローブ量に対して過剰量添加することが望ましい。本発明の測定キットにおいては、トラッピング鎖の場合はモル比で２．５倍以上、１本鎖核酸特異的結合性タンパク質やＰＮＡ等のトラッピング剤についてはモル比で１０倍以上添加することを特徴としている。
【００１７】
本発明の測定方法においては、２種類の発色蛍光団からの蛍光スペクトルの変化を測定して比較する方法について特に制限はない。例えば、ＦＲＥＴが起こっている時点の２種類の発蛍光団のそれぞれの蛍光強度比と、ＦＲＥＴが生じない条件下での２種類の発蛍光団のそれぞれの蛍光強度比とを比較する方法は好適に使用可能である。この場合、さらに高感度の測定を行うために、励起波長の選択、蛍光の選択的測定のためのフィルター、さらに２種類の蛍光を同時に測定する手段などが好適に使用される。また、本発明の測定方法で使用する蛍光スペクトル測定装置は特に制限はなく、通常の装置が好適に使用可能である。
【００１８】
さらに、本発明の測定方法を応用することにより、新規な１本鎖核酸特異的結合性タンパク質の検索や性能評価を行うことが可能である。この目的のため、本発明の測定方法において、該１本鎖核酸プローブのトラッピング鎖やトラッピング剤無添加の測定系を構築する。まず、加熱または酵素反応により２本鎖核酸プローブを１本鎖とした後、これに試料タンパク質を添加する。次いで、該１本鎖プローブ同士の再結合の状況をドナーまたはアクセプターの蛍光スペクトルの変化、すなわちＦＲＥＴ現象の発現の有無を確認する。この際、試料タンパク質が該１本鎖核酸プローブのいずれとも結合しなければ、プローブの再結合によりＦＲＥＴ現象が発現する。一方、試料タンパク質がいずれかのプローブと結合すればＦＲＥＴは起こらないため、この試料タンパク質は新規な１本鎖核酸特異的結合性タンパク質である可能性が高いことになる。
【００１９】
【実施例】
以下、本発明を実施例に従って詳細に説明する。ただし、本発明はこの実施例に制限されるものではない。
【００２０】（実施例１）
２本鎖ＤＮＡプローブの調製
化学合成法により、配列表の配列１で示される３’末端にフルオレセインが結合した１本鎖のプローブ（１）、および配列２で示される５’末端にテトラメチルローダミンが結合したプローブ（２）をそれぞれ合成した。合成したプローブ（１）と（２）を５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ８．０、３０ ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む）中で９５ ℃で５分間加熱後、室温に３時間放置して２本鎖を形成せしめ、８ ％アクリルアミドゲル電気泳動により２本鎖ＤＮＡに相当するバンドを精製した。これを２本鎖プローブ（Ａ）とした。同様に、配列表の配列１、３で示される１本鎖のプローブ（１）と（３）をそれぞれ合成し、同様のアニーリング操作と精製により２本鎖ＤＮＡを得た。これを２本鎖プローブ（Ｂ）とした。これらの２本鎖プローブをエタノールで沈殿させて乾燥後、それぞれ５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ８．０、３０ ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む）に溶解して以下の実施例に用いた。なお、以後の蛍光スペクトルの測定および蛍光強度の測定には、日立製作所製の蛍光分光光度計Ｆ４０１０型を使用した。
【００２１】（実施例２）
２本鎖プローブによるＦＲＥＴの検証
３０ ｎＭの２本鎖プローブ（Ａ）溶液を、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ８．０、３０ ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む）にて調製した。これを波長４９２ ｎｍの光により励起し、その蛍光スペクトルを蛍光光度計を用いて測定した。結果を図２に示した。図２において、１本鎖のプローブ（１）のみ（長破線で示す）では５１８ ｎｍ付近をピークとしたフルオレセインの大きな蛍光スペクトルが認められるのに対し、２本鎖プローブ（Ａ）（短破線で示す）ではＦＲＥＴによりフルオレセインに由来する蛍光がほとんど認められなかった。さらに、３０ ｎＭの２本鎖プローブ（Ａ）溶液を９５ ℃で５分加熱した後、氷上にて急冷して１本鎖化を行った。この溶液に、配列４で示される非ラベル化１本鎖のプローブ（４）を最終的に６０〜３００ ｎＭとなるように加え、室温で１時間放置した。これを波長４９２ ｎｍで励起して蛍光スペクトルを測定した。その結果も図２に同様に示した。図２において、ＦＲＥＴ現象により減少していたフルオレセインの蛍光は、配列４で示される１本鎖のプローブ（４）を添加することにより、濃度依存的に増加した。一方、配列表の配列１と配列４の塩基配列は等しいため、１本鎖化されたプローブ（２）は競合的にプローブ（１）かプローブ（４）にハイブリダイズすることが予想される。図２の結果からも、プローブ（４）の系中の量とＦＲＥＴ現象の解除に基づくフルオレセインの蛍光強度の増加は一致しており、プローブ（２）がプローブ（４）にトラップされていることは明らかである。
プローブ（１） とプローブ（３）とをハイブリダイズした２本鎖プローブ（Ｂ）についても、全く同様の実験を行い、その結果を図３に示した。２本鎖プローブ（Ｂ）においても２本鎖プローブ（Ａ）の場合と全く同様の結果が得られたことから、エネルギー受容体となる蛍光色素をテトラメチルローダミンからＣｙ３に換えた場合においても、本発明の測定方法が成立することが示された。
【００２２】（実施例３）
１本鎖核酸特異的結合性タンパク質存在下におけるＦＲＥＴ現象の検証
３０ ｎＭの２本鎖プローブ（Ａ）溶液を、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ８．０、３０ ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む）にて調製した。この溶液を９５ ℃で５分間加熱し氷上にて急冷して、大腸菌由来１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ストラテジーン社製、以下ＳＳＢと言う）を最終的に０〜９００ ｎＭとなるように添加して室温で１時間放置し、波長４９２ ｎｍの光で励起し５１８ ｎｍの蛍光強度を測定した。その結果を図４に示した。図４の結果から、解離した１本鎖のプローブ（１）およびプローブ（２）にＳＳＢが結合し、それに伴うＦＲＥＴ現象の解消が認められた。また、ＦＲＥＴの解消の度合いは系中に添加したＳＳＢの濃度に依存していた。すなわち、系中に６００ ｎＭ 以上のＳＳＢが添加されると１本鎖のプローブ鎖が有効にトラップされるため、ＦＲＥＴが解除されることが示された。したがって、本発明の測定キットにおいてＳＳＢの添加は有効であることが示された。
【００２３】（実施例４）
ＰＮＡ存在下におけるＦＲＥＴ現象の検証
３０ ｎＭの２本鎖プローブ（Ａ）溶液と、種々の濃度の配列５で示されるＰＮＡ（グライナー ジャパン社製）溶液を、２５ ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ ８．０、２０ ｍＭ ＮａＣｌを含む）にて調製した。２本鎖プローブ（Ａ）溶液を９５ ℃で５分加熱して氷上にて急冷した後、ＰＮＡ溶液を０〜１００ ｎＭになるように添加して室温にて３時間以上放置した。これを、波長４９２ ｎｍで励起して５１８ ｎｍの蛍光強度を測定した。その結果を図５に示した。図５の結果から、実施例３で示したＳＳＢの場合と全く同様に、ＰＮＡが７５ ｎＭ以上存在するとエネルギー受容体側のプローブ（２）鎖を有効にトラップしてＦＲＥＴが解除されることが示された。したがって、本発明の測定キットにおいてＰＮＡの添加も有効であることが示された。
【００２４】（実施例５）
本発明の測定方法を用いたＤＮＡヘリカーゼの活性測定
配列表の配列６で示される１本鎖のプローブ（６）と配列７で示される１本鎖のプローブ（７）を、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ８．０、３０ ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む）中で９５ ℃で５分間加熱後、室温に３時間放置し２本鎖を形成させた。これを、８ ％アクリルアミドゲル電気泳動に供して２本鎖ＤＮＡに相当するバンドを精製した。これを２本鎖プローブ（Ｃ）とした。２本鎖プローブ（Ｃ）を３０ ｎＭになるように２５ ｍＭ ＨＥＰＥＳ ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ ８．０、２０ ｍＭ ＮａＣｌ、５ ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ ｍＭ Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、５０ μｇ／ｍｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ， １２０ ｎＭの配列５で示されるＰＮＡ を含む）に溶解し、種々の濃度の大腸菌由来ＤＮＡ Ｈｅｌｉｃａｓｅ ＩＩ ７０／８０ （日本ジーン社製）を添加した。４ ｍＭのＡＴＰ存在下または非存在下において３７ ℃で３０分間反応し、波長４９２ ｎｍの光により励起したときの５１８ ｎｍにおける蛍光強度を測定した。その結果を図６に示した。図６の結果から、ヘリカーゼの添加量が増加するにしたがい、ＦＲＥＴ現象の解除によるフルオレセインの蛍光強度も濃度依存的に強くなっていくことが示された。このことから、ＤＮＡヘリカーゼによりＤＮＡの二本鎖が巻き戻されて１本鎖ＤＮＡが生成されていることが明らかとなった。すなわち、ヘリカーゼに代表される核酸の２本鎖構造を解消させる酵素等の測定に対して、本発明の測定方法が極めて有効であることが示された。
【００２５】
【配列表】
【００２６】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の測定方法の概略を示す図である。図中のＤおよびＡはそれぞれドナー、アクセプターの蛍光色素を表す。これら１対の１本鎖プローブをハイブリダイズさせて２本鎖プローブとし、ＦＲＥＴを生じさせる。この段階でドナーＤの励起波長の光を照射しても、ＦＲＥＴ現象によりＤの蛍光エネルギーはＡに転移されてＤの蛍光はわずかしか測定されない。この２本鎖プローブを熱変性または酵素反応により１本鎖化すると、ＤとＡの距離が離れてＦＲＥＴは解除され、Ｄの励起によりＤの蛍光スペクトルを測定することができる。この際、１本鎖アクセプタープローブと相補的な非ラベル化１本鎖プローブ、１本鎖核酸特異的結合性タンパク質、あるいはＰＮＡ等を添加しておくとアクセプタープローブがトラップされてＦＲＥＴの解除が継続される。
【図２】本発明に係るＦＲＥＴ現象を示す図である。この図では、ドナーとしてフルオレセインでラベルしたプローブ（１）と、アクセプターとしてテトラメチルローダミンでラベルしたプローブ（２）の組み合わせを表示した。ＦＲＥＴ現象により２本鎖プローブ（Ａ）の蛍光はほとんど認められない。また、１本鎖化後にプローブ（２）と相補的な非ラベル化プローブ（４）を添加すると、再結合によるＦＲＥＴが濃度依存的に解除される。
【図３】図２と全く同様の実験を、ドナーとしてフルオレセインでラベルしたプローブ（１）と、アクセプターとしてＣｙ３でラベルしたプローブ（３）の組み合わせで行い、その結果を表示した。この組み合わせにおいても、プローブ（４）の添加によりＦＲＥＴが濃度依存的に解除される。
【図４】熱変性により１本鎖化した２本鎖プローブ溶液に、種々の濃度のＳＳＢを添加した場合の波長４９２ ｎｍ における蛍光強度を示す図である。ＳＳＢの添加により再結合が阻害されて、濃度依存的にＦＲＥＴが解除されていることを示す。
【図５】図４と全く同様の実験を、ＳＳＢの代わりにＰＮＡを用いて行い、その結果を表示した。ＰＮＡもＳＳＢと全く同様の効果を示すことが分かる。
【図６】２本鎖プローブ（Ｃ）をヘリカーゼで処理した場合の、波長４９２ ｎｍ における蛍光強度の変化を示す図である。ヘリカーゼ濃度の増加に伴い、巻き戻しによる１本鎖プローブ量が増加してＦＲＥＴが解除され、フルオレセインの蛍光強度が濃度依存的、かつ直線的に上昇することが分かる。すなわち、本発明の測定方法はヘリカーゼの活性測定法として好適であることを示している。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for measuring the collapse of a higher-order structure of a nucleic acid, particularly the activity of eliminating and unwinding a double-stranded helical structure of a nucleic acid performed by heating or an enzyme, and the ability of a single-stranded nucleic acid-specific binding protein. .
[0002]
[Prior art]
An electrophoretic method is generally used as a method for measuring the state of unfolding of a double strand into a single strand due to double strand formation or denaturation due to nucleic acid hybridization. As for the enzymatic degradation of double-stranded nucleic acids, techniques using fluorescence polarization extinction and fluorescence resonance energy transfer exist and are widely used.
[0003]
Fluorescence Resonance Energy Transfer is a phenomenon related to fluorescence emission, in which the fluorescence spectrum of one fluorophore overlaps the excitation spectrum of another chromophore, and the fluorophores are close to each other. In this position, the excitation energy of one fluorophore induces the emission of fluorescence from another fluorophore, and the original fluorophore itself loses its energy and its fluorescence intensity decreases. (For example, see Non-Patent Documents 1 and 2). This phenomenon is known to be extremely sensitive to the distance between the fluorophores, and is generally proportional to the distance between the fluorophores, 10 −6 . For these reasons, the fluorescence resonance energy transfer phenomenon is widely used for microscopic research in molecular biology and cell biology (for example, see Patent Documents 1 and 2).
[0004]
On the other hand, in the case of measuring the activity of an enzyme such as DNA helicase, which unwinds and double-strands a double-stranded DNA, the single-stranded DNA released after the reaction between the substrate and the enzyme is electrophoretically analyzed. The mainstream is the end-point assay for measurement, which requires a long time, is complicated, and has poor quantitativeness. In addition, although the fluorescence measurement method using the stopped flow is suitable for speed analysis, it is disadvantageous in that a special measurement device is used (for example, see Non-Patent Documents 3 and 4).
[0005]
As described above, when the resolution of an enzymatic double helix structure is measured, it is complicated and the quantitative value is poor, or there is only a method that requires a complicated procedure for the measurement. The development of a method is desired.
[0006]
[Non-patent document 1]
L. Storyer: Annual Review of Biochemistry, 47 , 819-846, (1978)
[Non-patent document 2]
Taylor et al .: Fluorescence Microscopy of Living Cells in Culture; Part B,
Academic Press, New York, 220-245, (1989).
[Non-Patent Document 3]
Ochem et al .: Journal of Biological Chemistry, 272 , 29919-29926, (1997).
[Non-patent document 4]
Bjornson et al .: Biochemistry, 33 , 14306-14316, (1994).
[Patent Document 1]
JP-A-11-56398 [Patent Document 2]
JP-A-11-178600
[Problems to be solved by the invention]
The present invention relates to a novel assay for measuring the disruption of the higher-order structure of nucleic acids, in particular, the elimination or unwinding activity of a double-stranded helical structure of a nucleic acid performed by heating or an enzyme, or the ability of a single-stranded nucleic acid-specific binding protein. The task is to provide a method. It is another object of the present invention to provide a simple and easy-to-use measurement kit which is excellent in quantification and reproducibility by applying the above-mentioned measurement method.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies with the aim of solving the above-mentioned problems, and as a result, have found that a simple and highly quantitative single-stranded nucleic acid using fluorescence resonance energy transfer (hereinafter referred to as FRET). The present invention was completed by finding a chemical measurement method.
[0009]
The FRET phenomenon in the present invention is a phenomenon relating to fluorescence emission, and the fluorescence spectrum of one energy-donating fluorophore (hereinafter, referred to as an energy donor or simply a donor) is reflected by another energy-accepting fluorophore. When the excitation spectrum overlaps with the excitation spectrum of a fluorophore (hereinafter referred to as an energy acceptor or simply an acceptor) and the donor and the acceptor are in close proximity, the excitation of the donor induces the fluorescence of the acceptor and This means a phenomenon in which the fluorescence intensity of the donor itself decreases.
[0010]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to the drawings. FIG. 1 is a diagram schematically illustrating the measurement method of the present invention. The FRET compound according to the present invention is, as shown in FIG. 1, a single-stranded donor probe to which a fluorescent energy donor (D) is bound and a single-stranded acceptor probe to which a fluorescent energy acceptor (A) is further bound. Is a double-stranded hybrid body obtained by hybridizing That is, the probe is composed of two types of single-stranded nucleic acid probes and has at least (1) a donor (D) and an acceptor (A) for utilizing the FRET phenomenon at an end of the probe, and (2) the probe Are labeled with different fluorescent dyes DA. (3) When a double strand is formed by hybridization of the two probes, the probe is designed to have a spatial arrangement that allows FRET from the donor (D) to the acceptor (A). ing. Therefore, even if the light of the excitation wavelength of the donor (D) is irradiated at the stage of the double strand, the observed fluorescence spectrum becomes that of the acceptor (A) due to energy transfer by the FRET phenomenon. Next, when the double-stranded probe that has formed a hybrid form between two molecules becomes single-stranded by the reaction with the protein to be measured (for example, DNA helicase), the FRET phenomenon occurs because the distance between DA becomes large. By releasing, the fluorescence spectrum of the donor (D) can be measured. On the other hand, it is known that single-stranded nucleic acids complementary to each other naturally anneal in a solution even at room temperature. However, by allowing a sufficient amount of unlabeled complementary strand nucleic acid or the like to be present in the system, the acceptor probe is trapped and the FRET phenomenon is continuously released. Therefore, the activity of the unwinding reaction of the double-stranded nucleic acid by the helicase or the like can be suitably measured.
[0011]
In the measurement method of the present invention, usable energy donors (donors) and energy acceptors (acceptors) are not particularly limited as long as they can use FRET. Accordingly, dyes having various fluorophores can be used, and for example, fluorescein-based and rhodamine-based dyes can be suitably used. In the present invention, it is particularly preferable to use a dye having a fluorescein fluorophore as a donor and a dye having a rhodamine chromophore as an acceptor. Fluorescein shows a fluorescence peak at 518 nm when excited at 492 nm, and Rhodamine shows a fluorescence peak at 590 nm when excited at 570 nm. Cy3 shows a fluorescence peak at 565 nm when excited at 552 nm. Here, for example, if fluorescein and rhodamine are close enough to generate FRET, the fluorescence intensity at 518 nm from fluorescein decreases due to the fluorescence resonance energy transfer from fluorescein as a donor to rhodamine as an acceptor. , The fluorescence intensity at 590 nm based on rhodamine will increase.
[0012]
That is, two types of single-stranded nucleic acid probes that can be used in the measurement method of the present invention have a donor (D) and an acceptor (A) bonded to at least one end, respectively, as schematically shown in FIG. In addition, it is possible to form a double strand by hybridization of both of them having further complementarity. In this case, the ends of the complementary strands are those obtained by binding (A) and (D) to the respective ends of the opposite strands so that the FRET phenomenon can be used. Such a nucleic acid probe forms a double-stranded structure under ordinary hybridization conditions. As a result, (D) and (A) bound to both ends of the probe are close to each other in spatial arrangement, and are sufficient to cause the FRET phenomenon. Position. In this case, when light is excited with respect to (D), the excitation energy is resonantly transferred to (A) to give a characteristic fluorescence spectrum.
[0013]
In the measurement method of the present invention, there is no limitation on the chain length of the two single-stranded nucleic acid probes, and those having several bp to several kbp can be suitably used. The method of introducing the donor and the acceptor into the 5 ′ end or the 3 ′ end of the nucleotide chain is not particularly limited, and can be synthesized by binding by a general organic synthesis method or an enzymatic reaction. That is, a fluorescein chromophore at the 5 'end of one single-stranded nucleic acid probe and a rhodamine chromophore or Cy3-based chromophore at the 3' end of the other single-stranded nucleic acid probe complementary thereto are chemically synthesized. It is possible to synthesize by binding by a method or an enzymatic reaction. Similarly, the reverse arrangement can be combined.
[0014]
Furthermore, in the measurement method of the present invention, the base sequences of the two single-stranded nucleic acid probes can be appropriately selected according to the purpose of use, and are not particularly limited. That is, there is no restriction on the base sequence except that they are complementary to each other, and therefore, a nonsense sequence can be suitably used.
[0015]
In the measurement kit of the present invention, a double-stranded nucleic acid probe obtained by hybridizing two single-stranded nucleic acid probes in a solution under an appropriate temperature condition is used. At this time, when the concentration of the single-stranded nucleic acid probe is slightly different, one of the single-stranded nucleic acid probes may remain. It is desirable to remove the remaining single-stranded nucleic acid probe before use. For that purpose, an electrophoretic separation method using acrylamide gel, a physical separation method such as gel filtration, and an electrostatic separation method using an anion exchange column or the like can be used. In the measurement kit of the present invention, the double-stranded nucleic acid probe prepared as described above is used at a concentration of 3 to 600 nM.
[0016]
Preventing single-stranded nucleic acid probes dissociated by heat treatment or enzymatic treatment from binding again during measurement is an effective method for improving the simplicity and reliability of the measurement method of the present invention. As the method, (1) a single-stranded nucleic acid which is not fluorescently labeled and is complementary to any one of the single-stranded nucleic acid probes is added to a measurement system as a trapping strand; (2) a single-stranded nucleic acid-specific binding property (3) adding a non-natural compound (Peptide Nucleic Acid, hereinafter referred to as PNA) having a structure similar to a nucleic acid having a peptide skeleton to the measurement system as a trapping chain; Can be used. In (1), any one of the dissociated single-stranded nucleic acid probes and the trapping strand bind to each other to prevent recombination of the probe strands. The single-stranded nucleic acid-specific binding protein in (2) is a protein derived from an organism, specifically binds and stabilizes a single-stranded nucleic acid, and sterically hinders rebinding to a double-stranded strand. . The PNA in (3) has a peptide skeleton, and since it has no repulsion of negative charge due to a phosphate group, it hybridizes more strongly with a single-stranded nucleic acid. Therefore, it is possible to suitably prevent recombination between the probes. It is possible. In any of the cases (1) to (3), it is desirable to add a trapping strand or a trapping agent in an excess amount relative to the amount of the corresponding single-stranded nucleic acid probe. The measuring kit of the present invention is characterized in that a trapping strand is added at a molar ratio of 2.5 times or more, and a single-stranded nucleic acid-specific binding protein or a trapping agent such as PNA is added at a molar ratio of 10 times or more. And
[0017]
In the measurement method of the present invention, there is no particular limitation on the method of measuring the change in the fluorescence spectrum from the two types of chromophores and comparing them. For example, a method of comparing the fluorescence intensity ratio of each of the two types of fluorophores at the time when FRET is occurring with the fluorescence intensity ratio of each of the two types of fluorophores under conditions where FRET does not occur is preferable. It can be used for In this case, in order to perform measurement with higher sensitivity, a filter for selecting an excitation wavelength, a selective measurement of fluorescence, and a means for simultaneously measuring two types of fluorescence are preferably used. Further, the fluorescence spectrum measuring device used in the measuring method of the present invention is not particularly limited, and an ordinary device can be suitably used.
[0018]
Furthermore, by applying the measurement method of the present invention, it is possible to search for a novel single-stranded nucleic acid-specific binding protein and evaluate its performance. For this purpose, in the measuring method of the present invention, a measuring system is constructed without adding a trapping strand or a trapping agent of the single-stranded nucleic acid probe. First, after a double-stranded nucleic acid probe is converted into a single strand by heating or an enzymatic reaction, a sample protein is added thereto. Next, the state of the recombination between the single-stranded probes is checked for changes in the fluorescence spectrum of the donor or acceptor, that is, for the presence or absence of the FRET phenomenon. At this time, if the sample protein does not bind to any of the single-stranded nucleic acid probes, the FRET phenomenon occurs due to the recombination of the probes. On the other hand, since FRET does not occur if the sample protein binds to any of the probes, it is highly likely that this sample protein is a novel single-stranded nucleic acid-specific binding protein.
[0019]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, the present invention is not limited to this embodiment.
(Embodiment 1)
Preparation of double-stranded DNA probe A single-stranded probe (1) having fluorescein bound to the 3 'end shown in sequence 1 of the sequence listing and tetramethylrhodamine at the 5' end shown in sequence 2 by a chemical synthesis method The probe (2) bound to was synthesized. The synthesized probes (1) and (2) were heated in a 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0, containing 30 mM MgCl 2 ) at 95 ° C. for 5 minutes, and then left at room temperature for 3 hours. A strand was formed, and a band corresponding to double-stranded DNA was purified by 8% acrylamide gel electrophoresis. This was designated as a double-stranded probe (A). Similarly, single-stranded probes (1) and (3) represented by sequences 1 and 3 in the sequence listing were respectively synthesized, and double-stranded DNA was obtained by the same annealing operation and purification. This was designated as a double-stranded probe (B). These double-stranded probes were precipitated with ethanol and dried, then dissolved in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0, containing 30 mM MgCl 2 ) and used in the following Examples. In the subsequent measurement of the fluorescence spectrum and the measurement of the fluorescence intensity, a fluorescence spectrophotometer F4010 manufactured by Hitachi, Ltd. was used.
(Embodiment 2)
Verification of FRET using double-stranded probe A 30 nM double-stranded probe (A) solution was prepared in a 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0, containing 30 mM MgCl 2 ). This was excited by light having a wavelength of 492 nm, and its fluorescence spectrum was measured using a fluorometer. The results are shown in FIG. In FIG. 2, the single-strand probe (1) alone (shown by a long dashed line) shows a large fluorescence spectrum of fluorescein with a peak near 518 nm, whereas the double-stranded probe (A) (shown by a short dashed line) (Shown), almost no fluorescence derived from fluorescein was observed by FRET. Further, a 30 nM solution of the double-stranded probe (A) was heated at 95 ° C. for 5 minutes and then rapidly cooled on ice to form a single-stranded probe. To this solution, a non-labeled single-stranded probe (4) represented by Sequence 4 was added to a final concentration of 60 to 300 nM, and left at room temperature for 1 hour. This was excited at a wavelength of 492 nm and the fluorescence spectrum was measured. The results are also shown in FIG. In FIG. 2, the fluorescence of fluorescein, which was reduced by the FRET phenomenon, increased in a concentration-dependent manner by adding the single-stranded probe (4) shown in sequence 4. On the other hand, since the nucleotide sequences of Sequence 1 and Sequence 4 in the Sequence Listing are equal, it is expected that the single-stranded probe (2) will competitively hybridize to Probe (1) or Probe (4). From the results shown in FIG. 2, the amount of the probe (4) in the system is consistent with the increase in the fluorescence intensity of fluorescein due to the cancellation of the FRET phenomenon, indicating that the probe (2) is trapped by the probe (4). Is clear.
Exactly the same experiment was performed on the double-stranded probe (B) obtained by hybridizing the probe (1) and the probe (3), and the results are shown in FIG. Since the same result as that of the double-stranded probe (A) was obtained also in the double-stranded probe (B), even when the fluorescent dye serving as the energy acceptor was changed from tetramethylrhodamine to Cy3, It was shown that the measurement method of the present invention was established.
(Embodiment 3)
Verification of FRET Phenomenon in the Presence of Single-Stranded Nucleic Acid Specific Binding Protein A 30 nM double-stranded probe (A) solution was added to a 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0, containing 30 mM MgCl 2 ). Prepared. This solution was heated at 95 ° C. for 5 minutes and rapidly cooled on ice, and a single-stranded DNA binding protein derived from Escherichia coli (manufactured by Strategene, hereinafter referred to as SSB) was added to a final concentration of 0 to 900 nM. The mixture was left at room temperature for 1 hour, excited with light having a wavelength of 492 nm, and the fluorescence intensity at 518 nm was measured. The result is shown in FIG. From the results shown in FIG. 4, it was confirmed that SSB bound to the dissociated single-stranded probes (1) and (2), and the accompanying FRET phenomenon was eliminated. Further, the degree of the cancellation of FRET was dependent on the concentration of SSB added to the system. That is, it was shown that when 600 nM or more of SSB was added to the system, the single-stranded probe chain was effectively trapped, and FRET was released. Therefore, it was shown that the addition of SSB was effective in the measurement kit of the present invention.
(Embodiment 4)
Verification of FRET Phenomenon in the Presence of PNA A 30 nM double-stranded probe (A) solution and various concentrations of a PNA (Greiner Japan) solution represented by Sequence 5 were added to a 25 mM HEPES-NaOH buffer solution (pH 8). 2.0, containing 20 mM NaCl). After heating the double-stranded probe (A) solution at 95 ° C. for 5 minutes and rapidly cooling it on ice, a PNA solution was added to a concentration of 0 to 100 nM and left at room temperature for 3 hours or more. This was excited at a wavelength of 492 nm, and the fluorescence intensity at 518 nm was measured. The results are shown in FIG. The results in FIG. 5 show that the presence of 75 nM or more of PNA effectively traps the probe (2) chain on the energy receptor side and releases FRET, just like the case of SSB shown in Example 3. Was done. Therefore, it was shown that addition of PNA was also effective in the measurement kit of the present invention.
(Embodiment 5)
The single-stranded probe (6) shown in sequence 6 and the single-stranded probe (7) shown in sequence 7 of the DNA helicase activity measurement sequence list using the measurement method of the present invention were combined with 50 mM Tris-HCl. After heating in a buffer solution (pH 8.0, containing 30 mM MgCl 2 ) at 95 ° C. for 5 minutes, the mixture was left at room temperature for 3 hours to form a double strand. This was subjected to 8% acrylamide gel electrophoresis to purify a band corresponding to double-stranded DNA. This was designated as a double-stranded probe (C). The double-stranded probe (C) was adjusted to 30 nM with 25 mM HEPES NaOH buffer (pH 8.0, 20 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 , 1 mM Dithiothreitol, 50 μg / ml Bovine Serum Albumin, 120 nM). E. coli DNA Helicase II 70/80 (manufactured by Nippon Gene) at various concentrations was added. The reaction was carried out at 37 ° C. for 30 minutes in the presence or absence of 4 mM ATP, and the fluorescence intensity at 518 nm when excited by light having a wavelength of 492 nm was measured. FIG. 6 shows the result. The results in FIG. 6 indicate that as the amount of helicase added increases, the fluorescence intensity of fluorescein due to the cancellation of the FRET phenomenon increases in a concentration-dependent manner. This revealed that the double strand of DNA was unwound by the DNA helicase to generate single-stranded DNA. That is, it was shown that the measurement method of the present invention is extremely effective for measurement of an enzyme or the like that eliminates the double-stranded structure of a nucleic acid represented by helicase.
[0025]
[Sequence list]
[0026]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing an outline of a measurement method of the present invention. D and A in the figure represent donor and acceptor fluorescent dyes, respectively. The pair of single-stranded probes is hybridized to form a double-stranded probe, thereby causing FRET. Even if light of the excitation wavelength of the donor D is irradiated at this stage, the fluorescence energy of D is transferred to A by the FRET phenomenon, and the fluorescence of D is measured only slightly. When this double-stranded probe is made into a single strand by heat denaturation or enzymatic reaction, the distance between D and A is increased to cancel FRET, and the excitation spectrum of D allows the fluorescence spectrum of D to be measured. At this time, if an unlabeled single-stranded probe complementary to the single-stranded acceptor probe, a single-stranded nucleic acid-specific binding protein, or PNA is added, the acceptor probe is trapped and FRET is released. Is continued.
FIG. 2 is a diagram showing a FRET phenomenon according to the present invention. In this figure, a combination of a probe (1) labeled with fluorescein as a donor and a probe (2) labeled with tetramethylrhodamine as an acceptor is shown. Due to the FRET phenomenon, the fluorescence of the double-stranded probe (A) is hardly recognized. Further, when a non-labeled probe (4) complementary to the probe (2) is added after the single-strand formation, FRET due to recombination is released in a concentration-dependent manner.
FIG. 3 shows an experiment identical to that of FIG. 2 using a combination of a probe (1) labeled with fluorescein as a donor and a probe (3) labeled with Cy3 as an acceptor, and the results are displayed. Also in this combination, FRET is released in a concentration-dependent manner by the addition of the probe (4).
FIG. 4 is a diagram showing the fluorescence intensity at a wavelength of 492 nm when various concentrations of SSB are added to a double-stranded probe solution that has been made single-stranded by thermal denaturation. This indicates that addition of SSB inhibits recombination and releases FRET in a concentration-dependent manner.
FIG. 5 shows the same experiment as FIG. 4 except that PNA was used instead of SSB, and the results were displayed. It can be seen that PNA shows exactly the same effect as SSB.
FIG. 6 is a diagram showing a change in fluorescence intensity at a wavelength of 492 nm when the double-stranded probe (C) is treated with helicase. It can be seen that as the helicase concentration increases, the amount of single-stranded probe due to unwinding increases, FRET is released, and the fluorescence intensity of fluorescein increases linearly in a concentration-dependent manner. That is, it indicates that the measurement method of the present invention is suitable as a method for measuring helicase activity.
