JP2004290030A

JP2004290030A - Plant dna extraction kit and plant dna extraction method

Info

Publication number: JP2004290030A
Application number: JP2003084168A
Authority: JP
Inventors: Naoto Yabe; 尚登矢部; Akira Wakasa; 暁若狭
Original assignee: Nat Agric & Bio Oriented Res; Japan Science and Technology Agency; National Agriculture and Bio Oriented Research Organization NARO
Current assignee: Nat Agric & Bio Oriented Res; Japan Science and Technology Agency; National Agriculture and Bio Oriented Research Organization NARO
Priority date: 2003-03-26
Filing date: 2003-03-26
Publication date: 2004-10-21

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a simple extraction method by which DNA can be separated from a plant in a high purity without using RNase (ribonuclease), to provide an elusion reagent for therefor, and to provide an extraction kit therefor. <P>SOLUTION: This plant DNA elusion reagent is characterized by comprising a pH 7 to 9 buffered solution and containing SDS (sodium dodecyl sulfate), EDTA and a polyether-based defoaming agent. This plant DNA extraction method is characterized by comprising a process (a) for mixing the reagent with plant tissues to obtain the cell-dissolved solution, a process (b) for mixing the cell-dissolved solution with a nucleic acid-adsorbing solution containing a chaotropic substance to obtain a mixture solution, a process (c) for contacting the mixture solution with a nucleic acid-binding carrier to bind the DNA to the carrier, a process (d) for washing the DNA carried on the nucleic acid-bound carrier, and a process (e) for separating the DNA from the nucleic acid-binding carrier. The plant DNA extraction kit is characterized by comprising the DNA extraction reagent, the nucleic acid-binding carrier containing the chaotropic substance, and the nucleic acid-binding carrier. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物材料から植物ＤＮＡを抽出、精製するための抽出キット及び抽出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物からその核酸を抽出し精製することは、遺伝子工学等の研究において重要な工程の一つである。このような工程は、多くの場合、数多くの個体について行なわれることが求められるため、その工程はより単純なものであることが好ましい。さらに、このような工程は通常実験室において行なわれるものであるので、実験室において使い勝手がよいものが好ましい。
【０００３】
植物の核酸の抽出方法としては、これまでに数多くのものが知られている。例えば、特許文献１及び２には、核酸を核酸結合性固相担体に結合させてから分離する方法が開示されており、これらの方法ではＤＮＡ及びＲＮＡを効率的に抽出できる。しかしながらこれらの従来の核酸の抽出方法では、ＤＮＡとＲＮＡとの化学的性質が近似していることから、ＤＮＡをＲＮＡから高精製度で分離することが困難であるという問題点がある。
【０００４】
ＲＮＡを含むＤＮＡ試料からのＲＮＡの除去は、通常ＲＮａｓｅを試料溶液中に添加し、ＲＮＡを分解することにより行なわれる。しかし、一般に遺伝子工学の研究においては、ＲＮａｓｅフリーの条件下で実験を行なうことが求められることが多いため、実験室においてＲＮａｓｅを用いる作業には格別の注意を払わなければならないという、実用上の大きな問題点がある。
【０００５】
また、得られる核酸抽出物は、夾雑物が少ないものであることが好ましいが、通常夾雑物の少ない抽出法ほど抽出の工程が複雑である。したがって、工程が単純でありながら且つ夾雑物の少ない抽出方法が求められている。
【０００６】
【特許文献１】
特開平２−２８９５９６号公報
【特許文献２】
特開平１１−１６９１７０号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ＲＮａｓｅを使用することなく、ＤＮＡを高精製度で植物体から分離することができる簡便な抽出方法及びそれに用いる溶出試薬及び抽出キットを提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために種々検討をおこなったところ、植物組織から核酸を溶出させるための試薬の組成を特定のものとし、これを、核酸結合性固相担体を用いる抽出方法に適用することにより、ＲＮａｓｅを用いなくてもＲＮＡの混入割合が非常に低いＤＮＡ試料を簡便且つ効率的に抽出しうることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
即ち、本発明によれば、ｐＨ７〜９に緩衝された液からなり、ＳＤＳと、エチレンジアミン四酢酸と、ポリエーテル系消泡剤とを含むことを特徴とする植物ＤＮＡ溶出試薬が提供される。
【００１０】
また、本発明によれば、前記植物ＤＮＡ溶出試薬を植物組織に混合して植物組織中の細胞を溶解させ、細胞溶解液を得る工程（ａ）と；前記細胞溶解液に、カオトロピック物質を含む核酸吸着液を混合し、混合液を得る工程（ｂ）と；前記混合液を核酸結合性担体に接触させて、該担体にＤＮＡを結合させる工程（ｃ）と；前記核酸結合性担体上のＤＮＡを洗浄する工程（ｄ）と；前記核酸結合性担体からＤＮＡを分離する工程（ｅ）とを含むことを特徴とする植物ＤＮＡの抽出方法が提供される。
【００１１】
さらに、本発明によれば、前記ＤＮＡ溶出試薬と、カオトロピック物質を含む核酸吸着液と、核酸結合性担体とを含むことを特徴とする植物ＤＮＡ抽出キットが提供される。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の植物ＤＮＡ溶出試薬は、ｐＨ７〜９、好ましくはｐＨ７〜８に緩衝された液からなる。具体的にはトリス−ＨＣｌにより緩衝されたもの、即ちトリス等の緩衝剤を含み、塩酸等によりこの範囲のｐＨに調整された液とすることができる。本発明の植物ＤＮＡ溶出試薬中の前記緩衝剤の含有割合の下限値は、１５０ｍＭ以上、より好ましくは１８０ｍＭ以上とすることができる。上限値は特に限定されないが、通常は５００ｍＭ以下、好ましくは２５０ｍＭ以下とすることができる。
【００１３】
本発明の植物ＤＮＡ溶出試薬は、ＳＤＳを含む。ＳＤＳの含有割合は、植物ＤＮＡ溶出試薬全量に対して０．１〜１０％、好ましくは約０．５％とすることができる。
【００１４】
本発明の植物ＤＮＡ溶出試薬は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む。本発明の植物ＤＮＡ溶出試薬中のＥＤＴＡの含有割合は、１０〜５０ｍＭ、好ましくは２０〜３０ｍＭとすることができる。
【００１５】
本発明の植物ＤＮＡ溶出試薬は、さらに、ポリエーテル系消泡剤を含む。前記ポリエーテル系消泡剤としては、例えばオキシエチレン、オキシプロピレン等の重合単位を持つ重合体又はその誘導体を挙げることができる。特に好ましくは、ＰＥ−Ｌ（商品名、和光純薬株式会社製）を用いることができ、その含有割合は、植物ＤＮＡ溶出試薬全量中０．８％以上、好ましくは０．９％以上とすることができる。含有割合の上限は特に限定されないが、２．０％程度とすることができる。
【００１６】
本発明の植物ＤＮＡ溶出試薬の調製方法は、特に限定されず、上記各成分を水に溶解することにより調製することができる。
【００１７】
本発明の植物ＤＮＡの抽出方法は、前記本発明の植物ＤＮＡ溶出試薬を植物組織に混合して植物組織中の細胞を溶解させ、細胞溶解液を得る工程（ａ）を含む。
【００１８】
前記工程（ａ）における前記ＤＮＡ溶出試薬と植物組織との添加割合は、特に限定されないが、例えば５０ｍｇの植物組織に対し、５０〜２５０μｌの割合とすることができ、１００〜２００μｌの割合とすることが特に好ましい。
【００１９】
前記工程（ａ）は、適当なチューブ等の容器に、前記ＤＮＡ溶出試薬と植物組織とを入れ、さらに破砕球を入れて振とうすることにより行なうことができる。前記破砕球としては、セラミック、タングステン、ステンレス、ジルコニア等の球状又は歪んだ球状のビーズ等を用いることができる。破砕球の寸法は特に限定されないが、例えば内径５ｍｍ程度のチューブ中で破砕を行なう場合、直径４ｍｍ程度の破砕球１個を入れて行なうことができる。
【００２０】
特に前記工程（ａ）は、添加するＤＮＡ溶出試薬の一部を先に植物組織と混合し、破砕球等により破砕し、それからＤＮＡ溶出試薬の残りを添加することにより行なうことができる。具体的には例えば、約１００μｌのＤＮＡ溶出試薬と植物組織とをチューブ等の容器に入れ、振とうを行なってから、さらに約１００μｌのＤＮＡ溶出試薬を混合することができる。このように、先に比較的少量の溶出試薬によって、より短時間の破砕操作で、ＤＮＡに物理的な切断をもたらさずに、効率的に破砕を行なうことができる。
【００２１】
本発明の抽出方法は、前記細胞溶解液に、カオトロピック物質を含む核酸吸着液を混合し、混合液を得る工程（ｂ）を含む。工程（ｂ）において、前記核酸吸着液の添加量は、特に限定されないが植物組織５０ｍｇに対し、１５０〜２５０μｌの割合とすることができる。
【００２２】
前記核酸吸着液は、カオトロピック物質として、グアニジンの塩（チオシアン酸塩、塩酸塩等）、並びにＳＣＮ⁻及びＩ⁻の塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）等を含むことができる。前記核酸吸着液中の前記カオトロピック物質の含有割合は、１Ｍ〜２０Ｍ、好ましくは５〜１５Ｍとすることができる。
【００２３】
前記核酸吸着液は、さらに、ｐＨを一定とするための緩衝剤を含むことができる。当該緩衝剤としては、酢酸ナトリウム緩衝剤等を挙げることができる。
【００２４】
前記工程（ｂ）終了後、得られた混合液は、一旦遠心分離し上澄のみを取ってから次の工程に供することが好ましい。
【００２５】
また、前記混合液は、必要に応じて、リセート分離用フィルタに通す工程（ｂ’）に供してから、次の工程に供することができる。前記リセート分離用フィルタは特に限定されず、現在商業的に入手可能なリセートのクリーニング用のフィルタ等を挙げることができる。前記混合液をリセート分離用フィルタに通す操作は、特に限定されないが、底部がフィルタとなったウェルの形状を有するものなどの通常のフィルタに前記混合液を入れ、遠心することにより行なうことができる。
【００２６】
本発明の抽出方法は、前記混合液を核酸結合性担体に接触させて、該担体にＤＮＡを結合させる工程（ｃ）を含む。前記核酸結合性担体は、通常固相の担体とすることができ、好ましくは細胞の溶解液を容易に接触させることができる粒子、フィルタ、反応容器等の形状とすることができる。前記担体の材質は、カオトロピック物質の存在下でＤＮＡを吸着することができるものであれば特に限定されないが、核酸吸着能を有するものであれば特に限定されないが、シリカ、又は他の物質上にシリカを結合させたもの等を好ましく挙げることができる。
【００２７】
工程（ｃ）を行なう操作は特に限定されないが、例えば前記分離用フィルタを通過した前記混合液をそのまま、核酸結合性担体のフィルタに通過させることにより行うことができる。
【００２８】
本発明の抽出方法は、前記核酸結合性担体上のＤＮＡを洗浄する工程（ｄ）を含む。工程（ｄ）を行なう操作は特に限定されないが、例えば、前記混合液を通過させＤＮＡを結合させた核酸結合性担体のフィルタに、洗浄液を、植物組織５０ｍｇあたり対し５０〜２５０μｌ程度の割合で通過させることにより行うことができる。前記洗浄液は、固相からのＤＮＡの溶出を促進せずに他の物質を担体から洗い落とすことができる物質であれば特に限定されず、４０〜８０％、好ましくは約７０％エタノール等のアルコール等を含む水溶液を挙げることができる。
【００２９】
本発明の抽出方法は、前記核酸結合性担体からＤＮＡを分離する工程（ｅ）を含む。この工程を行なう操作は、例えば核酸結合性担体から核酸を分離させる分離液を前記核酸結合性担体のフィルタに通し、通過した液をＤＮＡ溶液として回収することにより行なうことができる。前記分離液としては、適当なｐＨの緩衝液を適宜用いることができる。具体的には例えば、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、含１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を挙げることができる。
【００３０】
前記工程（ｅ）で得られたＤＮＡ溶液は、そのまま、ＰＣＲテンプレート等のための試料として用いることができる。特に、前記工程（ｅ）で得られたＤＮＡ溶液は、ＲＮａｓｅによるさらなる処理を行なわなくても、ＲＮＡの混入割合が少ないＤＮＡ試料として用いることができる点が大きな特徴である。いかなる理論にも拘束されないが、特定の溶出試薬を用いて溶出を行なうことにより、ＤＮＡが効率よく植物組織から溶出し且つ核酸結合性担体に選択的に捕捉されるために、このような効果が得られるものと思われる。
【００３１】
本発明の植物ＤＮＡ抽出キットは、前記ＤＮＡ溶出試薬と、前記カオトロピック物質を含む核酸吸着液と、前記核酸結合性担体とを含む。また、必要に応じて、前記リセート分離用フィルタ、前記核酸結合性担体の洗浄液、核酸結合性担体から核酸を分離させる分離液、又はこれらの２種以上の組み合わせをさらに含むことができる。本発明の植物ＤＮＡ抽出キットは、これらを含むことにより、前記本発明の植物ＤＮＡの抽出方法を容易に実施することができる。
【００３２】
【発明の効果】
本発明の植物ＤＮＡ溶出試薬、本発明の植物ＤＮＡ抽出キット及び植物ＤＮＡの抽出方法は、特定の組成の溶出試薬を採用することにより、ＲＮａｓｅを用いなくても、夾雑物が少なく、ＲＮＡ混入割合の少ないＤＮＡ試料を簡便且つ効率的に抽出することができる。
【００３３】
【実施例】
以下、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００３４】
【実施例１】
表１に示す組成の植物ＤＮＡ溶出試薬１及び表２に示す核酸吸着液１を、各成分を蒸留水に溶解することにより調製した。
【００３５】
【表１】

【００３６】
【表２】

【００３７】
【実施例２】
実施例１にて調製した溶出試薬１及び核酸吸着液１を用いて、以下の手順（ａ）〜（ｅ）により、表３及び表４に示す各種の植物試料について、ＤＮＡの抽出を行なった。
（ａ）５０ｍｇ又は１００ｍｇの植物試料とジルコニアビーズ（直径４ｍｍ）一つを、ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＭｉｃｒｏｔｕｂｅｓ（Ｑｉａｇｅｎ社製、商品番号１９５６０）の各チューブに入れた。２００μｌの溶出試薬１を、各チューブに加え、ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＭｉｃｒｏｔｕｂｅＣａｐｓ（Ｑｉａｇｅｎ社製、商品番号１９５６６）で蓋をし、ミキサーミル（Ｑｉａｇｅｎ社製、商品名ＭＭ３００、商品番号８５１００）で、３０１／ｓにて１．５分間撹拌した。植物試料が完全に粉砕されるまで、この撹拌を最大４回繰返し、細胞溶解液を得た。
（ｂ）工程（ａ）で得られた細胞溶解液に、核酸吸着液１を２００μｌ添加し、手で激しく撹拌し、遠心機（商品名ＣＦ１６ＲＸ、日立製作所製、スイングバケットローターＴ５Ｓ３２を備える）を用い、４８００ｒｐｍで１０分間遠心し、上澄みを得、混合液とした。
（ｃ）リセートのクリーニング用のフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、商品名ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎＮＡ）を、核酸結合性担体フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、商品名ＭｕｔｉＳｃｒｅｅｎＦＢ）上に、遠心分離用アダプタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、商品番号ＭＡＣＦ０９６０４）を用いてセットし、フロースルーコレクションプレート上に置いた。（ｂ）で得た上澄み２００μｌをクリーニング用フィルタの各ウェル上に置き、２分間１００ｒｐｍで遠心し、リセートを核酸結合性担体フィルタまで移動させた。
（ｄ）クリーニング用フィルタを取り除き、核酸結合性担体フィルタの各ウェル上に２００μｌの７０％エタノール水溶液を加え、１５００ｒｐｍで２分間遠心し、フィルタを通過した液を廃棄した。
（ｅ）核酸結合性担体フィルタの各ウェルに、６０℃に加温した５０μｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、１分間放置した。核酸結合性担体フィルタを９６ウェルＶボトムプレートに、遠心アダプタを用いて取り付け、２０００ｒｐｍで１分間遠心し、Ｖボトムプレート中に、植物ＤＮＡ抽出物溶液を得た。
【００３８】
得られた植物ＤＮＡ抽出物溶液について、ＤＮＡ濃度（μｇ／ｍｌ）を測定し、収量（μｇ）を求め、また、核酸の純度の指標であるＯＤ２６０／２８０を測定した。結果を表３及び表４に示す。
【００３９】
【表３】

【００４０】
【表４】

【００４１】
また、抽出したゲノムＤＮＡの１／５量を０．８％アガロースゲル／０．５ＸＴＢＥバッファーで電気泳動し、エチジウムブロミドで染色した後写真撮影を行なった。その結果、ＤＮＡのテイリングの少ない、鮮明なバンドが観察された。
【００４２】
【実施例３】
実施例２の工程（ａ）において、植物試料とビーズと１００μｌの溶出試薬１とをチューブに加え、植物試料が完全に破砕されるまで撹拌を繰返し、さらにその後１００μｌの植物試料を加えて細胞溶解液を得た他は、実施例２と同様に操作し、ＤＮＡの抽出を行ない、ＤＮＡ濃度（μｇ／ｍｌ）を測定し、収量（μｇ）を求め、ＯＤ２６０／２８０を測定した。結果を表５に示す。
【００４３】
【表５】

【００４４】
【実施例４】
実施例３において得たシロイヌナズナのＤＮＡ抽出液を、ＤＮＡ量が５００ｎｇとなるようにとり、これにＥｃｏＲＩを常法で２時間作用させた後、実施例２で行なったのと同様に電気泳動し、さらに、常法にしたがってサザンブロッティングを行なった。その結果、ブロッティングしたメンブレン上には単一の明確なバンドが表れ、本発明にしたがって得たＤＮＡ抽出液は、夾雑物による制限酵素の作用への悪影響がなく、ＲＮＡによるクロスハイブリダイゼーションの影響もなく、サザン解析にも用いうる良好な品質であることが確認された。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to an extraction kit and an extraction method for extracting and purifying plant DNA from plant material.
[0002]
[Prior art]
Extracting and purifying the nucleic acid from a plant is one of the important steps in research such as genetic engineering. Since such steps are often required to be performed on a large number of individuals, it is preferable that the steps be simpler. Further, since such a process is usually performed in a laboratory, it is preferable that the process be convenient in the laboratory.
[0003]
There are many known methods for extracting plant nucleic acids. For example, Patent Literatures 1 and 2 disclose methods of binding nucleic acids to a nucleic acid-binding solid phase carrier and then separating the nucleic acids. These methods can efficiently extract DNA and RNA. However, these conventional nucleic acid extraction methods have a problem that it is difficult to separate DNA from RNA with high purity because the chemical properties of DNA and RNA are similar.
[0004]
The removal of RNA from a DNA sample containing RNA is usually performed by adding RNase to a sample solution and decomposing the RNA. However, in general, in research on genetic engineering, it is often required to carry out experiments under RNase-free conditions, so that special attention must be paid to work using RNase in a laboratory, which is a practical problem. There is a big problem.
[0005]
Further, the obtained nucleic acid extract preferably has a small amount of contaminants. However, an extraction method having a small amount of contaminants generally requires a complicated extraction step. Therefore, there is a need for an extraction method that has a simple process and has few impurities.
[0006]
[Patent Document 1]
JP-A-2-289596 [Patent Document 2]
JP-A-11-169170
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a simple extraction method capable of separating DNA from a plant with a high degree of purification without using RNase, and an elution reagent and an extraction kit used therefor.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted various studies in order to solve the above-mentioned problems, and found that the composition of a reagent for eluting nucleic acid from plant tissue was specified, and this was extracted using a nucleic acid-binding solid phase carrier. By applying the method, it has been found that a DNA sample having a very low RNA contamination ratio can be easily and efficiently extracted without using RNase, and the present invention has been completed.
[0009]
That is, according to the present invention, there is provided a plant DNA eluting reagent comprising a liquid buffered to pH 7 to 9, and comprising SDS, ethylenediaminetetraacetic acid, and a polyether-based antifoaming agent.
[0010]
Further, according to the present invention, a step (a) of mixing the plant DNA eluting reagent with a plant tissue to lyse cells in the plant tissue to obtain a cell lysate; and the cell lysate contains a chaotropic substance. Mixing the nucleic acid-adsorbing solution to obtain a mixed solution (b); contacting the mixed solution with a nucleic acid-binding carrier to bind DNA to the carrier; and (c); A method for extracting plant DNA, comprising: a step (d) of washing the DNA; and a step (e) of separating the DNA from the nucleic acid-binding carrier.
[0011]
Further, according to the present invention, there is provided a plant DNA extraction kit comprising the DNA eluting reagent, a nucleic acid adsorption solution containing a chaotropic substance, and a nucleic acid binding carrier.
[0012]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The plant DNA elution reagent of the present invention comprises a solution buffered at pH 7 to 9, preferably pH 7 to 8. Specifically, a solution buffered with Tris-HCl, that is, a solution containing a buffer such as Tris and adjusted to a pH in this range with hydrochloric acid or the like can be used. The lower limit of the content ratio of the buffer in the plant DNA elution reagent of the present invention can be 150 mM or more, more preferably 180 mM or more. Although the upper limit is not particularly limited, it can be generally 500 mM or less, preferably 250 mM or less.
[0013]
The plant DNA elution reagent of the present invention contains SDS. The content ratio of SDS can be 0.1 to 10%, preferably about 0.5%, based on the total amount of the plant DNA elution reagent.
[0014]
The plant DNA elution reagent of the present invention contains ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). The content ratio of EDTA in the plant DNA elution reagent of the present invention can be 10 to 50 mM, preferably 20 to 30 mM.
[0015]
The plant DNA elution reagent of the present invention further contains a polyether-based antifoaming agent. Examples of the polyether-based antifoaming agent include a polymer having a polymerized unit such as oxyethylene and oxypropylene or a derivative thereof. Particularly preferably, PE-L (trade name, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) can be used, and its content is 0.8% or more, preferably 0.9% or more, of the total amount of the plant DNA elution reagent. be able to. The upper limit of the content ratio is not particularly limited, but can be about 2.0%.
[0016]
The method for preparing the plant DNA eluting reagent of the present invention is not particularly limited, and it can be prepared by dissolving the above components in water.
[0017]
The method for extracting plant DNA of the present invention includes the step (a) of mixing the above-described plant DNA eluting reagent of the present invention with plant tissue to lyse cells in the plant tissue to obtain a cell lysate.
[0018]
The ratio of addition of the DNA eluting reagent to the plant tissue in the step (a) is not particularly limited, but may be, for example, 50 to 250 μl, or 100 to 200 μl, for 50 mg of plant tissue. Is particularly preferred.
[0019]
The step (a) can be carried out by placing the DNA eluting reagent and the plant tissue in a container such as a suitable tube, further placing crushed spheres and shaking. As the crushed sphere, spherical or distorted spherical beads such as ceramic, tungsten, stainless steel, and zirconia can be used. Although the size of the crushed sphere is not particularly limited, for example, when crushing is performed in a tube having an inner diameter of about 5 mm, one crushed sphere having a diameter of about 4 mm can be inserted.
[0020]
In particular, the step (a) can be carried out by first mixing a part of the DNA eluting reagent to be added with the plant tissue, crushing it with crushing spheres or the like, and then adding the rest of the DNA eluting reagent. Specifically, for example, about 100 μl of the DNA eluting reagent and plant tissue are placed in a container such as a tube, shaken, and then about 100 μl of the DNA eluting reagent can be mixed. As described above, the DNA can be efficiently crushed by a relatively small amount of the elution reagent by a shorter crushing operation without physically cutting the DNA.
[0021]
The extraction method of the present invention includes a step (b) of mixing a nucleic acid adsorption solution containing a chaotropic substance with the cell lysate to obtain a mixed solution. In step (b), the amount of the nucleic acid adsorbing solution to be added is not particularly limited, but may be a ratio of 150 to 250 μl per 50 mg of plant tissue.
[0022]
The nucleic acid adsorption solution, as chaotropic substance, salt of guanidine (thiocyanate, hydrochloride, etc.), as well as SCN ^- and I ^- salts (sodium salt, potassium salt, etc.), and the like. The content ratio of the chaotropic substance in the nucleic acid adsorption solution can be 1M to 20M, preferably 5 to 15M.
[0023]
The nucleic acid adsorption solution may further include a buffer for keeping the pH constant. Examples of the buffer include a sodium acetate buffer and the like.
[0024]
After the step (b) is completed, the obtained liquid mixture is preferably centrifuged once and only the supernatant is taken, and then subjected to the next step.
[0025]
Further, the mixed solution can be subjected to the step (b ′) of passing through a filter for resate separation, if necessary, and then to the next step. The filter for the reseat separation is not particularly limited, and examples thereof include a commercially available resate cleaning filter. The operation of passing the mixed solution through the filter for resate separation is not particularly limited, and can be performed by putting the mixed solution into a normal filter such as one having a well shape having a bottom as a filter, and centrifuging the mixture. .
[0026]
The extraction method of the present invention includes a step (c) of bringing the mixed solution into contact with a nucleic acid-binding carrier to bind DNA to the carrier. The nucleic acid-binding carrier can be usually a solid-phase carrier, and preferably in the form of particles, a filter, a reaction vessel, etc., which can easily contact a cell lysate. The material of the carrier is not particularly limited as long as it can adsorb DNA in the presence of a chaotropic substance, but is not particularly limited as long as it has a nucleic acid adsorbing ability. Preferable examples include those bonded with silica.
[0027]
The operation for carrying out the step (c) is not particularly limited. For example, the operation can be performed by passing the mixed solution that has passed through the separation filter through a filter of a nucleic acid binding carrier as it is.
[0028]
The extraction method of the present invention includes a step (d) of washing the DNA on the nucleic acid binding carrier. The operation for performing the step (d) is not particularly limited. For example, the washing solution is passed through a filter of a nucleic acid-binding carrier to which DNA has been bound by passing the mixed solution at a rate of about 50 to 250 μl per 50 mg of plant tissue. Can be performed. The washing liquid is not particularly limited as long as it can wash other substances from the carrier without promoting the elution of DNA from the solid phase, and is 40 to 80%, preferably about 70% alcohol such as ethanol. An aqueous solution containing
[0029]
The extraction method of the present invention includes a step (e) of separating DNA from the nucleic acid binding carrier. The operation for performing this step can be performed, for example, by passing a separation solution for separating nucleic acids from the nucleic acid-binding carrier through a filter of the nucleic acid-binding carrier, and collecting the passed solution as a DNA solution. As the separation liquid, a buffer having an appropriate pH can be appropriately used. Specific examples include a TE buffer (10 mM Tris-HCl buffer, 1 mM EDTA containing, pH 8.0).
[0030]
The DNA solution obtained in the step (e) can be used as it is as a sample for a PCR template or the like. In particular, the DNA solution obtained in the step (e) has a great feature in that it can be used as a DNA sample having a low RNA contamination ratio without further treatment with RNase. Without being bound by any theory, by performing elution with a specific elution reagent, DNA is efficiently eluted from plant tissue and is selectively captured by a nucleic acid-binding carrier. It seems to be obtained.
[0031]
The plant DNA extraction kit of the present invention includes the DNA elution reagent, a nucleic acid adsorption solution containing the chaotropic substance, and the nucleic acid binding carrier. Further, if necessary, the filter may further include the filter for resate separation, a washing solution for the nucleic acid-binding carrier, a separation solution for separating nucleic acid from the nucleic acid-binding carrier, or a combination of two or more of these. By including these, the plant DNA extraction kit of the present invention can easily carry out the above-described method for extracting plant DNA of the present invention.
[0032]
【The invention's effect】
The plant DNA elution reagent of the present invention, the plant DNA extraction kit of the present invention, and the plant DNA extraction method employ an elution reagent having a specific composition, so that even if RNase is not used, the amount of contaminants is small, and A DNA sample with a small amount can be easily and efficiently extracted.
[0033]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
[0034]
Embodiment 1
A plant DNA elution reagent 1 having a composition shown in Table 1 and a nucleic acid adsorption solution 1 shown in Table 2 were prepared by dissolving each component in distilled water.
[0035]
[Table 1]

[0036]
[Table 2]

[0037]
Embodiment 2
Using the elution reagent 1 and the nucleic acid adsorption solution 1 prepared in Example 1, DNA was extracted from the various plant samples shown in Tables 3 and 4 by the following procedures (a) to (e). .
(A) 50 mg or 100 mg of a plant sample and one zirconia bead (4 mm in diameter) were placed in each tube of Collection Microtubes (manufactured by Qiagen, product number 19560). 200 μl of Elution Reagent 1 was added to each tube, capped with a Collection Microtube Caps (Qiagen, product number 19566), and mixed with a mixer mill (Qiagen, product name MM300, product number 85100) at 30 1 / s. For 1.5 minutes. This stirring was repeated up to four times until the plant sample was completely ground to obtain a cell lysate.
(B) 200 μl of the nucleic acid adsorption solution 1 is added to the cell lysate obtained in the step (a), the mixture is vigorously stirred by hand, and a centrifuge (trade name: CF16RX, manufactured by Hitachi, equipped with a swing bucket rotor T5S32) is used. And centrifuged at 4800 rpm for 10 minutes to obtain a supernatant, which was used as a mixed solution.
(C) A filter for cleaning the lysate (Millipore, trade name MultiScreen NA) is placed on a nucleic acid-binding carrier filter (Millipore, trade name MultiScreen FB) on a centrifuge adapter (Millipore, trade number). MACF 09604) and placed on a flow-through collection plate. 200 μl of the supernatant obtained in (b) was placed on each well of the cleaning filter, centrifuged at 100 rpm for 2 minutes, and the lysate was transferred to the nucleic acid binding carrier filter.
(D) The cleaning filter was removed, 200 μl of a 70% aqueous ethanol solution was added to each well of the nucleic acid-binding carrier filter, and the mixture was centrifuged at 1500 rpm for 2 minutes, and the liquid that passed through the filter was discarded.
(E) 50 μl of TE buffer (pH 8.0) heated to 60 ° C. was added to each well of the nucleic acid binding carrier filter, and the mixture was allowed to stand for 1 minute. The nucleic acid binding carrier filter was attached to a 96-well V-bottom plate using a centrifugal adapter, and centrifuged at 2000 rpm for 1 minute to obtain a plant DNA extract solution in the V-bottom plate.
[0038]
For the obtained plant DNA extract solution, the DNA concentration (μg / ml) was measured, the yield (μg) was obtained, and OD260 / 280, which is an index of nucleic acid purity, was measured. The results are shown in Tables 3 and 4.
[0039]
[Table 3]

[0040]
[Table 4]

[0041]
In addition, 1/5 of the extracted genomic DNA was electrophoresed with 0.8% agarose gel / 0.5 × TBE buffer, stained with ethidium bromide, and photographed. As a result, clear bands with little DNA tailing were observed.
[0042]
Embodiment 3
In the step (a) of Example 2, a plant sample, beads and 100 μl of the elution reagent 1 were added to a tube, and the mixture was repeatedly stirred until the plant sample was completely crushed. Thereafter, 100 μl of the plant sample was added to lyse the cells. The procedure of Example 2 was repeated except that a liquid was obtained, DNA was extracted, the DNA concentration (μg / ml) was measured, the yield (μg) was obtained, and OD260 / 280 was measured. Table 5 shows the results.
[0043]
[Table 5]

[0044]
Embodiment 4
An Arabidopsis thaliana DNA extract obtained in Example 3 was taken so that the DNA amount became 500 ng, and EcoRI was allowed to act on the DNA extract for 2 hours, followed by electrophoresis in the same manner as in Example 2. Furthermore, Southern blotting was performed according to a conventional method. As a result, a single clear band appears on the blotted membrane. And good quality which could be used for Southern analysis.

Claims

A plant DNA eluting reagent comprising a solution buffered to pH 7 to 9, and comprising SDS, ethylenediaminetetraacetic acid, and a polyether-based antifoaming agent.

(A) mixing the plant DNA eluting reagent according to claim 1 with a plant tissue to lyse cells in the plant tissue to obtain a cell lysate;
Mixing (b) a nucleic acid adsorption solution containing a chaotropic substance with the cell lysis solution to obtain a mixed solution;
Contacting the mixture with a nucleic acid binding carrier to bind DNA to the carrier (c);
Washing the DNA on the nucleic acid binding carrier (d);
(E) separating the DNA from the nucleic acid binding carrier.

A plant DNA extraction kit comprising the DNA elution reagent according to claim 1, a nucleic acid adsorption solution containing a chaotropic substance, and a nucleic acid-binding carrier.

The nucleic acid adsorption solution, wherein the guanidine as a chaotropic substance, SCN ^- and I ^- include chaotropic substance selected from the group consisting of salt, the nucleic acid-binding carrier, and characterized in that it comprises silica as nucleic acid binding substance The plant DNA extraction kit according to claim 2,

5. The plant DNA extraction kit according to claim 4, further comprising a filter for separating lysate, a washing solution for the nucleic acid-binding carrier, a separating solution for separating nucleic acid from the nucleic acid-binding carrier, or a combination of two or more thereof.