JP2004290003A

JP2004290003A - System for producing polygalacturonase by escherichia coli

Info

Publication number: JP2004290003A
Application number: JP2003082871A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Fukuda; 央福田; Shigeaki Mikami; 重明三上
Original assignee: National Research Institute of Brewing
Current assignee: National Research Institute of Brewing
Priority date: 2003-03-25
Filing date: 2003-03-25
Publication date: 2004-10-21
Anticipated expiration: 2023-03-25
Also published as: JP3757281B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To produce a polygalacturonase having an activity at a low cost by culturing the resultant transformant (e.g. FERM P-19207 or FERM P-19208). <P>SOLUTION: The transformant is obtained as follows. A polygalacturonase gene derived from Saccharomyces cerevisiae X2180A is ligated to an Escherichia coli expression vector (e.g. pQE80L) and the resultant transformant is then transferred into a strain of Escherichia coli (e.g. an Origami B strain) without an activity of a thioredoxin reductase (trxB) and a glutathione reductase (gor). <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリガラクツロナーゼ（ｐｏｌｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅ）の大腸菌による生産システムに関するものであって、ポリガラクツロナーゼ、対応するＤＮＡ配列、ベクター、形質転換された宿主、ポリガラクツロナーゼの製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
既に酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株のポリガラクツロナーゼ遺伝子はクローン化され遺伝子配列も判明している。しかし、これらの遺伝子配列にコードされているアミノ酸配列は、ポリガラクツロナーゼ活性を示さないことが報告されている。活性を有するポリガラクツロナーゼを生産する特殊な酵母とのＤＮＡの比較による研究から、酵母ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＳ２８８Ｃ株をはじめとする多くの酵母が活性を有するポリガラクツロナーゼを生産しない理由として、ポリガラクツロナーゼのアミノ酸配列が３ヶ所異なるためであると報告されている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
更に、ポリガラクツロナーゼ遣伝子配列を酵母に活性をもつポリガラクツロナーゼタンパク質の生産に成功した例は報告されているが、大腸菌に導入し、大腸菌に活性をもつポリガラクツロナーゼタンパク質の生産に成功した例は報告されていない。商品化されているポリガラクツロナーゼは、多くの場合、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属やＲｈｉｚｏｐｕｓ属から精製されたものであり、異なる宿主を用いて生産されたポリガラクツロナーゼは商品化されていない。
【０００４】
異なる宿主を用いたペクチン関連物質分解酵素の生産には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属が用いられている。例えば、Ｅｒｗｉｎｉａ属のポリガラクツロナーゼをＢａｃｉｌｌｕｓ属に生産させ（例えば、特許文献１参照）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属のペクチン酸リアーゼをＢａｃｉｌｌｕｓ属及び大腸菌で生産させ（例えば、特許文献２参照）、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属のポリメチルガラクツロナーゼをＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに生産させたことが（例えば、特許文献３参照）、それぞれ報告されている。
【０００５】
大腸菌は、研究された生物種であり、遭伝子工学の手法によく用いられているため、遣伝子のクローニング、タンパク質の発現に最も好ましい系のひとつである。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、タンパク質の発現に適した宿主であるが、原核生物より増殖が遅い、培地が高い、発現するタンパク量が少ないなどの欠点がある。Ｂａｃｉｌｌｕｓ属は、培地中にタンパク質を分泌する能力は高いものの、同時に培地中に目的タンパク質以外のものも分泌するなどの欠点があり、遺伝子操作、タンパク質発現の各種の技術も、大腸菌の系ほど発達していない。
【０００６】
特定のタンバク質生産のためには、遺伝子工学の技術を用いて適当な宿主に生産させることが一般的である。各種の宿主がそのために開発されているが、大腸菌はコスト面において最も優れた宿主の一つである。多くの場合には大腸菌のタンパク質生産システムの利用が試みられるが、実際のタンパク質生産の目的を達成できないことがある。ポリガラクツロナーゼもそのようなタンパク質の一つである。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｇｏｇｎｉｅｓ，Ｓ．，Ｇａｉｎｖｏｒｓ，Ａ．，Ａｉｇｌｅ．Ｍ．ａｎｄＢｅｌａｒｇｉ．Ａ．（１９９９）、Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＥｎｄｏｐｏｌｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅ−ＥｎｃｏｄｉｎｇＧｅｎｅ（ＰＧＬ１）：Ｙｅａｓｔ，１５，１１−１２。
【０００８】
【特許文献１】
特表平５−５００３０９号公報
【０００９】
【特許文献２】
特開２０００−２６２２９２号公報
【００１０】
【特許文献３】
特開平１０−３１３８５８号公報
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
ペクチンは、高等植物の細胞間物質の主要な構成成分であり、広範かつ大量に天然に存在する物質である。ポリガラクツロナーゼは、果汁の清澄化・ろ過性改善、収量向上、野菜果実のピューレ製造、ワインのろ過向上剤、又生化学用の商品として販売されている。またセルロース精製法にも利用方法が提案されている（特開平６−２２０７７２）など、その安価な製造、各種ポリガラクツロナーゼのコレクション数の増加は、食品工業界・生化学試薬業界・製紙業界において、重要な課題である。
【００１２】
市販されているポリガラクツロナーゼは、他の必要でない酵素も混入しており、高い純度のものは、生化学用の試薬として入手できるものの高価である。安価なポリガラクツロナーゼの製造は、食品工業界において重要な課題であり、更に高い純度を達成することは、生化学試薬業界にとって重要な課題である。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ポリガラクツロナーゼ遺伝子を大腸菌で発現せしめる条件について各種試験、検討した結果、該遺伝子を組み込むための大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）発現ベクター、及び、得られた組換えベクターを用いて形質転換する宿主の重要性に着目した。そして、更に鋭意研究の結果、既に活性がないと報告されている酵母のポリガラクツロナーゼ遺伝子（配列番号２：図３、図４）から活性を有するポリガラクツロナーゼタンパク質を生産させることに成功した。
【００１４】
活性を有するポリガラクツロナーゼを大腸菌に生産させる場合、宿主として用いられる大腸菌は、チオレドキシンレダクターゼ（ｔｒｘＢ）とグルタチオンレダクターゼ（ｇｏｒ）の活性のない株が適している（例えば、ＯｒｉｇａｍｉＢ（Ｎｏｖａｇｅｎ（株））。また、ベクターとしては発現が制御できる機能を有していることが好ましい。大腸菌発現ベクターとしては、例えばプラスミドｐＱＥ８０Ｌ（Ｑｉａｇｅｎ社）が好適例として挙げられ、そのＳｐｈＩ―ＨｉｎｄＩＩＩサイトに上記ポリガラクツロナーゼ遺伝子の構造遺伝子、それを含有するＤＮＡ断片、又は構造遺伝子のＤＮＡ断片等を挿入、連結し、得られた組換えベクターを宿主に導入すればよい。
【００１５】
これにより、従来より安価にポリガラクツロナーゼタンパク質を得ることが可能となる。
【００１６】
生産されたポリガラクツロナーゼは、３．５〜５．０の至適ｐＨ、及び３０〜５０℃の間の至適温度を示した。その分子量は３５〜４０ｋｄａであり、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列（部分アミノ酸配列）を含むものであった。
【００１７】
また、配列番号１（図１、２）に示す部分アミノ酸配列で２９３番目のアミノ酸セリン（Ｓ）がグリシンに置換されたアミノ酸配列（配列番号３）を含むポリガラクツロナーゼをコードする遺伝子を、上記と同様に大腸菌に生産させたところ、３．６〜６．０の至適ｐＨ、及び３０〜５５℃の間の至適温度を示し、分子量３５〜４０ｋｄａのポリガラクツロナーゼ（そのアミノ酸配列を配列番号３に示す）を得ることも可能となった。なお、前者のポリガラクツロナーゼを同Ｗ、後者のポリガラクツロナーゼを同２９３ということもある。
【００１８】
したがって本発明は、配列番号１に示す部分アミノ酸配列を含むポリガラクツロナーゼＷ、及び／又は配列番号１に示す部分アミノ酸配列で２９３番目のアミノ酸Ｓｅｒ（図２において囲まれたＳ）がＧｌｙに置換されたアミノ酸配列（配列番号３）を含むポリガラクツロナーゼ２９３を安価に提供するものである。
【００１９】
また、本発明は、これらのポリガラクツロナーゼタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡも新たに構築し、これらを提供するものであって、配列番号１、３のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡは、その塩基配列を配列番号２（図３、図４）及び配列番号４にそれぞれ示した。なお、配列番号４は、配列番号２において、８７７番目の塩基アデニン（図４において囲まれたＡ）をグアニンに置換したものである。
【００２０】
本発明に係るポリガラクツロナーゼ遺伝子は、配列番号１、３のアミノ酸配列で示される酵素タンパク質をコードする遺伝子（ポリガラクツロナーゼ構造遺伝子）のほか、該アミノ酸配列を部分配列として含むタンパク質、１又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有し且つ該酵素活性を有するタンパク質等をコードする遺伝子も広く包含するものであるので、配列番号２、４に示す塩基配列を有するＤＮＡのほか、上記した各種タンパク質に対応する塩基配列を有するＤＮＡ断片も包含される。したがって、本発明に係るポリガラクツロナーゼをコードする遺伝子のＤＮＡは、ポリガラクツロナーゼをコードする遺伝子のＤＮＡ構築物ということもあり、例えば、配列番号１又は３に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物であって、約３５ｋｄａの分子量（ＳＤＳ電気泳動法による）を有するポリガラクツロナーゼをコードする遺伝子のＤＮＡ構築物も本発明に包含されるものである。
【００２１】
このようにして得たＤＮＡ又はＤＮＡ構築物は、常法にしたがって、大腸菌発現ベクターに連結し（例えば、プラスミドｐＱＥ８０Ｌ等のＳｐｈＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトに連結し）、得られた組換えベクターを大腸菌宿主に導入して形質転換して、形質転換体を得、これを培養し、培養物を回収することにより、ポリガラクツロナーゼを得ることができる。本発明で製造されたポリガラクツロナーゼは、活性型であるので、ポリガラクツロン酸を分解することができる。
【００２２】
本発明にしたがい、ポリガラクツロナーゼＷを宿主大腸菌ＯｒｉｇａｍｉＢ株に導入した形質転換体はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＯｒｉｇａｍｉＢ・Ｗと命名して、Ｗの記号表示にて独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭＰ−１９２０７として寄託し、またポリガラクツロナーゼ２９３を導入した形質転換体は、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＯｒｉｇａｍｉＢ・２９３と命名し、２９３の記号表示にて同センターにＦＥＲＭＰ−１９２０８として寄託した。
【００２３】
【発明の実施の形態】
上記したように、本発明を実施するには、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する実験室酵母Ｘ２１８０Ａよりポリガラクツロナーゼ遺伝子を得、これを大腸菌発現ベクターにタンパク質発現するように連結する。このポリガラクツロナーゼ発現が可能となった組み換えＤＮＡを大腸菌に形質転換し、大腸菌に生産させる。使用する大腸菌発現ベクターに、特異的アフィニティーカラムに吸着するアミノ酸配列がポリガラクツロナーゼタンパク質に融合可能なものを使用することで、大腸菌で生産させたポリガラクツロナーゼタンパク質を容易に精製できる。
以下、本発明の実施例について述べる。
【００２４】
【実施例１】
（ポリガラクツロナーゼ遺伝子の発現系の構成（１））
サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属するＸ２１８０ＡよりＧｅｎとる君（宝酒造）を用いてゲノムＤＮＡを精製する。このゲノムＤＮＡをｐｒｉｍｅｒ１（配列番号５：図５）とｐｒｉｍｅｒ２（配列番号６：図６）を用いてＰＣＲ法にて増幅する。
【００２５】
（ＰＣＲ条件）
９５℃ １分
５９℃ １分
７２℃ １．５分
サイクル数２５回
【００２６】
増幅したＤＮＡ断片（ポリガラクツロナーゼ構造遺伝子：配列番号２）を制限酵素ＳｐｈＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同様に制限酵素ＳｐｈＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＱＥ８０Ｌ（Ｑｉａｇｅｎ（株））に連結する。ポリガラクツロナーゼ構造遺伝子を含むｐＱＥ８０Ｌ（組換えベクターｐＱＥ８０Ｌ／Ｗ）を、ＯｒｉｇａｍｉＢ（Ｎｏｖａｇｅｎ（株））に導入する。形質転換されたＯｒｉｇａｍｉＢ：形質転換体ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＯｒｉｇａｍｉＢ・Ｗ（Ｗ：ＦＥＲＭＰ−１９２０７）をＬ−ｂｒｏｔｈに接種し、増幅させた後、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭとなるように添加し、タンパク生産のための培養を続ける。その後、遠心集菌し、ＢａｇＢａｓｔｅｒｐｒｏｔｅｉｎｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ（株））でタンパク質を抽出し、Ｎｉ−ＮＴＡＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎｓ（Ｑｉａｇｅｎ（株））を用いて精製を行い、下記表１の至適ｐＨ及び温度を有するポリガラクツロナーゼＷを得た。
【００２７】

【００２８】
【実施例２】
（ポリガラクツロナーゼ遺伝子の発現系の構成（２））
上記実施例と同様にして、ただし、ポリガラクツロナーゼ遺伝子として配列番号４に示す塩基配列を有するＤＮＡ、組換えベクターｐＱＥ８０Ｌ／２９３を用い、そして形質転換体、ＥｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＯｒｉｇａｍｉＢ・２９３（２９３：ＦＥＲＭＰ−１９２０８）を用いて、アミノ酸配列の２９３番目のセリンがグリシンに置換されたアミノ酸配列（配列番号３）を有するポリガラクツロナーゼ２９３を得た。その至適ｐＨ及び至適温度を下記表２に示す。
【００２９】

【００３０】
【発明の効果】
酵母等天然に存在するポリガラクツロナーゼ遺伝子をそのまま通常の大腸菌に導入しても発現しなかったのであるが、本発明によってはじめて、ポリガラクツロナーゼの大腸菌（ＯｒｉｇａｍｉＢ）による生産が可能となり、活性を有するポリガラクツロナーゼを低コストで大量に生産することが可能となった。
【００３１】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】Ｘ２１８０のポリガラクツロナーゼのアミノ酸配列を示す。アンダーラインはプライマー１、２に相当する部分（クローニング用に導入された制限酵素部位は除く）を示す。
【図２】同上続きを示す。囲まれた文字は２９３番目のセリン（Ｓ）を示す。
【図３】Ｘ２１８０のポリガラクツロナーゼ遺伝子の塩基配列を示す。アンダーラインはプライマー１、２に相当する部分（クローニング用に導入された制限酵素部位は除く）を示す。
【図４】同上続きを示す。囲まれた文字は、８７７番目のアデニンを示し、これをグアニンにかえることによってアミノ酸配列の２９３番目のセリンはグリシンに置き換わる。
【図５】プライマー１を示す。
【図６】プライマー２を示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a polygalacturonase production system using Escherichia coli, which relates to a polygalacturonase, a corresponding DNA sequence, a vector, a transformed host, and a method for producing a polygalacturonase. is there.
[0002]
[Prior art]
The polygalacturonase gene of the yeast Saccharomyces cerevisiae strain has already been cloned and its gene sequence has been determined. However, it has been reported that the amino acid sequences encoded by these gene sequences do not show polygalacturonase activity. A study by comparison of DNA with a special yeast producing an active polygalacturonase shows that many yeasts including the yeast Saccharomyces cerevisiae S288C do not produce an active polygalacturonase. It is reported that the amino acid sequence of the enzyme differs at three positions (for example, see Non-Patent Document 1).
[0003]
Furthermore, there has been reported an example in which a polygalacturonase gene sequence was successfully produced in a polygalacturonase protein having yeast activity. No successful cases have been reported. Commercially available polygalacturonase is often purified from the genus Aspergillus or Rhizopus, and polygalacturonase produced using different hosts has not been commercialized.
[0004]
For the production of pectin-related substance-degrading enzymes using different hosts, Saccharomyces, Aspergillus and Bacillus are used. For example, a polygalacturonase of the genus Erwinia is produced by the genus Bacillus (for example, see Patent Document 1), a pectate lyase of the genus Bacillus is produced by the genus Bacillus and Escherichia coli (for example, see Patent Document 2), It has been reported that Saccharomyces cerevisiae produced polymethylgalacturonase (for example, see Patent Document 3).
[0005]
Escherichia coli is one of the most preferable systems for gene cloning and protein expression because Escherichia coli is a studied species and is often used in gene engineering techniques. Saccharomyces cerevisiae is a suitable host for protein expression, but has drawbacks such as slower growth than prokaryotes, higher media, and less expressed protein. Although the genus Bacillus has a high ability to secrete proteins into the medium, it also has the disadvantage of secreting other than the target protein into the medium at the same time. I haven't.
[0006]
For the production of a specific protein, it is common to produce the protein in an appropriate host using genetic engineering techniques. Various hosts have been developed for this purpose, but E. coli is one of the best hosts in terms of cost. In many cases, the use of Escherichia coli protein production systems is attempted, but the objective of actual protein production may not be achieved. Polygalacturonase is one such protein.
[0007]
[Non-patent document 1]
Gognies, S.M. , Gainvors, A .; Aigle. M. and Belargi. A. (1999), Cloning, sequence analysis and overexpression of a Saccharomyces cerevisiae Endopolygalacturonase-Encoding Gene (PGL1): Yeast, 15, 11-12.
[0008]
[Patent Document 1]
Japanese Patent Publication No. 5-500309
[Patent Document 2]
JP 2000-262292 A
[Patent Document 3]
JP-A-10-313858
[Problems to be solved by the invention]
Pectin is a major constituent of higher plant intercellular matter and is a naturally occurring substance in a wide range and in large quantities. Polygalacturonase is sold as a clarifying / improving filterability of fruit juice, improving yield, producing puree of vegetable fruits, a filter improver for wine, and a product for biochemistry. In addition, an inexpensive production method and an increase in the number of collections of various polygalacturonases, such as a method of using a cellulose purification method (Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-220772), are increasing in the food industry, biochemical reagent industry, and paper industry. Is an important issue.
[0012]
Commercially available polygalacturonase is contaminated with other unnecessary enzymes, and those with high purity are available as reagents for biochemistry, but are expensive. The production of inexpensive polygalacturonase is an important issue in the food industry, and achieving even higher purity is an important issue for the biochemical reagent industry.
[0013]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted various tests and examinations on the conditions for expressing the polygalacturonase gene in Escherichia coli, and as a result, using the Escherichia coli expression vector for incorporating the gene and the obtained recombinant vector We focused on the importance of the transformed host. Further, as a result of further intensive research, the inventors succeeded in producing an active polygalacturonase protein from the yeast polygalacturonase gene (SEQ ID NO: 2; FIGS. 3 and 4), which has already been reported to have no activity. did.
[0014]
When E. coli produces an active polygalacturonase, E. coli used as a host is preferably a strain having no activity of thioredoxin reductase (trxB) and glutathione reductase (gor) (for example, OrigamiB (Novagen)). The vector preferably has a function capable of controlling the expression, and the E. coli expression vector is, for example, a plasmid pQE80L (Qiagen) as a preferred example, and the above-mentioned polygallate is added to its SphI-HindIII site. A structural gene of a cutronase gene, a DNA fragment containing the same, or a DNA fragment of the structural gene may be inserted and ligated, and the resulting recombinant vector may be introduced into a host.
[0015]
This makes it possible to obtain a polygalacturonase protein at a lower cost than before.
[0016]
The produced polygalacturonase showed an optimal pH of 3.5-5.0 and an optimal temperature between 30-50 ° C. Its molecular weight was 35 to 40 kda, and it contained the amino acid sequence (partial amino acid sequence) shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
[0017]
Further, a gene encoding a polygalacturonase containing an amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) in which the 293th amino acid serine (S) in the partial amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (FIGS. 1 and 2) is substituted with glycine, When produced by Escherichia coli in the same manner as above, it showed an optimum pH of 3.6 to 6.0 and an optimum temperature of 30 to 55 ° C, and a polygalacturonase having a molecular weight of 35 to 40 kda (the amino acid sequence thereof). Is shown in SEQ ID NO: 3). The former polygalacturonase may be referred to as W, and the latter polygalacturonase may be referred to as 293.
[0018]
Therefore, the present invention relates to polygalacturonase W containing the partial amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and / or the amino acid Ser at position 293 (S enclosed in FIG. 2) in the partial amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 to Gly. Polygalacturonase 293 containing the substituted amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) is provided at low cost.
[0019]
Further, the present invention also newly constructs and provides DNAs of the genes encoding these polygalacturonase proteins, and provides the DNAs of the genes encoding the proteins having the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 1 and 3. The nucleotide sequence of the DNA is shown in SEQ ID NO: 2 (FIGS. 3 and 4) and SEQ ID NO: 4, respectively. In addition, SEQ ID NO: 4 is obtained by replacing 877th base adenine (A enclosed in FIG. 4) with guanine in SEQ ID NO: 2.
[0020]
The polygalacturonase gene according to the present invention includes a gene (polygalacturonase structural gene) encoding the enzyme protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NOS: 1 and 3, and a protein containing the amino acid sequence as a partial sequence, Or a gene having an amino acid sequence in which a plurality of amino acid residues are substituted, deleted, added or inserted, and widely encompasses a gene encoding a protein or the like having the enzymatic activity. In addition to DNA having a base sequence, DNA fragments having base sequences corresponding to the various proteins described above are also included. Therefore, the DNA of the gene encoding polygalacturonase according to the present invention may be referred to as a DNA construct of the gene encoding polygalacturonase. For example, a gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 3 may be used. A DNA construct comprising a gene encoding polygalacturonase having a molecular weight of about 35 kda (by SDS electrophoresis) is also encompassed by the present invention.
[0021]
The DNA or DNA construct thus obtained is ligated to an Escherichia coli expression vector (for example, ligated to the SphI-HindIII site of plasmid pQE80L or the like) according to a conventional method, and the obtained recombinant vector is introduced into an Escherichia coli host. Then, a transformant is obtained to obtain a transformant, which is cultured, and the culture is collected to obtain polygalacturonase. Since the polygalacturonase produced in the present invention is in an active form, it can degrade polygalacturonic acid.
[0022]
According to the present invention, a transformant in which polygalacturonase W has been introduced into the host Escherichia coli Origami B strain is named Escherichia coli Origami BW, and is referred to by the symbol W as an independent administrative corporation. A transformant into which the polygalacturonase 293 was introduced was deposited with the center as FERM P-19207, and was named Escherichia coli Origami B.293, and deposited with the center under the symbol 293 as FERM P-19208. .
[0023]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
As described above, in order to carry out the present invention, a polygalacturonase gene is obtained from a laboratory yeast X2180A belonging to the genus Saccharomyces cerevisiae and ligated to an Escherichia coli expression vector so as to express the protein. . Escherichia coli is transformed with the recombinant DNA capable of expressing the polygalacturonase and produced by Escherichia coli. By using an Escherichia coli expression vector whose amino acid sequence adsorbed on the specific affinity column can be fused to the polygalacturonase protein, the polygalacturonase protein produced in Escherichia coli can be easily purified.
Hereinafter, examples of the present invention will be described.
[0024]
Embodiment 1
(Configuration of polygalacturonase gene expression system (1))
Genomic DNA is purified from X2180A belonging to the genus Saccharomyces (Saccharomyces) cerevisiae by using Gento (Takara Shuzo). This genomic DNA is amplified by PCR using primer 1 (SEQ ID NO: 5: FIG. 5) and primer 2 (SEQ ID NO: 6: FIG. 6).
[0025]
(PCR conditions)
95 ° C for 1 minute 59 ° C for 1 minute 72 ° C for 1.5 minutes Number of cycles 25 times
The amplified DNA fragment (polygalacturonase structural gene: SEQ ID NO: 2) is digested with restriction enzymes SphI and HindIII, and ligated to pQE80L (Qiagen Co.) similarly digested with restriction enzymes SphI and HindIII. PQE80L containing the polygalacturonase structural gene (recombinant vector pQE80L / W) is introduced into OrigamiB (Novagen). Transformed Origami B: Transformant Escherichia coli Origami WW (W: FERM P-19207) was inoculated into L-broth, amplified, and then IPTG was added to a final concentration of 1 mM to produce protein. Continue culturing for. Thereafter, the cells are collected by centrifugation, proteins are extracted with BagBase protein extraction reagent (Novagen Co., Ltd.), and purified using Ni-NTA Spin Columns (Qiagen Co., Ltd.). Polygalacturonase W having the following formula was obtained.
[0027]

[0028]
Embodiment 2
(Configuration of polygalacturonase gene expression system (2))
In the same manner as in the above example, except that a DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 as the polygalacturonase gene and the recombinant vector pQE80L / 293 were used, and a transformant, Echerichia coli Origami B • 293 (293: Using FERM P-19208), polygalacturonase 293 having an amino acid sequence in which serine at position 293 of the amino acid sequence was substituted with glycine (SEQ ID NO: 3) was obtained. The optimum pH and optimum temperature are shown in Table 2 below.
[0029]

[0030]
【The invention's effect】
Although a polygalacturonase gene naturally occurring in yeast or the like was not expressed when introduced directly into ordinary Escherichia coli, production of polygalacturonase by Escherichia coli (Origami B) became possible for the first time according to the present invention. It has become possible to mass-produce polygalacturonase having activity at low cost.
[0031]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the amino acid sequence of X2180 polygalacturonase. Underlines indicate portions corresponding to primers 1 and 2 (excluding restriction enzyme sites introduced for cloning).
FIG. 2 shows a continuation of the above. The enclosed characters indicate the 293th serine (S).
FIG. 3 shows the nucleotide sequence of the polygalacturonase gene of X2180. Underlines indicate portions corresponding to primers 1 and 2 (excluding restriction enzyme sites introduced for cloning).
FIG. 4 shows a continuation of the above. The enclosed characters indicate adenine at position 877, and by replacing it with guanine, serine 293 in the amino acid sequence is replaced with glycine.
FIG. 5 shows Primer 1.
FIG. 6 shows Primer 2.

Claims

A polygalacturonase comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.

The polygalacturonase according to claim 1, wherein the polygalacturonase has a molecular weight of 35 to 40 kda and exhibits an optimum pH of 3.5 to 5.0 and an optimum temperature of 30 to 50C. Galacturonase.

A DNA of a gene encoding the polygalacturonase according to claim 1 or 2.

The DNA of the gene according to claim 3, which is a DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2.

A polygalacturonase comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in which the 293th amino acid serine is substituted with glycine.

The polygalacturonase according to claim 5, wherein the polygalacturonase has a molecular weight of 35 to 40 kda and exhibits an optimum pH of 3.5 to 6.0 and an optimum temperature of 30 to 55C. Galacturonase.

A DNA of a gene encoding the polygalacturonase according to claim 5.

The DNA of the gene according to claim 7, which is a DNA having a nucleotide sequence in which the 877th nucleotide, adenine, in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 has been substituted with guanine.

A recombinant vector containing the DNA according to at least one of claims 3 and 4, or at least one of claims 7 and 8.

A transformant obtained by transforming Escherichia coli having no thioredoxin reductase and glutathione reductase activities using the recombinant vector according to claim 9.

Transformant, Escherichia coli Origami BW (FERM P-19207).

Transformant, Escherichia coli Origami B.293 (FERM P-19208).

A method for producing a polygalacturonase, comprising using the transformant according to claim 10.

A polygalacturonase according to any one of claims 1, 2, 5, and 6, or a polygalacturonase obtained by the production method according to claim 13. Acid decomposition method.