JP2004285041A - Agent for regulating secretion of adrenocortical hormone - Google Patents

Agent for regulating secretion of adrenocortical hormone Download PDF

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昌司 福住
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain an agent for regulating the secretion of adrenocortical hormones, and containing a new secretory protein bondable to AQ27 receptor or a polynucleotide encoding the protein. <P>SOLUTION: The secretory protein containing an amino acid sequence same as or essentially same as the amino acid sequence of the sequence number 1, its partial peptide or its salt has an action to regulate the secretion of adrenocortical hormones. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

本発明は、ＡＱ２７受容体に結合しうる新規な分泌蛋白質またはそれをコードするポリヌクレオチドを含有する副腎皮質ホルモン分泌調節剤などに関する。   The present invention relates to a novel secretory protein capable of binding to the AQ27 receptor or a corticosteroid secretion regulator containing a polynucleotide encoding the same.

近年、ヒトゲノムＤＮＡあるいは各種ヒト組織由来のｃＤＮＡのランダムな配列決定による配列情報の蓄積および遺伝子解析技術の急速な進歩によってヒトの遺伝子が加速度的に解明されてきている。それにともない、機能未知の蛋白質をコードすると予想される多くの遺伝子の存在が明らかになっている。
オーファンＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質であるＡＱ２７受容体およびそのＤＮＡが報告されている（特許文献１）。 In recent years, the accumulation of sequence information by random sequencing of human genomic DNA or cDNA derived from various human tissues, and rapid advances in gene analysis techniques have led to the rapid elucidation of human genes. Along with that, the existence of many genes predicted to encode proteins of unknown function has been revealed.
An AQ27 receptor which is an orphan G protein-coupled receptor protein and its DNA have been reported (Patent Document 1).

ＷＯ０１／１６３１３号WO01 / 16313 No.

本発明は、ＡＱ２７受容体およびそれに結合しうる新規な分泌蛋白質の新規な用途、すなわち副腎皮質ホルモン分泌調節剤などとしての用途を提供する。   The present invention provides a novel use of the AQ27 receptor and a novel secretory protein capable of binding thereto, that is, a use as a regulator of adrenocortical hormone secretion.

本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ヒト全脳等から分泌シグナルを含む新規なペプチドをコードする４種類のＤＮＡを取得することに成功し、このＤＮＡに分泌ペプチドがコードされていることを見い出した。さらに、本発明者らは、これらの分泌ペプチドが予想外にもＡＱ２７受容体に結合すること、副腎皮質ホルモン分泌促進作用を示すことを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。   The present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems, and as a result, succeeded in obtaining four types of DNAs encoding novel peptides containing secretory signals from the whole human brain and the like. Was found to encode a secretory peptide. Furthermore, the present inventors have found that these secretory peptides unexpectedly bind to the AQ27 receptor and show an action of promoting secretion of corticosteroids. The present inventors have further studied based on these findings, and have completed the present invention.

すなわち、本発明は、
〔１〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調節剤、
〔２〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列が配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列である第〔１〕記載の剤、
〔３〕部分ペプチドが、
（１）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第８０番目〜８８番目のアミノ酸配列または第１２７番目〜１３３番目のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチド、
（２）配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第１１６番目〜１２２番目のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチド、
（３）配列番号：５で表わされるアミノ酸配列の第１１６番目〜１２２番目のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチド、または
（４）配列番号：７で表わされるアミノ酸配列の第１２５番目〜１３１番目のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドである第〔１〕記載の剤、
〔４〕部分ペプチドが、
（１）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第９０番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第９１番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第９３番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１０４番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１０８番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１０９番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１１１番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１１５番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１１９番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１２４番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１２６番目〜１３３番目または第１２７番目〜１３３番目のアミノ酸配列からなるペプチド、
（２）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第９１番目〜１３３番目のアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端のグルタミン残基（Ｇｌｎ）がピログルタミン化されているペプチド、または
（３）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第９０番目〜１３３番目のアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端のアルギニン残基（Ａｒｇ）がチロシン残基（Ｔｙｒ）に置換されているペプチドである第〔１〕記載の剤、
〔５〕副腎皮質ホルモン分泌促進剤である第〔１〕記載の剤、
〔６〕低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛みまたは肥満の予防・治療剤である第〔５〕記載の剤、
〔７〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調節剤、
〔８〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列が配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列である第〔７〕記載の剤、
〔９〕部分ペプチドが、
（１）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第８０番目〜８８番目のアミノ酸配列または第１２７番目〜１３３番目のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチド、
（２）配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第１１６番目〜１２２番目のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチド、
（３）配列番号：５で表わされるアミノ酸配列の第１１６番目〜１２２番目のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチド、または
（４）配列番号：７で表わされるアミノ酸配列の第１２５番目〜１３１番目のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドである第〔７〕記載の剤、
〔１０〕部分ペプチドが
（１）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第９０番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第９１番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第９３番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１０４番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１０８番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１０９番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１１１番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１１５番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１１９番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１２４番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１２６番目〜１３３番目または第１２７番目〜１３３番目のアミノ酸配列からなるペプチド、
（２）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第９１番目〜１３３番目のアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端のグルタミン残基（Ｇｌｎ）がピログルタミン化されているペプチド、または
（３）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第９０番目〜１３３番目のアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端のアルギニン残基（Ａｒｇ）がチロシン残基（Ｔｙｒ）に置換されているペプチドである第〔７〕記載の剤、
〔１１〕副腎皮質ホルモン分泌促進剤である第〔７〕記載の剤、
〔１２〕低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛みまたは肥満の予防・治療剤である第〔１１〕記載の剤、
〔１３〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有してなる低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛み、肥満、クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の診断剤、
〔１４〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調節剤、
〔１５〕副腎皮質ホルモン分泌阻害剤である第〔１４〕記載の剤、
〔１６〕クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の予防・治療剤である第〔１５〕記載の剤、
〔１７〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体を含有してなる低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛み、肥満、クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の診断剤、
〔１８〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調節剤、
〔１９〕副腎皮質ホルモン分泌阻害剤である第〔１８〕記載の剤、
〔２０〕クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の予防・治療剤である第〔１９〕記載の剤、
〔２１〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛み、肥満、クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の診断剤、
〔２２〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の機能を促進または阻害する化合物またはその塩を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調節剤、
〔２３〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の機能を促進する化合物またはその塩を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌促進剤、
〔２４〕低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛みまたは肥満の予防・治療剤である第〔２３〕記載の剤、
〔２５〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の機能を阻害する化合物またはその塩を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌阻害剤、
〔２６〕クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の予防・治療剤である第〔２５〕記載の剤、
〔２７〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の発現を促進または阻害する化合物またはその塩を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調節剤、
〔２８〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の発現を促進する化合物またはその塩を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌促進剤、
〔２９〕低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛みまたは肥満の予防・治療剤である第〔２８〕記載の剤、
〔３０〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の発現を阻害する化合物またはその塩を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌阻害剤、
〔３１〕クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の予防・治療剤である第〔３０〕記載の剤、
〔３２〕配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調節剤、
〔３３〕副腎皮質ホルモン分泌促進剤である第〔３２〕記載の剤、
〔３４〕低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛みまたは肥満の予防・治療剤である第〔３３〕記載の剤、
〔３５〕配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調節剤、
〔３６〕副腎皮質ホルモン分泌促進剤である第〔３５〕記載の剤、
〔３７〕低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛みまたは肥満の予防・治療剤である第〔３６〕記載の剤、
〔３８〕配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有してなる低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛み、肥満、クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の診断剤、
〔３９〕配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調節剤、
〔４０〕副腎皮質ホルモン分泌阻害剤である第〔３９〕記載の剤、
〔４１〕クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の予防・治療剤である第〔４０〕記載の剤、
〔４２〕配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛み、肥満、クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の診断剤、
〔４３〕配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調節剤、
〔４４〕副腎皮質ホルモン分泌阻害剤である第〔４３〕記載の剤、
〔４５〕クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の予防・治療剤である第〔４４〕記載の剤、
〔４６〕配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛み、肥満、クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の診断剤、
〔４７〕配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩の機能を促進または阻害する化合物またはその塩を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調節剤、
〔４８〕配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩の機能を促進する化合物またはその塩を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌促進剤、
〔４９〕低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛みまたは肥満の予防・治療剤である第〔４８〕記載の剤、
〔５０〕配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する化合物またはその塩を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌阻害剤、
〔５１〕クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の予防・治療剤である第〔５０〕記載の剤、
〔５２〕配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩の発現を促進または阻害する化合物またはその塩を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調節剤、
〔５３〕配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩の発現を促進する化合物またはその塩を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌促進剤、
〔５４〕低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛みまたは肥満の予防・治療剤である第〔５３〕記載の剤、
〔５５〕配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩の発現を阻害する化合物またはその塩を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌阻害剤、
〔５６〕クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の予防・治療剤である第〔５５〕記載の剤、
〔５７〕（１）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩と（２）配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調節剤、
〔５８〕配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩に対するアゴニストを含有してなる副腎皮質ホルモン分泌促進剤、
〔５９〕低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛みまたは肥満の予防・治療剤である第〔５８〕記載の剤、
〔６０〕配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩に対するアンタゴニストを含有してなる副腎皮質ホルモン分泌阻害剤、
〔６１〕クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の予防・治療剤である第〔６０〕記載の剤、
〔６２〕哺乳動物に対して、1)配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、2)配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド、3)配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の機能を促進する化合物またはその塩、4)配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の発現を促進する化合物またはその塩、5)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩、6)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド、7)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩の機能を促進する化合物またはその塩、8)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩の発現を促進する化合物またはその塩または9)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体またはその塩に対するアゴニストの有効量を投与することを特徴とする（ｉ）副腎皮質ホルモン分泌促進方法または（ii）低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛みまたは肥満の予防・治療方法、
〔６３〕哺乳動物に対して、1)配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体、2)配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンスポリヌクレオチド、3)配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の機能を阻害する化合物またはその塩、4)配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の発現を阻害する化合物またはその塩、5)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、6)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンスポリヌクレオチド、7)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する化合物またはその塩、8)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩の発現を阻害する化合物またはその塩または9)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体またはその塩に対するアンタゴニストの有効量を投与することを特徴とする（ｉ）副腎皮質ホルモン分泌阻害方法または（ii）クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の予防・治療方法、
〔６４〕（ｉ）副腎皮質ホルモン分泌促進剤または（ii）低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛みまたは肥満の予防・治療剤を製造するための、1)配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、2)配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド、3)配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の機能を促進する化合物またはその塩、4)配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の発現を促進する化合物またはその塩、5)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩、6)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド、7)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩の機能を促進する化合物またはその塩、8)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩の発現を促進する化合物またはその塩または9)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体またはその塩に対するアゴニストの使用、
〔６５〕（ｉ）副腎皮質ホルモン分泌阻害剤または（ii）クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の予防・治療剤を製造するための、1)配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体、2)配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンスポリヌクレオチド、3)配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の機能を阻害する化合物またはその塩、4)配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の発現を阻害する化合物またはその塩、5)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、6)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンスポリヌクレオチド、7)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する化合物またはその塩、8)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩の発現を阻害する化合物またはその塩または9)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体またはその塩に対するアンタゴニストの使用、
〔６６〕（ｉ）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩および（または）配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする副腎皮質ホルモン分泌調節薬のスクリーニング方法、
〔６７〕（ｉ）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩および（または）配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする副腎皮質ホルモン分泌調節薬のスクリーニング用キット、
〔６８〕試験化合物を非哺乳動物に投与し、血中の副腎皮質ホルモンまたは男性ホルモンの濃度を測定することを特徴とする配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体またはその塩に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、および
〔６９〕配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体またはその塩を活性化する化合物またはその塩を非ヒト哺乳動物に投与した場合と、該ＡＱ２７受容体を活性化する化合物またはその塩および試験化合物を非ヒト哺乳動物に投与した場合における、血中の副腎皮質ホルモンまたは男性ホルモンの濃度を測定し、比較することを特徴とする該ＡＱ２７受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法を提供する。 That is, the present invention
[1] Regulation of secretion of adrenocortical hormone comprising a secreted protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof Agent,
[2] The amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7. [1] the agent according to the above,
[3] the partial peptide is
(1) a peptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the 80th to 88th amino acid sequence or the 127th to 133rd amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(2) a peptide containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence at positions 116 to 122 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3,
(3) a peptide containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence at positions 116 to 122 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, or
(4) the agent according to [1], which is a peptide containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence at positions 125 to 131 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7;
[4] the partial peptide is
(1) The 90th to 133rd amino acid sequence, the 91st to 133th amino acid sequence, the 93rd to 133th amino acid sequence, and the 104th to 133th amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Amino acid sequence, 108th-133th amino acid sequence, 109th-133rd amino acid sequence, 111th-133rd amino acid sequence, 115th-133rd amino acid sequence, 119th-133rd amino acid sequence An amino acid sequence, a peptide consisting of the amino acid sequence at positions 124 to 133, the amino acid sequence at positions 126 to 133, or the amino acid sequence at positions 127 to 133;
(2) a peptide in which the glutamine residue (Gln) at the N-terminus of the peptide consisting of the 91st to 133rd amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is pyroglutamined, or
(3) a peptide consisting of the amino acid sequence at positions 90 to 133 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein the N-terminal arginine residue (Arg) is substituted with a tyrosine residue (Tyr) The agent according to [1],
[5] the agent of [1], which is a corticosteroid secretagogue;
[6] the agent according to [5], which is a prophylactic / therapeutic agent for hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain or obesity;
[7] a corticosteroid secretion regulator comprising a polynucleotide encoding a secretory protein or a partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
[8] The amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7. [7] the agent of the above,
[9] the partial peptide is
(1) a peptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the 80th to 88th amino acid sequence or the 127th to 133rd amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(2) a peptide containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence at positions 116 to 122 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3,
(3) a peptide containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence at positions 116 to 122 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, or
(4) the agent according to [7], which is a peptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the 125th to 131st amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7;
[10] partial peptide is
(1) The 90th to 133rd amino acid sequence, the 91st to 133th amino acid sequence, the 93rd to 133th amino acid sequence, and the 104th to 133th amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Amino acid sequence, 108th-133th amino acid sequence, 109th-133rd amino acid sequence, 111th-133rd amino acid sequence, 115th-133rd amino acid sequence, 119th-133rd amino acid sequence An amino acid sequence, a peptide consisting of the amino acid sequence at positions 124 to 133, the amino acid sequence at positions 126 to 133, or the amino acid sequence at positions 127 to 133;
(2) a peptide in which the glutamine residue (Gln) at the N-terminus of the peptide consisting of the 91st to 133rd amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is pyroglutamined, or
(3) a peptide consisting of the amino acid sequence at positions 90 to 133 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein the N-terminal arginine residue (Arg) is substituted with a tyrosine residue (Tyr) The agent according to [7],
[11] the agent of [7], which is a corticosteroid secretagogue;
[12] The agent according to [11], which is a prophylactic / therapeutic agent for hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain or obesity.
[13] hypoaldosteronism, hypocortisolemia, comprising a polynucleotide encoding a secretory protein or a partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, Secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain, obesity, Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol Diagnostic agent for resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, gastric / duodenal ulcer or irritable bowel syndrome,
[14] A corticosteroid comprising an antibody against a secreted protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof Secretion regulators,
[15] the agent of [14], which is an adrenocortical hormone secretion inhibitor;
[16] Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa The agent according to (15), which is an agent for preventing or treating insomnia, insomnia, gastric / duodenal ulcer or irritable bowel syndrome,
[17] hypoaldosteronism comprising an antibody to a secreted protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof , Hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain, obesity, Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, Diagnostic agent for aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, gastric / duodenal ulcer or irritable bowel syndrome,
[18] a base sequence complementary to a polynucleotide encoding a secretory protein or a partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a portion thereof; A corticosteroid secretion regulator comprising an antisense polynucleotide,
[19] the agent of [18], which is an adrenocortical hormone secretion inhibitor;
[20] Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa The agent according to (19), which is a prophylactic / therapeutic agent for sickness, insomnia, gastric / duodenal ulcer or irritable bowel syndrome,
[21] a base sequence complementary to a polynucleotide encoding a secretory protein or a partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a portion thereof; Hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain, obesity, Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone Producing pituitary tumor, CRH producing tumor, aldosterone producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, gastric / duodenal ulcer or irritable bowel syndrome Diagnostic agents,
[22] a compound or a compound thereof which promotes or inhibits the function of a secretory protein, a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or A corticosteroid secretion regulator comprising a salt,
[23] A secretory protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof or a compound promoting the function of a salt thereof, or a salt thereof. A corticosteroid secretagogue,
(24) the agent according to (23), which is a prophylactic / therapeutic agent for hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain or obesity;
[25] A compound or a salt thereof that inhibits the function of a secretory protein, a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof, or a salt thereof, having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. A corticosteroid secretion inhibitor comprising,
[26] Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa The agent according to (25), which is an agent for preventing or treating insomnia, insomnia, gastric / duodenal ulcer or irritable bowel syndrome,
[27] a compound that promotes or inhibits the expression of a secretory protein, a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof, or a salt thereof, which contains the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or A corticosteroid secretion regulator comprising a salt,
[28] A secretory protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof or a compound thereof which promotes the expression thereof, or a salt thereof. A corticosteroid secretagogue,
(29) the agent according to (28), which is a prophylactic / therapeutic agent for hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain or obesity;
[30] A compound or a salt thereof that inhibits the expression of a secretory protein, a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof, or a salt thereof, containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. A corticosteroid secretion inhibitor comprising,
[31] Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa The agent according to (30), which is an agent for preventing or treating sickness, insomnia, gastric / duodenal ulcer or irritable bowel syndrome,
[32] comprising an AQ27 receptor having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, a partial peptide thereof or a salt thereof Corticosteroid secretion regulators,
[33] the agent of [32], which is a corticosteroid secretagogue;
(34) the agent according to (33), which is a prophylactic / therapeutic agent for hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain or obesity;
[35] a polynucleotide encoding the AQ27 receptor or a partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, or SEQ ID NO: 13; Adrenocortical hormone secretion regulator,
[36] the agent of [35], which is a corticosteroid secretagogue;
(37) the agent according to (36), which is a preventive or therapeutic agent for hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain or obesity;
[38] a polynucleotide encoding an AQ27 receptor having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, or a polynucleotide encoding a partial peptide thereof; Hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain, obesity, Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor , Aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, diagnostic agent for gastric / duodenal ulcer or irritable bowel syndrome,
[39] an antibody against the AQ27 receptor having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, a partial peptide thereof or a salt thereof; Adrenocortical hormone secretion regulator,
[40] the agent of [39], which is an adrenocortical hormone secretion inhibitor;
[41] Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa The agent according to (40), which is an agent for preventing or treating insomnia, insomnia, gastric / duodenal ulcer or irritable bowel syndrome,
[42] an antibody against an AQ27 receptor having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, a partial peptide thereof or an antibody against a salt thereof; Hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain, obesity, Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor , Aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, diagnostic agent for gastric / duodenal ulcer or irritable bowel syndrome,
[43] Complementary to a polynucleotide encoding an AQ27 receptor or a partial peptide thereof having an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 Corticosteroid secretion regulator comprising an antisense polynucleotide comprising a base sequence or a portion thereof,
[44] the agent of [43], which is an adrenocortical hormone secretion inhibitor;
[45] Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa The agent according to (44), which is an agent for preventing or treating insomnia, insomnia, gastric / duodenal ulcer or irritable bowel syndrome,
[46] complementary to a polynucleotide encoding an AQ27 receptor or a partial peptide thereof having an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 Aldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic adrenal insufficiency, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain, obesity comprising an antisense polynucleotide comprising a novel nucleotide sequence or a part thereof , Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, Diagnostic agent for insomnia, gastric / duodenal ulcer or irritable bowel syndrome,
[47] promotes the function of an AQ27 receptor having an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, a partial peptide thereof, or a salt thereof; A corticosteroid secretion regulator comprising an inhibitory compound or a salt thereof,
[48] Promotes the function of an AQ27 receptor having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, a partial peptide thereof or a salt thereof A corticosteroid secretagogue comprising a compound or a salt thereof,
(49) the agent according to (48), which is a prophylactic / therapeutic agent for hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain or obesity;
[50] Inhibits the function of an AQ27 receptor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, a partial peptide thereof or a salt thereof A corticosteroid secretion inhibitor comprising a compound or a salt thereof,
[51] Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa The agent according to (50), which is an agent for preventing or treating insomnia, insomnia, gastric / duodenal ulcer or irritable bowel syndrome,
[52] promotes the expression of an AQ27 receptor having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, a partial peptide thereof, or a salt thereof; A corticosteroid secretion regulator comprising an inhibitory compound or a salt thereof,
[53] Promotes the expression of an AQ27 receptor having an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, a partial peptide thereof or a salt thereof A corticosteroid secretagogue comprising a compound or a salt thereof,
(54) the agent according to (53), which is a prophylactic / therapeutic agent for hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain or obesity;
[55] inhibits the expression of an AQ27 receptor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, a partial peptide thereof, or a salt thereof A corticosteroid secretion inhibitor comprising a compound or a salt thereof,
[56] Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa The agent according to (55), which is an agent for preventing or treating sickness, insomnia, gastric / duodenal ulcer or irritable bowel syndrome,
[57] (1) a secretory protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, its partial peptide, its amide or its ester or its salt, and (2) SEQ ID NO: 9. AQ27 receptor having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, a compound capable of changing the binding to a partial peptide or a salt thereof, or a salt thereof A corticosteroid secretion regulator, comprising
[58] An agonist for an AQ27 receptor having an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, or SEQ ID NO: 13, a partial peptide thereof or an agonist thereof. Adrenocortical hormone secretagogue,
(59) the agent according to (58), which is a prophylactic / therapeutic agent for hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain or obesity;
[60] an antagonist to the AQ27 receptor having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, a partial peptide thereof, or an antagonist thereof; A corticosteroid secretion inhibitor,
[61] Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa The agent according to (60), which is an agent for preventing or treating insomnia, insomnia, gastric / duodenal ulcer or irritable bowel syndrome,
[62] With respect to mammals, 1) a secretory protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, its partial peptide, its amide or its ester or its salt, 2 A) a polynucleotide encoding a secretory protein or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; 3) identical or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 A secretory protein containing the same amino acid sequence, its partial peptide, its amide or its ester, or a compound that promotes the function of its salt or its salt; 4) identical or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Secreted proteins containing the same amino acid sequence, their partial peptides, their amides or A compound that promotes the expression of the ester or a salt thereof, or a salt thereof; 5) AQ27 containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, or SEQ ID NO: 13 6) AQ27 receptor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 or a portion thereof A polynucleotide encoding a peptide, 7) an AQ27 receptor containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, a partial peptide thereof or A compound promoting the function of a salt or a salt thereof, 8) SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: AQ27 receptor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by No. 13, a compound promoting the expression of a partial peptide thereof or a salt thereof or a salt thereof, or 9) SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 Or (i) promoting secretion of adrenocortical hormone, which comprises administering an effective amount of an agonist to the AQ27 receptor or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13. The method or (ii) a method for preventing or treating hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain or obesity,
[63] an antibody against a mammal 1) a secretory protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof , 2) containing a nucleotide sequence complementary to a polynucleotide encoding a secretory protein or a partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a part thereof; 3) inhibits the function of a secretory protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof 4) a compound or a salt thereof, which is identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Is a secretory protein containing substantially the same amino acid sequence, a partial peptide thereof, a compound thereof which inhibits the expression of an amide or an ester thereof or a salt thereof, or a salt thereof; 5) SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: : An antibody against the AQ27 receptor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, its partial peptide or its salt, 6) SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13. An antisense polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to a polynucleotide encoding an AQ27 receptor or a partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the represented amino acid sequence or a part thereof, 7 ) The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 AQ27 receptor having the same or substantially the same amino acid sequence, a compound inhibiting the function of a partial peptide thereof or a salt thereof or a salt thereof, 8) represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 AQ27 receptor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence, a compound inhibiting the expression of a partial peptide or a salt thereof or a salt thereof, or 9) SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: : (I) a method of inhibiting secretion of adrenocortical hormone or (i) comprising administering an effective amount of an antagonist to the AQ27 receptor or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by: ii) Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor , Aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance syndrome, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, prevention and a method of treatment of gastric and duodenal ulcers or irritable bowel syndrome,
[64] (i) a corticosteroid secretagogue or (ii) a prophylactic / therapeutic agent for hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypogonadism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain or obesity 1) secretory protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, its partial peptide, its amide or its ester or its salt, 2) SEQ ID NO: 1: a polynucleotide encoding a secretory protein or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by 1); 3) the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Secretory protein, its partial peptide, its amide or its ester or its A compound promoting the function of a salt or a salt thereof, 4) a secretory protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, an amide or an ester thereof, or a salt thereof 5) AQ27 receptor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, a portion thereof Peptide or a salt thereof, 6) Polypeptide encoding AQ27 receptor having an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, or a partial peptide thereof Nucleotide, 7) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, or SEQ ID NO: 13 AQ27 receptor having the same or substantially the same amino acid sequence, a compound promoting the function of a partial peptide thereof or a salt thereof or a salt thereof, 8) represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 AQ27 receptor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence to be expressed, a compound that promotes the expression of a partial peptide or a salt thereof or a salt thereof, or 9) SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: : Use of an agonist for an AQ27 receptor or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by 13,
[65] (i) a corticosteroid secretion inhibitor or (ii) Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital 1) the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 for producing a prophylactic / therapeutic agent for adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, gastric / duodenal ulcer or irritable bowel syndrome Or an antibody against a secretory protein containing a substantially identical amino acid sequence, a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof, 2) an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Complementary to a polynucleotide encoding a secretory protein or a partial peptide thereof containing An antisense polynucleotide comprising a base sequence or a part thereof; 3) a secretory protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, an amide thereof or A compound inhibiting the function of the ester or a salt thereof or a salt thereof; 4) a secretory protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, an amide thereof or A compound inhibiting the expression of an ester or a salt thereof or a salt thereof; 5) AQ27 receptor containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 Antibody to the body, its partial peptide or its salt, 6) SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 Or a nucleotide sequence complementary to a polynucleotide encoding the AQ27 receptor or a partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, or a part thereof. An antisense polynucleotide, 7) an AQ27 receptor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, or SEQ ID NO: 13, a partial peptide thereof or a salt thereof; A compound or a salt thereof that inhibits the function; 8) AQ27 receptor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, or a partial peptide thereof Or a compound inhibiting the expression of a salt thereof or a salt thereof or 9) SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: : 11 or SEQ ID NO: identical or substantially the amino acid sequence represented by 13 containing the same amino acid sequence AQ27 receptor or use of an antagonist to a salt thereof,
[66] (i) a secreted protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, its partial peptide, its amide or its ester or its salt, and / or SEQ ID NO: 9. Secretion of adrenocortical hormone using an AQ27 receptor having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, a partial peptide thereof or a salt thereof Modulator screening methods,
[67] (i) a secreted protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, its partial peptide, its amide or its ester or its salt, and / or SEQ ID NO: 9. An adrenocortical hormone comprising an AQ27 receptor having an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, a partial peptide thereof, or a salt thereof Screening kit for secretion modulators,
[68] an amino acid represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, wherein a test compound is administered to a non-mammal, and the concentration of blood corticosteroid or male hormone is measured. A method for screening for an agonist or antagonist for an AQ27 receptor or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the sequence, and
[69] A compound or a salt thereof, which activates an AQ27 receptor or a salt thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 The concentrations of adrenocortical hormone and male hormone in blood were measured when administered to a non-human mammal and when a compound or a salt thereof that activates the AQ27 receptor and a test compound were administered to the non-human mammal. And a method for screening for an agonist or antagonist to the AQ27 receptor.

さらに、本発明は、
〔７０〕（ｉ）配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩に、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を接触させた場合と（ii）配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩に、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩および試験化合物を接触させた場合における、副腎皮質ホルモン分泌促進活性または男性ホルモン分泌促進活性を測定し、比較することを特徴とする配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体またはその塩に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、
〔７１〕（ｉ）配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体またはその塩を活性化する化合物を、配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体を含有する細胞に接触させた場合と（ii）配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体またはその塩を活性化する化合物および試験化合物を、配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体を含有する細胞に接触させた場合における、副腎皮質ホルモン分泌促進活性または男性ホルモン分泌促進活性を測定し、比較することを特徴とする配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体またはその塩に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、
〔７２〕試験化合物（例、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩の結合性を変化させる化合物またはその塩）を、配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体を含有する細胞に接触させた場合における、副腎皮質ホルモン分泌促進活性または男性ホルモン分泌促進活性を測定することを特徴とする配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体またはその塩に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、
〔７３〕（ｉ）配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体またはその塩を活性化する化合物またはその塩（例、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩）を配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体またはその塩を含有する細胞に接触させた場合と、（ii）配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体またはその塩を活性化する化合物またはその塩（例、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩）および試験化合物（例、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩の結合性を変化させる化合物またはその塩）をＡＱ２７受容体を含有する細胞に接触させた場合における、副腎皮質ホルモン分泌促進活性または男性ホルモン分泌促進活性を測定し、比較することを特徴とする配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体またはその塩に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、
〔７４〕試験化合物（例、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩の結合性を変化させる化合物またはその塩）を非哺乳動物に投与し、血中の副腎皮質ホルモンまたは男性ホルモンの濃度を測定することを特徴とする配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体またはその塩に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、および
〔７５〕（ｉ）配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体またはその塩を活性化する化合物またはその塩（例、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩）を非ヒト哺乳動物に投与した場合と、（ii）配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体またはその塩を活性化する化合物またはその塩（例、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩）および試験化合物を非ヒト哺乳動物に投与した場合における、血中の副腎皮質ホルモンまたは男性ホルモンの濃度を測定し、比較することを特徴とする配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体またはその塩に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法を提供する。 Further, the present invention provides
[70] (i) an AQ27 receptor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, a partial peptide thereof, or a salt thereof, Secretion protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, its partial peptide, its amide or its ester or its salt, and (ii) SEQ ID NO: 9 An AQ27 receptor having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13; a partial peptide thereof or a salt thereof; Secreted protein containing the same or substantially the same amino acid sequence, its partial peptide, its amide Is the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein the activity of promoting secretion of adrenocortical hormone or the activity of promoting secretion of androgen when an ester or a salt thereof and a test compound are brought into contact is measured and compared. Alternatively, it is the same as or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 and a secretory protein containing the same amino acid sequence, its partial peptide, its amide or its ester or its salt. Screening method for agonists or antagonists to AQ27 receptor or a salt thereof containing the same amino acid sequence,
[71] (i) a compound that activates an AQ27 receptor or a salt thereof having an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, or SEQ ID NO: 13; , SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 when contacted with a cell containing an AQ27 receptor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13; A compound that activates the AQ27 receptor or a salt thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 and a test compound are represented by SEQ ID NO: 9. It contains the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13. The same or substantially the same as or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein the activity of promoting secretion of adrenocortical hormone or the activity of promoting androgen secretion when contacted with a cell containing a Q27 receptor is measured and compared. The same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 and a secretory protein containing the same amino acid sequence, its partial peptide, its amide or its ester or its salt. A method for screening for an agonist or antagonist for an AQ27 receptor or a salt thereof containing the same amino acid sequence,
[72] A test compound (eg, a secretory protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, an amide thereof or an ester thereof or a salt thereof and SEQ ID NO: 9) An AQ27 receptor having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13; a compound that changes the binding property of a partial peptide or a salt thereof, or a salt thereof) Corticosteroid when contacted with a cell containing an AQ27 receptor having an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 9 characterized in that secretion promoting activity or androgen secretion promoting activity is measured SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 AQ27 receptor or screening method of agonist or antagonist to a salt thereof comprising an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by,
[73] (i) a compound that activates an AQ27 receptor or a salt thereof that has the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, or SEQ ID NO: 13, or The salt thereof (eg, a secretory protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, its partial peptide, its amide or its ester or its salt) is represented by SEQ ID NO: 9, No. 11 or SEQ ID NO: 13 when contacted with a cell containing an AQ27 receptor having the same or substantially the same amino acid sequence or a salt thereof; and (ii) SEQ ID NO: 9 Contains the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13. Or a salt thereof (eg, a secreted protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, an amide thereof) An ester or a salt thereof) and a test compound (eg, a secretory protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof) AQ27 receptor having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, a compound capable of changing the binding property of a partial peptide or a salt thereof, or (A salt thereof) in contact with a cell containing an AQ27 receptor. Measuring or comparing the activity of promoting secretion of adrenocortical hormone or the activity of promoting secretion of androgen hormone, and is identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13. A method for screening for an agonist or antagonist for AQ27 receptor or a salt thereof comprising the amino acid sequence of
[74] a test compound (eg, a secretory protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, an amide thereof or an ester thereof or a salt thereof and SEQ ID NO: 9) An AQ27 receptor having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13; a compound that changes the binding property of a partial peptide or a salt thereof, or a salt thereof) The same or substantially the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, wherein the amino acid sequence is administered to a non-mammal and measures the concentration of corticosteroid or male hormone in blood. Agonist or antagonist to AQ27 receptor or a salt thereof containing the same amino acid sequence as (75) (i) an AQ27 receptor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, or a salt thereof Or a salt thereof (eg, a secretory protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, an amide thereof or an ester thereof or a salt thereof). When administered to a non-human mammal, and (ii) an AQ27 receptor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, or SEQ ID NO: 13, or the same. A compound that activates a salt or a salt thereof (eg, identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1) Concentration of adrenocortical hormone or male hormone in blood when a secretory protein containing the same amino acid sequence, its partial peptide, its amide or its ester or its salt) and a test compound are administered to a non-human mammal AQ27 receptor containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, or a salt thereof, characterized by measuring Methods for screening for agonists or antagonists are provided.

本発明の新規分泌蛋白質は副腎皮質ホルモン分泌調節作用を有しており、本発明の新規分泌蛋白質またはそのＤＮＡは、副腎皮質ホルモン分泌調節剤などとして有用である。
さらに、本発明の新規分泌蛋白質と結合するＡＱ２７受容体は、本発明の新規分泌蛋白質とＡＱ２７受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニングに有用であり、スクリーニングで得られる化合物は副腎皮質ホルモン分泌調節剤として使用することができる。 The novel secretory protein of the present invention has an activity of regulating adrenocortical hormone secretion, and the novel secretory protein of the present invention or its DNA is useful as an agent for regulating adrenocortical hormone secretion.
Furthermore, the AQ27 receptor that binds to the novel secretory protein of the present invention is useful for screening for a compound that alters the binding property between the novel secretory protein of the present invention and the AQ27 receptor. It can be used as a secretion regulator.

本発明の分泌蛋白質としては、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質であり、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、網膜細胞、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、網膜、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など、または血球系の細胞もしくはその培養細胞（例えば、ＭＥＬ，Ｍ１，ＣＴＬＬ−２，ＨＴ−２，ＷＥＨＩ−３，ＨＬ−６０，ＪＯＳＫ−１，Ｋ５６２，ＭＬ−１，ＭＯＬＴ−３，ＭＯＬＴ−４，ＭＯＬＴ−１０，ＣＣＲＦ−ＣＥＭ，ＴＡＬＬ−１，Ｊｕｒｋａｔ，ＣＣＲＴ−ＨＳＢ−２，ＫＥ−３７，ＳＫＷ−３，ＨＵＴ−７８，ＨＵＴ−１０２，Ｈ９，Ｕ９３７，ＴＨＰ−１，ＨＥＬ，ＪＫ−１，ＣＭＫ，ＫＯ−８１２，ＭＥＧ−０１など）に由来する蛋白質であってもよく、合成蛋白質であってもよい。   The secretory protein of the present invention is a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and is a human or warm-blooded animal (eg, guinea pig, rat, mouse, chicken, rabbit) , Pigs, sheep, cows, monkeys, etc.) (eg, retinal cells, hepatocytes, splenocytes, neurons, glial cells, pancreatic β cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells) Cell, fibroblast, fiber cell, muscle cell, fat cell, immune cell (eg, macrophage, T cell, B cell, natural killer cell, mast cell, neutrophil, basophil, eosinophil, monocyte) , Megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, osteocytes, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, hepatocytes or stromal cells, or precursors, stem cells or cancers of these cells Vesicles) or any tissue where these cells are present, such as the brain, various parts of the brain (eg, retina, olfactory bulb, amygdala, basal sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, cerebral cortex, medulla, cerebellum), Spinal cord, pituitary, stomach, pancreas, kidney, liver, gonad, thyroid, gall bladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, digestive tract (eg, large intestine, small intestine), blood vessels, heart, thymus, spleen, submandibular gland , Peripheral blood, prostate, testis, ovary, placenta, uterus, bone, joint, skeletal muscle, etc., or cells of the blood system or cultured cells thereof (for example, MEL, M1, CTLL-2, HT-2, WEHI-3, HL-60, JOSK-1, K562, ML-1, MOLT-3, MOLT-4, MOLT-10, CCRF-CEM, TALL-1, Jurkat, CCRT-HSB-2, KE-37, SKW-3, HUT-78, HU T-102, H9, U937, THP-1, HEL, JK-1, CMK, KO-812, MEG-01) or a synthetic protein.

配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。具体的には、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列としては、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列、配列番号：５で表わされるアミノ酸配列または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列が挙げられる。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。
また、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列としては、
（i）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７（以下、アミノ酸配列Ｘと略記する）、
（ii）アミノ酸配列Ｘ中の１〜３０個（例えば１〜１５個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、特に好ましくは１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（iii）アミノ酸配列Ｘに１〜３０個（例えば１〜１５個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、特に好ましくは１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（iv）アミノ酸配列Ｘに１〜３０個（例えば１〜１５個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、特に好ましくは１個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
（v）アミノ酸配列Ｘ中の１〜３０個（例えば１〜１５個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、特に好ましくは１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
（vi）上記（ii）〜（v）を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
本発明の分泌蛋白質の具体例としては、例えば、
（１）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるヒト型分泌蛋白質、
（２）配列番号：３で表わされるアミノ酸配列からなるラット型分泌蛋白質、
（３）配列番号：５で表わされるアミノ酸配列からなるマウス型分泌蛋白質、
（４）配列番号：７で表わされるアミノ酸配列からなるウシ型分泌蛋白質などが挙げられる。
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第１番目〜１８番目のアミノ酸配列は分泌シグナル配列を示す。
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第１番目〜１７番目のアミノ酸配列は分泌シグナル配列を示す。
配列番号：５で表わされるアミノ酸配列の第１番目〜１７番目のアミノ酸配列は分泌シグナル配列を示す。
配列番号：７で表わされるアミノ酸配列の第１番目〜１７番目のアミノ酸配列は分泌シグナル配列を示す。
したがって、本発明の分泌蛋白質は、上記したアミノ酸配列からシグナル配列を除いたものであってもよい。
本発明の分泌蛋白質は、後述する本発明のペプチドと同様の活性を有していてもよい。 The amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is at least about 50%, preferably at least about 60%, more preferably at least about 70%, More preferably, an amino acid sequence having about 80% or more, further preferably 90% or more, and most preferably about 95% or more homology can be mentioned. Specifically, the amino acid sequence having 60% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5. : 7.
The homology of amino acid sequences was determined using the homology calculation algorithm NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool), and the following conditions (expected value = 10; gap allowed; matrix = BLOSUM62; filtering = BLOSUM62). Can be calculated.
In addition, as the amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(I) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7 (hereinafter abbreviated as amino acid sequence X),
(Ii) 1 to 30 (for example, 1 to 15, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, and particularly preferably 1) amino acids in amino acid sequence X An amino acid sequence in which is deleted,
(Iii) 1 to 30 (for example, 1 to 15, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, and particularly preferably 1) amino acids in amino acid sequence X Added amino acid sequence,
(Iv) 1 to 30 (for example, 1 to 15, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, and particularly preferably 1) amino acids in amino acid sequence X The inserted amino acid sequence,
(V) 1 to 30 (for example, 1 to 15, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, and particularly preferably 1) amino acids in amino acid sequence X Has been replaced with another amino acid,
(Vi) an amino acid sequence obtained by combining the above (ii) to (v).
Specific examples of the secretory protein of the present invention include, for example,
(1) a human secretory protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(2) a rat-type secretory protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3,
(3) a mouse secretory protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5,
(4) A bovine secretory protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, and the like.
The 1st to 18th amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 show a secretory signal sequence.
The 1st to 17th amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 show a secretory signal sequence.
The 1st to 17th amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 show a secretory signal sequence.
The 1st to 17th amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 show a secretory signal sequence.
Therefore, the secretory protein of the present invention may be one obtained by removing the signal sequence from the above amino acid sequence.
The secretory protein of the present invention may have the same activity as the peptide of the present invention described later.

本発明の分泌蛋白質の部分ペプチド（以下、本発明のペプチドと略記する）としては、前記した本発明の分泌蛋白質の部分ペプチドであれば何れのものであってもよいが、通常、アミノ酸が５個以上、好ましくは１０個以上からなるペプチドが好ましい。
具体的には、本発明のペプチドとしては、
（１）本発明の配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第２６番目〜８８番目のアミノ酸配列、第８０番目〜８８番目のアミノ酸配列、第９１番目〜１３３番目のアミノ酸配列または第１２７番目〜１３３番目のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチド（以下、本発明のヒト型ペプチドと略記する場合がある）、
（２）本発明の配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第１１５番目〜１２２番目のアミノ酸配列または第１１６番目〜１２２番目のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチド（以下、本発明のラット型ペプチドと略記する場合がある）、
（３）本発明の配列番号：５で表わされるアミノ酸配列の第１１５番目〜１２２番目のアミノ酸配列または第１１６番目〜１２２番目のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチド（以下、本発明のマウス型ペプチドと略記する場合がある）、
（４）本発明の配列番号：７で表わされるアミノ酸配列の第１２４番目〜１３１番目のアミノ酸配列または第１２５番目〜１３１番目のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチド（以下、本発明のウシ型ペプチドと略記する場合がある）などが用いられる。 The partial peptide of the secretory protein of the present invention (hereinafter abbreviated as peptide of the present invention) may be any peptide as long as it is the partial peptide of the secretory protein of the present invention described above. Peptides consisting of at least 10 and preferably at least 10 are preferred.
Specifically, as the peptide of the present invention,
(1) The 26th to 88th amino acid sequence, the 80th to 88th amino acid sequence, the 91st to 133th amino acid sequence, or the 127th to 127th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention. A peptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the 133rd amino acid sequence (hereinafter sometimes abbreviated as the human peptide of the present invention);
(2) a peptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the 115th to 122nd amino acid sequence or the 116th to 122nd amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 of the present invention ( Hereinafter, it may be abbreviated as a rat peptide of the present invention),
(3) a peptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the 115th to 122nd amino acid sequence or the 116th to 122nd amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 of the present invention ( Hereinafter, it may be abbreviated as mouse-type peptide of the present invention),
(4) a peptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the 124th to 131st amino acid sequence or the 125th to 131st amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 of the present invention ( Hereinafter, it may be abbreviated as the bovine peptide of the present invention).

本発明のペプチドは、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、網膜細胞、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、網膜、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など、または血球系の細胞もしくはその培養細胞（例えば、ＭＥＬ，Ｍ１，ＣＴＬＬ−２，ＨＴ−２，ＷＥＨＩ−３，ＨＬ−６０，ＪＯＳＫ−１，Ｋ５６２，ＭＬ−１，ＭＯＬＴ−３，ＭＯＬＴ−４，ＭＯＬＴ−１０，ＣＣＲＦ−ＣＥＭ，ＴＡＬＬ−１，Ｊｕｒｋａｔ，ＣＣＲＴ−ＨＳＢ−２，ＫＥ−３７，ＳＫＷ−３，ＨＵＴ−７８，ＨＵＴ−１０２，Ｈ９，Ｕ９３７，ＴＨＰ−１，ＨＥＬ，ＪＫ−１，ＣＭＫ，ＫＯ−８１２，ＭＥＧ−０１など）に由来するペプチドであってもよく、合成ペプチドであってもよい。   The peptide of the present invention can be used for cells of humans and warm-blooded animals (eg, guinea pig, rat, mouse, chicken, rabbit, pig, sheep, cow, monkey, etc.) (eg, retinal cells, hepatocytes, splenocytes, nerve cells, Glial cells, pancreatic β cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, adipocytes, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells) , Natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, osteocytes, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, hepatocytes Or stromal cells, or precursor cells, stem cells, or cancer cells of these cells) or any tissue in which these cells are present, for example, the brain, various parts of the brain (eg, retina, olfactory bulb, amygdala, cerebrum Baseball, hippocampus, thalamus, hypothalamus, cerebral cortex, medulla, cerebellum), spinal cord, pituitary, stomach, pancreas, kidney, liver, gonad, thyroid, gallbladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, digestive tract ( Eg, large intestine, small intestine), blood vessels, heart, thymus, spleen, submandibular gland, peripheral blood, prostate, testicle, ovary, placenta, uterus, bone, joint, skeletal muscle, etc., or blood cell line or its cultured cells ( For example, MEL, M1, CTLL-2, HT-2, WEHI-3, HL-60, JOSK-1, K562, ML-1, MOLT-3, MOLT-4, MOLT-10, CCRF-CEM, TALL- 1, Jurkat, CCRT-HSB-2, KE-37, SKW-3, HUT-78, HUT-102, H9, U937, THP-1, HEL, JK-1, CMK, KO-812, MEG-01, etc. Derived from) Or a synthetic peptide.

本願明細書において、アミノ酸配列Ｙとは、以下の１０種類のアミノ酸配列から選ばれる１つのアミノ酸配列を示す。
（１）1)配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第２６番目〜８８番目のアミノ酸配列、
2)配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第８０番目〜８８番目のアミノ酸配列、
3)配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第９１番目〜１３３番目のアミノ酸配列、
4)配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第１２７番目〜１３３番目のアミノ酸配列、
（２）1)配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第１１５番目〜１２２番目のアミノ酸配列、
2)配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第１１６番目〜１２２番目のアミノ酸配列、
（３）1)配列番号：５で表わされるアミノ酸配列の第１１５番目〜１２２番目のアミノ酸配列、
2)配列番号：５で表わされるアミノ酸配列の第１１６番目〜１２２番目のアミノ酸配列、
（４）1)配列番号：７で表わされるアミノ酸配列の第１２４番目〜１３１番目のアミノ酸配列、
2)配列番号：７で表わされるアミノ酸配列の第１２５番目〜１３１番目のアミノ酸配列。
アミノ酸配列Ｙと実質的に同一のアミノ酸配列としては、アミノ酸配列Ｙと約７０％以上、好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
アミノ酸配列Ｙと実質的に同一のアミノ酸配列を有するペプチドとしては、例えば、前記のアミノ酸配列Ｙと実質的に同一のアミノ酸配列を有し、アミノ酸配列Ｙを有するペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチドなどが好ましい。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。
実質的に同質の活性としては、例えば、本発明のペプチドが有する活性（例えば、副腎皮質ホルモン分泌促進活性、受容体との結合活性、受容体発現細胞に対する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性などを促進する活性等）等）などが挙げられる。
実質的に同質とは、それらの活性が性質的に（例、生理化学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。 In the specification of the present application, the amino acid sequence Y indicates one amino acid sequence selected from the following 10 types of amino acid sequences.
(1) 1) the 26th to 88th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
2) the 80th to 88th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
3) the 91st to 133rd amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
4) the 127th to 133th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(2) 1) the 115th to 122nd amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3,
2) the amino acid sequence at positions 116 to 122 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3,
(3) 1) the 115th to 122nd amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5,
2) the amino acid sequence at positions 116 to 122 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5,
(4) 1) the 124th to 131st amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7,
2) The 125th to 131st amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7.
The amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence Y includes amino acids having about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably 90% or more, and most preferably about 95% or more homology with the amino acid sequence Y. Arrays and the like.
Examples of the peptide having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence Y include, for example, an amino acid sequence having substantially the same amino acid sequence as the above-mentioned amino acid sequence Y, and having substantially the same activity as the peptide having the amino acid sequence Y. Are preferred.
The homology of amino acid sequences was determined using the homology calculation algorithm NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool), and the following conditions (expected value = 10; gap allowed; matrix = BLOSUM62; filtering = BLOSUM62). Can be calculated.
Examples of the substantially equivalent activity include, for example, the activity of the peptide of the present invention (for example, the activity of promoting secretion of adrenocortical hormone, the activity of binding to a receptor, the activity of stimulating cells against receptor-expressing cells (for example, arachidonic acid release, Acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH decrease, GTPγS binding activity Etc.) and the like).
Substantially the same means that their activities are qualitatively (eg, physiochemically or pharmacologically) the same.

アミノ酸配列Ｙと同一または実質的に同一のアミノ酸配列の具体例としては、
（ｉ）アミノ酸配列Ｙ、
（ii）アミノ酸配列Ｙ中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（iii）アミノ酸配列Ｙに１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（iv）アミノ酸配列Ｙに１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
（v）アミノ酸配列Ｙ中の１〜１０個（好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
（vi）上記（ii）〜（v）を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。 Specific examples of the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence Y include:
(I) the amino acid sequence Y,
(Ii) an amino acid sequence in which 1 to 5 (preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, and more preferably 1) amino acids in the amino acid sequence Y have been deleted,
(Iii) an amino acid sequence obtained by adding 1 to 5 (preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, and more preferably 1) amino acids to the amino acid sequence Y;
(Iv) an amino acid sequence in which 1 to 5 (preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, and more preferably 1) amino acids have been inserted into the amino acid sequence Y;
(V) an amino acid sequence in which 1 to 10 (preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, and more preferably 1) amino acids in the amino acid sequence Y are substituted with another amino acid;
(Vi) an amino acid sequence obtained by combining the above (ii) to (v).

本発明のペプチドの具体例としては、例えば、
（１）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第１９番目〜８８番目のアミノ酸配列、第２０番目〜８８番目のアミノ酸配列、第２１番目〜８８番目のアミノ酸配列、第２２番目〜８８番目のアミノ酸配列、第２３番目〜８８番目のアミノ酸配列、第２４番目〜８８番目のアミノ酸配列、第２５番目〜８８番目のアミノ酸配列、第２６番目〜８８番目のアミノ酸配列、第２７番目〜８８番目のアミノ酸配列、第２８番目〜８８番目のアミノ酸配列、第２９番目〜８８番目のアミノ酸配列、第３０番目〜８８番目のアミノ酸配列、第３１番目〜８８番目のアミノ酸配列、第３２番目〜８８番目のアミノ酸配列、第３３番目〜８８番目のアミノ酸配列、第３４番目〜８８番目のアミノ酸配列、第３５番目〜８８番目のアミノ酸配列、第３６番目〜８８番目のアミノ酸配列、第３７番目〜８８番目のアミノ酸配列、第３８番目〜８８番目のアミノ酸配列、第３９番目〜８８番目のアミノ酸配列、第４０番目〜８８番目のアミノ酸配列、第４１番目〜８８番目のアミノ酸配列、第４２番目〜８８番目のアミノ酸配列、第４３番目〜８８番目のアミノ酸配列、第４４番目〜８８番目のアミノ酸配列、第４５番目〜８８番目のアミノ酸配列、第４６番目〜８８番目のアミノ酸配列、第４７番目〜８８番目のアミノ酸配列、第４８番目〜８８番目のアミノ酸配列、第４９番目〜８８番目のアミノ酸配列、第５０番目〜８８番目のアミノ酸配列、第５１番目〜８８番目のアミノ酸配列、第５２番目〜８８番目のアミノ酸配列、第５３番目〜８８番目のアミノ酸配列、第５４番目〜８８番目のアミノ酸配列、第５５番目〜８８番目のアミノ酸配列、第５６番目〜８８番目のアミノ酸配列、第５７番目〜８８番目のアミノ酸配列、第５８番目〜８８番目のアミノ酸配列、第５９番目〜８８番目のアミノ酸配列、第６０番目〜８８番目のアミノ酸配列、第６１番目〜８８番目のアミノ酸配列、第６２番目〜８８番目のアミノ酸配列、第６３番目〜８８番目のアミノ酸配列、第６４番目〜８８番目のアミノ酸配列、第６５番目〜８８番目のアミノ酸配列、第６６番目〜８８番目のアミノ酸配列、第６７番目〜８８番目のアミノ酸配列、第６８番目〜８８番目のアミノ酸配列、第６９番目〜８８番目のアミノ酸配列、第７０番目〜８８番目のアミノ酸配列、第７１番目〜８８番目のアミノ酸配列、第７２番目〜８８番目のアミノ酸配列、第７３番目〜８８番目のアミノ酸配列、第７４番目〜８８番目のアミノ酸配列、第７５番目〜８８番目のアミノ酸配列、第７６番目〜８８番目のアミノ酸配列、第７７番目〜８８番目のアミノ酸配列、第７８番目〜８８番目のアミノ酸配列、第７９番目〜８８番目のアミノ酸配列または第８０番目〜８８番目のアミノ酸配列からなるヒト型ペプチド、または配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第１９番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第２０番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第２１番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第２２番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第２３番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第２４番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第２５番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第２６番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第２７番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第２８番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第２９番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第３０番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第３１番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第３２番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第３３番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第３４番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第３５番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第３６番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第３７番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第３８番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第３９番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第４０番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第４１番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第４２番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第４３番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第４４番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第４５番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第４６番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第４７番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第４８番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第４９番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第５０番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第５１番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第５２番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第５３番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第５４番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第５５番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第５６番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第５７番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第５８番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第５９番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第６０番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第６１番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第６２番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第６３番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第６４番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第６５番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第６６番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第６７番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第６８番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第６９番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第７０番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第７１番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第７２番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第７３番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第７４番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第７５番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第７６番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第７７番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第７８番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第７９番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第８０番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第８１番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第８２番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第８３番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第８４番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第８５番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第８６番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第８７番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第８８番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第８９番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第９０番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第９１番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第９２番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第９３番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第９４番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第９５番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第９６番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第９７番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第９８番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第９９番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１００番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１０１番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１０２番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１０３番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１０４番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１０５番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１０６番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１０７番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１０８番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１０９番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１１０番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１１１番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１１２番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１１３番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１１４番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１１５番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１１６番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１１７番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１１８番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１１９番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１２０番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１２１番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１２２番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１２３番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１２４番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１２５番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１２６番目〜１３３番目のアミノ酸配列または第１２７番目〜１３３番目のアミノ酸配列からなるヒト型ペプチド（なかでも配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第２６番目〜８８番目のアミノ酸配列、第８０番目〜８８番目のアミノ酸配列、第９０番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第９１番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第９３番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１０４番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１０８番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１０９番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１１１番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１１５番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１１９番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１２４番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１２６番目〜１３３番目または第１２７番目〜１３３番目のアミノ酸配列からなるヒト型ペプチドなどが好ましく、特に配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第９０番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第９１番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第９３番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１０４番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１０８番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１０９番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１１１番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１１５番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１１９番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１２４番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１２６番目〜１３３番目または第１２７番目〜１３３番目のアミノ酸配列からなるヒト型ペプチドなどが好ましく、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第９１番目〜１３３番目のアミノ酸配列からなるペプチドはＮ末端のグルタミン残基（Ｇｌｎ）がピログルタミン化されていてもよく、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第９０番目〜１３３番目のアミノ酸配列からなるペプチドはＮ末端のアルギニン残基（Ａｒｇ）がチロシン残基（Ｔｙｒ）に置換されていてもよい（図４７および図４８参照））、 Specific examples of the peptide of the present invention include, for example,
(1) The 19th to 88th amino acid sequence, the 20th to 88th amino acid sequence, the 21st to 88th amino acid sequence, and the 22nd to 88th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Amino acid sequence, 23rd to 88th amino acid sequence, 24th to 88th amino acid sequence, 25th to 88th amino acid sequence, 26th to 88th amino acid sequence, 27th to 88th amino acid sequence Amino acid sequence, 28th to 88th amino acid sequence, 29th to 88th amino acid sequence, 30th to 88th amino acid sequence, 31st to 88th amino acid sequence, 32nd to 88th amino acid sequence Amino acid sequence, 33rd to 88th amino acid sequence, 34th to 88th amino acid sequence, 35th to 88th amino acid sequence, 36th amino acid sequence The amino acid sequence at position 88, the amino acid sequence at positions 37 to 88, the amino acid sequence at positions 38 to 88, the amino acid sequence at positions 39 to 88, the amino acid sequence at positions 40 to 88, and the amino acid sequence at positions 41 to 41 The amino acid sequence at position 88, the amino acid sequence at positions 42 to 88, the amino acid sequence at positions 43 to 88, the amino acid sequence at positions 44 to 88, the amino acid sequence at positions 45 to 88, and the amino acid sequence at positions 46 to 46 The amino acid sequence at position 88, the amino acid sequence at positions 47 to 88, the amino acid sequence at positions 48 to 88, the amino acid sequence at positions 49 to 88, the amino acid sequence at positions 50 to 88, and the amino acid sequence at positions 51 to 51 The 88th amino acid sequence, the 52nd to 88th amino acid sequence, the 53rd to 88th amino acid sequence, the 54th to 88th amino acid Sequence, amino acid sequence at positions 55-88, amino acid sequence at positions 56-88, amino acid sequence at positions 57-88, amino acid sequence at positions 58-88, amino acid sequence at positions 59-88 Sequence, amino acid sequence at positions 60 to 88, amino acid sequence at positions 61 to 88, amino acid sequence at positions 62 to 88, amino acid sequence at positions 63 to 88, amino acids at positions 64 to 88 Sequence, amino acid sequence at positions 65-88, amino acid sequence at positions 66-88, amino acid sequence at positions 67-88, amino acid sequence at positions 68-88, amino acid sequence at positions 69-88 Sequence, amino acid sequence at positions 70-88, amino acid sequence at positions 71-88, amino acid sequence at positions 72-88, sequence 73- The amino acid sequence at position 88, the amino acid sequence at positions 74 to 88, the amino acid sequence at positions 75 to 88, the amino acid sequence at positions 76 to 88, the amino acid sequence at positions 77 to 88, and the amino acid sequence at positions 78 to 78 An amino acid sequence at position 88, a human peptide consisting of the amino acid sequence at positions 79 to 88 or an amino acid sequence at positions 80 to 88, or an amino acid at positions 19 to 133 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Sequence, 20th-133rd amino acid sequence, 21st-133rd amino acid sequence, 22nd-133rd amino acid sequence, 23rd-133rd amino acid sequence, 24th-133rd amino acid Sequence, amino acid sequence at positions 25-133, amino acid sequence at positions 26-133, sequence 27- Th amino acid sequence, 28th to 133th amino acid sequence, 29th to 133th amino acid sequence, 30th to 133th amino acid sequence, 31st to 133th amino acid sequence, 32nd to 133th amino acid sequence Th amino acid sequence, the 33rd-133rd amino acid sequence, the 34th-133rd amino acid sequence, the 35th-133rd amino acid sequence, the 36th-133rd amino acid sequence, the 37th-133rd amino acid sequence Th amino acid sequence, 38 th to 133 th amino acid sequence, 39 th to 133 th amino acid sequence, 40 th to 133 th amino acid sequence, 41 th to 133 th amino acid sequence, 42 th to 133 th The amino acid sequence at position 43, the amino acid sequence at positions 43 to 133, the amino acid sequence at positions 44 to 133 45th to 133rd amino acid sequence, 46th to 133th amino acid sequence, 47th to 133th amino acid sequence, 48th to 133th amino acid sequence, 49th to 133th amino acid sequence, 50th to 133rd amino acid sequence, 51st to 133th amino acid sequence, 52nd to 133th amino acid sequence, 53rd to 133th amino acid sequence, 54th to 133th amino acid sequence, 55th to 133rd amino acid sequence, 56th to 133rd amino acid sequence, 57th to 133th amino acid sequence, 58th to 133th amino acid sequence, 59th to 133th amino acid sequence, The 60th-133rd amino acid sequence, the 61st-133rd amino acid sequence, the 62nd-133rd amino acid sequence The amino acid sequence of the eyes, the 63rd to 133rd amino acid sequence, the 64th to 133rd amino acid sequence, the 65th to 133rd amino acid sequence, the 66th to 133th amino acid sequence, the 67th to 133th amino acid sequences The 68th to 133rd amino acid sequence, the 69th to 133rd amino acid sequence, the 70th to 133rd amino acid sequence, the 71st to 133rd amino acid sequence, the 72nd to 133th amino acid sequences The 73rd to 133rd amino acid sequence, the 74th to 133rd amino acid sequence, the 75th to 133rd amino acid sequence, the 76th to 133th amino acid sequence, the 77th to 133th amino acid sequences The amino acid sequence of the 78th to 133rd amino acid sequence, the 79th to 133rd amino acid sequence, 0th to 133rd amino acid sequence, 81st to 133rd amino acid sequence, 82nd to 133th amino acid sequence, 83rd to 133th amino acid sequence, 84th to 133th amino acid sequence, The 85th to 133rd amino acid sequence, the 86th to 133rd amino acid sequence, the 87th to 133th amino acid sequence, the 88th to 133th amino acid sequence, the 89th to 133th amino acid sequence, 90th to 133rd amino acid sequence, 91st to 133rd amino acid sequence, 92nd to 133rd amino acid sequence, 93rd to 133th amino acid sequence, 94th to 133th amino acid sequence, 95th-133rd amino acid sequence, 96th-133rd amino acid sequence, 97th-133rd amino acid sequence Amino acid sequence, 98th-133rd amino acid sequence, 99th-133rd amino acid sequence, 100th-133rd amino acid sequence, 101st-133rd amino acid sequence, 102nd-133rd amino acid sequence Amino acid sequence, 103rd-133rd amino acid sequence, 104th-133rd amino acid sequence, 105th-133rd amino acid sequence, 106th-133rd amino acid sequence, 107th-133rd amino acid sequence Amino acid sequence, 108th-133th amino acid sequence, 109th-133rd amino acid sequence, 110th-133rd amino acid sequence, 111th-133rd amino acid sequence, 112th-133rd amino acid sequence Amino acid sequence, 113th to 133rd amino acid sequence, 114th to 1st 33rd amino acid sequence, 115th-133rd amino acid sequence, 116th-133rd amino acid sequence, 117th-133rd amino acid sequence, 118th-133rd amino acid sequence, 119th- 133rd amino acid sequence, 120th to 133rd amino acid sequence, 121st to 133rd amino acid sequence, 122nd to 133th amino acid sequence, 123rd to 133th amino acid sequence, 124th to 124th amino acid sequence A human peptide consisting of the 133rd amino acid sequence, the 125th to 133rd amino acid sequence, the 126th to 133th amino acid sequence or the 127th to 133th amino acid sequence (among others, represented by SEQ ID NO: 1) 26th to 88th amino acid sequence, 80th to 8th amino acid sequences The 90th amino acid sequence, the 90th-133rd amino acid sequence, the 91st-133rd amino acid sequence, the 93rd-133rd amino acid sequence, the 104th-133rd amino acid sequence, the 108th-133rd amino acid sequence The amino acid sequence of the 109th to 133rd amino acid sequence, the 111th to 133th amino acid sequence, the 115th to 133th amino acid sequence, the 119th to 133th amino acid sequence, the 124th to 133th amino acid sequence The amino acid sequence at position 90, the amino acid sequence at positions 90 to 133 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is preferred, and human-type peptides comprising the amino acid sequence at positions 126 to 133 or 127 to 133 are preferred. The 91st to 133rd amino acid sequence, the 93rd to 133rd amino acid sequence, No acid sequence, 104th to 133rd amino acid sequence, 108th to 133th amino acid sequence, 109th to 133th amino acid sequence, 111th to 133th amino acid sequence, 115th to 133th amino acid sequence Amino acid sequence of the 119th to 133rd amino acid sequence, the 124th to 133th amino acid sequence, the 126th to 133th or the human type peptide consisting of the 127th to 133th amino acid sequence, and the like. The peptide consisting of the 91st to 133rd amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 may have a glutamine residue (Gln) at the N-terminus which may be pyroglutamined, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 A peptide consisting of the 90th to 133rd amino acid sequence is N-terminal arginine The residue (Arg) may be substituted with a tyrosine residue (Tyr) (see FIGS. 47 and 48).

（２）配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第１８番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第１９番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第２０番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第２１番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第２２番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第２３番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第２４番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第２５番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第２６番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第２７番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第２８番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第２９番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第３０番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第３１番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第３２番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第３３番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第３４番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第３５番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第３６番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第３７番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第３８番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第３９番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第４０番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第４１番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第４２番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第４３番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第４４番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第４５番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第４６番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第４７番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第４８番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第４９番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第５０番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第５１番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第５２番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第５３番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第５４番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第５５番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第５６番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第５７番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第５８番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第５９番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第６０番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第６１番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第６２番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第６３番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第６４番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第６５番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第６６番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第６７番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第６８番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第６９番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第７０番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第７１番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第７２番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第７３番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第７４番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第７５番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第７６番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第７７番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第７８番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第７９番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第８０番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第８１番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第８２番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第８３番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第８４番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第８５番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第８６番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第８７番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第８８番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第８９番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第９０番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第９１番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第９２番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第９３番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第９４番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第９５番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第９６番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第９７番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第９８番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第９９番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第１００番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第１０１番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第１０２番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第１０３番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第１０４番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第１０５番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第１０６番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第１０７番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第１０８番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第１０９番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第１１０番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第１１１番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第１１２番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第１１３番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第１１４番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第１１５番目〜１２２番目のアミノ酸配列または第１１６番目〜１２２番目のアミノ酸配列からなるラット型ペプチド（なかでも配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第１１５番目〜１２２番目のアミノ酸配列または第１１６番目〜１２２番目のアミノ酸配列からなるラット型ペプチドなどが好ましい）、 (2) The 18th to 122nd amino acid sequence, the 19th to 122nd amino acid sequence, the 20th to 122nd amino acid sequence, and the 21st to 122nd amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3. Amino acid sequence, 22nd to 122nd amino acid sequence, 23rd to 122nd amino acid sequence, 24th to 122nd amino acid sequence, 25th to 122nd amino acid sequence, 26th to 122th amino acid sequence Amino acid sequence, amino acid sequence at positions 27-122, amino acid sequence at positions 28-122, amino acid sequence at positions 29-122, amino acid sequence at positions 30-122, amino acid sequence at positions 31-122 Amino acid sequence, 32nd to 122nd amino acid sequence, 33rd to 122nd amino acid sequence, 34th to 1st 2nd amino acid sequence, 35th to 122nd amino acid sequence, 36th to 122nd amino acid sequence, 37th to 122nd amino acid sequence, 38th to 122nd amino acid sequence, 39th to 39th amino acid sequence 122nd amino acid sequence, 40th to 122nd amino acid sequence, 41st to 122nd amino acid sequence, 42nd to 122nd amino acid sequence, 43rd to 122nd amino acid sequence, 44th to 44th amino acid sequence 122nd amino acid sequence, 45th to 122nd amino acid sequence, 46th to 122nd amino acid sequence, 47th to 122nd amino acid sequence, 48th to 122nd amino acid sequence, 49th to 49th amino acid sequence 122nd amino acid sequence, 50th to 122nd amino acid sequence, 51st to 122nd amino acid sequence The amino acid sequence at positions 52-122, the amino acid sequence at positions 53-122, the amino acid sequence at positions 54-122, the amino acid sequence at positions 55-122, the amino acid sequence at positions 56-122 57th-122nd amino acid sequence, 58th-122nd amino acid sequence, 59th-122nd amino acid sequence, 60th-122nd amino acid sequence, 61st-122nd amino acid sequence 62nd-122nd amino acid sequence, 63rd-122nd amino acid sequence, 64th-122nd amino acid sequence, 65th-122nd amino acid sequence, 66th-122nd amino acid sequence 67th to 122th amino acid sequence, 68th to 122th amino acid sequence, 69th to 122th amino acid sequence The amino acid sequence at the 70th to 122nd amino acid sequence, the 71st to 122nd amino acid sequence, the 72nd to 122nd amino acid sequence, the 73rd to 122nd amino acid sequence, the 74th to 122nd amino acid sequence The amino acid sequence of the 75th to 122nd amino acid sequence, the amino acid sequence of the 76th to 122nd amino acid sequence, the amino acid sequence of the 77th to 122nd amino acid sequence, the 78th to 122nd amino acid sequence, the 79th to 122nd amino acid sequence The amino acid sequence at the 80th to 122nd amino acid sequence, the 81st to 122nd amino acid sequence, the 82nd to 122nd amino acid sequence, the 83rd to 122nd amino acid sequence, and the 84th to 122th amino acid sequences The amino acid sequence at position 85, the amino acid sequence at positions 85 to 122, the amino acid sequence at positions 86 to 122, 87th to 122nd amino acid sequence, 88th to 122nd amino acid sequence, 89th to 122nd amino acid sequence, 90th to 122nd amino acid sequence, 91st to 122th amino acid sequence, The 92nd to 122nd amino acid sequence, the 93rd to 122nd amino acid sequence, the 94th to 122nd amino acid sequence, the 95th to 122nd amino acid sequence, the 96th to 122nd amino acid sequence, 97th to 122nd amino acid sequence, 98th to 122nd amino acid sequence, 99th to 122nd amino acid sequence, 100th to 122nd amino acid sequence, 101st to 122th amino acid sequence, 102nd to 122nd amino acid sequence, 103rd to 122nd amino acid sequence, 104th amino acid sequence 122nd amino acid sequence, 105th to 122nd amino acid sequence, 106th to 122nd amino acid sequence, 107th to 122nd amino acid sequence, 108th to 122th amino acid sequence, 109th to 109th amino acid sequence 122nd amino acid sequence, 110th to 122nd amino acid sequence, 111th to 122nd amino acid sequence, 112th to 122nd amino acid sequence, 113th to 122th amino acid sequence, 114th to 114th amino acid sequence A rat-type peptide consisting of the amino acid sequence at position 122, the amino acid sequence at positions 115 to 122 or the amino acid sequence at positions 116 to 122 (among the amino acid sequences at positions 115 to 122 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3) From the amino acid sequence or the amino acid sequence at positions 116 to 122 Rat peptides are preferred),

（３）配列番号：５で表わされるアミノ酸配列の第１８番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第１９番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第２０番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第２１番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第２２番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第２３番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第２４番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第２５番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第２６番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第２７番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第２８番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第２９番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第３０番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第３１番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第３２番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第３３番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第３４番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第３５番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第３６番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第３７番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第３８番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第３９番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第４０番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第４１番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第４２番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第４３番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第４４番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第４５番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第４６番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第４７番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第４８番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第４９番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第５０番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第５１番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第５２番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第５３番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第５４番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第５５番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第５６番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第５７番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第５８番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第５９番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第６０番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第６１番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第６２番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第６３番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第６４番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第６５番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第６６番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第６７番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第６８番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第６９番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第７０番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第７１番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第７２番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第７３番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第７４番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第７５番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第７６番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第７７番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第７８番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第７９番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第８０番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第８１番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第８２番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第８３番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第８４番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第８５番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第８６番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第８７番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第８８番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第８９番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第９０番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第９１番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第９２番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第９３番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第９４番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第９５番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第９６番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第９７番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第９８番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第９９番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第１００番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第１０１番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第１０２番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第１０３番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第１０４番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第１０５番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第１０６番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第１０７番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第１０８番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第１０９番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第１１０番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第１１１番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第１１２番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第１１３番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第１１４番目〜１２２番目のアミノ酸配列、第１１５番目〜１２２番目のアミノ酸配列または第１１６番目〜１２２番目のアミノ酸配列からなるマウス型ペプチド（なかでも配列番号：５で表わされるアミノ酸配列の第１１５番目〜１２２番目のアミノ酸配列または第１１６番目〜１２２番目のアミノ酸配列からなるペプチドなどが好ましい）、 (3) the amino acid sequence at positions 18 to 122, the amino acid sequence at positions 19 to 122, the amino acid sequence at positions 20 to 122, and the amino acid sequence at positions 21 to 122 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 Amino acid sequence, 22nd to 122nd amino acid sequence, 23rd to 122nd amino acid sequence, 24th to 122nd amino acid sequence, 25th to 122nd amino acid sequence, 26th to 122th amino acid sequence Amino acid sequence, amino acid sequence at positions 27-122, amino acid sequence at positions 28-122, amino acid sequence at positions 29-122, amino acid sequence at positions 30-122, amino acid sequence at positions 31-122 Amino acid sequence, 32nd to 122nd amino acid sequence, 33rd to 122nd amino acid sequence, 34th to 1st 2nd amino acid sequence, 35th to 122nd amino acid sequence, 36th to 122nd amino acid sequence, 37th to 122nd amino acid sequence, 38th to 122nd amino acid sequence, 39th to 39th amino acid sequence 122nd amino acid sequence, 40th to 122nd amino acid sequence, 41st to 122nd amino acid sequence, 42nd to 122nd amino acid sequence, 43rd to 122nd amino acid sequence, 44th to 44th amino acid sequence 122nd amino acid sequence, 45th to 122nd amino acid sequence, 46th to 122nd amino acid sequence, 47th to 122nd amino acid sequence, 48th to 122nd amino acid sequence, 49th to 49th amino acid sequence 122nd amino acid sequence, 50th to 122nd amino acid sequence, 51st to 122nd amino acid sequence The amino acid sequence at positions 52-122, the amino acid sequence at positions 53-122, the amino acid sequence at positions 54-122, the amino acid sequence at positions 55-122, the amino acid sequence at positions 56-122 57th-122nd amino acid sequence, 58th-122nd amino acid sequence, 59th-122nd amino acid sequence, 60th-122nd amino acid sequence, 61st-122nd amino acid sequence 62nd-122nd amino acid sequence, 63rd-122nd amino acid sequence, 64th-122nd amino acid sequence, 65th-122nd amino acid sequence, 66th-122nd amino acid sequence 67th to 122th amino acid sequence, 68th to 122th amino acid sequence, 69th to 122th amino acid sequence The amino acid sequence at the 70th to 122nd amino acid sequence, the 71st to 122nd amino acid sequence, the 72nd to 122nd amino acid sequence, the 73rd to 122nd amino acid sequence, the 74th to 122nd amino acid sequence The amino acid sequence of the 75th to 122nd amino acid sequence, the amino acid sequence of the 76th to 122nd amino acid sequence, the amino acid sequence of the 77th to 122nd amino acid sequence, the 78th to 122nd amino acid sequence, the 79th to 122nd amino acid sequence The amino acid sequence at the 80th to 122nd amino acid sequence, the 81st to 122nd amino acid sequence, the 82nd to 122nd amino acid sequence, the 83rd to 122nd amino acid sequence, and the 84th to 122th amino acid sequences The amino acid sequence at position 85, the amino acid sequence at positions 85 to 122, the amino acid sequence at positions 86 to 122, 87th to 122nd amino acid sequence, 88th to 122nd amino acid sequence, 89th to 122nd amino acid sequence, 90th to 122nd amino acid sequence, 91st to 122th amino acid sequence, The 92nd to 122nd amino acid sequence, the 93rd to 122nd amino acid sequence, the 94th to 122nd amino acid sequence, the 95th to 122nd amino acid sequence, the 96th to 122nd amino acid sequence, 97th to 122nd amino acid sequence, 98th to 122nd amino acid sequence, 99th to 122nd amino acid sequence, 100th to 122nd amino acid sequence, 101st to 122th amino acid sequence, 102nd to 122nd amino acid sequence, 103rd to 122nd amino acid sequence, 104th amino acid sequence 122nd amino acid sequence, 105th to 122nd amino acid sequence, 106th to 122nd amino acid sequence, 107th to 122nd amino acid sequence, 108th to 122th amino acid sequence, 109th to 109th amino acid sequence 122nd amino acid sequence, 110th to 122nd amino acid sequence, 111th to 122nd amino acid sequence, 112th to 122nd amino acid sequence, 113th to 122th amino acid sequence, 114th to 114th amino acid sequence A mouse-type peptide consisting of the amino acid sequence at position 122, the amino acid sequence at positions 115 to 122, or the amino acid sequence at positions 116 to 122 (particularly the amino acid sequence at positions 115 to 122 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5); From the amino acid sequence or the amino acid sequence at positions 116 to 122 Are preferred),

（４）配列番号：７で表わされるアミノ酸配列の第１８番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第１９番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第２０番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第２１番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第２２番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第２３番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第２４番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第２５番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第２６番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第２７番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第２８番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第２９番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第３０番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第３１番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第３２番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第３３番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第３４番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第３５番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第３６番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第３７番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第３８番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第３９番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第４０番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第４１番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第４２番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第４３番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第４４番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第４５番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第４６番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第４７番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第４８番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第４９番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第５０番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第５１番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第５２番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第５３番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第５４番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第５５番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第５６番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第５７番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第５８番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第５９番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第６０番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第６１番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第６２番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第６３番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第６４番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第６５番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第６６番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第６７番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第６８番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第６９番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第７０番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第７１番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第７２番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第７３番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第７４番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第７５番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第７６番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第７７番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第７８番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第７９番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第８０番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第８１番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第８２番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第８３番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第８４番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第８５番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第８６番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第８７番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第８８番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第８９番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第９０番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第９１番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第９２番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第９３番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第９４番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第９５番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第９６番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第９７番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第９８番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第９９番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第１００番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第１０１番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第１０２番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第１０３番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第１０４番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第１０５番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第１０６番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第１０７番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第１０８番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第１０９番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第１１０番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第１１１番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第１１２番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第１１３番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第１１４番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第１１５番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第１１６番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第１１７番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第１１８番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第１１９番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第１２０番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第１２１番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第１２２番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第１２３番目〜１３１番目のアミノ酸配列、第１２４番目〜１３１番目のアミノ酸配列または第１２５番目〜１３１番目のアミノ酸配列からなるウシ型ペプチドＩ（なかでも配列番号：７で表わされるアミノ酸配列の第１２４番目〜１３１番目のアミノ酸配列または第１２５番目〜１３１番目のアミノ酸配列からなるペプチドなどが好ましい）などが挙げられる。
これらのペプチドとしては、Ｃ末端のアミド体が好ましく用いられる。
本願明細書において、上記のヒト型、ラット型、マウス型およびウシ型ペプチドを本発明のペプチドと総称する。 (4) the 18th to 131st amino acid sequence, the 19th to 131st amino acid sequence, the 20th to 131st amino acid sequence, and the 21st to 131st amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7. Amino acid sequence, 22nd to 131st amino acid sequence, 23rd to 131st amino acid sequence, 24th to 131st amino acid sequence, 25th to 131st amino acid sequence, 26th to 131st amino acid sequence Amino acid sequence, amino acid sequence at positions 27-131, amino acid sequence at positions 28-131, amino acid sequence at positions 29-131, amino acid sequence at positions 30-131, amino acid sequence at positions 31-131 Amino acid sequence, 32nd to 131st amino acid sequence, 33rd to 131st amino acid sequence, 34th to 1st 1st amino acid sequence, 35th to 131st amino acid sequence, 36th to 131st amino acid sequence, 37th to 131st amino acid sequence, 38th to 131st amino acid sequence, 39th to 39th amino acid sequence The 131st amino acid sequence, the 40th to 131st amino acid sequence, the 41st to 131st amino acid sequence, the 42nd to 131st amino acid sequence, the 43rd to 131st amino acid sequence, the 44th to 131st amino acid sequence 131st amino acid sequence, 45th to 131st amino acid sequence, 46th to 131st amino acid sequence, 47th to 131st amino acid sequence, 48th to 131st amino acid sequence, 49th to 49th amino acid sequence 131st amino acid sequence, 50th-131st amino acid sequence, 51st-131st amino acid sequence 52nd to 131st amino acid sequence, 53rd to 131st amino acid sequence, 54th to 131st amino acid sequence, 55th to 131st amino acid sequence, 56th to 131st amino acid sequence 57th to 131st amino acid sequence, 58th to 131st amino acid sequence, 59th to 131st amino acid sequence, 60th to 131st amino acid sequence, 61st to 131th amino acid sequence 62nd to 131st amino acid sequence, 63rd to 131st amino acid sequence, 64th to 131st amino acid sequence, 65th to 131st amino acid sequence, 66th to 131st amino acid sequence 67th to 131th amino acid sequence, 68th to 131st amino acid sequence, 69th to 131st Amino acid sequence at positions 70-131, amino acids 71-131, amino acids 72-131, amino acids 73-131, 74-131 The amino acid sequence at the 75th to 131st amino acid sequence, the amino acid sequence at the 76th to 131st amino acid sequence, the amino acid sequence at the 77th to 131st amino acid sequence, the 78th to 131st amino acid sequence, and the 79th to 131st amino acid sequence Amino acid sequence at positions 80-131, amino acids 81-131, amino acids 82-131, amino acids 83-131, 84-131 The amino acid sequence at position 85, the amino acid sequence at positions 85 to 131, the amino acid sequence at positions 86 to 131, 87th to 131st amino acid sequence, 88th to 131st amino acid sequence, 89th to 131st amino acid sequence, 90th to 131st amino acid sequence, 91st to 131st amino acid sequence, The 92nd to 131st amino acid sequence, the 93rd to 131st amino acid sequence, the 94th to 131st amino acid sequence, the 95th to 131st amino acid sequence, the 96th to 131st amino acid sequence, 97-131 amino acid sequence, 98-131 amino acid sequence, 99-131 amino acid sequence, 100-131 amino acid sequence, 101-131 amino acid sequence, 102nd to 131st amino acid sequence, 103rd to 131st amino acid sequence, 104th amino acid sequence 131st amino acid sequence, 105th to 131st amino acid sequence, 106th to 131st amino acid sequence, 107th to 131st amino acid sequence, 108th to 131st amino acid sequence, 109th to 109th amino acid sequence 131st amino acid sequence, 110th to 131st amino acid sequence, 111th to 131st amino acid sequence, 112th to 131st amino acid sequence, 113th to 131st amino acid sequence, 114th to 114th amino acid sequence 131st amino acid sequence, 115th to 131st amino acid sequence, 116th to 131st amino acid sequence, 117th to 131st amino acid sequence, 118th to 131st amino acid sequence, 119th to 119th amino acid sequence 131st amino acid sequence, 120th to 131st amino acid sequence, From the 121st to 131st amino acid sequence, the 122nd to 131st amino acid sequence, the 123rd to 131st amino acid sequence, the 124th to 131st amino acid sequence, or the 125th to 131st amino acid sequence Bovine peptide I (especially a peptide consisting of the amino acid sequence at positions 124 to 131 or the amino acid sequence at positions 125 to 131 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7).
As these peptides, C-terminal amides are preferably used.
In the present specification, the above-mentioned human, rat, mouse and bovine peptides are collectively referred to as peptides of the present invention.

本発明の分泌蛋白質または本発明のペプチド（以下、本発明のペプチドと略記する場合がある）は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなる分泌蛋白質をはじめとする、本発明のペプチドはＣ末端はカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ-）、アミド（−ＣＯＮＨ2）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ3-8シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ6-12アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ1-2アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ1-2アルキル基などのＣ7-14アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明のペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明のペプチドには、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アルカノイルなどのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アルカノイル基などのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。 The secretory protein of the present invention or the peptide of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the peptide of the present invention) has the N-terminus (amino terminus) at the left end and the C-terminus (carboxyl terminus) at the right end according to the convention of peptide labeling. .
SEQ ID NO: 1, including the secretory protein comprising the amino acid sequence represented by the peptides of the present invention is C-terminal carboxyl group (-COOH), a carboxylate (-COO -), amide (-CONH 2) or ester ( -COOR).
Here, as R in the ester, for example, a C 1-6 alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl or n-butyl, for example, a C 3-8 cycloalkyl group such as cyclopentyl and cyclohexyl, for example, phenyl , C 6-12 aryl groups such as α-naphthyl, for example, phenyl-C 1-2 alkyl groups such as benzyl and phenethyl or C 7- alkyl groups such as α-naphthyl-C 1-2 alkyl groups such as α-naphthylmethyl. In addition to 14 aralkyl groups, pivaloyloxymethyl groups and the like commonly used as oral esters are used.
When the peptide of the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) other than at the C-terminus, those in which the carboxyl group is amidated or esterified are also included in the peptide of the present invention. As the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
Furthermore, in the peptide of the present invention, the amino group of the N-terminal amino acid residue (eg, a methionine residue) has a protecting group (eg, a C 1-6 acyl such as a C 1-6 alkanoyl such as a formyl group and an acetyl group). ), N-terminal glutamyl group formed by cleavage in vivo, pyroglutamine oxidation, substituents on the side chains of amino acids in the molecule (eg, -OH, -SH, amino Group, an imidazole group, an indole group, a guanidino group, etc.) protected with a suitable protecting group (eg, a C 1-6 acyl group such as a C 1-6 alkanoyl group such as a formyl group or an acetyl group); Alternatively, a complex protein such as a so-called glycoprotein to which a sugar chain is bound is also included.

本発明のペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。以下、塩も含めて、本発明のペプチドと称する。
本発明のペプチドは、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から自体公知のペプチドの精製方法によって製造することもできるし、後述するペプチドをコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。 As a salt of the peptide of the present invention, a salt with a physiologically acceptable acid (eg, an inorganic acid or an organic acid) or a base (eg, an alkali metal salt) is used, and particularly, a physiologically acceptable acid. Addition salts are preferred. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid) Acids, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like are used. Hereinafter, the peptide of the present invention including salts is also referred to.
The peptide of the present invention can be produced from the above-mentioned human or warm-blooded animal cells or tissues by a known peptide purification method, or by culturing a transformant transformed with a DNA encoding the peptide described below. Can also be manufactured. Further, it can be produced according to the peptide synthesis method described later.
When producing from human or mammalian tissues or cells, after homogenizing human or mammalian tissues or cells, extraction is performed with an acid or the like, and the extract is subjected to chromatography such as reverse phase chromatography or ion exchange chromatography. Can be purified and isolated.

本発明のペプチドまたはそれらのアミド体の合成には、通常市販のペプチド合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２'，４'−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２'，４'−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などをあげることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするペプチドの配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的の本発明のペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、ペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ'−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。 For the synthesis of the peptide of the present invention or an amide thereof, a commercially available resin for peptide synthesis can be used. Examples of such a resin include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, and 4-hydroxymethylmethyl. Examples include phenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-hydroxymethyl) phenoxy resin, and 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-Fmocaminoethyl) phenoxy resin. it can. Using such a resin, an amino acid having an α-amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target peptide according to various condensation methods known per se. At the end of the reaction, the peptide is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed. Further, an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain a target peptide of the present invention or an amide thereof.
Regarding the condensation of the protected amino acids described above, various activating reagents that can be used for peptide synthesis can be used, and carbodiimides are particularly preferable. As the carbodiimides, DCC, N, N′-diisopropylcarbodiimide, N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminoprolyl) carbodiimide and the like are used. For activation by these, the protected amino acid was directly added to the resin together with a racemization inhibitor additive (for example, HOBt, HOOBt), or the protected amino acid was previously activated as a symmetric acid anhydride or HOBt ester or HOOBt ester. It can be added later to the resin.
The solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the peptide condensation reaction. For example, acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, alcohols such as trifluoroethanol, and dimethyl sulfoxide. Sulfoxides, ethers such as pyridine, dioxane, and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, and appropriate mixtures thereof are used. The reaction temperature is appropriately selected from a range known to be used for the peptide bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about −20 to 50 ° C. The activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess. As a result of the test using the ninhydrin reaction, when the condensation is insufficient, sufficient condensation can be performed by repeating the condensation reaction without removing the protecting group. When sufficient condensation cannot be obtained even by repeating the reaction, unreacted amino acids can be acetylated using acetic anhydride or acetylimidazole to prevent the subsequent reaction from being affected.

原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Fmocなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ1-6）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ2−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
本発明のペプチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（蛋白質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したペプチドとを製造し、この両ペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護ペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗ペプチドを得ることができる。この粗ペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の本発明のペプチドのアミド体を得ることができる。
本発明のペプチドのエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、本発明のペプチドのアミド体と同様にして、所望の本発明のペプチドのエステル体を得ることができる。 Examples of the protecting group for the amino group of the raw material include, for example, Z, Boc, t-pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Br-Z, adamantyloxycarbonyl, trifluoroacetyl , Phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like.
The carboxyl group may be, for example, a linear, branched or cyclic alkyl ester such as an alkyl esterified ester (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl). ), Aralkyl esterification (eg, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzyloxycarbonylhydrazide, t-butoxy It can be protected by carbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
The hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification. Examples of groups suitable for this esterification include lower (C 1-6 ) alkanoyl groups such as acetyl groups, aroyl groups such as benzoyl groups, and groups derived from carbonic acid such as benzyloxycarbonyl groups and ethoxycarbonyl groups. Used. Examples of a group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a t-butyl group.
As the protecting group for the phenolic hydroxyl group of tyrosine, for example, Bzl, Cl 2 -Bzl, 2-nitrobenzyl, Br-Z, t-butyl and the like are used.
As the imidazole protecting group for histidine, for example, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
Examples of the activated carboxyl group of the raw material include, for example, a corresponding acid anhydride, azide, active ester [alcohol (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4-dinitrophenol, Cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, and an ester with HOBt). As the activated amino group of the raw material, for example, a corresponding phosphoric amide is used.
As a method for removing (eliminating) the protecting group, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, trifluoromethane, etc. Acid treatment with dichloromethane, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., reduction with sodium in liquid ammonia, and the like are also used. The elimination reaction by the above-mentioned acid treatment is generally performed at a temperature of about -20 to 40 ° C. In the acid treatment, for example, anisole, phenol, thioanisole, meta-cresol, para-cresol, dimethyl sulfide, 1,4- It is effective to add a cation scavenger such as butanedithiol or 1,2-ethanedithiol. Further, the 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as an indole protecting group of tryptophan is the above 1,2-ethanedithiol, 1,4-butane. In addition to deprotection by acid treatment in the presence of dithiol or the like, it is also removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia or the like.
The protection of the functional group that should not be involved in the reaction of the raw materials, the protective group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
As another method for obtaining the amide form of the peptide of the present invention, for example, first, after amidating and protecting the α-carboxyl group of the carboxy terminal amino acid, a peptide (protein) chain is added to the amino group side to a desired chain length. After the elongation, a peptide was prepared by removing only the protecting group of the N-terminal α-amino group of the peptide chain, and a peptide was obtained by removing only the protecting group of the C-terminal carboxyl group. Condensate in a mixed solvent. Details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected peptide obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above-mentioned method to obtain a desired crude peptide. This crude peptide is purified by various known purification means, and the main fraction is freeze-dried to obtain a desired amide of the peptide of the present invention.
In order to obtain an ester of the peptide of the present invention, for example, after condensing the α-carboxyl group of the carboxy-terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, the desired amide of the peptide of the present invention can be obtained. An ester of the peptide of the present invention can be obtained.

本発明のペプチドは、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明の分泌蛋白質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明のペプチドの部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の1)〜5)に記載された方法があげられる。
1)M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド・シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
2)SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年)
3)泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）
4)矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タンパク質の化学IV、 205、(1977年)
5)矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明のペプチドまたはその部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる本発明のペプチドの部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。 The peptide of the present invention can be produced according to a peptide synthesis method known per se, or by cleaving the secretory protein of the present invention with an appropriate peptidase. As a method for synthesizing a peptide, for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, it is possible to produce a target peptide by condensing a partial peptide or amino acid that can constitute a partial peptide of the peptide of the present invention with the remaining portion, and if the product has a protecting group, removing the protecting group. it can. Known condensation methods and elimination of protecting groups include, for example, the methods described in the following 1) to 5).
1) M. Bodanszky and MA Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966)
2) Schroeder and Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965)
3) Nobuo Izumiya et al., Basics and Experiments on Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd. (1975)
4) Haruaki Yajima and Shunpei Sakakibara, Laboratory of Biochemical Experiments 1, Protein Chemistry IV, 205, (1977)
5) Supervised by Haruaki Yajima, Development of Pharmaceuticals, Vol. 14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten After the reaction, use the usual purification methods, such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization, etc. The peptide of the present invention or a partial peptide thereof can be purified and isolated in combination. When the partial peptide of the peptide of the present invention obtained by the above method is in a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, when it is obtained as a salt, it can be converted to a known salt. Can be converted to a free form or another salt by the method of or a method analogous thereto.

本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、上記した本発明のペプチドをコードする塩基配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）を含有するものであればいかなるものであってもよい。該ポリヌクレオチドとしては、本発明のペプチドをコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡであり、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（すなわち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（すなわち、非コード鎖）であってもよい。
本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いて、例えば、公知の実験医学増刊「新ＰＣＲとその応用」１５（７）、１９９７記載の方法またはそれに準じた方法により、本発明のペプチドのｍＲＮＡを定量することができる。 The polynucleotide encoding the peptide of the present invention may be any polynucleotide containing a base sequence (DNA or RNA, preferably DNA) encoding the peptide of the present invention. The polynucleotide is RNA such as DNA or mRNA encoding the peptide of the present invention, and may be double-stranded or single-stranded. In the case of double-stranded, it may be double-stranded DNA, double-stranded RNA or DNA: RNA hybrid. In the case of a single strand, it may be a sense strand (ie, a coding strand) or an antisense strand (ie, a non-coding strand).
Using the polynucleotide encoding the peptide of the present invention, for example, the mRNA of the peptide of the present invention can be obtained by the method described in the well-known experimental medicine special edition “New PCR and its Applications” 15 (7), 1997 or a method analogous thereto. It can be quantified.

本発明のペプチドをコードするＤＮＡとしては、前述した本発明のペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ-ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。 The DNA encoding the peptide of the present invention may be any DNA containing the above-described nucleotide sequence encoding the peptide of the present invention. In addition, any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the aforementioned cells / tissues, cDNA library derived from the aforementioned cells / tissues, and synthetic DNA may be used.
The vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, amplification can be performed directly by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR) using a total RNA or mRNA fraction prepared from the cells and tissues described above.

本願明細書において、塩基配列Ｐとは、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６および配列番号：８から選ばれる１つの配列番号で表される塩基配列を示す。
本願明細書において、塩基配列Ｑとは、以下の４種類の塩基配列から選ばれる１つの塩基配列を示す。
（１）配列番号：２で表わされる塩基配列の第５５番目〜４０８番目の塩基配列、
（２）配列番号：４で表わされる塩基配列の第５２番目〜３７２番目の塩基配列、
（３）配列番号：６で表わされる塩基配列の第５２番目〜３７２番目の塩基配列、
（４）配列番号：８で表わされる塩基配列の第５２番目〜４０２番目の塩基配列。
本発明の分泌蛋白質をコードするＤＮＡとしては、例えば、塩基配列ＰまたはＱを含有するＤＮＡの塩基配列を有するＤＮＡ、または塩基配列ＰまたはＱとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、本発明の分泌蛋白質と実質的に同質の活性を有する分泌蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
塩基配列ＰまたはＱとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列としては、例えば、塩基配列ＰまたはＱと約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などが用いられる。
塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。 In the present specification, the nucleotide sequence P indicates a nucleotide sequence represented by one SEQ ID NO selected from SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, and SEQ ID NO: 8.
In the present specification, the base sequence Q indicates one base sequence selected from the following four types of base sequences.
(1) the 55th to 408th base sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2,
(2) the 52nd to 372nd nucleotide sequence of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4,
(3) the 52nd to 372nd nucleotide sequence of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6,
(4) The 52nd to 402nd nucleotide sequence of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8.
As the DNA encoding the secretory protein of the present invention, for example, a DNA having a nucleotide sequence of a DNA containing the nucleotide sequence P or Q, or a nucleotide sequence that hybridizes with the nucleotide sequence P or Q under high stringency conditions For example, DNAs containing the base sequence of a DNA encoding the secretory protein having the same activity as the secretory protein of the present invention may be used.
Examples of the base sequence capable of hybridizing with the base sequence P or Q under high stringency conditions include, for example, about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably 70% or more, and more preferably the base sequence P or Q. A nucleotide sequence having a homology of about 80% or more, more preferably about 90% or more, most preferably about 95% or more is used.
The homology of the nucleotide sequences was determined using the homology calculation algorithm NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) under the following conditions (expected value = 10; gap allowed; filtering = ON; match score = 1; Mismatch score = −3).
Hybridization can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). . When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be carried out under high stringent conditions.
The high stringent conditions are, for example, conditions in which the sodium concentration is about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and the temperature is about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 65 ° C. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C. is most preferable.

より具体的には、
(１)配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるヒト型分泌蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２で表わされる塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。
(２)配列番号：３で表わされるアミノ酸配列からなるラット型分泌蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：４で表わされる塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。
(３)配列番号：５で表わされるアミノ酸配列からなるマウス型分泌蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：６で表わされる塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。
(４)配列番号：７で表わされるアミノ酸配列からなるウシ型分泌蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：８で表わされる塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。
（５）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第１９番目〜１３６番目のアミノ酸配列からなるヒト型分泌蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２で表わされる塩基配列の第５５番目〜４０８番目の塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。
（６）配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第１８番目〜１２４番目のアミノ酸配列からなるラット型分泌蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：４で表わされる塩基配列の第５２番目〜３７２番目の塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。
（７）配列番号：５で表わされるアミノ酸配列の第１８番目〜１２４番目のアミノ酸配列からなるマウス型分泌蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：６で表わされる塩基配列の第５２番目〜３７２番目の塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。
（８）配列番号：７で表わされるアミノ酸配列の第１８番目〜１３４番目のアミノ酸配列からなるウシ型分泌蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：８で表わされる塩基配列の第５２番目〜４０２番目の塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。 More specifically,
(1) As the DNA encoding the human secretory protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the like is used.
(2) As the DNA encoding the rat secretory protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, a DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 or the like is used.
(3) As the DNA encoding the mouse secretory protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, a DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 and the like are used.
(4) As the DNA encoding the bovine secretory protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, a DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 and the like are used.
(5) As a DNA encoding a human secretory protein consisting of the 19th to 136th amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, the 55th to 408th nucleotides of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 For example, a DNA consisting of the base sequence is used.
(6) The DNA encoding the rat secretory protein consisting of the 18th to 124th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is the 52nd to 372th nucleotide of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4. For example, a DNA consisting of the base sequence is used.
(7) As the DNA encoding the mouse secretory protein consisting of the 18th to 124th amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, the 52nd to 372th nucleotides of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 For example, a DNA consisting of the base sequence is used.
(8) The DNA encoding the bovine secretory protein consisting of the 18th to 134th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 is the 52nd to 402th nucleotide of the base sequence represented by SEQ ID NO: 8. For example, a DNA consisting of the base sequence is used.

本願明細書において、塩基配列Ｒとは、以下の１０種類の塩基配列から選ばれる１つの塩基配列を示す。
（１）1)配列番号：２で表わされる塩基配列の第７６番目〜２６４番目の塩基配列、
2)配列番号：２で表わされる塩基配列の第２３８番目〜２６４番目の塩基配列、
3)配列番号：２で表わされる塩基配列の第２７１番目〜３９９番目の塩基配列、
4)配列番号：２で表わされる塩基配列の第３７９番目〜３９９番目の塩基配列、
（２）1)配列番号：４で表わされる塩基配列の第３４３番目〜３６６番目の塩基配列、
2)配列番号：４で表わされる塩基配列の第３４６番目〜３６６番目の塩基配列、
（３）1)配列番号：６で表わされる塩基配列の第３４３番目〜３６６番目の塩基配列、
2)配列番号：６で表わされる塩基配列の第３４６番目〜３６６番目の塩基配列、
（４）1)配列番号：８で表わされる塩基配列の第３７０番目〜３９３番目の塩基配列、
2)配列番号：８で表わされる塩基配列の第３７３番目〜３９３番目の塩基配列。
本発明のペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば塩基配列Ｒとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、本発明のペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡなどであれば何れのものでもよい。
塩基配列Ｒとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列としては、例えば、塩基配列Ｒと約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などが用いられる。
塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。 In the present specification, the base sequence R indicates one base sequence selected from the following ten types of base sequences.
(1) 1) the 76th to 264th base sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2,
2) the 238th to 264th base sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2,
3) the 271st to 399th base sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2,
4) the 379th to 399th base sequences of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2,
(2) 1) the 343rd to 366th nucleotide sequence of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4,
2) the 346th to 366th base sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4;
(3) 1) the 343rd to 366th base sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6,
2) the 346th to 366th nucleotide sequence of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6,
(4) 1) the 370th to 393rd base sequences of the base sequence represented by SEQ ID NO: 8,
2) The 373rd to 393rd base sequences of the base sequence represented by SEQ ID NO: 8.
Examples of the DNA encoding the peptide of the present invention include, for example, a DNA containing a nucleotide sequence that hybridizes with the nucleotide sequence R under high stringency conditions and encoding a peptide having substantially the same activity as the peptide of the present invention. Any one may be used as long as it is the same.
Examples of a base sequence that can hybridize with the base sequence R under high stringency conditions include, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and still more preferably about 95% or more. For example, a base sequence having homology of at least% is used.
The homology of the nucleotide sequences was determined using the homology calculation algorithm NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) under the following conditions (expected value = 10; gap allowed; filtering = ON; match score = 1; Mismatch score = −3).
The same hybridization method and high stringency conditions as described above are used.

より具体的には、
（１）（i）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第２６番目〜８８番目のアミノ酸配列からなるヒト型ペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２で表わされる塩基配列の第７６番目〜２６４番目の塩基配列からなるＤＮＡなどが、
（ii）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第８０番目〜８８番目のアミノ酸配列からなるヒト型ペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２で表わされる塩基配列の第２３８番目〜２６４番目の塩基配列からなるＤＮＡなどが、
（iii）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第９１番目〜１３３番目のアミノ酸配列からなるヒト型ペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２で表わされる塩基配列の第２７１番目〜３９９番目の塩基配列からなるＤＮＡなどが、
（iv）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第１２７番目〜１３３番目のアミノ酸配列からなるヒト型ペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２で表わされる塩基配列の第３７９番目〜３９９番目の塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。
（２）（i）配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第１１５番目〜１２２番目のアミノ酸配列からなるラット型ペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：４で表わされる塩基配列の第３４３番目〜３６６番目の塩基配列からなるＤＮＡなどが、
（ii）配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第１１６番目〜１２２番目のアミノ酸配列からなるラット型ペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：４で表わされる塩基配列の第３４６番目〜３６６番目の塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。
（３）（i）配列番号：５で表わされるアミノ酸配列の第１１５番目〜１２２番目のアミノ酸配列からなるマウス型ペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：６で表わされる塩基配列の第３４３番目〜３６６番目の塩基配列からなるＤＮＡなどが、
（ii）配列番号：５で表わされるアミノ酸配列の第１１６番目〜１２２番目のアミノ酸配列からなるマウス型ペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：６で表わされる塩基配列の第３４６番目〜３６６番目の塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。
（４）（i）配列番号：８で表わされるアミノ酸配列の第１２４番目〜１３１番目のアミノ酸配列からなるウシ型ペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：８で表わされる塩基配列の第３７０番目〜３９３番目の塩基配列からなるＤＮＡなどが、
（ii）配列番号：８で表わされるアミノ酸配列の第１２５番目〜１３１番目のアミノ酸配列からなるウシ型ペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：８で表わされる塩基配列の第３７３番目〜３９３番目の塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。 More specifically,
(1) (i) As a DNA encoding a human peptide consisting of the amino acid sequence at positions 26 to 88 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, the DNA encoding the human type peptide represented by SEQ ID NO: 2 DNA consisting of the -264th base sequence,
(Ii) As a DNA encoding a human peptide consisting of the amino acid sequence at positions 80 to 88 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 238 to 264 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 DNA consisting of the base sequence of
(Iii) DNA encoding a human peptide consisting of the 91st to 133rd amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 includes the 271st to 399th amino acids of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 DNA consisting of the base sequence of
(Iv) As DNA encoding a human peptide consisting of the 127th to 133rd amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, the 379th to 399th nucleotides of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 And the like having a base sequence of
(2) (i) The DNA encoding the rat peptide consisting of the 115th to 122nd amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is the 343rd amino acid sequence of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4. DNA consisting of the ~ 366th base sequence,
(Ii) DNA encoding a rat peptide consisting of the amino acid sequence at positions 116 to 122 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 includes the 346th position to 366th position of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 And the like having a base sequence of
(3) (i) As a DNA encoding a mouse-type peptide consisting of the 115th to 122nd amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, the 343rd nucleotide of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 DNA consisting of the ~ 366th base sequence,
(Ii) DNA encoding a mouse-type peptide consisting of the amino acid sequence at positions 116 to 122 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 includes the 346th position to 366th position of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 And the like having a base sequence of
(4) (i) The DNA encoding the bovine peptide consisting of the 124th to 131st amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 is the 370th nucleotide of the base sequence represented by SEQ ID NO: 8. DNA consisting of the 393rd base sequence, etc.
(Ii) As DNA encoding a bovine peptide consisting of the 125th to 131st amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, the 373rd to 393rd nucleotides of the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 And the like having a base sequence of

本発明のペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列の一部、または該ＤＮＡと相補的な塩基配列の一部を含有してなるポリヌクレオチドとは、本発明のペプチドをコードするＤＮＡを包含するだけではなく、ＲＮＡをも包含する意味で用いられる。
本発明に従えば、本発明のペプチド遺伝子の複製または発現を阻害することのできるアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）を、クローン化した、あるいは決定された本発明のペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうしたポリヌクレオチド（核酸）は、本発明のペプチド遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成または機能を阻害することができるか、あるいは本発明のペプチド関連ＲＮＡとの相互作用を介して本発明のペプチド遺伝子の発現を調節・制御することができる。本発明のペプチド関連ＲＮＡの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、および本発明のペプチド関連ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内および生体外で本発明のペプチド遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列または核酸とペプチド（蛋白質）との間で「対応する」とは、ヌクレオチド（核酸）の配列またはその相補体から誘導される指令にあるペプチド（蛋白質）のアミノ酸を通常指している。本発明のペプチド遺伝子の５'端ヘアピンループ、５'端６−ベースペア・リピート、５'端非翻訳領域、ペプチド翻訳開始コドン、蛋白質コード領域、ＯＲＦ翻訳終止コドン、３'端非翻訳領域、３'端パリンドローム領域、および３'端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、本発明のペプチド遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。 A polynucleotide comprising a part of the base sequence of the DNA encoding the peptide of the present invention or a part of the base sequence complementary to the DNA is not limited to including the DNA encoding the peptide of the present invention. But also used to include RNA.
According to the present invention, an antisense polynucleotide (nucleic acid) capable of inhibiting the replication or expression of the peptide gene of the present invention has been cloned or determined. It can be designed and synthesized based on information. Such a polynucleotide (nucleic acid) can hybridize with the RNA of the peptide gene of the present invention and inhibit the synthesis or function of the RNA, or through the interaction with the peptide-related RNA of the present invention. Thus, the expression of the peptide gene of the present invention can be regulated and controlled. Polynucleotides that are complementary to the selected sequence of the peptide-related RNA of the present invention, and that can specifically hybridize with the peptide-related RNA of the present invention, can be used in vivo and in vitro to produce the peptide gene of the present invention. It is useful for regulating and controlling the expression of, and also useful for treating or diagnosing diseases and the like. The term "corresponding" means having homology or being complementary to a specific sequence of nucleotides, base sequences or nucleic acids including genes. "Corresponding" between a nucleotide, base sequence or nucleic acid and a peptide (protein) usually refers to the amino acid of the peptide (protein) as directed by the nucleotide (nucleic acid) sequence or its complement. . 5′-end hairpin loop, 5′-end 6-base pair repeat, 5′-end untranslated region, peptide translation initiation codon, protein coding region, ORF translation termination codon, 3′-end untranslated region of the peptide gene of the present invention, The 3'-end palindrome region and the 3'-end hairpin loop can be selected as preferred target regions, but any region within the peptide gene of the present invention can be selected as a target.

目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、対象物と「アンチセンス」であるということができる。アンチセンス・ポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリデオキシリボヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販の蛋白質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えば蛋白質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、プソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。   The relationship between the target nucleic acid and a polynucleotide that is complementary to at least a part of the target region and can hybridize can be said to be “antisense” with the target. Antisense polynucleotides include polydeoxyribonucleotides containing 2-deoxy-D-ribose, polyribonucleotides containing D-ribose, N-glycosides of purine or pyrimidine bases and other types of polynucleotides. Other polymers with nucleotides or non-nucleotide backbones (eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers) or other polymers containing special bonds, provided that the polymers are found in DNA or RNA Base pairs and nucleotides having a configuration that allows base attachment). They can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and also DNA: RNA hybrids, and can be unmodified polynucleotides (or unmodified oligonucleotides), or even known. Such as labeled, capped, methylated, one or more naturally-occurring nucleotides replaced by analogs, intramolecular nucleotides Modified, such as those having uncharged bonds (eg, methylphosphonates, phosphotriesters, phosphoramidates, carbamates, etc.), charged or sulfur-containing bonds (eg, phosphorothioates, phosphorodithioates, etc.) ), Such as proteins (nucleases, nuclease inhibitors, toxic , Antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.) or sugars (for example, monosaccharides) having side chain groups, interacting compounds (for example, acridine, psoralen, etc.), chelates Those containing compounds (eg, metals, radioactive metals, boron, oxidizing metals, etc.), those containing alkylating agents, those having modified bonds (eg, α-anomeric nucleic acids, etc.) It may be. Here, "nucleoside", "nucleotide", and "nucleic acid" may include not only those containing purine and pyrimidine bases but also those having other modified heterocyclic bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles. Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, e.g., where one or more hydroxyl groups have been replaced by halogens, aliphatic groups, etc., or by functional groups such as ethers, amines, etc. It may have been converted.

本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。
こうして修飾は当該分野で数多く知られており、例えば J. Kawakami et al., Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp.247, 1992; Vol. 8, pp.395, 1992; S. T. Crooke et al. ed., Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993 などに開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３'端あるいは５'端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３'端あるいは５'端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいは本発明のペプチドの生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸それ自体公知の各種の方法で細胞に適用できる。 The antisense polynucleotide (nucleic acid) of the present invention is RNA, DNA, or a modified nucleic acid (RNA, DNA). Specific examples of the modified nucleic acid include, but are not limited to, sulfur derivatives and thiophosphate derivatives of nucleic acids, and those that are resistant to degradation of polynucleoside amides and oligonucleoside amides. The antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed according to the following policy. That is, to make the antisense nucleic acid more stable in the cell, to make the antisense nucleic acid more cell permeable, to have a greater affinity for the target sense strand, and to be more toxic if it is toxic. Minimize the toxicity of sense nucleic acids.
Thus, many modifications are known in the art, for example, J. Kawakami et al., Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp. 247, 1992; Vol. 8, pp. 395, 1992; ST Crooke et al. Ed. , Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993.
The antisense nucleic acid of the present invention may contain altered or modified sugars, bases or bonds, may be provided in a special form such as liposomes or microspheres, may be applied by gene therapy, It could be provided in an added form. Thus, in the form of addition, polycations such as polylysine which acts to neutralize the charge of the phosphate skeleton, lipids which enhance the interaction with the cell membrane or increase the uptake of nucleic acids ( For example, hydrophobic substances such as phospholipid and cholesterol can be mentioned. Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chloroformate, cholic acid, etc.). These can be attached to the 3 'end or 5' end of the nucleic acid, and can be attached via a base, sugar, or intramolecular nucleoside bond. Other groups include cap groups specifically arranged at the 3 ′ end or 5 ′ end of a nucleic acid for preventing degradation by nucleases such as exonuclease and RNase. Such capping groups include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
The inhibitory activity of the antisense nucleic acid can be examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of the peptide of the present invention. The nucleic acid can be applied to cells by various methods known per se.

本発明のペプチドをコードするＤＮＡは、自体公知の方法で標識化されていてもよく、具体的にはアイソトープラベル化されたもの、蛍光標識されたもの（例えば、フルオレセインなどによる蛍光標識）、ビオチン化されたものまたは酵素標識されたものなどがあげられる。
本発明のペプチドを完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のペプチドの部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いて自体公知のＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のペプチドの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。 The DNA encoding the peptide of the present invention may be labeled by a method known per se, and specifically, isotope-labeled DNA, fluorescently-labeled DNA (eg, fluorescent labeling with fluorescein, etc.), biotin And those labeled with an enzyme.
As a means for cloning the DNA completely encoding the peptide of the present invention, the DNA was amplified by a known PCR method using a synthetic DNA primer having a partial nucleotide sequence of the peptide of the present invention, or incorporated into an appropriate vector. The DNA can be selected by hybridization with a DNA fragment encoding a part or all of the peptide of the present invention or labeled with a synthetic DNA. Hybridization can be performed, for example, according to the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.

ＤＮＡの塩基配列の変換は、公知のキット、例えば、MutanTM-super Express Km（宝酒造（株））、MutanTM-K（宝酒造（株））等を用いて、ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化されたペプチドをコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５'末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３'末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のペプチドの発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のペプチドをコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＩＶ・ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどがあげられる。 The DNA base sequence can be converted using a known kit, for example, Mutan ™ -super Express Km (Takara Shuzo), Mutan ™ -K (Takara Shuzo), ODA-LA PCR, Gapped duplex. The method can be carried out according to a method known per se, such as the method or the Kunkel method, or a method analogous thereto.
The DNA encoding the cloned peptide can be used as it is depending on the purpose, or can be used after digesting with a restriction enzyme or adding a linker, if desired. The DNA may have ATG as a translation initiation codon at the 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at the 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
For the expression vector of the peptide of the present invention, for example, (a) a target DNA fragment is excised from DNA encoding the peptide of the present invention, and (b) the DNA fragment is ligated downstream of a promoter in an appropriate expression vector. It can be manufactured by the following.
Examples of the vector include Escherichia coli-derived plasmids (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5, pC194), yeast-derived plasmids (eg, pSH19, pSH15), λ phage and the like. In addition to animal viruses such as bacteriophage, retrovirus, vaccinia virus, and baculovirus, pA1-11, pXT1, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNAI / Neo, and the like are used.
The promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression. For example, when animal cells are used as a host, SRα promoter, SV40 promoter, HIV / LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned.

これらのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰLプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等があげられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のペプチドのＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、PhoＡ・シグナル配列、OmpＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のペプチドをコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。 Of these, it is preferable to use a CMV (cytomegalovirus) promoter, SRα promoter, or the like. When the host is Escherichia, trp promoter, lac promoter, recA promoter, λPL promoter, lpp promoter, T7 promoter, etc., and when the host is Bacillus, SPO1 promoter, SPO2 promoter, penP promoter, etc. When the host is yeast, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like are preferable. When the host is an insect cell, a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferable.
In addition to the above, an expression vector containing an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), and the like may be used, if desired. it can. Examples of selectable markers include a dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene [methotrexate (MTX) resistance], an ampicillin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Ampr), a neomycin resistance gene ( Hereinafter, G418 resistance), which may be abbreviated as Neor, may be mentioned. In particular, when the dhfr gene is used as a selection marker using dhfr gene-deficient Chinese hamster cells, the target gene can also be selected using a thymidine-free medium.
If necessary, a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the peptide of the present invention. When the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, a PhoA signal sequence, an OmpA signal sequence, or the like is used. In some cases, MFα signal sequence, SUC2 signal sequence, etc., and when the host is an animal cell, insulin signal sequence, α-interferon signal sequence, antibody molecule, signal sequence, etc. can be used.
Using the vector containing the DNA encoding the peptide of the present invention thus constructed, a transformant can be produced.
As the host, for example, Escherichia, Bacillus, yeast, insect cells, insects, animal cells and the like are used.

エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６０巻，１６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research），９巻，３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biology），１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア パストリス（Pichia pastoris）ＫＭ７１などが用いられる。 Specific examples of the genus Escherichia include, for example, Escherichia coli K12 DH1 [Processings of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 60, 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology (Journal of Molecular Biology)]. Biology, 120, 517 (1978)], HB101 [Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)], etc. Used.
Examples of Bacillus bacteria include, for example, Bacillus subtilis MI114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)]. )] Is used.
Examples of yeast include Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) AH22, AH22R - , NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe (Schizosaccharomyces pombe) NCYC1913, NCYC2036, such as Pichia pastoris (Pichia pastoris) KM71 is Used.

昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N 細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In Vivo）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８５)〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７（ＣＯＳ７），Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６９巻，２１１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１９８２)などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９７９)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７５巻，１９２９(１９７８)などに記載の方法に従って行なうことができる。 Insect cells include, for example, when the virus is AcNPV, a cell line derived from a larva of night roth moth (Spodoptera frugiperda cell; Sf cell), MG1 cells derived from the midgut of Trichoplusia ni, and High Five ™ derived from eggs of Trichoplusia ni. Cells, cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea are used. When the virus is BmNPV, a silkworm-derived cell line (Bombyx mori N cell; BmN cell) or the like is used. As the Sf cells, for example, Sf9 cells (ATCC CRL 1711), Sf21 cells (Vaughn, JL et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)) and the like are used.
As the insect, for example, a silkworm larva is used [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
Examples of animal cells include monkey cells COS-7 (COS7), Vero, Chinese hamster cells CHO (hereinafter abbreviated as CHO cells), and dhfr gene-deficient Chinese hamster cells CHO (hereinafter abbreviated as CHO (dhfr − ) cells). , Mouse L cells, mouse AtT-20, mouse myeloma cells, rat GH3, human FL cells, and the like.
In order to transform Escherichia, for example, Procagings of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 69, 2110 ( 1972) and Gene, Vol. 17, 107 (1982).
Transformation of Bacillus spp. Can be performed, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, Vol. 168, 111 (1979).
To transform yeast, for example, Methods in Enzymology, 194, 182-187 (1991), Proceedings of the National Academy of Sciences of Science -The USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 75, 1929 (1978).

昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）, 6, 47-55(1988)などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８ 新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、ペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがあげられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal of Experiments in Molecular Genetics），４３１−４３３，Cold Spring Harbor LaboHumanory, New York １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。 Insect cells or insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
To transform animal cells, for example, see Cell Engineering Separate Volume 8, New Cell Engineering Experiment Protocol. 263-267 (1995) (published by Shujunsha) and Virology, Vol. 52, 456 (1973).
Thus, a transformant transformed with the expression vector containing the DNA encoding the peptide can be obtained.
When culturing a transformant whose host is a genus Escherichia or Bacillus, a liquid medium is suitable as a medium used for the culturing, and among them, a carbon source necessary for growth of the transformant, Nitrogen sources, inorganic substances, etc. are contained. As a carbon source, for example, glucose, dextrin, soluble starch, sucrose, etc., as a nitrogen source, for example, ammonium salts, nitrates, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, potato extract and the like Examples of the inorganic or organic substance and the inorganic substance include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride. In addition, yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added. The pH of the medium is preferably about 5 to 8.
As a medium for culturing the genus Escherichia, for example, an M9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics] 431-433, Cold Spring Harbor Labo Human, New York 1972]. If necessary, an agent such as 3β-indolylacrylic acid can be added in order to make the promoter work efficiently.

宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７７巻，４５０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），８１巻，５３３０（１９８４）〕があげられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(1962)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The Journal of the American Medical Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding of the Society for the Biological Medicine），７３巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外などに本発明のペプチドを生成せしめることができる。
上記培養物から本発明のペプチドを分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。 When the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, the cultivation is usually performed at about 15 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be added.
When the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, the cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
When culturing a transformant in which the host is yeast, as a medium, for example, Burkholder's minimal medium [Bostian, KL et al., Processings of the National Academy of Sciences of Science Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)] and an SD medium containing 0.5% casamino acid [Bitter, GA et al., Processings of the National. -Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 81, 5330 (1984)]. Preferably, the pH of the medium is adjusted to about 5-8. The cultivation is usually performed at about 20 to 35 ° C. for about 24 to 72 hours, and aeration and / or agitation are added as necessary.
When culturing an insect cell or a transformant whose host is an insect, 10% bovine serum immobilized in Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195,788 (1962)) is added as a medium. What added the thing suitably is used. The pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. The cultivation is usually performed at about 27 ° C. for about 3 to 5 days, and if necessary, aeration and / or agitation are added.
When culturing a transformant in which the host is an animal cell, examples of the medium include MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, Vol. 122, 501 (1952)], DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, Vol. 73, 1 (1950)] and the like are used. Preferably, the pH is between about 6 and 8. The cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 15 to 60 hours, and if necessary, aeration and stirring are added.
As described above, the peptide of the present invention can be produced in the cells of the transformant, in the cell membrane or outside the cells.
The peptide of the present invention can be separated and purified from the above culture by, for example, the following method.

本発明のペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により本発明のペプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にペプチドが分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる本発明のペプチドの精製は、自体公知の分離・精製法を適宜組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
かくして得られる本発明のペプチドが遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生する本発明のペプチドを、精製前または精製後に適当な蛋白質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。 When extracting the peptide of the present invention from the cultured cells or cells, after the culture, the cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasonic wave, lysozyme, and / or freeze-thawing. After the cells or cells are destroyed by the method described above, a method of obtaining a crude extract of the peptide of the present invention by centrifugation or filtration is used as appropriate. The buffer may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 ™ . When the peptide is secreted into the culture solution, after the culture, the supernatant is separated from the cells or cells by a method known per se, and the supernatant is collected.
Purification of the peptide of the present invention contained in the thus obtained culture supernatant or extract can be carried out by appropriately combining known separation and purification methods. These known separation and purification methods include methods utilizing solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, mainly molecular weight. Method using difference in charge, method using charge difference such as ion exchange chromatography, method using specific affinity such as affinity chromatography, and use of difference in hydrophobicity such as reverse phase high performance liquid chromatography A method utilizing a difference between isoelectric points, such as an isoelectric focusing method, is used.
When the peptide of the present invention thus obtained is obtained in a free form, it can be converted to a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, when the peptide is obtained as a salt, a method known per se or The compound can be converted into a free form or another salt by an analogous method.
The peptide of the present invention produced by the recombinant can be arbitrarily modified or partially removed by applying an appropriate protein-modifying enzyme before or after purification. As the protein modifying enzyme, for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.

本発明のペプチドに対する抗体（以下、単に本発明の抗体と称する場合がある）は、本発明のペプチドに対する抗体を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明のペプチドに対する抗体は、本発明のペプチドを抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。 The antibody against the peptide of the present invention (hereinafter sometimes simply referred to as the antibody of the present invention) may be any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody as long as it can recognize the antibody against the peptide of the present invention.
An antibody against the peptide of the present invention can be produced using the peptide of the present invention as an antigen, according to a method for producing an antibody or antiserum known per se.

〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のペプチドは、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリがあげられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化ペプチドと抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature）、256、495 (1975)〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウイルスなどがあげられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄腫細胞があげられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、ペプチド（蛋白質）抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したペプチドを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などがあげられる。
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。 [Preparation of monoclonal antibody]
(A) Preparation of Monoclonal Antibody-Producing Cell The peptide of the present invention is administered to a warm-blooded animal at a site capable of producing an antibody by administration, itself or together with a carrier and a diluent. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. The administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times. Examples of the warm-blooded animal used include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and chickens, and mice and rats are preferably used.
When producing monoclonal antibody-producing cells, a warm-blooded animal immunized with an antigen, for example, an individual having an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization and contained therein. By fusing the antibody-producing cells thus obtained with myeloma cells of the same or different species, a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared. The antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting a labeled peptide described below with the antiserum, and then measuring the activity of a labeling agent bound to the antibody. The fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Kohler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)]. Examples of the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but PEG is preferably used.
Examples of myeloma cells include myeloma cells of warm-blooded animals such as NS-1, P3U1, SP2 / 0, and AP-1, but P3U1 is preferably used. The preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is added at a concentration of about 10 to 80%. By incubating at 20 to 40 ° C, preferably 30 to 37 ° C for 1 to 10 minutes, cell fusion can be carried out efficiently.
Various methods can be used to screen for monoclonal antibody-producing hybridomas. For example, a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, microplate) on which a peptide (protein) antigen is adsorbed directly or together with a carrier, and then A method for detecting a monoclonal antibody bound to a solid phase by adding an anti-immunoglobulin antibody labeled with a radioactive substance, an enzyme, or the like (an anti-mouse immunoglobulin antibody is used when the cells used for cell fusion are mice) or protein A A method in which a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase on which an anti-immunoglobulin antibody or protein A is adsorbed, a peptide labeled with a radioactive substance, an enzyme, or the like is added, and a monoclonal antibody bound to the solid phase is detected. .
Selection of the monoclonal antibody can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto. Usually, it can be performed in a medium for animal cells to which HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) is added. As a selection and breeding medium, any medium can be used as long as the hybridoma can grow. For example, RPMI 1640 medium containing 1-20%, preferably 10-20% fetal calf serum, GIT medium containing 1-10% fetal calf serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) or serum-free for hybridoma culture A culture medium (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) or the like can be used. The culturing temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C. The culturing time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks. The culture can be usually performed under 5% carbon dioxide gas. The antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.

（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。 (B) Purification of monoclonal antibody Monoclonal antibody can be separated and purified by a method known per se, for example, an immunoglobulin separation and purification method [eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchange method Absorption / desorption method using body (eg, DEAE), ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or specific antibody that collects only antibody by active adsorbent such as protein A or protein G, and dissociates the bond to obtain antibody Purification method].

〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（ペプチド抗原）自体、あるいはそれとキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のペプチドに対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。 (Preparation of polyclonal antibody)
The polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto. For example, an immunizing antigen (peptide antigen) itself or a complex thereof with a carrier protein is formed, and immunization is performed on a warm-blooded animal in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody. It can be produced by collecting a substance and separating and purifying the antibody.
Regarding the complex of an immunizing antigen and a carrier protein used to immunize a warm-blooded animal, the type of the carrier protein and the mixing ratio of the carrier and the hapten are such that the antibody is efficiently cross-linked to the hapten immunized by crosslinking the carrier. If possible, any material may be cross-linked at any ratio. For example, bovine serum albumin, bovine thyroglobulin, hemocyanin, etc. are used in a weight ratio of about 0.1 to 20, preferably about 1 to 20, relative to hapten 1. A method of coupling at a rate of ~ 5 is used.
Various coupling agents can be used for coupling the hapten and the carrier. For example, glutaraldehyde, carbodiimide, a maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithioviridyl group, or the like is used.
The condensation product is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier or diluent at a site where antibody production is possible. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. Administration is usually performed once every about 2 to 6 weeks, about 3 to 10 times in total.
The polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, or the like, preferably from the blood of a warm-blooded animal immunized by the above method.
The measurement of the polyclonal antibody titer in the antiserum can be performed in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above. The separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same immunoglobulin separation and purification method as the above-mentioned separation and purification of the monoclonal antibody.

本発明のペプチドをコードするＤＮＡ（以下、これらのＤＮＡを本発明のＤＮＡと略記する場合がある）に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスＤＮＡ（以下、これらのＤＮＡをアンチセンスＤＮＡと略記する場合がある）としては、本発明のＤＮＡに相補的な、または実質的に相補的な塩基配列を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスＤＮＡであってもよい。
本発明のＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基配列（すなわち、本発明のＤＮＡの相補鎖）の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などがあげられる。特に、本発明のＤＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、本発明のペプチドのＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスＤＮＡが好適である。これらのアンチセンスＤＮＡは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
以下に、1)本発明のペプチド、2)本発明のＤＮＡ、3)本発明の抗体、および4)アンチセンスＤＮＡの用途を説明する。 An antisense DNA having a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to DNA encoding the peptide of the present invention (hereinafter, these DNAs may be abbreviated as the DNA of the present invention) DNA may be abbreviated as antisense DNA), which has a base sequence complementary to or substantially complementary to the DNA of the present invention, and has an action capable of suppressing the expression of the DNA. Any antisense DNA may be used.
The nucleotide sequence substantially complementary to the DNA of the present invention is, for example, about 70% of the total nucleotide sequence or a partial nucleotide sequence of the nucleotide sequence complementary to the DNA of the present invention (that is, the complementary strand of the DNA of the present invention). % Or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more. In particular, of the entire base sequence of the complementary strand of the DNA of the present invention, the base sequence of the portion encoding the N-terminal portion of the peptide of the present invention (for example, a base sequence near the start codon and the like) is at least about 70% or more. An antisense DNA having a homology of preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more is suitable. These antisense DNAs can be produced using a known DNA synthesizer or the like.
The use of 1) the peptide of the present invention, 2) the DNA of the present invention, 3) the antibody of the present invention, and 4) the use of antisense DNA will be described below.

（１）本発明のペプチドが関与する各種疾病の治療・予防剤
本発明のペプチドおよびそれをコードするＤＮＡは、安全で低毒性な医薬、例えば、副腎皮質ホルモン分泌調節剤、好ましくは副腎皮質ホルモン分泌促進剤として有用である。
副腎皮質ホルモンとしては、アルドステロン、デオキシコルチコステロンなどの鉱質コルチコイドやコルチコステロン、コルチゾール、コルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾンなどの糖質コルチコイドなどが挙げられ、なかでもコルチコステロン、アルドステロンが好ましい。
また、本発明のペプチドおよびそれをコードするＤＮＡは、例えば、低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛み、肥満などの予防・治療剤として有用である。
さらに、本発明のペプチドおよびそれをコードするＤＮＡは、安全で低毒性な医薬、例えば、男性ホルモン分泌調節剤、好ましくは男性ホルモン分泌促進剤として有用である。
男性ホルモンとしては、テストステロンが挙げられる。
また、本発明のペプチドおよびそれをコードするＤＮＡは、例えば、男性性腺機能不全、造精機能障害に伴う男子不妊症、再生不良性貧血、骨髄線維症、腎性貧血、末期女性性器癌の疼痛緩和、乳癌（例、手術不能乳癌）、乳腺症、乳腺腫瘍、女性化乳房などの予防・治療剤として有用である。 (1) Therapeutic / prophylactic agent for various diseases related to the peptide of the present invention The peptide of the present invention and a DNA encoding the same are safe and low toxic pharmaceuticals, for example, a corticosteroid secretion regulator, preferably a corticosteroid Useful as a secretagogue.
Examples of corticosteroids include mineral corticoids such as aldosterone and deoxycorticosterone, and glucocorticoids such as corticosterone, cortisol, cortisone and hydrocortisone butyrate. Among them, corticosterone and aldosterone are preferable.
Further, the peptide of the present invention and a DNA encoding the same can be used, for example, for the prevention and treatment of hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain, obesity, etc. Useful as an agent.
Furthermore, the peptide of the present invention and DNA encoding the same are useful as safe and low-toxicity medicines, for example, androgen secretion regulators, preferably androgen secretagogues.
Testosterone is an example of a male hormone.
In addition, the peptide of the present invention and DNA encoding the same include, for example, male gonad dysfunction, male infertility associated with impaired spermatogenic function, aplastic anemia, myelofibrosis, renal anemia, and pain in terminal female genital cancer. It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for palliation, breast cancer (eg, inoperable breast cancer), mastopathy, breast tumor, gynecomastia, and the like.

本発明のペプチドおよび本発明のＤＮＡは、例えば、生体内において本発明のペプチドが減少あるいは欠損している患者がいる場合に、（イ）本発明のＤＮＡを該患者に投与し、生体内で本発明のペプチドを発現させることによって、（ロ）細胞に本発明のＤＮＡを挿入し、本発明のペプチドを発現させた後に、該細胞を患者に移植することによって、または（ハ）本発明のペプチドを該患者に投与することなどによって、該患者における本発明のペプチドの役割を十分に、あるいは正常に発揮させることができる。
本発明のＤＮＡを上記の治療・予防剤として使用する場合は、該ＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは温血動物に投与することができる。本発明のＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
本発明のペプチドを上記の治療・予防剤として使用する場合は、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
本発明のペプチドは、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、本発明のペプチドを生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。 The peptide of the present invention and the DNA of the present invention can be used, for example, by administering the DNA of the present invention to a patient when the peptide of the present invention is reduced or deficient in the living body. By expressing the peptide of the present invention, (ii) inserting the DNA of the present invention into cells and expressing the peptide of the present invention, and then transplanting the cells into a patient; The role of the peptide of the present invention in the patient can be sufficiently or normally exerted by administering the peptide to the patient.
When the DNA of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic or prophylactic agent, the DNA may be inserted alone or into a suitable vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, and the like. It can be administered to humans or warm-blooded animals. The DNA of the present invention can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an auxiliary agent for promoting uptake, using a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
When the peptide of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic / prophylactic agent, it should be purified to at least 90%, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and still more preferably 99% or more. preferable.
The peptide of the present invention can be, for example, orally as a sugar-coated tablet, capsule, elixir, microcapsule or the like, or sterilized with water or other pharmaceutically acceptable liquids. It can be used parenterally in the form of injections, such as solutions or suspensions. For example, the peptide of the present invention is mixed with physiologically acceptable carriers, flavors, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like in a unit dosage form generally required for the practice of pharmaceutical preparations. Can be manufactured by The amount of the active ingredient in these preparations is such that a proper dosage in the specified range can be obtained.

錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０TM、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
本発明のＤＮＡが挿入されたベクターも上記と同様に製剤化され、通常、非経口的に使用される。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、など）に対して投与することができる。
本発明のペプチドの投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、本発明のペプチドを経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該ペプチドを約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該ペプチドの１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のペプチドを注射剤の形で成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該ペプチドを約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を患部に注射することにより投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。 Examples of additives that can be incorporated into tablets, capsules, and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, and acacia, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid. Useful bulking agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavoring agents such as peppermint, reddish oil or cherry and the like are used. When the preparation unit form is a capsule, a liquid carrier such as oils and fats can be further contained in the above-mentioned type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like.
Examples of aqueous liquids for injection include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.), and suitable solubilizing agents. For example, it may be used in combination with an alcohol (eg, ethanol or the like), a polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol or the like), a nonionic surfactant (eg, polysorbate 80 ™ , HCO-50, or the like). Examples of the oily liquid include sesame oil and soybean oil, and may be used in combination with a solubilizing agent such as benzyl benzoate or benzyl alcohol. Also, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), You may mix | blend with a preservative (for example, benzyl alcohol, phenol etc.), an antioxidant, etc. The prepared injection is usually filled in an appropriate ampoule.
The vector into which the DNA of the present invention has been inserted is also formulated as described above, and is usually used parenterally.
The preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, for example, human or warm-blooded animals (eg, rat, mouse, guinea pig, rabbit, bird, sheep, pig, cow, horse, cat, dog, monkey). , Etc.).
The dosage of the peptide of the present invention varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like. About 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg of the peptide. In the case of parenteral administration, the single dose of the peptide varies depending on the administration subject, target disease and the like. It is convenient to administer the peptide by injecting about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day into the affected area. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.

（２）疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明のペプチドは、本発明のペプチドの機能を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法に使用することができる。本発明のペプチドの機能としては、ＡＱ２７受容体への結合作用、ＡＱ２７受容体を介するシグナル伝達作用、後述する細胞刺激活性などが挙げられる。
また、本発明のＤＮＡは、本発明のペプチドの発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法に使用することができる。
以下に、本発明のペプチドまたは本発明のＤＮＡを用いるスクリーニング方法を具体的に説明する。 (2) Screening of drug candidate compounds for diseases The peptide of the present invention can be used in a method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the function of the peptide of the present invention. Functions of the peptide of the present invention include a binding action to AQ27 receptor, a signal transduction action via AQ27 receptor, a cell stimulating activity described later, and the like.
Further, the DNA of the present invention can be used in a method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the expression of the peptide of the present invention.
Hereinafter, a screening method using the peptide of the present invention or the DNA of the present invention will be specifically described.

（２−１）ＡＱ２７受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法
該スクリーニングは、本発明のペプチドを用いるか、または組換え型本発明のペプチドの発現系を構築し、該発現系を用いたレセプター結合アッセイ系を用いることによって、本発明のペプチドとＡＱ２７受容体との結合性を変化させる化合物（本発明のペプチドの活性を促進または阻害する化合物）またはその塩をスクリーニングすることができる。
このような化合物には、本発明のペプチドのＡＱ２７受容体を介した細胞刺激活性を有する化合物（すなわちＡＱ２７受容体アゴニスト）と該細胞刺激活性を有しない化合物（すなわちＡＱ２７受容体アンタゴニスト）などが含まれる。「結合性を変化させる」とは、本発明のペプチドＡＱ２７受容体との結合を阻害する場合と促進する場合の両方を包含するものである。
ＡＱ２７受容体を介する細胞刺激活性としては、例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性、副腎皮質ホルモン分泌作用、男性ホルモン分泌作用などを促進する活性または抑制する活性などが挙げられ、特に細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性、副腎皮質ホルモン分泌促進活性、男性ホルモン分泌促進活性が好ましい。 (2-1) Method for Screening Agonist or Antagonist for AQ27 Receptor In the screening, a peptide of the present invention is used, or a recombinant expression system of the peptide of the present invention is constructed, and receptor binding using the expression system is performed. By using the assay system, it is possible to screen for a compound that alters the binding between the peptide of the present invention and the AQ27 receptor (a compound that promotes or inhibits the activity of the peptide of the present invention) or a salt thereof.
Such compounds include compounds having the cell stimulating activity of the peptide of the present invention via the AQ27 receptor (ie, AQ27 receptor agonist) and compounds having no such cell stimulating activity (ie, AQ27 receptor antagonist). It is. “Altering the binding” includes both cases of inhibiting and promoting the binding to the peptide AQ27 receptor of the present invention.
Cell stimulating activity via the AQ27 receptor includes, for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein Phosphorylation, activation of c-fos, lowering of pH, GTPγS binding activity, adrenocortical hormone secretion activity, activity to promote or suppress androgen secretion activity, etc., and the like. Adrenal cortex hormone secretion promoting activity and male hormone secretion promoting activity are preferred.

すなわち、本発明は、
本発明のペプチドを用いることを特徴とする本発明のペプチドの機能を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、具体的には、
（ｉ）本発明のペプチドおよび（または）ＡＱ２７受容体またはその部分ペプチド（以下、これらを単にＡＱ２７受容体と略称する）を用いることを特徴とする副腎皮質ホルモン分泌調節薬（例、副腎皮質ホルモン分泌促進薬、副腎皮質ホルモン分泌阻害薬）のスクリーニング方法、
（ii）ＡＱ２７受容体またはその部分ペプチド（以下、これらを単にＡＱ２７受容体と略称する）に、本発明のペプチドを接触させた場合と（ii）ＡＱ２７受容体に、本発明のペプチドおよび試験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする本発明のペプチドとＡＱ２７受容体の結合性を変化させる化合物（本発明のペプチドの機能を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法においては、（i）ＡＱ２７受容体に、本発明のペプチドを接触させた場合と（ii）ＡＱ２７受容体に、本発明のペプチドおよび試験化合物を接触させた場合における、例えばＡＱ２７受容体に対する本発明のペプチドの結合量、細胞刺激活性などを測定して、比較する。 That is, the present invention
A method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the function of the peptide of the present invention, which comprises using the peptide of the present invention, specifically,
(I) a corticosteroid secretion regulator (eg, corticosteroid) characterized by using the peptide of the present invention and / or the AQ27 receptor or a partial peptide thereof (hereinafter, these are simply referred to as AQ27 receptor). Secretagogues, corticosteroid secretion inhibitors),
(Ii) AQ27 receptor or its partial peptide (hereinafter simply referred to as AQ27 receptor) and a peptide of the present invention, and (ii) AQ27 receptor with a peptide of the present invention and a test compound. A method for screening a compound that alters the binding property between the peptide of the present invention and the AQ27 receptor (a compound that promotes or inhibits the function of the peptide of the present invention) or a salt thereof, which is characterized by comparing with the case of contacting I will provide a.
In the screening method of the present invention, for example, when AQ27 receptor is contacted with the peptide of the present invention, and (ii) AQ27 receptor is contacted with the peptide of the present invention and a test compound, for example, AQ27 The binding amount of the peptide of the present invention to the receptor, cell stimulating activity and the like are measured and compared.

本発明のスクリーニング方法は具体的には、
1)標識した本発明のペプチドを、ＡＱ２７受容体に接触させた場合と、標識した本発明のペプチドおよび試験化合物をＡＱ２７受容体に接触させた場合における、標識した本発明のペプチドのＡＱ２７受容体に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする本発明のペプチドとＡＱ２７受容体との結合性を変化させる化合物（本発明のペプチドの機能を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング方法、
2)標識した本発明のペプチドを、ＡＱ２７受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、標識した本発明のペプチドおよび試験化合物をＡＱ２７受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、標識した本発明のペプチドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする本発明のペプチドとＡＱ２７受容体との結合性を変化させる化合物（本発明のペプチドの機能を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング方法、
3)標識した本発明のペプチドを、ＡＱ２７受容体をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＡＱ２７受容体に接触させた場合と、標識した本発明のペプチドおよび試験化合物をＡＱ２７受容体をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＡＱ２７受容体に接触させた場合における、標識した本発明のペプチドのＡＱ２７受容体に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする本発明のペプチドとＡＱ２７受容体との結合性を変化させる化合物（本発明のペプチドの機能を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング方法、 Specifically, the screening method of the present invention comprises:
1) AQ27 receptor of the labeled peptide of the present invention in the case where the labeled peptide of the present invention is brought into contact with the AQ27 receptor, and in the case where the labeled peptide of the present invention and the test compound are brought into contact with the AQ27 receptor A method for screening a compound that alters the binding between the peptide of the present invention and the AQ27 receptor (a compound that promotes or inhibits the function of the peptide of the present invention) or a salt thereof, which comprises measuring and comparing the amount of binding to AQ27 receptor. ,
2) When the labeled peptide of the present invention is brought into contact with an AQ27 receptor-containing cell or a membrane fraction of the cell, or when the labeled peptide of the present invention and a test compound are contacted with an AQ27 receptor-containing cell or Measuring the amount of binding of the labeled peptide of the present invention to the cell or the membrane fraction when the peptide of the present invention is brought into contact with the membrane fraction of the cell, and comparing the peptide with the AQ27 receptor; A method for screening a compound that changes the binding property (a compound that promotes or inhibits the function of the peptide of the present invention) or a salt thereof,
3) When the labeled peptide of the present invention is brought into contact with the AQ27 receptor expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing DNA encoding the AQ27 receptor, When the test compound was brought into contact with the AQ27 receptor expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing DNA encoding the AQ27 receptor, the amount of the labeled peptide of the present invention bound to the AQ27 receptor was determined. A method for screening a compound that changes the binding property between the peptide of the present invention and the AQ27 receptor (a compound that promotes or inhibits the function of the peptide of the present invention) or a salt thereof, which is measured and compared;

4)ＡＱ２７受容体を活性化する化合物またはその塩（例えば、本発明のペプチド）をＡＱ２７受容体を含有する細胞に接触させた場合と、ＡＱ２７受容体を活性化する化合物またはその塩および試験化合物をＡＱ２７受容体を含有する細胞（例、ＣＨＯ細胞）に接触させた場合における、ＡＱ２７受容体を介した細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とする本発明のペプチドとＡＱ２７受容体との結合性を変化させる化合物（本発明のペプチドの機能を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング方法、および
5)ＡＱ２７受容体を活性化する化合物またはその塩（例えば、本発明のペプチドなど）をＡＱ２７受容体をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＡＱ２７受容体に接触させた場合と、ＡＱ２７受容体を活性化する化合物またはその塩および試験化合物を、ＡＱ２７受容体をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＡＱ２７受容体に接触させた場合における、ＡＱ２７受容体を介する細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とする本発明のペプチドとＡＱ２７受容体との結合性を変化させる化合物（本発明のペプチドの機能を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング方法などである。 4) AQ27 receptor activating compound or salt thereof (eg, the peptide of the present invention) is brought into contact with AQ27 receptor-containing cells, and AQ27 receptor activating compound or salt thereof and test compound A peptide of the present invention and an AQ27 receptor characterized by measuring and comparing AQ27 receptor-mediated cell stimulating activity when is contacted with a cell containing AQ27 receptor (eg, CHO cell). Screening method for a compound that alters the binding of a compound (a compound that promotes or inhibits the function of the peptide of the present invention) or a salt thereof, and
5) AQ27 receptor expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing a DNA encoding the AQ27 receptor with a compound that activates the AQ27 receptor or a salt thereof (for example, the peptide of the present invention). When contacted, a compound or a salt thereof that activates the AQ27 receptor and a test compound are brought into contact with the AQ27 receptor expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing the DNA encoding the AQ27 receptor. A cell stimulating activity mediated by the AQ27 receptor is measured and compared, and a compound that alters the binding between the peptide of the present invention and the AQ27 receptor (promotes the function of the peptide of the present invention or A method of screening for a compound that inhibits) or a salt thereof.

本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、本発明のスクリーニング方法に用いるＡＱ２７受容体としては、本発明のペプチドをリガンドとして認識するものであれば何れのものであってもよいが、ヒトや温血動物の臓器の膜画分などが好適である。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、スクリーニングに用いられるものとしては、組換え体を用いて大量発現させたＡＱ２７受容体などが適している。ＡＱ２７受容体は、公知の方法に従って製造することができる。
本発明のスクリーニング方法において、ＡＱ２７受容体を含有する細胞あるいは該細胞膜画分などを用いる場合、後述の調製法に従えばよい。
ＡＱ２７受容体を含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行うことができる。
ＡＱ２７受容体を含有する細胞としては、ＡＱ２７受容体を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、前述の大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。また、ＡＱ２７受容体を発現した宿主細胞は、前述の本発明のペプチドを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体の製造方法と同様の方法などがあげられる。
膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などがあげられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したＡＱ２７受容体と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
該ＡＱ２７受容体を含有する細胞や膜画分中のＡＱ２７受容体の量は、１細胞当たり１０3〜１０8分子であるのが好ましく、１０5〜１０7分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。 The specific description of the screening method of the present invention is as follows.
First, the AQ27 receptor used in the screening method of the present invention may be any as long as it recognizes the peptide of the present invention as a ligand, such as the membrane fraction of human or warm-blooded animal organs. Is preferred. However, since it is extremely difficult to obtain human-derived organs in particular, AQ27 receptor and the like which are expressed in large amounts using recombinants are suitable for screening. The AQ27 receptor can be produced according to a known method.
In the screening method of the present invention, when a cell containing the AQ27 receptor or a cell membrane fraction thereof is used, the preparation method described below may be used.
When using cells containing the AQ27 receptor, the cells may be immobilized with glutaraldehyde, formalin, or the like. The immobilization method can be performed according to a method known per se.
The cell containing the AQ27 receptor refers to a host cell that has expressed the AQ27 receptor. Examples of the host cell include the aforementioned Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells, and the like. The host cell that has expressed the AQ27 receptor includes the same method as the above-described method for producing a transformant transformed with the expression vector containing the peptide of the present invention.
The membrane fraction refers to a fraction abundant in cell membrane obtained by disrupting cells and then obtained by a method known per se. As a method for crushing cells, a method of crushing cells with a Potter-Elvehjem type homogenizer, crushing with a Waring blender or a polytron (manufactured by Kinematica), crushing with ultrasonic waves, spouting cells from a thin nozzle while applying pressure with a French press, etc. Crushing and the like. For fractionation of cell membranes, fractionation by centrifugal force such as fractionation centrifugation or density gradient centrifugation is mainly used. For example, the cell lysate is centrifuged at a low speed (500-3000 rpm) for a short time (usually about 1 to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a high speed (15000 to 30000 rpm) for usually 30 minutes to 2 hours. Is the membrane fraction. The membrane fraction is rich in the expressed AQ27 receptor and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
The amount of the AQ27 receptor in the cell or membrane fraction containing the AQ27 receptor is preferably 10 3 to 10 8 molecules per cell, and more preferably 10 5 to 10 7 molecules per cell. The higher the expression level, the higher the ligand binding activity (specific activity) per membrane fraction, which makes it possible not only to construct a highly sensitive screening system, but also to measure a large number of samples in the same lot. .

本発明のペプチドとＡＱ２７受容体との結合性を変化させる化合物（本発明のペプチドの機能を促進または阻害する化合物）またはその塩をスクリーニングする前記の1)〜3)を実施するためには、適当なＡＱ２７受容体画分と、標識した本発明のペプチドなどが用いられる。ＡＱ２７受容体画分としては、天然型のＡＱ２７受容体画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型ＡＱ２７受容体画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性などを示す。標識した本発明のペプチドとしては、例えば〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕などで標識された本発明のペプチドやそのアナログ化合物などを利用することができる。このうち好ましくは、〔125Ｉ〕で標識された本発明のペプチドである。
具体的には、本発明のペプチドとＡＱ２７受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニングを行うには、まずＡＱ２７受容体を含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりレセプター標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンドとレセプターとの結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０TM（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによるＡＱ２７受容体や本発明のペプチドの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０．０１〜１０ｍｌの該レセプター溶液に、一定量（５０００〜５０００００ｃｐｍ）の標識した本発明のペプチドを添加し、同時に１０-10〜１０-7Ｍの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識の本発明のペプチドを加えた反応チューブも用意する。反応は０〜５０℃、望ましくは４〜３７℃で２０分〜２４時間、望ましくは３０分〜３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント（Ｂ0）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ0−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が例えば５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。 In order to carry out the above-mentioned 1) to 3) for screening a compound that changes the binding property between the peptide of the present invention and the AQ27 receptor (a compound that promotes or inhibits the function of the peptide of the present invention) or a salt thereof, An appropriate AQ27 receptor fraction and a labeled peptide of the present invention are used. The AQ27 receptor fraction is preferably a natural AQ27 receptor fraction or a recombinant AQ27 receptor fraction having an activity equivalent thereto. Here, the equivalent activity indicates an equivalent ligand binding activity and the like. As the labeled peptide of the present invention, for example, the peptide of the present invention labeled with [ 3 H], [ 125 I], [ 14 C], [ 35 S], or the like, or an analog compound thereof can be used. Of these, the peptide of the present invention labeled with [ 125 I] is preferred.
Specifically, to screen a compound or a salt thereof that alters the binding between the peptide of the present invention and the AQ27 receptor, first, cells containing the AQ27 receptor or a membrane fraction of the cells are suitable for screening. To prepare a receptor standard. The buffer may be any buffer such as a phosphate buffer having a pH of 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) or a buffer such as Tris-HCl buffer which does not inhibit the binding between the ligand and the receptor. For the purpose of reducing non-specific binding, a surfactant such as CHAPS, Tween-80 ™ (Kao-Atlas), digitonin, and deoxycholate can be added to the buffer. Furthermore, a protease inhibitor such as PMSF, leupeptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Laboratories), pepstatin and the like can be added for the purpose of suppressing the degradation of the AQ27 receptor and the peptide of the present invention by the protease. A fixed amount (5,000 to 500,000 cpm) of the labeled peptide of the present invention is added to 0.01 to 10 ml of the receptor solution, and 10 -10 to 10 -7 M of the test compound is allowed to coexist. A reaction tube containing a large excess of the unlabeled peptide of the present invention is also prepared to determine the amount of non-specific binding (NSB). The reaction is carried out at 0 to 50 ° C, preferably 4 to 37 ° C, for 20 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 3 hours. After the reaction, the mixture is filtered with a glass fiber filter or the like, washed with an appropriate amount of the same buffer, and the radioactivity remaining on the glass fiber filter is measured with a liquid scintillation counter or a γ-counter. When the count (B 0 -NSB) obtained by subtracting the non-specific binding amount (NSB) from the count (B 0 ) when there is no antagonistic substance is 100%, the specific binding amount (B-NSB) is, for example, 50%. % Of the test compound can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.

本発明のペプチドとＡＱ２７受容体との結合性を変化させる化合物（本発明のペプチドの機能を促進または阻害する化合物）またはその塩をスクリーニングする前記の4)〜5)の方法を実施するためには、ＡＱ２７受容体を介する細胞刺激活性を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。具体的には、まず、ＡＱ２７受容体を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行うにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、ｃＡＭＰ、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、適当なＡＱ２７受容体を発現した細胞が必要である。ＡＱ２７受容体を発現した細胞としては、前述のＡＱ２７受容体発現細胞株などが望ましい。
試験化合物および試験化合物が形成してもよい塩としては、前記と同様のものが用いられる。
また、試験化合物としては、ＡＱ２７受容体の活性部位の原子座標およびリガンド結合ポケットの位置に基づいて、リガンド結合ポケットに結合するように設計された化合物が好ましく用いられる。ＡＱ２７受容体の活性部位の原子座標およびリガンド結合ポケットの位置の測定は、公知の方法あるいはそれに準じる方法を用いて行うことができる。
さらに、本発明のペプチドに代えて、本発明のペプチドとＡＱ２７受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩をリガンドとして用いることもできる。本発明のペプチドとＡＱ２７受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩は、例えば、リガンドとして本発明のペプチドを用いて、前述した本発明のスクーニング方法を実施することによって得ることができる。 In order to carry out the above methods 4) to 5) for screening a compound that changes the binding property of the peptide of the present invention to the AQ27 receptor (a compound that promotes or inhibits the function of the peptide of the present invention) or a salt thereof, Can be measured for the cell stimulating activity mediated by the AQ27 receptor using a known method or a commercially available measurement kit. Specifically, first, cells containing the AQ27 receptor are cultured in a multiwell plate or the like. Before performing screening, the cells were exchanged with a fresh medium or an appropriate buffer that does not show toxicity for cells, and a test compound was added and incubated for a certain period of time. The product is quantified according to the respective method. When the production of a substance (for example, cAMP, arachidonic acid, etc.) as an indicator of cell stimulating activity is difficult to be assayed by a degrading enzyme contained in a cell, an assay may be performed by adding an inhibitor to the degrading enzyme. . In addition, the activity such as cAMP production suppression can be detected as a production suppression effect on cells whose basic production amount has been increased by forskolin or the like.
For screening by measuring the cell stimulating activity, cells expressing an appropriate AQ27 receptor are required. As the cells expressing the AQ27 receptor, the above-mentioned AQ27 receptor-expressing cell lines and the like are desirable.
As the test compound and the salt which the test compound may form, the same as described above are used.
As the test compound, a compound designed to bind to the ligand binding pocket based on the atomic coordinates of the active site of the AQ27 receptor and the position of the ligand binding pocket is preferably used. The measurement of the atomic coordinates of the active site of the AQ27 receptor and the position of the ligand binding pocket can be performed by a known method or a method analogous thereto.
Furthermore, instead of the peptide of the present invention, a compound or a salt thereof that changes the binding between the peptide of the present invention and the AQ27 receptor can be used as the ligand. A compound or a salt thereof that alters the binding property of the peptide of the present invention to the AQ27 receptor can be obtained, for example, by performing the above-mentioned squaring method of the present invention using the peptide of the present invention as a ligand.

本発明のペプチドとＡＱ２７受容体との結合性を変化させる化合物（本発明のペプチドの機能を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング用キットは、ＡＱ２７受容体またはその塩、ＡＱ２７受容体の部分ペプチドまたはその塩、ＡＱ２７受容体を含有する細胞、あるいはＡＱ２７受容体を含有する細胞の膜画分、および本発明のペプチドを含有するものである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
１．スクリーニング用試薬
1)測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
2)ＡＱ２７受容体標品
ＡＱ２７受容体を発現させたＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０5個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ2、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。
3)標識リガンド
〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕などで標識した本発明のペプチドを適当な溶媒または緩衝液に溶解したものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。
4)リガンド標準液
本発明のペプチドを０.１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で保存する。 A screening kit for a compound of the present invention that changes the binding property between the peptide and the AQ27 receptor (a compound that promotes or inhibits the function of the peptide of the present invention) or a salt thereof is provided by an AQ27 receptor or a salt thereof, It contains a partial peptide or a salt thereof, an AQ27 receptor-containing cell, or a membrane fraction of an AQ27 receptor-containing cell, and the peptide of the present invention.
Examples of the screening kit of the present invention include the following.
1. Screening reagent
1) Measurement buffer and washing buffer
Hanks' Balanced Salt Solution (manufactured by Gibco) supplemented with 0.05% bovine serum albumin (manufactured by Sigma).
The solution may be sterilized by filtration through a 0.45 μm filter and stored at 4 ° C., or may be prepared at use.
2) AQ27 receptor preparation CHO cells expressing the AQ27 receptor were subcultured on a 12-well plate at 5 x 10 5 cells / well, and cultured at 37 ° C, 5% CO 2 , 95% air for 2 days. thing.
3) A solution of the peptide of the present invention labeled with a labeled ligand [ 3 H], [ 125 I], [ 14 C], [ 35 S] or the like in a suitable solvent or buffer is brought to 4 ° C. or −20 ° C. Store and dilute to 1 μM with measurement buffer before use.
4) Ligand standard solution The peptide of the present invention is dissolved to a concentration of 1 mM in PBS containing 0.1% bovine serum albumin (manufactured by Sigma) and stored at -20 ° C.

２．測定法
1)１２穴組織培養用プレートにて培養したＡＱ２７受容体を発現させた細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。
2)１０-3〜１０-10Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた後、標識した本発明のペプチドを５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物の代わりに１０-3Ｍの本発明のペプチドを５μｌ加えておく。
3)反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。細胞に結合した標識された本発明のペプチドを０.２Ｎ ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
4)液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding（ＰＭＢ）を次の式〔数１〕で求める。
〔数１〕
ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ0−ＮＳＢ）］×１００
ＰＭＢ：Percent Maximum Binding
Ｂ ：検体を加えた時の値
ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量）
Ｂ0 ：最大結合量 2. Measurement method
1) The cells expressing the AQ27 receptor cultured in a 12-well tissue culture plate are washed twice with 1 ml of the measurement buffer, and then 490 μl of the measurement buffer is added to each well.
2) After adding 5 μl of a 10 −3 to 10 −10 M test compound solution, 5 μl of the labeled peptide of the present invention is added, and reacted at room temperature for 1 hour. To determine the amount of non-specific binding, 5 μl of 10 −3 M peptide of the present invention is added instead of the test compound.
3) Remove the reaction solution and wash three times with 1 ml of washing buffer. The labeled peptide of the present invention bound to the cells is dissolved in 0.2N NaOH-1% SDS, and mixed with 4 ml of liquid scintillator A (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
4) The radioactivity is measured using a liquid scintillation counter (manufactured by Beckman), and the Percent Maximum Binding (PMB) is determined by the following equation (Equation 1).
[Equation 1]
PMB = [(B−NSB) / (B 0 −NSB)] × 100
PMB: Percent Maximum Binding
B: Value at the time of adding the sample NSB: Non-specific Binding (non-specific binding amount)
B 0 : maximum binding amount

本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、本発明のペプチドとＡＱ２７受容体との結合を変化させる化合物（本発明のペプチドの機能を促進または阻害する化合物）またはその塩であり、具体的にはＡＱ２７受容体を介して細胞刺激活性を有する化合物またはその塩（いわゆるＡＱ２７受容体アゴニスト）、あるいは該刺激活性を有しない化合物またはその塩（いわゆるＡＱ２７受容体アンタゴニスト）である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物としては、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。 The compound obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention or a salt thereof is a compound that alters the binding between the peptide of the present invention and the AQ27 receptor (a compound that promotes or inhibits the function of the peptide of the present invention) or A salt thereof, specifically, a compound having a cell stimulating activity via an AQ27 receptor or a salt thereof (a so-called AQ27 receptor agonist), or a compound having no stimulating activity or a salt thereof (a so-called AQ27 receptor antagonist) It is.
Compounds obtained using the screening method or screening kit of the present invention include peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, and the like. And these compounds may be novel compounds or known compounds.
As the salt of the compound, a salt with a physiologically acceptable acid (eg, an inorganic acid or the like) or a base (eg, an organic acid or the like) is used, and particularly, a physiologically acceptable acid addition salt is preferable. . Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, For example, salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like are used.

上記ＡＱ２７受容体アゴニストであるかアンタゴニストであるかの具体的な評価方法は以下の（ｉ）または（ii）に従えばよい。
（ｉ）例えば、前記1)〜3)のスクリーニング方法で示されるバインディング・アッセイを行い、本発明のペプチドとＡＱ２７受容体との結合性を変化させる（特に、結合を阻害する）化合物またはその塩を得た後、該化合物またはその塩が上記したＡＱ２７受容体を介する細胞刺激活性を有しているか否かを測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩はＡＱ２７受容体アゴニストであり、該活性を有しない化合物またはその塩はＡＱ２７受容体アンタゴニストである。
（ii）（ａ）試験化合物（例、前記1)〜3)のスクリーニング方法で示されるバインディング・アッセイを行い、本発明のペプチドとＡＱ２７受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩）をＡＱ２７受容体を含有する細胞（例、ＣＨＯ細胞）に接触させ、上記ＡＱ２７受容体を介した細胞刺激活性を測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩はＡＱ２７受容体アゴニストである。
（ｂ）ＡＱ２７受容体を活性化する化合物またはその塩（例えば、本発明のペプチドアゴニストなど）をＡＱ２７受容体を含有する細胞に接触させた場合と、ＡＱ２７受容体を活性化する化合物またはその塩および試験化合物（例、前記1)〜3)のスクリーニング方法で示されるバインディング・アッセイを行い、本発明のペプチドとＡＱ２７受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩）をＡＱ２７受容体を含有する細胞に接触させた場合における、ＡＱ２７受容体を介した細胞刺激活性を測定し、比較する。ＡＱ２７受容体を活性化する化合物による細胞刺激活性を減少させ得る化合物またはその塩はＡＱ２７受容体アンタゴニストである。
（ｃ）試験化合物（例、前記1)〜3)のスクリーニング方法で示されるバインディング・アッセイを行い、本発明のペプチドとＡＱ２７受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩）を非哺乳動物（例、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ）に投与し、血中の副腎皮質ホルモンまたは男性ホルモンの濃度を測定する。血中の副腎皮質ホルモンまたは男性ホルモンの濃度を上昇させる化合物またはその塩はＡＱ２７受容体アゴニストである。一方、血中の副腎皮質ホルモンまたは男性ホルモンの濃度を減少させる化合物またはその塩はＡＱ２７受容体アンタゴニストである。
（ｄ）ＡＱ２７受容体を活性化する化合物またはその塩（例えば、本発明のペプチドアゴニストなど）を非ヒト哺乳動物（例、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ）に投与した場合と、ＡＱ２７受容体を活性化する化合物またはその塩および試験化合物を非ヒト哺乳動物（例、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ）に投与した場合における、血中の副腎皮質ホルモンまたは男性ホルモンの濃度を測定し、比較する。ＡＱ２７受容体を活性化する化合物による血中の副腎皮質ホルモンまたは男性ホルモンの分泌促進作用を減少させ得る化合物またはその塩はＡＱ２７受容体アンタゴニストである。
副腎皮質ホルモン分泌作用および男性ホルモン分泌作用は、後述する実施例１〜５に準じて測定することができる。 A specific method for evaluating whether the compound is an AQ27 receptor agonist or antagonist may be according to the following (i) or (ii).
(I) A compound or a salt thereof that changes (particularly, inhibits the binding) the binding between the peptide of the present invention and the AQ27 receptor by performing the binding assay shown in the screening methods 1) to 3) above, for example. After obtaining, it is determined whether or not the compound or a salt thereof has the above-described AQ27 receptor-mediated cell stimulating activity. A compound having a cell stimulating activity or a salt thereof is an AQ27 receptor agonist, and a compound having no such activity or a salt thereof is an AQ27 receptor antagonist.
(Ii) (a) a test compound (eg, a compound or a salt thereof that changes the binding between the peptide of the present invention and the AQ27 receptor by performing a binding assay shown in the screening method of 1) to 3) above; The cells are brought into contact with cells containing AQ27 receptor (eg, CHO cells), and the cell stimulating activity via the AQ27 receptor is measured. The compound having a cell stimulating activity or a salt thereof is an AQ27 receptor agonist.
(B) AQ27 receptor-activating compound or salt thereof (eg, the peptide agonist of the present invention) is contacted with AQ27 receptor-containing cells, and AQ27 receptor-activating compound or salt thereof And a binding assay shown in the screening method for test compounds (eg, the above 1) to 3), and a compound or a salt thereof that changes the binding property of the peptide of the present invention to the AQ27 receptor is contained in the AQ27 receptor. AQ27 receptor-mediated cell stimulating activity in the case of contact with cells to be treated is measured and compared. A compound or a salt thereof capable of decreasing the cell stimulating activity of a compound that activates the AQ27 receptor is an AQ27 receptor antagonist.
(C) a test compound (eg, a compound or a salt thereof that changes the binding property of the peptide of the present invention to the AQ27 receptor by performing a binding assay shown in the screening method of the above 1) to 3) with a non-mammal (Eg, mice, rats, hamsters, rabbits) and measure the concentration of corticosteroids or androgens in the blood. Compounds or salts thereof that increase blood levels of corticosteroids or androgens are AQ27 receptor agonists. On the other hand, compounds or salts thereof that reduce the concentration of corticosteroids or androgens in the blood are AQ27 receptor antagonists.
(D) when a compound or a salt thereof that activates the AQ27 receptor (eg, the peptide agonist of the present invention) is administered to a non-human mammal (eg, mouse, rat, hamster, rabbit), When the activating compound or a salt thereof and the test compound are administered to a non-human mammal (eg, mouse, rat, hamster, rabbit), the concentrations of corticosteroids or male hormones in the blood are measured and compared. A compound or a salt thereof capable of decreasing the secretion-promoting action of blood adrenocortical hormone or male hormone by a compound activating AQ27 receptor is an AQ27 receptor antagonist.
The corticosteroid secretion action and the male hormone secretion action can be measured according to Examples 1 to 5 described later.

本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる本発明のペプチドとＡＱ２７受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩（本発明のペプチドの機能を促進または阻害する化合物またはその塩）は、安全で低毒性な副腎皮質ホルモン分泌調節剤として有用である。
ＡＱ２７受容体アゴニストまたは本発明のペプチドの機能を促進する化合物もしくはその塩は、ＡＱ２７受容体に対する本発明のペプチドが有する生理活性と同様の作用を有しているので、本発明のペプチドと同様に安全で低毒性な副腎皮質ホルモン分泌調節剤、好ましくは副腎皮質ホルモン分泌促進剤として有用である。さらに、該ＡＱ２７受容体アゴニストまたは本発明のペプチドの機能を促進する化合物もしくはその塩は、低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛み、肥満などの予防・治療剤として有用である。
また、ＡＱ２７受容体アゴニストまたは本発明のペプチドの機能を促進する化合物もしくはその塩は、安全で低毒性な男性ホルモン分泌調節剤、好ましくは男性ホルモン分泌促進剤として有用である。さらに、該ＡＱ２７受容体アゴニストまたは本発明のペプチドの機能を促進する化合物もしくはその塩は、例えば、男性性腺機能不全、造精機能障害に伴う男子不妊症、再生不良性貧血、骨髄線維症、腎性貧血、末期女性性器癌の疼痛緩和、乳癌（例、手術不能乳癌）、乳腺症、乳腺腫瘍、女性化乳房などの予防・治療剤として有用である。
逆に、ＡＱ２７受容体アンタゴニストまたは本発明のペプチドの機能を阻害する化合物もしくはその塩は、ＡＱ２７受容体に対する本発明のペプチドが有する生理活性を抑制することができるので、安全で低毒性な副腎皮質ホルモン分泌調節剤、好ましくは副腎皮質ホルモン分泌阻害剤（副腎皮質ホルモン分泌抑制剤）として有用である。さらに、ＡＱ２７受容体アンタゴニストまたは本発明のペプチドの機能を阻害する化合物もしくはその塩は、クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍、過敏性腸症候群などの予防・治療剤として有用である。
また、ＡＱ２７受容体アンタゴニストまたは本発明のペプチドの機能を阻害する化合物もしくはその塩は、安全で低毒性な男性ホルモン分泌調節剤、好ましくは男性ホルモン分泌阻害剤（男性ホルモン分泌抑制剤）として有用である。さらに、ＡＱ２７受容体アンタゴニストまたは本発明のペプチドの機能を阻害する化合物もしくはその塩は、例えば、陰茎肥大、精巣萎縮、精巣機能異常（例、精子減少）、月経異常、多毛、色素沈着、嗄声、過敏症、坐瘡、悪心、嘔吐、消化器系症状（例、食欲不振）、満月様顔貌などの予防・治療剤として有用である。 Compounds or salts thereof that alter the binding between the peptide of the present invention and the AQ27 receptor obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention (compounds or salts thereof that promote or inhibit the function of the peptide of the present invention) Is useful as a safe and low-toxicity regulator of corticosteroid secretion.
An AQ27 receptor agonist or a compound that promotes the function of the peptide of the present invention or a salt thereof has the same activity as the physiological activity of the peptide of the present invention on the AQ27 receptor. It is useful as a safe and low-toxicity corticosteroid secretion regulator, preferably a corticosteroid secretagogue. Further, the AQ27 receptor agonist or a compound or a salt thereof that promotes the function of the peptide of the present invention may be hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain It is useful as an agent for preventing and treating obesity and the like.
Further, an AQ27 receptor agonist or a compound that promotes the function of the peptide of the present invention or a salt thereof is useful as a safe and low toxic androgen secretion regulator, preferably a androgen secretion promoter. Further, the AQ27 receptor agonist or a compound or a salt thereof which promotes the function of the peptide of the present invention includes, for example, male gonad dysfunction, male infertility associated with impaired spermatogenic function, aplastic anemia, myelofibrosis, renal It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for somatic anemia, pain relief for terminal female genital cancer, breast cancer (eg, inoperable breast cancer), mastopathy, breast tumor, gynecomastia, and the like.
Conversely, an AQ27 receptor antagonist or a compound that inhibits the function of the peptide of the present invention or a salt thereof can suppress the physiological activity of the peptide of the present invention on the AQ27 receptor, and thus is safe and low-toxic in the adrenal cortex. It is useful as a hormone secretion regulator, preferably a corticosteroid secretion inhibitor (corticosteroid secretion inhibitor). Further, an AQ27 receptor antagonist or a compound or a salt thereof that inhibits the function of the peptide of the present invention may be used for Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, It is useful as a preventive or therapeutic agent for cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, gastric / duodenal ulcer, irritable bowel syndrome, and the like.
Further, an AQ27 receptor antagonist or a compound inhibiting the function of the peptide of the present invention or a salt thereof is useful as a safe and low toxic androgen secretion regulator, preferably a androgen secretion inhibitor (androgen secretion inhibitor). is there. Furthermore, AQ27 receptor antagonists or compounds that inhibit the function of the peptide of the present invention or salts thereof include, for example, penile enlargement, testicular atrophy, testicular dysfunction (eg, sperm reduction), menstrual abnormalities, hirsutism, pigmentation, hoarseness, It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for hypersensitivity, acne, nausea, vomiting, gastrointestinal symptoms (eg, anorexia), full moon-like face, and the like.

本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物を上述の治療・予防剤として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。例えば、前記した本発明のペプチドを含有する医薬と同様にして、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などとすることができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、ＡＱ２７受容体アゴニストを経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ当たり）においては、一日につきＡＱ２７受容体アゴニストを約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、ＡＱ２７受容体アゴニストを注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇ当たり）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。 When a compound obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic / prophylactic agent, it can be carried out according to conventional means. For example, tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sterile solutions, suspensions, and the like can be prepared in the same manner as in the above-mentioned drug containing the peptide of the present invention.
The preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, human or warm-blooded animals (eg, mouse, rat, rabbit, sheep, pig, cow, horse, bird, cat, dog, monkey, chimpanzee, etc.) ) Can be administered.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on its action, target disease, subject to be administered, administration route, and the like. Administers about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg of AQ27 receptor agonist per day. In the case of parenteral administration, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease and the like. In such a case, it is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound by intravenous injection per day. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.

ＡＱ２７受容体としては、配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩（以下、ＡＱ２７受容体と略記する場合がある）などが用いられる。
配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
本発明の配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例えば、配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。
実質的に同質の活性としては、例えば、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。したがって、リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性が同等（例、約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度や蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、前記と同様にして測定することができる。 As the AQ27 receptor, a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 or a salt thereof (hereinafter, referred to as “AQ27 receptor”) AQ27 receptor).
As the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, for example, the amino acid represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 Amino acid sequences having about 70% or more homology with the sequence, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and still more preferably about 95% or more.
Examples of the protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 in the present invention include, for example, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or Has substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, and has substantially the same activity as the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13. And the like are preferred.
The homology of amino acid sequences was determined using the homology calculation algorithm NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool), and the following conditions (expected value = 10; gap allowed; matrix = BLOSUM62; filtering = BLOSUM62). Can be calculated.
Examples of substantially the same activity include a ligand binding activity and a signal transduction action. Substantially the same means that their activities are the same in nature. Therefore, it is preferable that the activities such as the ligand binding activity and the signal transduction action are equal (eg, about 0.5 to 2 times), but the quantitative factors such as the degree of these activities and the molecular weight of the protein are different. You may.
The activities such as the ligand binding activity and the signal information transmission activity can be measured in the same manner as described above.

また、ＡＱ２７受容体としては、1)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１または２個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、2)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１または２個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、3)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１または２個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または4)それら欠失・付加・置換を組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質なども用いられる。
ＡＱ２７受容体は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質をはじめとするＡＱ２７受容体は、Ｃ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート(−ＣＯＯ-)、アミド（−ＣＯＮＨ2）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ3-8シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ6-12アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ1-2アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ1-2アルキル基などのＣ7-14アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
ＡＱ２７受容体がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、ＡＱ２７受容体には、上記した蛋白質において、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ2-6アルカノイル基などのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ2-6アルカノイル基などのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
ＡＱ２７受容体の具体例としては、例えば、配列番号：９で表わされるアミノ酸配列からなるヒト由来ＡＱ２７受容体、配列番号：１１で表わされるアミノ酸配列からなるラット由来ＡＱ２７受容体、配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列からなるマウス由来ＡＱ２７受容体などがあげられる。 Examples of the AQ27 receptor include: 1) one or more (preferably about 1 to 30, more preferably 1 to 30) amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13; About 10 to 10 amino acids, more preferably several (one or two) amino acids are deleted, 2) 1 or 9 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13. An amino acid sequence to which two or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and even more preferably several (1 or 2)) amino acids are added; 3) SEQ ID NO: 9, sequence 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably several (1 or 2) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13. Amino acids are substituted by other amino acids), or 4) a protein comprising them amino acid sequence which is a combination of deletion, addition and substitution may also be used.
The AQ27 receptor has the N-terminus (amino terminus) at the left end and the C-terminus (carboxyl terminus) at the right end according to the convention of peptide labeling. The AQ27 receptor including the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 has a carboxyl group (—COOH), a carboxylate (—COO − ) amides may be any (-CONH 2) or an ester (-COOR).
Here, as R in the ester, for example, a C 1-6 alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl or n-butyl, for example, a C 3-8 cycloalkyl group such as cyclopentyl and cyclohexyl, for example, phenyl , C 6-12 aryl groups such as α-naphthyl, for example, phenyl-C 1-2 alkyl groups such as benzyl and phenethyl or C 7- alkyl groups such as α-naphthyl-C 1-2 alkyl groups such as α-naphthylmethyl. In addition to 14 aralkyl groups, pivaloyloxymethyl groups and the like commonly used as oral esters are used.
When the AQ27 receptor has a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus, the carboxyl group amidated or esterified is also included in the protein of the present invention. As the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
Furthermore, in the AQ27 receptor, the amino group of the methionine residue at the N-terminus in the protein described above has a protecting group (for example, a C 1-6 acyl group such as a C 2-6 alkanoyl group such as a formyl group and an acetyl group). ), A glutamyl group formed by cleavage of the N-terminal side in vivo and pyroglutamine oxidation, a substituent on a side chain of an amino acid in the molecule (for example, -OH, -SH, an amino group, Those in which an imidazole group, an indole group, a guanidino group, etc.) are protected with a suitable protecting group (eg, a C 1-6 acyl group such as a C 2-6 alkanoyl group such as a formyl group or an acetyl group), or a sugar Complex proteins, such as so-called glycoproteins, to which chains are linked are also included.
Specific examples of the AQ27 receptor include, for example, a human-derived AQ27 receptor having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, a rat-derived AQ27 receptor having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, and SEQ ID NO: 13. Mouse-derived AQ27 receptor comprising the amino acid sequence represented, and the like.

ＡＱ２７受容体の部分ペプチドとしては、前記したＡＱ２７受容体部分ペプチドであれば何れのものであってもよいが、例えば、ＡＱ２７受容体の蛋白質分子のうち、細胞膜の外に露出している部位であって、レセプター結合活性を有するものなどが用いられる。
ＡＱ２７受容体の部分ペプチドとしては、疎水性プロット解析において細胞外領域（親水性（Hydrophilic）部位）であると分析された部分を含むペプチドである。また、疎水性（Hydrophobic）部位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、複数のドメインを同時に含む部分のペプチドでも良い。
ＡＱ２７受容体の部分ペプチドのアミノ酸の数は、前記したＡＱ２７受容体の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、より好ましくは１００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。
実質的に同一のアミノ酸配列とは、これらアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を示す。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。
ここで、「実質的に同質の活性」とは、前記と同意義を示す。「実質的に同質の活性」の測定は前記と同様に行なうことができる。
また、ＡＱ２７受容体の部分ペプチドは、上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１または２個））のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１または２個））のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは１〜５個程度、さらに好ましくは数個（１または２個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、ＡＱ２７受容体の部分ペプチドはＣ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ-）、アミド（−ＣＯＮＨ2）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
さらに、ＡＱ２７受容体の部分ペプチドには、前記したＡＱ２７受容体と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
ＡＱ２７受容体またはその部分ペプチドの塩としては、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。 The partial peptide of the AQ27 receptor may be any peptide as long as it is the above-mentioned partial peptide of the AQ27 receptor. For example, in a protein molecule of the AQ27 receptor which is exposed outside the cell membrane, Those having receptor binding activity are used.
The partial peptide of the AQ27 receptor is a peptide containing a portion analyzed as an extracellular region (hydrophilic site) in a hydrophobic plot analysis. Further, a peptide partially containing a hydrophobic (Hydrophobic) site can also be used. A peptide containing individual domains may be used, but a peptide containing a plurality of domains at the same time may be used.
The number of amino acids in the partial peptide of the AQ27 receptor is preferably a peptide having an amino acid sequence of at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 100 or more of the amino acid sequences constituting the AQ27 receptor.
A substantially identical amino acid sequence is defined as about 50% or more, preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, still more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more, of these amino acid sequences. 1 shows an amino acid sequence having homology.
The homology of amino acid sequences was determined using the homology calculation algorithm NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool), and the following conditions (expected value = 10; gap allowed; matrix = BLOSUM62; filtering = BLOSUM62). Can be calculated.
Here, “substantially the same activity” has the same meaning as described above. The “substantially equivalent activity” can be measured in the same manner as described above.
Further, the partial peptide of the AQ27 receptor has one or more (preferably about 1 to 10, more preferably several (1 or 2)) amino acids in the above amino acid sequence deleted, or One or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, and still more preferably several (1 or 2)) amino acids are added to the amino acid sequence, or One or two or more (preferably about 1 to 10, more preferably about 1 to 5, and still more preferably several (1 or 2)) amino acids in the amino acid sequence are substituted with other amino acids. You may.
In addition, the partial peptide of the AQ27 receptor may have a carboxyl group (—COOH), a carboxylate (—COO − ), an amide (—CONH 2 ), or an ester (—COOR) at the C-terminus.
Further, similar to the above-mentioned AQ27 receptor, partial peptides of the AQ27 receptor include those in which the amino group of the N-terminal methionine residue is protected by a protecting group, and those obtained by cutting the N-terminal side in vivo to form glutamyl. Examples include those in which the group is pyroglutamine-oxidized, those in which the substituent on the side chain of the amino acid in the molecule is protected with an appropriate protecting group, and those in which a sugar chain is bound, such as a so-called glycopeptide.
As the salt of the AQ27 receptor or a partial peptide thereof, a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid) And tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid and benzenesulfonic acid).

ＡＱ２７受容体をコードするＤＮＡとしては、前述したＡＱ２７受容体をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ-ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
具体的には、ＡＱ２７受容体をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１０、配列番号：１２または配列番号：１４で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：１０、配列番号：１２または配列番号：１４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有し、配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列からなるＡＱ２７受容体と実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するＡＱ２７受容体をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：１０、配列番号：１２または配列番号：１４で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１０、配列番号：１２または配列番号：１４で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
該ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号：９で表わされるアミノ酸配列からなるヒトＡＱ２７受容体をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１０で表わされる塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。配列番号：１１で表わされるアミノ酸配列からなるラットＡＱ２７受容体をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１２で表わされる塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列からなるマウスＡＱ２７受容体をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１４で表わされる塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。
ヒトＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩は、ＷＯ０１／１６３１６号公報に記載の方法に準じて製造することができる。
ラットまたはマウスＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩は、新規な蛋白質であり、ＷＯ０１／１６３１６号公報に記載の方法に準じて製造することができる。 The DNA encoding the AQ27 receptor may be any DNA containing the above-described nucleotide sequence encoding the AQ27 receptor. In addition, any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the aforementioned cells / tissues, cDNA library derived from the aforementioned cells / tissues, and synthetic DNA may be used. The vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, amplification can be performed directly by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR) using a total RNA or mRNA fraction prepared from the cells and tissues described above.
Specifically, as the DNA encoding the AQ27 receptor, for example, a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, or SEQ ID NO: 14, or SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: It has a DNA that hybridizes under high stringent conditions with a DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 14, and has a DNA sequence comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11 or 13 Any DNA may be used as long as it encodes an AQ27 receptor having substantially the same activity (eg, ligand binding activity, signal transduction action, etc.) as the AQ27 receptor.
Examples of the DNA that hybridizes with the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 14 under high stringent conditions include, for example, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 or DNA containing a base sequence having a homology of about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and still more preferably about 95% or more with the base sequence represented by SEQ ID NO: 14; Used.
The homology of the nucleotide sequences was determined using the homology calculation algorithm NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) under the following conditions (expected value = 10; gap allowed; filtering = ON; match score = 1; Mismatch score = −3).
Hybridization can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). . When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be carried out under high stringent conditions.
The high stringent conditions are, for example, conditions in which the sodium concentration is about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and the temperature is about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 65 ° C. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C. is most preferable.
More specifically, as the DNA encoding the human AQ27 receptor consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, a DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 or the like is used. As the DNA encoding the rat AQ27 receptor consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, a DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 12 or the like is used. As the DNA encoding the mouse AQ27 receptor consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, a DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 14 or the like is used.
The human AQ27 receptor, a partial peptide thereof, or a salt thereof can be produced according to the method described in WO01 / 16316.
The rat or mouse AQ27 receptor, a partial peptide thereof or a salt thereof is a novel protein and can be produced according to the method described in WO01 / 16316.

（２−２）本発明のペプチドの発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法
本発明のペプチド、本発明のオリゴヌクレオチド、本発明の形質変換体または本発明の抗体は、本発明のペプチドの発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング法に使用することができる。
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明のペプチドを発現し得る細胞または組織を、試験化合物の存在下および非存在下で培養した場合における、それぞれの本発明のペプチドの発現量または本発明のペプチドをコードするｍＲＮＡ量を測定し、比較することを特徴とする本発明のペプチドの発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のペプチドを発現し得る細胞または組織としては、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル等）の細胞（例えば、神経細胞、内分泌細胞、神経内分泌細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、肝細胞、脾細胞、メサンギウム細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、樹状細胞）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞等、もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、唾液腺、末梢血、前立腺、睾丸（精巣）、卵巣、胎盤、子宮、骨、軟骨、関節、骨格筋等を用いても良い。その際、株化細胞、初代培養系を用いてもよい。また、前記した本発明の形質転換された形質変換体を使用してもよい。
本発明のペプチドを発現し得る細胞の培養方法は、前記した本発明の形質変換体の培養法と同様である。
試験化合物としては、前記の試験化合物の他、ＤＮＡライブラリーなどを用いることができる。 (2-2) Screening method for compound or salt thereof that promotes or inhibits expression of peptide of the present invention The peptide of the present invention, the oligonucleotide of the present invention, the transformant of the present invention, or the antibody of the present invention It can be used in a screening method for a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the expression of a peptide.
That is, the present invention
(I) Expression amount of each peptide of the present invention or amount of mRNA encoding the peptide of the present invention when cells or tissues capable of expressing the peptide of the present invention are cultured in the presence and absence of a test compound And a method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the expression of the peptide of the present invention, characterized by measuring and comparing
Examples of cells or tissues capable of expressing the peptide of the present invention include cells of humans and warm-blooded animals (eg, guinea pigs, rats, mice, chickens, rabbits, pigs, sheep, cows, monkeys, etc.) (eg, neurons, endocrine cells). Cells, neuroendocrine cells, glial cells, pancreatic β cells, bone marrow cells, hepatocytes, splenocytes, mesangial cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fibrocytes, muscle cells, adipocytes, immune cells ( Eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes, dendritic cells), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells, Osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, or stromal cells, or precursor cells, stem cells, or cancer cells of these cells, or any tissue in which these cells are present, for example, brain, parts of the brain (Eg, olfactory bulb, amygdala, basal cerebral sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, cerebral cortex, medulla, cerebellum), spinal cord, pituitary, stomach, pancreas, kidney, liver, gonads, thyroid, gallbladder, bone marrow, adrenal, Skin, muscle, lung, digestive tract (eg, large intestine, small intestine), blood vessels, heart, thymus, spleen, salivary gland, peripheral blood, prostate, testicle (testis), ovary, placenta, uterus, bone, cartilage, joint, skeletal muscle In this case, a cell line or a primary culture system may be used, and the above-described transformed transformant of the present invention may be used.
The method for culturing cells capable of expressing the peptide of the present invention is the same as the above-described method for culturing the transformant of the present invention.
As the test compound, a DNA library or the like can be used in addition to the test compounds described above.

本発明のペプチドの発現量は抗体などを用いて免疫化学的方法などの公知の方法により測定することもできるし、本発明のペプチドをコードするｍＲＮＡをノーザンハイブリダイゼーション法、ＲＴ−ＰＣＲやＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法を用いて、公知の方法により測定することもできる。
ｍＲＮＡの発現量の比較をハイブリダイゼーション法によって行うには、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法等に従って行なうことができる。
具体的には、本発明のペプチドをコードするｍＲＮＡの量の測定は、公知の方法に従って細胞から抽出したＲＮＡと、本発明のポリヌクレオチドもしくはその一部または本発明のアンチセンスポリヌクレオチドとを接触させ、本発明のポリヌクレオチドもしくはその一部または本発明のアンチセンスポリヌクレオチド結合したｍＲＮＡの量を測定することによって行われる。本発明のポリヌクレオチドもしくはその一部または本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを、例えば放射性同位元素、色素などで標識することによって、本発明のポリヌクレオチドもしくはその一部または本発明のアンチセンスポリヌクレオチドに結合したｍＲＮＡの量が容易に測定できる。放射性同位元素としては、例えば32Ｐ、3Ｈなどが用いられ、色素としては、例えばfluorescein、ＦＡＭ（PE Biosystems社製）、ＪＯＥ（PE Biosystems社製）、ＴＡＭＲＡ（PE Biosystems社製）、ＲＯＸ（PE Biosystems社製）、Ｃｙ５（Amersham社製）、Ｃｙ３（Amersham社製）などの蛍光色素が用いられる。
また、ｍＲＮＡの量は、細胞から抽出したＲＮＡを逆転写酵素によってｃＤＮＡに変換した後、本発明のポリヌクレオチドもしくはその一部または本発明のアンチセンスポリヌクレオチドをプライマーとして用いるＰＣＲによって、増幅されるｃＤＮＡの量を測定することによって行うことができる。
このように、本発明のペプチドをコードするｍＲＮＡの量を増加させる試験化合物を、本発明のペプチドの発現を促進する活性を有する化合物またはその塩として選択することができ、また本発明のペプチドをコードするｍＲＮＡの量を減少させる試験化合物を、本発明のペプチドの発現を阻害する活性を有する化合物またはその塩として選択することができる。 The expression level of the peptide of the present invention can be measured by a known method such as an immunochemical method using an antibody or the like, or mRNA encoding the peptide of the present invention can be analyzed by Northern hybridization, RT-PCR or TaqMan PCR. It can also be measured by a known method using the method.
In order to compare the expression level of mRNA by a hybridization method, a known method or a method similar thereto, for example, Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) And the like.
Specifically, the amount of mRNA encoding the peptide of the present invention is measured by contacting RNA extracted from cells according to a known method with the polynucleotide of the present invention or a part thereof, or the antisense polynucleotide of the present invention. Then, the amount of mRNA bound to the polynucleotide of the present invention or a part thereof or the antisense polynucleotide of the present invention is measured. By labeling the polynucleotide of the present invention or a part thereof or the antisense polynucleotide of the present invention with, for example, a radioisotope, a dye or the like, the polynucleotide of the present invention or a part thereof or the antisense polynucleotide of the present invention can be obtained. The amount of bound mRNA can be easily measured. As the radioisotope, for example, 32 P, 3 H or the like is used, and as the dye, for example, fluorescein, FAM (manufactured by PE Biosystems), JOE (manufactured by PE Biosystems), TAMRA (manufactured by PE Biosystems), ROX ( Fluorescent dyes such as PE Biosystems, Cy5 (Amersham) and Cy3 (Amersham) are used.
Further, the amount of mRNA is amplified by converting RNA extracted from cells into cDNA with reverse transcriptase, and then performing PCR using the polynucleotide of the present invention or a part thereof or the antisense polynucleotide of the present invention as a primer. It can be performed by measuring the amount of cDNA.
As described above, a test compound that increases the amount of mRNA encoding the peptide of the present invention can be selected as a compound having an activity of promoting the expression of the peptide of the present invention or a salt thereof. A test compound that reduces the amount of the encoded mRNA can be selected as a compound having an activity of inhibiting the expression of the peptide of the present invention or a salt thereof.

さらに、本発明は、
（ii）本発明のペプチドをコードする遺伝子のプロモーター領域またはエンハンサー領域の下流にレポーター遺伝子を連結した組換えＤＮＡで形質転換した形質転換体を試験化合物の存在下および非存在下で培養した場合における、それぞれのレポーター活性を測定し、比較することを特徴とする当該プロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
レポーター遺伝子としては、例えば、ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、ルシフェラーゼ、成長因子、β-グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼ、Green fluorescent protein (GFP)、β-ラクタマーゼなどが用いられる。
レポーター遺伝子産物（例、ｍＲＮＡ、蛋白質）の量を公知の方法を用いて測定することによって、レポーター遺伝子産物の量を増加させる試験化合物を本発明のペプチドのプロモーターもしくはエンハンサーの活性を制御（特に促進）する作用を有する化合物またはその塩、すなわち本発明のペプチドの発現を促進する活性を有する化合物またはその塩として選択できる。逆に、レポーター遺伝子産物の量を減少させる試験化合物を本発明のペプチドのプロモーターもしくはエンハンサーの活性を制御（特に阻害）する作用を有する化合物またはその塩、すなわち本発明のペプチドの発現を阻害する活性を有する化合物またはその塩として選択することができる。
試験化合物と試験化合物が形成してもよい塩としては、前記と同様のものが使用される。
形質転換体の培養は、前記の本発明の形質転換体と同様にして行うことができる。
レポーター遺伝子のベクター構築やアッセイ法は公知の技術に従うことができる（例えば、Molecular Biotechnology 13, 29-43, 1999）。 Further, the present invention provides
(Ii) When a transformant transformed with a recombinant DNA having a reporter gene ligated downstream of a promoter region or an enhancer region of a gene encoding the peptide of the present invention is cultured in the presence or absence of a test compound. And a method for screening for a compound or a salt thereof which promotes or inhibits the promoter activity, which comprises measuring and comparing the respective reporter activities.
As the reporter gene, for example, lacZ (β-galactosidase gene), chloramphenicol acetyltransferase (CAT), luciferase, growth factor, β-glucuronidase, alkaline phosphatase, Green fluorescent protein (GFP), β-lactamase and the like are used. Can be
By measuring the amount of the reporter gene product (eg, mRNA, protein) using a known method, a test compound that increases the amount of the reporter gene product controls (particularly promotes) the activity of the promoter or enhancer of the peptide of the present invention. ), Or a salt thereof, that is, a compound having an activity of promoting the expression of the peptide of the present invention or a salt thereof. Conversely, a compound having a function of controlling (particularly inhibiting) the activity of the promoter or enhancer of the peptide of the present invention or a salt thereof, that is, an activity of inhibiting the expression of the peptide of the present invention, Or a salt thereof.
As a salt which may be formed by the test compound and the test compound, the same as those described above are used.
The transformant can be cultured in the same manner as the above-described transformant of the present invention.
Vector construction and assay of the reporter gene can be performed according to known techniques (for example, Molecular Biotechnology 13, 29-43, 1999).

本発明のペプチドの発現を促進する活性を有する化合物またはその塩は、本発明のペプチドの作用を増強することができるので、本発明のペプチドと同様に安全で低毒性な副腎皮質ホルモン分泌調節剤、好ましくは副腎皮質ホルモン分泌促進剤として有用である。さらに、本発明のペプチドの発現を促進する活性を有する化合物またはその塩は、低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛み、肥満などの予防・治療剤として有用である。
また、本発明のペプチドの発現を促進する活性を有する化合物またはその塩は、安全で低毒性な男性ホルモン分泌調節剤、好ましくは男性ホルモン分泌促進剤として有用である。さらに、本発明のペプチドの発現を促進する活性を有する化合物またはその塩は、例えば、男性性腺機能不全、造精機能障害に伴う男子不妊症、再生不良性貧血、骨髄線維症、腎性貧血、末期女性性器癌の疼痛緩和、乳癌（例、手術不能乳癌）、乳腺症、乳腺腫瘍、女性化乳房などの予防・治療剤として有用である。
逆に、本発明のペプチドの発現を阻害する活性を有する化合物またはその塩は、本発明のペプチドが有する生理活性を抑制することができるので、安全で低毒性な副腎皮質ホルモン分泌調節剤、好ましくは副腎皮質ホルモン分泌阻害剤（副腎皮質ホルモン分泌抑制剤）として有用である。さらに、本発明のペプチドの発現を阻害する活性を有する化合物またはその塩は、クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍、過敏性腸症候群などの予防・治療剤として有用である。
また、本発明のペプチドの発現を阻害する活性を有する化合物またはその塩は、安全で低毒性な男性ホルモン分泌調節剤、好ましくは男性ホルモン分泌阻害剤（男性ホルモン分泌抑制剤）として有用である。さらに、本発明のペプチドの発現を阻害する活性を有する化合物またはその塩は、例えば、陰茎肥大、精巣萎縮、精巣機能異常（例、精子減少）、月経異常、多毛、色素沈着、嗄声、過敏症、坐瘡、悪心、嘔吐、消化器系症状（例、食欲不振）、満月様顔貌などの予防・治療剤として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物である。
該化合物の塩としては、前記した本発明のペプチドの塩と同様のものが用いられる。 Since the compound having the activity of promoting the expression of the peptide of the present invention or a salt thereof can enhance the action of the peptide of the present invention, it is a safe and low toxic adrenocortical hormone secretion regulator similar to the peptide of the present invention. , Preferably as a corticosteroid secretagogue. Further, a compound having an activity of promoting the expression of the peptide of the present invention or a salt thereof may be hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain, obesity, etc. Is useful as a prophylactic / therapeutic agent.
Further, the compound having an activity of promoting the expression of the peptide of the present invention or a salt thereof is useful as a safe and low toxic androgen secretion regulator, preferably a androgen secretion promoter. Further, a compound having an activity of promoting the expression of the peptide of the present invention or a salt thereof is, for example, male gonad dysfunction, male infertility associated with impaired spermatogenic function, aplastic anemia, myelofibrosis, renal anemia, It is useful as a pain relieving agent for terminal female genital cancer, a preventive / therapeutic agent for breast cancer (eg, inoperable breast cancer), mastopathy, breast tumor, gynecomastia, etc.
Conversely, a compound having an activity of inhibiting the expression of the peptide of the present invention or a salt thereof can suppress the physiological activity of the peptide of the present invention, and thus is a safe and low-toxicity corticosteroid secretion regulator, preferably Is useful as a corticosteroid secretion inhibitor (corticosteroid secretion inhibitor). Further, a compound having an activity of inhibiting the expression of the peptide of the present invention or a salt thereof is used for Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for sickness, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, gastric / duodenal ulcer, irritable bowel syndrome and the like.
The compound having an activity of inhibiting the expression of the peptide of the present invention or a salt thereof is useful as a safe and low toxic androgen secretion regulator, preferably a androgen secretion inhibitor (androgen secretion inhibitor). Further, the compound having an activity of inhibiting the expression of the peptide of the present invention or a salt thereof includes, for example, penile hypertrophy, testicular atrophy, testicular dysfunction (eg, sperm reduction), menstrual abnormalities, hirsutism, pigmentation, hoarseness, and hypersensitivity. , Acne, nausea, vomiting, gastrointestinal symptoms (eg, anorexia), full moon-like face, etc. are useful as preventive and therapeutic agents.
Compounds or salts thereof obtained using the screening method or screening kit of the present invention include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts And compounds selected from plasma and the like.
As the salt of the compound, those similar to the aforementioned salts of the peptide of the present invention are used.

本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物を上述の治療・予防剤として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。例えば、前記した本発明のペプチドを含有する医薬と同様にして、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などとすることができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、本発明のペプチドの発現を促進する化合物またはその塩を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ当たり）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のペプチドの発現を促進する化合物またはその塩を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇ当たり）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
これらの医薬は前記と同様に製剤化して、使用することができる。 When a compound obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic / prophylactic agent, it can be carried out according to conventional means. For example, tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sterile solutions, suspensions, and the like can be prepared in the same manner as in the above-mentioned drug containing the peptide of the present invention.
The preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, human or warm-blooded animals (eg, mouse, rat, rabbit, sheep, pig, cow, horse, bird, cat, dog, monkey, chimpanzee, etc.) ) Can be administered.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on its action, target disease, administration subject, administration route, and the like. Particularly for adults (per 60 kg body weight), about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg of the compound is administered per day. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, the target disease, and the like. When administered to an adult (per 60 kg body weight), the compound is administered by intravenous injection at about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day. It is convenient to do so. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
These medicaments can be formulated and used as described above.

（３）本発明のペプチドの定量および診断方法
本発明の抗体は、本発明のペプチドを特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のペプチドの定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化された本発明のペプチドとを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明のペプチドの割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のペプチドの定量法、および
（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のペプチドの定量法を提供する。
上記（ii）の定量法においては、一方の抗体が本発明のペプチドのＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のペプチドのＣ端部に反応する抗体であることが望ましい。
また、本発明のペプチドに対するモノクローナル抗体を用いて本発明のペプチドの定量を行うことができるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')2、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のペプチドの定量法は、 特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、ペプチド量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。 (3) Method for quantifying and diagnosing the peptide of the present invention Since the antibody of the present invention can specifically recognize the peptide of the present invention, the quantification of the peptide of the present invention in a test solution, particularly a sandwich immunoassay method It can be used for quantification by, for example.
That is, the present invention
(I) reacting the antibody of the present invention with a test solution and a labeled peptide of the present invention competitively, and measuring the ratio of the labeled peptide of the present invention bound to the antibody; And (ii) simultaneously or sequentially reacting the test solution with the antibody of the present invention insolubilized on a carrier and another antibody of the present invention labeled on the carrier. The present invention provides a method for quantifying the peptide of the present invention in a test solution, which comprises measuring the activity of a labeling agent on an insolubilized carrier after the reaction.
In the quantification method (ii), it is desirable that one antibody is an antibody that recognizes the N-terminal of the peptide of the present invention and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal of the peptide of the present invention.
In addition, the peptide of the present invention can be quantified using a monoclonal antibody against the peptide of the present invention, and can also be detected by tissue staining or the like. For these purposes, the antibody molecule itself may be used, or F (ab ') 2 , Fab', or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
The method for quantifying the peptide of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited. Any measurement method may be used as long as the amount is detected by chemical or physical means and the amount is calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. For example, nephelometry, a competitive method, an immunometric method, and a sandwich method are preferably used, but in terms of sensitivity and specificity, it is particularly preferable to use a sandwich method described later.

標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125Ｉ〕、〔131Ｉ〕、〔3Ｈ〕、〔14Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、物理吸着を用いてもよく、また通常ペプチドあるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のペプチド量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。 As a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance, for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used. As the radioisotope, for example, [ 125 I], [ 131 I], [ 3 H], [ 14 C] and the like are used. As the above enzyme, a stable enzyme having a large specific activity is preferable. For example, β-galactosidase, β-glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used. As the fluorescent substance, for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate and the like are used. As the luminescent substance, for example, luminol, a luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used. Further, a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
For insolubilization of the antigen or antibody, physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used for insolubilizing or immobilizing a peptide or enzyme may be used. Examples of the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass.
In the sandwich method, the test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with another labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction). By measuring the activity of the labeling agent, the amount of the peptide of the present invention in the test solution can be determined. The primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times. The labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above. In the immunoassay by the sandwich method, the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one kind, and a mixture of two or more kinds of antibodies is used for the purpose of improving the measurement sensitivity and the like. You may.

本発明のサンドイッチ法による本発明のペプチドの測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、本発明のペプチドの結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明のペプチドのＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原(Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のペプチドの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D : Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E : Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I : Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、本発明のペプチドを感度良く定量することができる。 In the method for measuring the peptide of the present invention by the sandwich method of the present invention, the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having a different site to which the peptide of the present invention binds. That is, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the peptide of the present invention, the antibody used in the primary reaction is preferably An antibody that recognizes, for example, the N-terminal other than the C-terminal is used.
The monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, a nephrometry, or the like.
In the competition method, after the antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated. (B / F separation), the amount of any of B and F is measured, and the amount of antigen in the test solution is quantified. In this reaction method, a soluble antibody is used as the antibody, B / F separation is performed using polyethylene glycol, a liquid phase method using a second antibody against the antibody, or a solid phase antibody is used as the first antibody. As the first antibody, a soluble antibody is used, and an immobilization method using an immobilized antibody as the second antibody is used.
In the immunometric method, the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction against a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated. And an excess amount of the labeled antibody, and then immobilized antigen is added to bind unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of label in any phase is measured to determine the amount of antigen in the test solution.
In nephelometry, the amount of insoluble precipitates generated as a result of an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
In applying these individual immunoassays to the quantification method of the present invention, no special conditions, operations, and the like need to be set. The measurement system for the peptide of the present invention may be constructed by adding ordinary technical considerations of those skilled in the art to ordinary conditions and operation methods in each method. For details of these general technical means, reference can be made to reviews, books, and the like.
For example, Hiroe Irie, "Radio Immunoassay" (Kodansha, published in 1974), Hiroshi Irie, "Radio Immunoassay" (Kodansha, published in 1974), Eiji Ishikawa et al., "Enzyme Immunoassay" (Medical Shoin, Showa Ed. Ishikawa et al., “Enzyme Immunoassay” (2nd edition) (Issue Shoin, 1982), Eiji Ishikawa et. Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A)), Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B)), Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C)), Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part C)) 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays)), ibid.Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), ibid.Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies). Academic Press Issue) and the like can be referred to.
As described above, the peptide of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.

さらに、本発明の抗体を用いて本発明のペプチドの濃度を定量することによって、本発明のペプチドの濃度の減少が検出された場合、例えば、本発明のペプチドの機能不全に関連する疾患である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、本発明のペプチドの濃度の増加が検出された場合には、例えば、本発明のペプチドの過剰発現に起因する疾患である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
本発明のペプチドの機能不全に関連する疾患としては、例えば、低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛み、肥満、男性性腺機能不全、造精機能障害に伴う男子不妊症、再生不良性貧血、骨髄線維症、腎性貧血、末期女性性器癌の疼痛緩和、乳癌（例、手術不能乳癌）、乳腺症、乳腺腫瘍、女性化乳房などが挙げられる。
本発明のペプチドの過剰発現に起因する疾患としては、例えば、クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍、過敏性腸症候群、陰茎肥大、精巣萎縮、精巣機能異常（例、精子減少）、月経異常、多毛、色素沈着、嗄声、過敏症、坐瘡、悪心、嘔吐、消化器系症状（例、食欲不振）、満月様顔貌などが挙げられる。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のペプチドを検出するために使用することができる。また、本発明のペプチドを精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のペプチドの検出、被検細胞内における本発明のペプチドの挙動の分析などのために使用することができる。 Furthermore, when a decrease in the concentration of the peptide of the present invention is detected by quantifying the concentration of the peptide of the present invention using the antibody of the present invention, for example, a disease associated with dysfunction of the peptide of the present invention. Or the likelihood of future illness is high.
When an increase in the concentration of the peptide of the present invention is detected, for example, it can be diagnosed that the disease is caused by overexpression of the peptide of the present invention or that the disease is likely to be caused in the future.
Diseases associated with dysfunction of the peptide of the present invention include, for example, hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain, obesity, male gonad dysfunction , Male infertility associated with dysgenesis dysfunction, aplastic anemia, myelofibrosis, renal anemia, pain relief for end stage female genital cancer, breast cancer (eg, inoperable breast cancer), mastopathy, breast tumor, gynecomastia And the like.
Examples of diseases caused by overexpression of the peptide of the present invention include Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, and congenital Adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, stomach / duodenal ulcer, irritable bowel syndrome, penile hypertrophy, testicular atrophy, testicular dysfunction (eg, decreased sperm), menstrual abnormalities, hirsutism, pigmentation , Hoarseness, irritability, acne, nausea, vomiting, gastrointestinal symptoms (eg, anorexia), full moon-like face, and the like.
Further, the antibody of the present invention can be used for detecting the peptide of the present invention present in a subject such as a body fluid or a tissue. In addition, for preparation of an antibody column used for purifying the peptide of the present invention, detection of the peptide of the present invention in each fraction at the time of purification, analysis of the behavior of the peptide of the present invention in test cells, etc. Can be used.

（４）遺伝子診断剤
本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、例えば、プローブとして使用することにより、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、など）における本発明のペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。
本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Genomics），第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America），第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションにより発現低下が検出された場合は、 例えば、本発明のペプチドの機能不全に関連する疾患である可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、ノーザンハイブリダイゼーションにより発現過多が検出された場合は、例えば、本発明のペプチドの過剰発現に起因する疾患である可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
本発明のペプチドの発現低下に起因する疾患としては、例えば、低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛み、肥満、男性性腺機能不全、造精機能障害に伴う男子不妊症、再生不良性貧血、骨髄線維症、腎性貧血、末期女性性器癌の疼痛緩和、乳癌（例、手術不能乳癌）、乳腺症、乳腺腫瘍、女性化乳房などが挙げられる。
本発明のペプチドの過剰発現に起因する疾患としては、例えば、クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍、過敏性腸症候群、陰茎肥大、精巣萎縮、精巣機能異常（例、精子減少）、月経異常、多毛、色素沈着、嗄声、過敏症、坐瘡、悪心、嘔吐、消化器系症状（例、食欲不振）、満月様顔貌などが挙げられる。 (4) Gene diagnostic agent The polynucleotide of the present invention or the antisense polynucleotide of the present invention can be used, for example, as a probe to produce a human or warm-blooded animal (eg, rat, mouse, guinea pig, rabbit, bird, sheep, Since abnormalities (genetic abnormalities) of DNA or mRNA encoding the peptide of the present invention in pigs, cows, horses, cats, dogs, monkeys, etc.) can be detected, for example, damage or mutation of the DNA or mRNA Alternatively, it is useful as an agent for diagnosing a gene such as decreased expression, increased DNA or mRNA, or excessive expression.
The above-mentioned genetic diagnosis using the polynucleotide of the present invention or the antisense polynucleotide of the present invention can be performed, for example, by the known Northern hybridization or PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989)). Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 86, pp. 2766-2770 (1989). ) And the like.
For example, when a decrease in expression is detected by Northern hybridization, for example, it can be diagnosed that there is a high possibility that the disease is related to dysfunction of the peptide of the present invention, or that there is a high possibility that the disease will occur in the future.
When overexpression is detected by Northern hybridization, for example, it can be diagnosed that the disease is highly likely to be caused by overexpression of the peptide of the present invention or is likely to be affected in the future.
Diseases resulting from reduced expression of the peptide of the present invention include, for example, hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain, obesity, male gonad dysfunction , Male infertility associated with dysgenesis dysfunction, aplastic anemia, myelofibrosis, renal anemia, pain relief for end stage female genital cancer, breast cancer (eg, inoperable breast cancer), mastopathy, breast tumor, gynecomastia And the like.
Examples of diseases caused by overexpression of the peptide of the present invention include Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, and congenital Adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, stomach / duodenal ulcer, irritable bowel syndrome, penile hypertrophy, testicular atrophy, testicular dysfunction (eg, decreased sperm), menstrual abnormalities, hirsutism, pigmentation , Hoarseness, irritability, acne, nausea, vomiting, gastrointestinal symptoms (eg, anorexia), full moon-like face, and the like.

（５）アンチセンスポリヌクレオチドを含有する医薬
本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）に相補的に結合し、該ポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）の発現を抑制することができる本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは低毒性であり、生体内における本発明のレセプター蛋白質または本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）の機能を抑制することができるので、例えば、本発明のペプチドの過剰発現に起因する疾患の予防・治療剤として用いることができる。
具体的には、本発明のＤＮＡに対するアンチセンスポリヌクレオチド（例、アンチセンスＤＮＡ）は、本発明のペプチドの機能を阻害することができるので、副腎皮質ホルモン分泌調節剤、好ましくは副腎皮質ホルモン分泌阻害剤（副腎皮質ホルモン分泌抑制剤）として有用である。さらに、本発明のＤＮＡに対するアンチセンスポリヌクレオチドは、クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍、過敏性腸症候群などの予防・治療剤として有用である。
また、本発明のＤＮＡに対するアンチセンスポリヌクレオチド（例、アンチセンスＤＮＡ）は、安全で低毒性な男性ホルモン分泌調節剤、好ましくは男性ホルモン分泌阻害剤（男性ホルモン分泌抑制剤）として有用である。さらに、本発明のＤＮＡに対するアンチセンスポリヌクレオチドは、例えば、男性性腺機能不全、造精機能障害に伴う男子不妊症、再生不良性貧血、骨髄線維症、腎性貧血、末期女性性器癌の疼痛緩和、乳癌（例、手術不能乳癌）、乳腺症、乳腺腫瘍、女性化乳房などの予防・治療剤として有用である。 (5) Drugs Containing Antisense Polynucleotide The antisense polynucleotide of the present invention capable of binding complementarily to the polynucleotide (eg, DNA) of the present invention and suppressing the expression of the polynucleotide (eg, DNA). Since nucleotides have low toxicity and can suppress the function of the receptor protein of the present invention or the polynucleotide (eg, DNA) of the present invention in vivo, for example, a disease caused by overexpression of the peptide of the present invention can be used. It can be used as a prophylactic / therapeutic agent.
Specifically, since an antisense polynucleotide (eg, antisense DNA) against the DNA of the present invention can inhibit the function of the peptide of the present invention, a corticosteroid secretion regulator, preferably a corticosteroid secretion is used. It is useful as an inhibitor (an inhibitor of corticosteroid secretion). Furthermore, antisense polynucleotides against the DNA of the present invention include Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency , Stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, gastric / duodenal ulcer, irritable bowel syndrome, etc.
Further, the antisense polynucleotide (eg, antisense DNA) against the DNA of the present invention is useful as a safe and low toxic androgen secretion regulator, preferably a androgen secretion inhibitor (androgen secretion inhibitor). Furthermore, the antisense polynucleotide against the DNA of the present invention can be used, for example, to relieve pain in male gonad dysfunction, male infertility associated with impaired spermatogenic function, aplastic anemia, myelofibrosis, renal anemia, and terminal female genital cancer. It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for breast cancer (eg, inoperable breast cancer), mastopathy, breast tumor, gynecomastia, and the like.

上記アンチセンスポリヌクレオチドを上記の治療・予防剤として使用する場合は、該アンチセンスポリヌクレオチドを、上記した本発明のポリヌクレオチドの場合と同様にして製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は低毒性であり、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。
なお、該アンチセンスポリヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進用の補助剤などの生理学的に認められる担体とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することもできる。
該アンチセンスポリヌクレオチドの投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより異なるが、例えば、癌の治療の目的で本発明のアンチセンスヌクレオチドを臓器（例、肝臓、肺、心臓、腎臓など）に局所投与する場合、成人（体重６０ｋｇ）に対して、一日あたり約０．１〜１００ｍｇである。
さらに、該アンチセンスポリヌクレオチドは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。 When the above-mentioned antisense polynucleotide is used as the above-mentioned therapeutic / prophylactic agent, the above-mentioned antisense polynucleotide can be formulated as in the case of the above-mentioned polynucleotide of the present invention.
The preparation thus obtained has low toxicity and should be administered orally or parenterally to humans or mammals (eg, rats, rabbits, sheep, pigs, cattle, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be.
The antisense polynucleotide can be administered as it is or together with a physiologically acceptable carrier such as an auxiliary for promoting uptake by a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
The dose of the antisense polynucleotide varies depending on the target disease, the subject of administration, the administration route, and the like. For example, the antisense nucleotide of the present invention may be administered to an organ (eg, liver, lung, heart, kidney, etc.) for the treatment of cancer. ) Is about 0.1 to 100 mg per day for an adult (body weight 60 kg).
Further, the antisense polynucleotide can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence of the DNA of the present invention in tissues or cells and the state of expression thereof.

本発明は、さらに
１）本発明のペプチドをコードするＲＮＡの一部とそれに相補的なＲＮＡとを含有する二重鎖ＲＮＡ、
２）前記二重鎖ＲＮＡを含有してなる医薬、
３）本発明のペプチドをコードするＲＮＡの一部を含有するリボザイム、
４）前記リボザイムを含有してなる医薬を提供する。
これらの二重鎖ＲＮＡ（RNAi；RNA interference法）、リボザイムなどは、上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）の発現を抑制することができ、生体内における本発明のペプチドまたはそれをコードする本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）の機能を抑制することができるので、例えば、副腎皮質ホルモン分泌調節剤、好ましくは副腎皮質ホルモン分泌阻害剤（副腎皮質ホルモン分泌抑制剤）として有用である。さらに、これらの二重鎖ＲＮＡ、リボザイムなどは、クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍、過敏性腸症候群などの予防・治療剤として有用である。
また、これらの二重鎖ＲＮＡ、リボザイムなどは、安全で低毒性な男性ホルモン分泌調節剤、好ましくは男性ホルモン分泌阻害剤（男性ホルモン分泌抑制剤）として有用である。さらに、これらの二重鎖ＲＮＡ、リボザイムなどは、例えば、男性性腺機能不全、造精機能障害に伴う男子不妊症、再生不良性貧血、骨髄線維症、腎性貧血、末期女性性器癌の疼痛緩和、乳癌（例、手術不能乳癌）、乳腺症、乳腺腫瘍、女性化乳房などの予防・治療剤として有用である。
二重鎖ＲＮＡは、公知の方法（例、Nature, 411巻, 494頁, 2001年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
リボザイムは、公知の方法（例、TRENDS in Molecular Medicine, 7巻, 221頁, 2001年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。例えば、本発明のペプチドをコードするＲＮＡの一部に公知のリボザイムを連結することによって製造することができる。本発明のペプチドをコードするＲＮＡの一部としては、公知のリボザイムによって切断され得る本発明のＲＮＡ上の切断部位に近接した部分（ＲＮＡ断片）が挙げられる。
上記の二重鎖ＲＮＡまたはリボザイムを上記予防・治療剤として使用する場合、アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、投与することができる。 The present invention further provides 1) a double-stranded RNA containing a part of the RNA encoding the peptide of the present invention and an RNA complementary thereto.
2) a medicine comprising the double-stranded RNA,
3) a ribozyme containing a part of RNA encoding the peptide of the present invention;
4) To provide a medicine comprising the ribozyme.
These double-stranded RNAs (RNAi; RNA interference method), ribozymes, and the like can suppress the expression of the polynucleotide (eg, DNA) of the present invention in the same manner as the above-mentioned antisense polynucleotide. Since the function of the peptide of the present invention or the polynucleotide of the present invention (eg, DNA) encoding the same can be suppressed, for example, a corticosteroid secretion regulator, preferably a corticosteroid secretion inhibitor (corticosteroid secretion) Useful as an inhibitor). Furthermore, these double-stranded RNAs, ribozymes, etc. are used for Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency , Stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, gastric / duodenal ulcer, irritable bowel syndrome, and the like.
In addition, these double-stranded RNAs, ribozymes and the like are useful as safe and low toxic androgen secretion regulators, preferably as androgen secretion inhibitors (androgen secretion inhibitors). Furthermore, these double-stranded RNAs, ribozymes and the like are used, for example, for relieving pain in male gonad dysfunction, male infertility associated with impaired dysgenesis, aplastic anemia, myelofibrosis, renal anemia, terminal female genital cancer. It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for breast cancer (eg, inoperable breast cancer), mastopathy, breast tumor, gynecomastia, and the like.
The double-stranded RNA can be produced by designing based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, Nature, 411, 494, 2001).
A ribozyme can be designed and produced based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, TRENDS in Molecular Medicine, Vol. 7, pp. 221, 2001). For example, it can be produced by linking a known ribozyme to a part of RNA encoding the peptide of the present invention. Examples of a part of the RNA encoding the peptide of the present invention include a portion (RNA fragment) close to a cleavage site on the RNA of the present invention that can be cleaved by a known ribozyme.
When the above-mentioned double-stranded RNA or ribozyme is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated and administered in the same manner as an antisense polynucleotide.

（６）本発明の抗体を含有する医薬
本発明のペプチドの活性を中和する作用を有する本発明の抗体は、例えば、本発明のペプチドの過剰発現に起因する疾患などの予防・治療薬などの医薬として使用することができる。
具体的には、本発明のペプチドに対する抗体（例、中和抗体）は、本発明のペプチドの機能を阻害することができるので、副腎皮質ホルモン分泌調節剤、好ましくは副腎皮質ホルモン分泌阻害剤（副腎皮質ホルモン分泌抑制剤）として有用である。さらに、本発明のペプチドに対する抗体（例、中和抗体）は、クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍、過敏性腸症候群などの予防・治療剤として有用である。
また、本発明のペプチドに対する抗体（例、中和抗体）は、安全で低毒性な男性ホルモン分泌調節剤、好ましくは男性ホルモン分泌阻害剤（男性ホルモン分泌抑制剤）として有用である。さらに、本発明のペプチドに対する抗体は、例えば、男性性腺機能不全、造精機能障害に伴う男子不妊症、再生不良性貧血、骨髄線維症、腎性貧血、末期女性性器癌の疼痛緩和、乳癌（例、手術不能乳癌）、乳腺症、乳腺腫瘍、女性化乳房などの予防・治療剤として有用である。
本発明の抗体を含有する上記疾患の治療・予防剤は、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人に使用する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常０.０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０.１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０.１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。 (6) Pharmaceuticals Containing Antibody of the Present Invention Antibodies of the present invention which have an activity of neutralizing the activity of the peptide of the present invention include, for example, preventive / therapeutic agents for diseases caused by overexpression of the peptide of the present invention, etc. Can be used as a medicine.
Specifically, since an antibody against the peptide of the present invention (eg, a neutralizing antibody) can inhibit the function of the peptide of the present invention, a corticosteroid secretion regulator, preferably a corticosteroid secretion inhibitor ( It is useful as a corticosteroid secretion inhibitor). Furthermore, antibodies (eg, neutralizing antibodies) against the peptide of the present invention include Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for sex adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, gastric / duodenal ulcer, irritable bowel syndrome, and the like.
Further, an antibody against the peptide of the present invention (eg, a neutralizing antibody) is useful as a safe and low toxic androgen secretion regulator, preferably an androgen secretion inhibitor (androgen secretion inhibitor). Furthermore, antibodies against the peptide of the present invention include, for example, male gonad dysfunction, male infertility associated with impaired spermatogenic function, aplastic anemia, myelofibrosis, renal anemia, pain relief for end-stage female genital cancer, breast cancer ( For example, it is useful as a prophylactic / therapeutic agent for mammary gland, breast tumor, gynecomastia, etc.
The therapeutic / prophylactic agent for the above-mentioned diseases containing the antibody of the present invention can be used as it is as a liquid or as a pharmaceutical composition in an appropriate dosage form, in humans or mammals (eg, rat, rabbit, sheep, pig, cow, cat, Dogs, monkeys, etc.) orally or parenterally. The dose varies depending on the administration subject, target disease, symptoms, administration route, and the like. For example, when used in adults, the antibody of the present invention is usually administered in a single dose of about 0.01 to 20 mg / kg body weight. Preferably, about 0.1 to 10 mg / kg body weight, more preferably about 0.1 to 5 mg / kg body weight is administered by intravenous injection about 1 to 5 times a day, preferably about 1 to 3 times a day. It is convenient. In the case of other parenteral administration and oral administration, an equivalent amount can be administered. If the symptoms are particularly severe, the dose may be increased according to the symptoms.

本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
すなわち、例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene（５０mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記抗体が含有されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。 The antibodies of the present invention can be administered as such or as a suitable pharmaceutical composition. The pharmaceutical composition used for the above administration contains the above or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient. Such compositions are provided in dosage forms suitable for oral or parenteral administration.
That is, for example, compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (soft capsules and the like). ), Syrups, emulsions, suspensions and the like. Such a composition is produced by a method known per se and contains a carrier, diluent or excipient commonly used in the field of formulation. For example, lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.
As the composition for parenteral administration, for example, injections, suppositories, etc. are used, and the injections are in the form of intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, intravenous injections and the like. Is included. Such injections are prepared according to a method known per se, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the antibody or a salt thereof in a sterile aqueous or oily liquid commonly used for injections. As the aqueous liquid for injection, for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants and the like are used. It may be used in combination with propylene glycol, polyethylene glycol), a nonionic surfactant [eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)]. As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil, or the like is used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol, or the like may be used in combination as a solubilizing agent. The prepared injection is usually filled in an appropriate ampoule. Suppositories to be used for rectal administration are prepared by mixing the above antibody or a salt thereof with a conventional suppository base.
The above-mentioned oral or parenteral pharmaceutical composition is conveniently prepared in a unit dosage form so as to be compatible with the dosage of the active ingredient. Examples of such dosage unit dosage forms include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories and the like. It is preferable that other dosage forms contain 10 to 250 mg of the above antibody.
Each of the above-mentioned compositions may contain another active ingredient as long as the composition does not cause an undesirable interaction with the antibody.

（７）各種薬物の作用メカニズムの解明方法
ＡＱ２７受容体を用いることによって、各種薬物がＡＱ２７受容体を介して薬理効果を発揮しているか否かを確認することができる。
すなわち、本発明は、
（１）ＡＱ２７受容体を用いることを特徴とする、（ｉ）副腎皮質ホルモン分泌促進薬、（ii）低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛み、肥満などの予防・治療薬、（iii）男性ホルモン分泌促進薬、（iv）男性性腺機能不全、造精機能障害に伴う男子不妊症、再生不良性貧血、骨髄線維症、腎性貧血、末期女性性器癌の疼痛緩和、乳癌（例、手術不能乳癌）、乳腺症、乳腺腫瘍、女性化乳房などの予防・治療薬、（ｖ）副腎皮質ホルモン分泌阻害薬（副腎皮質ホルモン分泌抑制薬）、（vi）クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍、過敏性腸症候群などの予防・治療薬、（vii）男性ホルモン分泌阻害薬（男性ホルモン分泌抑制薬）、または（viii）陰茎肥大、精巣萎縮、精巣機能異常（例、精子減少）、月経異常、多毛、色素沈着、嗄声、過敏症、坐瘡、悪心、嘔吐、消化器系症状（例、食欲不振）、満月様顔貌などの予防・治療薬がＡＱ２７受容体に結合することを確認する方法、
（２）ＡＱ２７受容体を用いることを特徴とする、（ｉ）副腎皮質ホルモン分泌促進薬、（ii）低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛み、肥満などの予防・治療薬、（iii）男性ホルモン分泌促進薬、または（iv）男性性腺機能不全、造精機能障害に伴う男子不妊症、再生不良性貧血、骨髄線維症、腎性貧血、末期女性性器癌の疼痛緩和、乳癌（例、手術不能乳癌）、乳腺症、乳腺腫瘍、女性化乳房などの予防・治療薬がＡＱ２７受容体に対するアゴニストであることを確認する方法、
（３）ＡＱ２７受容体を用いることを特徴とする、（ｉ）副腎皮質ホルモン分泌阻害薬（副腎皮質ホルモン分泌抑制薬）、（ii）クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍、過敏性腸症候群などの予防・治療薬、（iii）男性ホルモン分泌阻害薬（男性ホルモン分泌抑制薬）、または（iv）陰茎肥大、精巣萎縮、精巣機能異常（例、精子減少）、月経異常、多毛、色素沈着、嗄声、過敏症、坐瘡、悪心、嘔吐、消化器系症状（例、食欲不振）、満月様顔貌などの予防・治療薬がＡＱ２７受容体に対するアンタゴニストであることを確認する方法、
（４）各薬をＡＱ２７受容体に接触させた場合における、各薬とＡＱ２７受容体との結合量を測定することを特徴とする上記（１）〜（３）記載のスクリーニング方法を提供する。
この確認方法は、前記した本発明のペプチドとＡＱ２７受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法において、試験化合物に代えて、上記の薬物を使用することによって実施することができる。
また、本発明の確認方法用キットは、前記した本発明のペプチドとＡＱ２７受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング用キットにおいて、試験化合物に代えて、上記の薬物を含有するものである。
このように、本発明の確認方法を用いることによって、市販または開発途中の各種薬物がＡＱ２７受容体を介して薬理効果を発揮していることを確認することができる。 (7) Method of elucidating the mechanism of action of various drugs By using the AQ27 receptor, it can be confirmed whether or not various drugs exert a pharmacological effect via the AQ27 receptor.
That is, the present invention
(1) AQ27 receptor is used, (i) a corticosteroid secretagogue, (ii) hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal gland Preventive / therapeutic drugs for dysfunction, pain, obesity, etc., (iii) androgen secretagogue, (iv) male gonad dysfunction, male infertility associated with imperfect dysgenesis, aplastic anemia, myelofibrosis, kidney Prophylactic / therapeutic agents such as pain relief for sexual anemia, end stage female genital cancer, breast cancer (eg, inoperable breast cancer), mastopathy, mammary gland tumor, gynecomastia, etc., (v) corticosteroid secretion inhibitors (corticosteroid secretion) Inhibitor), (vi) Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital Renal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, gastric / duodenal ulcer, irritable bowel syndrome, etc., prophylactic / therapeutic drugs, (vii) androgen secretion inhibitor (androgen secretion inhibitor), or (Viii) penis enlargement, testicular atrophy, testicular dysfunction (eg, sperm loss), menstrual abnormalities, hirsutism, pigmentation, hoarseness, irritability, acne, nausea, vomiting, gastrointestinal symptoms (eg, anorexia), A method for confirming that a preventive or therapeutic agent such as a full moon-like face binds to the AQ27 receptor,
(2) AQ27 receptor is used, (i) a corticosteroid secretagogue, (ii) hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison disease, adrenal gland Prophylactic / therapeutic agents for dysfunction, pain, obesity, etc., (iii) androgen secretagogue, or (iv) male gonad dysfunction, male infertility associated with impaired dysgenesis, aplastic anemia, myelofibrosis, A method for confirming that a prophylactic / therapeutic agent such as renal anemia, pain relief for terminal stage female genital cancer, breast cancer (eg, inoperable breast cancer), mastopathy, breast tumor, gynecomastia is an agonist for AQ27 receptor,
(3) AQ27 receptor is used, (i) a corticosteroid secretion inhibitor (adrenocortical hormone secretion inhibitor), (ii) Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, Prevention and treatment of CRH-producing tumors, aldosterone-producing tumors, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, gastric / duodenal ulcer, irritable bowel syndrome, etc. Drugs, (iii) androgen secretion inhibitors (androgen secretion inhibitors), or (iv) penile hypertrophy, testicular atrophy, testicular dysfunction (eg, sperm reduction), menstrual abnormalities, hirsutism, pigmentation, hoarseness, hypersensitivity That prophylactic / therapeutic agents, such as acne, nausea, vomiting, gastrointestinal symptoms (eg, anorexia), and full moon-like face, are antagonists to AQ27 receptor How to check,
(4) The screening method according to any one of (1) to (3), wherein the amount of binding between each drug and the AQ27 receptor when each drug is brought into contact with the AQ27 receptor is provided.
This confirmation method can be carried out by using the above drug in place of the test compound in the above-mentioned method for screening a compound that alters the binding property between the peptide of the present invention and the AQ27 receptor.
The kit for a confirmation method of the present invention is a kit for screening a compound that alters the binding property between the peptide of the present invention and the AQ27 receptor, wherein the kit contains the above drug in place of a test compound. .
As described above, by using the confirmation method of the present invention, it is possible to confirm that various drugs that are commercially available or in development are exhibiting pharmacological effects via the AQ27 receptor.

（８）ＤＮＡ転移動物
本発明は、外来性の本発明のペプチドをコードするＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
（ii）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（ｉ）記載の動物、
（iii）ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第（ii）記載の動物、および
（iv）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ転移動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを転移することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＤＮＡ転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ1系統，ＢＤＦ1系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ1系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。 (8) DNA-Transferred Animal The present invention relates to a DNA encoding an exogenous peptide of the present invention (hereinafter abbreviated as the exogenous DNA of the present invention) or a mutant DNA thereof (when abbreviated as the exogenous mutant DNA of the present invention) Is provided.
That is, the present invention
(I) a non-human mammal having the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof,
(Ii) the animal according to (i), wherein the non-human mammal is a rodent;
(Iii) The animal according to (ii), wherein the rodent is a mouse or a rat; and (iv) a recombinant vector containing the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof and capable of being expressed in a mammal. Things.
Non-human mammals having the exogenous DNA of the present invention or the mutant DNA thereof (hereinafter abbreviated as the DNA-transferred animal of the present invention) can be used for non-fertilized eggs, fertilized eggs, germ cells including spermatozoa and their progenitor cells, and the like. And preferably at the stage of embryonic development in non-human mammal development (more preferably at the stage of single cells or fertilized eggs and generally before the 8-cell stage), the calcium phosphate method, the electric pulse method, the lipofection method, the agglutination method, It can be produced by transferring a target DNA by a microinjection method, a particle gun method, a DEAE-dextran method, or the like. In addition, the exogenous DNA of the present invention can be transferred to somatic cells, organs of living organisms, tissue cells, and the like by the DNA transfer method, and can be used for cell culture, tissue culture, and the like. The DNA-transferred animal of the present invention can also be produced by fusing the above-mentioned germ cells with a cell fusion method known per se.
As the non-human mammal, for example, cow, pig, sheep, goat, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, mouse, rat and the like are used. Among them, rodents, which are relatively short in ontogeny and biological cycle in terms of the preparation of diseased animal model systems, and are easy to breed, particularly mice (for example, hybrids such as C57BL / 6 strain and DBA2 strain as pure strains) As the strain, B6C3F 1 strain, BDF 1 strain, B6D2F 1 strain, BALB / c strain, ICR strain, etc.) or rat (for example, Wistar, SD etc.) are preferable.
"Mammals" in a recombinant vector that can be expressed in mammals include humans in addition to the above-mentioned non-human mammals.

本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明のペプチドを発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発明のペプチドの機能を抑制するペプチドを発現させるＤＮＡなどが用いられる。
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ転移哺乳動物を作出することができる。
本発明のペプチドの発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記のＤＮＡ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、１）ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、２）各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性蛋白質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存蛋白質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ペプチド鎖延長因子1α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎蛋白質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物において目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネーターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネーターなどが用いられる。 The exogenous DNA of the present invention refers not to the DNA of the present invention originally possessed by non-human mammals, but to the DNA of the present invention once isolated and extracted from the mammal.
As the mutant DNA of the present invention, those having a mutation (for example, mutation) in the base sequence of the original DNA of the present invention, specifically, base addition, deletion, substitution with another base, etc. The resulting DNA and the like are used, and also include abnormal DNA.
The abnormal DNA means a DNA that expresses an abnormal peptide of the present invention. For example, a DNA that expresses a peptide that suppresses the function of the normal peptide of the present invention is used.
The exogenous DNA of the present invention may be derived from a mammal that is the same or different from the animal of interest. In transferring the DNA of the present invention to a target animal, it is generally advantageous to use the DNA as a DNA construct linked downstream of a promoter capable of being expressed in animal cells. For example, when the human DNA of the present invention is transferred, DNA derived from various mammals (eg, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.) having the DNA of the present invention having high homology thereto is expressed. Highly expressing the DNA of the present invention by microinjecting a DNA construct (eg, a vector, etc.) in which the human DNA of the present invention is bound downstream of various promoters that can be made into a fertilized egg of a target mammal, for example, a mouse fertilized egg. DNA-transferring mammals can be created.
Examples of the expression vector for the peptide of the present invention include plasmids derived from Escherichia coli, plasmids derived from Bacillus subtilis, plasmids derived from yeast, bacteriophages such as λ phage, retroviruses such as Moloney leukemia virus, animal viruses such as vaccinia virus or baculovirus. Are used. Among them, a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis or a plasmid derived from yeast is preferably used.
Examples of the promoter for controlling the DNA expression include: 1) a promoter derived from a virus (eg, simian virus, cytomegalovirus, Moloney leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.); Promoters derived from mammals (human, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.), for example, albumin, insulin II, uroplakin II, elastase, erythropoietin, endothelin, muscle creatine kinase, glial fibrillary acidic protein, Glutathione S-transferase, platelet-derived growth factor β, keratins K1, K10 and K14, collagen types I and II, cyclic AMP-dependent protein kinase β I subunit, dystrophin, tartar Acid-resistant alkaline phosphatase, atrial natriuretic factor, endothelial receptor tyrosine kinase (commonly abbreviated as Tie2), sodium potassium adenosine 3 kinase (Na, K-ATPase), neurofilament light chains, metallothionein I and IIA, Metalloproteinase 1 tissue inhibitor, MHC class I antigen (H-2L), H-ras, renin, dopamine β-hydroxylase, thyroid peroxidase (TPO), peptide chain elongation factor 1α (EF-1α), β actin, α And β-myosin heavy chain, myosin light chain 1 and 2, myelin basic protein, thyroglobulin, Thy-1, immunoglobulin, heavy chain variable region (VNP), serum amyloid P component, myoglobin, troponin C, smooth muscle α-actin, Pre-pro Cephalin A, such as a promoter, such as vasopressin is used. Among them, a cytomegalovirus promoter capable of high expression throughout the body, a human peptide chain elongation factor 1α (EF-1α) promoter, human and chicken β-actin promoters and the like are preferable.
The vector preferably has a sequence (generally called a terminator) that terminates transcription of the messenger RNA of interest in a DNA-transferred mammal. A simian virus SV40 terminator or the like is preferably used.

その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５'上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３'下流に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のペプチドの翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常なペプチドの翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有する。
本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。 In addition, a splicing signal of each DNA, an enhancer region, a part of an intron of a eukaryotic DNA, and the like are placed 5 ′ upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region, or between the translation region for the purpose of further expressing the desired foreign DNA. It is also possible to connect 3 ′ downstream of the above depending on the purpose.
The normal translation region of the peptide of the present invention can be obtained from liver, kidney, thyroid cells, fibroblast-derived DNA derived from humans or various mammals (eg, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.) and commercially available DNAs. From a variety of genomic DNA libraries, or as a starting material, a complementary DNA prepared by known methods from RNA derived from liver, kidney, thyroid cells, and fibroblasts. In addition, a translation region obtained by mutating a translation region of a normal peptide obtained from the above-mentioned cells or tissues by a point mutagenesis method can be used for the exogenous abnormal DNA.
The translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a transposed animal by a conventional DNA engineering technique in which it is ligated downstream of the above-mentioned promoter and, if desired, upstream of the transcription termination site.
Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal. The presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA transfer means that all the progeny of the produced animal retain the exogenous DNA of the present invention in all of the germinal cells and somatic cells. means. The progeny of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
The non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred can be subcultured in a normal breeding environment as a DNA-carrying animal by confirming that the exogenous DNA is stably maintained by mating. .

受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。
導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。
本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に本発明のペプチドの機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のペプチドの機能亢進症や、本発明のペプチドが関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のペプチドの増加症状を有することから、本発明のペプチドに関連する疾患に対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。 Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in excess in all germ cells and somatic cells of the target mammal. Excessive presence of the exogenous DNA of the present invention in germ cells of a produced animal after DNA transfer means that all offspring of the produced animal have an excessive amount of the exogenous DNA of the present invention in all of their germ cells and somatic cells. Means Progeny of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have an excess of the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
By obtaining a homozygous animal having the introduced DNA on both homologous chromosomes and mating the male and female animals, all offspring can be bred to have the DNA in excess.
The non-human mammal having the normal DNA of the present invention expresses the normal DNA of the present invention at a high level, and eventually promotes the hyperactivity of the peptide of the present invention by promoting the function of endogenous normal DNA. Occasionally, it can be used as a disease model animal. For example, by using the normal DNA transgenic animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of the hyperactivity of the peptide of the present invention and diseases associated with the peptide of the present invention, and to examine a method for treating these diseases. It is possible.
Further, since the mammal into which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released peptide of the present invention, it can be used for screening tests for therapeutic drugs for diseases related to the peptide of the present invention. is there.

一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原料として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラク卜は、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的に本発明のペプチドの機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のペプチドの機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明のペプチドの機能不活性型不応症における本発明の異常ペプチドによる正常ペプチドの機能阻害（dominant negative作用）を解明するモデルとなる。 On the other hand, a non-human mammal having the exogenous abnormal DNA of the present invention can be subcultured in a normal breeding environment as an animal having the DNA after confirming that the exogenous DNA is stably maintained by mating. Furthermore, the target foreign DNA can be incorporated into the above-mentioned plasmid and used as a raw material. The DNA construct with the promoter can be prepared by a usual DNA engineering technique. The transfer of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal. The presence of the abnormal DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA transfer means that all the offspring of the produced animal have the abnormal DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells. The progeny of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have the abnormal DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells. A homozygous animal having the introduced DNA on both homologous chromosomes is obtained, and by crossing these male and female animals, it is possible to breed so that all progeny have the DNA.
The non-human mammal having the abnormal DNA of the present invention expresses the abnormal DNA of the present invention at a high level, and finally inhibits the function of the endogenous normal DNA, thereby finally inactivating the functionally inactive form of the peptide of the present invention. It can be refractory and can be used as a model animal for the disease. For example, using the abnormal DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of the function-inactive refractory of the peptide of the present invention and to examine a method for treating this disease.
In addition, as a specific possibility, the abnormal DNA-highly expressing animal of the present invention can inhibit the abnormal peptide of the present invention (dominant negative action) by the abnormal peptide of the present invention in the function-inactive refractory disease of the peptide of the present invention. A model to elucidate.

また、本発明の外来異常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のペプチドの増加症状を有することから、本発明のペプチドまたはの機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記２種類の本発明のＤＮＡ転移動物のその他の利用可能性として、例えば、
１）組織培養のための細胞源としての使用、
２）本発明のＤＮＡ転移動物の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現されたペプチド組織を分析することによる、本発明のペプチドにより特異的に発現あるいは活性化するペプチドとの関連性についての解析、
３）ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
４）上記３）記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
５）本発明の変異ペプチドを単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のペプチドの機能不活性型不応症などを含む、本発明のペプチドに関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、本発明のペプチドに関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、本発明のＤＮＡ転移動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどの蛋白質分解酵素により、遊離したＤＮＡ転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、本発明のペプチド産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明のペプチドおよびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のペプチドの機能不活性型不応症を含む、本発明のペプチドに関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のＤＮＡ転移動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発明のペプチドが関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。 In addition, since the mammal to which the foreign abnormal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released peptide of the present invention, it is also used for a therapeutic drug screening test for the peptide of the present invention or a functionally inactive refractory disease. It is possible.
In addition, other possible uses of the above two kinds of DNA transgenic animals of the present invention include, for example,
1) use as a cell source for tissue culture;
2) A peptide specifically expressed or activated by the peptide of the present invention by directly analyzing DNA or RNA in the tissue of the DNA-transferred animal of the present invention or by analyzing a peptide tissue expressed by the DNA. Analysis of the relevance of
3) culturing cells of DNA-bearing tissue by standard tissue culture techniques and using them to study the function of cells from tissues that are generally difficult to culture;
4) Screening of a drug that enhances the function of the cell by using the cell described in 3) above, and 5) Isolation and purification of the mutant peptide of the present invention and production of an antibody thereof are conceivable.
Furthermore, using the DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to examine the clinical symptoms of diseases related to the peptide of the present invention, including the inactive refractory type of the peptide of the present invention, etc. More detailed pathological findings in each organ of a disease model related to the disease can be obtained, which can contribute to the development of a new treatment method, and further to the research and treatment of a secondary disease caused by the disease.
In addition, it is possible to take out each organ from the DNA-transferred animal of the present invention, cut it into pieces, and then use a protease such as trypsin to obtain the released DNA-transferred cells, culture them, or systematize the cultured cells. . Furthermore, it is possible to investigate the specificity of the peptide-producing cells of the present invention, apoptosis, the relationship with differentiation or proliferation, or the signal transduction mechanism thereof, and to investigate their abnormalities. It is an effective research material for
Further, in order to develop a therapeutic agent for a disease associated with the peptide of the present invention, including the inactive refractory type of the peptide of the present invention, using the DNA-transferred animal of the present invention, It is possible to provide an effective and rapid screening method for a therapeutic agent for the disease by using a method or the like. In addition, using the transgenic animal of the present invention or the exogenous DNA expression vector of the present invention, it is possible to examine and develop a DNA treatment method for diseases associated with the peptide of the present invention.

（９）ノックアウト動物
本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（ii）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された第（ｉ）項記載の胚幹細胞、
（iii）ネオマイシン耐性である第（ｉ）項記載の胚幹細胞、
（iv）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（ｉ）項記載の胚幹細胞、
（v）ゲッ歯動物がマウスである第（iv）項記載の胚幹細胞、
（vi）本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（vii）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる第（vi）項記載の非ヒト哺乳動物、
（viii）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（vi）項記載の非ヒト哺乳動物、
（ix）ゲッ歯動物がマウスである第（viii）項記載の非ヒト哺乳動物、および
（x）第（vii）項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしている本発明のペプチドの活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的に本発明のペプチドの発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。 (9) Knockout Animal The present invention provides a non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated and a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
That is, the present invention
(I) a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated,
(Ii) the embryonic stem cell according to (i), wherein the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, a β-galactosidase gene derived from Escherichia coli);
(Iii) the embryonic stem cell according to (i), which is resistant to neomycin;
(Iv) the embryonic stem cell according to (i), wherein the non-human mammal is a rodent;
(V) the embryonic stem cell according to (iv), wherein the rodent is a mouse,
(Vi) a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention, wherein the DNA is inactivated;
(Vii) the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, a β-galactosidase gene derived from Escherichia coli), and the reporter gene can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention. The non-human mammal according to the item,
(Viii) the non-human mammal according to (vi), wherein the non-human mammal is a rodent;
(Ix) administering a test compound to the non-human mammal according to (viii), wherein the rodent is a mouse, and (x) the animal according to (vii), and detecting the expression of a reporter gene. And a method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the promoter activity of the DNA of the present invention.
A non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated is a DNA which is artificially mutated to the DNA of the present invention possessed by the non-human mammal to suppress the DNA expression ability, or By substantially eliminating the activity of the peptide of the present invention encoded by the DNA, the DNA substantially does not have the ability to express the peptide of the present invention (hereinafter, may be referred to as the knockout DNA of the present invention). ) Non-human mammal embryonic stem cells (hereinafter abbreviated as ES cells).
As the non-human mammal, the same one as described above is used.
The method of artificially mutating the DNA of the present invention can be carried out, for example, by deleting a part or all of the DNA sequence and inserting or substituting another DNA by a genetic engineering technique. With these mutations, the knockout DNA of the present invention may be prepared, for example, by shifting the codon reading frame or disrupting the function of the promoter or exon.

本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、polyＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知 EvansとKaufmaの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ1マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ1）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ1マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３.５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。 Specific examples of the non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated (hereinafter abbreviated as the DNA-inactivated ES cells of the present invention or the knockout ES cells of the present invention) include, for example, The DNA of the present invention possessed by a non-human mammal is isolated, and its exon portion is a drug resistance gene represented by a neomycin resistance gene or a hygromycin resistance gene, or lacZ (β-galactosidase gene), cat (chloramphenicol acetyl). Transferrase gene) or a reporter gene or the like as a representative to destroy the function of the exon, or insert a DNA sequence that terminates the transcription of the gene into an intron between the exons (eg, a polyA addition signal, etc.) By preventing the synthesis of complete messenger RNA Then, a DNA chain having a DNA sequence constructed so as to eventually disrupt the gene (hereinafter abbreviated as a targeting vector) is introduced into the chromosome of the animal by, for example, homologous recombination, and the obtained ES cells PCR using a DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe and a DNA sequence on a targeting vector and a DNA sequence in a neighboring region other than the DNA of the present invention used for the preparation of the targeting vector as a primer And selecting the knockout ES cells of the present invention.
As the ES cells from which the DNA of the present invention is inactivated by the homologous recombination method or the like, for example, those already established as described above may be used, or according to the known Evans and Kaufma method. It may be a newly established one. For example, in the case of mouse ES cells, currently, 129 ES cells are generally used, but since the immunological background is not clear, an alternative pure immunological and genetic background is used. for example the purpose of acquiring the obvious ES cells, the BDF 1 mice (C57BL / 6 and DBA / 2 for the egg collection number of lack of C57BL / 6 mice and C57BL / 6 were improved by crossing with DBA / 2 Those established using F 1 ) can also be used favorably. BDF 1 mice are often egg number, and, in addition to the advantage that the egg is tough, since with C57BL / 6 mice in the background, when the ES cells obtained therefrom, which were generated pathological model mice , C57BL / 6 mice can be advantageously used in that their genetic background can be replaced with C57BL / 6 mice by backcrossing.
In addition, when ES cells are established, blastocysts 3.5 days after fertilization are generally used. However, a large number of blastocysts can be efficiently obtained by collecting embryos at the 8-cell stage and culturing them up to blastocysts. Early embryos can be obtained.
Although either male or female ES cells may be used, male ES cells are generally more convenient for producing a germline chimera. It is also desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce cumbersome culture labor.

ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０6個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１〜１００００U/ml）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０.００１〜０.５％トリプシン／０.１〜５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０.１％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１〜３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M. J. Evans及びM. H. Kaufman, ネイチャー（Nature）第292巻、154頁、1981年；G. R. Martin プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）第78巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschman ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおける本発明のペプチドまたは本発明のレセプター蛋白質の細胞生物学的検討において有用である。 As a method for determining the sex of ES cells, for example, a method of amplifying and detecting a gene in a sex-determining region on the Y chromosome by a PCR method can be mentioned. By using this method, the number of ES cells of about 1 colony (about 50 cells) is sufficient, whereas the conventional method required about 10 6 cells for karyotype analysis. The primary selection of ES cells in the early stage can be performed by discriminating between male and female, and the early stage of culture can be greatly reduced by enabling the selection of male cells at an early stage.
The secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-banding method. The number of chromosomes in the obtained ES cells is desirably 100% of the normal number. However, when it is difficult due to physical operations at the time of establishment, after knocking out the gene of the ES cells, the cells are knocked out of normal cells (for example, chromosomes in mice). It is desirable to clone again into cells (number 2n = 40).
The embryonic stem cell line obtained in this manner usually has very good growth properties, but it must be carefully subcultured because it tends to lose its ontogenic ability. For example, on a suitable feeder cell such as STO fibroblast, in the presence of LIF (1 to 10,000 U / ml) in a carbon dioxide incubator (preferably 5% carbon dioxide, 95% air or 5% oxygen, 5% The cells are cultured by a method such as culturing at about 37 ° C. in carbon dioxide gas and 90% air. At the time of subculture, for example, trypsin / EDTA solution (usually 0.001 to 0.5% trypsin / 0.1 to 5 mM EDTA, Preferably, a method is used in which cells are made into single cells by treatment with about 0.1% trypsin / 1 mM EDTA and seeded on newly prepared feeder cells. Such subculture is usually performed every 1 to 3 days. At this time, it is desirable to observe the cells and, if any morphologically abnormal cells are found, discard the cultured cells.
ES cells are differentiated into various types of cells, such as parietal muscle, visceral muscle, and cardiac muscle, by monolayer culture up to high density or suspension culture until cell clumps are formed under appropriate conditions. [MJ Evans and MH Kaufman, Nature 292, 154, 1981; GR Martin Proceedings of National Academy of Sciences USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 78, 7634, 1981; TC Doetschman et al., Journal of Embryology and Experimental Morphology, 87, 27, 1985]. The cells deficient in expression of the DNA of the present invention obtained by differentiation are useful in in vitro cell biology of the peptide of the present invention or the receptor protein of the present invention in vitro.

本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明のペプチドのヘテロ発現不全個体であり、本発明のペプチドのヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明のペプチドのホモ発現不全個体を得ることができる。 The non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA level of the animal using a known method and indirectly comparing the expression level.
As the non-human mammal, those similar to the aforementioned can be used.
The non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is, for example, a DNA in which the targeting vector prepared as described above is introduced into mouse embryonic stem cells or mouse egg cells, and the DNA of the targeting vector is inactivated by the introduction. The DNA of the present invention can be knocked out by homologous recombination in which the sequence replaces the DNA of the present invention on the chromosome of mouse embryonic stem cells or mouse egg cells by homologous recombination.
Cells in which the DNA of the present invention has been knocked out can be used as a DNA sequence on a Southern hybridization analysis or targeting vector using the DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe, and the DNA of the present invention derived from the mouse used for the targeting vector. The determination can be made by analysis by a PCR method using a DNA sequence of a nearby region other than DNA as a primer. When non-human mammalian embryonic stem cells are used, a cell line in which the DNA of the present invention has been inactivated by gene homologous recombination is cloned, and the cells are cultured at an appropriate time, for example, at the 8-cell stage of non-human mammalian cells. The chimeric embryo is injected into an animal embryo or a blastocyst, and the produced chimeric embryo is transplanted into the uterus of the pseudopregnant non-human mammal. The produced animal is a chimeric animal composed of both cells having the normal DNA locus of the present invention and cells having the artificially mutated DNA locus of the present invention.
When a part of the germ cells of the chimeric animal has a mutated DNA locus of the present invention, all tissues are artificially mutated from a population obtained by crossing such a chimeric individual with a normal individual. It can be obtained by selecting individuals composed of cells having the added DNA locus of the present invention, for example, by judging coat color or the like. The individual thus obtained is usually an individual having a heterozygous expression of the peptide of the present invention, which is crossed with an individual having a heterozygous expression of the peptide of the present invention, and homozygously expressing the peptide of the present invention from their offspring. Defective individuals can be obtained.

卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のペプチドにより誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のペプチドの生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。 When an egg cell is used, for example, a transgenic non-human mammal having a targeting vector introduced into a chromosome can be obtained by injecting a DNA solution into a nucleus of an egg by a microinjection method. Compared to mammals, they can be obtained by selecting those having a mutation in the DNA locus of the present invention by homologous recombination.
In this manner, the individual in which the DNA of the present invention has been knocked out can be bred in an ordinary breeding environment after confirming that the DNA has been knocked out in the animal individual obtained by mating.
Furthermore, the germline can be obtained and maintained in accordance with a conventional method. That is, by crossing male and female animals having the inactivated DNA, a homozygous animal having the inactivated DNA on both homologous chromosomes can be obtained. The obtained homozygous animal can be efficiently obtained by breeding the mother animal in such a manner that there are one normal animal and one homozygote. By mating male and female heterozygous animals, homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and subcultured.
The non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated are extremely useful for producing a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention.
In addition, since the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention lacks various biological activities that can be induced by the peptide of the present invention, a model of a disease caused by inactivation of the biological activity of the peptide of the present invention. Therefore, it is useful for investigating the cause of these diseases and studying treatment methods.

（９ａ）本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
試験化合物および試験化合物が形成してもよい塩としては、前記と同様のものが用いられる。
具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、該試験動物の機能（例えば、副腎皮質ホルモン分泌調節活性）が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上上昇した場合、該試験化合物を上記の疾患に対して治療・予防効果を有する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、副腎皮質ホルモン分泌調節剤、好ましくは副腎皮質ホルモン分泌促進剤として有用である。さらに、該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛み、肥満などの予防・治療剤として有用である。
また、該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、安全で低毒性な男性ホルモン分泌調節剤、好ましくは男性ホルモン分泌促進剤として有用である。さらに、該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、例えば、男性性腺機能不全、造精機能障害に伴う男子不妊症、再生不良性貧血、骨髄線維症、腎性貧血、末期女性性器癌の疼痛緩和、乳癌（例、手術不能乳癌）、乳腺症、乳腺腫瘍、女性化乳房などの予防・治療剤として有用である。 (9a) Method for screening for a compound having a therapeutic / preventive effect on diseases caused by DNA deficiency or damage of the present invention The non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention is deficient or damaged of the DNA of the present invention. Can be used for screening for a compound having a therapeutic / preventive effect on a disease caused by the above.
That is, the present invention is characterized by administering a test compound to a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention, and observing and measuring a change in the animal. Provided is a method for screening a compound or a salt thereof having a therapeutic / prophylactic effect against a disease.
Examples of the non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention used in the screening method include the same ones as described above.
As the test compound and the salt which the test compound may form, the same as described above are used.
Specifically, a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is treated with a test compound, compared with an untreated control animal, and tested using changes in each organ, tissue, disease symptoms, etc. of the animal as an index. The therapeutic / preventive effects of the compounds can be tested.
As a method of treating a test animal with a test compound, for example, oral administration, intravenous injection and the like are used, and it can be appropriately selected according to the symptoms of the test animal, the properties of the test compound, and the like. The dose of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, the properties of the test compound, and the like.
In the screening method, when a test compound is administered to a test animal, the function (eg, corticosteroid secretion regulating activity) of the test animal is about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more. When it increases, the test compound can be selected as a compound having a therapeutic / preventive effect on the above-mentioned diseases.
The compound obtained by using the screening method is useful as a corticosteroid secretion regulator, preferably a corticosteroid secretagogue. Further, the compound obtained using the screening method is useful as a prophylactic / therapeutic agent for hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain, obesity, etc. It is.
Further, the compound obtained by using the screening method is useful as a safe and low toxic androgen secretion regulator, preferably a androgen secretagogue. Further, compounds obtained by using the screening method include, for example, male gonad dysfunction, male infertility associated with impaired spermatogenic function, aplastic anemia, myelofibrosis, renal anemia, pain relief for terminal female genital cancer It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for breast cancer (eg, inoperable breast cancer), mastopathy, breast tumor, gynecomastia, and the like.

該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のペプチドの欠損や損傷などによって引き起こされる疾患に対して治療・予防効果を有するので、該疾患に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のペプチドを含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、該化合物を経口投与する場合、一般的に成人患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、該化合物を注射剤の形で通常成人患者（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。 The compound obtained by using the screening method is a compound selected from the test compounds described above, and has a therapeutic / preventive effect on a disease caused by deficiency or damage of the peptide of the present invention. It can be used as a drug such as a safe and low toxic therapeutic / prophylactic agent. Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used in the same manner.
The compound obtained by the screening method may form a salt. Examples of the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids, etc.) and bases (eg, alkali metals, etc.). And the like, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, For example, salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like are used.
A drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing the peptide of the present invention.
Since the preparation thus obtained is safe and low toxic, it can be used, for example, in humans or mammals (eg, rat, mouse, guinea pig, rabbit, sheep, pig, cow, horse, cat, dog, monkey, etc.). Can be administered.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route and the like. About 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg of the compound. In the case of parenteral administration, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease and the like. It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound by intravenous injection per day. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.

（９ｂ）本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法
本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物および試験化合物が形成してもよい塩としては、前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、本発明のペプチドをコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発明のペプチドの発現する組織で、本発明のペプチドの代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明のペプチドの動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明のペプチド欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物またはその塩であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩である。
該スクリーニング方法で得られた化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。 (9b) Screening method for compound or salt thereof that promotes or inhibits the activity of a promoter for DNA of the present invention The present invention provides a method for administering a test compound to a non-human mammal deficient in expression of a DNA of the present invention to increase the expression of a reporter gene. The present invention provides a method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of a promoter for DNA of the present invention, which is characterized by detecting.
In the above-described screening method, the non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention may be a non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention in which the DNA of the present invention is inactivated by introducing a reporter gene, A reporter gene that can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention is used.
Examples of the test compound and salts which the test compound may form include the same as described above.
As the reporter gene, the same one as described above is used, and a β-galactosidase gene (lacZ), a soluble alkaline phosphatase gene, a luciferase gene and the like are preferable.
In a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention in which the DNA of the present invention is replaced with a reporter gene, since the reporter gene is under the control of the promoter for the DNA of the present invention, the expression of the substance encoded by the reporter gene is traced. By doing so, the activity of the promoter can be detected.
For example, when a part of the DNA region encoding the peptide of the present invention is replaced with a β-galactosidase gene (lacZ) derived from Escherichia coli, the tissue that expresses the peptide of the present invention may be used instead of the peptide of the present invention. Β-galactosidase is expressed. Therefore, for example, the present invention can be easily performed by staining with a reagent serving as a substrate for β-galactosidase such as 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-galactopyranoside (X-gal). Of the peptide of the present invention in an animal body can be observed. Specifically, the peptide-deficient mouse of the present invention or a tissue section thereof is fixed with glutaraldehyde or the like, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-gal at room temperature or around 37 ° C. After reacting for about 30 minutes to 1 hour, the β-galactosidase reaction may be stopped by washing the tissue specimen with a 1 mM EDTA / PBS solution, and coloration may be observed. Further, mRNA encoding lacZ may be detected according to a conventional method.
The compound or a salt thereof obtained by using the above-mentioned screening method is a compound or a salt thereof selected from the above-mentioned test compounds, and is a compound or a salt thereof which promotes or inhibits the promoter activity for the DNA of the present invention.
As a salt of the compound obtained by the screening method, a salt with a physiologically acceptable acid (eg, an inorganic acid or the like) or a base (eg, an organic acid or the like) is used, and particularly, a physiologically acceptable salt is used. Acid addition salts are preferred. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, For example, salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like are used.

本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、本発明のペプチドの発現を促進し、該ペプチドの機能を促進することができるので、例えば、副腎皮質ホルモン分泌調節剤、好ましくは副腎皮質ホルモン分泌促進剤として有用である。さらに、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛み、肥満などの予防・治療剤として有用である。
また、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、安全で低毒性な男性ホルモン分泌調節剤、好ましくは男性ホルモン分泌促進剤として有用である。さらに、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、例えば、男性性腺機能不全、造精機能障害に伴う男子不妊症、再生不良性貧血、骨髄線維症、腎性貧血、末期女性性器癌の疼痛緩和、乳癌（例、手術不能乳癌）、乳腺症、乳腺腫瘍、女性化乳房などの予防・治療剤として有用である。
一方、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、例えば、副腎皮質ホルモン分泌調節剤、好ましくは副腎皮質ホルモン分泌阻害剤（副腎皮質ホルモン分泌抑制剤）として有用である。さらに、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、例えば、クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍、過敏性腸症候群などの予防・治療剤として有用である。
また、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、安全で低毒性な男性ホルモン分泌調節剤、好ましくは男性ホルモン分泌阻害剤（男性ホルモン分泌抑制剤）として有用である。さらに、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、例えば、陰茎肥大、精巣萎縮、精巣機能異常（例、精子減少）、月経異常、多毛、色素沈着、嗄声、過敏症、坐瘡、悪心、嘔吐、消化器系症状（例、食欲不振）、満月様顔貌などの予防・治療剤として有用である。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のペプチドまたはその塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩を経口投与する場合、一般的に成人患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物またはその塩の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩を注射剤の形で通常成人患者（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
一方、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩を経口投与する場合、一般的に成人患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物またはその塩の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩を注射剤の形で通常成人患者（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。 Since the compound or a salt thereof that promotes the promoter activity of the DNA of the present invention can promote the expression of the peptide of the present invention and promote the function of the peptide, for example, a corticosteroid secretion regulator, preferably an adrenal It is useful as a corticosteroid secretagogue. Furthermore, the compound of the present invention or a salt thereof that promotes the promoter activity for the DNA is useful for preventing hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain, obesity and the like. -Useful as a therapeutic agent.
Further, the compound or its salt of the present invention which promotes the promoter activity for DNA is useful as a safe and low toxic androgen secretion regulator, preferably a androgen secretagogue. Furthermore, the compound of the present invention or a salt thereof that promotes the promoter activity for DNA includes, for example, male gonad dysfunction, male infertility associated with impaired spermatogenic function, aplastic anemia, myelofibrosis, renal anemia, end-stage female It is useful as an agent for relieving pain in genital cancer, breast cancer (eg, inoperable breast cancer), mastopathy, breast tumor, gynecomastia, and the like.
On the other hand, the compound of the present invention or a salt thereof that inhibits promoter activity on DNA is useful, for example, as a corticosteroid secretion regulator, preferably a corticosteroid secretion inhibitor (corticosteroid secretion inhibitor). Furthermore, the compound of the present invention or a salt thereof that inhibits the promoter activity against DNA includes, for example, Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for sickness, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, gastric / duodenal ulcer, irritable bowel syndrome and the like.
Further, the compound of the present invention or a salt thereof that inhibits promoter activity on DNA is useful as a safe and low toxic androgen secretion regulator, preferably a androgen secretion inhibitor (androgen secretion inhibitor). Furthermore, the compound of the present invention or a salt thereof that inhibits promoter activity against DNA includes, for example, penile hypertrophy, testicular atrophy, testicular dysfunction (eg, sperm loss), menstrual abnormalities, hirsutism, pigmentation, hoarseness, irritability, It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for acne, nausea, vomiting, gastrointestinal symptoms (eg, anorexia), full moon-like face, etc.
Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used in the same manner.
A drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing the peptide of the present invention or a salt thereof.
Since the preparation thus obtained is safe and low toxic, it can be used, for example, in humans or mammals (eg, rat, mouse, guinea pig, rabbit, sheep, pig, cow, horse, cat, dog, monkey, etc.). Can be administered.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like.For example, when a compound or a salt thereof that promotes a promoter activity for DNA of the present invention is orally administered, it is generally used. For an adult patient (assuming a body weight of 60 kg), about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg of the compound is administered per day. When administered parenterally, the single dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, the target disease, and the like. For example, the compound or its salt that promotes the promoter activity for DNA of the present invention may be used as an injection. When administered to an adult patient (assuming a body weight of 60 kg) in the form of a compound, the compound is administered in an amount of about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day. Is conveniently administered by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
On the other hand, for example, when a compound or a salt thereof that inhibits promoter activity for DNA of the present invention is orally administered, generally, in an adult patient (with a body weight of 60 kg), about 0.1 to 100 mg of the compound per day is used. Preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg is administered. When administered parenterally, the single dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target disease, and the like. For example, the compound or its salt that inhibits the promoter activity for DNA of the present invention may be used as an injection. When administered to an adult patient (assuming a body weight of 60 kg) in the form of a compound, the compound is administered in an amount of about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day. Is conveniently administered by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.

このように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療薬の開発に大きく貢献することができる。
また、本発明のペプチドのプロモーター領域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々の蛋白質をコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入動物）を作成すれば、特異的にそのペプチドを合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、本発明のペプチドそのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。 As described above, the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is extremely useful for screening for a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the promoter for the DNA of the present invention, It can greatly contribute to investigating the cause of various diseases caused by the disease or to develop preventive and therapeutic drugs.
In addition, using a DNA containing the promoter region of the peptide of the present invention, genes encoding various proteins are ligated downstream thereof and injected into egg cells of an animal to produce a so-called transgenic animal (gene-transferred animal). Once prepared, the peptide can be specifically synthesized and its action in the living body can be examined. Furthermore, a low-molecular compound having an action of specifically promoting or suppressing the ability of the peptide itself of the present invention to produce in the body, if an appropriate reporter gene is bound to the above promoter portion and a cell line that expresses the reporter gene is established. Can be used as a search system.

ＡＱ２７受容体に対する抗体、ＡＱ２７受容体をコードするＤＮＡと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンスポリヌクレオチド（アンチセンスＤＮＡ）は、ＷＯ０１／１６３１３号に記載の方法に準じて製造することができる。
ＡＱ２７受容体、ＡＱ２７受容体をコードするＤＮＡ（以下、ＡＱ２７受容体ＤＮＡと略記する場合がある）、ＡＱ２７受容体に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）、ＡＱ２７受容体ＤＮＡに対するアンチセンスＤＮＡ（以下、本発明のアンチセンスＤＮＡと略記する場合がある）は、以下の用途を有している。 An antibody against the AQ27 receptor and an antisense polynucleotide (antisense DNA) containing a base sequence complementary to a DNA encoding the AQ27 receptor or a part thereof can be prepared according to the method described in WO01 / 16313. Can be manufactured.
AQ27 receptor, DNA encoding AQ27 receptor (hereinafter sometimes abbreviated as AQ27 receptor DNA), antibody to AQ27 receptor (hereinafter sometimes abbreviated as antibody of the present invention), AQ27 receptor DNA (Hereinafter sometimes abbreviated as the antisense DNA of the present invention) has the following uses.

（１）ＡＱ２７受容体の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤
ａ）ＡＱ２７受容体またはｂ）ＡＱ２７受容体をコードするＤＮＡを、ＡＱ２７受容体の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤などの医薬として使用することができる。
例えば、生体内においてＡＱ２７受容体が減少しているために、リガンドである脂肪酸の生理作用が期待できない（ＡＱ２７受容体の欠乏症）患者がいる場合に、ａ）ＡＱ２７受容体を該患者に投与し該ＡＱ２７受容体の量を補充したり、ｂ）（イ）ＡＱ２７受容体をコードするＤＮＡを該患者に投与し発現させることによって、あるいは（ロ）対象となる細胞にＡＱ２７受容体をコードするＤＮＡを挿入し発現させた後に、該細胞を該患者に移植することなどによって、患者の体内におけるＡＱ２７受容体の量を増加させ、リガンドの作用を充分に発揮させることができる。すなわち、ＡＱ２７受容体をコードするＤＮＡは、安全で低毒性なＡＱ２７受容体の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤などとして有用である。
具体的には、ＡＱ２７受容体またはＡＱ２７受容体ＤＮＡは、安全で低毒性な副腎皮質ホルモン分泌調節剤、好ましくは副腎皮質ホルモン分泌促進剤として有用である。さらに、ＡＱ２７受容体またはＡＱ２７受容体ＤＮＡは、低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛み、肥満などの予防・治療剤として有用である。
また、ＡＱ２７受容体またはＡＱ２７受容体ＤＮＡは、安全で低毒性な男性ホルモン分泌調節剤、好ましくは男性ホルモン分泌促進剤として有用である。さらに、ＡＱ２７受容体またはＡＱ２７受容体ＤＮＡは、例えば、男性性腺機能不全、造精機能障害に伴う男子不妊症、再生不良性貧血、骨髄線維症、腎性貧血、末期女性性器癌の疼痛緩和、乳癌（例、手術不能乳癌）、乳腺症、乳腺腫瘍、女性化乳房などの予防・治療剤として有用である。
ＡＱ２７受容体を上記予防・治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
一方、ＡＱ２７受容体ＤＮＡを上記予防・治療剤として使用する場合は、ＡＱ２７受容体ＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。ＡＱ２７受容体ＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
例えば、ａ）ＡＱ２７受容体またはｂ）ＡＱ２７受容体ＤＮＡは、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、a）ＡＱ２７受容体またはb）ＡＱ２７受容体ＤＮＡを生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。 (1) A preventive and / or therapeutic agent for a disease associated with dysfunction of AQ27 receptor a) AQ27 receptor or b) DNA encoding the AQ27 receptor can be used for prevention of a disease associated with dysfunction of AQ27 receptor and It can be used as a medicament such as a therapeutic agent.
For example, when there is a patient who cannot expect the physiological action of a fatty acid as a ligand (AQ27 receptor deficiency) due to a decrease in AQ27 receptor in a living body, a) administering the AQ27 receptor to the patient. By supplementing the amount of the AQ27 receptor, b) (a) administering the DNA encoding the AQ27 receptor to the patient and expressing it, or After insertion and expression of the AQ27 receptor, the amount of AQ27 receptor in the body of the patient can be increased by, for example, transplanting the cells into the patient, and the effect of the ligand can be sufficiently exerted. That is, the DNA encoding the AQ27 receptor is useful as a safe and low-toxicity agent for preventing and / or treating a disease associated with dysfunction of the AQ27 receptor.
Specifically, AQ27 receptor or AQ27 receptor DNA is useful as a safe and low toxic adrenocortical hormone secretion regulator, preferably a corticosteroid secretion promoter. Furthermore, AQ27 receptor or AQ27 receptor DNA is useful as a preventive / therapeutic agent for hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain, obesity, etc. is there.
The AQ27 receptor or AQ27 receptor DNA is useful as a safe and low toxic androgen secretion regulator, preferably a male hormone secretagogue. Further, AQ27 receptor or AQ27 receptor DNA is used, for example, for male gonad dysfunction, male infertility associated with impaired spermatogenic function, aplastic anemia, myelofibrosis, renal anemia, pain relief for terminal female genital cancer, It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for breast cancer (eg, inoperable breast cancer), mastopathy, breast tumor, gynecomastia, and the like.
When the AQ27 receptor is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated according to conventional means.
On the other hand, when the AQ27 receptor DNA is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, the AQ27 receptor DNA is used alone or after being inserted into an appropriate vector such as a retrovirus vector, adenovirus vector, adenovirus associated virus vector, and the like. It can be implemented according to the means. The AQ27 receptor DNA can be administered as it is or together with an auxiliary for promoting uptake, using a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
For example, a) AQ27 receptor or b) AQ27 receptor DNA can be orally administered as tablets, capsules, elixirs, microcapsules and the like, or coated with water or other pharmaceutically as required. It can be used parenterally in the form of an injection, such as a sterile solution with an acceptable liquid, or a suspension. For example, a) AQ27 receptor or b) AQ27 receptor DNA can be used in the practice of generally accepted formulation with known physiologically recognized carriers, flavors, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc. It can be manufactured by mixing in the required unit dosage form. The amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.

錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０TM、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。 Examples of additives that can be incorporated into tablets, capsules, and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, and acacia, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid. Useful bulking agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavoring agents such as peppermint, reddish oil or cherry and the like are used. When the unit dosage form is a capsule, a liquid carrier such as oils and fats can be further contained in the above-mentioned type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. As the aqueous solution for injection, for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like are used. For example, it may be used in combination with an alcohol (eg, ethanol), a polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), a nonionic surfactant (eg, Polysorbate 80 ™ , HCO-50). As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.

また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
ＡＱ２７受容体の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、成人患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、成人患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
ＡＱ２７受容体ＤＮＡの投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、成人患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、成人患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。 The prophylactic / therapeutic agents include, for example, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human Serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants, etc. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
The preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, and should be administered to humans and mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be.
The dose of the AQ27 receptor varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method and the like. However, in the case of oral administration, generally, for example, in an adult patient (with a body weight of 60 kg), the dose is about 0 per day. 0.1-100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg. When administered parenterally, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, condition, administration method, and the like. For example, it is usually in the form of an injection, for example, in an adult patient (with a body weight of 60 kg). It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
The dose of AQ27 receptor DNA varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like. In the case of oral administration, for example, in an adult patient (with a body weight of 60 kg), it is generally about The amount is 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, and more preferably about 1.0 to 20 mg. When administered parenterally, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, condition, administration method, and the like. For example, it is usually in the form of an injection, for example, in an adult patient (with a body weight of 60 kg). It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.

（２）遺伝子診断剤
ＡＱ２７受容体ＤＮＡおよびアンチセンスＤＮＡは、プローブとして使用することにより、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）におけるＡＱ２７受容体またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。
ＡＱ２７受容体ＤＮＡまたはアンチセンスＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Genomics），第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America），第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションによりＡＱ２７受容体の発現低下が検出された場合は、例えば、ＡＱ２７受容体の機能不全に関連する疾患である可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、ノーザンハイブリダイゼーションによりＡＱ２７受容体の発現過多が検出された場合は、例えば、ＡＱ２７受容体の過剰発現に起因する疾患である可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
ＡＱ２７受容体の機能不全に関連する疾患としては、例えば、低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛み、肥満、男性性腺機能不全、造精機能障害に伴う男子不妊症、再生不良性貧血、骨髄線維症、腎性貧血、末期女性性器癌の疼痛緩和、乳癌（例、手術不能乳癌）、乳腺症、乳腺腫瘍、女性化乳房などが挙げられる。
ＡＱ２７受容体の過剰発現に起因する疾患としては、例えば、クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍、過敏性腸症候、陰茎肥大、精巣萎縮、精巣機能異常（例、精子減少）、月経異常、多毛、色素沈着、嗄声、過敏症、坐瘡、悪心、嘔吐、消化器系症状（例、食欲不振）、満月様顔貌などが挙げられる。 (2) Gene diagnostic agents AQ27 receptor DNA and antisense DNA can be used as probes to detect human or mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.). Since abnormalities (genetic abnormalities) of DNA or mRNA encoding the AQ27 receptor or its partial peptide can be detected, for example, damage, mutation or reduced expression of the DNA or mRNA, increase of the DNA or mRNA, or It is useful as a diagnostic agent for genes such as overexpression.
The above-described genetic diagnosis using AQ27 receptor DNA or antisense DNA is performed, for example, by Northern hybridization or PCR-SSCP method known per se (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989), Processing). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 86, pp. 2766-2770 (1989)) be able to.
For example, when a decrease in the expression of the AQ27 receptor is detected by Northern hybridization, for example, it can be diagnosed that the disease is highly likely to be associated with the dysfunction of the AQ27 receptor or is likely to be affected in the future. it can.
When overexpression of the AQ27 receptor is detected by Northern hybridization, for example, it can be diagnosed that the disease is highly likely to be caused by overexpression of the AQ27 receptor or that the disease is likely to be caused in the future. it can.
Diseases associated with AQ27 receptor dysfunction include, for example, hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain, obesity, male gonad dysfunction, Male infertility associated with impaired dysgenesis, aplastic anemia, myelofibrosis, renal anemia, pain relief for terminal female genital cancer, breast cancer (eg, inoperable breast cancer), mastopathy, breast tumor, gynecomastia, etc. Is mentioned.
Diseases caused by overexpression of AQ27 receptor include, for example, Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal gland Enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, stomach / duodenal ulcer, irritable bowel symptoms, penile enlargement, testicular atrophy, testicular dysfunction (eg, decreased sperm), menstrual abnormalities, hirsutism, pigmentation, Examples include hoarseness, irritability, acne, nausea, vomiting, gastrointestinal symptoms (eg, anorexia), full moon-like face, and the like.

（３）ＡＱ２７受容体の発現量を変化させる化合物またはその塩を含有する医薬
ＡＱ２７受容体ＤＮＡは、プローブとして用いることにより、ＡＱ２７受容体の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、例えば、（ｉ）非ヒト哺乳動物のａ）血液、ｂ）特定の臓器、ｃ）臓器から単離した組織もしくは細胞、または（ii）形質転換体等に含まれるＡＱ２７受容体のｍＲＮＡ量を測定することによる、ＡＱ２７受容体の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
ＡＱ２７受容体のｍＲＮＡ量の測定は具体的には以下のようにして行なう。
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より具体的には痴呆ラット、肥満マウス、動脈硬化ウサギ、担癌マウスなど）に対して、薬剤（例えば、抗痴呆薬、血圧低下薬、抗癌剤、抗肥満薬など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓など）、または臓器から単離した組織、あるいは細胞を得る。
得られた細胞に含まれるＡＱ２７受容体のｍＲＮＡは、例えば、通常の方法により細胞等からｍＲＮＡを抽出し、例えば、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲなどの手法を用いることにより定量することができ、自体公知の手段によりノーザンブロットを行なうことにより解析することもできる。
（ii）ＡＱ２７受容体を発現する形質転換体を上記の方法に従い作製し、該形質転換体に含まれるＡＱ２７受容体のｍＲＮＡを同様にして定量、解析することができる。 (3) A drug containing a compound or a salt thereof that alters the expression level of AQ27 receptor AQ27 receptor DNA is used as a probe to screen for a compound that alters the expression level of AQ27 receptor or a salt thereof. Can be.
That is, the present invention relates to, for example, AQ27 receptor contained in (i) a) blood of a non-human mammal, b) a specific organ, c) a tissue or cell isolated from an organ, or (ii) a transformant. Provided is a method for screening a compound or a salt thereof that changes the expression level of an AQ27 receptor by measuring the amount of mRNA in the body.
The measurement of the mRNA amount of the AQ27 receptor is specifically performed as follows.
(I) Normal or disease model non-human mammals (eg, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc., more specifically, dementia rats, obese mice, arteriosclerotic rabbits, cancer-bearing A drug (eg, an anti-dementia drug, a blood pressure lowering drug, an anti-cancer drug, an anti-obesity drug, etc.) or a physical stress (eg, waterlogging stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.), etc. After the passage, blood or a specific organ (eg, brain, liver, kidney, etc.), or a tissue or cell isolated from the organ is obtained.
The AQ27 receptor mRNA contained in the obtained cells can be quantified by, for example, extracting mRNA from cells or the like by an ordinary method and using, for example, a technique such as TaqMan PCR, and by a method known per se. It can also be analyzed by performing a Northern blot.
(Ii) A transformant expressing the AQ27 receptor is prepared according to the above method, and the mRNA of the AQ27 receptor contained in the transformant can be quantified and analyzed in the same manner.

ＡＱ２７受容体の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニングは、
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、薬剤あるいは物理的ストレスなどを与える一定時間前（３０分前〜２４時間前、好ましくは３０分前〜１２時間前、より好ましくは１時間前〜６時間前）もしくは一定時間後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に試験化合物を投与し、投与後一定時間経過後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、細胞に含まれるＡＱ２７受容体のｍＲＮＡ量を定量、解析することにより行なうことができ、
（ii）形質転換体を常法に従い培養する際に試験化合物を培地中に混合させ、一定時間培養後（１日後〜７日後、好ましくは１日後〜３日後、より好ましくは２日後〜３日後）、該形質転換体に含まれるＡＱ２７受容体のｍＲＮＡ量を定量、解析することにより行なうことができる。
試験化合物および試験化合物が形成してもよい塩としては、前記と同様のものがあげられる。 Screening for a compound or a salt thereof that alters the expression level of the AQ27 receptor includes:
(I) A given time (30 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 12 hours, more preferably 1 hour) before giving a drug or physical stress to a normal or disease model non-human mammal Before or after 6 hours) or after a certain time (after 30 minutes to 3 days, preferably after 1 hour to 2 days, more preferably after 1 hour to 24 hours), or simultaneously with the drug or physical stress. After a certain period of time after administration (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours), the amount of AQ27 receptor mRNA contained in cells is determined. , Can be done by analyzing,
(Ii) When culturing the transformant according to a conventional method, the test compound is mixed in the medium, and after culturing for a certain period of time (1 day to 7 days, preferably 1 day to 3 days, more preferably 2 days to 3 days) ), By quantifying and analyzing the amount of AQ27 receptor mRNA contained in the transformant.
Examples of the test compound and salts which the test compound may form include the same as described above.

本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、ＡＱ２７受容体の発現量を変化させる作用を有する化合物またはその塩であり、具体的には、（イ）ＡＱ２７受容体の発現量を増加させることにより、ＡＱ２７受容体を介する細胞刺激活性を増強させる化合物、（ロ）ＡＱ２７受容体の発現量を減少させることにより、該細胞刺激活性を減弱させる化合物である。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物としては、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
上記スクリーニング方法で得られるＡＱ２７受容体の発現量を変化させる化合物またはその塩は、安全で低毒性な副腎皮質ホルモン分泌調節剤として有用である。
ＡＱ２７受容体の発現量を増加させ、細胞刺激活性を増強させる化合物またはその塩は、副腎皮質ホルモン分泌調節剤、好ましくは副腎皮質ホルモン分泌促進剤として有用である。さらに、ＡＱ２７受容体の発現量を増加させ、細胞刺激活性を増強させる化合物またはその塩は、例えば、低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛み、肥満などの予防・治療剤として有用である。
また、ＡＱ２７受容体の発現量を増加させ、細胞刺激活性を増強させる化合物またはその塩は、安全で低毒性な男性ホルモン分泌調節剤、好ましくは男性ホルモン分泌促進剤として有用である。さらに、ＡＱ２７受容体の発現量を増加させ、細胞刺激活性を増強させる化合物は、例えば、陰茎肥大、精巣萎縮、精巣機能異常（例、精子減少）、月経異常、多毛、色素沈着、嗄声、過敏症、坐瘡、悪心、嘔吐、消化器系症状（例、食欲不振）、満月様顔貌などの予防・治療剤として有用である。
一方、ＡＱ２７受容体の発現量を減少させ、細胞刺激活性を減弱させる化合物またはその塩は、副腎皮質ホルモン分泌調節剤、好ましくは副腎皮質ホルモン分泌阻害剤（副腎皮質ホルモン分泌抑制剤）として有用である。さらに、ＡＱ２７受容体の発現量を減少させ、細胞刺激活性を減弱させる化合物またはその塩は、例えば、クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍、過敏性腸症候群などの予防・治療剤として有用である。
また、ＡＱ２７受容体の発現量を減少させ、細胞刺激活性を減弱させる化合物またはその塩は、安全で低毒性な男性ホルモン分泌調節剤、好ましくは男性ホルモン分泌阻害剤（男性ホルモン分泌抑制剤）として有用である。さらに、ＡＱ２７受容体の発現量を減少させ、細胞刺激活性を減弱させる化合物またはその塩は、例えば、陰茎肥大、精巣萎縮、精巣機能異常（例、精子減少）、月経異常、多毛、色素沈着、嗄声、過敏症、坐瘡、悪心、嘔吐、消化器系症状（例、食欲不振）、満月様顔貌などの予防・治療剤として有用である。 The compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is a compound or a salt thereof having an action of changing the expression level of AQ27 receptor. Specifically, (a) the expression level of AQ27 receptor is A compound that enhances AQ27 receptor-mediated cell stimulating activity by increasing the amount, and (b) a compound that reduces the amount of AQ27 receptor expression to thereby reduce the cell stimulating activity.
Compounds obtained using the screening method of the present invention include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, etc., and these compounds may be novel compounds or known compounds. It may be.
As a salt of a compound obtained by using the screening method of the present invention, a salt with a physiologically acceptable acid (eg, an inorganic acid, etc.) or a base (eg, an organic acid, etc.) is used. Are preferred. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, For example, salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like are used.
The compound or its salt that changes the expression level of the AQ27 receptor obtained by the above-mentioned screening method is useful as a safe and low-toxicity regulator of corticosteroid secretion.
The compound or its salt that increases the expression level of the AQ27 receptor and enhances the cell stimulating activity is useful as a corticosteroid secretion regulator, preferably a corticosteroid secretagogue. In addition, compounds or salts thereof that increase the expression level of AQ27 receptor and enhance cell stimulating activity include, for example, hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal function It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for insufficiency, pain, obesity and the like.
Further, a compound or a salt thereof that increases the expression level of the AQ27 receptor and enhances the cell stimulating activity is useful as a safe and low toxic androgen secretion regulator, preferably a androgen secretagogue. Furthermore, compounds that increase the expression level of the AQ27 receptor and enhance cell stimulating activity include, for example, penile enlargement, testicular atrophy, testicular dysfunction (eg, sperm reduction), menstrual abnormalities, hirsutism, pigmentation, hoarseness, hypersensitivity It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for illness, acne, nausea, vomiting, digestive symptoms (eg, anorexia), full moon-like face, and the like.
On the other hand, a compound or a salt thereof which reduces the expression level of AQ27 receptor and attenuates the cell stimulating activity is useful as a corticosteroid secretion regulator, preferably a corticosteroid secretion inhibitor (corticosteroid secretion inhibitor). is there. Furthermore, compounds or salts thereof that decrease the expression level of AQ27 receptor and attenuate cell stimulating activity include, for example, Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosterone It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for sickness, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, gastric / duodenal ulcer, irritable bowel syndrome and the like.
Further, a compound or a salt thereof which reduces the expression level of AQ27 receptor and attenuates cell stimulating activity is a safe and low toxic androgen secretion regulator, preferably a androgen secretion inhibitor (androgen secretion inhibitor). Useful. Furthermore, compounds or salts thereof that decrease the expression level of the AQ27 receptor and attenuate the cell stimulating activity include, for example, penile enlargement, testicular atrophy, testicular dysfunction (eg, sperm reduction), menstrual abnormalities, hirsutism, pigmentation, It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for hoarseness, irritability, acne, nausea, vomiting, digestive symptoms (eg, anorexia), full moon-like face, etc.

本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を医薬組成物として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、該化合物またはその塩は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０TM、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。 When a compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is used as a pharmaceutical composition, it can be formulated according to a conventional method.
For example, the compound or a salt thereof may be sterilized orally as a tablet, capsule, elixir, microcapsule or the like, if necessary, coated with sugar or water or other pharmaceutically acceptable liquid. It can be used parenterally in the form of injections, such as aqueous solutions or suspensions. For example, the compound may be mixed with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like, in a unit dosage form required for generally accepted pharmaceutical practice. Can be manufactured by The amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
Examples of additives that can be incorporated into tablets, capsules, and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, and acacia, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid. Useful bulking agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavoring agents such as peppermint, reddish oil or cherry and the like are used. When the unit dosage form is a capsule, a liquid carrier such as oils and fats can be further contained in the above-mentioned type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. As the aqueous solution for injection, for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like are used. For example, it may be used in combination with an alcohol (eg, ethanol), a polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), a nonionic surfactant (eg, Polysorbate 80 ™ , HCO-50). As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.

また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、成人患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、成人患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。 The prophylactic / therapeutic agents include, for example, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human Serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants, etc. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
The preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, and should be administered to humans and mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, condition, administration method, and the like. In the case of oral administration, for example, in an adult patient (with a body weight of 60 kg), the dose is generally one day. It is about 0.1-100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg. When administered parenterally, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, condition, administration method, and the like. For example, it is usually in the form of an injection, for example, in an adult patient (with a body weight of 60 kg). It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.

（４）ＡＱ２７受容体の定量法および診断方法
本発明の抗体は、ＡＱ２７受容体を特異的に認識することができるので、被検液中のＡＱ２７受容体の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化されたＡＱ２７受容体とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたＡＱ２７受容体の割合を測定することを特徴とする被検液中のＡＱ２７受容体の定量法、および
（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中のＡＱ２７受容体の定量法を提供する。 (4) AQ27 Receptor Quantitative Method and Diagnosis Method Since the antibody of the present invention can specifically recognize the AQ27 receptor, quantification of AQ27 receptor in a test solution, particularly quantification by a sandwich immunoassay method And so on.
That is, the present invention
(I) reacting the antibody of the present invention with a test solution and a labeled AQ27 receptor competitively, and measuring a ratio of the labeled AQ27 receptor bound to the antibody. A method for quantifying the AQ27 receptor in a test solution, and (ii) reacting the test solution with the antibody of the present invention insoluble on a carrier and another labeled antibody of the present invention simultaneously or continuously. The present invention further provides a method for quantifying the AQ27 receptor in a test solution, which comprises measuring the activity of a labeling agent on an insolubilized carrier.

上記（ii）の定量法においては、一方の抗体がＡＱ２７受容体のＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体がＡＱ２７受容体のＣ端部に反応する抗体であることが望ましい。
また、ＡＱ２７受容体に対するモノクローナル抗体を用いてＡＱ２７受容体の定量を行うことができるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')2、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いるＡＱ２７受容体の定量法は、 特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、ＡＱ２７受容体量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125Ｉ〕、〔131Ｉ〕、〔3Ｈ〕、〔14Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、物理吸着を用いてもよく、また通常ＡＱ２７受容体あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中のＡＱ２７受容体量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。 In the quantitative method (ii), it is preferable that one antibody is an antibody that recognizes the N-terminal of the AQ27 receptor and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal of the AQ27 receptor.
In addition, the AQ27 receptor can be quantified using a monoclonal antibody against the AQ27 receptor, and can also be detected by tissue staining or the like. For these purposes, the antibody molecule itself may be used, or F (ab ') 2 , Fab', or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
The method for quantifying AQ27 receptor using the antibody of the present invention is not particularly limited, and may be an antibody, an antigen, or an antibody-antigen complex corresponding to the amount of antigen (eg, the amount of AQ27 receptor) in the test solution. Any method can be used as long as it is a method for detecting the amount of the compound by chemical or physical means and calculating the amount from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of the antigen. For example, nephelometry, a competitive method, an immunometric method, and a sandwich method are preferably used, but in terms of sensitivity and specificity, it is particularly preferable to use a sandwich method described later.
As a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance, for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used. As the radioisotope, for example, [ 125 I], [ 131 I], [ 3 H], [ 14 C] and the like are used. As the above enzyme, a stable enzyme having a large specific activity is preferable. For example, β-galactosidase, β-glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used. As the fluorescent substance, for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate and the like are used. As the luminescent substance, for example, luminol, a luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used. Further, a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
For insolubilization of the antigen or antibody, physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used for insolubilizing and immobilizing the AQ27 receptor or enzyme or the like may be used. Examples of the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass.
In the sandwich method, the test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with another labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction). By measuring the activity of the labeling agent, the amount of AQ27 receptor in the test solution can be determined. The primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times. The labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above. In the immunoassay by the sandwich method, the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one kind, and a mixture of two or more kinds of antibodies is used for the purpose of improving the measurement sensitivity and the like. You may.

本発明のサンドイッチ法によるＡＱ２７受容体の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、ＡＱ２７受容体の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、ＡＱ２７受容体のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原(Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてＡＱ２７受容体の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D : Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E : Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I : Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、ＡＱ２７受容体を感度良く定量することができる。 In the method for measuring AQ27 receptor by the sandwich method of the present invention, as the monoclonal antibody of the present invention used for the primary reaction and the secondary reaction, an antibody having a different binding site to the AQ27 receptor is preferably used. That is, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the AQ27 receptor, the antibody used in the primary reaction is preferably C For example, an antibody that recognizes an N-terminal other than the end is used.
The monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, a nephrometry, or the like.
In the competition method, after the antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated. (B / F separation), the amount of any of B and F is measured, and the amount of antigen in the test solution is quantified. In this reaction method, a soluble antibody is used as the antibody, B / F separation is performed using polyethylene glycol, a liquid phase method using a second antibody against the antibody, or a solid phase antibody is used as the first antibody. As the first antibody, a soluble antibody is used, and an immobilization method using an immobilized antibody as the second antibody is used.
In the immunometric method, the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction against a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated. And an excess amount of the labeled antibody, and then immobilized antigen is added to bind unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of label in any phase is measured to determine the amount of antigen in the test solution.
In nephelometry, the amount of insoluble precipitates generated as a result of an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
In applying these individual immunoassays to the quantification method of the present invention, no special conditions, operations, and the like need to be set. A measurement system for AQ27 receptor may be constructed by adding ordinary technical considerations of those skilled in the art to ordinary conditions and operation methods in each method. For details of these general technical means, reference can be made to reviews, books, and the like.
For example, Hiroe Irie, "Radio Immunoassay" (Kodansha, published in 1974), Hiroshi Irie, "Radio Immunoassay" (Kodansha, published in 1974), Eiji Ishikawa et al., "Enzyme Immunoassay" (Medical Shoin, Showa Ed. Ishikawa et al., “Enzyme Immunoassay” (2nd edition) (Issue Shoin, 1982), Eiji Ishikawa et. Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A)), Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B)), Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C)), Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part C)) 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays)), ibid.Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), ibid.Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies). Academic Press Issue) and the like can be referred to.
As described above, the AQ27 receptor can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.

さらに、本発明の抗体を用いてＡＱ２７受容体の濃度を定量することによって、ＡＱ２７受容体の濃度の減少が検出された場合、例えば、ＡＱ２７受容体の機能不全に関連する疾患である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、ＡＱ２７受容体の濃度の増加が検出された場合には、例えば、ＡＱ２７受容体の過剰発現に起因する疾患である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
ＡＱ２７受容体の機能不全に関連する疾患としては、例えば、低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛み、肥満、男性性腺機能不全、造精機能障害に伴う男子不妊症、再生不良性貧血、骨髄線維症、腎性貧血、末期女性性器癌の疼痛緩和、乳癌（例、手術不能乳癌）、乳腺症、乳腺腫瘍、女性化乳などが挙げられる。
ＡＱ２７受容体の過剰発現に起因する疾患としては、例えば、クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍、過敏性腸症候、陰茎肥大、精巣萎縮、精巣機能異常（例、精子減少）、月経異常、多毛、色素沈着、嗄声、過敏症、坐瘡、悪心、嘔吐、消化器系症状（例、食欲不振）、満月様顔貌などが挙げられる。 Further, when a decrease in the concentration of the AQ27 receptor is detected by quantifying the concentration of the AQ27 receptor using the antibody of the present invention, for example, a disease associated with dysfunction of the AQ27 receptor, or a disease in the future It can be diagnosed that they are likely to be affected.
When an increase in the concentration of the AQ27 receptor is detected, for example, it can be diagnosed that the disease is caused by overexpression of the AQ27 receptor or that the disease is likely to be caused in the future.
Diseases associated with AQ27 receptor dysfunction include, for example, hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain, obesity, male gonad dysfunction, Male infertility associated with imperfect dysgenesis, aplastic anemia, myelofibrosis, renal anemia, pain relief for terminal stage female genital cancer, breast cancer (eg, inoperable breast cancer), mastopathy, breast tumor, gynecomastia, etc. Is mentioned.
Diseases caused by overexpression of AQ27 receptor include, for example, Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal gland Enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, stomach / duodenal ulcer, irritable bowel symptoms, penile enlargement, testicular atrophy, testicular dysfunction (eg, decreased sperm), menstrual abnormalities, hirsutism, pigmentation, Examples include hoarseness, irritability, acne, nausea, vomiting, gastrointestinal symptoms (eg, anorexia), full moon-like face, and the like.

（５）細胞膜におけるＡＱ２７受容体またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物またはその塩を含有する医薬
本発明の抗体は、ＡＱ２７受容体を特異的に認識することができるので、細胞膜におけるＡＱ２７受容体の量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニングに用いることができる。
すなわち本発明は、例えば、
（ｉ）非ヒト哺乳動物のａ）血液、ｂ）特定の臓器、ｃ）臓器から単離した組織もしくは細胞等を破壊した後、細胞膜画分を単離し、細胞膜画分に含まれるＡＱ２７受容体を定量することによる、細胞膜におけるＡＱ２７受容体の量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（ii）ＡＱ２７受容体を発現する形質転換体等を破壊した後、細胞膜画分を単離し、細胞膜画分に含まれるＡＱ２７受容体を定量することによる、細胞膜におけるＡＱ２７受容体の量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（iii）非ヒト哺乳動物のａ）血液、ｂ）特定の臓器、ｃ）臓器から単離した組織もしくは細胞等を切片とした後、免疫染色法を用いることにより、細胞表層での該受容体蛋白質の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上の該蛋白質を確認することによる、細胞膜におけるＡＱ２７受容体の量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
（iv）ＡＱ２７受容体を発現する形質転換体等を切片とした後、免疫染色法を用いることにより、細胞表層での該受容体蛋白質の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上の該蛋白質を確認することによる、細胞膜におけるＡＱ２７受容体の量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。 (5) Pharmaceuticals Containing Compounds or Salts That Change the Amount of AQ27 Receptor or Partial Peptide in Cell Membrane Since the antibody of the present invention can specifically recognize AQ27 receptor, Can be used for screening for a compound or a salt thereof that changes the amount of the compound.
That is, the present invention, for example,
(I) a) the blood of a non-human mammal, b) a specific organ, c) a tissue or a cell isolated from an organ, etc., after disrupting, a cell membrane fraction is isolated and the AQ27 receptor contained in the cell membrane fraction A method for screening a compound or a salt thereof that alters the amount of AQ27 receptor in the cell membrane by quantifying
(Ii) After disrupting a transformant or the like that expresses the AQ27 receptor, the amount of the AQ27 receptor in the cell membrane is changed by isolating the cell membrane fraction and quantifying the AQ27 receptor contained in the cell membrane fraction. A method for screening a compound or a salt thereof,
(Iii) a non-human mammal's a) blood, b) a specific organ, c) a tissue or cell isolated from the organ, etc., and then the receptor is used on the cell surface by immunostaining. Provided is a method for screening a compound or a salt thereof, which changes the amount of AQ27 receptor in a cell membrane by confirming the protein on the cell membrane by quantifying the degree of staining of the protein.
(Iv) A transformant expressing the AQ27 receptor is sectioned, and the degree of staining of the receptor protein on the cell surface is quantified by using an immunostaining method, whereby the protein on the cell membrane is quantified. And a method of screening for a compound or a salt thereof that alters the amount of AQ27 receptor in the cell membrane by confirming the following.

細胞膜画分に含まれるＡＱ２７受容体の定量は具体的には以下のようにして行なう。
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より具体的には痴呆ラット、肥満マウス、動脈硬化ウサギ、担癌マウスなど）に対して、薬剤（例えば、抗痴呆薬、血圧低下薬、抗癌剤、抗肥満薬など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓など）、または臓器から単離した組織、あるいは細胞を得る。得られた臓器、組織または細胞等を、例えば、適当な緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ヘペス緩衝液など）等に懸濁し、臓器、組織あるいは細胞を破壊し、界面活性剤（例えば、トリトンＸ１００TM、ツイーン２０TMなど）などを用い、さらに遠心分離や濾過、カラム分画などの手法を用いて細胞膜画分を得る。
細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）のよる破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したＡＱ２７受容体と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
細胞膜画分に含まれるＡＱ２７受容体は、例えば、本発明の抗体を用いたサンドイッチ免疫測定法、ウエスタンブロット解析などにより定量することができる。
かかるサンドイッチ免疫測定法は上記の方法と同様にして行なうことができ、ウエスタンブロットは自体公知の手段により行なうことができる。
（ii）ＡＱ２７受容体を発現する形質転換体を上記の方法に従い作製し、細胞膜画分に含まれるＡＱ２７受容体を定量することができる。 The quantification of the AQ27 receptor contained in the cell membrane fraction is specifically performed as follows.
(I) Normal or disease model non-human mammals (eg, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc., more specifically, dementia rats, obese mice, arteriosclerotic rabbits, cancer-bearing A drug (eg, an anti-dementia drug, a blood pressure lowering drug, an anti-cancer drug, an anti-obesity drug, etc.) or a physical stress (eg, waterlogging stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.), etc. After the passage, blood or a specific organ (eg, brain, liver, kidney, etc.), or a tissue or cell isolated from the organ is obtained. The obtained organ, tissue or cell is suspended in, for example, an appropriate buffer (eg, Tris-HCl buffer, phosphate buffer, Hepes buffer, etc.), and the organ, tissue or cell is destroyed. An activator (eg, Triton X100 ™ , Tween 20 ™, etc.) or the like is used, and a cell membrane fraction is obtained using techniques such as centrifugation, filtration, and column fractionation.
The cell membrane fraction refers to a fraction abundant in cell membrane obtained by disrupting cells and then obtained by a method known per se. The cells can be crushed by crushing the cells with a Potter-Elvehjem homogenizer, crushing with a Waring blender or a polytron (Kinematica), crushing with ultrasonic waves, or squirting the cells from a thin nozzle while applying pressure with a French press. Crushing and the like. For fractionation of cell membranes, fractionation by centrifugal force such as fractionation centrifugation or density gradient centrifugation is mainly used. For example, the cell lysate is centrifuged at a low speed (500-3000 rpm) for a short time (usually about 1 to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a high speed (15000 to 30000 rpm) for usually 30 minutes to 2 hours. Is the membrane fraction. The membrane fraction is rich in the expressed AQ27 receptor and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
The AQ27 receptor contained in the cell membrane fraction can be quantified by, for example, sandwich immunoassay using the antibody of the present invention, Western blot analysis, or the like.
Such a sandwich immunoassay can be performed in the same manner as described above, and the Western blot can be performed by a means known per se.
(Ii) A transformant expressing the AQ27 receptor is prepared according to the method described above, and the AQ27 receptor contained in the cell membrane fraction can be quantified.

細胞膜におけるＡＱ２７受容体の量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニングは、
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、薬剤あるいは物理的ストレスなどを与える一定時間前（３０分前〜２４時間前、好ましくは３０分前〜１２時間前、より好ましくは１時間前〜６時間前）もしくは一定時間後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に試験化合物を投与し、投与後一定時間経過後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、細胞膜におけるＡＱ２７受容体の量を定量することにより行なうことができ、
（ii）形質転換体を常法に従い培養する際に試験化合物を培地中に混合させ、一定時間培養後（１日後〜７日後、好ましくは１日後〜３日後、より好ましくは２日後〜３日後）、細胞膜におけるＡＱ２７受容体の量を定量することにより行なうことができる。
細胞膜画分に含まれるＡＱ２７受容体の確認は具体的には以下のようにして行なう。
（iii）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より具体的には痴呆ラット、肥満マウス、動脈硬化ウサギ、担癌マウスなど）に対して、薬剤（例えば、抗痴呆薬、血圧低下薬、抗癌剤、抗肥満薬など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓など）、または臓器から単離した組織、あるいは細胞を得る。得られた臓器、組織または細胞等を、常法に従い組織切片とし、本発明の抗体を用いて免疫染色を行う。細胞表層での該受容体蛋白質の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上の該蛋白質を確認することにより、定量的または定性的に、細胞膜におけるＡＱ２７受容体の量を確認することができる。
（iv）ＡＱ２７受容体を発現する形質転換体等を用いて同様の手段をとることにより確認することもできる。
試験化合物および試験化合物が形成してもよい塩としては、前記と同様のものがあげられる。 Screening for a compound or a salt thereof that alters the amount of AQ27 receptor in the cell membrane comprises:
(I) A given time (30 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 12 hours, more preferably 1 hour) before giving a drug or physical stress to a normal or disease model non-human mammal Before or after 6 hours) or after a certain time (after 30 minutes to 3 days, preferably after 1 hour to 2 days, more preferably after 1 hour to 24 hours), or simultaneously with the drug or physical stress. After a certain period of time after administration (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours), the amount of AQ27 receptor in the cell membrane is determined. Can do
(Ii) When culturing the transformant according to a conventional method, the test compound is mixed in the medium, and after culturing for a certain period of time (1 day to 7 days, preferably 1 day to 3 days, more preferably 2 days to 3 days) ), By quantifying the amount of AQ27 receptor in the cell membrane.
The confirmation of the AQ27 receptor contained in the cell membrane fraction is specifically performed as follows.
(Iii) Normal or disease model non-human mammals (eg, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc., more specifically, dementia rats, obese mice, arteriosclerotic rabbits, cancer-bearing A drug (eg, an anti-dementia drug, a blood pressure lowering drug, an anti-cancer drug, an anti-obesity drug, etc.) or a physical stress (eg, waterlogging stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.), etc. After the passage, blood or a specific organ (eg, brain, liver, kidney, etc.), or a tissue or cell isolated from the organ is obtained. The obtained organ, tissue or cell is cut into a tissue section according to a conventional method, and immunostaining is performed using the antibody of the present invention. By quantifying the degree of staining of the receptor protein on the cell surface, and confirming the protein on the cell membrane, the amount of AQ27 receptor in the cell membrane can be quantitatively or qualitatively confirmed.
(Iv) The same can be confirmed by using a transformant or the like expressing the AQ27 receptor and performing the same procedure.
Examples of the test compound and salts which the test compound may form include the same as described above.

本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、細胞膜におけるＡＱ２７受容体の量を変化させる作用を有する化合物またはその塩であり、具体的には、（イ）細胞膜におけるＡＱ２７受容体の量を増加させることにより、ＡＱ２７受容体を介する細胞刺激活性（を増強させる化合物またはその塩、（ロ）細胞膜におけるＡＱ２７受容体の量を減少させることにより、該細胞刺激活性を減弱させる化合物またはその塩である。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物としては、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
該化合物の塩としては、前記した本発明ペプチドの塩と同様のものが用いられる。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、安全で低毒性な副腎皮質ホルモン分泌調節剤として有用である。
また、細胞膜におけるＡＱ２７受容体の量を増加させることにより、細胞刺激活性を増強させる化合物またはその塩は、副腎皮質ホルモン分泌調節剤、好ましくは副腎皮質ホルモン分泌促進剤として有用である。さらに、細胞膜におけるＡＱ２７受容体の量を増加させることにより、細胞刺激活性を増強させる化合物またはその塩は、低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛み、肥満などの予防・治療剤として有用である。
さらに、細胞膜におけるＡＱ２７受容体の量を増加させることにより、細胞刺激活性を増強させる化合物またはその塩は、安全で低毒性な男性ホルモン分泌調節剤、好ましくは男性ホルモン分泌促進剤として有用である。さらに、細胞膜におけるＡＱ２７受容体の量を増加させることにより、細胞刺激活性を増強させる化合物またはその塩は、例えば、男性性腺機能不全、造精機能障害に伴う男子不妊症、再生不良性貧血、骨髄線維症、腎性貧血、末期女性性器癌の疼痛緩和、乳癌（例、手術不能乳癌）、乳腺症、乳腺腫瘍、女性化乳房などの予防・治療剤として有用である。
一方、細胞膜におけるＡＱ２７受容体の量を減少させることにより、細胞刺激活性を減弱させる化合物またはその塩は、副腎皮質ホルモン分泌調節剤、好ましくは副腎皮質ホルモン分泌阻害剤（副腎皮質ホルモン分泌抑制剤）として有用である。さらに、細胞膜におけるＡＱ２７受容体の量を減少させることにより、細胞刺激活性を減弱させる化合物またはその塩は、クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍、過敏性腸症候群などの予防・治療剤として有用である。
さらに、細胞膜におけるＡＱ２７受容体の量を減少させることにより、細胞刺激活性を減弱させる化合物またはその塩は、安全で低毒性な男性ホルモン分泌調節剤、好ましくは男性ホルモン分泌阻害剤（男性ホルモン分泌抑制剤）として有用である。さらに、細胞膜におけるＡＱ２７受容体の量を減少させることにより、細胞刺激活性を減弱させる化合物またはその塩は、例えば、陰茎肥大、精巣萎縮、精巣機能異常（例、精子減少）、月経異常、多毛、色素沈着、嗄声、過敏症、坐瘡、悪心、嘔吐、消化器系症状（例、食欲不振）、満月様顔貌などの予防・治療剤として有用である。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を医薬組成物として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、該化合物またはその塩は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。 The compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is a compound or a salt thereof having an action of changing the amount of AQ27 receptor in the cell membrane, and specifically, (a) the AQ27 receptor in the cell membrane A compound or a salt thereof that enhances AQ27 receptor-mediated cell stimulating activity by increasing the amount, or (b) a compound that reduces the AQ27 receptor-mediated cell stimulating activity by decreasing the amount of AQ27 receptor in the cell membrane, or a compound thereof. Salt.
Compounds obtained using the screening method of the present invention include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, etc., and these compounds may be novel compounds or known compounds. It may be.
As the salt of the compound, those similar to the aforementioned salts of the peptide of the present invention are used.
The compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is useful as a safe and low-toxicity agent for regulating corticosteroid secretion.
In addition, a compound or a salt thereof that enhances the cell stimulating activity by increasing the amount of AQ27 receptor in the cell membrane is useful as a corticosteroid secretion regulator, preferably a corticosteroid secretagogue. In addition, compounds or salts thereof that enhance cell stimulating activity by increasing the amount of AQ27 receptor in the cell membrane are hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal gland It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for dysfunction, pain, obesity and the like.
Further, a compound or a salt thereof that enhances the cell stimulating activity by increasing the amount of AQ27 receptor in the cell membrane is useful as a safe and low toxic androgen secretion regulator, preferably a androgen secretagogue. Further, a compound or a salt thereof that enhances the cell stimulating activity by increasing the amount of AQ27 receptor in the cell membrane can be used, for example, for male gonad dysfunction, male infertility associated with impaired spermatogenic function, aplastic anemia, bone marrow It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for fibrosis, renal anemia, pain relief for terminal stage female genital cancer, breast cancer (eg, inoperable breast cancer), mastopathy, breast tumor, gynecomastia, and the like.
On the other hand, a compound or a salt thereof that attenuates the cell stimulating activity by decreasing the amount of AQ27 receptor in the cell membrane is a corticosteroid secretion regulator, preferably a corticosteroid secretion inhibitor (corticosteroid secretion inhibitor). Useful as Further, a compound or a salt thereof that attenuates the cell stimulating activity by reducing the amount of AQ27 receptor in the cell membrane is used for Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, gastric / duodenal ulcer, irritable bowel syndrome, and the like.
Further, a compound or a salt thereof that reduces the cell stimulating activity by reducing the amount of AQ27 receptor in the cell membrane is a safe and low toxic androgen secretion regulator, preferably an androgen secretion inhibitor (androgen secretion inhibitor). Agent). Furthermore, compounds or salts thereof that reduce the cell stimulating activity by reducing the amount of AQ27 receptor in the cell membrane include, for example, penile enlargement, testicular atrophy, testicular dysfunction (eg, sperm reduction), menstrual abnormalities, hirsutism, It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for pigmentation, hoarseness, irritability, acne, nausea, vomiting, gastrointestinal symptoms (eg, anorexia), full moon-like face, and the like.
When a compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is used as a pharmaceutical composition, it can be formulated according to a conventional method.
For example, the compound or a salt thereof may be sterilized orally as a tablet, capsule, elixir, microcapsule or the like, if necessary, coated with sugar or water or other pharmaceutically acceptable liquid. It can be used parenterally in the form of injections, such as aqueous solutions or suspensions. For example, the compound may be mixed with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like, in a unit dosage form required for generally accepted pharmaceutical practice. Can be manufactured by The amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.

錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０TM、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、成人患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、成人患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。 Examples of additives that can be incorporated into tablets, capsules, and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, and acacia, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid. Useful bulking agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavoring agents such as peppermint, reddish oil or cherry and the like are used. When the unit dosage form is a capsule, a liquid carrier such as oils and fats can be further contained in the above-mentioned type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. As the aqueous solution for injection, for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like are used. For example, it may be used in combination with an alcohol (eg, ethanol), a polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), a nonionic surfactant (eg, Polysorbate 80 ™ , HCO-50). As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
The prophylactic / therapeutic agents include, for example, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human Serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants, etc. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
The preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, and should be administered to humans and mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, condition, administration method, and the like. In the case of oral administration, for example, in an adult patient (with a body weight of 60 kg), the dose is generally one day. It is about 0.1-100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg. When administered parenterally, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, condition, administration method, and the like. For example, it is usually in the form of an injection, for example, in an adult patient (with a body weight of 60 kg). It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.

（６）ＡＱ２７受容体に対する抗体を含有してなる医薬
ＡＱ２７受容体に対する抗体が中和活性を有する場合は、該ＡＱ２７受容体の関与するシグナル伝達、例えば、該ＡＱ２７受容体を介する細胞刺激活性を不活性化することができる。
したがって、ＡＱ２７受容体に対する抗体（例、中和抗体）は、安全で低毒性な副腎皮質ホルモン分泌調節剤、好ましくは副腎皮質ホルモン分泌阻害剤（副腎皮質ホルモン分泌抑制剤）として有用である。さらに、ＡＱ２７受容体に対する抗体（例、中和抗体）は、例えば、クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍、過敏性腸症候群などの予防・治療剤として有用である。
さらに、ＡＱ２７受容体に対する抗体（例、中和抗体）は、安全で低毒性な男性ホルモン分泌調節剤、好ましくは男性ホルモン分泌阻害剤（男性ホルモン分泌抑制剤）として有用である。さらに、ＡＱ２７受容体に対する抗体（例、中和抗体）は、例えば、陰茎肥大、精巣萎縮、精巣機能異常（例、精子減少）、月経異常、多毛、色素沈着、嗄声、過敏症、坐瘡、悪心、嘔吐、消化器系症状（例、食欲不振）、満月様顔貌などの予防・治療剤として有用である。 (6) Pharmaceuticals Containing Antibody to AQ27 Receptor When the antibody to AQ27 receptor has a neutralizing activity, it exerts a signal transduction involving the AQ27 receptor, for example, a cell stimulating activity via the AQ27 receptor. Can be inactivated.
Therefore, an antibody against the AQ27 receptor (eg, a neutralizing antibody) is useful as a safe and low-toxicity corticosteroid secretion regulator, preferably a corticosteroid secretion inhibitor (corticosteroid secretion inhibitor). Furthermore, antibodies to the AQ27 receptor (eg, neutralizing antibodies) include, for example, Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, gastric / duodenal ulcer, irritable bowel syndrome, and the like.
Furthermore, an antibody against the AQ27 receptor (eg, a neutralizing antibody) is useful as a safe and low toxic androgen secretion regulator, preferably an androgen secretion inhibitor (androgen secretion inhibitor). Furthermore, antibodies to the AQ27 receptor (eg, neutralizing antibodies) include, for example, penile enlargement, testicular atrophy, testicular dysfunction (eg, sperm loss), menstrual abnormalities, hirsutism, pigmentation, hoarseness, irritability, acne, It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for nausea, vomiting, gastrointestinal symptoms (eg, anorexia), full moon-like face, etc.

（７）本発明のアンチセンスＤＮＡを含有してなる医薬
本発明のアンチセンスＤＮＡは、安全で低毒性な副腎皮質ホルモン分泌調節剤、好ましくは副腎皮質ホルモン分泌阻害剤（副腎皮質ホルモン分泌抑制剤）として有用である。さらに、本発明のアンチセンスＤＮＡは、クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍、過敏性腸症候群などの予防・治療剤として有用である。
また、本発明のアンチセンスＤＮＡは、安全で低毒性な男性ホルモン分泌調節剤、好ましくは男性ホルモン分泌阻害剤（男性ホルモン分泌抑制剤）として有用である。さらに、本発明のアンチセンスＤＮＡは、例えば、陰茎肥大、精巣萎縮、精巣機能異常（例、精子減少）、月経異常、多毛、色素沈着、嗄声、過敏症、坐瘡、悪心、嘔吐、消化器系症状（例、食欲不振）、満月様顔貌などの予防・治療剤として有用である。
例えば、該アンチセンスＤＮＡを用いる場合、該アンチセンスＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。該アンチセンスＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
さらに、該アンチセンスＤＮＡは、組織や細胞におけるＡＱ２７受容体ＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。 (7) Pharmaceutical containing antisense DNA of the present invention The antisense DNA of the present invention is a safe and low-toxicity corticosteroid secretion regulator, preferably a corticosteroid secretion inhibitor (a corticosteroid secretion inhibitor) ) Is useful. Furthermore, the antisense DNA of the present invention is used for Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, It is useful as a prophylactic or therapeutic agent for depression, anorexia nervosa, insomnia, gastric / duodenal ulcer, irritable bowel syndrome, and the like.
Further, the antisense DNA of the present invention is useful as a safe and low toxic androgen secretion regulator, preferably a androgen secretion inhibitor (androgen secretion inhibitor). Furthermore, the antisense DNA of the present invention can be used, for example, for penis hypertrophy, testicular atrophy, testicular dysfunction (eg, sperm reduction), menstrual abnormalities, hirsutism, pigmentation, hoarseness, irritability, acne, nausea, vomiting, gastrointestinal tract. It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for systemic symptoms (eg, anorexia), full moon-like face, etc.
For example, when using the antisense DNA, the antisense DNA can be used alone or after being inserted into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, and the like, followed by a conventional method. The antisense DNA can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant for promoting uptake, and administered with a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
Furthermore, the antisense DNA can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence and expression of AQ27 receptor DNA in tissues and cells.

（８）ＡＱ２７受容体ＤＮＡ導入動物の作製
本発明は、外来性のＡＱ２７受容体ＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
〔１〕本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
〔２〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔１〕記載の動物、
〔３〕ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第〔２〕記載の動物、および
〔４〕本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、ＡＱ２７受容体ＤＮＡ転移動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを転移することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合させることによりＡＱ２７受容体ＤＮＡ転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ1系統，ＢＤＦ1系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ1系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。 (8) Preparation of AQ27 Receptor DNA-Introduced Animal The present invention provides an exogenous AQ27 receptor DNA (hereinafter abbreviated as the exogenous DNA of the present invention) or a mutant DNA thereof (abbreviated as the exogenous mutant DNA of the present invention). A non-human mammal having (possibly)
That is, the present invention
[1] a non-human mammal having the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof,
[2] the animal of [1], wherein the non-human mammal is a rodent;
[3] The animal according to [2], wherein the rodent is a mouse or a rat; and [4] a recombinant vector containing the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof and capable of being expressed in a mammal. Things.
Non-human mammals having the exogenous DNA of the present invention or the mutant DNA thereof (hereinafter abbreviated as AQ27 receptor DNA transgenic animals) can be used for non-fertilized eggs, fertilized eggs, germ cells including spermatozoa and their progenitor cells, and the like. And preferably at the stage of embryonic development in non-human mammal development (more preferably at the stage of single cells or fertilized eggs and generally before the 8-cell stage), the calcium phosphate method, the electric pulse method, the lipofection method, the agglutination method, It can be produced by transferring a target DNA by a microinjection method, a particle gun method, a DEAE-dextran method, or the like. In addition, the exogenous DNA of the present invention can be transferred to somatic cells, organs of living organisms, tissue cells, and the like by the DNA transfer method, and can be used for cell culture, tissue culture, and the like. An AQ27 receptor DNA-transferred animal can also be produced by fusing the above-mentioned germ cells with a cell fusion method known per se.
As the non-human mammal, for example, cow, pig, sheep, goat, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, mouse, rat and the like are used. Among them, rodents, which are relatively short in ontogeny and biological cycle in terms of the preparation of diseased animal model systems, and are easy to breed, particularly mice (for example, hybrids such as C57BL / 6 strain and DBA2 strain as pure strains) As the strain, B6C3F 1 strain, BDF 1 strain, B6D2F 1 strain, BALB / c strain, ICR strain, etc.) or rat (for example, Wistar, SD etc.) are preferable.
"Mammals" in a recombinant vector that can be expressed in mammals include humans in addition to the above-mentioned non-human mammals.

本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有しているＡＱ２７受容体ＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出されたＡＱ２７受容体ＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元のＡＱ２７受容体ＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
該異常ＤＮＡとしては、異常なＡＱ２７受容体を発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常なＡＱ２７受容体の機能を抑制するＡＱ２７受容体を発現させるＤＮＡなどが用いられる。
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。ＡＱ２７受容体ＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高いＡＱ２７受容体ＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによってＡＱ２７受容体ＤＮＡを高発現するＤＮＡ転移哺乳動物を作出することができる。 The exogenous DNA of the present invention refers to the AQ27 receptor DNA once isolated and extracted from the mammal, not the AQ27 receptor DNA originally possessed by the non-human mammal.
As the mutant DNA of the present invention, those having a mutation (for example, mutation) in the base sequence of the original AQ27 receptor DNA, specifically, base addition, deletion, substitution with another base, etc. The resulting DNA and the like are used, and also include abnormal DNA.
The abnormal DNA means a DNA that expresses an abnormal AQ27 receptor, and for example, a DNA that expresses an AQ27 receptor that suppresses the function of a normal AQ27 receptor is used.
The exogenous DNA of the present invention may be derived from a mammal that is the same or different from the animal of interest. When transferring the AQ27 receptor DNA to a target animal, it is generally advantageous to use the DNA as a DNA construct linked downstream of a promoter capable of being expressed in animal cells. For example, when the human DNA of the present invention is transferred, DNA derived from various mammals (eg, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.) having AQ27 receptor DNA highly homologous thereto is expressed. High expression of AQ27 receptor DNA by microinjecting a DNA construct (eg, vector, etc.) to which the human DNA of the present invention is bound downstream of various promoters that can be made into a fertilized egg of a target mammal, for example, a mouse fertilized egg. DNA-transferring mammals can be created.

ＡＱ２７受容体の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記のＤＮＡ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、１）ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、２）各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存蛋白質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ペプチド鎖延長因子1α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎蛋白質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物において目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネーターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネーターなどが用いられる。 Examples of AQ27 receptor expression vectors include Escherichia coli-derived plasmids, Bacillus subtilis-derived plasmids, yeast-derived plasmids, bacteriophages such as λ phage, retroviruses such as Moloney leukemia virus, and animal viruses such as vaccinia virus or baculovirus. Is used. Among them, a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis or a plasmid derived from yeast is preferably used.
Examples of the promoter for controlling the DNA expression include 1) a promoter derived from a virus (eg, simian virus, cytomegalovirus, Moloney leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.), 2) various promoters. Promoters from mammals (human, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.), such as albumin, insulin II, uroplakin II, elastase, erythropoietin, endothelin, muscle creatine kinase, glial fibrillary acidic protein, Glutathione S-transferase, platelet-derived growth factor β, keratins K1, K10 and K14, collagen types I and II, cyclic AMP-dependent protein kinase βI subunit, dystrophin, Tartrate-resistant alkaline phosphatase, atrial natriuretic factor, endothelial receptor tyrosine kinase (commonly abbreviated as Tie2), sodium potassium adenosine 3 kinase (Na, K-ATPase), neurofilament light chains, metallothionein I and IIA, Metalloproteinase 1 tissue inhibitor, MHC class I antigen (H-2L), H-ras, renin, dopamine β-hydroxylase, thyroid peroxidase (TPO), peptide chain elongation factor 1α (EF-1α), β actin, α And β-myosin heavy chain, myosin light chain 1 and 2, myelin basic protein, thyroglobulin, Thy-1, immunoglobulin, heavy chain variable region (VNP), serum amyloid P component, myoglobin, troponin C, smooth muscle α-actin, Prep Enkephalin A, such as a promoter, such as vasopressin is used. Among them, a cytomegalovirus promoter capable of high expression throughout the body, a human peptide chain elongation factor 1α (EF-1α) promoter, human and chicken β-actin promoters and the like are preferable.
The vector preferably has a sequence (generally called a terminator) that terminates transcription of the messenger RNA of interest in a DNA-transferred mammal. A simian virus SV40 terminator or the like is preferably used.

その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５'上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３'下流に連結することも目的により可能である。
正常なＡＱ２７受容体の翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常なＡＱ２７受容体の翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有する。
本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。
導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。 In addition, a splicing signal of each DNA, an enhancer region, a part of an intron of a eukaryotic DNA, and the like are placed 5 ′ upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region, or between the translation region for the purpose of further expressing the desired foreign DNA. It is also possible to connect 3 ′ downstream of the above depending on the purpose.
The translation region of the normal AQ27 receptor is obtained from liver, kidney, thyroid cells, fibroblast-derived DNA from humans or various mammals (eg, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.) and commercially available DNAs. All or a part of genomic DNA can be obtained from various genomic DNA libraries, or complementary DNA prepared by known methods from liver, kidney, thyroid cell, or fibroblast-derived RNA can be used as a raw material. In addition, a translation region obtained by mutating a translation region of a normal AQ27 receptor obtained from the above-mentioned cells or tissues by a point mutagenesis method can be prepared from the exogenous abnormal DNA.
The translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a transposed animal by a conventional DNA engineering technique in which it is ligated downstream of the above-mentioned promoter and, if desired, upstream of the transcription termination site.
Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal. The presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA transfer means that all the progeny of the produced animal retain the exogenous DNA of the present invention in all of the germinal cells and somatic cells. means. The progeny of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
The non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred can be subcultured in a normal breeding environment as a DNA-carrying animal by confirming that the exogenous DNA is stably maintained by mating. .
Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in excess in all germ cells and somatic cells of the target mammal. Excessive presence of the exogenous DNA of the present invention in germ cells of a produced animal after DNA transfer means that all offspring of the produced animal have an excessive amount of the exogenous DNA of the present invention in all of their germ cells and somatic cells. Means Progeny of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have an excess of the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
By obtaining a homozygous animal having the introduced DNA on both homologous chromosomes and mating the male and female animals, all offspring can be bred to have the DNA in excess.

本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的にＡＱ２７受容体の機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ転移動物を用いて、ＡＱ２７受容体の機能亢進症や、ＡＱ２７受容体が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離したＡＱ２７受容体の増加症状を有することから、ＡＱ２７受容体に関連する疾患に対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原料として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラク卜は、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。 The non-human mammal having the normal DNA of the present invention expresses the normal DNA of the present invention at a high level, and eventually develops hyperactivity of the AQ27 receptor by promoting the function of endogenous normal DNA. Can be used as a disease model animal. For example, using the normal DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of AQ27 receptor hyperfunction and AQ27 receptor-related diseases, and to examine treatment methods for these diseases. is there.
In addition, since the mammal into which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released AQ27 receptor, it can be used for a screening test for a therapeutic drug for a disease associated with the AQ27 receptor.
On the other hand, a non-human mammal having the exogenous abnormal DNA of the present invention can be subcultured in a normal breeding environment as an animal having the DNA after confirming that the exogenous DNA is stably maintained by mating. Furthermore, the target foreign DNA can be incorporated into the above-mentioned plasmid and used as a raw material. The DNA construct with the promoter can be prepared by a usual DNA engineering technique. The transfer of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal. The presence of the abnormal DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA transfer means that all the offspring of the produced animal have the abnormal DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells. The progeny of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have the abnormal DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells. A homozygous animal having the introduced DNA on both homologous chromosomes is obtained, and by crossing these male and female animals, it is possible to breed so that all progeny have the DNA.

本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的にＡＱ２７受容体の機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物を用いて、ＡＱ２７受容体の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、ＡＱ２７受容体の機能不活性型不応症における本発明の異常ＡＱ２７受容体による正常ＡＱ２７受容体の機能阻害（dominant negative作用）を解明するモデルとなる。
また、本発明の外来異常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離したＡＱ２７受容体の増加症状を有することから、ＡＱ２７受容体またはの機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記２種類のＡＱ２７受容体ＤＮＡ転移動物のその他の利用可能性として、例えば、
１）組織培養のための細胞源としての使用、
２）ＡＱ２７受容体ＤＮＡ転移動物の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現されたＡＱ２７受容体組織を分析することによる、ＡＱ２７受容体により特異的に発現あるいは活性化するＡＱ２７受容体との関連性についての解析、
３）ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
４）上記３）記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
５）本発明の変異ＡＱ２７受容体を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
さらに、ＡＱ２７受容体ＤＮＡ転移動物を用いて、ＡＱ２７受容体の機能不活性型不応症などを含む、ＡＱ２７受容体に関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、ＡＱ２７受容体に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、ＡＱ２７受容体ＤＮＡ転移動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどの蛋白質分解酵素により、遊離したＤＮＡ転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、ＡＱ２７受容体産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、ＡＱ２７受容体およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、ＡＱ２７受容体ＤＮＡ転移動物を用いて、ＡＱ２７受容体の機能不活性型不応症を含む、ＡＱ２７受容体に関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、ＡＱ２７受容体ＤＮＡ転移動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、ＡＱ２７受容体が関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。 The non-human mammal having the abnormal DNA of the present invention, in which the abnormal DNA of the present invention is highly expressed, inhibits the function of endogenous normal DNA, thereby ultimately inactivating the inactive form of the AQ27 receptor. It can be used as a disease model animal. For example, using the abnormal DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of AQ27 receptor function-inactive refractory disease and to examine a method for treating this disease.
Also, as a specific possibility, the abnormal DNA highly expressing animal of the present invention can be used to inhibit the function of the normal AQ27 receptor by the abnormal AQ27 receptor of the present invention (dominant negative) in the inactive type refractory disease of the AQ27 receptor. Action).
In addition, since the mammal into which the foreign abnormal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released AQ27 receptor, it can be used for a therapeutic drug screening test for AQ27 receptor or a functionally inactive refractory disease. is there.
In addition, other possible uses of the above two AQ27 receptor DNA transgenic animals include, for example,
1) use as a cell source for tissue culture;
2) AQ27 receptor specifically expressed or activated by AQ27 receptor by directly analyzing DNA or RNA in the tissue of AQ27 receptor DNA-transferred animal or analyzing AQ27 receptor tissue expressed by DNA Analysis of the association with the receptor,
3) culturing cells of DNA-bearing tissue by standard tissue culture techniques and using them to study the function of cells from tissues that are generally difficult to culture;
4) Screening of a drug that enhances the function of the cell by using the cell described in 3) above, and 5) Isolation and purification of the mutant AQ27 receptor of the present invention and production of an antibody thereof are conceivable.
Furthermore, the AQ27 receptor DNA-transferred animal can be used to examine clinical symptoms of AQ27 receptor-related diseases, including AQ27 receptor function-inactive refractory disease, etc. A more detailed pathological finding in each organ of the disease model can be obtained, which can contribute to the development of a new treatment method and further to the study and treatment of a secondary disease caused by the disease.
In addition, it is possible to take out each organ from an AQ27 receptor DNA-transferred animal, cut it into small pieces, and then use a proteolytic enzyme such as trypsin to obtain released DNA-transferred cells, culture them, or systematize the cultured cells. . Furthermore, the AQ27 receptor-producing cells can be identified, examined for their relationship with apoptosis, differentiation or proliferation, or their signal transduction mechanisms, and their abnormalities can be examined. It is an effective research material.
Further, in order to develop a therapeutic agent for a disease associated with AQ27 receptor, including a functionally inactive refractory type of AQ27 receptor, using an AQ27 receptor DNA-transferred animal, the above-described test method and quantification method, etc. Can be used to provide an effective and rapid method for screening for a therapeutic agent for the disease. Further, it is possible to examine and develop a DNA therapy for AQ27 receptor-related diseases using an AQ27 receptor DNA transgenic animal or the exogenous DNA expression vector of the present invention.

（９）ノックアウト動物
本発明は、ＡＱ２７受容体ＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞およびＡＱ２７受容体ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
〔１〕ＡＱ２７受容体ＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
〔２〕該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された第〔１〕項記載の胚幹細胞、
〔３〕ネオマイシン耐性である第〔１〕項記載の胚幹細胞、
〔４〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔１〕項記載の胚幹細胞、
〔５〕ゲッ歯動物がマウスである第〔４〕項記載の胚幹細胞、
〔６〕ＡＱ２７受容体ＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
〔７〕該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子がＡＱ２７受容体ＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる第〔６〕項記載の非ヒト哺乳動物、
〔８〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔６〕項記載の非ヒト哺乳動物、
〔９〕ゲッ歯動物がマウスである第〔８〕項記載の非ヒト哺乳動物、および
〔１０〕第〔７〕項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とするＡＱ２７受容体ＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
ＡＱ２７受容体ＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有するＡＱ２７受容体ＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしているＡＱ２７受容体の活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的にＡＱ２７受容体の発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
ＡＱ２７受容体ＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。 (9) Knockout animal The present invention provides a non-human mammal embryonic stem cell in which AQ27 receptor DNA is inactivated and a non-human mammal deficient in AQ27 receptor DNA expression.
That is, the present invention
[1] a non-human mammalian embryonic stem cell in which AQ27 receptor DNA has been inactivated,
[2] the embryonic stem cell according to [1], wherein the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, a β-galactosidase gene derived from Escherichia coli);
[3] the embryonic stem cell according to [1], which is neomycin-resistant;
[4] the embryonic stem cell according to [1], wherein the non-human mammal is a rodent;
[5] the embryonic stem cell of [4], wherein the rodent is a mouse;
[6] a non-human mammal deficient in AQ27 receptor DNA expression deficiency,
[7] The DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, a β-galactosidase gene derived from Escherichia coli), and the reporter gene can be expressed under the control of a promoter for AQ27 receptor DNA [6]. The non-human mammal according to the item,
[8] the non-human mammal according to [6], wherein the non-human mammal is a rodent;
[9] administering a test compound to the non-human mammal according to [8], wherein the rodent is a mouse, and [10] the animal according to [7], and detecting the expression of a reporter gene; And a method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the promoter activity of AQ27 receptor DNA.
A non-human mammal embryonic stem cell in which AQ27 receptor DNA has been inactivated refers to a DNA that is capable of suppressing the expression ability of DNA by artificially mutating the AQ27 receptor DNA of the non-human mammal, or By substantially losing the activity of the AQ27 receptor encoded by the DNA, the DNA substantially lacks the ability to express the AQ27 receptor (hereinafter, may be referred to as the knockout DNA of the present invention). Refers to human mammalian embryonic stem cells (hereinafter abbreviated as ES cells).
As the non-human mammal, the same one as described above is used.
Methods for artificially mutating the AQ27 receptor DNA can be performed, for example, by deleting a part or all of the DNA sequence and inserting or substituting another DNA by genetic engineering techniques. With these mutations, the knockout DNA of the present invention may be prepared, for example, by shifting the codon reading frame or disrupting the function of the promoter or exon.

ＡＱ２７受容体ＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、ＡＱ２７受容体ＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有するＡＱ２７受容体ＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、polyＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞についてＡＱ２７受容体ＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用したＡＱ２７受容体ＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
また、相同組換え法等によりＡＱ２７受容体ＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知 EvansとKaufmaの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ1マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ1）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ1マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３.５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。 Specific examples of non-human mammalian embryonic stem cells in which AQ27 receptor DNA has been inactivated (hereinafter abbreviated as AQ27 receptor DNA-inactivated ES cells or knockout ES cells of the present invention) include, for example, The AQ27 receptor DNA of a non-human mammal is isolated and its exon portion is a drug resistance gene typified by a neomycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, or lacZ (β-galactosidase gene), cat (chloramphenicol acetyl). Transferrase gene) or a reporter gene or the like as a representative to destroy the function of the exon, or insert a DNA sequence that terminates the transcription of the gene into an intron between the exons (eg, a polyA addition signal, etc.) Synthesis of complete messenger RNA As a result, a DNA strand having a DNA sequence constructed so as to eventually destroy the gene (hereinafter abbreviated as a targeting vector) was introduced into the chromosome of the animal by, for example, homologous recombination, and the resultant was obtained. For ES cells, a DNA sequence on or near the AQ27 receptor DNA as a probe was used as a probe for Southern hybridization analysis or a DNA sequence on a targeting vector and a DNA sequence in a neighboring region other than the AQ27 receptor DNA used for the preparation of the targeting vector. The knockout ES cells of the present invention can be obtained by analyzing by the PCR method described above.
As the original ES cells for inactivating the AQ27 receptor DNA by the homologous recombination method or the like, for example, those already established as described above may be used, or according to the known Evans and Kaufma method. It may be a newly established one. For example, in the case of mouse ES cells, currently, 129 ES cells are generally used, but since the immunological background is not clear, an alternative pure immunological and genetic background is used. for example the purpose of acquiring the obvious ES cells, the BDF 1 mice (C57BL / 6 and DBA / 2 for the egg collection number of lack of C57BL / 6 mice and C57BL / 6 were improved by crossing with DBA / 2 Those established using F 1 ) can also be used favorably. BDF 1 mice are often egg number, and, in addition to the advantage that the egg is tough, since with C57BL / 6 mice in the background, when the ES cells obtained therefrom, which were generated pathological model mice , C57BL / 6 mice can be advantageously used in that their genetic background can be replaced with C57BL / 6 mice by backcrossing.
In addition, when ES cells are established, blastocysts 3.5 days after fertilization are generally used. However, a large number of blastocysts can be efficiently obtained by collecting embryos at the 8-cell stage and culturing them up to blastocysts. Early embryos can be obtained.
Although either male or female ES cells may be used, male ES cells are generally more convenient for producing a germline chimera. It is also desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce cumbersome culture labor.

ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０6個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１〜１００００U/ml）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０.００１〜０.５％トリプシン／０.１〜５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０.１％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１〜３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M. J. Evans及びM. H. Kaufman, ネイチャー（Nature）第292巻、154頁、1981年；G. R. Martin プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）第78巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschman ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られるＡＱ２７受容体ＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおけるＡＱ２７受容体またはＡＱ２７受容体の細胞生物学的検討において有用である。 As a method for determining the sex of ES cells, for example, a method of amplifying and detecting a gene in a sex-determining region on the Y chromosome by a PCR method can be mentioned. By using this method, the number of ES cells of about 1 colony (about 50 cells) is sufficient, whereas the conventional method required about 10 6 cells for karyotype analysis. The primary selection of ES cells in the early stage can be performed by discriminating between male and female, and the early stage of culture can be greatly reduced by enabling the selection of male cells at an early stage.
The secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-banding method. The number of chromosomes in the obtained ES cells is desirably 100% of the normal number. However, when it is difficult due to physical operations at the time of establishment, after knocking out the gene of the ES cells, the cells are knocked out of normal cells (for example, chromosomes in mice). It is desirable to clone again into cells (number 2n = 40).
The embryonic stem cell line obtained in this manner usually has very good growth properties, but it must be carefully subcultured because it tends to lose its ontogenic ability. For example, on a suitable feeder cell such as STO fibroblast, in the presence of LIF (1 to 10,000 U / ml) in a carbon dioxide incubator (preferably 5% carbon dioxide, 95% air or 5% oxygen, 5% The cells are cultured by a method such as culturing at about 37 ° C. in carbon dioxide gas and 90% air. At the time of subculture, for example, trypsin / EDTA solution (usually 0.001 to 0.5% trypsin / 0.1 to 5 mM EDTA, Preferably, a method is used in which cells are made into single cells by treatment with about 0.1% trypsin / 1 mM EDTA and seeded on newly prepared feeder cells. Such subculture is usually performed every 1 to 3 days. At this time, it is desirable to observe the cells and, if any morphologically abnormal cells are found, discard the cultured cells.
ES cells are differentiated into various types of cells, such as parietal muscle, visceral muscle, and cardiac muscle, by monolayer culture up to high density or suspension culture until cell clumps are formed under appropriate conditions. [MJ Evans and MH Kaufman, Nature 292, 154, 1981; GR Martin Proceedings of National Academy of Sciences USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 78, 7634, 1981; TC Doetschman et al., Journal of Embryology and Experimental Morphology, 87, 27, 1985]. AQ27 receptor DNA-deficient cells obtained by differentiating are useful in in vitro AQ27 receptor or AQ27 receptor cell biology studies.

ＡＱ２７受容体ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
ＡＱ２７受容体ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターのＡＱ２７受容体ＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上のＡＱ２７受容体ＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、ＡＱ２７受容体ＤＮＡをノックアウトさせることができる。
ＡＱ２７受容体ＤＮＡがノックアウトされた細胞は、ＡＱ２７受容体ＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来のＡＱ２７受容体ＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、ＡＱ２７受容体ＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常なＡＱ２７受容体ＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異したＡＱ２７受容体ＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異したＡＱ２７受容体ＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えたＡＱ２７受容体ＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、ＡＱ２７受容体のヘテロ発現不全個体であり、ＡＱ２７受容体のヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔からＡＱ２７受容体のホモ発現不全個体を得ることができる。 A non-human mammal deficient in AQ27 receptor DNA expression can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA level of the animal using a known method and indirectly comparing the expression level.
As the non-human mammal, those similar to the aforementioned can be used.
The non-human mammal deficient in AQ27 receptor DNA expression is, for example, a DNA in which the targeting vector prepared as described above is introduced into mouse embryonic stem cells or mouse egg cells, and the AQ27 receptor DNA of the targeting vector is inactivated by the introduction. The AQ27 receptor DNA can be knocked out by homologous recombination in which the sequence replaces the AQ27 receptor DNA on the chromosome of mouse embryonic stem cells or mouse egg cells by gene homologous recombination.
Cells in which the AQ27 receptor DNA was knocked out were analyzed by Southern hybridization analysis using a DNA sequence on or near the AQ27 receptor DNA as a probe, and a mouse-derived AQ27 receptor used in the targeting vector. It can be determined by analysis by a PCR method using a DNA sequence of a nearby region other than DNA as a primer. When non-human mammalian embryonic stem cells are used, a cell line in which the AQ27 receptor DNA has been inactivated by gene homologous recombination is cloned, and the cells are cultured at an appropriate time, for example, at the 8-cell stage of non-human mammals. The chimeric embryo is injected into an animal embryo or a blastocyst, and the produced chimeric embryo is transplanted into the uterus of the pseudopregnant non-human mammal. The produced animal is a chimeric animal composed of both cells having a normal AQ27 receptor DNA locus and cells having an artificially mutated AQ27 receptor DNA locus.
When a part of the germ cells of the chimeric animal has a mutated AQ27 receptor DNA locus, all tissues are artificially mutated from a population obtained by crossing such a chimeric individual with a normal individual. It can be obtained by selecting individuals composed of cells having the added AQ27 receptor DNA locus, for example, by judging coat color or the like. The individuals obtained in this manner are usually individuals with heterozygous expression of AQ27 receptor heterozygous, crossed with individuals with heterozygous expression of AQ27 receptor, and homozygous individuals with heterozygous expression of AQ27 receptor from their offspring. Obtainable.

卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えによりＡＱ２７受容体ＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにしてＡＱ２７受容体ＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
ＡＱ２７受容体ＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、ＡＱ２７受容体ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、ＡＱ２７受容体ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、ＡＱ２７受容体により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、ＡＱ２７受容体の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。 When an egg cell is used, for example, a transgenic non-human mammal having a targeting vector introduced into a chromosome can be obtained by injecting a DNA solution into a nucleus of an egg by a microinjection method, and these transgenic non-human mammals can be obtained. Compared to mammals, they can be obtained by selecting those having a mutation in the AQ27 receptor DNA locus by homologous recombination of the gene.
In the individual in which the AQ27 receptor DNA is knocked out in this way, the animal individual obtained by mating can confirm that the DNA has been knocked out, and can carry out rearing subculture in a normal rearing environment.
Furthermore, the germline can be obtained and maintained in accordance with a conventional method. That is, by crossing male and female animals having the inactivated DNA, a homozygous animal having the inactivated DNA on both homologous chromosomes can be obtained. The obtained homozygous animal can be efficiently obtained by breeding the mother animal in such a manner that there are one normal animal and one homozygote. By mating male and female heterozygous animals, homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and subcultured.
The non-human mammalian embryonic stem cells in which the AQ27 receptor DNA has been inactivated are very useful for producing a non-human mammal deficient in AQ27 receptor DNA expression.
In addition, since a non-human mammal deficient in AQ27 receptor DNA expression lacks various biological activities that can be induced by the AQ27 receptor, it can serve as a model for a disease caused by inactivation of the biological activity of the AQ27 receptor. Therefore, it is useful for investigating the causes of these diseases and examining treatment methods.

（９ａ）ＡＱ２７受容体ＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法
ＡＱ２７受容体ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、ＡＱ２７受容体ＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、ＡＱ２７受容体ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、ＡＱ２７受容体ＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられるＡＱ２７受容体ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
試験化合物および試験化合物が形成してもよい塩としては、前記と同様のものが用いられる。
具体的には、ＡＱ２７受容体ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択す
ることができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。 (9a) Method of screening for a compound or a salt thereof that has a therapeutic / preventive effect against diseases caused by AQ27 receptor DNA deficiency or damage, etc. AQ27 receptor DNA-deficient non-human mammals are deficient in AQ27 receptor DNA It can be used for screening for a compound or a salt thereof that has a therapeutic / preventive effect on diseases caused by damage or damage.
That is, the present invention is characterized by administering a test compound to a non-human mammal deficient in AQ27 receptor DNA expression, observing and measuring changes in the animal, and resulting from deficiency or damage of AQ27 receptor DNA. It is intended to provide a method for screening a compound having a therapeutic / preventive effect against a disease or a salt thereof or a salt thereof.
Examples of the non-human mammal deficient in AQ27 receptor DNA expression used in the screening method include those described above.
As the test compound and the salt which the test compound may form, the same as described above are used.
Specifically, a non-human mammal deficient in AQ27 receptor DNA expression is treated with a test compound, compared with an untreated control animal, and tested using changes in organs, tissues, disease symptoms, etc. of the animal as indices. Compounds can be tested for their therapeutic and prophylactic effects.
As a method of treating a test animal with a test compound, for example, oral administration, intravenous injection and the like are used, and it can be appropriately selected according to the symptoms of the test animal, the properties of the test compound, and the like. The dose of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, the properties of the test compound, and the like.

該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、該試験動物の機能（例えば、副腎皮質ホルモン分泌促進活性）が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上上昇した場合、該試験化合物を上記の疾患に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物またはその塩であり、副腎皮質ホルモン分泌調節剤、好ましくは副腎皮質ホルモン分泌促進剤として有用である。さらに、該スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、例えば、低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛み、肥満などの予防・治療剤として有用である。
また、該スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、安全で低毒性な男性ホルモン分泌調節剤、好ましくは男性ホルモン分泌促進剤として有用である。さらに、該スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、例えば、男性性腺機能不全、造精機能障害に伴う男子不妊症、再生不良性貧血、骨髄線維症、腎性貧血、末期女性性器癌の疼痛緩和、乳癌（例、手術不能乳癌）、乳腺症、乳腺腫瘍、女性化乳房などの予防・治療剤として有用である。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記したＡＱ２７受容体とリガンドとの結合性を変化させる化合物を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、該化合物またはその塩を経口投与する場合、一般的に成人患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物またはその塩を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物またはその塩の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、該化合物を注射剤の形で通常、成人患者（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。 In the screening method, when a test compound is administered to a test animal, the function of the test animal (eg, activity of promoting secretion of corticosteroids) is about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more. When it increases, the test compound can be selected as a compound having a therapeutic / preventive effect on the above-mentioned diseases or a salt thereof.
The compound or a salt thereof obtained by the screening method is a compound selected from the above-mentioned test compounds or a salt thereof, and is useful as a corticosteroid secretion regulator, preferably a corticosteroid secretagogue. Further, a compound or a salt thereof obtained by using the screening method may be used, for example, to prevent hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain, obesity, etc. -Useful as a therapeutic agent.
Further, the compound or a salt thereof obtained by using the screening method is useful as a safe and low toxic androgen secretion regulator, preferably a androgen secretagogue. Further, compounds or salts thereof obtained by using the screening method include, for example, male gonad dysfunction, male infertility associated with imperfect dysgenesis, aplastic anemia, myelofibrosis, renal anemia, terminal female genital cancer It is useful as an agent for pain relief, breast cancer (eg, inoperable breast cancer), mastopathy, breast tumor, gynecomastia, and the like.
Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used in the same manner.
As a salt of the compound obtained by the screening method, a salt with a physiologically acceptable acid (eg, an inorganic acid, an organic acid, etc.) or a base (eg, an alkali metal, etc.) is used. Are preferred. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, For example, salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like are used.
A drug containing a compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as a drug containing a compound that alters the binding between the AQ27 receptor and a ligand.
Since the preparation thus obtained is safe and low toxic, it can be used, for example, in humans or mammals (eg, rat, mouse, guinea pig, rabbit, sheep, pig, cow, horse, cat, dog, monkey, etc.). Can be administered.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the subject of administration, the administration route, and the like. For example, when the compound or a salt thereof is orally administered, generally in an adult patient (with a body weight of 60 kg), About 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg of the compound or a salt thereof per day. When administered parenterally, the single dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target disease, and the like. For example, the compound is usually in the form of an injection and usually is administered to an adult patient (with a body weight of 60 kg). When administered to a subject, it is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound by intravenous injection per day. . In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.

（９ｂ）ＡＱ２７受容体ＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニング方法
本発明は、ＡＱ２７受容体ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とするＡＱ２７受容体ＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、ＡＱ２７受容体ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記したＡＱ２７受容体ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、ＡＱ２７受容体ＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子がＡＱ２７受容体ＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物および試験化合物が形成してもよい塩としては、前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
ＡＱ２７受容体ＤＮＡをレポーター遺伝子で置換されたＡＱ２７受容体ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子がＡＱ２７受容体ＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、ＡＱ２７受容体をコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、ＡＱ２７受容体の発現する組織で、ＡＱ２７受容体の代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便にＡＱ２７受容体の動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、ＡＱ２７受容体欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。 (9b) Method of screening for compound or salt thereof that promotes or inhibits the activity of a promoter for AQ27 receptor DNA The present invention provides a method for administering a test compound to a non-human mammal deficient in AQ27 receptor DNA expression, and increasing the expression of a reporter gene. Provided is a method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of a promoter for AQ27 receptor DNA, which is characterized by detecting the compound.
In the above screening method, the non-human mammal deficient in AQ27 receptor DNA expression, among the non-human mammals deficient in AQ27 receptor DNA expression described above, is inactivated by introducing a reporter gene into the AQ27 receptor DNA, A reporter gene that can be expressed under the control of a promoter for AQ27 receptor DNA is used.
Examples of the test compound and salts which the test compound may form include the same as described above.
As the reporter gene, the same one as described above is used, and a β-galactosidase gene (lacZ), a soluble alkaline phosphatase gene, a luciferase gene and the like are preferable.
In a non-human mammal deficient in AQ27 receptor DNA expression in which AQ27 receptor DNA has been replaced with a reporter gene, expression of a substance encoded by the reporter gene is traced because the reporter gene is under the control of a promoter for AQ27 receptor DNA. By doing so, the activity of the promoter can be detected.
For example, when a part of the DNA region encoding the AQ27 receptor is replaced with a β-galactosidase gene (lacZ) derived from Escherichia coli, originally in a tissue expressing the AQ27 receptor, β-galactosidase is expressed in place of the AQ27 receptor. Galactosidase is expressed. Therefore, for example, by staining with a reagent serving as a substrate for β-galactosidase such as 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-galactopyranoside (X-gal), AQ27 receptor can be easily obtained. The expression state of the body in the animal body can be observed. Specifically, an AQ27 receptor-deficient mouse or a tissue section thereof is fixed with glutaraldehyde or the like, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-gal at room temperature or around 37 ° C. After reacting for about 30 minutes to 1 hour, the β-galactosidase reaction may be stopped by washing the tissue specimen with a 1 mM EDTA / PBS solution, and coloration may be observed. Further, mRNA encoding lacZ may be detected according to a conventional method.

上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物またはその塩であり、ＡＱ２７受容体ＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩である。
該スクリーニング方法で得られた化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
ＡＱ２７受容体ＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩は、安全で低毒性な副腎皮質ホルモン分泌調節剤として有用である。
ＡＱ２７受容体ＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、ＡＱ２７受容体の発現を促進し、ＡＱ２７受容体の機能を促進することができるので、例えば、副腎皮質ホルモン分泌調節剤、好ましくは副腎皮質ホルモン分泌促進剤として有用である。さらに、ＡＱ２７受容体ＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、例えば、低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛み、肥満などの予防・治療剤として有用である。
さらに、ＡＱ２７受容体ＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、安全で低毒性な男性ホルモン分泌調節剤、好ましくは男性ホルモン分泌促進剤として有用である。さらに、ＡＱ２７受容体ＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、例えば、男性性腺機能不全、造精機能障害に伴う男子不妊症、再生不良性貧血、骨髄線維症、腎性貧血、末期女性性器癌の疼痛緩和、乳癌（例、手術不能乳癌）、乳腺症、乳腺腫瘍、女性化乳房などの予防・治療剤として有用である。
一方、ＡＱ２７受容体ＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、ＡＱ２７受容体の発現を阻害し、ＡＱ２７受容体の機能を阻害することができるので、例えば、副腎皮質ホルモン分泌調節剤、好ましくは副腎皮質ホルモン分泌阻害剤（副腎皮質ホルモン分泌抑制剤）として有用である。さらに、ＡＱ２７受容体ＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、例えば、クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍、過敏性腸症候群などの予防・治療剤として有用である。
さらに、ＡＱ２７受容体ＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、安全で低毒性な男性ホルモン分泌調節剤、好ましくは男性ホルモン分泌阻害剤（男性ホルモン分泌抑制剤）として有用である。さらに、ＡＱ２７受容体ＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、例えば、陰茎肥大、精巣萎縮、精巣機能異常（例、精子減少）、月経異常、多毛、色素沈着、嗄声、過敏症、坐瘡、悪心、嘔吐、消化器系症状（例、食欲不振）、満月様顔貌などの予防・治療剤として有用である。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。 The compound or a salt thereof obtained by using the above-mentioned screening method is a compound or a salt thereof selected from the above-mentioned test compounds, and is a compound or a salt thereof which promotes or inhibits the promoter activity for AQ27 receptor DNA.
As a salt of the compound obtained by the screening method, a salt with a physiologically acceptable acid (eg, an inorganic acid or the like) or a base (eg, an organic acid or the like) is used, and particularly, a physiologically acceptable salt is used. Acid addition salts are preferred. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, For example, salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like are used.
A compound or a salt thereof that promotes or inhibits the promoter activity of AQ27 receptor DNA is useful as a safe and low-toxicity regulator of corticosteroid secretion.
A compound or a salt thereof that promotes the promoter activity for AQ27 receptor DNA can promote the expression of AQ27 receptor and promote the function of AQ27 receptor. It is useful as a corticosteroid secretagogue. Further, compounds or salts thereof that promote promoter activity for AQ27 receptor DNA include, for example, hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain, obesity, etc. Is useful as a prophylactic / therapeutic agent.
Further, a compound or a salt thereof that promotes the promoter activity for AQ27 receptor DNA is useful as a safe and low toxic androgen secretion regulator, preferably a androgen secretagogue. Furthermore, compounds or salts thereof that promote the promoter activity for AQ27 receptor DNA include, for example, male gonad dysfunction, male infertility associated with impaired spermatogenic function, aplastic anemia, myelofibrosis, renal anemia, end-stage female It is useful as an agent for relieving pain in genital cancer, breast cancer (eg, inoperable breast cancer), mastopathy, breast tumor, gynecomastia, and the like.
On the other hand, compounds or salts thereof that inhibit the promoter activity of AQ27 receptor DNA can inhibit the expression of AQ27 receptor and inhibit the function of AQ27 receptor. Is useful as a corticosteroid secretion inhibitor (corticosteroid secretion inhibitor). Furthermore, compounds or salts thereof that inhibit the promoter activity for AQ27 receptor DNA include, for example, Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for sickness, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, gastric / duodenal ulcer, irritable bowel syndrome, and the like.
Further, the compound or a salt thereof that inhibits the promoter activity for AQ27 receptor DNA is useful as a safe and low toxic androgen secretion regulator, preferably a androgen secretion inhibitor (androgen secretion inhibitor). Furthermore, compounds or salts thereof that inhibit promoter activity against AQ27 receptor DNA include, for example, penile enlargement, testicular atrophy, testicular dysfunction (eg, sperm loss), menstrual abnormalities, hirsutism, pigmentation, hoarseness, irritability, It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for acne, nausea, vomiting, gastrointestinal symptoms (eg, anorexia), full moon-like face, etc.
Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used in the same manner.

該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記したＡＱ２７受容体またはその塩とリガンドとの結合性を変化させる化合物を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、ＡＱ２７受容体ＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩を経口投与する場合、一般的に成人患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物またはその塩の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、ＡＱ２７受容体ＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩を注射剤の形で通常、成人患者（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物またはその塩を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
このように、ＡＱ２７受容体ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、ＡＱ２７受容体ＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、ＡＱ２７受容体ＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療薬の開発に大きく貢献することができる。
また、ＡＱ２７受容体のプロモーター領域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々の蛋白質をコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入動物）を作成すれば、特異的にそのＡＱ２７受容体を合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、ＡＱ２７受容体そのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。 A drug containing a compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as a drug containing a compound that alters the binding between the AQ27 receptor or a salt thereof and a ligand.
Since the preparation thus obtained is safe and low toxic, it can be used, for example, in humans or mammals (eg, rat, mouse, guinea pig, rabbit, sheep, pig, cow, horse, cat, dog, monkey, etc.). Can be administered.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like. For example, when a compound or a salt thereof that promotes a promoter activity for AQ27 receptor DNA is orally administered, it is generally used. For an adult patient (assuming a body weight of 60 kg), about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg of the compound is administered per day. When administered parenterally, the single dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target disease, and the like. For example, a compound or a salt thereof that promotes the promoter activity of AQ27 receptor DNA may be administered as an injection. Usually, when administered to an adult patient (with a body weight of 60 kg) in the form of about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 20 mg of the compound or a salt thereof per day. It is convenient to administer about 1 to 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
Thus, a non-human mammal deficient in AQ27 receptor DNA expression is extremely useful in screening for a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of a promoter for AQ27 receptor DNA, It can greatly contribute to investigating the cause of various diseases caused by the disease or to develop preventive and therapeutic drugs.
In addition, using a DNA containing the promoter region of the AQ27 receptor, genes encoding various proteins are ligated downstream thereof and injected into egg cells of an animal to produce a so-called transgenic animal (gene-transferred animal). Then, it becomes possible to specifically synthesize the AQ27 receptor and examine its action in a living body. Furthermore, by linking an appropriate reporter gene to the above promoter portion and establishing a cell line that expresses this, a low-molecular compound having an action of specifically promoting or suppressing the in vivo production ability of the AQ27 receptor itself can be obtained. Can be used as a search system.

本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ ：アデニン
Ｔ ：チミン
Ｇ ：グアニン
Ｃ ：シトシン
Ｉ ：イノシン
Ｒ ：アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ）
Ｙ ：チミン（Ｔ）またはシトシン（Ｃ）
Ｍ ：アデニン（Ａ）またはシトシン（Ｃ）
Ｋ ：グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）
Ｓ ：グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）
Ｗ ：アデニン（Ａ）またはチミン（Ｔ）
Ｂ ：グアニン（Ｇ）、グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）
Ｄ ：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）
Ｖ ：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）
Ｎ ：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）もしくはチミン（Ｔ）
または不明もしくは他の塩基
ＲＮＡ ：リボ核酸
ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＢＨＡ ：ベンズヒドリルアミン
ｐＭＢＨＡ ：ｐ−メチルベンズヒドリルアミン
Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル
Ｂｚｌ ：ベンジル
Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル
Ｂｏｃ ：ｔ−ブチルオキシカルボニル
ＤＣＭ ：ジクロロメタン
ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＤＣＣ ：Ｎ,Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＴＦＡ ：トリフルオロ酢酸
ＤＩＥＡ ：ジイソプロピルエチルアミン In the present specification and drawings, bases, amino acids, and the like are indicated by abbreviations based on the abbreviations by the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or commonly used abbreviations in the art, and examples thereof are described below. When an amino acid can have an optical isomer, the L-form is indicated unless otherwise specified.
DNA: deoxyribonucleic acid cDNA: complementary deoxyribonucleic acid A: adenine T: thymine G: guanine C: cytosine I: inosine R: adenine (A) or guanine (G)
Y: thymine (T) or cytosine (C)
M: adenine (A) or cytosine (C)
K: guanine (G) or thymine (T)
S: guanine (G) or cytosine (C)
W: adenine (A) or thymine (T)
B: guanine (G), guanine (G) or thymine (T)
D: adenine (A), guanine (G) or thymine (T)
V: adenine (A), guanine (G) or cytosine (C)
N: adenine (A), guanine (G), cytosine (C) or thymine (T)
Or unknown or other base RNA: ribonucleic acid mRNA: messenger ribonucleic acid dATP: deoxyadenosine triphosphate dTTP: deoxythymidine triphosphate dGTP: deoxyguanosine triphosphate dCTP: deoxycytidine triphosphate ATP: adenosine triphosphate EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid SDS: sodium dodecyl sulfate BHA: benzhydrylamine pMBHA: p-methylbenzhydrylamine Tos: p-toluenesulfonyl Bzl: benzyl Bom: benzyloxymethyl Boc: t-butyloxycarbonyl DCM: dichloromethane HOBt: 1- Hydroxybenztriazole DCC: N, N'-dicyclohexylcarbodiimide TFA: trifluoroacetic acid DIEA: diisopropylethylamine

Ｇｌｙ又はＧ ：グリシン
Ａｌａ又はＡ ：アラニン
Ｖａｌ又はＶ ：バリン
Ｌｅｕ又はＬ ：ロイシン
Ｉｌｅ又はＩ ：イソロイシン
Ｓｅｒ又はＳ ：セリン
Ｔｈｒ又はＴ ：スレオニン
Ｃｙｓ又はＣ ：システイン
Ｍｅｔ又はＭ ：メチオニン
Ｇｌｕ又はＥ ：グルタミン酸
Ａｓｐ又はＤ ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ又はＫ ：リジン
Ａｒｇ又はＲ ：アルギニン
Ｈｉｓ又はＨ ：ヒスチジン
Ｐｈｅ又はＦ ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ又はＹ ：チロシン
Ｔｒｐ又はＷ ：トリプトファン
Ｐｒｏ又はＰ ：プロリン
Ａｓｎ又はＮ ：アスパラギン
Ｇｌｎ又はＱ ：グルタミン
ｐＧｌｕ又はＰｙｒ：ピログルタミン酸
Ｔｙｒ（Ｉ） ：３−ヨードチロシン
ＤＭＦ ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
Ｔｒｔ ：トリチル
Ｐｂｆ ：2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-
スルホニル
Ｃｌｔ ：２−クロロトリチル
Ｂｕt ：ｔ−ブチル
Ｍｅｔ（Ｏ） ：メチオニンスルフォキシド Gly or G: Glycine Ala or A: Alanine Val or V: Valine Leu or L: Leucine Ile or I: Isoleucine Ser or S: Serine Thr or T: Threonine Cys or C: Cysteine Met or M: Methionine Glu or E: Glutamic acid Asp or D: Aspartic acid Lys or K: Lysine Arg or R: Arginine His or H: Histidine Phe or F: Phenylalanine Tyr or Y: Tyrosine Trp or W: Tryptophan Pro or P: Proline Asn or N: Asparagine Gln or Q: Glutamine pGlu or Pyr: pyroglutamic acid Tyr (I): 3-iodotyrosine DMF: N, N-dimethylformamide Fmoc: N-9-fluorenylmethoxycarbonyl Trt: trityl Pb : 2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5
Sulfonyl Clt: 2-chlorotrityl But: t -butyl Met (O): methionine sulfoxide

本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
ヒト型前駆体蛋白質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
ヒト型前駆体蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕
ラット型前駆体蛋白質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４〕
ラット型前駆体蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕
マウス型前駆体蛋白質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：６〕
マウス型前駆体蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：７〕
ウシ前駆体蛋白質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：８〕
ウシ前駆体蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：９〕
ヒトＡＱ２７受容体のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１０〕
ヒトＡＱ２７受容体をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１〕
ラットＡＱ２７受容体のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１２〕
ラットＡＱ２７受容体をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３〕
マウスＡＱ２７受容体のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１４〕
マウスＡＱ２７受容体をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１５〕
参考例１でヒト型前駆体蛋白質をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：１６〕
参考例１でヒト型前駆体蛋白質をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：１７〕
参考例２でラット型前駆体蛋白質をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：１８〕
参考例２でラット型前駆体蛋白質をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：１９〕
参考例５でマウス型前駆体蛋白質をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：２０〕
参考例５でマウス型前駆体蛋白質をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：２１〕
参考例１６でウシ型前駆体蛋白質をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：２２〕
参考例１６でウシ型前駆体蛋白質をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：２３〕
参考例１７でラットＡＱ２７をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：２４〕
参考例１７でラットＡＱ２７をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：２５〕
参考例１７でマウスＡＱ２７をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：２６〕
参考例１７でマウスＡＱ２７をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：２７〕
参考例１９で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２８〕
参考例１９で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２９〕
参考例１９で使用したプローブの塩基配列を示す。
〔配列番号：３０〕
参考例２０で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３１〕
参考例２０で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３２〕
参考例２０で使用したプローブの塩基配列を示す。
〔配列番号：３３〕
参考例２１で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３４〕
参考例２１で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３５〕
参考例２１で使用したプローブの塩基配列を示す。
〔配列番号：３６〕
参考例２１で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３７〕
参考例２１で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３８〕
参考例２１で使用したプローブの塩基配列を示す。 The sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
[SEQ ID NO: 1]
2 shows the amino acid sequence of the human precursor protein.
[SEQ ID NO: 2]
1 shows the nucleotide sequence of DNA encoding the human precursor protein.
[SEQ ID NO: 3]
1 shows the amino acid sequence of rat precursor protein.
[SEQ ID NO: 4]
1 shows the nucleotide sequence of a DNA encoding a rat precursor protein.
[SEQ ID NO: 5]
2 shows the amino acid sequence of a mouse precursor protein.
[SEQ ID NO: 6]
1 shows the nucleotide sequence of a DNA encoding a mouse precursor protein.
[SEQ ID NO: 7]
2 shows the amino acid sequence of bovine precursor protein.
[SEQ ID NO: 8]
1 shows the nucleotide sequence of DNA encoding bovine precursor protein.
[SEQ ID NO: 9]
2 shows the amino acid sequence of the human AQ27 receptor.
[SEQ ID NO: 10]
2 shows the nucleotide sequence of DNA encoding the human AQ27 receptor.
[SEQ ID NO: 11]
2 shows the amino acid sequence of rat AQ27 receptor.
[SEQ ID NO: 12]
2 shows the nucleotide sequence of DNA encoding rat AQ27 receptor.
[SEQ ID NO: 13]
2 shows the amino acid sequence of mouse AQ27 receptor.
[SEQ ID NO: 14]
1 shows the nucleotide sequence of DNA encoding mouse AQ27 receptor.
[SEQ ID NO: 15]
The synthetic DNA used in the screening of cDNA encoding the human precursor protein in Reference Example 1 is shown.
[SEQ ID NO: 16]
The synthetic DNA used in the screening of cDNA encoding the human precursor protein in Reference Example 1 is shown.
[SEQ ID NO: 17]
The synthetic DNA used for screening the cDNA encoding the rat precursor protein in Reference Example 2 is shown.
[SEQ ID NO: 18]
The synthetic DNA used for screening the cDNA encoding the rat precursor protein in Reference Example 2 is shown.
[SEQ ID NO: 19]
The synthetic DNA used for screening the cDNA encoding the mouse precursor protein in Reference Example 5 is shown.
[SEQ ID NO: 20]
The synthetic DNA used for screening the cDNA encoding the mouse precursor protein in Reference Example 5 is shown.
[SEQ ID NO: 21]
The synthetic DNA used for screening the cDNA encoding the bovine precursor protein in Reference Example 16 is shown.
[SEQ ID NO: 22]
The synthetic DNA used for screening the cDNA encoding the bovine precursor protein in Reference Example 16 is shown.
[SEQ ID NO: 23]
The synthetic DNA used in the screening of cDNA encoding rat AQ27 in Reference Example 17 is shown.
[SEQ ID NO: 24]
The synthetic DNA used in the screening of cDNA encoding rat AQ27 in Reference Example 17 is shown.
[SEQ ID NO: 25]
The synthetic DNA used for screening the cDNA encoding mouse AQ27 in Reference Example 17 is shown.
[SEQ ID NO: 26]
The synthetic DNA used for screening the cDNA encoding mouse AQ27 in Reference Example 17 is shown.
[SEQ ID NO: 27]
19 shows the nucleotide sequence of a primer used in Reference Example 19.
[SEQ ID NO: 28]
19 shows the nucleotide sequence of a primer used in Reference Example 19.
[SEQ ID NO: 29]
19 shows the nucleotide sequence of a probe used in Reference Example 19.
[SEQ ID NO: 30]
The base sequence of the primer used in Reference Example 20 is shown.
[SEQ ID NO: 31]
The base sequence of the primer used in Reference Example 20 is shown.
[SEQ ID NO: 32]
19 shows the base sequence of a probe used in Reference Example 20.
[SEQ ID NO: 33]
The base sequence of the primer used in Reference Example 21 is shown.
[SEQ ID NO: 34]
The base sequence of the primer used in Reference Example 21 is shown.
[SEQ ID NO: 35]
26 shows the base sequence of a probe used in Reference Example 21.
[SEQ ID NO: 36]
The base sequence of the primer used in Reference Example 21 is shown.
[SEQ ID NO: 37]
The base sequence of the primer used in Reference Example 21 is shown.
[SEQ ID NO: 38]
26 shows the base sequence of a probe used in Reference Example 21.

後述の参考例１で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＡｈＦＲＦ−１は、２００２年２月１８日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９０３として、２００２年２月６日から大阪府大阪市淀川区十三本町２−１７−８５（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６７５２として寄託されている。
後述の参考例２で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＡｒＦＲＦ−１は、２００２年２月１８日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９０５として、２００２年２月６日から大阪府大阪市淀川区十三本町２−１７−８５（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６７５４として寄託されている。
後述の参考例５で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＡｍＦＲＦ−１は、２００２年２月１８日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９０４として、２００２年２月６日から大阪府大阪市淀川区十三本町２−１７−８５（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６７５３として寄託されている。
後述の参考例１６で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＡｂＦＲＦ−１は、２００２年８月２１日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１６２として寄託されている。
後述の参考例１７で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＣＲ２．１−ｒａｔＡＱ２７は、２００２年８月２１日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１６３として寄託されている。
後述の参考例１８で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＣＲ２．１−ｍｏｕｓｅＡＱ２７は、２００２年８月２１日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１６４として寄託されている。 The transformant Escherichia coli JM109 / pTAhFRF-1 obtained in Reference Example 1 to be described later has been administered on February 18, 2002 at 1-1, Higashi 1-1, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Chuo No. 6 (Zip code 305-8566). Incorporated by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the deposit number FERM BP-7903 at the Patent Organism Depositary Center from February 6, 2002, 2-17-85, Jusanhoncho, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Osaka (postal code 532-8686). -Deposited with the Fermentation Research Institute (IFO) under the deposit number IFO 16752.
The transformant Escherichia coli JM109 / pTArFRF-1 obtained in Reference Example 2 to be described later has been an independent administrative agency of 1-1, Higashi 1-1, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture since February 18, 2002 (zip code 305-8566). Incorporated by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the deposit number FERM BP-7905 at the Patent Organism Depositary Center, 2-17-85, Jusanhoncho, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Osaka from February 6, 2002 (zip code 532-8686). -Deposited with the Fermentation Research Institute (IFO) under the deposit number IFO 16754.
The transformant Escherichia coli JM109 / pTAmFRF-1 obtained in Reference Example 5 to be described later has been administered from February 18, 2002 at 1-1, Higashi 1-1, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Chuo No. 6 (Zip code 305-8566). Incorporated by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the deposit number FERM BP-7904 at the Patent Organism Depositary Center, 2-17-85, Jusanhoncho, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Osaka from February 6, 2002 (zip code 532-8686). -Deposited with the Fermentation Research Institute (IFO) under the deposit number IFO 16753.
The transformant Escherichia coli JM109 / pTAbFRF-1 obtained in Reference Example 16 to be described later has been administered from August 21, 2002, at 1-1, Higashi 1-1, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Chuo No. 6 (Zip code 305-8566). Deposited at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the deposit number FERM BP-8162.
The transformant Escherichia coli JM109 / pCR2.1-ratAQ27 obtained in Reference Example 17 described below was obtained from August 1, 2002, at 1-1, Higashi 1-1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki Prefecture, Chuo No. 6 (Zip code 305-8566). Deposited at the Patent Organism Depositary, the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the deposit number FERM BP-8163.
The transformant Escherichia coli JM109 / pCR2.1-mouseAQ27 obtained in Reference Example 18 described below was obtained from August 1, 2002 at 1-1, Higashi 1-1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki Prefecture, Chuo No. 6 (zip code 305-8566). Deposited at the Patent Organism Depositary, the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the deposit number FERM BP-8164.

以下に参考例および実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
参考例１ ヒトｃＤＮＡからのＰＣＲ法による新規分泌蛋白質遺伝子の取得
クローンテック社より購入したＨｕｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｃＤＮＡを鋳型として、以下の２種類の合成ＤＮＡを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。
RFF2 5'-ATGGTAAGGCCTTACCCCCTGATCTAC-3' （配列番号：１５）
RFR1 5'-CAAATCCTTCCAAGGCGTCCTGGCCCT-3' （配列番号：１６）
ＰＣＲの反応液はｃＤＮＡ溶液１ｍｉｃｒｏｌ、０．５ｍｉｃｒｏｌ ＲＦＦ２（１０ｍｉｃｒｏＭ）、０．５ｍｉｃｒｏｌ ＲＦＲ１（１０ｍｉｃｒｏＭ）、２．５ｍｉｃｒｏｌ添付の１０ｘ反応液、２．５ｍｉｃｒｏｌ ｄＮＴＰ（１０ ｍＭ）、０．２５ｍｉｃｒｏｌ ＥｘＴａｑ（タカラ）、１７．７５ｍｉｃｒｏｌ大塚蒸留水を加えて合計２５ｍｉｃｒｏｌにした。反応液を、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ９６００を用いてＰＣＲ反応にかけた。ＰＣＲの条件は９５℃・２分の変性の後、９８℃・１０秒、６０℃・２０秒、７２℃・３０秒のサイクルを４０回繰り返した。ＰＣＲ産物の一部を用いて電気泳動で約４００ｂｐのＰＣＲ産物の増幅を確認した後、ＰＣＲ産物をＱｕｉａｇｅｎ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製し、直接配列決定を行ったところ図１で示す配列がえられた。図１のＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列は図１２に示すものであった。また、図２のアミノ酸配列の１から１８番目のアミノ酸配列は分泌シグナルと予想された。
さらに、生成するペプチドとして、
（１）Ｃ末端がアミド化された、図２（配列番号：１）に示されたアミノ酸配列の第２６番目〜８８番目のアミノ酸配列を含有するペプチド、
（２）Ｃ末端がアミド化された、図２（配列番号：１）に示されたアミノ酸配列の第８０番目〜８８番目のアミノ酸配列を含有するペプチド、
（３）Ｃ末端がアミド化された、図２（配列番号：１）に示されたアミノ酸配列の第９１番目〜１３３番目のアミノ酸配列を含有するペプチド、
（４）Ｃ末端がアミド化された、図２（配列番号：１）に示されたアミノ酸配列の第１２７番目〜１３３番目のアミノ酸配列を含有するペプチドなどが考えられる。
次に、ゲルから回収したＰＣＲ産物をＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて大腸菌ＪＭ１０９にサブクローニングし、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴＡｈＦＲＦ−１を取得した。サブクローニングで得られた大腸菌からプラスミドｐＴＡｈＦＲＦ−１をプラスミド抽出機（クラボウ社）を用いて抽出し、挿入断片の塩基配列を決定し、その配列が図１１と同じヒト型分泌蛋白質遺伝子ｃＤＮＡであることを確認した。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Reference Examples and Examples, but these examples do not limit the scope of the present invention.
Reference Example 1 Acquisition of a New Secreted Protein Gene from Human cDNA by PCR Using Human Universal cDNA purchased from Clonetech as a template, amplification was performed by PCR using the following two types of synthetic DNA.
RFF2 5'-ATGGTAAGGCCTTACCCCCTGATCTAC-3 '(SEQ ID NO: 15)
RFR1 5'-CAAATCCTTCCAAGGCGTCCTGGCCCT-3 '(SEQ ID NO: 16)
The reaction solution for PCR was 1 micron of cDNA solution, 0.5 micron RFF2 (10 microM), 0.5 micron RFR1 (10 microM), a 10x reaction solution attached to 2.5 micron, 2.5 micron dNTP (10 mM), 0.25 micron ExTaq (Takara) , 17.75 microliter Otsuka distilled water was added to make a total of 25 microroll. The reaction solution was subjected to a PCR reaction using a Thermal Cycler 9600. As for the PCR conditions, a cycle of 98 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 20 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds was repeated 40 times after denaturation at 95 ° C. for 2 minutes. After confirming the amplification of a PCR product of about 400 bp by electrophoresis using a part of the PCR product, the PCR product was purified using a Quiagen PCR purification Kit and subjected to direct sequencing. As a result, the sequence shown in FIG. 1 was obtained. Was done. The amino acid sequence predicted from the DNA sequence of FIG. 1 is shown in FIG. In addition, the amino acid sequence at positions 1 to 18 in the amino acid sequence in FIG. 2 was predicted to be a secretory signal.
Furthermore, as a peptide to be produced,
(1) a peptide containing the amino acid sequence at positions 26 to 88 of the amino acid sequence shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 1), wherein the C-terminal is amidated;
(2) a peptide containing the amino acid sequence at positions 80 to 88 of the amino acid sequence shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 1), wherein the C-terminal is amidated;
(3) a peptide containing the 91st to 133rd amino acid sequence of the amino acid sequence shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 1), wherein the C-terminal is amidated;
(4) A peptide containing the 127th to 133rd amino acid sequence of the amino acid sequence shown in FIG.
Next, the PCR product recovered from the gel was subcloned into E. coli JM109 using a TA cloning kit (Invitrogen) to obtain E. coli JM109 / pTAhFRF-1. Plasmid pTAhFRF-1 was extracted from Escherichia coli obtained by subcloning using a plasmid extractor (Kurabo Co., Ltd.), and the nucleotide sequence of the inserted fragment was determined. It was confirmed.

参考例２ ラットゲノムＤＮＡからのＰＣＲ法によるリガンド候補遺伝子の取得
クローンテック社より購入したＲａｔ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡを鋳型として、以下の２種類の合成ＤＮＡを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。
F1 5'-CCTCCTCTCTCTCCCTCCTCTGCTCAG-3' （配列番号：１７）
R1 5'-ACGGGGCAGAGTCCACGCAGGCCCTCA-3' （配列番号：１８）
ＰＣＲの反応液はＤＮＡ溶液１ｍｉｃｒｏｌ、０．５ｍｉｃｒｏｌ Ｆ１（１０ｍｉｃｒｏＭ）、０．５ｍｉｃｒｏｌ Ｒ１（１０ｍｉｃｒｏＭ）、２．５ｍｉｃｒｏｌ添付の１０ｘ反応液、２．５ｍｉｃｒｏｌ ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、０．２５ｍｉｃｒｏｌ ＥｘＴａｑ（タカラ）、１７．７５ｍｉｃｒｏｌ大塚蒸留水を加えて合計２５ｍｉｃｒｏｌにした。反応液を、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ９６００を用いてＰＣＲ反応にかけた。ＰＣＲの条件は９５℃・２分の変性の後、９８℃・１０秒、６０℃・２０秒、７２℃・３０秒のサイクルを３０回繰り返した。ＰＣＲ産物の一部を用いて電気泳動で約４００ｂｐのＰＣＲ産物の増幅を確認した後、ＰＣＲ産物をＱｕｉａｇｅｎ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製し、直接配列決定を行ったところ図３で示す配列がえられた。図３のＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列は図１４に示すものであった。また図４のアミノ酸配列の１から１７番目のアミノ酸配列は分泌シグナルと予想された。
またヒト型とラット型のアミノ酸配列を比較したところ図５のようになり、特にＣ末端のＲＦアミドモチーフの配列（Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｒｇ）が保存されていた。さらに、生成するペプチドとしてＣ末端がアミド化されたＧｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｐｈｅ−ＮＨ2（配列番号：２７の第１１６番目〜１２２番目）、Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｐｈｅ−ＮＨ2（配列番号：２７の第１１５番目〜１２２番目）等が予想された。
次に、ゲルから回収したＰＣＲ産物をＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて大腸菌ＪＭ１０９にサブクローニングし、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴＡｒＦＲＦ−１を取得した。サブクローニングで得られた大腸菌からプラスミドｐＴＡｒＦＲＦ−１をプラスミド抽出機（クラボウ社）を用いて抽出し、挿入断片の塩基配列を決定し、その配列が図３と同じラット型分泌蛋白質遺伝子ｃＤＮＡであることを確認した。 Reference Example 2 Acquisition of Ligand Candidate Genes from Rat Genomic DNA by PCR Using Rat Genomic DNA purchased from Clonetech as a template, amplification was performed by PCR using the following two types of synthetic DNA.
F1 5'-CCTCCTCTCTCTCCCTCCTCTGCTCAG-3 '(SEQ ID NO: 17)
R1 5'-ACGGGGCAGAGTCCACGCAGGCCCTCA-3 '(SEQ ID NO: 18)
The PCR reaction solution was a DNA solution of 1 micron, 0.5 micron F1 (10 microM), 0.5 micron R1 (10 microM), a 10 × reaction solution attached to 2.5 micron, 2.5 micron dNTP (10 mM), 0.25 micron ExTaq (Takara), 17.75 microliter Otsuka distilled water was added to make a total of 25 microroll. The reaction solution was subjected to a PCR reaction using a Thermal Cycler 9600. The PCR conditions were: denaturation at 95 ° C. for 2 minutes, and a cycle of 98 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 20 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds was repeated 30 times. After confirming the amplification of a PCR product of about 400 bp by electrophoresis using a part of the PCR product, the PCR product was purified using a Quiagen PCR purification Kit and sequenced directly, and the sequence shown in FIG. 3 was obtained. Was done. The amino acid sequence predicted from the DNA sequence of FIG. 3 is shown in FIG. In addition, the amino acid sequence at positions 1 to 17 in the amino acid sequence of FIG. 4 was predicted to be a secretory signal.
Comparison of the amino acid sequences of the human type and the rat type shows that the sequence is as shown in FIG. 5, and that the sequence of the C-terminal RF amide motif (Arg Phe Gly Arg) was particularly conserved. Furthermore, as a peptide to be produced, Gly Gly Phe Ser Phe Arg Phe-NH 2 (C-terminal amidated) (116th to 122nd positions of SEQ ID NO: 27), Lys Gly Gly Phe Ser Phe Arg Phe-NH 2 (sequence (The 115th to 122nd of No. 27) were expected.
Next, the PCR product recovered from the gel was subcloned into E. coli JM109 using a TA cloning kit (Invitrogen) to obtain E. coli JM109 / pTArFRF-1. The plasmid pTArFRF-1 was extracted from the E. coli obtained by subcloning using a plasmid extractor (Kurabo), the nucleotide sequence of the inserted fragment was determined, and the sequence was the rat-type secretory protein gene cDNA as shown in FIG. It was confirmed.

参考例３
（１） Gly-Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第１２７番目〜１３３番目）および Glu-His-Ala-Gly-Cys-Arg-Phe-Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第８０番目〜８８番目）の合成
Gly-Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第１２７番目〜１３３番目）および Glu-His-Ala-Gly-Cys-Arg-Phe-Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第８０番目〜８８番目）を自体公知のペプチド合成法を用いて製造した。
（２） Arg-Lys-Lys-Gly-Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第１２４番目〜１３３番目）の合成
Arg-Lys-Lys-Gly-Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第１２４番目〜１３３番目）を自体公知のペプチド合成法を用いて製造した。 Reference Example 3
(1) Gly-Gly-Phe -Ser-Phe-Arg-Phe-NH 2 ( SEQ ID NO: 1 of the 127-th to 133-th) and Glu-His-Ala-Gly- Cys-Arg-Phe-Arg-Phe -NH 2 (SEQ ID NO: # 80 th to 88 th 1) synthesis of
Gly-Gly-Phe-Ser- Phe-Arg-Phe-NH 2 ( SEQ ID NO: 127 th to 133 th 1) and Glu-His-Ala-Gly- Cys-Arg-Phe-Arg-Phe-NH 2 (The 80th to 88th positions of SEQ ID NO: 1) were produced using a peptide synthesis method known per se.
(2) Arg-Lys-Lys -Gly-Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH 2 ( SEQ ID NO: # 124 th to 133 th 1) Synthesis of
Arg-Lys-Lys-Gly- Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH 2 ( SEQ ID NO: # 124 th to 133 th 1) were prepared using known peptide synthesis method.

参考例４ 新規ヒト型ペプチド：Gly-Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第１２７番目〜１３３番目）および Glu-His-Ala-Gly-Cys-Arg-Phe-Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第８０番目〜８８番目）のＡＱ２７受容体およびＯＴ７Ｔ０２２受容体を一過性に発現させたＨＥＫ２９３細胞に対するレポーター遺伝子発現量の上昇活性
参考例３で合成した新規ヒト型ペプチドによるＡＱ２７受容体（配列番号：３１）およびヒトＯＴ７Ｔ０２２受容体（配列番号：３５）に特異的な刺激活性の検出は、ｃＡＭＰレスポンスエレメント（ＣＲＥ）プロモーターの発現誘導によって産生されるレポーター遺伝子産物（ルシフェラーゼ）の発現量を指標に行った。
ＨＥＫ２９３細胞を増殖培地（ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium）（GibcoBRL）に１０％ウシ胎児血清（GibcoBRL）を添加したもの）に懸濁し、１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度にてコラーゲンでコートされたＢｌａｃｋ ｗｅｌｌ ９６ウェルプレート（ベクトンディッキンソン社）にまいた。３７℃、５％ＣＯ2条件下で一晩培養した後、レポーター遺伝子を含むプラスミドであるｐＣＲＥ−Ｌｕｃ（Clontech）と同時に、公知の方法により動物細胞での発現用ベクターｐＡＫＫＯ−１１１Ｈ（Biochem. Biophys. Acta, Hinuma, S. et al., 1219, 251-259, 1994記載のｐＡＫＫＯ−１．１１Ｈと同一のプラスミドベクター）にＡＱ２７遺伝子（配列番号：３２）およびヒトＯＴ７Ｔ０２２遺伝子（配列番号：３６）を挿入して作製した発現ベクタープラスミド、または、ＡＱ２７遺伝子を含まないもとのｐＡＫＫＯ−１１１Ｈを用いて細胞のトランスフェクションを以下のとおりに行った。
ＯＰＴＩ−ＭＥＭ−Ｉ（GibcoBRL）とＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅTM ２０００ Ｒｅａｇｅｎｔ（GibcoBRL）を２４：１にて混合することにより、リポフェクトアミン希釈液を調製した。また、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ−Ｉ、ＡＱ２７発現ベクタープラスミドまたはもとのベクタープラスミド（２４０ｎｇ／μｌ）およびｐＣＲＥ−Ｌｕｃ（２４０ｎｇ／μｌ）を２４：０．９：０．１にて混合することによりＤＮＡ希釈液を調製した。リポフェクトアミン希釈液とＤＮＡ希釈液を等量混合し、２０分間室温で静置することによりＤＮＡとリポフェクトアミンの複合体を形成させた後、上記のＨＥＫ２９３細胞を培養したプレートに２５μｌ添加し、さらに３７℃、５％ＣＯ2条件下で一晩培養した。
トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞をアッセイ用培地（ＤＭＥＭに０．１％ウシ血清アルブミンを添加したもの）にて洗浄した後、アッセイ用培地にて希釈した参考例３で合成した新規ヒト型ペプチドを１０、１、０．１μＭとなるよう添加し、３７℃、５％ＣＯ2条件下で４時間培養した。培養上清を捨てて、ルシフェラーゼ活性測定用の基質であるピッカジーンＬＴ２．０（東洋インキ製造株式会社）を５０μｌ添加し、プレートリーダー（ＡＲＶＯ ｓｘマルチラベルカウンター、Wallac社）を用いてルシフェラーゼの発光量を測定した。
その結果、２種類の新規ヒト型ペプチドはいずれもＡＱ２７受容体に対しフォルスコリン（ＦＳＫ）添加で刺激したルシフェラーゼ活性を濃度依存的に増強する反応として検出された。一方、ヒトＯＴ７Ｔ０２２受容体に対してはＦＳＫ添加で刺激したルシフェラーゼ活性を抑制する反応として検出された。これらの反応は受容体を導入していない空のベクターｐＡＫＫＯ-111Ｈを発現させた細胞では検出されなかった。したがって、２種類の新規ヒト型ペプチドはＡＱ２７受容体特異的にルシフェラーゼ活性の増強を引き起こしたことが確認された（図６、図７）。 Reference Example 4 novel human type peptide: Gly-Gly-Phe-Ser -Phe-Arg-Phe-NH 2 ( SEQ ID NO: 127 th to 133 th 1) and Glu-His-Ala-Gly- Cys-Arg- Phe-Arg-Phe-NH 2 ( SEQ ID NO: 1 of the 80 th to 88 th) of the AQ27 receptors and OT7T022 increase reporter gene expression relative to HEK293 cells expressing receptor transiently active reference example 3 Of the stimulating activity specific to the AQ27 receptor (SEQ ID NO: 31) and the human OT7T022 receptor (SEQ ID NO: 35) by the novel human-type peptide synthesized by the induction of cAMP response element (CRE) promoter expression The expression level of the reporter gene product (luciferase) to be used was used as an index.
HEK293 cells are suspended in a growth medium (DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) (GibcoBRL) supplemented with 10% fetal bovine serum (GibcoBRL)), and a 96-well Black well coated with collagen at a concentration of 1 × 10 5 cells / well is used. Plated (Becton Dickinson). After culturing overnight at 37 ° C. and 5% CO 2 , the expression vector pAKKO-111H (Biochem. Biophys.) For expression in animal cells is obtained by a known method at the same time as pCRE-Luc (Clontech), a plasmid containing a reporter gene. AQ27 gene (SEQ ID NO: 32) and human OT7T022 gene (SEQ ID NO: 36) were added to pAKKO-1.11H described in Acta, Hinuma, S. et al., 1219, 251-259, 1994. Was transfected as follows using an expression vector plasmid prepared by insertion of, or pAKKO-111H not containing the AQ27 gene.
A lipofectamine dilution was prepared by mixing OPTI-MEM-I (GibcoBRL) and Lipofectamine ™ 2000 Reagent (GibcoBRL) at 24: 1. Further, DNA dilution was carried out by mixing OPTI-MEM-I, AQ27 expression vector plasmid or original vector plasmid (240 ng / μl) and pCRE-Luc (240 ng / μl) at 24: 0.9: 0.1. A liquid was prepared. An equal amount of the lipofectamine diluent and the DNA diluent are mixed and left standing at room temperature for 20 minutes to form a complex of DNA and lipofectamine, and then 25 μl is added to the plate on which the HEK293 cells are cultured. The cells were further cultured overnight at 37 ° C. and 5% CO 2 .
After washing the transfected HEK293 cells with an assay medium (DMEM supplemented with 0.1% bovine serum albumin), the novel human-type peptide synthesized in Reference Example 3 diluted with the assay medium was 10, 1, 0.1 μM, and cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 4 hours. The culture supernatant is discarded, 50 μl of Picagene LT2.0 (Toyo Ink Mfg. Co., Ltd.), a substrate for measuring luciferase activity, is added, and the luciferase luminescence is measured using a plate reader (ARVO sx multilabel counter, Wallac). Was measured.
As a result, each of the two novel human peptides was detected as a reaction that concentration-dependently enhanced luciferase activity stimulated by addition of forskolin (FSK) to the AQ27 receptor. On the other hand, the human OT7T022 receptor was detected as a reaction suppressing luciferase activity stimulated by the addition of FSK. These reactions were not detected in cells expressing the empty vector pAKKO-111H into which the receptor had not been introduced. Therefore, it was confirmed that the two novel human peptides caused enhancement of luciferase activity specifically for the AQ27 receptor (FIGS. 6 and 7).

参考例５ マウスゲノムＤＮＡからのＰＣＲ法によるリガンド候補遺伝子の取得
クローンテック社より購入したＭｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡを鋳型として、以下の２種類の合成ＤＮＡを用いて、ＰＣＲ による増幅を行った。
F2 5'-ATGAGGGGCTTCCGGCCTTTGCTTTCC-3'（配列番号：１９）
R2 5'-TCACCGTCCAAAGCGGAAGCTGAAGCC-3'（配列番号：２０）
ＰＣＲの反応液はＤＮＡ溶液１ｍｉｃｒｏｌ、０．５ｍｉｃｒｏｌ Ｆ２（１０ｍｉｃｒｏＭ）、０．５ｍｉｃｒｏｌ Ｒ２（１０ｍｉｃｒｏＭ）、２．５ｍｉｃｒｏｌ添付の１０ｘ反応液、２．５ｍｉｃｒｏｌ ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、０．２５ｍｉｃｒｏｌ ＥｘＴａｑ（タカラ）、１７．７５ｍｉｃｒｏｌ大塚蒸留水を加えて合計２５ｍｉｃｒｏｌにした。反応液を、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ９６００を用いてＰＣＲ反応にかけた。ＰＣＲの条件は９５℃・２分の変性の後、９８℃・１０秒、６０℃・２０秒、７２℃・３０秒のサイクルを３０回繰り返した。ＰＣＲ産物の一部を用いて電気泳動で約４００ｂｐのＰＣＲ産物の増幅を確認した後、ＰＣＲ産物をＱｕｉａｇｅｎ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製し、直接配列決定を行ったところ図８で示す配列がえられた。図８のDNA配列から予測されるアミノ酸配列は図９に示すものであった。また、図９のアミノ酸配列の１〜１７番目のアミノ酸配列は分泌シグナルと予想された。さらに生成するペプチドとしてＣ末端がアミド化されたGly Gly Phe Ser Phe Arg Phe-NH2（配列番号：５の第１１６番目〜１２２番目）、Lys Gly Gly Phe Ser Phe Arg Phe-NH2（配列番号：５の第１１５番目〜１２２番目）等が予想された。
次に、ゲルから回収したPCR産物をTAクローニングキット（Invitrogen社）を用いて大腸菌JM109にサブクローニングし、大腸菌JM109/pTAmFRF-1を取得した。サブクローニングで得られた大腸菌からプラスミドpTAmFRF-1をプラスミド抽出機（クラボウ社）を用いて抽出し、挿入断片の塩基配列を決定し、その配列が図８と同じマウス型分泌蛋白質遺伝子cDNAであることを確認した。 Reference Example 5 Acquisition of ligand candidate gene from mouse genomic DNA by PCR method Using Mouse Genomic DNA purchased from Clonetech as a template, amplification was performed by PCR using the following two types of synthetic DNA.
F2 5'-ATGAGGGGCTTCCGGCCTTTGCTTTCC-3 '(SEQ ID NO: 19)
R2 5'-TCACCGTCCAAAGCGGAAGCTGAAGCC-3 '(SEQ ID NO: 20)
The PCR reaction solution was a DNA solution of 1 micron, 0.5 micron F2 (10 microM), 0.5 micron R2 (10 microM), a 10 × reaction liquid attached to 2.5 micron, 2.5 micron dNTP (10 mM), 0.25 micron ExTaq (Takara), 17.75 microliter Otsuka distilled water was added to make a total of 25 microroll. The reaction solution was subjected to a PCR reaction using a Thermal Cycler 9600. The PCR conditions were: denaturation at 95 ° C. for 2 minutes, and a cycle of 98 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 20 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds was repeated 30 times. After confirming the amplification of a PCR product of about 400 bp by electrophoresis using a part of the PCR product, the PCR product was purified using a Quiagen PCR purification Kit, and directly sequenced. As a result, the sequence shown in FIG. 8 was obtained. Was done. The amino acid sequence predicted from the DNA sequence in FIG. 8 is shown in FIG. In addition, the 1st to 17th amino acid sequences in the amino acid sequence of FIG. 9 were expected to be secretory signals. Gly Gly Phe Ser Phe Arg Phe-NH 2 (Aid No. 116 to 122 of SEQ ID NO: 5), Lys Gly Gly Phe Ser Phe Arg Phe-NH 2 (SEQ ID NO: 5) in which the C-terminal is amidated : 115th to 122nd of No. 5).
Next, the PCR product recovered from the gel was subcloned into E. coli JM109 using a TA cloning kit (Invitrogen) to obtain E. coli JM109 / pTAmFRF-1. Plasmid pTAmFRF-1 was extracted from Escherichia coli obtained by subcloning using a plasmid extractor (Kurabo), the base sequence of the inserted fragment was determined, and the sequence was the same mouse-type secretory protein gene cDNA as in FIG. It was confirmed.

参考例６ 新規ヒト型ペプチド：Arg-Lys-Lys-Gly-Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第１２４番目〜１３３番目）のＡＱ２７受容体を一過性に発現させたＨＥＫ２９３細胞に対するレポーター遺伝子発現量の上昇活性
参考例４と同様の方法で新規ヒト型ペプチド：Arg-Lys-Lys-Gly-Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第１２４番目〜１３３番目）の（１）ＡＱ２７受容体を一過性に発現させていないＨＥＫ２９３細胞（図１０）および（２）ＡＱ２７受容体を一過性に発現させたＨＥＫ２９３細胞（図１１）に対するレポーター遺伝子発現量の上昇活性を測定した。その結果、新規ペプチドはＡＱ２７に対してはルシフェラーゼ活性の上昇作用を（図１１）を引き起こした。 Reference Example 6 novel human type peptide: Arg-Lys-Lys-Gly -Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH 2 ( SEQ ID NO: 1 of the 124-th to 133-th) transiently the AQ27 receptor Activity for increasing the expression level of reporter gene in sexually expressed HEK293 cells A novel human peptide in the same manner as in Reference Example 4: Arg-Lys-Lys-Gly-Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH 2 HEK293 cells (FIG. 10) that did not transiently express AQ27 receptor (FIG. 10) and (2) AQ27 receptor of (124) to 133 of SEQ ID NO: 1 were transiently expressed. The activity of increasing the expression level of the reporter gene in HEK293 cells (FIG. 11) was measured. As a result, the novel peptide caused a luciferase activity increasing effect on AQ27 (FIG. 11).

参考例７ ヒトＡＱ２７発現ＣＨＯ細胞におけるｃＡＭＰ産生抑制活性の検出
自体公知の方法で樹立したＡＱ２７発現ＣＨＯ細胞（図１２）およびコントロールとなるｍｏｃｋ ＣＨＯ細胞（図１３）を、４ｘ１０4／ｗｅｌｌの濃度にて９６ウェルプレート（ベクトンデッキンソン）に撒いて、一晩培養した。アッセイ用バッファーにはＨａｎｋｓ' Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎに０．１％ウシ血清アルブミンおよび０．２ ｍＭ ３−Ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅを添加したものを用いた。アッセイ用バッファーで細胞を２回洗浄し、３７℃で３０分間プレインキュベーションした。再度細胞を２回洗浄したのちにアッセイ用バッファーで調製したサンプルを添加し、３７℃で３０分間インキュベーションした。ｃＡＭＰ産生抑制活性を評価するため、ｃＡＭＰ産生上昇を促進するホルスコリン（ＦＳＫ、和光純薬）２ μＭのみのサンプルと同濃度のＦＳＫと１０-7〜１０-5Ｍの新規ヒト型ペプチド：Arg-Lys-Lys-Gly-Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第１２４番目〜１３３番目）を含むサンプルで比較した。細胞の上清を捨てて、ｃＡＭＰ Ｓｃｒｅｅｎ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライド バイオシステムズ）によって細胞内のｃＡＭＰ産生量を測定した。その結果、図１２に示す通り、ＡＱ２７発現ＣＨＯにおいてのみ、ＦＳＫで誘導されたｃＡＭＰ産生がペプチドの添加によって抑制された。 Reference Example 7 Detection of cAMP production inhibitory activity in human AQ27-expressing CHO cells AQ27-expressing CHO cells (FIG. 12) established by a method known per se and mock CHO cells as a control (FIG. 13) were adjusted to a concentration of 4 × 10 4 / well. To a 96-well plate (Becton Dickinson) and cultured overnight. As an assay buffer, Hanks' Balanced Salt Solution to which 0.1% bovine serum albumin and 0.2 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthine were added was used. Cells were washed twice with assay buffer and pre-incubated for 30 minutes at 37 ° C. After washing the cells twice again, a sample prepared in an assay buffer was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 30 minutes. To evaluate cAMP production inhibitory activity, a new human peptide of 10-7 to 10-5 M with FSK at the same concentration as a sample containing only 2 μM of forskolin (FSK, Wako Pure Chemical Industries) which promotes an increase in cAMP production: Arg- Lys-Lys-Gly-Gly- Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH 2 ( SEQ ID NO: # 124 th to 133 th 1) were compared with samples containing. The cell supernatant was discarded, and the amount of intracellular cAMP production was measured by cAMP Screen System (Applied Biosystems). As a result, as shown in FIG. 12, only in the CHO expressing AQ27, the cAMP production induced by FSK was suppressed by the addition of the peptide.

参考例８ ＡＱ２７発現ＣＨＯ細胞における細胞内カルシウムイオン遊離促進活性の検出
自体公知の方法で樹立したＡＱ２７発現ＣＨＯ細胞を９６−ｗｅｌｌの黒色培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ社）に４×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞数で播種し、一晩培養した。Ｈａｎｋ'ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）に２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４，同仁化学研究所）、２．５ｍＭ ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ（Ｓｉｇｍａ社）を添加したものをアッセイバッファーとして用意した。細胞の培地を除去し、アッセイバッファーに４μＭのＦｌｕｏ ３−ＡＭ（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）および０．０４％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ（Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を添加したものを加え、３７℃で１時間インキュベーションした。細胞をアッセイバッファーで洗浄して過剰なＦｌｕｏ ３を除去し、ＦＬＩＰＲ（モレキュラーデバイス社）にセットした。アッセイバッファーに溶解した検体も同じくＦＬＩＰＲにセットした後、内蔵のマニュピレーターによってサンプルを細胞に添加し、励起光の照射によって発生する細胞内カルシウムイオン濃度に依存した蛍光量の変化を測定した。その結果、サンプル無添加（○）に対し、新規ヒト型ペプチド：Arg-Lys-Lys-Gly-Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第１２４番目〜１３３番目；ＲＫＫＧＧＦＳＦＲＦ−ＮＨ2）および新規ヒト型ペプチド：Gly-Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第１２７番目〜１３３番目；ＧＧＦＳＦＲＦ−ＮＨ2）について、１０μＭ（▲）、１μＭ（□）ではそれぞれ図１４および図１５に示すような反応が検出され、それぞれのペプチドによってＡＱ２７発現ＣＨＯ細胞の細胞内カルシウムイオン遊離促進活性が検出された。 Reference Example 8 Detection of Intracellular Calcium Ion Release Promoting Activity in AQ27-Expressing CHO Cells AQ27-expressing CHO cells established by a method known per se were placed in a 96-well black culture plate (Costar) at 4 × 10 4 cells / well. Numbers were seeded and cultured overnight. Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) to which 20 mM HEPES (pH 7.4, Dojindo Laboratories) and 2.5 mM probenecid (Sigma) were added was prepared as an assay buffer. The cell culture medium was removed, and 4 μM Fluo 3-AM (Dojindo) and 0.04% Pluronic acid (Molecular Probes) were added to the assay buffer, followed by incubation at 37 ° C. for 1 hour. Cells were washed with assay buffer to remove excess Fluo 3 and set on a FLIPR (Molecular Devices). After the sample dissolved in the assay buffer was also set on the FLIPR, the sample was added to the cells by a built-in manipulator, and the change in the amount of fluorescence depending on the intracellular calcium ion concentration generated by irradiation with excitation light was measured. As a result, a new human peptide: Arg-Lys-Lys-Gly-Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH 2 (No. RKGGGFSFRF-NH 2 ) and a novel human peptide: 10 μM for Gly-Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH 2 (127 to 133 of SEQ ID NO: 1; GGFSFRF-NH 2 ) (▲) At 1 μM (□), the reactions as shown in FIG. 14 and FIG. 15 were detected, respectively, and the activity of promoting calcium ion release in intracellular CHO cells expressing AQ27 was detected by each peptide.

参考例９
（１）Thr-Ser-Gly-Pro-Leu-Gly-Asn-Leu-Ala-Glu-Glu-Leu-Asn-Gly-Tyr-Ser-Arg -Lys-Lys-Gly-Gly-Phe-Ser-Phe Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第１０８番目〜１３３番目；Ｔ１−Ｆ２６−ＮＨ2）の合成
Ｔ１−Ｆ２６−ＮＨ2を自体公知のペプチド合成法を用いて製造した。
（２）Pyr-Asp-Glu-Gly-Ser-Glu-Ala-Thr-Gly-Phe-Leu-Pro-Ala-Ala-Gly-Glu-Lys-Thr-Ser-Gly-Pro-Leu-Gly-Asn-Leu-Ala-Glu-Glu-Leu-Asn-Gly-Tyr-Ser-Arg -Lys-Lys-Gly-Gly-Phe-Ser-Phe Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第９１番目〜１３３番目；Ｐｙｒ１−Ｆ４３−ＮＨ2）の合成
Ｐｙｒ１−Ｆ４３−ＮＨ2を自体公知のペプチド合成法を用いて製造した。
（３）Ala-Ser-Gln-Pro-Gln-Ala-Leu-Leu-Val-Ile-Ala-Arg-Gly -Leu-Gln-Thr-Ser-Gly-Arg-Glu-His-Ala-Gly-Cys-Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第６１番目〜８６番目；Ａ１−Ｆ２８−ＮＨ2）の合成
Ａ１−Ｆ２８−ＮＨ2を自体公知のペプチド合成法を用いて製造した。 Reference Example 9
(1) Thr-Ser-Gly-Pro-Leu-Gly-Asn-Leu-Ala-Glu-Glu-Leu-Asn-Gly-Tyr-Ser-Arg-Lys-Lys-Gly-Gly-Phe-Ser-Phe produced synthetic T1-F26-NH 2 with a known peptide synthesis method of;: (T1-F26-NH 2 1 of 108th to 133 th SEQ ID NO:) arg-Phe-NH 2.
(2) Pyr-Asp-Glu-Gly-Ser-Glu-Ala-Thr-Gly-Phe-Leu-Pro-Ala-Ala-Gly-Glu-Lys-Thr-Ser-Gly-Pro-Leu-Gly-Asn -Leu-Ala-Glu-Glu- Leu-Asn-Gly-Tyr-Ser-Arg -Lys-Lys-Gly-Gly-Phe-Ser-Phe Arg-Phe-NH 2 ( SEQ ID NO: 1 of the 91 th to 133 th; Pyr1-F43-NH 2) synthesis Pyr1-F43-NH 2 was prepared using the per se known peptide synthesis methods.
(3) Ala-Ser-Gln-Pro-Gln-Ala-Leu-Leu-Val-Ile-Ala-Arg-Gly-Leu-Gln-Thr-Ser-Gly-Arg-Glu-His-Ala-Gly-Cys produced synthetic A1-F28-NH 2 with a known peptide synthesis method of;: (A1-F28-NH 2 1 of the 61 th to 86 th SEQ ID NO:) -Arg-Phe-NH 2.

参考例１０ 新規ヒト型ペプチド：Thr-Ser-Gly-Pro-Leu-Gly-Asn-Leu-Ala-Glu-Glu-Leu-Asn-Gly-Tyr-Ser-Arg -Lys-Lys-Gly-Gly-Phe-Ser-Phe Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第１０８番目〜１３３番目；Ｔ１−Ｆ２６−ＮＨ2）およびPyr-Asp-Glu-Gly-Ser-Glu-Ala-Thr-Gly-Phe-Leu-Pro-Ala-Ala-Gly-Glu-Lys-Thr-Ser-Gly-Pro-Leu-Gly-Asn-Leu-Ala-Glu-Glu-Leu-Asn-Gly-Tyr-Ser-Arg -Lys-Lys-Gly-Gly-Phe-Ser-Phe Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第９１番目〜１３３番目；Ｐｙｒ１−Ｆ４３−ＮＨ2）のヒトＡＱ２７受容体を一過性に発現させたＨＥＫ２９３細胞に対するレポーター遺伝子発現量の上昇活性
参考例４と同様の方法を用いて、参考例９で合成した新規ペプチドＴ１−Ｆ２６−ＮＨ2およびＰｙｒ１−Ｆ４３−ＮＨ2の（１）ＡＱ２７受容体を一過性に発現させていないＨＥＫ２９３細胞（図１６）、（２）ＡＱ２７受容体を一過性に発現させたＨＥＫ２９３細胞（図１７）に対するレポーター遺伝子発現量の上昇活性を測定した。その結果、それぞれのペプチドによってＡＱ２７受容体を発現させたＨＥＫ２９３細胞においてルシフェラーゼ活性の上昇が検出された。 Reference Example 10 New human peptide: Thr-Ser-Gly-Pro-Leu-Gly-Asn-Leu-Ala-Glu-Glu-Leu-Asn-Gly-Tyr-Ser-Arg-Lys-Lys-Gly-Gly- Phe-Ser-Phe Arg-Phe -NH 2 ( SEQ ID NO: 1 108th to 133 th; T1-F26-NH 2) and Pyr-Asp-Glu-Gly- Ser-Glu-Ala-Thr-Gly- Phe-Leu-Pro-Ala-Ala-Gly-Glu-Lys-Thr-Ser-Gly-Pro-Leu-Gly-Asn-Leu-Ala-Glu-Glu-Leu-Asn-Gly-Tyr-Ser-Arg- Lys-Lys-Gly-Gly- Phe-Ser-Phe Arg-Phe-NH 2 ( SEQ ID NO: 1 of the 91 th to 133 th; Pyr1-F43-NH 2) transiently expressing human AQ27 receptor in the same manner as in increasing activity in reference example 4 of reporter gene expression relative to HEK293 cells were, reference example 9 synthesized novel peptides T1-F26-NH 2 and Pyr1-F43-NH 2 with (1) AQ27 receptor HEK293 cells not transiently expressing the body (FIG. 16), (2) transiently transfecting AQ27 receptor It was measured increase activity of the reporter gene expression level for HEK293 cells expressing (Figure 17). As a result, an increase in luciferase activity was detected in HEK293 cells in which the AQ27 receptor was expressed by each peptide.

参考例１１ 新規ヒト型ペプチド：Ｐｙｒ１−Ｆ４３−ＮＨ2によるＡＱ２７発現ＣＨＯ細胞特異的な細胞内カルシウムイオン動員活性の検出
参考例８と同様の方法により、Ｐｙｒ１−Ｆ４３−ＮＨ2によるＡＱ２７発現ＣＨＯ細胞特異的な細胞内カルシウムイオン動員活性の検討を行った。その結果、図１８に示す通り１０-8Ｍ以上の新規ペプチドＰｙｒ１−Ｆ４３−ＮＨ2の添加によって、ＣＨＯ−ＡＱ２７特異的な細胞内カルシウムイオン動員活性が認められた。一方、図１９に示す通り、コントロールとなるｍｏｃｋ ＣＨＯ細胞においては活性が認められず、同ペプチドがＡＱ２７のリガンドとして特異的なアゴニスト活性を示すことが確認された。 Reference Example 11 Detection of AQ27-expressing CHO cell-specific intracellular calcium ion mobilization activity using a novel human peptide: Pyr1-F43-NH 2 In the same manner as in Reference Example 8, AQ27-expressing CHO cells using Pyr1-F43-NH 2 Specific intracellular calcium ion mobilization activity was examined. As a result, as shown in FIG. 18, CHO-AQ27-specific intracellular calcium ion mobilization activity was observed by the addition of a novel peptide Pyr1-F43-NH 2 of 10 −8 M or more. On the other hand, as shown in FIG. 19, no activity was observed in mock CHO cells as a control, confirming that the peptide exhibited a specific agonist activity as a ligand for AQ27.

参考例１２ 新規ヒト型ペプチド：Ｐｙｒ１−Ｆ４３−ＮＨ2によるＡＱ２７発現ＣＨＯ細胞特異的なｃＡＭＰ産生抑制活性
参考例７の方法と同様の方法により、新規ペプチドＰｙｒ１−Ｆ４３−ＮＨ2によるＡＱ２７発現ＣＨＯ細胞特異的なｃＡＭＰ産生抑制活性を検出した。その結果、図２０に示す通り、ＡＱ２７発現ＣＨＯ特異的に、ＦＳＫで誘導されたｃＡＭＰ産生が新規ペプチドＰｙｒ１−Ｆ４３−ＮＨ2の添加によって抑制された。一方、図２１に示す通り、コントロールとなるｍｏｃｋ ＣＨＯ細胞においては活性が認められず、同ペプチドがＡＱ２７のリガンドとして特異的なアゴニスト活性を示すことが確認された。 Reference Example 12 Activity of Inhibiting AQ27-Expressing CHO Cells by a New Human Peptide: Pyr1-F43-NH 2 Specific cAMP Production Inhibition By the same method as that of Reference Example 7, AQ27-expressing CHO cells using a novel peptide Pyr1-F43-NH 2 Specific cAMP production inhibitory activity was detected. As a result, as shown in FIG. 20, the FSK-induced cAMP production was specifically suppressed by the addition of the novel peptide Pyr1-F43-NH 2 , specifically for AQ27-expressed CHO. On the other hand, as shown in FIG. 21, no activity was observed in mock CHO cells as a control, and it was confirmed that the peptide showed specific agonist activity as a ligand for AQ27.

参考例１３ 新規ヒト型ペプチド：Ala-Ser-Gln-Pro-Gln-Ala-Leu-Leu-Val-Ile-Ala-Arg-Gly-Leu-Gln-Thr-Ser-Gly-Arg-Glu-His-Ala-Gly-Cys-Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第６１番目〜８６番目；Ａ１−Ｆ２８−ＮＨ2）のヒトＡＱ２７受容体を一過性に発現させたＨＥＫ２９３細胞に対するレポーター遺伝子発現量の上昇活性
参考例４と同様の方法を用いて、参考例９で合成した新規ヒト型ペプチド：Ａ１−Ｆ２８−ＮＨ2の（１）ＡＱ２７受容体を一過性に発現させていないＨＥＫ２９３細胞（図２２）、（２）ＡＱ２７受容体を一過性に発現させたＨＥＫ２９３細胞（図２３）に対するレポーター遺伝子発現量の上昇活性を測定した。その結果、Ａ１−Ｆ２８−ＮＨ2によってＡＱ２７受容体を発現させたＨＥＫ２９３細胞においてルシフェラーゼ活性の上昇が検出された。 Reference Example 13 New human peptide: Ala-Ser-Gln-Pro-Gln-Ala-Leu-Leu-Val-Ile-Ala-Arg-Gly-Leu-Gln-Thr-Ser-Gly-Arg-Glu-His- ala-Gly-Cys-Arg- Phe-NH 2 ( SEQ ID NO: 1 of the 61 th to 86 th; A1-F28-NH 2) reporter gene human AQ27 receptor for HEK293 cells were transiently expressed in HEK293 not transiently expressing (1) AQ27 receptor of novel human peptide: A1-F28-NH 2 synthesized in Reference Example 9 using the same method as in Reference Example 4 Cell (FIG. 22), (2) The activity of increasing the expression level of reporter gene in HEK293 cells (FIG. 23) in which AQ27 receptor was transiently expressed was measured. As a result, an increase in the luciferase activity was detected in HEK293 cells expressing AQ27 receptor by A1-F28-NH 2.

参考例１４ 新規ヒト型ペプチド：Ａ１−Ｆ２８−ＮＨ2によるＡＱ２７発現ＣＨＯ細胞特異的な細胞内カルシウムイオン動員活性の検出
参考例８と同様の方法により、新規ペプチドＡ１−Ｆ２８−ＮＨ2によるＡＱ２７発現ＣＨＯ細胞特異的な細胞内カルシウムイオン動員活性の検討を行った。その結果、図２４に示す通り１０-6Ｍ以上の新規ペプチドＡ１−Ｆ２８−ＮＨ2の添加によって、ＣＨＯ−ＡＱ２７特異的な細胞内カルシウムイオン動員活性が認められた。一方、図２５に示す通り、コントロールとなるｍｏｃｋ ＣＨＯ細胞においては活性が認められず、同ペプチドがＡＱ２７のリガンドとして特異的なアゴニスト活性を示すことが確認された。 Reference Example 14 Expression of AQ27 by New Human Type Peptide: A1-F28-NH 2 Detection of CHO Cell-Specific Intracellular Calcium Ion Mobilization Activity AQ27 Expression by New Peptide A1-F28-NH 2 by the same method as in Reference Example 8. CHO cell-specific intracellular calcium ion mobilization activity was examined. As a result, as shown in FIG. 24, CHO-AQ27-specific intracellular calcium ion mobilization activity was observed by addition of the novel peptide A1-F28-NH 2 of 10 −6 M or more. On the other hand, as shown in FIG. 25, no activity was observed in mock CHO cells as a control, confirming that the peptide exhibited a specific agonist activity as a ligand for AQ27.

参考例１５ 新規ヒト型ペプチド：Ａ１−Ｆ２８−ＮＨ2によるＡＱ２７発現ＣＨＯ細胞特異的なｃＡＭＰ産生抑制活性
参考例７の方法と同様の方法により、新規ペプチドＡ１−Ｆ２８−ＮＨ2によるＡＱ２７発現ＣＨＯ細胞特異的なｃＡＭＰ産生抑制活性を検出した。その結果、図２６に示す通り、ＡＱ２７発現ＣＨＯ特異的に、ＦＳＫで誘導されたｃＡＭＰ産生が１０-6Ｍ以上の新規ペプチドＡ１−Ｆ２８−ＮＨ2の添加によって抑制された。一方、図２７に示す通り、コントロールとなるｍｏｃｋ ＣＨＯ細胞においては活性が認められず、同ペプチドがＡＱ２７のリガンドとして特異的なアゴニスト活性を示すことが確認された。 Reference Example 15 novel human type peptide: the A1-F28-NH by 2 AQ27-expressing CHO cell-specific manner similar to the cAMP production inhibitory activity in Reference Example 7, AQ27-expressing CHO cells with novel peptide A1-F28-NH 2 Specific cAMP production inhibitory activity was detected. As a result, as shown in FIG. 26, the FSK-induced cAMP production was specifically inhibited by the addition of a novel peptide A1-F28-NH 2 of 10 −6 M or more, specifically for AQ27-expressed CHO. On the other hand, as shown in FIG. 27, no activity was observed in mock CHO cells as a control, and it was confirmed that the peptide exhibited specific agonist activity as a ligand for AQ27.

参考例１６ ウシゲノムＤＮＡからのＰＣＲ法による新規分泌蛋白質Ｉ遺伝子の取得
クローンテック社より購入したＢｏｖｉｎｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡを鋳型として、以下の２種類の合成ＤＮＡを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。
ｂF 5'- ATGCGGAGCCCTTACTCCCTGCCCTAC -3' （配列番号：２１）
ｂR 5'- TCACCGCCGACCGAAGCGGAAGCTGAA -3' （配列番号：２２）
ＰＣＲの反応液はＤＮＡ溶液１ｍｉｃｒｏｌ、０．５ｍｉｃｒｏｌ ｂＦ（１０ｍｉｃｒｏＭ）、０．５ｍｉｃｒｏｌ ｂＲ（１０ｍｉｃｒｏＭ）、２．５ｍｉｃｒｏｌ添付の１０ｘ反応液、２．５ｍｉｃｒｏｌ ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、０．２５ｍｉｃｒｏｌ ＥｘＴａｑ（タカラ）、１７．７５ｍｉｃｒｏｌ大塚蒸留水を加えて合計２５ｍｉｃｒｏｌにした。反応液を、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ９６００を用いてＰＣＲ反応にかけた。ＰＣＲの条件は９５℃・２分の変性の後、９８℃・１０秒、６０℃・２０秒、７２℃・３０秒のサイクルを３０回繰り返した。ＰＣＲ産物の一部を用いて電気泳動で約４００ｂｐのＰＣＲ産物の増幅を確認した後、ＰＣＲ産物をＱｕｉａｇｅｎ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製し、直接配列決定を行ったところ図２８で示す配列がえられた。図２８のＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列は図２９に示すものであった。また図２９のアミノ酸配列の１〜１７番目のアミノ酸配列は分泌シグナルと予想された。さらに生成するペプチドとして、Ｃ末端がアミド化された図２９のアミノ酸配列の第１２４番目〜１３１番目のアミノ酸配列を有するペプチドまたはＣ末端がアミド化された図２９のアミノ酸配列の第１２５番目〜１３１番目のアミノ酸配列を有するペプチド等が予想される。
次に、ゲルから回収したＰＣＲ産物をＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて大腸菌ＪＭ１０９にサブクローニングし、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴＡｂＦＲＦ−１。サブクローニングで得られた大腸菌からプラスミドｐＴＡｂＦＲＦ−１をプラスミド抽出機（クラボウ社）を用いて抽出し、挿入断片の塩基配列を決定し、その配列が図２８と同じヒト型分泌蛋白質遺伝子ｃＤＮＡであることを確認した。 REFERENCE EXAMPLE 16 Acquisition of a novel secreted protein I gene by PCR from bovine genomic DNA Using Bovine Genomic DNA purchased from Clonetech as a template, amplification was performed by PCR using the following two types of synthetic DNA.
bF 5'- ATGCGGAGCCCTTACTCCCTGCCCTAC -3 '(SEQ ID NO: 21)
bR 5'- TCACCGCCGACCGAAGCGGAAGCTGAA -3 '(SEQ ID NO: 22)
The PCR reaction solution was a DNA solution of 1 micron, 0.5 micron bF (10 microM), 0.5 micron bR (10 micron), a 10x reaction solution attached to 2.5 micron, 2.5 micron dNTP (10 mM), 0.25 micron ExTaq (Takara), 17.75 microliter Otsuka distilled water was added to make a total of 25 microroll. The reaction solution was subjected to a PCR reaction using a Thermal Cycler 9600. The PCR conditions were: denaturation at 95 ° C. for 2 minutes, and a cycle of 98 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 20 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds was repeated 30 times. After confirming the amplification of a PCR product of about 400 bp by electrophoresis using a part of the PCR product, the PCR product was purified using a Quiagen PCR purification Kit and subjected to direct sequencing. As a result, the sequence shown in FIG. 28 was obtained. Was done. The amino acid sequence predicted from the DNA sequence of FIG. 28 is shown in FIG. In addition, the amino acid sequence at positions 1 to 17 in the amino acid sequence in FIG. 29 was predicted to be a secretion signal. Further, as the peptide to be produced, a peptide having the amino acid sequence at positions 124 to 131 of the amino acid sequence of FIG. 29 in which the C-terminal is amidated or the amino acid sequence of positions 125 to 131 of the amino acid sequence of FIG. 29 in which the C-terminal is amidated A peptide having the amino acid sequence at position N is expected.
Next, the PCR product recovered from the gel was subcloned into Escherichia coli JM109 using a TA cloning kit (Invitrogen) to obtain Escherichia coli JM109 / pTAbFRF-1. Plasmid pTAbFRF-1 was extracted from Escherichia coli obtained by subcloning using a plasmid extractor (Kurabo Co., Ltd.), and the nucleotide sequence of the inserted fragment was determined. It was confirmed.

参考例１７ ラット副腎ｃＤＮＡからのＰＣＲ法によるＡＱ２７受容体遺伝子の取得
ラット副腎のｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ１μｇからランダムプライマー、逆転写酵素としてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を用い、添付のマニュアルに従って４２℃で反応を行い、ｃＤＮＡを得た。以下の２種類の合成ＤＮＡを用いて、ＰＣＲ による増幅を行った。
F1 5'-CGTCGACGCATGCAGGCGCTCAACATCACCGCG-3' （配列番号：２３）
R2 5'-CACTAGTTTACAGTTCATGGCCACTACCAAAAGTA-3' （配列番号：２４）
ＰＣＲの反応液はｃＤＮＡ溶液１ｍｉｃｒｏｌ、０．５ｍｉｃｒｏｌ Ｆ１（１０ｍｉｃｒｏＭ）、０．５ｍｉｃｒｏｌ Ｒ１（１０ｍｉｃｒｏＭ）、５ｍｉｃｒｏｌ添付の５ｘ反応液、２．５ｍｉｃｒｏｌ Ｇｃｍｅｌｔ、２．５ｍｉｃｒｏｌ ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、０．５ｍｉｃｒｏｌ Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ｇｃｍｅｌｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（クローンテック）、１２．５ｍｉｃｒｏｌ大塚蒸留水を加えて合計２５ｍｉｃｒｏｌにした。反応液を、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ９６００を用いてＰＣＲ反応にかけた。ＰＣＲの条件は９５℃・２分の変性の後、９８℃・１０秒、６１℃・２０秒、７２℃・１２０秒のサイクルを３５回繰り返した。ＰＣＲ産物の一部を用いて電気泳動で約１３００ｂｐのＰＣＲ産物の増幅を確認した後、ＰＣＲ産物をＱｕｉａｇｅｎ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製し、ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて大腸菌ＪＭ１０９にサブクローニングし、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＣＲ２．１−ｒａｔＡＱ２７を取得した。サブクローニングで得られた大腸菌からプラスミドｐＣＲ２．１−ｒａｔＡＱ２７をＱｕｉａｇｅｎ ＱＩＡｗｅｌｌ ８ Ｕｌｔｒａ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔを用いて抽出し、挿入断片の塩基配列を決定し、図３０で示す配列がえられた。図３０のＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列は図３１に示すものであった。また、ヒト型およびマウス型ＡＱ２７との相同性は図３２に示すとおりであり、ラット型ＡＱ２７受容体であることが確認された。 Reference Example 17 Acquisition of AQ27 receptor gene from rat adrenal gland cDNA by PCR method Using 1 μg of rat adrenal polyA + RNA, random primers, SuperScript II reverse transcriptase (GIBCO BRL) as a reverse transcriptase, and the reaction at 42 ° C. according to the attached manual. Performed to obtain cDNA. Amplification by PCR was performed using the following two types of synthetic DNA.
F1 5'-CGTCGACGCATGCAGGCGCTCAACATCACCGCG-3 '(SEQ ID NO: 23)
R2 5'-CACTAGTTTACAGTTCATGGCCACTACCAAAAGTA-3 '(SEQ ID NO: 24)
The reaction solution of the PCR was 1 micron of cDNA solution, 0.5 micron F1 (10 microM), 0.5 micron R1 (10 microM), 5x reaction liquid attached to 5 micron, 2.5 micron Gcmelt, 2.5 micron dNTP (10 mM), 0.5 micron Advantage cm Polymerase Mix (Clontech), 12.5 microl Otsuka distilled water was added to make a total of 25 microl. The reaction solution was subjected to a PCR reaction using a Thermal Cycler 9600. As for the PCR conditions, a cycle of 98 ° C. for 10 seconds, 61 ° C. for 20 seconds, and 72 ° C. for 120 seconds was repeated 35 times after denaturation at 95 ° C. for 2 minutes. After confirming the amplification of a PCR product of about 1300 bp by electrophoresis using a part of the PCR product, the PCR product is purified using a Quiagen PCR purification Kit, and subcloned into E. coli JM109 using a TA cloning kit (Invitrogen). Then, Escherichia coli JM109 / pCR2.1-ratAQ27 was obtained. Plasmid pCR2.1-ratAQ27 was extracted from E. coli obtained by subcloning using Quiagen QIAwell 8 Ultra Plasmid Kit, the base sequence of the inserted fragment was determined, and the sequence shown in FIG. 30 was obtained. The amino acid sequence predicted from the DNA sequence in FIG. 30 is shown in FIG. The homology with human and mouse AQ27 is as shown in FIG. 32, confirming that it is a rat AQ27 receptor.

参考例１８ マウス脳ｃＤＮＡからのＰＣＲ法によるＡＱ２７受容体遺伝子の取得
クローンテック マウスＭＴＣ Ｐａｎｅｌの脳ｃＤＮＡを鋳型として、以下の２種類の合成ＤＮＡを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。
F1 5'-CGTCGACGCATGCAGGCGCTCAACATCACCGCG-3' （配列番号：２５）
R2 5'-CATCGATATTACAGTTCATGTCCACTGCCGAAAGTA-3' （配列番号：２６）
ＰＣＲの反応液はｃＤＮＡ溶液１ｍｉｃｒｏｌ、０．５ｍｉｃｒｏｌ Ｆ１（１０ｍｉｃｒｏＭ）、０．５ｍｉｃｒｏｌ Ｒ１（１０ｍｉｃｒｏＭ）、５ｍｉｃｒｏｌ添付の５ｘ反応液、２．５ｍｉｃｒｏｌ Ｇｃｍｅｌｔ、２．５ ｍｉｃｒｏｌ ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、０．５ｍｉｃｒｏｌ Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ｇｃｍｅｌｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（クローンテック）、１２．５ｍｉｃｒｏｌ大塚蒸留水を加えて合計２５ｍｉｃｒｏｌにした。反応液を、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ９６００を用いてＰＣＲ反応にかけた。ＰＣＲの条件は９５℃・２分の変性の後、９８℃・１０秒、５９℃・２０秒、７２℃・１２０秒のサイクルを３５回繰り返した。ＰＣＲ産物の一部を用いて電気泳動で約１３００ｂｐのＰＣＲ産物の増幅を確認した後、ＰＣＲ産物をＱｕｉａｇｅｎ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製し、ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて大腸菌ＪＭ１０９にサブクローニングし、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＣＲ２．１−ｍｏｕｓｅＡＱ２７を取得した。サブクローニングで得られた大腸菌からプラスミドｐＣＲ２．１−ｍｏｕｓｅＡＱ２７をＱｕｉａｇｅｎ ＱＩＡｗｅｌｌ ８ Ｕｌｔｒａ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔを用いて抽出し、挿入断片の塩基配列を決定し、図３３で示す配列がえられた。図３３のＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列は図３４に示すものであった。またヒト型およびラット型ＡＱ２７との相同性は図３５のようであり、マウス型ＡＱ２７受容体であることが確認された。 Reference Example 18 Acquisition of AQ27 Receptor Gene from Mouse Brain cDNA by PCR Method Using the following two types of synthetic DNAs, amplification was performed by PCR using the brain cDNA of Clonetech Mouse MTC Panel as a template.
F1 5'-CGTCGACGCATGCAGGCGCTCAACATCACCGCG-3 '(SEQ ID NO: 25)
R2 5'-CATCGATATTACAGTTCATGTCCACTGCCGAAAGTA-3 '(SEQ ID NO: 26)
The reaction solution of the PCR was 1 micron of cDNA solution, 0.5 micron F1 (10 microM), 0.5 micron R1 (10 micronM), 5x reaction liquid attached to 5 micron, 2.5 micron Gcmelt, 2.5 micron dNTP (10 mM), 0.5 micron Advantage Gcmelt Polymerase Mix (Clontech), 12.5 microl Otsuka distilled water was added to make a total of 25 microl. The reaction solution was subjected to a PCR reaction using a Thermal Cycler 9600. As for the PCR conditions, a cycle of 98 ° C. for 10 seconds, 59 ° C. for 20 seconds, and 72 ° C. for 120 seconds was repeated 35 times after denaturation at 95 ° C. for 2 minutes. After confirming the amplification of a PCR product of about 1300 bp by electrophoresis using a part of the PCR product, the PCR product is purified using a Quiagen PCR purification Kit, and subcloned into E. coli JM109 using a TA cloning kit (Invitrogen). Then, Escherichia coli JM109 / pCR2.1-mouseAQ27 was obtained. Plasmid pCR2.1-mouseAQ27 was extracted from E. coli obtained by subcloning using Quiagen QIAwell 8 Ultra Plasmid Kit, the base sequence of the inserted fragment was determined, and the sequence shown in FIG. 33 was obtained. The amino acid sequence predicted from the DNA sequence in FIG. 33 is shown in FIG. The homology with human and rat AQ27 is as shown in FIG. 35, confirming that it is a mouse AQ27 receptor.

参考例１９ ＲＴ−ＰＣＲによるＡＱ２７受容体ｍＲＮＡのヒトにおける組織分布の検討
鋳型となるｃＤＮＡには、ヒト各種組織由来のｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ（クロンテック社）から以下の方法で合成したものを使用した。ＲＮＡ１μｇからランダムプライマー、逆転写酵素としてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を用い、添付のマニュアルに従って４２℃で反応を行い、反応終了後にエタノール沈殿して１００μｌに溶解した。ＲＴ−ＰＣＲはＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｐｒｉｓｍ ７７００（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、増幅と検出のためのプライマーとして５'−ＣＣＡＧＡＡＣＡＴＴＴＣＣＧＡＣＡＡＣＴＧ−３'（配列番号：２７），５'−ＡＣＡＧＣＧＧＴＡＧＡＣＴＧＧＡＣＡＡＡ−３'（配列番号：２８）およびＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅとして５'−（Ｆａｍ）−ＴＧＣＴＴＴＣＡＴＴＴＧＣＡＡＧＡＴＧＧＴＧＣＣ−（Ｔａｍｒａ）−３'（配列番号：２９）を使用した。ＲＴ−ＰＣＲ反応液はＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）１２．５μｌに、それぞれ１００μＭのプライマー溶液を０．０５μｌ、５μＭのＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅを０．５μｌ、および上記で調製したｃＤＮＡ溶液を０．５μｌ加え、蒸留水で総反応液量を２５μｌとした。ＰＣＲ反応は５０℃・２分、９５℃・１０分の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分のサイクルを４０回繰り返した。得られたヒト各種組織におけるＡＱ２７受容体のｍＲＮＡ発現量はｔｏｔａｌ ＲＮＡ ２５ｎｇあたりのコピー数として算出した（図３６）。 Reference Example 19 Examination of Tissue Distribution of AQ27 Receptor mRNA in Human by RT-PCR As cDNA serving as a template, one synthesized from polyA + RNA (Clontech) derived from various human tissues by the following method was used. Using 1 μg of RNA, a random primer was used, and SuperScript II reverse transcriptase (GIBCO BRL) was used as a reverse transcriptase at 42 ° C. according to the attached manual. After the reaction was completed, ethanol was precipitated and dissolved in 100 μl. RT-PCR uses Sequence Detection System Prism 7700 (PE Biosystems), and 5'-CCAGAACATTTCCCACACACTG-3 '(SEQ ID NO: 27), 5'-ACAGCGGGTAGACGAGAA' sequence as a primer for amplification and detection. 28) and 5 '-(Fam) -TGCTTTCATTTGCAAGATGGTGCC- (Tamra) -3' (SEQ ID NO: 29) was used as TaqMan probe. The RT-PCR reaction solution was 12.5 μl of TaqMan Universal PCR Master Mix (PE Biosystems), 0.05 μl of 100 μM primer solution, 0.5 μl of 5 μM TaqMan probe, and 0.1 μl of the cDNA solution prepared above. 5 μl was added, and the total reaction solution volume was adjusted to 25 μl with distilled water. In the PCR reaction, a cycle of 50 ° C. for 2 minutes, 95 ° C. for 10 minutes, and a cycle of 95 ° C. for 15 seconds and 60 ° C. for 1 minute were repeated 40 times. The AQ27 receptor mRNA expression levels in the obtained human tissues were calculated as the number of copies per 25 ng of total RNA (FIG. 36).

参考例２０ ＲＴ−ＰＣＲによるＡＱ２７受容体ｍＲＮＡのラットにおける組織分布の検討
鋳型となるｃＤＮＡには、ラット各種組織由来のｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡから以下の方法で合成したものを使用した。ＲＮＡ１μｇからランダムプライマー、逆転写酵素としてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を用い、添付のマニュアルに従って４２℃で反応を行い、反応終了後にエタノール沈殿して１００μｌに溶解した。ＲＴ−ＰＣＲはＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｐｒｉｓｍ ７７００（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、増幅と検出のためのプライマーとして５'−ＣＧＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＡＡＴＴＣＴＧ−３'（配列番号：３０），５'−ＡＴＧＴＧＴＣＴＣＣＴＴＴＧＧＴＴＴＣＴＴＣＣＡ−３'（配列番号：３１）およびＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅとして５'−（Ｆａｍ）−ＡＧＣＡＡＡＧＴＴＡＴＣＴＣＧＡＣＣＡＣＡＧＣＧＴＣＣＡ−（Ｔａｍｒａ）−３'（配列番号：３２）を使用した。ＲＴ−ＰＣＲ反応液はＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）１２．５μｌに、それぞれ１００μＭのプライマー溶液を０．０５μｌ、５μＭのＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅを０．５μｌ、および上記で調製したｃＤＮＡ溶液を０．５μｌ加え、蒸留水で総反応液量を２５μｌとした。ＰＣＲ反応は５０℃・２分、９５℃・１０分の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分のサイクルを４０回繰り返した。得られたラット各種組織におけるＡＱ２７受容体のｍＲＮＡ発現量はｔｏｔａｌ ＲＮＡ ２５ｎｇあたりのコピー数として算出した（図３６）。 Reference Example 20 Examination of Tissue Distribution of AQ27 Receptor mRNA in Rats by RT-PCR cDNA used as a template was synthesized from polyA + RNA derived from various rat tissues by the following method. Using 1 μg of RNA, a random primer was used, and SuperScript II reverse transcriptase (GIBCO BRL) was used as a reverse transcriptase at 42 ° C. according to the attached manual. After the reaction was completed, ethanol was precipitated and dissolved in 100 μl. RT-PCR uses Sequence Detection System Prism 7700 (PE Biosystems), and 5'-CGGAAGCCTGGGATTTCTG-3 '(SEQ ID NO: 30), 5'-ATGTTGTCTCTCTGCT sequence (SEQ ID NO: TGTGTGTGT) as a primer for amplification and detection. 31) and 5 '-(Fam) -AGCAAAGTTTATCGCGACCACAGCGTCCA- (Tamra) -3' (SEQ ID NO: 32) was used as TaqMan probe. The RT-PCR reaction solution was 12.5 μl of TaqMan Universal PCR Master Mix (PE Biosystems), 0.05 μl of 100 μM primer solution, 0.5 μl of 5 μM TaqMan probe, and 0.1 μl of the cDNA solution prepared above. 5 μl was added, and the total reaction solution volume was adjusted to 25 μl with distilled water. In the PCR reaction, a cycle of 50 ° C. for 2 minutes, 95 ° C. for 10 minutes, and a cycle of 95 ° C. for 15 seconds and 60 ° C. for 1 minute were repeated 40 times. The amount of AQ27 receptor mRNA expression in the obtained rat tissues was calculated as the number of copies per 25 ng of total RNA (FIG. 36).

参考例２１ ＲＴ−ＰＣＲによる新規分泌蛋白質ＧのｍＲＮＡのラットにおける組織分布の検討
Ｗｉｓｔａｒラットより各種臓器を摘出し、ｔｏｔａｌ ＲＮＡをＩｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社）、ｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡをｍＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）により、それぞれのマニュアルにしたがって調製した。得られたｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡ １μｇをＤｎａｓｅＩ（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｇｒａｄｅ，ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）処理後、１６０ｎｇ分をＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社）を用いて、マニュアルに従い４２℃でｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡはｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡ換算で４ｎｇ／μｌの溶液とし、以後のＲＴ−ＰＣＲの鋳型として用いた。ＲＴ−ＰＣＲはＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｐｒｉｓｍ ７７００（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、増幅と検出のためのプライマーとして５’−ＡＧＣＡＣＡＣＴＧＧＣＴＴＣＣＧＴＣＴＡＧ−３’（配列番号：３３），５’−ＣＧＣＴＧＧＣＣＴＴＣＴＣＴＧＡＧＴＣＡ−３’（配列番号：３４）およびＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅとして５’−（Ｆａｍ）ＡＧＧＣＡＧＧＡＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＡＡＧＣＣ−（Ｔａｍｒａ）−３’（配列番号：３５）を使用した。ＲＴ−ＰＣＲ反応液はＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）１２．５μｌに、それぞれ１００μＭのプライマー溶液を０．２２５μｌ、５μＭのＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅを１．２５μｌ、および上記で調製したｃＤＮＡ溶液を０．５μｌ加え、蒸留水で総反応液量を２５μｌとした。ＰＣＲ反応は５０℃・２分、９５℃・１０分の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分のサイクルを４０回繰り返した。得られたラット各種組織における新規分泌蛋白質ＧのｍＲＮＡ発現量はｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡ １ｎｇあたりのコピー数として算出した（図３７）。 Reference Example 21 Examination of tissue distribution in rat of mRNA of novel secreted protein G by RT-PCR Various organs were excised from Wistar rats, total RNA was Isogen (Nippon Gene), and poly (A) + RNA was mRNA purification kit (Pharmacia). Was prepared according to each manual. After 1 μg of the obtained poly (A) + RNA was treated with Dnase I (Amplification Grade, GIBCO BRL), cDNA was synthesized at 42 ° C. according to the manual using RNA PCR Kit (Takara) for 160 ng. The synthesized cDNA was used as a solution of 4 ng / μl in terms of poly (A) + RNA and used as a template for subsequent RT-PCR. RT-PCR uses Sequence Detection System Prism 7700 (PE Biosystems), and 5'-AGCACCACTGCTTCCGTCCTAG-3 '(SEQ ID NO: 33), 5'-CGCTGGGCCTTCTGATCA sequence as a primer for amplification and detection. 34) and 5 '-(Fam) AGGCAGGACAGTGGCAGTGAAGCC- (Tamra) -3' (SEQ ID NO: 35) was used as TaqMan probe. The RT-PCR reaction solution was 12.5 μl of TaqMan Universal PCR Master Mix (PE Biosystems), 0.225 μl of 100 μM primer solution, 1.25 μl of 5 μM TaqMan probe, and 0.1 μl of the cDNA solution prepared above. 5 μl was added, and the total reaction solution volume was adjusted to 25 μl with distilled water. In the PCR reaction, a cycle of 50 ° C. for 2 minutes, 95 ° C. for 10 minutes, and a cycle of 95 ° C. for 15 seconds and 60 ° C. for 1 minute were repeated 40 times. The mRNA expression level of the novel secreted protein G in the obtained rat tissues was calculated as the number of copies per 1 ng of poly (A) + RNA (FIG. 37).

参考例２２ ＲＴ−ＰＣＲによる新規ヒト型分泌蛋白質のｍＲＮＡのヒトにおける組織分布の検討
ｍＲＮＡの発現量検出のためのＲＴ−ＰＣＲの鋳型となるｃＤＮＡには、ヒト各種組織由来のｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ（クロンテック社）から以下の方法で合成したものを使用した。ＲＮＡ１μｇからランダムプライマー、逆転写酵素としてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を用い、添付のマニュアルに従って４２℃で反応を行い、反応終了後にエタノール沈殿して１００μｌに溶解した。発現量の定量はＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｐｒｉｓｍ ７７００を用いて行った。増幅と検出のためのプライマーとして5'-ＴＧＡＧＡＧＣＴＴＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡ-3'（配列番号：３６），5'-ＡＧＣＴＧＡＡＧＣＣＧＣＣＴＴＴＣＴＴ-3'（配列番号：３７）およびＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅとして5'-(Ｆａｍ)ＡＡＣＣＴＧＧＣＴＧＡＧＧＡＧＣＴＣＡＡＴＧＧＣＴＡ-(Ｔａｍｒａ)-3'（配列番号：３８）を使用した。ＲＴ−ＰＣＲ反応は参考例１９と同様の方法で行った。
得られたヒト各種組織における新規ヒト型分泌蛋白質のｍＲＮＡ発現量はｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡ １ｎｇあたりのコピー数として算出した（図３８）。 Reference Example 22 Examination of Tissue Distribution of mRNA of Novel Human Secretory Protein in Human by RT-PCR The cDNA used as a template for RT-PCR for detecting the expression level of mRNA includes polyA + RNA derived from various human tissues (Clontech). Was synthesized by the following method. Using 1 μg of RNA, a random primer was used, and SuperScript II reverse transcriptase (GIBCO BRL) was used as a reverse transcriptase at 42 ° C. according to the attached manual. After the reaction was completed, ethanol was precipitated and dissolved in 100 μl. Quantification of the expression level was performed using Sequence Detection System Prism 7700. 5'-TGAGAGCTTCACAGCCACA-3 '(SEQ ID NO: 36), 5'-AGCTGAAGCCGCCTTCTT-3' (SEQ ID NO: 37) as primers for amplification and detection and 5 '-(Fam) AACCTGGCTGAGGAGCTCAATGGCTA-TaRa as TaqMan probe. -3 '(SEQ ID NO: 38) was used. The RT-PCR reaction was performed in the same manner as in Reference Example 19.
The mRNA expression level of the novel human secretory protein in the obtained various human tissues was calculated as the number of copies per ng of poly (A) + RNA (FIG. 38).

参考例２３ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法による新規分泌蛋白質mRNAのラット脳における発現分布の検討
Ｗｉｓｔａｒラットをネンブタール麻酔下で開腹し、左心室から０．９％食塩水を５分間潅流し、続いて４％パラホルムアルデヒド溶液を５分間潅流した。取り出した脳を同溶液中に２４時間４℃で浸漬したのち、３０％スクロース溶液に置換し，４℃で３日間浸漬し、解析に供する脳のサンプルを得た。
新規分泌蛋白質アンチセンス、センスプローブは以下の方法で調製した。
まず、プラスミドベクターｐＣＲＩＩ ＴＯＰＯ（インビトロジェン社）に自体公知の方法でラット型ＡＱ２７リガンドｃＤＮＡを挿入した。このｃＤＮＡを、Ｍ１３プライマー（インビトロジェン社）・Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＧＣ２ポリメラーゼ（クロンテック社）を用いたＰＣＲにて増幅・直鎖化し、エタノール沈殿法により精製した。このｃＤＮＡから、ＤＩＧ ＲＮＡ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ＫＩＴ（ＳＰ６／Ｔ７）（ロッシュ社）にてＳＰ６もしくはＴ７によるｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎを行い（４０μｌスケール）、生成されたＤＩＧラベルリボプローブをエタノール沈殿により精製した。精製したプローブは大塚精製水１００μｌに溶解した。ｃＤＮＡの挿入方向から、ＳＰ６により生成されたＤＩＧラベルリボプローブがアンチセンスプローブ、Ｔ７により生成されたＤＩＧラベルリボプローブがセンスプローブであった。
Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにはフリーフローティング法を使用した。まずクライオスタットＣＭ３０５０（ライカ社）を用いて４０μｍの厚さの前頭断凍結切片を作製した。つぎに切片をＰＢＳで洗浄した後、１μｇ／ｍｌ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）処理（３７℃・１５分）にてプロテアーゼ処理を行った。さらに、０．２５％無水酢酸を含む０．１Ｍトリエタノールアミン（ｐＨ８．０）による処理（室温・１０分）にてアセチル化を行った後、ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（５０％ホルムアミド，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５，１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ'ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ， ２００μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ，１０％デキストラン硫酸，６００ｍＭ ＮａＣｌ，０．２５％ ＳＤＳ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）による処理（６０℃・２０分）にてｐｒｅ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ反応を行った。Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ反応には、ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒでアンチセンスプローブもしくはセンスプローブを１０００倍に希釈し、８５℃で３分変性した後、切片に加え６０℃で１２時間以上反応させた。引き続き、非特異的にｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎしたプローブを洗浄するため以下の操作を行った。１）２×ＳＳＣ（ＳＳＣ；１×ＳＳＣ＝１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１５ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．０）／５０％ホルムアミド処理（６０℃・１５分・２回）、２）ＴＮＥ（０．５Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理（３７℃・１０分）、３）２０ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ Ａ ｉｎ ＴＮＥ処理（３７℃・３０分）、４）ＴＮＥ処理（３７℃・１０分）、５）２×ＳＳＣ処理（６０℃・１５分・２回）、６）０．５×ＳＳＣ処理（６０℃・１５分・２回）。以上の操作を行った後、ＤＩＧラベルプローブを検出するための免疫組織化学を行った。まず、ＤＩＧ−１（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した後、１．５％ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ（ロッシュ社）を含むＤＩＧ−１による処理（３７℃・１時間）にて非特異反応のブロッキングを行い、ａｎｔｉ−ＤＩＧ ｆａｂ−ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ロッシュ社）を含むＤＩＧ−１（１：１０００）を室温で１時間反応させた。ＤＩＧ−１で十分洗浄した後、ＤＩＧ−３（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．５，１００ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＭｇＣｌ2）でリンスし、０．１８ｍｇ／ｍｌ ５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＢＣＩＰ）を含むジメチルホルムアミド、および０．３４ｍｇ／ｍｌ ４−ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（ＮＢＴ）を含む７０％ジメチルホルムアミドを、ＤＩＧ−３ １ｍｌにつきそれぞれ３．５ｍｌおよび４．５ｍｌ加えた溶液によって、室温にて発色反応を行った。適時に発色をＰＢＳ洗浄により止めた後、切片をスライドガラスに載せ、９０％グリセロールを含むＰＢＳで封入し、光学顕微鏡で観察した。
アンチセンスプローブにて特異的に発色していたのは、視床下部のｒｅｔｒｏｃｈｉａｓｍａｔｉｃ ａｒｅａを中心に、ａｒｃｕａｔｅ ｎｕｃｌｅｕｓの吻側、特に背側部・外側部にかけてであった。これらの領域においてセンスプローブによる発色は検出されなかった。
上記部位では、ｃｏｃａｉｎｅ− ａｎｄ ａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ（ＣＡＲＴ）、ＰＯＭＣが発現し（ともに摂食抑制）、またレプチン受容体が高濃度に存在することが知られている。このことから、ＡＱ２７リガンドは摂食を制御すると考えられる。ａｒｃｕａｔｅ ｎｕｃｌｅｕｓはＧＨＲＨの存在する部位で、正中隆起外層に投射する神経があることが知られている。このことから、新規分泌蛋白質は神経内分泌に関与すると考えられる。さらに、参考例２４に記すＡＱ２７ｍＲＮＡの分布と併せ考えると、新規分泌蛋白質が睡眠・覚醒、痛覚、交感神経系、自発行動・情動行動等を制御・修飾すると考えられる。 Reference Example 23 Investigation of Expression Distribution of Newly Secreted Protein mRNA in Rat Brain by In Situ Hybridization Method Wistar rats were laparotomized under Nembutal anesthesia, and perfused with 0.9% saline for 5 minutes from the left ventricle, followed by 4% The paraformaldehyde solution was perfused for 5 minutes. The taken out brain was immersed in the same solution at 4 ° C. for 24 hours, replaced with a 30% sucrose solution, and immersed at 4 ° C. for 3 days to obtain a brain sample to be analyzed.
The novel secretory protein antisense and sense probe were prepared by the following method.
First, rat AQ27 ligand cDNA was inserted into a plasmid vector pCRII TOPO (Invitrogen) by a method known per se. This cDNA was amplified and linearized by PCR using M13 primer (Invitrogen) and Advantage GC2 polymerase (Clontech), and purified by ethanol precipitation. From this cDNA, in vitro transcription using SP6 or T7 was performed (40 μl scale) using a DIG RNA Labeling KIT (SP6 / T7) (Roche), and the resulting DIG-labeled riboprobe was purified by ethanol precipitation. The purified probe was dissolved in 100 μl of Otsuka purified water. From the cDNA insertion direction, the DIG-labeled riboprobe generated by SP6 was an antisense probe, and the DIG-labeled riboprobe generated by T7 was a sense probe.
The free floating method was used for in situ hybridization. First, a frozen frontal section having a thickness of 40 μm was prepared using a cryostat CM3050 (Leica). Next, the sections were washed with PBS, and then subjected to protease treatment with 10 mM Tris-HCl / 1 mM EDTA (pH 8.0) containing 1 μg / ml Proteinase K (37 ° C., 15 minutes). Furthermore, after acetylation was performed by a treatment (room temperature, 10 minutes) with 0.1 M triethanolamine (pH 8.0) containing 0.25% acetic anhydride, a hybridization buffer (50% formamide, 10 mM Tris-HCl pH7) was used. The pre-hybridization reaction was performed by a treatment (60 ° C., 20 minutes) with 5,1 × Denhardt's solution, 200 μg / ml tRNA, 10% dextran sulfate, 600 mM NaCl, 0.25% SDS, 1 mM EDTA). . In the hybridization reaction, the antisense probe or the sense probe was diluted 1000-fold with a hybridization buffer, denatured at 85 ° C. for 3 minutes, added to a section, and reacted at 60 ° C. for 12 hours or more. Subsequently, the following operation was performed to wash the non-specifically hybridized probe. 1) 2 × SSC (SSC; 1 × SSC = 150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.0) / 50% formamide treatment (60 ° C., 15 minutes × 2 times), 2) TNE (0.5 M NaCl, 10 mM) Tris-HCl (pH 7.6), 1 mM EDTA) treatment (37 ° C., 10 minutes), 3) 20 mg / ml RNase A in TNE treatment (37 ° C., 30 minutes), 4) TNE treatment (37 ° C., 10 minutes) 5) 2 × SSC treatment (60 ° C., 15 minutes, twice), 6) 0.5 × SSC treatment (60 ° C., 15 minutes, 2 times). After performing the above operations, immunohistochemistry for detecting the DIG label probe was performed. First, after washing with DIG-1 (100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20), treatment with DIG-1 containing 1.5% Blocking reagent (Roche) (37 ° C./1) ), Non-specific reaction was blocked, and DIG-1 (1: 1000) containing anti-DIG fab-fragment antibody conjugated with alkaline phosphatase (Roche) was reacted at room temperature for 1 hour. After thoroughly washing with DIG-1, rinse with DIG-3 (100 mM Tris-HCl pH 9.5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl 2 ) and 0.18 mg / ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate. A solution of 3.5% and 4.5 ml of dimethylformamide containing (BCIP) and 70% dimethylformamide containing 0.34 mg / ml 4-nitroblue tetrazolium (NBT) per 1 ml of DIG-3 was added at room temperature. A color reaction was performed. After appropriately stopping color development by washing with PBS, the section was mounted on a slide glass, sealed with PBS containing 90% glycerol, and observed with an optical microscope.
The color developed specifically by the antisense probe was on the rostral side of arcate nucleus, particularly on the dorsal side and the outer side, centering on the retrochiasmatic area of the hypothalamus. No color development by the sense probe was detected in these regions.
It is known that cocaine- and amphetamine-regulated transscript (CART) is expressed at the above-mentioned site, POMC is expressed (both suppressive on feeding), and leptin receptor is present at a high concentration. This suggests that AQ27 ligand controls feeding. Arcate nucleus is a site where GHRH is present, and it is known that there is a nerve projecting to the median ridge outer layer. From this, it is considered that the newly secreted protein is involved in neuroendocrine. Furthermore, when considered in combination with the distribution of AQ27 mRNA described in Reference Example 24, it is considered that the newly secreted protein controls and modifies sleep / wake, pain, sympathetic nervous system, self-issue movement / emotional behavior, and the like.

参考例２４ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法によるＡＱ２７ｍＲＮＡのラット脳における発現分布の検討
Ｗｉｓｔａｒラットをネンブタール麻酔下で開腹し、左心室から０．９％食塩水を５分間潅流し、続いて４％パラホルムアルデヒド溶液を５分間潅流した。取り出した脳を同溶液中に２４時間４℃で浸漬したのち、３０％スクロース溶液に置換し，４℃で３日間浸漬し、解析に供する脳のサンプルを得た。
ＡＱ２７アンチセンス、センスプローブは以下の方法で調製した。
まず、プラスミドベクターｐＣＲＩＩ ＴＯＰＯ（インビトロジェン社）に自体公知の方法でラット型ＡＱ２７ｃＤＮＡを挿入した。このｃＤＮＡを、Ｍ１３プライマー（インビトロジェン社）・Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＧＣ２ポリメラーゼ（クロンテック社）を用いたＰＣＲにて増幅・直鎖化し、エタノール沈殿法により精製した。このｃＤＮＡから、ＤＩＧ ＲＮＡ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ＫＩＴ（ＳＰ６／Ｔ７）（ロッシュ社）にてＳＰ６もしくはＴ７によるｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎを行い（４０μｌスケール）、生成されたＤＩＧラベルリボプローブをさらに４０ｍＭ ＮａＨＣＯ３，６０ｍＭＮａ2ＣＯ3 ｐＨ１０．２により４００ｂｐにアルカリ加水分解した後エタノール沈殿により精製した。精製したプローブは大塚精製水１００μｌに溶解した。ｃＤＮＡの挿入方向から、ＳＰ６により生成されたＤＩＧラベルリボプローブがアンチセンスプローブ、Ｔ７により生成されたＤＩＧラベルリボプローブがセンスプローブであった。
Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにはフリーフローティング法を使用した。まずクライオスタットＣＭ３０５０（ライカ社）を用いて４０μｍの厚さの前頭断凍結切片を作製した。つぎに切片をＰＢＳで洗浄した後、１μｇ／ｍｌ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）処理（３７℃・１５分）にてプロテアーゼ処理を行った。さらに、０．２５％無水酢酸を含む０．１Ｍトリエタノールアミン（ｐＨ８．０）による処理（室温・１０分）にてアセチル化を行った後、ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（５０％ホルムアミド，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５，１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ'ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，２００μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ，１０％デキストラン硫酸，６００ｍＭ ＮａＣｌ，０．２５％ ＳＤＳ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）による処理（６０℃・２０分）にてｐｒｅ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ反応を行った。Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ反応には、ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒでアンチセンスプローブもしくはセンスプローブを１０００倍に希釈し、８５℃で３分変性した後、切片に加え６０℃で１２時間以上反応させた。引き続き、非特異的にｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎしたプローブを洗浄するため以下の操作を行った。１）２×ＳＳＣ（ＳＳＣ；１×ＳＳＣ＝１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１５ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．０）／５０％ホルムアミド処理（６０℃・１５分・２回）、２）ＴＮＥ（０．５Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理（３７℃・１０分）、３）２０ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ Ａ ｉｎ ＴＮＥ処理（３７℃・３０分）、４）ＴＮＥ処理（３７℃・１０分）、５）２×ＳＳＣ処理（６０℃・１５分・２回）、６）０．５×ＳＳＣ処理（６０℃・１５分・２回）。以上の操作を行った後、ＤＩＧラベルプローブを検出するための免疫組織化学を行った。まず、ＤＩＧ−１（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した後、１．５％ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ（ロッシュ社）を含む ＤＩＧ−１による処理（３７℃、１時間）にて非特異反応のブロッキングを行い、ａｎｔｉ−ＤＩＧ ｆａｂ−ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ロッシュ社）を含むＤＩＧ−１（１：１０００）を室温で１時間反応させた。ＤＩＧ−１で十分洗浄した後、ＤＩＧ−３（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．５，１００ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＭｇＣｌ2）でリンスし、０．１８ｍｇ／ｍｌ ５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＢＣＩＰ）を含むジメチルホルムアミド、および０．３４ｍｇ／ｍｌ ４−ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（ＮＢＴ）を含む７０％ジメチルホルムアミドを、ＤＩＧ−３ １ｍｌにつきそれぞれ３．５ｍｌおよび４．５ｍｌ加えた溶液によって、４℃にて一晩発色反応を行った。適時に発色をＰＢＳ洗浄により止めた後、切片をスライドガラスに載せ、９０％グリセロールを含むＰＢＳで封入し、光学顕微鏡で観察した。
アンチセンスプローブにて特異的に発色していたのは、ｐｉｒｉｆｏｒｍ ｃｏｒｔｅｘ（梨状皮質）、ｃｏｒｔｅｘ−ａｍｙｇｄａｒａ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｚｏｎｅ（皮質扁桃移行帯）、ｖｅｎｔｒａｌ ｐａｌｌｉｄｕｍ（淡蒼球）、ｌａｔｅｒａｌ ｐｒｅｏｐｔｉｃ ａｒｅａ（視索前野）、ｖｅｎｔｒｏｍｅｄｉａｌ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ ｎｕｃｌｅｕｓ（腹内側核）、ｚｏｎａ ｉｎｃｅｒｔａ（不確帯）、ｐｏｓｔｅｒｏｒ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ ａｒｅａ（視床下部後核）、ｍａｒｇｉｎａｌ ｚｏｎｅ ｍｅｄｉａｎ ｇｅｎｉｃｕｌａｔｅ（内側膝状周辺帯）、ｄｏｒｓａｌ ｒａｐｈｅ ｎｕｃｌｅｕｓ（背側縫線核）、ｎｕｃｌｅｕｓ ｏｆ ｂｒａｃｈｉｕｍ ｉｎｆｅｒｉｏｒ ｃｏｌｌｉｃｕｌｕｓ（下丘腕核）、ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃｕｌａｔｅ ｌｅａｆ（膝状体間小葉）、ｌｏｃｕｓ ｃｏｅｒｕｌｅｕｓ（青斑核）、ｃｅｎｔｒａｌ ｇｒａｙ，ａｌｐｈａ・ｂｅｔａ ｐａｒｔ（中心灰白質）等であった（図３９）。特にｄｏｒｓａｌ ｒａｐｈｅ ｎｕｃｌｅｕｓ（背側縫線核）、ｌｏｃｕｓ ｃｏｅｒｕｌｅｕｓ（青斑核）では強い発色が認められた。これらの領域ではセンスプローブによる発色は検出されなかった。
以上の結果から、新規分泌蛋白質／ＡＱ２７は視床下部で統合された情報を大脳−脳幹に伝達する役割を担うと考えられた。具体的には、１）摂食、２）睡眠・覚醒、３）痛覚、４）ストレス応答、５）自発行動・情動行動等の制御・修飾作用が示唆された。 Reference Example 24 Investigation of expression distribution of AQ27 mRNA in rat brain by in situ hybridization method Wistar rats were laparotomized under Nembutal anesthesia, and perfused with 0.9% saline for 5 minutes from the left ventricle, followed by 4% paraformaldehyde solution Was perfused for 5 minutes. The taken out brain was immersed in the same solution at 4 ° C. for 24 hours, replaced with a 30% sucrose solution, and immersed at 4 ° C. for 3 days to obtain a brain sample to be analyzed.
AQ27 antisense and sense probes were prepared by the following method.
First, rat AQ27 cDNA was inserted into a plasmid vector pCRII TOPO (Invitrogen) by a method known per se. This cDNA was amplified and linearized by PCR using M13 primer (Invitrogen) and Advantage GC2 polymerase (Clontech), and purified by ethanol precipitation. The cDNA was subjected to in vitro transcription (40 μl scale) using SP6 or T7 in DIG RNA Labeling KIT (SP6 / T7) (Roche), and the resulting DIG-labeled riboprobe was further added to 40 mM NaHCO3, 60 mM Na 2 CO 3 pH10. And then subjected to alkaline hydrolysis to 400 bp, followed by purification by ethanol precipitation. The purified probe was dissolved in 100 μl of Otsuka purified water. From the cDNA insertion direction, the DIG-labeled riboprobe generated by SP6 was an antisense probe, and the DIG-labeled riboprobe generated by T7 was a sense probe.
The free floating method was used for in situ hybridization. First, a frozen frontal section having a thickness of 40 μm was prepared using a cryostat CM3050 (Leica). Next, the sections were washed with PBS, and then subjected to protease treatment with 10 mM Tris-HCl / 1 mM EDTA (pH 8.0) containing 1 μg / ml Proteinase K (37 ° C., 15 minutes). Furthermore, after acetylation by a treatment (room temperature, 10 minutes) with 0.1 M triethanolamine (pH 8.0) containing 0.25% acetic anhydride, a hybridization buffer (50% formamide, 10 mM Tris-HCl pH7) The pre-hybridization reaction was carried out by a treatment (60 ° C., 20 minutes) with 5,1 × Denhardt's solution, 200 μg / ml tRNA, 10% dextran sulfate, 600 mM NaCl, 0.25% SDS, 1 mM EDTA). . In the hybridization reaction, the antisense probe or the sense probe was diluted 1000-fold with a hybridization buffer, denatured at 85 ° C. for 3 minutes, added to a section, and reacted at 60 ° C. for 12 hours or more. Subsequently, the following operation was performed to wash the non-specifically hybridized probe. 1) 2 × SSC (SSC; 1 × SSC = 150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.0) / 50% formamide treatment (60 ° C., 15 minutes × 2 times), 2) TNE (0.5 M NaCl, 10 mM) Tris-HCl (pH 7.6), 1 mM EDTA) treatment (37 ° C., 10 minutes), 3) 20 mg / ml RNase A in TNE treatment (37 ° C., 30 minutes), 4) TNE treatment (37 ° C., 10 minutes) 5) 2 × SSC treatment (60 ° C., 15 minutes, twice), 6) 0.5 × SSC treatment (60 ° C., 15 minutes, 2 times). After performing the above operations, immunohistochemistry for detecting the DIG label probe was performed. First, after washing with DIG-1 (100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20), treatment with DIG-1 containing 1.5% Blocking reagent (Roche) (37 ° C., 1 ), And DIG-1 (1: 1000) containing anti-DIG fab-fragment antibody conjugated with alkaline phosphatase (Roche) was reacted at room temperature for 1 hour. After thoroughly washing with DIG-1, rinse with DIG-3 (100 mM Tris-HCl pH 9.5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl 2 ) and 0.18 mg / ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate. A solution obtained by adding 3.5 ml and 4.5 ml of dimethylformamide containing (BCIP) and 70% dimethylformamide containing 0.34 mg / ml 4-nitroblue tetrazolium (NBT) per 1 ml of DIG-3 to 4 ° C. To perform a color reaction overnight. After appropriately stopping color development by washing with PBS, the section was mounted on a slide glass, sealed with PBS containing 90% glycerol, and observed with an optical microscope.
The colors that were specifically developed by the antisense probe were pyriform cortex (piriform cortex), cortex-amygdara transition zone (cortical tonsil transition zone), ventral pallidum (pallidal sphere), lateral preoptic area (visual preoptic area). ), Ventromedial hypothalamic nucleus (ventral medial nucleus), zona incerta (uncertain zone), posteror hypothalamic area (post-hypothalamic nucleus), marginal zone median skeletal nucleus, medial zone muscular glandular glandular glandular glandular glandular genus ), Nucleus of brachium inferior colliculus (brachial nucleus), Ntergeniculate leaf (geniculate body between the leaflets), locus coeruleus (locus coeruleus) were central gray, alpha · beta part (central gray matter) or the like (FIG. 39). In particular, strong color development was observed in Dorsal raphe nucleus (dorsal raphe nucleus) and locus coeruleus (blue spot nucleus). No color development by the sense probe was detected in these regions.
From the above results, it was considered that the novel secreted protein / AQ27 plays a role in transmitting information integrated in the hypothalamus to the cerebrum-brain stem. Specifically, it was suggested that 1) eating, 2) sleep / wake, 3) pain, 4) stress response, and 5) controlling / modifying actions such as self-issue movement / emotional behavior.

参考例２５ 新規ヒト型分泌蛋白質遺伝子を導入したＣＨＯ細胞上清中のＡＱ２７特異的活性成分の精製
まず定法により、新規ヒト型分泌蛋白質遺伝子全長（配列番号：２４）を発現ベクターｐＡＫＫＯ−Ｈ１１１に導入した。このベクターをリポフェクトアミン２０００（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いてトランスフェクションし、一過性にＣＨＯ細胞において新規ヒト型分泌蛋白質を発現させ、培養上清を取得した。この培養上清中に、ベクターのみを導入したＣＨＯ細胞（ｍｏｃｋ ＣＨＯ細胞）の培養上清と比較して、ＨＥＫ細胞に一過性に発現させたオーファンレセプターＡＱ２７に対して特異的な刺激活性を見出した（図４０）。ＡＱ２７特異的な刺激活性の検出は、ｃＡＭＰレスポンスエレメント（ＣＲＥ）プロモーターの発現誘導によって産生されるレポーター遺伝子産物（ルシフェラーゼ）の発現量を指標に行った。
次に、この発現ベクターを、ジーントランスファー（和光純薬）を用いてＣＨＯｄｈｆｒ−細胞にトランスフェクションし、ヒト型ＡＱ２７リガンド遺伝子を恒常的に発現するＣＨＯ細胞を取得した。この新規ヒト型分泌蛋白質遺伝子発現ＣＨＯ細胞を培養し、培養上清を得た。
培養上清からの精製にあたって、既知ＲＦアミドペプチドを認識する抗体が新規ヒト型分泌蛋白質を認識し得るか、液相の競合法で検討したところ、抗ＲＦＲＰ−１抗体の１Ｆ３−１がヒト型分泌蛋白質のＣ末端構造を認識することが判明した（図４１）。
培養上清を２．４Ｌ取得し、１Ｆ３−１抗体を用いたアフィニティー精製を行った。まず、上清を煮沸し、遠心にて析出物を取り除き、１Ｆ３−１抗体を結合させたＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（アマシャムバイオサイエンス）にアプライした。カラムを１．０Ｍ ＮａＣｌを加えたＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）にて洗浄後、０．５ＭｎａＣｌを含む０．２Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ ｐＨ２．２で１Ｆ３−１抗体を結合させたＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに結合した成分を溶出した。この溶出画分を，Ｖｙｄａｃ Ｃ１８ ２１８ＴＰ５４１５カラムにアプライし、２０〜３５％アセトニトリルの濃度勾配で溶出したところ、２つのピークのＡＱ２７特異的な刺激活性が検出された（図４２）。それぞれの活性ピークをμＲＰＣ Ｃ２／Ｃ１８ ＳＣ２．１／１０カラムで分離したことろ、それぞれ活性ピークは２つに分かれ合計４つの活性ピーク１〜４が得られた（図４３および図４４）。
４つの活性画分に含まれるペプチドの分子量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで測定した。図４３および図４４に示されるそれぞれの活性ピークに含まれるペプチドの測定分子量とそれらに対応するヒト型分泌蛋白質遺伝子から推測される分子量の理論値およびアミノ酸配列を図４５に示す。 Reference Example 25 Purification of AQ27-specific active ingredient in CHO cell supernatant into which novel human secretory protein gene was introduced First, the full length of novel human secretory protein gene (SEQ ID NO: 24) was introduced into expression vector pAKKO-H111 by a conventional method. did. This vector was transfected using Lipofectamine 2000 (Gibco-BRL), and a novel human secretory protein was transiently expressed in CHO cells, and a culture supernatant was obtained. Compared with the culture supernatant of CHO cells (mock CHO cells) into which only the vector has been introduced, the stimulating activity specific to the orphan receptor AQ27 transiently expressed in HEK cells was added to this culture supernatant. (FIG. 40). The detection of AQ27-specific stimulating activity was performed using the expression level of a reporter gene product (luciferase) produced by inducing the expression of the cAMP response element (CRE) promoter as an index.
Next, this expression vector was transfected into CHOdhfr- cells using Gene Transfer (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to obtain CHO cells that constantly express the human AQ27 ligand gene. The CHO cells expressing the novel human secretory protein gene were cultured to obtain a culture supernatant.
In purifying from the culture supernatant, it was examined whether an antibody recognizing a known RF amide peptide could recognize a novel human secretory protein by a liquid phase competition method, and it was confirmed that 1F3-1 of the anti-RFRP-1 antibody was human type. It was found to recognize the C-terminal structure of the secretory protein (FIG. 41).
2.4 L of the culture supernatant was obtained, and affinity purification was performed using the 1F3-1 antibody. First, the supernatant was boiled, the precipitate was removed by centrifugation, and applied to an NHS-activated Sepharose column (Amersham Bioscience) to which the 1F3-1 antibody was bound. The column was washed with 1.0 M NaCl-added PBS (Phosphate Buffered Saline), and then bound to an NHS-activated Sepharose column to which the 1F3-1 antibody was bound with 0.2 M Glycine-HCl pH 2.2 containing 0.5 MnaCl. The eluted components were eluted. The eluted fraction was applied to a Vydac C18 218TP5415 column and eluted with a concentration gradient of 20 to 35% acetonitrile, and two peaks of AQ27-specific stimulating activity were detected (FIG. 42). Each activity peak was separated on a μRPC C2 / C18 SC2.1 / 10 column, and each activity peak was split into two, giving a total of four activity peaks 1-4 (FIGS. 43 and 44).
The molecular weights of the peptides contained in the four active fractions were measured by MALDI-TOF-MS. FIG. 45 shows the measured molecular weights of the peptides contained in the respective activity peaks shown in FIGS. 43 and 44, the theoretical values of the molecular weights estimated from the corresponding human secretory protein genes, and the amino acid sequences.

参考例２６ 長さの異なるヒト型ペプチドのＡＱ２７発現ＣＨＯ細胞株に対するｃＡＭＰ産生抑制試験
ＡＱ２７を発現させたＣＨＯ細胞を、９６穴プレート（ファルコン）に４×１０4個／ｗｅｌｌでまき、３７℃、５％ＣＯ2・９５％ａｉｒで一晩培養した。アッセイ用バッファーとして、Ｈａｎｋｓ'Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ギブコ）に、終濃度０．１％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマ）、２００μＭ ３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ（シグマ）、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）（ギブコ）を加えたものを調製した。試料希釈用バッファーとしてアッセイ用バッファーに終濃度２μＭ フォルスコリンを添加したものを作成、これを用い図４６に示した試料ペプチドを、２×１０-6Ｍ、２×１０-7Ｍ、２×１０-8Ｍ、２×１０-9Ｍ、２×１０-10Ｍ、２×１０-11Ｍに希釈した。一晩培養した細胞は、アッセイ用バッファー１５０μｌで二回洗浄後交換して３０分、３７℃、１００％ ａｉｒで培養し、同様に２回洗浄して、アッセイ用バッファー５０μｌ、試料溶液５０μｌを添加し、攪拌した後３０分、３７℃、１００％ ａｉｒで培養した。細胞内ｃＡＭＰ量を、ｃＡＭＰ−ＳｃｒｅｅｎTM Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＩ）を用い、本キットのプロトコールに従い測定した。Ｍａｘｉｍａｍ ｌｅｖｅｌのｃＡＭＰ量と各サンプルを添加した時のｃＡＭＰ量の差を算出して、フォルスコリンによるｃＡＭＰ産生促進量に対する百分率を算出し、これをｃＡＭＰの産生の抑制率とした（図４７）。図４６に各試料のＥＣ50値を示す。この結果から、本発明のヒト型ペプチドがＡＱ２７受容体を介して細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性を示すことが明らかになった。 Reference Example 26 cAMP Production Inhibition Test of Human-Type Peptides of Different Lengths on AQ27-Expressing CHO Cell Line CHO cells expressing AQ27 were seeded at 4 × 10 4 cells / well on a 96-well plate (Falcon) at 37 ° C. The cells were cultured overnight at 5% CO 2 and 95% air. As a buffer for the assay, Hanks' Balanced Salt Solution (Gibco) was added to a final concentration of 0.1% bovine serum albumin (BSA, Sigma), 200 μM 3-isobutyl-1-methylxanthine (Sigma), 20 mM HEPES (pH 7.4) (pH 7.4) ( Gibco) was prepared. As a sample diluting buffer, a buffer prepared by adding a final concentration of 2 μM forskolin to an assay buffer was prepared, and using this, the sample peptide shown in FIG. 46 was converted to 2 × 10 −6 M, 2 × 10 −7 M, 2 × 10 −7 M -8 M, 2 × 10 −9 M, 2 × 10 −10 M, 2 × 10 −11 M. The cells cultured overnight are washed twice with 150 μl of assay buffer, exchanged, and cultured for 30 minutes at 37 ° C. and 100% air, washed twice in the same manner, and added with 50 μl of assay buffer and 50 μl of sample solution. After stirring, the cells were cultured for 30 minutes at 37 ° C. and 100% air. The amount of intracellular cAMP was measured using cAMP-Screen ™ System (ABI) according to the protocol of this kit. The difference between the amount of cAMP at the maximum level and the amount of cAMP when each sample was added was calculated, and the percentage of the amount of cAMP production promoted by forskolin was calculated, and this was defined as the inhibition rate of cAMP production (FIG. 47). FIG. 46 shows the EC 50 value of each sample. These results revealed that the human peptide of the present invention exhibited intracellular cAMP production inhibitory activity via the AQ27 receptor.

実施例１ 新規ヒト型分泌蛋白質のラットコルチコステロンの分泌刺激活性
ＡＱ２７受容体がラット副腎で高い発現をしていることから、副腎ホルモンの分泌に作用する可能性があるため、図４６に記載のＡＱ２７Ｌ−４３をラットに投与して副腎皮質ホルモンに対する影響を調べた。８週齢のオスＷｉｓｔａｒラットを軽く固定し尾静脈からＡＱ２７Ｌ−４３を生理食塩水に溶解し０．５ｍｇ／ラットの濃度で投与し３０分後に断頭により採血を行った。またコントロールとして生理食塩水を投与したラットから採血した。これらの血清成分をラットコルチコステロン測定キット（アマーシャム社）を用いて測定したところＡＱ２７投与ラットで血中コルチコステロンの上昇が観察できた。 Example 1 Secretion-stimulating activity of rat corticosterone, a novel human secretory protein Since the AQ27 receptor is highly expressed in rat adrenal glands, it may act on the secretion of adrenal hormones. AQ27L-43 was administered to rats to examine the effect on corticosteroids. Eight-week-old male Wistar rats were gently fixed, and AQ27L-43 was dissolved in physiological saline from the tail vein and administered at a concentration of 0.5 mg / rat. Blood was collected by decapitation 30 minutes later. As a control, blood was collected from rats to which physiological saline was administered. When these serum components were measured using a rat corticosterone measurement kit (Amersham), an increase in blood corticosterone was observed in AQ27-administered rats.

実施例２ 新規ヒト型分泌蛋白質のラットコルチコステロンの分泌刺激活性
ＡＱ２７受容体がラット副腎で高い発現をしていることから、副腎ホルモンの分泌に作用する可能性があるため、図４６に記載のＡＱ２７Ｌ−４３をラットに投与して副腎皮質ホルモンに対する影響を調べた。８週齢のオスＷｉｓｔａｒラットにカニュレーションを行い静脈からＡＱ２７Ｌ−４３を生理食塩水に溶解し０．５ｍｇ／ラットの濃度で投与し採血を行った。またコントロールとして生理食塩水を投与したラットから採血した。これらの血清成分をラットコルチコステロン測定キット（アマーシャム社）を用いて測定したところＡＱ２７Ｌ−４３投与ラットで血中コルチコステロンの上昇傾向が観察できた（図４８）。 Example 2 Secretion-stimulating activity of rat corticosterone, a novel human secretory protein Since the AQ27 receptor is highly expressed in rat adrenal glands, it may act on the secretion of adrenal hormones. AQ27L-43 was administered to rats to examine its effect on corticosteroids. Eight-week-old male Wistar rats were cannulated, and AQ27L-43 was dissolved in physiological saline from a vein and administered at a concentration of 0.5 mg / rat to collect blood. As a control, blood was collected from rats to which physiological saline was administered. When these serum components were measured using a rat corticosterone measurement kit (Amersham), an increasing tendency of blood corticosterone was observed in rats administered with AQ27L-43 (FIG. 48).

実施例３ 新規ヒト型分泌蛋白質のラットテストステロンの分泌刺激活性
ＡＱ２７受容体がラット副腎で高い発現をしていることから、副腎ホルモンの分泌に作用する可能性があるため、図４６に記載のＡＱ２７Ｌ−４３をラットに投与して副腎皮質ホルモンに対する影響を調べた。８週齢のオスＷｉｓｔａｒラットにカニュレーションを行い静脈からＡＱ２７Ｌ−４３を生理食塩水に溶解し０．５ｍｇ／ラットの濃度で投与し採血を行った。またコントロールとして生理食塩水を投与したラットから採血した。これらの血清成分をラットテストステロン測定キット（日本シェーリング社）を用いて測定したところＡＱ２７Ｌ−４３投与ラットで血中テストステロンの上昇傾向が観察できた（図４９）。 Example 3 Secretion-stimulating activity of rat testosterone, a novel human secretory protein Since the AQ27 receptor is highly expressed in rat adrenal glands, it may act on the secretion of adrenal hormones. -43 was administered to rats to examine its effect on corticosteroids. Eight-week-old male Wistar rats were cannulated, and AQ27L-43 was dissolved in physiological saline from a vein and administered at a concentration of 0.5 mg / rat to collect blood. As a control, blood was collected from rats to which physiological saline was administered. When these serum components were measured using a rat testosterone measurement kit (Nippon Schering Co., Ltd.), an increase in blood testosterone was observed in rats administered with AQ27L-43 (FIG. 49).

実施例４ 新規ヒト型分泌蛋白質のラットアルドステロンの分泌刺激活性
ＡＱ２７受容体がラット副腎で高い発現をしていることから、副腎ホルモンの分泌に作用する可能性があるため、図４６に記載のＡＱ２７Ｌ−４３をラットに投与して副腎皮質ホルモンに対する影響を調べた。８週齢のオスＷｉｓｔａｒラットにカニュレーションを行い静脈からＡＱ２７Ｌ−４３を生理食塩水に溶解し０．５ｍｇ／ラットの濃度で投与し採血を行った。またコントロールとして生理食塩水を投与したラットから採血した。これらの血清成分をラットアルドステロン測定キット（日本ダイナボット社）を用いて測定したところＡＱ２７Ｌ−４３投与ラットで血中アルドステロンの上昇が観察できた（図５０）。 Example 4 Secretion-stimulating activity of rat aldosterone, a novel human secretory protein Since the AQ27 receptor is highly expressed in rat adrenal glands, it may act on the secretion of adrenal hormones. -43 was administered to rats to examine its effect on corticosteroids. Eight-week-old male Wistar rats were cannulated, and AQ27L-43 was dissolved in physiological saline from a vein and administered at a concentration of 0.5 mg / rat to collect blood. As a control, blood was collected from rats to which physiological saline was administered. When these serum components were measured using a rat aldosterone measurement kit (Nippon Dynabot), an increase in blood aldosterone was observed in rats administered with AQ27L-43 (FIG. 50).

実施例５ 新規ヒト型分泌蛋白質のラットアルドステロン分泌刺激活性の時間経過と濃度依存性
ＡＱ２７受容体がラットアルドステロンの分泌に作用があるため、図４６に記載のＡＱ２７Ｌ−４３をラットに投与して時間経過と濃度依存性を調べた。８週齢のオスＷｉｓｔａｒラットにカニュレーションを行い静脈からＡＱ２７Ｌ−４３を生理食塩水に溶解し４ｎｍｏｌ／ｋｇ、４０ｎｍｏｌ／ｋｇ、４００ｎｍｏｌ／ｋｇの濃度で投与し採血を行った。またコントロールとして生理食塩水を投与したラットから採血した。これらの血清成分をラットアルドステロン測定キット（日本ダイナボット社）を用いて測定したところ４０ｎｍｏｌ／ｋｇ、４００ｎｍｏｌ／ｋｇのＡＱ２７Ｌ−４３投与ラットで血中アルドステロンの上昇が観察できた（図５１）。 Example 5 Time course and concentration dependency of rat aldosterone secretion stimulating activity of a novel human secretory protein Since AQ27 receptor has an effect on rat aldosterone secretion, administration of AQ27L-43 shown in FIG. The course and concentration dependence were examined. An 8-week-old male Wistar rat was cannulated, and AQ27L-43 was dissolved in physiological saline from a vein and administered at a concentration of 4 nmol / kg, 40 nmol / kg, or 400 nmol / kg to collect blood. As a control, blood was collected from rats to which physiological saline was administered. When these serum components were measured using a rat aldosterone measurement kit (Nippon Dynabot), an increase in blood aldosterone was observed in rats administered with 40 nmol / kg and 400 nmol / kg of AQ27L-43 (FIG. 51).

ヒト型分泌蛋白質のＤＮＡ配列を示す。1 shows the DNA sequence of human secretory protein. ヒト型分泌蛋白質のアミノ酸配列を示す。1 shows the amino acid sequence of a human secretory protein. ラット型分泌蛋白質のＤＮＡ配列を示す。1 shows the DNA sequence of rat secretory protein. ラット型分泌蛋白質のアミノ酸配列を示す。1 shows the amino acid sequence of rat secretory protein. ヒト型分泌蛋白質とラット型分泌蛋白質のアミノ酸配列の比較図を示す。FIG. 2 shows a comparison diagram of the amino acid sequences of human secretory protein and rat secretory protein. 新規ヒト型ペプチド：Gly-Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第１２７番目〜１３３番目）および新規ヒト型ペプチド：Glu-His-Ala-Gly-Cys-Arg-Phe-Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第８０番目〜８８番目）のヒトＡＱ２７受容体およびヒトＯＴ７Ｔ０２２受容体を発現させていないＨＥＫ２９３細胞に対するレポーター遺伝子発現量の上昇活性（ルシフェラーゼ活性）を示す。縦軸はルシフェラーゼ活性（ｃｐｓ）を示す。横軸はペプチドの濃度（μＭ）を示す。ＦＳＫはフォルスコリンを示す。ＥＨＡＧＣＲＦＲＦ-NH2はペプチドGlu-His-Ala-Gly-Cys-Arg-Phe-Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第８０番目〜８８番目）を、ＧＧＦＳＦＲＦはペプチドGly-Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第１２７番目〜１３３番目）を示す。ｂａｓｅはペプチド無添加の場合を示す。Novel human type peptide: Gly-Gly-Phe-Ser -Phe-Arg-Phe-NH 2 ( SEQ ID NO: 1 of the 127-th to 133-th), and a novel human type peptide: Glu-His-Ala-Gly -Cys- Activity to increase the reporter gene expression level on HEK293 cells that do not express the human AQ27 receptor of Arg-Phe-Arg-Phe-NH 2 (80th to 88th in SEQ ID NO: 1) and human OT7T022 receptor (luciferase Activity). The vertical axis indicates luciferase activity (cps). The horizontal axis shows the concentration (μM) of the peptide. FSK indicates forskolin. EHAGCRFRF-NH 2 peptide Glu-His-Ala-Gly- Cys-Arg-Phe-Arg-Phe-NH 2: (SEQ ID No. 80 th to 88 th 1), GGFSFRF peptide Gly-Gly-Phe- This shows Ser-Phe-Arg-Phe-NH 2 (the 127th to 133rd positions of SEQ ID NO: 1). base indicates the case where no peptide was added. 新規ヒト型ペプチド：Gly-Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第１２７番目〜１３３番目）および新規ヒト型ペプチド：Glu-His-Ala-Gly-Cys-Arg-Phe-Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第８０番目〜８８番目）のヒトＡＱ２７受容体を一過性に発現させたＨＥＫ２９３細胞に対するレポーター遺伝子発現量の上昇活性（ルシフェラーゼ活性）を示す。縦軸はルシフェラーゼ活性（ｃｐｓ）を示す。横軸はペプチドの濃度（μＭ）を示す。ＦＳＫはフォルスコリンを示す。ＥＨＡＧＣＲＦＲＦ-NH2はペプチドGlu-His-Ala-Gly-Cys-Arg-Phe-Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第８０番目〜８８番目）を、ＧＧＦＳＦＲＦはペプチドGly-Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第１２７番目〜１３３番目）を示す。ｂａｓｅはペプチド無添加の場合を示す。Novel human type peptide: Gly-Gly-Phe-Ser -Phe-Arg-Phe-NH 2 ( SEQ ID NO: 1 of the 127-th to 133-th), and a novel human type peptide: Glu-His-Ala-Gly -Cys- Activity to increase the reporter gene expression level (luciferase activity) on HEK293 cells transiently expressing the human AQ27 receptor of Arg-Phe-Arg-Phe-NH 2 (80th to 88th in SEQ ID NO: 1) Is shown. The vertical axis indicates luciferase activity (cps). The horizontal axis shows the concentration (μM) of the peptide. FSK indicates forskolin. EHAGCRFRF-NH 2 peptide Glu-His-Ala-Gly- Cys-Arg-Phe-Arg-Phe-NH 2: (SEQ ID No. 80 th to 88 th 1), GGFSFRF peptide Gly-Gly-Phe- This shows Ser-Phe-Arg-Phe-NH 2 (the 127th to 133rd positions of SEQ ID NO: 1). base indicates the case where no peptide was added. マウス型分泌蛋白質のＤＮＡ配列を示す。1 shows the DNA sequence of a mouse secretory protein. マウス型分泌蛋白質のアミノ酸配列を示す。1 shows the amino acid sequence of a mouse secretory protein. 新規ヒト型ペプチド：Arg-Lys-Lys-Gly-Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第１２4番目〜１３３番目）のヒトＡＱ２７受容体を発現させていないＨＥＫ２９３細胞に対するレポーター遺伝子発現量の上昇活性（ルシフェラーゼ活性）を示す。縦軸はルシフェラーゼ活性（ｃｐｓ）を示す。横軸はペプチドの濃度（μＭ）を示す。ＦＳＫはフォルスコリンを示す。ＲＫＫＧＧＦＳＦＲＦ-NH2はペプチドArg-Lys-Lys-Gly-Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第１２４番目〜１３３番目）を示す。ｂａｓｅはペプチド無添加の場合を示す。Novel human type peptide: Arg-Lys-Lys-Gly -Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH 2 ( SEQ ID NO: # 124 th to 133 th 1) not to express human AQ27 receptor The activity of increasing the reporter gene expression level (luciferase activity) for HEK293 cells is shown. The vertical axis indicates luciferase activity (cps). The horizontal axis shows the concentration (μM) of the peptide. FSK indicates forskolin. RKKGGFSFRF-NH 2 peptide Arg-Lys-Lys-Gly- Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH 2: (SEQ ID No. 124-th to 133 th 1). base indicates the case where no peptide was added. 新規ヒト型ペプチド：Arg-Lys-Lys-Gly-Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第１２4番目〜１３３番目）のヒトＡＱ２７受容体を発現させたＨＥＫ２９３細胞に対するレポーター遺伝子発現量の上昇活性（ルシフェラーゼ活性）を示す。縦軸はルシフェラーゼ活性（ｃｐｓ）を示す。横軸はペプチドの濃度（μＭ）を示す。ＦＳＫはフォルスコリンを示す。ＲＫＫＧＧＦＳＦＲＦ-NH2はペプチドArg-Lys-Lys-Gly-Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第１２４番目〜１３３番目）を示す。ｂａｓｅはペプチド無添加の場合を示す。Novel human type peptide: Arg-Lys-Lys-Gly -Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH 2: HEK293 was expressed human AQ27 receptor (SEQ ID No. 124-th to 133 th 1) 4 shows the activity of increasing the expression level of a reporter gene (luciferase activity) with respect to cells. The vertical axis indicates luciferase activity (cps). The horizontal axis shows the concentration (μM) of the peptide. FSK indicates forskolin. RKKGGFSFRF-NH 2 peptide Arg-Lys-Lys-Gly- Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH 2: (SEQ ID No. 124-th to 133 th 1). base indicates the case where no peptide was added. ＡＱ２７発現ＣＨＯ細胞におけるｃＡＭＰ産生抑制活性を示す。ｎ＝２の平均値である。縦軸はｃＡＭＰ濃度(pmol)を示す。横軸はペプチドの濃度をｌｏｇＭで表したものである。ＦＳＫ−はフォルスコリン無添加の場合を、ＦＳＫ＋はフォルスコリン添加の場合を示す。ＲＫＫＧＧＦＳＦＲＦ-NH2はヒト型ペプチド：Arg-Lys-Lys-Gly-Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第１２４番目〜１３３番目）を示す。3 shows cAMP production inhibitory activity in AQ27-expressing CHO cells. It is an average value of n = 2. The vertical axis indicates the cAMP concentration (pmol). The horizontal axis represents the concentration of the peptide in logM. FSK- indicates the case where no forskolin was added, and FSK + indicates the case where forskolin was added. RKKGGFSFRF-NH 2 human type peptide: Arg-Lys-Lys-Gly -Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH 2: (SEQ ID No. 124-th to 133 th 1). ｍｏｃｋ ＣＨＯ細胞におけるｃＡＭＰ産生抑制活性を示す。ｎ＝２の平均値を示す。縦軸はｃＡＭＰ濃度(pmol)を示す。横軸はペプチドの濃度をｌｏｇＭで表したものである。ＦＳＫ−はフォルスコリン無添加の場合を、ＦＳＫ＋はフォルスコリン添加の場合を示す。ＲＫＫＧＧＦＳＦＲＦ-NH2はヒト型ペプチド：Arg-Lys-Lys-Gly-Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第１２４番目〜１３３番目）を示す。3 shows cAMP production inhibitory activity in mock CHO cells. The average value of n = 2 is shown. The vertical axis indicates the cAMP concentration (pmol). The horizontal axis represents the concentration of the peptide in logM. FSK- indicates the case where no forskolin was added, and FSK + indicates the case where forskolin was added. RKKGGFSFRF-NH 2 human type peptide: Arg-Lys-Lys-Gly -Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH 2: (SEQ ID No. 124-th to 133 th 1). ＧＧＦＳＦＲＦ-NH2のＡＱ２７発現ＣＨＯ細胞における細胞内カルシウムイオン遊離促進活性を示す。縦軸のＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅは蛍光強度(cps)を示す。横軸は時間（秒）を示す。ＧＧＦＳＦＲＦ-NH2はヒト型ペプチド：Gly-Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第１２７番目〜１３３番目）を示す。○、□および▲はそれぞれ添加したＧＧＦＳＦＲＦ-NH2の濃度が０μＭ、１μＭおよび１０μＭであることを示す。3 shows the activity of GGFSFRF-NH 2 to promote intracellular calcium ion release in AQ27-expressing CHO cells. Fluorescence on the vertical axis indicates the fluorescence intensity (cps). The horizontal axis indicates time (second). GGFSFRF-NH 2 human type peptide: Gly-Gly-Phe-Ser -Phe-Arg-Phe-NH 2: (SEQ ID NO: 127 th to 133 th 1). ○, □ and ▲ indicate that the concentrations of the added GGFSFRF-NH 2 were 0 μM, 1 μM and 10 μM, respectively. ＲＫＫＧＧＦＳＦＲＦ-NH2のＡＱ２７発現ＣＨＯ細胞における細胞内カルシウムイオン遊離促進活性を示す。縦軸のＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅは蛍光強度(cps)を示す。横軸は時間（秒）を示す。ＲＫＫＧＧＦＳＦＲＦ-NH2はヒト型ペプチド：Arg-Lys-Lys-Gly-Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第１２４番目〜１３３番目）を示す。○、□および▲はそれぞれ添加したＧＧＦＳＦＲＦ-NH2の濃度が０μＭ、１μＭおよび１０μＭであることを示す。3 shows the activity of RKKGGFSFRF-NH 2 to promote intracellular calcium ion release in AQ27-expressing CHO cells. Fluorescence on the vertical axis indicates the fluorescence intensity (cps). The horizontal axis indicates time (second). RKKGGFSFRF-NH 2 human type peptide: Arg-Lys-Lys-Gly -Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH 2: (SEQ ID No. 124-th to 133 th 1). ○, □ and ▲ indicate that the concentrations of the added GGFSFRF-NH 2 were 0 μM, 1 μM and 10 μM, respectively. 新規ヒト型ペプチド：Thr-Ser-Gly-Pro-Leu-Gly-Asn-Leu-Ala-Glu-Glu-Leu-Asn-Gly-Tyr-Ser-Arg -Lys-Lys-Gly-Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH2、Pyr-Asp-Glu-Gly-Ser-Glu-Ala-Thr-Gly-Phe-Leu-Pro-Ala-Ala-Gly-Glu-Lys-Thr-Ser-Gly-Pro-Leu-Gly-Asn-Leu-Ala-Glu-Glu-Leu-Asn-Gly-Tyr-Ser-Arg -Lys-Lys-Gly-Gly-Phe-Ser-Phe Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第１０８番目〜１３３番目および第９１番目〜１３３番目）のヒトＡＱ２７受容体を発現させていないＨＥＫ２９３細胞に対するレポーター遺伝子発現量の上昇活性（ルシフェラーゼ活性）を示す。縦軸はルシフェラーゼ活性（ｃｐｓ）を示す。横軸はペプチドの濃度をｌｏｇＭで表したものである。ＦＳＫ−はフォルスコリン無添加の場合を、ＦＳＫ＋はフォルスコリン添加の場合を示す。Ｔ１−Ｆ２６−ＮＨ2は新規ヒト型ペプチド： Thr-Ser-Gly-Pro-Leu-Gly-Asn-Leu-Ala-Glu-Glu-Leu-Asn-Gly-Tyr-Ser-Arg-Lys-Lys-Gly-Gly-Phe-Ser-Phe Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第１０８番目〜１３３番目）、Ｐｙｒ１−Ｆ４３−ＮＨ2は新規ヒト型ペプチド：Pyr -Asp-Glu-Gly-Ser-Glu-Ala-Thr-Gly-Phe-Leu-Pro-Ala-Ala-Gly-Glu-Lys-Thr-Ser-Gly-Pro-Leu-Gly-Asn-Leu-Ala-Glu-Glu-Leu-Asn-Gly-Tyr-Ser-Arg -Lys-Lys-Gly-Gly-Phe-Ser-Phe Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第９１番目〜１３３番目）を示す。Pyrは環状ピログルタミル化されたグルタミンを示す。Novel human peptide: Thr-Ser-Gly-Pro-Leu-Gly-Asn-Leu-Ala-Glu-Glu-Leu-Asn-Gly-Tyr-Ser-Arg -Lys-Lys-Gly-Gly-Phe-Ser -Phe-Arg-Phe-NH 2 , Pyr-Asp-Glu-Gly-Ser-Glu-Ala-Thr-Gly-Phe-Leu-Pro-Ala-Ala-Gly-Glu-Lys-Thr-Ser-Gly- Pro-Leu-Gly-Asn- Leu-Ala-Glu-Glu-Leu-Asn-Gly-Tyr-Ser-Arg -Lys-Lys-Gly-Gly-Phe-Ser-Phe Arg-Phe-NH 2 ( SEQ ID NO: 1 shows the activity (luciferase activity) of increasing the reporter gene expression level in HEK293 cells that do not express the human AQ27 receptor (108th to 133th and 91st to 133th). The vertical axis indicates luciferase activity (cps). The horizontal axis represents the concentration of the peptide in logM. FSK- indicates the case where no forskolin was added, and FSK + indicates the case where forskolin was added. T1-F26-NH 2 is a novel human peptide: Thr-Ser-Gly-Pro-Leu-Gly-Asn-Leu-Ala-Glu-Glu-Leu-Asn-Gly-Tyr-Ser-Arg-Lys-Lys- Gly-Gly-Phe-Ser- Phe Arg-Phe-NH 2 ( SEQ ID NO: 108th to 133 th 1), Pyr1-F43-NH 2 is novel human type peptide: Pyr -Asp-Glu-Gly- Ser -Glu-Ala-Thr-Gly-Phe-Leu-Pro-Ala-Ala-Gly-Glu-Lys-Thr-Ser-Gly-Pro-Leu-Gly-Asn-Leu-Ala-Glu-Glu-Leu-Asn -Gly-Tyr-Ser-Arg -Lys -Lys-Gly-Gly-Phe-Ser-Phe Arg-Phe-NH 2: (SEQ ID NO: 91 th to 133 th 1). Pyr indicates cyclic pyroglutamylated glutamine. 新規ヒト型ペプチド：Thr-Ser-Gly-Pro-Leu-Gly-Asn-Leu-Ala-Glu-Glu-Leu-Asn-Gly-Tyr-Ser-Arg -Lys-Lys-Gly-Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH2、Pyr-Asp-Glu-Gly-Ser-Glu-Ala-Thr-Gly-Phe-Leu-Pro-Ala-Ala-Gly-Glu-Lys-Thr-Ser-Gly-Pro-Leu-Gly-Asn-Leu-Ala-Glu-Glu-Leu-Asn-Gly-Tyr-Ser-Arg -Lys-Lys-Gly-Gly-Phe-Ser-Phe Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第１０８番目〜１３３番目および第９１番目〜１３３番目）のヒトＡＱ２７受容体を発現させたＨＥＫ２９３細胞に対するレポーター遺伝子発現量の上昇活性（ルシフェラーゼ活性）を示す。縦軸はルシフェラーゼ活性（ｃｐｓ）を示す。横軸はペプチドの濃度をｌｏｇＭで表したものである。ＦＳＫ−はフォルスコリン無添加の場合を、ＦＳＫ＋はフォルスコリン添加の場合を示す。Ｔ１−Ｆ２６−ＮＨ2は新規ヒト型ペプチド： Thr-Ser-Gly-Pro-Leu-Gly-Asn-Leu-Ala-Glu-Glu-Leu-Asn-Gly-Tyr-Ser-Arg -Lys-Lys-Gly-Gly-Phe-Ser-Phe Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第１０８番目〜１３３番目、Ｐｙｒ１−Ｆ４３−ＮＨ2は新規ヒト型ペプチド：Pyr-Asp-Glu-Gly-Ser-Glu-Ala-Thr-Gly-Phe-Leu-Pro-Ala-Ala-Gly-Glu-Lys-Thr-Ser-Gly-Pro-Leu-Gly-Asn-Leu-Ala-Glu-Glu-Leu-Asn-Gly-Tyr-Ser-Arg -Lys-Lys-Gly-Gly-Phe-Ser-Phe Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第９１番目〜１３３番目）を示す。Pyrは環状ピログルタミル化されたグルタミンを示す。Novel human peptide: Thr-Ser-Gly-Pro-Leu-Gly-Asn-Leu-Ala-Glu-Glu-Leu-Asn-Gly-Tyr-Ser-Arg-Lys-Lys-Gly-Gly-Phe-Ser -Phe-Arg-Phe-NH 2 , Pyr-Asp-Glu-Gly-Ser-Glu-Ala-Thr-Gly-Phe-Leu-Pro-Ala-Ala-Gly-Glu-Lys-Thr-Ser-Gly- Pro-Leu-Gly-Asn- Leu-Ala-Glu-Glu-Leu-Asn-Gly-Tyr-Ser-Arg -Lys-Lys-Gly-Gly-Phe-Ser-Phe Arg-Phe-NH 2 ( SEQ ID NO: 1 shows the activity (luciferase activity) for increasing the expression level of a reporter gene in HEK293 cells expressing the 108th to 133th and 91st to 133th human AQ27 receptors. The vertical axis indicates luciferase activity (cps). The horizontal axis represents the concentration of the peptide in logM. FSK- indicates the case where no forskolin was added, and FSK + indicates the case where forskolin was added. T1-F26-NH 2 is a novel human peptide: Thr-Ser-Gly-Pro-Leu-Gly-Asn-Leu-Ala-Glu-Glu-Leu-Asn-Gly-Tyr-Ser-Arg-Lys-Lys- Gly-Gly-Phe-Ser- Phe Arg-Phe-NH 2 ( SEQ ID NO: 108th to 133 th 1, Pyr1-F43-NH 2 is novel human type peptide: Pyr-Asp-Glu-Gly -Ser- Glu-Ala-Thr-Gly-Phe-Leu-Pro-Ala-Ala-Gly-Glu-Lys-Thr-Ser-Gly-Pro-Leu-Gly-Asn-Leu-Ala-Glu-Glu-Leu-Asn- Gly-Tyr-Ser-Arg -Lys -Lys-Gly-Gly-Phe-Ser-Phe Arg-Phe-NH 2 ( SEQ ID NO: 1 of the 91-th to 133-th) .Pyr showing a is annular pyroglutamylated Glutamine. 新規ヒト型ペプチドＰｙｒ１−Ｆ４３−ＮＨ2によるＡＱ２７発現ＣＨＯ細胞での細胞内カルシウムイオン動員活性を示す。縦軸のＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅは蛍光強度(cps)を示す。横軸は時間（秒）を示す。□はペプチド無添加の場合を、■、△、▲、○、●および◇は添加したペプチドの濃度をｌｏｇＭで表したものであり、それぞれ５、６、７、８、９および１０を示す。3 shows the activity of mobilizing intracellular calcium ions in AQ27-expressing CHO cells by a novel human peptide Pyr1-F43-NH 2 . Fluorescence on the vertical axis indicates the fluorescence intensity (cps). The horizontal axis indicates time (second). □ indicates the case where no peptide was added, and Δ, Δ, ▲, ○, ● and Δ indicate the concentration of the added peptide in logM, and indicate 5, 6, 7, 8, 9 and 10, respectively. ｍｏｃｋ ＣＨＯ細胞での細胞内カルシウムイオン濃度変化に対する新規ヒト型ペプチド：Ｐｙｒ１−Ｆ４３−ＮＨ2の影響を調べた結果を示す。縦軸のＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅは蛍光強度（ｃｐｓ）を示す。横軸は時間（秒）を示す。□はペプチド無添加の場合を、■、△、▲、○、●および◇は添加したペプチドの濃度をｌｏｇＭで表したものであり、それぞれ５、６、７、８、９および１０を示す。shows the results of effects were examined of Pyr1-F43-NH 2: novel human type peptide on intracellular calcium ion concentration changes in the mock CHO cells. Fluorescence on the vertical axis indicates the fluorescence intensity (cps). The horizontal axis indicates time (second). □ indicates the case where no peptide was added, and Δ, Δ, ▲, ○, ● and Δ indicate the concentration of the added peptide in logM, and indicate 5, 6, 7, 8, 9 and 10, respectively. 新規ヒト型ペプチドＰｙｒ１−Ｆ４３−ＮＨ2によるＡＱ２７発現ＣＨＯ細胞でのｃＡＭＰ産生抑制活性を示す。ｎ＝３の平均値。縦軸のｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎはｃＡＭＰ産生抑制率（％）を示す。横軸のＣｏｎｃ．は添加したペプチドの濃度をｌｏｇＭで表した。3 shows the activity of suppressing cAMP production in AQ27-expressing CHO cells by the novel human peptide Pyr1-F43-NH 2 . Average value of n = 3. Inhibition on the vertical axis indicates the cAMP production inhibition rate (%). Conc. On the horizontal axis. Indicates the concentration of the added peptide by logM. ｍｏｃｋ ＣＨＯのｃＡＭＰ産生抑制活性に対する新規ヒト型ペプチドＰｙｒ１−Ｆ４３−ＮＨ2の影響を調べた結果を示す。ｎ＝３の平均値。縦軸のｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎはｃＡＭＰ産生抑制率（％）を示す。横軸のＣｏｎｃ．は添加したペプチドの濃度をｌｏｇＭで表した。shows the results of examining the effect of the novel human type peptide Pyr1-F43-NH 2 on cAMP production suppressing activity of mock CHO. Average value of n = 3. Inhibition on the vertical axis indicates the cAMP production inhibition rate (%). Conc. On the horizontal axis. Indicates the concentration of the added peptide by logM. 新規ヒト型ペプチド：Ala-Ser-Gln-Pro-Gln-Ala-Leu-Leu-Val-Ile-Ala-Arg-Gly-Leu-Gln-Thr-Ser-Gly-Arg-Glu-His-Ala-Gly-Cys-Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第６１番目〜８６番目）のヒトＡＱ２７受容体を発現させていないＨＥＫ２９３細胞に対するレポーター遺伝子発現量の上昇活性（ルシフェラーゼ活性）を示す。縦軸はルシフェラーゼ活性（ｃｐｓ）、横軸はペプチドの濃度をｌｏｇＭで表したものである。ＦＳＫ−はフォルスコリン無添加の場合を、ＦＳＫ＋はフォルスコリン添加の場合を示す。Ａ１−Ｆ２８−ＮＨ2は新規ヒト型ペプチド：Ala-Ser-Gln-Pro-Gln-Ala-Leu-Leu-Val-Ile-Ala-Arg-Gly-Leu-Gln-Thr-Ser-Gly-Arg-Glu-His-Ala-Gly-Cys-Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第６１番目〜８６番目）を示す。A novel human peptide: Ala-Ser-Gln-Pro-Gln-Ala-Leu-Leu-Val-Ile-Ala-Arg-Gly-Leu-Gln-Thr-Ser-Gly-Arg-Glu-His-Ala-Gly -Cys-Arg-Phe-NH 2 : (SEQ ID nO: 1 of the 61 th -86 th) of human AQ27 increasing activity of the reporter gene expression level for the HEK293 cells not expressing the receptor (luciferase activity). The vertical axis represents luciferase activity (cps), and the horizontal axis represents peptide concentration in logM. FSK- indicates the case where no forskolin was added, and FSK + indicates the case where forskolin was added. A1-F28-NH 2 is a novel human peptide: Ala-Ser-Gln-Pro-Gln-Ala-Leu-Leu-Val-Ile-Ala-Arg-Gly-Leu-Gln-Thr-Ser-Gly-Arg- 1 shows Glu-His-Ala-Gly-Cys-Arg-Phe-NH 2 (the 61st to 86th positions of SEQ ID NO: 1). 新規ヒト型ペプチド：Ala-Ser-Gln-Pro-Gln-Ala-Leu-Leu-Val-Ile-Ala-Arg-Gly-Leu-Gln-Thr-Ser-Gly-Arg-Glu-His-Ala-Gly-Cys-Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第６１番目〜８６番目）のヒトＡＱ２７受容体を発現させたＨＥＫ２９３細胞に対するレポーター遺伝子発現量の上昇活性（ルシフェラーゼ活性）を示す。縦軸のＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅはルシフェラーゼ活性（ｃｐｓ）、横軸はペプチドの濃度をｌｏｇＭで表したものである。ＦＳＫ−はフォルスコリン無添加の場合を、ＦＳＫ＋はフォルスコリン添加の場合を示す。Ａ１−Ｆ２８−ＮＨ2は新規ヒト型ペプチド：Ala-Ser-Gln-Pro-Gln-Ala-Leu-Leu-Val-Ile-Ala-Arg-Gly-Leu-Gln-Thr-Ser-Gly-Arg-Glu-His-Ala-Gly-Cys-Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第６１番目〜８６番目）を示す。A novel human peptide: Ala-Ser-Gln-Pro-Gln-Ala-Leu-Leu-Val-Ile-Ala-Arg-Gly-Leu-Gln-Thr-Ser-Gly-Arg-Glu-His-Ala-Gly The activity of increasing the reporter gene expression level (luciferase activity) in HEK293 cells that expressed the human AQ27 receptor of -Cys-Arg-Phe-NH 2 (positions 61 to 86 of SEQ ID NO: 1) is shown. Fluorescence on the vertical axis represents luciferase activity (cps), and the horizontal axis represents the concentration of the peptide in logM. FSK- indicates the case where no forskolin was added, and FSK + indicates the case where forskolin was added. A1-F28-NH 2 is a novel human peptide: Ala-Ser-Gln-Pro-Gln-Ala-Leu-Leu-Val-Ile-Ala-Arg-Gly-Leu-Gln-Thr-Ser-Gly-Arg- 1 shows Glu-His-Ala-Gly-Cys-Arg-Phe-NH 2 (the 61st to 86th positions of SEQ ID NO: 1). 新規ヒト型ペプチドＡ１−Ｆ２８−ＮＨ2によるＡＱ２７発現ＣＨＯ細胞での細胞内カルシウムイオン動員活性を示す。縦軸のＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅは蛍光強度（ｃｐｓ）を示す。横軸は時間（秒）を示す。＊はペプチド無添加の場合を、■、●、○、▲、◇および◆はペプチドの濃度をｌｏｇＭで表したものであり、それぞれ５、６、７、８、９および１０を示す。3 shows the activity of mobilizing intracellular calcium ions in AQ27-expressing CHO cells by a novel human peptide A1-F28-NH 2 . Fluorescence on the vertical axis indicates the fluorescence intensity (cps). The horizontal axis indicates time (second). * Indicates the case where no peptide was added, and ■, ●, 、, ◇, ◇, and ◆ indicate the peptide concentration in logM, and indicate 5, 6, 7, 8, 9, and 10, respectively. ｍｏｃｋ ＣＨＯ細胞での細胞内カルシウムイオン濃度変化に対する新規ヒト型ペプチドＡ１−Ｆ２８−ＮＨ2の影響を調べた結果を示す。縦軸のＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅは蛍光強度（ｃｐｓ）を示す。横軸は時間（秒）を示す。＊はペプチド無添加の場合を、■、●、○、▲、◇および◆はペプチドの濃度をｌｏｇＭで表したものであり、それぞれ５、６、７、８、９および１０を示す。shows the results of examining the effect of the novel human type peptide A1-F28-NH 2 on the intracellular calcium ion concentration changes in the mock CHO cells. Fluorescence on the vertical axis indicates the fluorescence intensity (cps). The horizontal axis indicates time (second). * Indicates the case where no peptide was added, and ■, ●, 、, ◇, ◇, and ◆ indicate the peptide concentration in logM, and indicate 5, 6, 7, 8, 9, and 10, respectively. 新規ヒト型ペプチドＡ１−Ｆ２８−ＮＨ2によるＡＱ２７発現ＣＨＯ細胞でのｃＡＭＰ産生抑制活性を示す。ｎ＝２の平均値。縦軸のｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎはｃＡＭＰ産生抑制率（％）を示す。横軸のＣｏｎｃ．は添加したペプチドの濃度をｌｏｇＭで表したものである。Shows the cAMP production inhibitory activity in AQ27-expressing CHO cells with novel human type peptide A1-F28-NH 2. Average value of n = 2. Inhibition on the vertical axis indicates the cAMP production inhibition rate (%). Conc. On the horizontal axis. Is the concentration of the added peptide expressed in logM. ｍｏｃｋ ＣＨＯ細胞のｃＡＭＰ産生抑制活性に対する新規ヒト型ペプチドＡ１−Ｆ２８−ＮＨ2の影響を調べた結果を示す。ｎ＝２の平均値。縦軸のｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎはｃＡＭＰ産生抑制率（％）を示す。横軸のＣｏｎｃ．は添加したペプチドの濃度をｌｏｇＭで表したものである。shows the results of examining the effect of the novel human type peptide A1-F28-NH 2 on cAMP production inhibitory activity in mock CHO cells. Average value of n = 2. Inhibition on the vertical axis indicates the cAMP production inhibition rate (%). Conc. On the horizontal axis. Is the concentration of the added peptide expressed in logM. ウシ型分泌蛋白質のＤＮＡ配列を示す。1 shows the DNA sequence of bovine secretory protein. ウシ型分泌蛋白質のアミノ酸配列を示す。1 shows the amino acid sequence of a bovine secretory protein. ラットＡＱ２７受容体の塩基配列を示す。2 shows the nucleotide sequence of rat AQ27 receptor. ラットＡＱ２７受容体のアミノ酸配列を示す。2 shows the amino acid sequence of rat AQ27 receptor. マウスＡＱ２７受容体の塩基配列を示す。2 shows the nucleotide sequence of mouse AQ27 receptor. マウスＡＱ２７受容体のアミノ酸配列を示す。2 shows the amino acid sequence of mouse AQ27 receptor. ヒトＡＱ２７受容体（Ａ）、ラットＡＱ２７受容体（Ｂ）およびマウスＡＱ２７受容体（Ｃ）のアミノ酸配列の相同性を示す。1 shows the amino acid sequence homology of human AQ27 receptor (A), rat AQ27 receptor (B) and mouse AQ27 receptor (C). ＡＱ２７受容体ｍＲＮＡのヒトにおける組織分布を示す。Figure 4 shows the tissue distribution of AQ27 receptor mRNA in humans. ＡＱ２７受容体ｍＲＮＡのラットにおける組織分布を示す。図中のｉはｉｎｆａｎｔ（胎児）を示す。Fig. 4 shows tissue distribution of AQ27 receptor mRNA in rats. I in the figure indicates infant (fetus). ラット型分泌蛋白質のｍＲＮＡのラットにおける組織分布を示す。Fig. 2 shows tissue distribution of rat type secretory protein mRNA in rats. ヒト型分泌蛋白質のｍＲＮＡのヒトにおける組織分布を示す。2 shows tissue distribution of human secretory protein mRNA in humans. ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法によるＡＱ２７ｍＲＮＡのラット脳における発現分布を示す。シグナルの相対強度の＋＋＋は最も強い（ｈｉｇｈｅｓｔ）、＋＋は中程度（ｍｏｄｅｒａｔｅ ｄｅｎｓｉｔｙ）、＋は弱い（ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ）を示す。3 shows the distribution of expression of AQ27 mRNA in rat brain by the in situ hybridization method. The relative intensity of the signal +++ indicates the highest (highest), ++ indicates the moderate (moderate density), and + indicates the low density. ヒト型分泌蛋白質遺伝子を導入したＣＨＯ細胞またはヒト型分泌蛋白質遺伝子を導入していないＣＨＯ細胞の細胞上清をＡＱ２７受容体発現細胞（ＡＱ２７／ＨＥＫ）またはＡＱ２７受容体を発現していない細胞（ｐＡＫＫＯ／ＨＥＫ）に接触させた時の特異的刺激活性を検出した結果を示す。縦軸はルシフェラーゼの発現量（ｃｐｓ）を示す。横軸はＡＱ２７受容体に反応させた物質の濃度または希釈度を示す。Ｂａｓａｌは無添加の場合を示す。ＦＳＫはフォルスコリンを添加した場合を示す。ペプチド（１）はヒト型ペプチド：Glu-His-Ala-Gly-Cys-Arg-Phe-Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第８０番目〜８８番目）を、ペプチド（２）はヒト型ペプチド：Gly-Gly-Phe-Ser-Phe-Arg-Phe-NH2（配列番号：１の第１２７番目〜１３３番目）を添加した場合を示す。ｍｏｃｋ ＳＵＰ．はヒト型分泌蛋白質遺伝子を導入していないＣＨＯ細胞の細胞上清を添加した場合を示す。ペプチドＦ ＳＵＰ．はヒト型分泌蛋白質遺伝子を導入したＣＨＯ細胞の細胞上清を添加した場合を示す。Cell supernatants of CHO cells into which a human secretory protein gene has been introduced or CHO cells into which a human secretory protein gene has not been introduced can be used to express AQ27 receptor-expressing cells (AQ27 / HEK) or cells not expressing AQ27 receptor (pAKKO). / HEK) shows the results of detecting the specific stimulating activity when contacted with (/ HEK). The vertical axis indicates the expression level (cps) of luciferase. The horizontal axis shows the concentration or dilution of the substance reacted with the AQ27 receptor. Basal shows the case without addition. FSK shows the case where forskolin was added. Peptide (1) is a human peptide: Glu-His-Ala-Gly-Cys-Arg-Phe-Arg-Phe-NH 2 (80th to 88th positions of SEQ ID NO: 1), and peptide (2) is human type peptide: shows a case of adding: (127 th to 133 th 1 SEQ ID NO:) Gly-Gly-Phe-Ser -Phe-Arg-Phe-NH 2. mock SUP. Shows the case where the cell supernatant of CHO cells into which the human secretory protein gene was not introduced was added. Peptide F SUP. Shows the case where the cell supernatant of the CHO cells into which the human secretory protein gene was introduced was added. 既知の抗ＲＦＲＰ−１抗体 １Ｆ３−１とヒト型分泌蛋白質との反応曲線を示す。縦軸のＢ／Ｂ0（％）はサンプル添加時の結合量とサンプル非添加時の結合量の比を、横軸のＰｅｐｔｉｄｅ ｃｏｎｃ．はヒト型分泌蛋白質の濃度をｌｏｇＭで表したものである。1 shows a reaction curve between a known anti-RFRP-1 antibody 1F3-1 and a human secretory protein. B / B 0 (%) on the vertical axis represents the ratio of the amount of binding when the sample was added to the amount of binding when no sample was added, and Peptide conc. Is the concentration of human secretory protein expressed in logM. 既知の抗ＲＦＲＰ−１抗体 １Ｆ３−１を用いたアフィニティクロマトグラフィー結合画分のＡＱ２７受容体発現細胞（ＡＱ２７）またはＡＱ２７受容体を発現していない細胞（ｐＡＫＫＯ）に対する特異的刺激活性を示す。横軸のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙはルシフェラーゼ活性（ｃｐｓ）を示す。横軸はアフィニティクロマトグラフィー結合画分の番号を示す。[Fig. 4] Fig. 4 shows the specific stimulating activity of the fraction bound to affinity chromatography using a known anti-RFRP-1 antibody 1F3-1 on AQ27 receptor-expressing cells (AQ27) or cells not expressing the AQ27 receptor (pAKKO). Luciferase activity on the horizontal axis indicates luciferase activity (cps). The horizontal axis indicates the number of the fraction bound by affinity chromatography. 図４２のフラクション２０（ｆｒ．２０）を分離した時の各フラクションのＡＱ２７受容体発現細胞に対する特異的刺激活性を示す。横軸のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙはルシフェラーゼ活性（ｃｐｓ）を示す。横軸はフラクションの番号を示す。３と４は活性ピークを示す。FIG. 42 shows the specific stimulating activity of each fraction on AQ27 receptor-expressing cells when fraction 20 (fr. 20) in FIG. 42 was separated. Luciferase activity on the horizontal axis indicates luciferase activity (cps). The horizontal axis indicates the number of the fraction. 3 and 4 show activity peaks. 図４２のフラクション２０−１３（ｆｒ．２０−２３）を分離した時の各フラクションのＡＱ２７受容体発現細胞に対する特異的刺激活性を示す。横軸のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙはルシフェラーゼ活性（ｃｐｓ）を示す。横軸はフラクションの番号を示す。１と２は活性ピークを示す。FIG. 42 shows the specific stimulating activity of each fraction on AQ27 receptor-expressing cells when fractions 20-13 (fr. 20-23) in FIG. 42 were separated. Luciferase activity on the horizontal axis indicates luciferase activity (cps). The horizontal axis indicates the number of the fraction. 1 and 2 show activity peaks. 図４３および図４４の活性ピーク１〜４に含まれるヒト型ペプチドの測定分子量と理論値およびアミノ酸配列を示す。The measured molecular weight, the theoretical value, and the amino acid sequence of the human peptide contained in the activity peaks 1 to 4 in FIGS. 43 and 44 are shown. 長さの異なるヒト型ペプチドのアミノ酸配列と各種ヒト型ペプチドのＡＱ２７発現ＣＨＯ細胞株に対するｃＡＭＰ産生抑制活性（ＥＣ50値）を示す。1 shows the amino acid sequences of human peptides having different lengths and the cAMP production inhibitory activity (EC 50 value) of various human peptides on AQ27-expressing CHO cell lines. 図４６に示したヒト型ペプチドのＡＱ２７発現ＣＨＯ細胞株に対するｃＡＭＰ産生抑制率を示す。縦軸のｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ（％）はｃＡＭＰ産生抑制率（％）を示す。横軸のＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ｌｏｇＭ）は添加したヒト型ペプチドの濃度をｌｏｇＭで表したものである。FIG. 47 shows the cAMP production inhibitory rate of the human peptide shown in FIG. 46 on the CHO cell line expressing AQ27. Inhibition (%) on the vertical axis indicates the cAMP production suppression rate (%). Concentration (logM) on the horizontal axis represents the concentration of the added human peptide in logM. 図４６に示したヒト型ペプチドのコルチコステロン（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ）の分泌刺激活性を調べた結果を示す。縦軸のｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎは血中コルチコステロンの濃度（ｎｇ／ｍｉ）を示す。横軸のＰｒｅはヒト型ペプチドの投与前を、１０ｍｉｎは投与後１０分を、３０ｍｉｎは投与後３０分を示し、左の白カラムは生理食塩水を投与した場合（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、右の黒カラムはヒト型ペプチドを投与した場合（ＡＱ２７Ｌ）を示す。47 shows the result of examining the secretion stimulating activity of corticosterone of the humanized peptide shown in FIG. 46. The concentration on the vertical axis indicates the blood corticosterone concentration (ng / mi). Pre on the horizontal axis indicates before administration of the humanized peptide, 10 min indicates 10 minutes after administration, 30 min indicates 30 minutes after administration, the white column on the left indicates the case where saline was administered (Control), and the black column on the right. Indicates the case where the human peptide was administered (AQ27L). 図４６に示したヒト型ペプチドのテストステロン（Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）の分泌刺激活性を調べた結果を示す。縦軸のｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎは血中テストステロンの濃度（ｎｇ／ｍｉ）を示す。横軸のＰｒｅはヒト型ペプチドの投与前を、１０ｍｉｎは投与後１０分を、３０ｍｉｎは投与後３０分を示し、左の白カラムは生理食塩水を投与した場合（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、右の黒カラムはヒト型ペプチドを投与した場合（ＡＱ２７Ｌ）を示す。47 shows the result of examining the secretion stimulating activity of the human peptide shown in FIG. 46 on testosterone (Testosterone). Concentration on the vertical axis indicates the concentration of testosterone in blood (ng / mi). Pre on the horizontal axis indicates before administration of the humanized peptide, 10 min indicates 10 minutes after administration, 30 min indicates 30 minutes after administration, the white column on the left indicates the case where saline was administered (Control), and the black column on the right. Indicates the case where the human peptide was administered (AQ27L). 図４６に示したヒト型ペプチドのアルドステロン（Ａｌｄｓｔｅｒｏｎｅ）の分泌刺激活性を調べた結果を示す。縦軸のｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎは血中アルドステロンの濃度（ｎｇ／ｍｉ）を示す。横軸のＰｒｅはヒト型ペプチドの投与前を、１０ｍｉｎは投与後１０分を、３０ｍｉｎは投与後３０分を示し、左の白カラムは生理食塩水を投与した場合（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、右の黒カラムはヒト型ペプチドを投与した場合（ＡＱ２７Ｌ）を示す。47 shows the results of examining the secretion stimulating activity of the human-type peptide shown in FIG. 46 on aldosterone (Aldosterone). Concentration on the vertical axis indicates the blood aldosterone concentration (ng / mi). Pre on the horizontal axis indicates before administration of the humanized peptide, 10 min indicates 10 minutes after administration, 30 min indicates 30 minutes after administration, the white column on the left indicates the case where saline was administered (Control), and the black column on the right. Indicates the case where the human peptide was administered (AQ27L). 図４６に示したヒト型ペプチドのアルドステロン分泌刺激活性の時間経過と濃度依存性を調べた結果を示す。縦軸のｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎは血中アルドステロンの濃度（ｎｇ／ｍｉ）を示す。横軸のＴｉｍｅ（ｍｉｎ）は投与後の時間（分）を示す。◆は生理食塩水（ｖｅｈｉｃｌｅ）を投与した場合、■はヒト型ペプチド４ｎｍｏｌ／ｋｇを投与した場合、▲はヒト型ペプチド４０ｎｍｏｌ／ｋｇを投与した場合、×はヒト型ペプチド４００ｎｍｏｌ／ｋｇを投与した場合を示す。47 shows the results of examining the time course and concentration dependency of the aldosterone secretion stimulating activity of the humanized peptide shown in FIG. 46. Concentration on the vertical axis indicates the blood aldosterone concentration (ng / mi). Time (min) on the horizontal axis indicates the time (minute) after administration. ◆ indicates administration of physiological saline (vehicle), Δ indicates administration of 4 nmol / kg of human peptide, ▲ indicates administration of 40 nmol / kg of human peptide, and × indicates administration of 400 nmol / kg of human peptide. Show the case.

Claims (69)

配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調節剤。 An adrenocortical hormone secretion regulator comprising a secreted protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof. 配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列が配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列である請求項１記載の剤。 The amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7. Agent. 部分ペプチドが、
（１）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第８０番目〜８８番目のアミノ酸配列または第１２７番目〜１３３番目のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチド、
（２）配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第１１６番目〜１２２番目のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチド、
（３）配列番号：５で表わされるアミノ酸配列の第１１６番目〜１２２番目のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチド、または
（４）配列番号：７で表わされるアミノ酸配列の第１２５番目〜１３１番目のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドである請求項１記載の剤。 The partial peptide is
(1) a peptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the 80th to 88th amino acid sequence or the 127th to 133rd amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(2) a peptide containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence at positions 116 to 122 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3,
(3) a peptide containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence at positions 116 to 122 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, or (4) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 The agent according to claim 1, which is a peptide having the same or substantially the same amino acid sequence as that of the 125th to 131st amino acids. 部分ペプチドが、
（１）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第９０番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第９１番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第９３番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１０４番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１０８番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１０９番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１１１番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１１５番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１１９番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１２４番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１２６番目〜１３３番目または第１２７番目〜１３３番目のアミノ酸配列からなるペプチド、
（２）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第９１番目〜１３３番目のアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端のグルタミン残基（Ｇｌｎ）がピログルタミン化されているペプチド、または
（３）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第９０番目〜１３３番目のアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端のアルギニン残基（Ａｒｇ）がチロシン残基（Ｔｙｒ）に置換されているペプチドである請求項１記載の剤。 The partial peptide is
(1) The 90th to 133rd amino acid sequence, the 91st to 133th amino acid sequence, the 93rd to 133th amino acid sequence, and the 104th to 133th amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Amino acid sequence, 108th-133th amino acid sequence, 109th-133rd amino acid sequence, 111th-133rd amino acid sequence, 115th-133rd amino acid sequence, 119th-133rd amino acid sequence An amino acid sequence, a peptide consisting of the amino acid sequence at positions 124 to 133, the amino acid sequence at positions 126 to 133, or the amino acid sequence at positions 127 to 133;
(2) a peptide in which the glutamine residue (Gln) at the N-terminus of the peptide consisting of the 91st to 133rd amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is pyroglutamined, or (3) SEQ ID NO: The peptide according to claim 1, wherein the N-terminal arginine residue (Arg) of the peptide consisting of the 90th to 133rd amino acid sequence of the amino acid sequence represented by 1 is replaced with a tyrosine residue (Tyr). Agent. 副腎皮質ホルモン分泌促進剤である請求項１記載の剤。 The agent according to claim 1, which is a corticosteroid secretagogue. 低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛みまたは肥満の予防・治療剤である請求項５記載の剤。 The agent according to claim 5, which is an agent for preventing or treating hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain or obesity. 配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調節剤。 An adrenocortical hormone secretion regulator comprising a secretory protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding a partial peptide thereof. 配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列が配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列である請求項７記載の剤。 The amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7. Agent. 部分ペプチドが、
（１）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第８０番目〜８８番目のアミノ酸配列または第１２７番目〜１３３番目のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチド、
（２）配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第１１６番目〜１２２番目のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチド、
（３）配列番号：５で表わされるアミノ酸配列の第１１６番目〜１２２番目のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチド、または
（４）配列番号：７で表わされるアミノ酸配列の第１２５番目〜１３１番目のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドである請求項７記載の剤。 The partial peptide is
(1) a peptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the 80th to 88th amino acid sequence or the 127th to 133rd amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(2) a peptide containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence at positions 116 to 122 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3,
(3) a peptide containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence at positions 116 to 122 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, or (4) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 The agent according to claim 7, which is a peptide containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the 125th to 131st amino acid sequences of the above. 部分ペプチドが、
（１）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第９０番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第９１番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第９３番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１０４番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１０８番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１０９番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１１１番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１１５番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１１９番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１２４番目〜１３３番目のアミノ酸配列、第１２６番目〜１３３番目または第１２７番目〜１３３番目のアミノ酸配列からなるペプチド、
（２）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第９１番目〜１３３番目のアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端のグルタミン残基（Ｇｌｎ）がピログルタミン化されているペプチド、または
（３）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第９０番目〜１３３番目のアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端のアルギニン残基（Ａｒｇ）がチロシン残基（Ｔｙｒ）に置換されているペプチドである請求項７記載の剤。 The partial peptide is
(1) The 90th to 133rd amino acid sequence, the 91st to 133th amino acid sequence, the 93rd to 133th amino acid sequence, and the 104th to 133th amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Amino acid sequence, 108th-133th amino acid sequence, 109th-133rd amino acid sequence, 111th-133rd amino acid sequence, 115th-133rd amino acid sequence, 119th-133rd amino acid sequence An amino acid sequence, a peptide consisting of the amino acid sequence at positions 124 to 133, the amino acid sequence at positions 126 to 133, or the amino acid sequence at positions 127 to 133;
(2) a peptide in which the glutamine residue (Gln) at the N-terminus of the peptide consisting of the 91st to 133rd amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is pyroglutamined, or (3) SEQ ID NO: 8. The peptide according to claim 7, wherein the N-terminal arginine residue (Arg) of the peptide consisting of the 90th to 133rd amino acid sequence of the amino acid sequence represented by 1 is replaced with a tyrosine residue (Tyr). Agent. 副腎皮質ホルモン分泌促進剤である請求項７記載の剤。 The agent according to claim 7, which is a corticosteroid secretagogue. 低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛みまたは肥満の予防・治療剤である請求項１１記載の剤。 The agent according to claim 11, which is an agent for preventing or treating hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain or obesity. 配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有してなる低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛み、肥満、クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の診断剤。 Hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or hyposecretion, comprising a polynucleotide encoding a secretory protein or a partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Chronic adrenal insufficiency, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain, obesity, Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, Diagnostic agent for congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, gastric / duodenal ulcer or irritable bowel syndrome. 配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調節剤。 Adrenocortical hormone secretion regulator comprising an antibody to a secreted protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof . 副腎皮質ホルモン分泌阻害剤である請求項１４記載の剤。 The agent according to claim 14, which is a corticosteroid secretion inhibitor. クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の予防・治療剤である請求項１５記載の剤。 Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia The agent according to claim 15, which is an agent for preventing or treating gastric / duodenal ulcer or irritable bowel syndrome. 配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体を含有してなる低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛み、肥満、クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の診断剤。 Secretion protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, an amide or an ester thereof, or a hypoaldosteronism or a hypocortisol comprising an antibody to a salt thereof Blood, secondary or chronic adrenal insufficiency, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain, obesity, Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, Diagnostic agent for primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, gastric / duodenal ulcer or irritable bowel syndrome. 配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調節剤。 Antisense comprising a base sequence complementary to a polynucleotide encoding a secretory protein or a partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a part thereof A corticosteroid secretion regulator comprising a polynucleotide. 副腎皮質ホルモン分泌阻害剤である請求項１８記載の剤。 19. The agent according to claim 18, which is a corticosteroid secretion inhibitor. クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の予防・治療剤である請求項１９記載の剤。 Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia The agent according to claim 19, which is an agent for preventing or treating gastric / duodenal ulcer or irritable bowel syndrome. 配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛み、肥満、クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の診断剤。 Antisense comprising a base sequence complementary to a polynucleotide encoding a secretory protein or a partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a part thereof Hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain, obesity, Cushing's disease, Cushing's syndrome, pituitary gland producing a polynucleotide comprising a polynucleotide Diagnostic agent for tumor, CRH producing tumor, aldosterone producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, gastric / duodenal ulcer or irritable bowel syndrome . 配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の機能を促進または阻害する化合物またはその塩を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調節剤。 Contains a secretory protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof, or a compound which promotes or inhibits the function of a salt thereof, or a salt thereof. A corticosteroid secretion regulator. 配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の機能を促進する化合物またはその塩を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌促進剤。 A secretory protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof, a compound promoting the function of a salt thereof, or a salt thereof. Is a corticosteroid secretagogue. 低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛みまたは肥満の予防・治療剤である請求項２３記載の剤。 24. The agent according to claim 23, which is an agent for preventing or treating hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain or obesity. 配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の機能を阻害する化合物またはその塩を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌阻害剤。 A secretory protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof or a compound inhibiting the function of a salt thereof, or a salt thereof. A corticosteroid secretion inhibitor. クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の予防・治療剤である請求項２５記載の剤。 Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia The agent according to claim 25, which is an agent for preventing or treating gastric / duodenal ulcer or irritable bowel syndrome. 配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の発現を促進または阻害する化合物またはその塩を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調節剤。 Contains a secretory protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof or a compound which promotes or inhibits the expression of a salt thereof, or a salt thereof A corticosteroid secretion regulator. 配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の発現を促進する化合物またはその塩を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌促進剤。 Containing a secretory protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof, a compound promoting the expression of a salt thereof, or a salt thereof. Is a corticosteroid secretagogue. 低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛みまたは肥満の予防・治療剤である請求項２８記載の剤。 29. The agent according to claim 28, which is an agent for preventing or treating hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain or obesity. 配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の発現を阻害する化合物またはその塩を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌阻害剤。 A secretory protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof, a compound inhibiting the expression of a salt thereof, or a salt thereof. A corticosteroid secretion inhibitor. クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の予防・治療剤である請求項３０記載の剤。 Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia 31. The agent according to claim 30, which is a prophylactic / therapeutic agent for gastric / duodenal ulcer or irritable bowel syndrome. 配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調節剤。 AQ27 receptor having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, a corticosteroid comprising a partial peptide thereof or a salt thereof Secretion regulator. 副腎皮質ホルモン分泌促進剤である請求項３２記載の剤。 33. The agent according to claim 32, which is a corticosteroid secretagogue. 低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛みまたは肥満の予防・治療剤である請求項３３記載の剤。 The agent according to claim 33, which is an agent for preventing or treating hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain or obesity. 配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調節剤。 An adrenal gland comprising a polynucleotide encoding an AQ27 receptor or a partial peptide thereof having an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 Cortical hormone secretion regulator. 副腎皮質ホルモン分泌促進剤である請求項３５記載の剤。 The agent according to claim 35, which is a corticosteroid secretagogue. 低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛みまたは肥満の予防・治療剤である請求項３６記載の剤。 37. The agent according to claim 36, which is a preventive or therapeutic agent for hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain or obesity. 配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有してなる低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛み、肥満、クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の診断剤。 A polynucleotide comprising an AQ27 receptor having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 or a polynucleotide encoding a partial peptide thereof Aldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain, obesity, Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone production Diagnostic agent for tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, gastric / duodenal ulcer or irritable bowel syndrome. 配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調節剤。 An adrenal gland comprising an antibody against an AQ27 receptor having an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, a partial peptide thereof, or a salt thereof Cortical hormone secretion regulator. 副腎皮質ホルモン分泌阻害剤である請求項３９記載の剤。 40. The agent according to claim 39, which is a corticosteroid secretion inhibitor. クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の予防・治療剤である請求項４０記載の剤。 Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia 41. The agent according to claim 40, which is an agent for preventing or treating gastric / duodenal ulcer or irritable bowel syndrome. 配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛み、肥満、クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の診断剤。 An AQ27 receptor having an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, a partial peptide thereof, or a low-molecular weight antibody comprising an antibody against a salt thereof. Aldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain, obesity, Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone production Diagnostic agent for tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, gastric / duodenal ulcer or irritable bowel syndrome. 配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調節剤。 A nucleotide sequence complementary to a polynucleotide encoding an AQ27 receptor or a partial peptide thereof containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, or SEQ ID NO: 13 Or a corticosteroid secretion regulator comprising an antisense polynucleotide comprising a part thereof. 副腎皮質ホルモン分泌阻害剤である請求項４３記載の剤。 44. The agent according to claim 43, which is a corticosteroid secretion inhibitor. クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の予防・治療剤である請求項４４記載の剤。 Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia The agent according to claim 44, which is an agent for preventing or treating gastric / duodenal ulcer or irritable bowel syndrome. 配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛み、肥満、クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の診断剤。 A nucleotide sequence complementary to a polynucleotide encoding an AQ27 receptor or a partial peptide thereof containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, or SEQ ID NO: 13 Or hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain, obesity, Cushing's disease containing an antisense polynucleotide comprising a part thereof , Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, stomach -A diagnostic agent for duodenal ulcer or irritable bowel syndrome. 配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩の機能を促進または阻害する化合物またはその塩を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調節剤。 A compound that promotes or inhibits the function of an AQ27 receptor, a partial peptide thereof or a salt thereof, containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13. Or a corticosteroid secretion regulator comprising a salt thereof. 配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩の機能を促進する化合物またはその塩を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌促進剤。 AQ27 receptor having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, a partial peptide thereof or a compound promoting the function of a salt thereof, or a compound thereof A corticosteroid secretagogue comprising a salt. 低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛みまたは肥満の予防・治療剤である請求項４８記載の剤。 49. The agent according to claim 48, which is an agent for preventing or treating hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain or obesity. 配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する化合物またはその塩を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌阻害剤。 A compound that inhibits the function of an AQ27 receptor, a partial peptide thereof or a salt thereof, which has the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, or a compound thereof A corticosteroid secretion inhibitor comprising a salt. クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の予防・治療剤である請求項５０記載の剤。 Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia The agent according to claim 50, which is an agent for preventing or treating gastric / duodenal ulcer or irritable bowel syndrome. 配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩の発現を促進または阻害する化合物またはその塩を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調節剤。 A compound that promotes or inhibits the expression of an AQ27 receptor, a partial peptide thereof or a salt thereof, containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, or SEQ ID NO: 13. Or a corticosteroid secretion regulator comprising a salt thereof. 配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩の発現を促進する化合物またはその塩を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌促進剤。 A compound that promotes the expression of an AQ27 receptor, a partial peptide thereof or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, or a compound thereof A corticosteroid secretagogue comprising a salt. 低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛みまたは肥満の予防・治療剤である請求項５３記載の剤。 54. The agent according to claim 53, which is a prophylactic or therapeutic agent for hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain or obesity. 配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩の発現を阻害する化合物またはその塩を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌阻害剤。 A compound that inhibits the expression of an AQ27 receptor, a partial peptide thereof, or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, or SEQ ID NO: 13, or a compound thereof A corticosteroid secretion inhibitor comprising a salt. クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の予防・治療剤である請求項５５記載の剤。 Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia The agent according to claim 55, which is an agent for preventing or treating gastric / duodenal ulcer or irritable bowel syndrome. （１）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩と（２）配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有してなる副腎皮質ホルモン分泌調節剤。 (1) a secretory protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, its partial peptide, its amide or its ester or its salt, and (2) SEQ ID NO: 9, sequence AQ27 receptor having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, a compound capable of changing the binding to a partial peptide or a salt thereof, or a salt thereof. Adrenocortical hormone secretion regulator. 配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩に対するアゴニストを含有してなる副腎皮質ホルモン分泌促進剤。 An adrenal gland comprising an AQ27 receptor having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, a partial peptide thereof, or an agonist for a salt thereof Cortical hormone secretagogue. 低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛みまたは肥満の予防・治療剤である請求項５８記載の剤。 59. The agent according to claim 58, which is an agent for preventing or treating hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain or obesity. 配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩に対するアンタゴニストを含有してなる副腎皮質ホルモン分泌阻害剤。 An adrenal gland comprising an AQ27 receptor having an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, a partial peptide thereof, or an antagonist to a salt thereof Cortical hormone secretion inhibitor. クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の予防・治療剤である請求項６０記載の剤。 Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia 61. The agent according to claim 60, which is an agent for preventing or treating gastric / duodenal ulcer or irritable bowel syndrome. 哺乳動物に対して、1)配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、2)配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド、3)配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の機能を促進する化合物またはその塩、4)配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の発現を促進する化合物またはその塩、5)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩、6)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド、7)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩の機能を促進する化合物またはその塩、8)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩の発現を促進する化合物またはその塩または9)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体またはその塩に対するアゴニストの有効量を投与することを特徴とする（ｉ）副腎皮質ホルモン分泌促進方法または（ii）低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛みまたは肥満の予防・治療方法。 For mammals, 1) secretory protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, its partial peptide, its amide or its ester or its salt, 2) SEQ ID NO: 1: a polynucleotide encoding a secretory protein or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by 1); 3) the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 A secretory protein containing the amino acid sequence of, a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof or a compound promoting the function of a salt thereof or a salt thereof, 4) the same as or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Secretory protein containing an amino acid sequence, its partial peptide, its amide or its amino acid Or a salt thereof that promotes the expression of ter or a salt thereof, 5) AQ27 receptor containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 Body, its partial peptide or its salt, 6) AQ27 receptor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, or its partial peptide 7) AQ27 receptor having an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, a partial peptide thereof, or a salt thereof Or a salt thereof which promotes the function of: 8) SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 An AQ27 receptor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence shown, a compound promoting the expression of a partial peptide thereof or a salt thereof or a salt thereof, or 9) SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or (I) a method for promoting secretion of adrenocortical hormone, which comprises administering an effective amount of an agonist to the AQ27 receptor or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13. Or (ii) a method for preventing or treating hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic hypoadrenocorticism, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain or obesity. 哺乳動物に対して、1)配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体、2)配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンスポリヌクレオチド、3)配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の機能を阻害する化合物またはその塩、4)配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の発現を阻害する化合物またはその塩、5)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、6)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンスポリヌクレオチド、7)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する化合物またはその塩、8)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩の発現を阻害する化合物またはその塩または9)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体またはその塩に対するアンタゴニストの有効量を投与することを特徴とする（ｉ）副腎皮質ホルモン分泌阻害方法または（ii）クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の予防・治療方法。 For mammals, 1) an antibody against a secreted protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof, 2) Antisense comprising a base sequence complementary to a polynucleotide encoding a secretory protein or a partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a part thereof A polynucleotide, 3) a secretory protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, a compound thereof which inhibits the function of an amide or an ester thereof, or a compound thereof. Salt, 4) identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 A compound inhibiting the expression of a secretory protein, a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof or a salt thereof, which contains the same amino acid sequence as in SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13. AQ27 receptor having an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented, an antibody against a partial peptide thereof or a salt thereof, 6) the amino acid represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 An antisense polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to a polynucleotide encoding the AQ27 receptor or a partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence or a partial peptide thereof, or 7) SEQ ID NO: : 9, the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13. Or an AQ27 receptor containing a substantially identical amino acid sequence, a compound thereof or a salt thereof which inhibits the function of a partial peptide or a salt thereof, or 8) SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13. AQ27 receptor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence, a compound inhibiting the expression of a partial peptide or a salt thereof or a salt thereof, or 9) SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: : (I) a method of inhibiting secretion of adrenocortical hormone or (i) comprising administering an effective amount of an antagonist to the AQ27 receptor or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by: ii) Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, Al Suteron-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance syndrome, congenital adrenal enzyme deficiency, stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, prevention and a method of treatment of gastric and duodenal ulcers or irritable bowel syndrome. （ｉ）副腎皮質ホルモン分泌促進剤または（ii）低アルドステロン症、低コルチゾール血症、続発性または慢性副腎皮質機能低下症、アジソン病、副腎機能不全、痛みまたは肥満の予防・治療剤を製造するための、1)配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、2)配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド、3)配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の機能を促進する化合物またはその塩、4)配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の発現を促進する化合物またはその塩、5)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩、6)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド、7)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩の機能を促進する化合物またはその塩、8)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩の発現を促進する化合物またはその塩または9)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体またはその塩に対するアゴニストの使用。 (I) producing a corticosteroid secretagogue or (ii) a prophylactic / therapeutic agent for hypoaldosteronism, hypocortisolemia, secondary or chronic adrenal insufficiency, Addison's disease, adrenal insufficiency, pain or obesity 1) a secretory protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, an amide thereof or an ester thereof or a salt thereof; A polynucleotide encoding a secretory protein or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the represented amino acid sequence; 3) an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Of secretory protein, partial peptide, amide or ester or salt thereof containing Or a salt thereof, 4) expression of a secretory protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof. A promoting compound or a salt thereof, 5) an AQ27 receptor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, a partial peptide thereof or A salt, 6) a polynucleotide encoding an AQ27 receptor or a partial peptide thereof comprising an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, 7 ) Also identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 Or an AQ27 receptor containing substantially the same amino acid sequence, a compound promoting the function of a partial peptide thereof or a salt thereof or a salt thereof; 8) represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 AQ27 receptor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence to be expressed, a compound that promotes the expression of a partial peptide or a salt thereof or a salt thereof, or 9) SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: : Use of an agonist for the AQ27 receptor or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by 13. （ｉ）副腎皮質ホルモン分泌阻害剤または（ii）クッシング病、クッシング症候群、副腎皮質刺激ホルモン産生下垂体腫瘍、ＣＲＨ産生腫瘍、アルドステロン産生腫瘍、アルドステロン症、原発性コルチゾール抵抗症、先天性副腎酵素欠乏症、ストレス、うつ病、神経性食欲不振症、不眠、胃・十二指腸潰瘍または過敏性腸症候群の予防・治療剤を製造するための、1)配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体、2)配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンスポリヌクレオチド、3)配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の機能を阻害する化合物またはその塩、4)配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の発現を阻害する化合物またはその塩、5)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、6)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンスポリヌクレオチド、7)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する化合物またはその塩、8)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩の発現を阻害する化合物またはその塩または9)配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体またはその塩に対するアンタゴニストの使用。 (I) a corticosteroid secretion inhibitor or (ii) Cushing's disease, Cushing's syndrome, adrenocorticotropic hormone-producing pituitary tumor, CRH-producing tumor, aldosterone-producing tumor, aldosteronism, primary cortisol resistance, congenital adrenal enzyme deficiency 1) the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 for the manufacture of a prophylactic / therapeutic agent for stress, depression, anorexia nervosa, insomnia, gastric / duodenal ulcer or irritable bowel syndrome An antibody against a secretory protein containing the same amino acid sequence, its partial peptide, its amide or its ester or its salt, 2) containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Nucleotide sequence complementary to polynucleotide encoding secretory protein or its partial peptide Or an antisense polynucleotide comprising a part thereof, 3) a secretory protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, an amide thereof or A compound inhibiting the function of an ester or a salt thereof or a salt thereof; 4) a secretory protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, an amide thereof or an ester thereof Or a compound that inhibits the expression of a salt thereof or a salt thereof. 5) AQ27 receptor containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 , An antibody against the partial peptide or a salt thereof, 6) SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or An antisequence comprising a base sequence complementary to a polynucleotide encoding the AQ27 receptor or a partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, or a part thereof Sense polynucleotide, 7) function of AQ27 receptor having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, its partial peptide or its salt 8) AQ27 receptor having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, a partial peptide thereof or A compound inhibiting the expression of a salt thereof or a salt thereof or 9) SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 Other SEQ ID NO: AQ27 receptor comprising an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by 13 or use of an antagonist to a salt thereof. （ｉ）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩および（または）配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする副腎皮質ホルモン分泌調節薬のスクリーニング方法。 (I) a secreted protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, its partial peptide, its amide or its ester or its salt, and / or SEQ ID NO: 9, sequence No. 11 or an AQ27 receptor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, a partial peptide thereof or a salt thereof. Screening method. （ｉ）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する分泌蛋白質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩および（または）配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体、その部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする副腎皮質ホルモン分泌調節薬のスクリーニング用キット。 (I) a secreted protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, its partial peptide, its amide or its ester or its salt, and / or SEQ ID NO: 9, sequence No. 11 or an AQ27 receptor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, a partial peptide thereof or a salt thereof, which is a corticosteroid secretion regulator. Screening kit. 試験化合物を非哺乳動物に投与し、血中の副腎皮質ホルモンの濃度を測定することを特徴とする配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体またはその塩に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法。 Administering the test compound to a non-mammal and measuring the concentration of corticosteroids in the blood, which is identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 A method for screening for an agonist or antagonist for the AQ27 receptor or a salt thereof containing the same amino acid sequence as described above. 配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＡＱ２７受容体またはその塩を活性化する化合物またはその塩を非ヒト哺乳動物に投与した場合と、該ＡＱ２７受容体を活性化する化合物またはその塩および試験化合物を非ヒト哺乳動物に投与した場合における、血中の副腎皮質ホルモンの濃度を測定し、比較することを特徴とする該ＡＱ２７受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法。

A compound or salt thereof that activates the AQ27 receptor or a salt thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13 or a non-human mammal Measuring and comparing blood levels of corticosteroids when administered to an animal and when administered to a non-human mammal with a compound or salt thereof that activates the AQ27 receptor. A method for screening for an agonist or antagonist for the AQ27 receptor.

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