JP2004283144A - Method for producing glucosamine and n-acetylglucosamine - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
クロロウイルスを利用したグルコサミン及びＮ−アセチルグルコサミンの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、ＮＡＧと略記する）は、エビ、カニ等の甲殻類、カブトムシ、コオロギ等の昆虫類や真菌類の細胞壁に含まれており、キチンの構成単位として天然界に広く存在する単糖類の１種である。このＮＡＧは、ムコ多糖類の構成糖として存在するなど、生体内において重要な役割を果たしていることが知られており、また、その甘味度が砂糖の半分程度でさわやかな甘味を有していることなどから、食品への利用が期待されている物質の一つである。また、ＮＡＧの脱アセチル体であるグルコサミンは、変形性関節炎の治療あるいは予防を目的として、積極的に食品に利用しようとする試みがなされている。
【０００３】
従来、飲食品等に利用可能なＮＡＧやグルコサミンは、カニ、エビ、オキアミ等の甲殻類やイカの軟骨等に含まれるキチンを原料として酸や酵素による加水分解により製造されている。
【０００４】
例えば、下記特許文献１には、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとＮ−アセチルキトオリゴ糖の混合物であるキチンの酸加水分解物から、分離膜によりＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを選択的に取り出すことを特徴とする天然型Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの製造法が開示されている。
【０００５】
また、下記特許文献２には、非晶質キチン又は均一系部分脱アセチル化キチンを基質とし、低分子化酵素でこの非晶質キチン又は均一系部分脱アセチル化キチンを低分子に加水分解すると共に、単糖化酵素で前記低分子からＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを遊離させることを特徴とする、非晶質キチン類を基質とする酵素によるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの製造方法が開示されている。
【０００６】
【特許文献１】
特開２０００−２８１６９６号公報
【特許文献２】
特開２００１−７８７９５号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、海洋汚染等による海洋環境及び生態系の変化、欧米や日本における漁獲できる総量を定めるＴＡＣ（漁獲可能量）制度の導入、東南アジアやアフリカにおける乱獲を防ぐための制度の整備、ロシア海域（オホーツク海）でカニの取りすぎによる資源の枯渇、内分泌かく乱物質による水産資源の汚染等の様々な理由により、グルコサミンやＮＡＧの原料として用いられてきたカニやエビ等の甲殻類由来の天然キチンの確保が今後難しくなることが予想され、グルコサミンやＮＡＧの工業レベルでの製造は不安定な状態に陥る可能性がでてきた。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、飲食品等に利用可能なグルコサミン及びＮＡＧを、グルコース等の安価な原料を用いて発酵法によって効率的に製造する方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究した結果、クロロウイルスがグルコサミン合成に関わる遺伝子を有しており、このウイルスに感染したクロレラ細胞を培養することにより、該細胞内にグルコサミンやＮＡＧが生成されることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明の一つは、クロロウイルスに感染したクロレラ細胞を培養して得られる培養物からグルコサミン及びＮ−アセチルグルコサミンを回収することを特徴とするグルコサミン及びＮ−アセチルグルコサミンの製造方法を提供するものである。
【００１１】
上記製造方法によれば、クロレラ細胞にクロロウイルスが感染することにより、ウイルス由来のグルタミン・フルクトース−６−リン酸トランスアミナーゼが発現される。この酵素は、フルクトース−６−リン酸にグルタミンを転移してグルコサミン−６−リン酸を生成する酵素である。一方、クロレラ細胞の解糖系によってグルコースがフルクトース−６−リン酸に代謝され、このフルクトース−６−リン酸に、上記グルタミン・フルクトース−６−リン酸トランスアミナーゼによってグルタミンが転移されてグルコサミン−６−リン酸が生成される。このグルコサミン−６−リン酸は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ生成経路の中間体であり、クロレラ細胞の別の代謝系によって、グルコサミンやＮＡＧに変換される。
【００１２】
したがって、クロロウイルスに感染したクロレラ細胞を培地で培養することにより、該クロレラ細胞にグルコサミン及びＮＡＧを生成させることができ、該クロレラ細胞の培養物から容易にグルコサミン及びＮＡＧを得ることができる。
【００１３】
また、本発明のもう一つは、クロロウイルス由来のグルタミン・フルクトース−６−リン酸トランスアミナーゼ遺伝子を導入した組み換え大腸菌を培養して得られる培養物からグルコサミン及びＮ−アセチルグルコサミンを回収することを特徴とするグルコサミン及びＮ−アセチルグルコサミンの製造方法を提供するものである。
【００１４】
上記製造方法によれば、組み換え大腸菌内に発現したグルタミン・フルクトース−６−リン酸トランスアミナーゼによって、該大腸菌の解糖系の中間代謝物であるフルクトース−６−リン酸にグルタミンが転移されてグルコサミン−６−リン酸が生成され、他の代謝系によってグルコサミンやＮＡＧに変換される。
【００１５】
したがって、クロロウイルス由来のグルタミン・フルクトース−６−リン酸トランスアミナーゼ遺伝子を導入した組み換え大腸菌を培地で培養することにより、該大腸菌にグルコサミン及びＮＡＧを生成させることができ、該組み換え大腸菌の培養物から容易にグルコサミン及びＮＡＧを得ることができる。また、溶菌することがないので、安定してグルコサミン及びＮＡＧを生成させることができる。
【００１６】
上記グルコサミン及びＮ−アセチルグルコサミンの製造方法においては、前記クロロウイルスとして、クロロウイルスＣＶＫ２を用いることが好ましい。
【００１７】
これによれば、クロロウイルスＣＶＫ２由来のグルタミン・フルクトース−６−リン酸トランスアミナーゼは、宿主細胞内で抑制制御がかからないため、効率よくグルコサミン及びＮＡＧを製造することができる。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明で用いられるクロロウイルス（クロレラウイルスとも言われる）は、分類学上はＰｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｉｄａｅ科Ｐｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｕｓ属に属し、一部の単細胞緑藻類クロレラに感染して増殖するウイルスである。
【００１９】
これまでに分かっているこのウイルスの特徴としては、（ｉ）直径１４０〜１９０ｎｍの巨大な正二十面体粒子であり（ショ糖密度勾配沈降係数２３００Ｓ）、主としてタンパク質（６４％）、ＤＮＡ（２５％）及び脂質（１０％）から成る、（ｉｉ）ウイルス粒子は５０種以上の構成タンパク質から成り、そのうち主要タンパク質Ｖｐ５４（Ｖｐ５２）が約４０％を占める、（ｉｉｉ）ウイルスゲノムは巨大なｄｓＤＮＡ（３３０〜３８０ｋｂｐ）であり、特殊なヘアピン末端構造を有する、（ｉｖ）ウイルスゲノムには７００個以上の遺伝子読み取り枠（ＯＲＦ）があり、その多くが感染サイクル中に発現している、（ｖ）自然界の淡水中に広く分布している、ことなどが挙げられる（Ｙａｍａｄａ Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ５７， ３４３３−３４３７， １９９１；Ｙａｍａｄａ Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ５７， ７３３−７３９， １９９３）。
【００２０】
本発明においては、グルタミン・フルクトース−６−リン酸トランスアミナーゼ（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ、以下、ＧＦＡＴと略記する）遺伝子を有しているクロロウイルスであれば特に制限なく用いることができる。なお、ＧＦＡＴは、フルクトース−６−リン酸にグルタミンを転移して、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ生成経路の中間体であるグルコサミン−６−リン酸を生成する酵素である。
【００２１】
クロロウイルスは、上記のように自然淡水中に広く存在することが知られており、本発明で用いられるクロロウイルスも、河川や湖沼水等の自然淡水中からプラークアッセイ法によりスクリーニングすることができる。
【００２２】
すなわち、サンプリングした河川や湖沼水を、メンブランフィルター（０．４５μｍ）で除菌処理して試料水を調製する。
【００２３】
そして、ＭＢＢＭ培地（硝酸ナトリウム０．０２５％、塩化カルシウム０．００２５％、硫酸マグネシウム０．００７５％、リン酸１カリウム０．０１７５％、リン酸２カリウム０．００７５％、食塩０．００２５％、ペプトン０．１％、ショ糖０．５％、ｐＨ６．５）等の公知の培地を用いて、常法に従って培養したクロレラ細胞培養液と上記試料水とＭＢＢＭ軟寒天培地（寒天０．７５％）とを混合し、これをＭＢＢＭ寒天培地（寒天１．５％）に重層した後、光照射下（白色光３０００〜５０００ルックス）、１８〜３０℃で２〜４日間培養する。形成されたプラークを爪楊枝でつついて、新しいクロレラ細胞培養液に接種して６〜８時間培養した後、遠心分離によりクロロウイルスを沈殿として回収する。
【００２４】
次いで、常法に従って培養したクロレラ細胞培養液に回収したクロロウイルスを接種して、所定時間（通常、３〜４時間）培養した後、遠心分離によりクロレラ細胞を回収して、適当な緩衝液中で破砕し、ホモジネートを調製する。このホモジネートを常法に従って糖組成分析を行い、グルコサミン及びＮＡＧが含まれているサンプルのクロロウイルスを選択すればよい。
【００２５】
本発明においては、上記のような方法で自然淡水中からスクリーニングされたクロロウイルスである、クロロウイルスＣＶＫ２が特に好ましく用いられる。
【００２６】
クロロウイルスＣＶＫ２は、Ｐｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｉｄａｅ科Ｐｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｕｓ属に属し、ゲノム（３３０〜３８０ｋｂｐの直鎖状ｄｓＤＮＡ）上に、約１．８ｋｂｐのＧＦＡＴ遺伝子（Ａ１００Ｒ）を有している。なお、クロロウイルスＣＶＫ２は、特許法施行規則第２７条の３の規定に準じて、出願人がその分譲を保証するものである。
【００２７】
本発明で用いられるクロレラ細胞としては、一般に入手可能なクロレラ株であれば特に制限されないが、具体的には、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ． ＮＣ６４Ａ（ＡＴＣＣ ３０５６２）、Ｃ． ｐｒｏｔｏｔｅｃｈｏｉｄｅｓ ｋｒｕｇｅｒ（ＡＴＣＣ ３０４２０）等が例示できる。
【００２８】
以下、本発明のグルコサミン及びＮＡＧの製造方法について更に詳細に説明する。
【００２９】
まず、本発明のグルコサミン及びＮＡＧの製造方法の一つは、クロロウイルスに感染したクロレラ細胞を培養して得られる培養物からグルコサミン及びＮＡＧを回収することを特徴とするものである。
【００３０】
クロレラ細胞の培養は公知の方法に従って行うことができる。例えば、クロレラ細胞の前培養液を、炭素、窒素及びリン酸塩の同化できる供給源を含む培地、例えば、ＭＢＢＭ培地等の公知の培地に添加して、光照射下（好ましくは白色光３０００〜５０００ルックス）、１８〜３０℃で培養して得られるクロレラ細胞培養液（１０７〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）に、クロロウイルスをｍｏｉ １〜１０（細胞あたりのウイルス数）となるように添加してウイルスを感染させた後、上記と同様の条件で１〜１２０時間培養し、遠心分離等の適当な手段により、クロレラ細胞を回収する。
【００３１】
回収したクロレラ細胞を適当な緩衝液に懸濁し、超音波処理等で破砕した後、遠心分離してその上清（ホモジネート）を回収する。回収したホモジネートからタンパク質を除去した後、グルコサミン及びＮＡＧを結晶化させて回収する。なお、上記ホモジネートからタンパク質を除去する方法は特に制限されないが、処理効率の点から限外濾過膜（例えば、商品名「ＮＴＵ−３２５０」（日東電工株式会社製）等）を用いることが好ましい。すなわち、限外濾過膜の透過液を回収して濃縮し、グルコサミン及びＮＡＧを結晶化させて回収すればよい。
【００３２】
そして、回収したグルコサミン及びＮＡＧの混合物を脱イオン水に溶解して、強酸性イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーに供することにより、ＮＡＧとグルコサミンを分離精製することができる。
【００３３】
この方法によれば、クロレラ細胞にクロロウイルスが感染することにより、該クロレラ細胞内にクロロウイルス由来のＧＦＡＴが発現され、このＧＦＡＴによってクロレラ細胞の解糖系の中間代謝物であるフルクトース−６−リン酸にグルタミンが転移されてグルコサミン−６−リン酸が生成される。このクルコサミン−６−リン酸は、更にクロレラ細胞の別の代謝系によってグルコサミンやＮＡＧに変換される。したがって、クロロウイルスがクロレラ細胞に感染、増殖して溶菌するまでの間にグルコサミンやＮＡＧを生成させることができる。
【００３４】
また、本発明のグルコサミン及びＮＡＧの製造方法のもう一つは、クロロウイルス由来のＧＦＡＴ遺伝子を導入した組み換え大腸菌を培養して得られる培養物からグルコサミン及びＮＡＧを回収することを特徴とするものである。
【００３５】
上記ＧＦＡＴ遺伝子を導入した組み換え大腸菌（形質転換体）は、例えば、以下のようにして作製することができる。
【００３６】
ＧＦＡＴ遺伝子を有するクロロウイルス、好ましくはクロロウイルスＣＶＫ２のゲノムから、ＰＣＲ法によりＧＦＡＴ遺伝子をクローニングする。例えば、ゾウリムシ共生藻ウイルスＰＢＣＶ−１のゲノム情報（ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ ＤＤＢＪ ｄａｔａｂａｓｅｓ，Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＣ ０００８５２）等に基づいて、ＧＦＡＴのコード領域を完全に含む形でクローニングできるように設計・作製したプライマーを用いて、常法に従ってＰＣＲを行うことによりＧＦＡＴ遺伝子をクローニングすることができる。なお、上記プライマーは、クローニングされたＧＦＡＴ遺伝子の両端に、該遺伝子を組み込む発現ベクターに適応した制限酵素配列が形成されるように設計することが好ましい。
【００３７】
クローニングしたＧＦＡＴ遺伝子は、常法に従ってリガーゼを用いて適当な大腸菌ベクター（発現ベクター）に連結して大腸菌に導入することにより、目的の形質転換体を得ることができる。
【００３８】
上記大腸菌ベクターとしては、具体的には、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３、ｐＧＥＸ−４Ｔ−２（いずれもアマシャムバイオサイエンス株式会社製）等が例示できる。また、大腸菌としては、具体的には、ＢＬ２１、ＴＧ１、ＤＨ５α等が例示できる。なお、これらの大腸菌は、アマシャムバイオサイエンス株式会社、ＣｉｎｎａＧｅｎ Ｉｎｃ．， Ｉｒａｎ等から入手することができる。
【００３９】
上記のようにして得られた大腸菌（形質転換体）の前培養液を、炭素、窒素及びリン酸塩の同化できる供給源を含む培地、例えば、ＬＢ培地、２×ＹＴ培地等の公知の培地に接種し、３０〜３７℃で１〜３日間培養した後、遠心分離等の適当な手段により、菌体を回収する。なお、ＧＦＡＴ遺伝子の発現に何らかの誘導（例えば、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−１−ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）等による誘導）が必要な場合は、培養期間中の適当な時期に行えばよい。
【００４０】
回収した菌体を適当な緩衝液に懸濁し、フレンチプレス細胞破砕機等を用いて破砕した後、遠心分離してその上清（ホモジネート）を回収する。回収したホモジネートから、上記と同様にしてタンパク質を除去した後、グルコサミン及びＮＡＧを結晶化させて、強酸性イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーに供し、ＮＡＧとグルコサミンを分離精製すればよい。
【００４１】
この方法によれば、上記大腸菌（形質転換体）内に、クロロウイルス由来のＧＦＡＴが発現され、このＧＦＡＴによって大腸菌の解糖系の中間代謝物であるフルクトース−６−リン酸にグルタミンが転移されてグルコサミン−６−リン酸が生成される。このクルコサミン−６−リン酸は、更に大腸菌の別の代謝系によってグルコサミンやＮＡＧに変換される。したがって、上記上記大腸菌（形質転換体）を培養することにより、効率よくグルコサミン及びＮＡＧを生成させることができる。また、クロロウイルスが感染したクロレラ細胞を用いる場合とは異なり、溶菌することがないので、安定してグルコサミン及びＮＡＧを生成させることができる。
【００４２】
【実施例】
実施例１ クロロウイルスのスクリーニング
各地の湖沼、河川から採取したの水を、メンブランフィルター（０．４５μｍ）で除菌処理した後、これらの水（試料水）から、プラークアッセイ法によってＧＦＡＴ遺伝子を有するクロロウイルスをスクリーニングした。
【００４３】
すなわち、ＭＢＢＭ寒天培地（硝酸ナトリウム０．０２５％、塩化カルシウム０．００２５％、硫酸マグネシウム０．００７５％、リン酸１カリウム０．０１７５％、リン酸２カリウム０．００７５％、食塩０．００２５％、ペプトン０．１％、ショ糖０．５％、寒天１．５％、ｐＨ６．５）に、培養クロレラ細胞（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ． ＮＣ６４Ａ、ＡＴＣＣ３０５６２）１０７ｃｅｌｌｓと、上記各試料水（１００μｌ）、０．７５％ＭＢＢＭ軟寒天培地の混合液を重層した後、光照射下（白色光３０００〜５０００ルックス）２５℃で２〜４日間培養した。そして、形成されたプラークを爪楊枝でつつき、それぞれ培養クロレラ細胞液にウイルスを接種して６〜８時間培養した後、溶菌液を遠心分離し、沈殿としてウイルスを回収した。
【００４４】
このようにして分離された各クロロウイルスを、ＭＢＢＭ培地で培養したクロレラ細胞培養液に接種して３〜４時間培養した後、遠心分離によりクロレラ細胞を回収した。このクロレラ細胞を０．１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）に懸濁し、低温下で超音波（２０ｋＨｚ）で１５分間処理して細胞壁を破壊した後、遠心分離（１０，０００×ｇ、２０分）を行い、上清（ホモジネート）を回収した。そして、以下の方法で該ホモジネート中の糖組成を分析してグルコサミン及びＮＡＧが生成されているサンプルをスクリーニングした結果、クロロウイルスＣＶＫ２が得られた。
【００４５】
（分析方法）
ホモジネートを、ＡＢＥＥ（４−アミノ安息香酸エチルエステル）糖組成分析キット（株式会社ホーネンコーポレーション製）により標識後、ホーネンパックＣ１８カラム（株式会社ホーネンコーポレーション製）を用いてＨＰＬＣ分析した。
・ＨＰＬＣカラム：ホーネンパックＣ１８カラム（７５ｍｍ×４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．）
・溶媒Ａ：０．０２％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル（９０／１０）
溶媒Ｂ：０．０２％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル（５０／５０）
・プログラム：溶媒Ａで３０分間の分析後、溶媒Ｂに切り替えて５分間洗浄。
再び溶媒Ａに切り替えて１５分間平衡化する。
・流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
・カラム温度：４５℃
・検出器：蛍光（Ｅｘ． ３０５ｎｍ、Ｅｍ． ３６０ｎｍ）
実施例２
クロレラ株（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ． ＮＣ６４Ａ、ＡＴＣＣ３０５６２）を、ＭＢＢＭ培地で光照射下（白色光３０００〜５０００ルックス）、２５℃で対数増殖期後期（１０７〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）まで培養した（増殖速度（倍加時間）約６時間）。
【００４６】
得られた培養液に、ｍｏｉ １〜１０（細胞あたりのウイルス数）の条件でクロロウイルスＣＶＫ２を感染させ、経時的に培養液をサンプリングした。サンプリングしたクロレラ細胞から常法に従ってＲＮＡを回収し、ＧＦＡＴ遺伝子から調製したＤＮＡ断片をプローブとしてノーザンブロット（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ）法によってＧＦＡＴの遺伝子発現を調べた。その結果、ＧＦＡＴ遺伝子は感染後２０分より発現し、４０〜６０分でピークに達することが判明した。
【００４７】
これらの結果に基づいて、クロレラ細胞（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ． ＮＣ６４Ａ、ＡＴＣＣ３０５６２）を、ＭＢＢＭ培地で培養したクロレラ細胞培養液１Ｌ（１０７〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）に、クロロウイルスＣＶＫ２をｍｏｉ １〜１０程度で感染させ、感染後３〜４時間で遠心分離によりクロレラ細胞を回収した。実施例１と同様にしてクロレラ細胞のホモジネートを調製して糖組成分析を行い、グルコサミン及びＮＡＧが生成されていることを確認した。
【００４８】
そして、ホモジネートを、限外濾過膜（商品名「ＮＴＵ−３２５０」（日東電工株式会社製）を用いて膜処理を行い、透過液を回収して濃縮し、グルコサミン及びＮＡＧを結晶化させて回収した。得られたグルコサミン及びＮＡＧの混合物を脱イオン水に溶解して、強酸性イオン交換樹脂（商品名「アンバーライト ＣＲ１３２０ Ｃａ（Ｈ＋型）」（ローム＆ハースジャパン株式会社製））を充填したカラムに供し、カラムの３倍容量の脱イオン水を流してＮＡＧを含む素通り画分を回収した後、１Ｎ塩酸をカラムの５倍容量流して、グルコサミンを溶出して回収した。そして、各画分を加熱減圧濃縮して結晶化を行い、ＮＡＧ及びグルコサミンをそれぞれ分離精製した。
【００４９】
実施例３
ｉ）クロロウイルスＣＶＫ２のＧＦＡＴ遺伝子（Ａ１００Ｒ）のクローニング
ゾウリムシ共生藻ウイルスＰＢＣＶ−１のゲノム情報（ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ ＤＤＢＪ ｄａｔａｂａｓｅｓ，Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＣ ０００８５２）に基づいてＧＦＡＴのコード領域を完全に含む形でクローニングできるように配列番号１、２に示すプライマーを作製した。なお、配列番号１に示すプライマー（センスプライマー）は、制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位（３〜８番目の塩基配列）を有しており、配列番号２に示すプライマー（アンチセンスプライマー）は、制限酵素ＳｍａＩ認識部位（３〜８番目の塩基配列）を有している。したがって、これらのプライマーを用いてＰＣＲによって増幅されるＧＦＡＴ遺伝子断片の両末端には、ＢａｍＨＩの認識部位とＳｍａＩの認識部位が形成されている。
【００５０】
これらのプライマーを用いクロロウイルスＣＶＫ２のＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ反応（６２℃アニーリング、２８サイクル）を行ったところ、約１．８ｋｂｐの生成物が得られた。
【００５１】
ｉｉ）形質転換体の作製
上記ＰＣＲ生成物を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳｍａＩで処理してから、市販の大腸菌ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−３（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）のＢａｍＨＩ、ＳｍａＩサイトにインフレームで結合し、大腸菌ＢＬ２１株［Ｆ−， ｄｃｍ， ｏｍｐＴ， ｈｓｄＳ（ｒＢ−ｍＢ−）， ｇａｌλ（ＤＥ３）］（ＣｉｎｎａＧｅｎ Ｉｎｃ．， Ｉｒａｎ）に常法に従って導入して形質転換体を得た。
【００５２】
得られた形質転換体を、２×ＹＴ培地（Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ １．６％、Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｘｃｔ １．０％、ＮａＣｌ ０．５％、Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ ５０μｇ／ｍＬ）に接種し、３７℃で振とう培養し、この培養液を新しい２×ＹＴ培地に接種して約１．５時間培養した後（ＯＤ６００＝０．６〜１．０）、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるよう添加して、３７℃で３〜５時間培養し、ＧＦＡＴを誘導した。誘導後、菌体を回収して０．１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）に懸濁し、２０，０００ｐｓｉの条件下でフレンチプレス細胞破砕機に通過させ、破砕液を遠心分離（１０，０００×ｇ、２０分）して上清（ホモジネート）を回収した。このホモジネートを「Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ」カラム（商品名、アマシャムバイオサイエンス株式会社製）に供してＧＦＡＴを精製してＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、誘導をかけていないサンプルとの比較を行って目的タンパク質（ＧＦＡＴ）が発現していることを確認した。
【００５３】
ｉｉｉ）得られたＧＦＡＴの酵素活性の測定
ＧＦＡＴの酵素活性を、図１に示す原理に基づいて測定した（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２７５， ｐ．２１９８４−２１９８７ （２０００）、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２６６， ｐ．１０１４８−１０１５４ （１９９１）参照）。
【００５４】
具体的には、グルタミン（１０ｍＭ）、フルクトース−６−リン酸（１０ｍＭ）、ＡＰＡＤ（０．５ｍＭ）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（２０ｕｎｉｔ）、ＫＣｌ（５０ｍＭ）、ＫＨ２ＰＯ４（１００ｍＭ）を含む溶液（ｐＨ７．５）に、得られたＧＦＡＴ（ＧＳＴ−ＧＦＡＴ融合タンパク質）５００ｎｇを添加して３７℃で反応を行い、反応液の吸光度（ＯＤ３６５）を経時的に測定した。その結果を図２に示す。
【００５５】
図２から、経時的にＡＰＡＤＨが生成されていることが分かり、上記形質転換体から精製されたＧＦＡＴが酵素活性を有していることが分かる。
【００５６】
また、上記菌体のホモジネートを、実施例１と同様の方法で糖組成分析を行い、グルコサミン及びＮＡＧが生成されていることを確認した。そして、実施例２と同様にしてホモジネートを除タンパク処理した後、グルコサミン及びＮＡＧを結晶化して回収し、強酸性イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーに供してグルコサミンとＮＡＧをそれぞれ分離精製した。
【００５７】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば、クロロウイルスに感染したクロレラ細胞、又はクロロウイルス由来のＧＦＡＴ遺伝子を導入した組み換え大腸菌を培養することにより、該クロレラ細胞又は該組み換え大腸菌内に発現するＧＦＡＴ、及びクロレラ細胞や大腸菌の解糖系をはじめとする様々な代謝系の作用により、グルコサミン及びＮＡＧを生成させることができる。したがって、これらの培養物から容易にグルコサミン及びＮＡＧを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＧＦＡＴの酵素活性の測定原理の説明図である。
【図２】クロロウイルス由来のＧＦＡＴ遺伝子を導入した組み換え大腸菌から精製したＧＦＡＴの酵素活性を測定した結果を示す図である。
【配列表】
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing glucosamine and N-acetylglucosamine using chlorovirus.
[0002]
[Prior art]
N-acetylglucosamine (hereinafter abbreviated as NAG) is contained in the cell walls of crustaceans such as shrimp and crabs, insects such as beetles and crickets, and fungi, and widely exists in the natural world as a constituent unit of chitin. Is a kind of monosaccharide. This NAG is known to play an important role in living organisms, such as being present as a constituent sugar of mucopolysaccharides, and has a refreshing sweetness with a sweetness about half that of sugar. Therefore, it is one of the substances expected to be used for food. Glucosamine, which is a deacetylated form of NAG, has been actively used in foods for the purpose of treating or preventing osteoarthritis.
[0003]
2. Description of the Related Art Conventionally, NAG and glucosamine that can be used in foods and drinks have been produced by hydrolysis with acids and enzymes using chitin contained in crustaceans such as crab, shrimp and krill, and cartilage of squid and the like.
[0004]
For example, in Patent Document 1 below, N-acetyl-D-glucosamine is selectively extracted by a separation membrane from an acid hydrolyzate of chitin, which is a mixture of N-acetyl-D-glucosamine and N-acetylchitooligosaccharide. A method for producing natural N-acetyl-D-glucosamine, characterized by the above, is disclosed.
[0005]
Patent Document 2 below discloses that amorphous chitin or homogeneous partially deacetylated chitin is used as a substrate, and the amorphous chitin or homogeneous partially deacetylated chitin is hydrolyzed to a low molecule by a low molecular weight enzyme. In addition, a method for producing N-acetyl-D-glucosamine using an enzyme using amorphous chitin as a substrate, characterized by releasing N-acetyl-D-glucosamine from the low molecule with a monosaccharifying enzyme, is disclosed. ing.
[0006]
[Patent Document 1]
JP 2000-281696 A
[Patent Document 2]
JP 2001-78795 A
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
However, changes in the marine environment and ecosystem due to marine pollution, the introduction of a TAC (capable catch) system that determines the total amount of fish that can be caught in Europe, the United States, and Japan, the development of a system to prevent overfishing in Southeast Asia and Africa, the Russian waters (Okhotsk) Securing natural chitin derived from crustaceans such as crabs and shrimps, which has been used as a raw material for glucosamine and NAG, for various reasons such as depletion of resources due to excessive crab harvesting in the sea and contamination of marine resources by endocrine disruptors. Is expected to be difficult in the future, and the production of glucosamine and NAG at an industrial level may be unstable.
[0008]
Therefore, an object of the present invention is to provide a method for efficiently producing glucosamine and NAG that can be used in foods and drinks by a fermentation method using inexpensive raw materials such as glucose.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies to achieve the above object, and as a result, a chlorovirus has a gene involved in glucosamine synthesis, and by culturing chlorella cells infected with this virus, glucosamine or They found that NAG was generated, and completed the present invention based on this finding.
[0010]
That is, one aspect of the present invention provides a method for producing glucosamine and N-acetylglucosamine, comprising recovering glucosamine and N-acetylglucosamine from a culture obtained by culturing chlorella cells infected with a chlorovirus. To do.
[0011]
According to the above-mentioned production method, glutamine / fructose-6-phosphate transaminase derived from the virus is expressed by infecting chlorella cells with the chlorovirus. This enzyme is an enzyme that transfers glutamine to fructose-6-phosphate to generate glucosamine-6-phosphate. On the other hand, glucose is metabolized to fructose-6-phosphate by the glycolysis system of chlorella cells, and glutamine is transferred to this fructose-6-phosphate by the glutamine / fructose-6-phosphate transaminase to give glucosamine-6-phosphate. Phosphoric acid is produced. This glucosamine-6-phosphate is an intermediate in the UDP-GlcNAc production pathway, and is converted to glucosamine and NAG by another metabolic system of chlorella cells.
[0012]
Therefore, by culturing chlorella cells infected with a chlorovirus in a medium, glucosamine and NAG can be generated in the chlorella cells, and glucosamine and NAG can be easily obtained from the culture of the chlorella cells.
[0013]
Another feature of the present invention is that glucosamine and N-acetylglucosamine are recovered from a culture obtained by culturing a recombinant Escherichia coli transfected with a glutamine / fructose-6-phosphate transaminase gene derived from a chlorovirus. And a method for producing glucosamine and N-acetylglucosamine.
[0014]
According to the above production method, glutamine is transferred to fructose-6-phosphate, which is an intermediate metabolite of the glycolytic system of Escherichia coli, by glutamine-fructose-6-phosphate transaminase expressed in recombinant Escherichia coli. 6-phosphate is produced and converted to glucosamine and NAG by other metabolic systems.
[0015]
Therefore, by culturing in a medium a recombinant Escherichia coli transfected with a glutamine / fructose-6-phosphate transaminase gene derived from a chlorovirus, glucosamine and NAG can be produced in the Escherichia coli, and the recombinant Escherichia coli can be easily produced from the recombinant Escherichia coli culture. And glucosamine and NAG can be obtained. In addition, since there is no lysis, glucosamine and NAG can be generated stably.
[0016]
In the method for producing glucosamine and N-acetylglucosamine, it is preferable to use chlorovirus CVK2 as the chlorovirus.
[0017]
According to this, glutamine / fructose-6-phosphate transaminase derived from chlorovirus CVK2 is not regulated in host cells, so that glucosamine and NAG can be efficiently produced.
[0018]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The chlorovirus (also referred to as chlorella virus) used in the present invention belongs to the genus Phycodnaviridae in the genus Phycodnavirus from the taxonomic point of view, and is a virus that infects and proliferates a part of the unicellular green alga Chlorella.
[0019]
The characteristics of this virus known so far include: (i) giant icosahedral particles with a diameter of 140 to 190 nm (sucrose density gradient sedimentation coefficient 2300S), mainly proteins (64%) and DNA (25%). %) And lipids (10%), (ii) virus particles are composed of more than 50 constituent proteins, of which the major protein Vp54 (Vp52) accounts for about 40%, and (iii) the viral genome is a large dsDNA ( (Iv) the viral genome has more than 700 gene open reading frames (ORFs), many of which are expressed during the infection cycle, (v) Widely distributed in freshwater in nature (Yamada T. et al., Appl. E Microbiol., 57, 3433-3437, 1991; Yamada T. et al., Biosci. Biotech. Biochem., 57, 733-739, 1993).
[0020]
In the present invention, any chlorovirus having a glutamine-fructose-6-phosphate transaminase (glutamine-fructose-6-phosphate transaminase, hereinafter abbreviated as GFAT) gene can be used without particular limitation. GFAT is an enzyme that transfers glutamine to fructose-6-phosphate to generate glucosamine-6-phosphate, which is an intermediate in the UDP-GlcNAc production pathway.
[0021]
Chlorovirus is known to exist widely in natural freshwater as described above, and the chlorovirus used in the present invention can also be screened from natural freshwater such as rivers and lakes by plaque assay. .
[0022]
That is, the sampled river or lake water is sterilized by a membrane filter (0.45 μm) to prepare a sample water.
[0023]
And MBBM medium (sodium nitrate 0.025%, calcium chloride 0.0025%, magnesium sulfate 0.0075%, monopotassium phosphate 0.0175%, dipotassium phosphate 0.0075%, salt 0.0025%, Chlorella cell cultures cultured in a conventional manner using a known medium such as peptone 0.1%, sucrose 0.5%, pH 6.5), the above sample water, and MBBM soft agar medium (agar 0.75%) ) And layered on an MBBM agar medium (1.5% agar), and cultured under light irradiation (white light 3000-5000 lux) at 18-30 ° C for 2-4 days. The formed plaque is picked with a toothpick, inoculated into a fresh chlorella cell culture, cultured for 6 to 8 hours, and chlorovirus is recovered as a precipitate by centrifugation.
[0024]
Then, the recovered chlorovirus is inoculated into a chlorella cell culture cultivated according to a conventional method, cultured for a predetermined time (usually 3 to 4 hours), and then chlorella cells are recovered by centrifugation. And homogenate is prepared. The homogenate may be subjected to sugar composition analysis according to a conventional method, and a chlorovirus of a sample containing glucosamine and NAG may be selected.
[0025]
In the present invention, chlorovirus CVK2, which is a chlorovirus screened from natural freshwater by the method described above, is particularly preferably used.
[0026]
Chlorovirus CVK2 belongs to the genus Phycodnaviridae and belongs to the genus Phycodnavirus, and has a GFAT gene (A100R) of about 1.8 kbp on the genome (linear dsDNA of 330 to 380 kbp). The chlorovirus CVK2 is guaranteed by the applicant in accordance with the provisions of Article 27-3 of the Ordinance for Enforcement of the Patent Act.
[0027]
The chlorella cells used in the present invention are not particularly limited as long as they are generally available chlorella strains.Chlorella sp. NC64A (ATCC 30562),C. prototechoids kruger(ATCC 30420) and the like.
[0028]
Hereinafter, the method for producing glucosamine and NAG of the present invention will be described in more detail.
[0029]
First, one of the methods for producing glucosamine and NAG of the present invention is characterized in that glucosamine and NAG are recovered from a culture obtained by culturing chlorella cells infected with a chlorovirus.
[0030]
The chlorella cells can be cultured according to a known method. For example, a pre-culture solution of chlorella cells is added to a medium containing a source capable of assimilating carbon, nitrogen and phosphate, for example, a known medium such as MBBM medium, and under light irradiation (preferably, white light 3000 to 3000). Chlorella cell culture obtained by culturing at 18-30 ° C. (10,000 lux).7-108cells / ml), and the cells were infected with the virus by adding chlorovirus to moi 1 to 10 (the number of viruses per cell), followed by culturing for 1 to 120 hours under the same conditions as above, centrifugation, etc. Chlorella cells are recovered by an appropriate means.
[0031]
The collected chlorella cells are suspended in an appropriate buffer, disrupted by sonication or the like, and then centrifuged to recover the supernatant (homogenate). After removing the protein from the recovered homogenate, glucosamine and NAG are crystallized and recovered. The method for removing the protein from the homogenate is not particularly limited, but it is preferable to use an ultrafiltration membrane (for example, trade name “NTU-3250” (manufactured by Nitto Denko Corporation) or the like) from the viewpoint of processing efficiency. That is, the permeate from the ultrafiltration membrane may be collected and concentrated, and glucosamine and NAG may be crystallized and collected.
[0032]
Then, the recovered mixture of glucosamine and NAG is dissolved in deionized water and subjected to column chromatography using a strongly acidic ion exchange resin, whereby NAG and glucosamine can be separated and purified.
[0033]
According to this method, when a chlorovirus is infected to a chlorella cell, GFAT derived from the chlorovirus is expressed in the chlorella cell, and the GFAT causes fructose-6-, which is an intermediate metabolite of the glycolytic system of the chlorella cell. Glutamine is transferred to phosphoric acid to produce glucosamine-6-phosphate. This curcosamine-6-phosphate is further converted to glucosamine and NAG by another metabolic system of chlorella cells. Therefore, glucosamine and NAG can be generated before the chlorovirus infects, proliferates, and lyses chlorella cells.
[0034]
Another method of the present invention for producing glucosamine and NAG is characterized in that glucosamine and NAG are recovered from a culture obtained by culturing a recombinant Escherichia coli transfected with a GFAT gene derived from a chlorovirus. is there.
[0035]
The recombinant Escherichia coli (transformant) into which the GFAT gene has been introduced can be prepared, for example, as follows.
[0036]
The GFAT gene is cloned from the genome of the chlorovirus having the GFAT gene, preferably the chlorovirus CVK2, by PCR. For example, based on genomic information of paramecium symbiotic algae virus PBCV-1 (EMBL / GenBank DDBJ databases, Accession No. NC 000852), primers designed and prepared so that they can be cloned so as to completely contain the coding region of GFAT can be used. The GFAT gene can be cloned by performing PCR according to a conventional method. The primer is preferably designed so that a restriction enzyme sequence suitable for an expression vector incorporating the gene is formed at both ends of the cloned GFAT gene.
[0037]
The cloned GFAT gene can be ligated to an appropriate Escherichia coli vector (expression vector) using a ligase according to a conventional method, and introduced into Escherichia coli to obtain a desired transformant.
[0038]
Specific examples of the Escherichia coli vector include pGEX-4T-3 and pGEX-4T-2 (both manufactured by Amersham Biosciences). Specific examples of Escherichia coli include BL21, TG1, DH5α, and the like. These Escherichia coli were obtained from Amersham Bioscience Co., Ltd., CinaGen Inc. , Iran et al.
[0039]
The pre-culture solution of Escherichia coli (transformant) obtained as described above is used as a medium containing a source capable of assimilating carbon, nitrogen and phosphate, for example, a known medium such as LB medium and 2 × YT medium. After culturing at 30 to 37 ° C. for 1 to 3 days, the cells are recovered by an appropriate means such as centrifugation. If some induction (for example, induction by IPTG (isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside) or the like) is required for the expression of the GFAT gene, it may be performed at an appropriate time during the culture period.
[0040]
The collected cells are suspended in an appropriate buffer, crushed using a French press cell crusher or the like, and then centrifuged to recover the supernatant (homogenate). After removing the protein from the recovered homogenate in the same manner as described above, glucosamine and NAG are crystallized and subjected to column chromatography using a strongly acidic ion exchange resin to separate and purify NAG and glucosamine.
[0041]
According to this method, chlorovirus-derived GFAT is expressed in the Escherichia coli (transformant), and glutamine is transferred by this GFAT to fructose-6-phosphate, which is an intermediate metabolite of glycolysis of Escherichia coli. To produce glucosamine-6-phosphate. This curcosamine-6-phosphate is further converted to glucosamine and NAG by another metabolic system of Escherichia coli. Therefore, by culturing the above Escherichia coli (transformant), glucosamine and NAG can be efficiently produced. Unlike chlorella cells infected with a chlorovirus, the cells do not lyse, so that glucosamine and NAG can be produced stably.
[0042]
【Example】
Example 1 Chlorovirus Screening
Water collected from lakes, marshes, and rivers in various places was subjected to a sterilization treatment with a membrane filter (0.45 μm), and chloroviruses having the GFAT gene were screened from these waters (sample waters) by a plaque assay.
[0043]
That is, MBBM agar medium (sodium nitrate 0.025%, calcium chloride 0.0025%, magnesium sulfate 0.0075%, monopotassium phosphate 0.0175%, dipotassium phosphate 0.0075%, salt 0.0025% , Peptone 0.1%, sucrose 0.5%, agar 1.5%, pH 6.5) and cultured chlorella cells (Chlorella sp. NC64A, ATCC 30562) 107After a mixture of cells, the above sample water (100 μl), and a 0.75% MBBM soft agar medium was overlaid, the cells were cultured at 25 ° C. for 2 to 4 days under light irradiation (white light 3000 to 5000 lux). Then, the formed plaque was picked with a toothpick, and the cultured chlorella cell solution was inoculated with the virus and cultured for 6 to 8 hours. Then, the lysate was centrifuged to collect the virus as a precipitate.
[0044]
Each chlorovirus thus separated was inoculated into a chlorella cell culture solution cultured in MBBM medium, cultured for 3 to 4 hours, and then chlorella cells were collected by centrifugation. The chlorella cells were placed in 0.1 M KH2PO4/ K2HPO4(PH 7.5), treated with ultrasonic waves (20 kHz) at low temperature for 15 minutes to break the cell wall, centrifuged (10,000 × g, 20 minutes), and the supernatant (homogenate) was collected. Collected. Then, the saccharide composition in the homogenate was analyzed by the following method to screen a sample in which glucosamine and NAG were produced. As a result, chlorovirus CVK2 was obtained.
[0045]
(Analysis method)
The homogenate was labeled with an ABEE (4-aminobenzoic acid ethyl ester) sugar composition analysis kit (manufactured by HONEN CORPORATION), and then analyzed by HPLC using a HONENPACK C18 column (manufactured by HONEN CORPORATION).
-HPLC column: Honenpak C18 column (75 mm x 4.6 mm ID)
-Solvent A: 0.02% trifluoroacetic acid / acetonitrile (90/10)
Solvent B: 0.02% trifluoroacetic acid / acetonitrile (50/50)
Program: After analysis with solvent A for 30 minutes, switch to solvent B and wash for 5 minutes.
Switch to solvent A again and equilibrate for 15 minutes.
・ Flow rate: 1 mL / min
-Column temperature: 45 ° C
Detector: Fluorescence (Ex. 305 nm, Em. 360 nm)
Example 2
Chlorella strain (Chlorella sp. NC64A, ATCC 30562) at 25 ° C. in late logarithmic growth phase (10 ° C.) under light irradiation (white light 3000-5000 lux) in MBBM medium.7-108cells / mL) (growth rate (doubling time) about 6 hours).
[0046]
The obtained culture was infected with chlorovirus CVK2 under conditions of moi 1 to 10 (the number of viruses per cell), and the culture was sampled over time. RNA was collected from the sampled chlorella cells according to a conventional method, and the gene expression of GFAT was examined by a Northern Blot method using a DNA fragment prepared from the GFAT gene as a probe. As a result, it was found that the GFAT gene was expressed from 20 minutes after the infection, and reached a peak at 40 to 60 minutes.
[0047]
Based on these results, chlorella cells (Chlorella sp. NC64A, ATCC 30562) in 1 L of a chlorella cell culture (10 L) cultured in MBBM medium.7-108cells / mL) was infected with the chlorovirus CVK2 at a moi of about 1 to 10, and chlorella cells were collected by centrifugation 3 to 4 hours after the infection. A chlorella cell homogenate was prepared in the same manner as in Example 1 and sugar composition analysis was performed to confirm that glucosamine and NAG were produced.
[0048]
The homogenate is subjected to a membrane treatment using an ultrafiltration membrane (trade name “NTU-3250” (manufactured by Nitto Denko Corporation)), and the permeate is collected and concentrated, and glucosamine and NAG are crystallized and recovered. The obtained mixture of glucosamine and NAG was dissolved in deionized water, and a strongly acidic ion exchange resin (trade name “Amberlite CR1320 Ca (H+Type) (manufactured by Rohm & Haas Japan KK)), and flowing through 3 times the volume of deionized water to collect a flow-through fraction containing NAG. Glucosamine was eluted and recovered by volume flow. Each fraction was heated and concentrated under reduced pressure for crystallization, and NAG and glucosamine were separated and purified.
[0049]
Example 3
i) Cloning of GFAT gene (A100R) of chlorovirus CVK2
The primers shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 are prepared based on the genome information of the paramecium symbiotic alga virus PBCV-1 (EMBL / GenBank DDBJ databases, Accession No. NC 000852) so that the GFAT coding region can be completely cloned so as to completely contain the GFAT coding region. did. The primer (sense primer) shown in SEQ ID NO: 1 has a restriction enzyme BamHI recognition site (3rd to 8th base sequence), and the primer shown in SEQ ID NO: 2 (antisense primer) is a restriction enzyme SmaI. It has a recognition site (3rd to 8th base sequence). Therefore, a BamHI recognition site and a SmaI recognition site are formed at both ends of the GFAT gene fragment amplified by PCR using these primers.
[0050]
A PCR reaction (annealing at 62 ° C., 28 cycles) was performed using these primers and chlorovirus CVK2 DNA as a template. As a result, a product of about 1.8 kbp was obtained.
[0051]
ii) Preparation of transformant
The above PCR product was treated with the restriction enzymes BamHI and SmaI, and then bound in-frame to the BamHI and SmaI sites of a commercially available E. coli vector pGEX-4T-3 (manufactured by Amersham Biosciences), and the E. coli BL21 strain [F−, Dcm, ompT, hsdS (rB−mB−), Galλ (DE3)] (CinnaGen Inc., Iran) to obtain a transformant.
[0052]
The obtained transformant was inoculated into a 2 × YT medium (Polypeptone 1.6%, Yeast extractct 1.0%, NaCl 0.5%,
[0053]
iii) Measurement of the enzymatic activity of the obtained GFAT
The enzymatic activity of GFAT was measured based on the principle shown in FIG. 1 (Journal of Biological Chemistry, 275, p. 21984-21987 (2000), The Journal of Biological Chemistry, 266, p. 10148, p. 101148). ).
[0054]
Specifically, glutamine (10 mM), fructose-6-phosphate (10 mM), APAD (0.5 mM), glutamate dehydrogenase (20 units), KCl (50 mM), KH2PO4(100 mM) (pH 7.5), 500 ng of the obtained GFAT (GST-GFAT fusion protein) was added and reacted at 37 ° C., and the absorbance (OD365) Was measured over time. The result is shown in FIG.
[0055]
From FIG. 2, it can be seen that APADH is produced with time, and that GFAT purified from the above transformant has enzymatic activity.
[0056]
In addition, the homogenate of the above cells was subjected to sugar composition analysis in the same manner as in Example 1, and it was confirmed that glucosamine and NAG were produced. After the homogenate was deproteinized in the same manner as in Example 2, glucosamine and NAG were crystallized and recovered, and subjected to column chromatography using a strongly acidic ion exchange resin to separate and purify glucosamine and NAG, respectively.
[0057]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, by culturing chlorella cells infected with chlorovirus, or recombinant Escherichia coli transfected with a GFAT gene derived from chlorovirus, GFAT expressed in the chlorella cells or the recombinant Escherichia coli, Glucosamine and NAG can be produced by the action of various metabolic systems such as chlorella cells and glycolysis of Escherichia coli. Therefore, glucosamine and NAG can be easily obtained from these cultures.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram illustrating the principle of measuring the enzyme activity of GFAT.
FIG. 2 shows the results of measuring the enzyme activity of GFAT purified from recombinant Escherichia coli into which a GFAT gene derived from a chlorovirus was introduced.
[Sequence list]
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2003
- 2003-03-25 JP JP2003082524A patent/JP2004283144A/en active Pending
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| US8383368B2 (en) | 2005-07-19 | 2013-02-26 | Hokko Chemical Industry Co., Ltd. | Method for fermentative production of N-acetyl-D-glucosamine by microorganism |
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