【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、消化率を改善した動物用飼料、より詳細には、プロテアーゼ阻害剤を配合することによって消化率を改善した動物用飼料に関する。
【０００２】
【従来技術】
トウモロコシ・大豆粕飼料は家畜用飼料として世界中で広く使用されている。トウモロコシ・大豆粕飼料は消化性が非常に高い。しかしながら、非デンプン多糖含有量が通常１０％以上であるため、酵素を添加することにより、トウモロコシ・大豆粕飼料の消化率を高めることができる（非特許文献１）。
【０００３】
近年、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、フィターゼ及びプロテアーゼ等を含む市販の酵素製剤を使用することにより、複数種の動物用飼料中におけるデンプン、タンパク質、脂質、及び無機物の利用可能性を高めることができることが示されている（非特許文献２から６）。
【０００４】
上記の通り、飼料にセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ等を含む酵素混合物を添加することにより飼料の消化率が改善され、ブロイラーや産卵鶏の生産性が向上することが知られている。しかしながら、飼料用酵素製剤はプロテアーゼを含む各種酵素の混合物であり、精製された単一の酵素の効果については調べられていない。さらに、各種酵素の組み合わせと効果の関係についてもほとんど調べられていない。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｂａｃｈ Ｋｎｕｄｓｅｎ （１９９７） Ａｎｉｍａｌ Ｆｅｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ６７：３１９−３３８
【非特許文献２】
Ｃｌａｓｓｅｎ， ＨＬ． （１９９６） Ａｎｉｍａｌ Ｆｅｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ６２：２１−２７
【非特許文献３】
Ｍａｌａｔｈｉ， Ｖ ＆ Ｄｅｖｅｇｏｗｄａ Ｇ． （２００１） Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ８０：３０２−３０５
【非特許文献４】
Ｗｉｒｙａｗａｎ， ＫＧ ＆ Ｄｉｎｇｌｅ， ＪＧ． （１９９９） Ａｎｉｍａｌ Ｆｅｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ７６：１８５−１９３
【非特許文献５】
Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＲ ＆ Ｃｌａｓｓｅｎ， ＨＬ． （１９９３） Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ７２：１３７−１４３
【非特許文献６】
Ｃａｓｔａｎｔｏｎ， ＪＩＲ．， Ｆｌｏｒｅｓ， ＭＰ． ＆ Ｐｅｔｔｅｒｓｏｎ， Ｄ． （１９９７） Ａｎｉｍａｌ Ｆｅｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ６８：３６１−３６５
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、各種の酵素を含む飼料において、さらに消化率を改善した飼料を提供することを解決すべき課題とした。
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決することを鋭意検討した結果、酵素を含む飼料にプロテアーゼ阻害剤を配合することによって飼料の消化率を高めることができることを実証した。本発明はこの知見に基づいて完成したものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明によれば、飼料成分、少なくとも１種以上の酵素、及びプロテアーゼ阻害剤を含む動物用飼料が提供される。
好ましくは、飼料成分は大豆粕及び／又はトウモロコシである。
【０００９】
好ましくは、酵素は微生物由来の酵素混合物である。
好ましくは、酵素はセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、フィターゼ及びプロテアーゼから成る群から選ばれる少なくとも１種以上の酵素である。
【００１０】
好ましくは、プロテアーゼ阻害剤の配合により粗タンパク質の消化率が向上している。
好ましくは、プロテアーゼ阻害剤はロイペプチンである。
好ましくは、動物は、家畜、家禽、養殖魚介類又はペットである。
【００１１】
本発明の別の側面によれば、プロテアーゼ阻害剤から成る、飼料成分及び少なくとも１種以上の酵素を含む動物用飼料のための消化率改善剤が提供される。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明の動物用飼料は、飼料成分、少なくとも１種以上の酵素、及びプロテアーゼ阻害剤を含む飼料である。本発明者らの研究により、現在市販されている飼料用酵素剤からプロテアーゼを除けば消化率を更に改善して高めることができることが示唆されていた（Ｆｕａｄ， Ｓ．， 他、（２００３） Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ， ７４：２３−２９）。しかし、実際に市販されている飼料用酵素剤（酵素混合物）からプロテアーゼを除くことは困難である。そこで、本発明では、既に市販されている酵素剤の効果の改善を目的として、プロテアーゼ阻害剤の効果を検討した。
【００１３】
本明細書の実施例において使用したロイペプチンは放線菌由来のプロテアーゼ阻害剤である。セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、フィターゼ及びプロテアーゼを含む酵素混合物にロイペプチンを加え、トウモロコシ・大豆粕混合物のｉｎ ｖｉｔｒｏ消化率を調べたところ、粗タンパク質の消化率は向上した。市販の酵素剤であるデンマークのノボ社のＥｎｅｒｇｅｘ（現在は、ロッシュ社からロノザイムＶＰとして販売されている）にロイペプチンを添加した場合も同様の傾向が見られた。これらの結果から、プロテアーゼ阻害剤の添加は飼料の粗タンパク質消化率の向上に有効であることが分かる。
【００１４】
本発明で用いる飼料成分は、動物又は魚介類用の飼料として一般に使用されるものであればいずれでもよい。そのような飼料は、通常、とうもろこし、ふすま、米、麦、綿実粕、マイロ、大豆粕、生魚、冷凍魚、冷蔵魚、魚粉、脱脂米糠、油脂、アルファルファ、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、塩化ナトリウム、塩化コリン、各種ビタミン剤（ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＢ１ 、ビタミンＢ２ 、ビタミンＢ６ 、ビタミンＢ１２、パントテン酸カルシウム、ニコチン酸アミド、葉酸）、無機塩（硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸銅、硫酸亜鉛、ヨウ化カリウム、硫酸コバルト）等の一部又は全部を混合して調製される。
【００１５】
飼料中の主要な成分としては、
トウモロコシ、粉砕したトウモロコシ、トウモロコシ粉、トウモロコシ胚芽粗粉、マイロ、キビ、小麦、小麦粉、小麦胚芽粉、大麦、米、ライ麦、燕麦などの穀物類又は加工穀物類副製品；
米ヌカ、フスマ、麦ヌカなどの糟糠類、エンドウマメ種子、ピーナッツ粉、大豆粉などのマメ類、ジャガイモ粉などのイモ類；
大豆粕、脱脂大豆、綿実粕、菜種粕、ゴマ粕、落花生粕、ヒマワリ粕、サフラワー粕、ココヤシ粗粉などの植物性油粕等；
オオムギモルト、ビール粕、酒粕、グルタミン酸発酵粕、トウモロコシ発酵粕、コーングルテンフィード、コーンジャームミール、コンニャク飛粉などの製造粕類；
生魚、冷凍魚、冷蔵魚、魚粉、肉粉、肉骨粉、ミートミール、ミートボーンミール、血粉、フェザーミール、脱脂粉乳、乾燥ホエー、オキアミミール、カゼイン、ゼラチンなどの動物質材料；
ビール酵母などの酵母類；
トウモロコシデンプン、デキストリンなどの糖類；
アルファルファ、乾燥アルファルファ、牧草、各種リーフミール、大豆タンパク、小麦グルテン、トウモロコシツエインなどの植物性タンパク質；
結晶性セルロース、タルク、シリカ、白雲母、ゼオライト等の無機物質の微粉末；
炭酸カルシウムなどの無機カルシウム化合物；並びに
リン酸カルシウムなどの無機リン酸塩；
などを挙げることができる。飼料には、さらに必要に応じ、飼料には、畜産分野で許容されている他の添加物（例えば、他の抗生物質や殺菌剤、駆虫剤、抗酸化剤など）を飼料に配合することもできる。
【００１６】
上記の中でも、本発明で用いる飼料成分の特に好ましい例は、大豆粕及び／又はトウモロコシであり、最も好ましい例は、大豆粕とトウモロコシの混合物である。
【００１７】
本発明の動物用飼料には少なくとも１種以上の酵素が含まれている。本発明で用いる酵素としては、各種の炭水化物分解酵素を使用することができ、使用する酵素の種類や数は特に限定されない。例えば、セルロースを加水分解するセルラーゼ、ヘミセルロースを加水分解するヘミセルラーゼ、ペクチンを加水分解するペクチナーゼ、キシランを加水分解するキシラナーゼ、グルカンを加水分解するグルカナーゼ、及びフィターゼ、プロテアーゼなどが挙げられ、本発明においては、これらの少なくとも１種類以上、好ましくは少なくとも２種類以上、さらに好ましくは少なくとも３種類以上、最も好ましくはこれらの全ての混合物を使用することができる。酵素としては、微生物由来の酵素混合物を使用することができる。
【００１８】
酵素の添加量は特に限定されず、飼料の消化率の向上を達成できる程度に適量を飼料に対して添加することができる。一例としては、トウモロコシ・大豆粕混合飼料の場合には２５０ｍｇの飼料当たり、１０〜１００Ｕのセルラーゼ、０．１〜５Ｕのヘミセルラーゼ、５〜５０Ｕのペクチナーゼ、５〜５０Ｕのキシラナーゼ、０．１〜５Ｕのグルカナーゼ、及び０．１〜５Ｕのフィターゼを使用することができるが、酵素の使用量は適宜変更することができ、この範囲に限定されるものではない。
【００１９】
本発明の動物用飼料にはプロテアーゼ阻害剤が含まれている。本発明の飼料においては、プロテアーゼ阻害剤の配合により粗タンパク質の消化率が向上していることを特徴としている。本発明で用いるプロテアーゼ阻害剤の種類は特に限定されず、粗タンパク質の消化率を向上できる限り、任意のプロテアーゼ阻害剤を使用することができる。
【００２０】
本発明で用いるプロテアーゼ阻害剤としては、各種のプロテアーゼに対する阻害剤が挙げられ、例えば、セリンプロテアーゼ阻害剤、システインプロテアーゼ阻害剤、メタロプロテアーゼ阻害剤などが挙げられる。
【００２１】
ここで、セリンプロテアーゼ阻害剤としては、α１アンチトリプシン、アンチキモトリプシン、アンチトロンビン、α２アンチプラスミン、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター、膵臓分泌トリプシンインヒビター、ヒルジンなどの動物由来のセリンプロテアーゼ阻害剤、トリプシンインヒビター、サブチリシンインヒビター、ロイペプチン、キモスタチン、エラスタチナールなどの植物や微生物由来のセリンプロテアーゼ阻害剤、α２マクログロブリンやオボマクログロブリンなどの生物由来のセリンプロテアーゼ阻害剤、ベンズアミジン、アミノカプロン酸、トラネキサム酸、ペプチド性クロロメチンケトン体などが挙げられる。
【００２２】
システインプロテアーゼ阻害剤としては、ステフィン、シスタチンやキニノーゲンなどの生物由来のものがあげられる。
また、メタロプロテアーゼ阻害剤としては、ＥＤＴＡ、フェナンスロリン、ＤＴＰＡなどの金属キレート剤、α２マクログロブリン、オボマクログロブリン、コラゲナーゼインヒビター（ＴＩＭＰ）などの生物由来のメタロプロテアーゼ阻害剤があげられる。
【００２３】
さらに、セリンプロテアーゼ及びシステインプロテアーゼの両方の阻害剤としては、ロイペプチンが挙げられる。
本発明では、上記に例示したプロテアーゼの一種又は二種以上の混合物を使用することができる。
上記したプロテアーゼ阻害剤は、飼料成分及び少なくとも１種以上の酵素を含む動物用飼料のための消化率改善剤として使用することができる。
【００２４】
本明細書で言う動物とは、ヒトを含めて最も広義に解釈されるものであり、例えば、家畜、家禽、養殖魚介類又はペットなどが挙げられる。
より具体的には、豚、牛、馬、ヤギ、鹿、ウサギ、ミンク、羊、山羊等の家畜類、ニワトリ（ブロイラー、採卵鶏の両方を含む）、七面鳥、アヒル、ウズラ、カモ、キジまたはガチョウ等の家禽類、猿、マウス、ラット、モルモット等の実験動物、ハマチ、マダイ、フグ、マグロ、ヒラメ、シマアジ、マアジ、サケ、ギンザケ、コイ、ウナギ、ニジマス、アユ、エビ類（クルマエビ、ボタンエビ、イセエビ、ロブスター、ブラックタイガー等）、カニ類（タラバガニ、ズワイガニ、ワタリガニ、ケガニ等）、貝類（アワビ、サザエ等）等の養殖水産動物、犬又は猫などのペット、並びに、象、キリン、ライオンその他の動物園で飼育される動物などが挙げられる。
【００２５】
本発明の飼料におけるプロテアーゼ阻害剤の含有量は特には限定されないが、一般的には０．００１重量％〜１重量％であり、好ましくは０．０１重量％〜０．１重量％の範囲である。しかしながら、飼料中におけるプロテアーゼ阻害剤の含有量は、上記の量に限定されるものではなく、使用するプロテアーゼ阻害剤の種類、飼料に含まれる他の酵素の種類およびその含有量、飼料の種類などに応じて必要量を適宜選択して添加配合することができ、それにより得られる効果を調整することができる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
【００２６】
【実施例】
（Ａ）材料と方法
（１）試料の調製
７０重量％の粉砕トウモロコシと３０重量％の大豆粕を混合してトウモロコシ・大豆粕混合物（以下、ＣＳＢＭとも略記する）を調製した。
【００２７】
（２）タンパク質消化率の測定
タンパク質消化率は、既報のペプシン−パンクレチン法（Ｓａｕｎｄｅｒｓ， ＲＭ．，他、（１９７３） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ， １０３： ５３０−５３５）に一つの改良を加えて測定した。６７８Ｕのペプシン（１Ｕのペプシンは、基質としてヘモグロビンを用いてＴＣＡ可溶産物として測定した場合、３７℃でｐＨ２．０で１分あたり０．００１のΔＡ２８０を産生する）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ Ｌｏｕｉｓｅ， ＭＯ， ＵＳＡ）を含有する１５ｍｌの０．１ＮのＨＣｌおよび試験酵素を、１ｍｍ篩にかけた２５０ｍｇのＣＳＢＭと混合し、混合物を３７℃で３時間穏やかに振とうした。０．５ＮのＮａＯＨで中和した後、消化物を５ｍｌのパンクレアチン溶液（少なくともＵ．Ｓ．Ｐ．規格に相当する活性、リパーゼ＞８Ｕ／ｍｇ、プロテアーゼ＞１００Ｕ／ｍｇ、アミラーゼ＞１００Ｕ／ｍｇ）（豚膵臓、パンクレア、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ Ｌｏｕｉｓｅ， ＭＯ， ＵＳＡ ）と混合した。パンクレアチン（４ｍｇ）を７．５ｍｌの０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、混合物を３７℃の湯浴で２４時間振とうした。次いで、溶液を１２００ｒｐｍで１０分間遠心し、上層の濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ ５Ａ）と下層のボトルトップフィルター（０．２２μｍ、Ｍｉｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｂｅｄｆｏｒｄ）から成る二重層で濾過した。濾液を使用して、Ｋｊｅｌｄａｈｌ法にて窒素含有量の分析を行った。粗タンパク質消化率は以下の式により計算した。
【００２８】
粗タンパク質（ＣＰ）消化率（％）＝（上清中の窒素／試料中の全窒素）×１００
【００２９】
（３）酵素
グルカナーゼ以外の酵素は全てＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ Ｌｏｕｉｓｅ， ＭＯ， ＵＳＡから購入した。グルカナーゼは、ＩＣＮ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｃ．（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， ＵＳＡ）から購入した。セルラーゼ（１，４−（１，３：１，４）−β−Ｄ−Ｇｌｕｃａｎ ４−ｇｌｕｃａｎｏ−ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ由来である。１ユニットは、３７℃でｐＨ５．０で１時間にセルロースから１．０マイクロモルのグルコースを遊離させる。キシラナーゼ（ｅｎｄｏ−１，３−β−Ｘｙｌａｎａｓｅ １，４−β−Ｄ−Ｘｙｌａｎｘｙｌａｎｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）はＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ由来である。１ユニットは、３０℃でｐＨ４．５で１分間にキシランからキシロースとして測定として１マイクロモルの還元糖を遊離させる。ペクチナーゼ（Ｐｏｌｙ−（１，４−α−Ｄ−ｇａｌａｃｔｕｒｏｎｉｄｅ）ｇｌｙｃａｎｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来である。１ユニットは、２５℃でｐＨ４．０で１分間にポリガラクツロン酸から１．０マイクロモルのガラクツロン酸を遊離させる。ヘミセルラーゼはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来である。１ユニットは、３７℃でｐＨ５．５で１時間にヘミセルロースから１．０マイクロモルのＤ−ガラクトースを遊離させる。フィターゼ（３−Ｐｈｙｔａｓｅ： ｍｙｏ−Ｉｎｏｓｉｔｏｌ−ｈｅｘａｋｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ３−ｐｈｏｓｐｈｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｉｃｕｕｍ由来である。１ユニットは、３７℃でｐＨ２．５で１分間に０．０４２Ｍのマグネシウム−カリウムフィテートから１．０マイクロモルの無機Ｐを遊離させる。プロテアーゼ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ（ＥＣ））はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ由来である。１ユニットは、３７℃でｐＨ２．８で１分間に、ヘモグロビンを加水分解して１．０マイクロモルのチロシンに相当する発色を生じる。グルカナーゼ（β−１，３−ｇｌｕｃａｎａｓｅ）はＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｌｕｔｅｕｓ由来である。１ユニットは２５℃でｐＨ７．５で１分間に０．００１のΔＡ８００を生じさせる。
【００３０】
セルラーゼ（４６Ｕ）、キシラナーゼ（１５Ｕ）、ペクチナーゼ（１２．５Ｕ）、ヘミセルロース（１Ｕ）、グルカナーゼ（１Ｕ）、フィターゼ（１．５Ｕ）、プロテアーゼ（０．９Ｕ）を使用した。また、各試料につきロイペプチン（０．０５５ｍｇ）（プロテアーゼ阻害剤）（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｉｎｃ． Ｏｓａｋａ， Ｊａｐａｎ）を使用した。
【００３１】
（２）結果
本実施例では、トウモロコシ・大豆粕混合物中のタンパク質の消化率に対する各種酵素の影響をインビトロ評価法（Ｓａｕｎｄｅｒｓ， ＲＭ．，他、（１９７３） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ， １０３： ５３０−５３５）を用いて評価した。
図１から分かるように、セルラーゼは粗タンパク質（ＣＰ）消化率を有意に高めた。トウモロコシ・大豆粕混合物は３．９％のセルロースを含有し、これは非デンプン多糖の約４０％に相当する。細胞壁でのＮＳＰ消化のために、タンパク質を含む細胞成分の消化が促進されるのかもしれない。本実施例では、プロテアーゼ、ペクチナーゼ、キシラナーゼ、フィターゼ、グルカナーゼ及びヘミセルラーゼは粗タンパク質消化率に影響しなかった。各種酵素を組み合わせることが、トウモロコシ・大豆粕混合物の細胞壁成分の消化の完遂には重要であるのかもしれない。
【００３２】
図１の結果から分かるように、粗タンパク質消化率は各種酵素の組み合わせにより有意に増加し、プロテアーゼを除いた場合、又はプロテアーゼ阻害剤を添加した場合に、この効果はより高かった。これらの結果は、本実施例で使用した炭水化物加水分解酵素がインキュベーション中にプロテアーゼによって消化されている可能性を示す。また、Ｅｎｅｒｇｅｘは粗タンパク質消化率に影響しなかったが、プロテアーゼ阻害剤をＥｎｅｒｇｅｘに添加した場合、粗タンパク質消化率は高まった。
【００３３】
【発明の効果】
本発明により、消化率、特に粗タンパク質消化率を改善した動物用飼料を提供することが可能になった。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、トウモロコシ・大豆粕混合物の粗たんぱく質消化率に対する各種酵素のインビトロでの効果を示す。値は平均±標準偏差で示す。異なる添字を有する平均値は互いに有意差があることを示す（Ｐ＜０．０５）。＊パンクレアチン[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to an animal feed with improved digestibility, and more particularly to an animal feed with improved digestibility by incorporating a protease inhibitor.
[0002]
[Prior art]
Corn and soybean meal feed is widely used worldwide as livestock feed. Corn and soybean meal feed is very digestible. However, since the non-starch polysaccharide content is usually 10% or more, the digestibility of a corn / soybean meal feed can be increased by adding an enzyme (Non-Patent Document 1).
[0003]
In recent years, it has been shown that the availability of starch, proteins, lipids, and minerals in multiple animal feeds can be increased by using commercially available enzyme preparations, including cellulases, hemicellulases, phytases, and proteases. (Non-Patent Documents 2 to 6).
[0004]
As described above, it is known that by adding an enzyme mixture containing cellulase, hemicellulase, pectinase and the like to feed, digestibility of the feed is improved, and productivity of broilers and laying hens is improved. However, the enzyme preparation for feed is a mixture of various enzymes including protease, and the effect of a single purified enzyme has not been investigated. Furthermore, the relationship between the combination of various enzymes and the effect has hardly been investigated.
[0005]
[Non-patent document 1]
Bach Knudsen (1997) Animal Feed Science and Technology, 67: 319-338.
[Non-patent document 2]
Classen, HL. (1996) Animal Feed Science and Technology, 62: 21-27.
[Non-Patent Document 3]
Malathi, V & Devegowda G. (2001) Poultry Science, 80: 302-305.
[Non-patent document 4]
Wiryawan, KG & Dingle, JG. (1999) Animal Feed Science and Technology, 76: 185-193.
[Non-Patent Document 5]
Bedford, MR & Classen, HL. (1993) Poultry Science, 72: 137-143.
[Non-Patent Document 6]
Castanton, JIR. , Flores, MP. & Peterson, D.A. (1997) Animal Feed Science and Technology, 68: 361-365.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a feed further improved in digestibility in a feed containing various enzymes.
[0007]
Means for Solving the Problems As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have demonstrated that the digestibility of feed can be increased by adding a protease inhibitor to a feed containing an enzyme. The present invention has been completed based on this finding.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
That is, according to the present invention, there is provided an animal feed comprising a feed component, at least one or more enzymes, and a protease inhibitor.
Preferably, the feed ingredient is soybean meal and / or corn.
[0009]
Preferably, the enzyme is a mixture of enzymes from a microorganism.
Preferably, the enzyme is at least one enzyme selected from the group consisting of cellulase, hemicellulase, pectinase, xylanase, glucanase, phytase and protease.
[0010]
Preferably, the incorporation of a protease inhibitor improves the digestibility of the crude protein.
Preferably, the protease inhibitor is leupeptin.
Preferably, the animal is a livestock, poultry, farmed seafood or pet.
[0011]
According to another aspect of the present invention, there is provided a digestibility improver for animal feed comprising a feed component and at least one enzyme, comprising a protease inhibitor.
[0012]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described.
The animal feed of the present invention is a feed containing a feed component, at least one or more enzymes, and a protease inhibitor. Our studies have suggested that excluding proteases from feed enzymes currently on the market can further improve and increase digestibility (Fuad, S., et al., (2003) Animal). Science Journal, 74: 23-29). However, it is difficult to remove the protease from the feed enzyme preparation (enzyme mixture) that is actually commercially available. Therefore, in the present invention, the effect of a protease inhibitor was examined for the purpose of improving the effect of an enzyme agent that is already commercially available.
[0013]
Leupeptin used in the examples herein is a protease inhibitor from actinomycetes. Leupeptin was added to an enzyme mixture containing cellulase, hemicellulase, pectinase, xylanase, glucanase, phytase and protease, and the in vitro digestibility of the corn / soybean meal mixture was examined. As a result, the digestibility of the crude protein was improved. A similar tendency was observed when leupeptin was added to a commercially available enzyme preparation, Energex from Novo, Denmark (currently sold as Ronozyme VP by Roche). These results show that the addition of the protease inhibitor is effective in improving the crude protein digestibility of the feed.
[0014]
The feed component used in the present invention may be any feed component generally used as feed for animals or fish and shellfish. Such feeds are usually corn, bran, rice, wheat, cottonseed meal, milo, soybean meal, raw fish, frozen fish, chilled fish, fish meal, defatted rice bran, oils, alfalfa, calcium carbonate, calcium phosphate, sodium chloride, Choline chloride, various vitamin preparations (vitamin A, vitamin D, vitamin E, vitamin B1, vitamin B2, vitamin B6, vitamin B12, calcium pantothenate, nicotinamide, folic acid), inorganic salts (magnesium sulfate, iron sulfate, copper sulfate) , Zinc sulfate, potassium iodide, cobalt sulfate) and the like.
[0015]
The main ingredients in the feed are
Corn, milled corn, corn flour, corn germ meal, mylo, millet, wheat, flour, wheat germ powder, barley, rice, rye, oats and other cereals or processed cereal by-products;
Rice bran such as rice bran, bran and wheat bran; beans such as pea seeds, peanut flour and soy flour; and potatoes such as potato flour;
Vegetable oil lees such as soybean lees, defatted soybeans, cottonseed lees, rapeseed lees, sesame lees, peanut lees, sunflower lees, safflower lees, and coconut meal;
Manufactured lees such as barley malt, beer lees, sake lees, glutamate fermented lees, corn fermented lees, corn gluten feed, corn germ meal, konjac flour;
Animal material such as raw fish, frozen fish, refrigerated fish, fish meal, meat meal, meat and bone meal, meat meal, meat bone meal, blood meal, feather meal, skim milk powder, dried whey, krill meal, casein, gelatin, etc .;
Yeasts such as beer yeast;
Sugars such as corn starch and dextrin;
Vegetable proteins such as alfalfa, dried alfalfa, grass, various leaf meals, soy protein, wheat gluten, corn swayin;
Fine powder of inorganic substances such as crystalline cellulose, talc, silica, muscovite, zeolite;
Inorganic calcium compounds such as calcium carbonate; and inorganic phosphates such as calcium phosphate;
And the like. If necessary, the feed may contain other additives that are acceptable in the livestock industry (for example, other antibiotics, fungicides, anthelmintics, antioxidants, etc.). it can.
[0016]
Among the above, particularly preferred examples of the feed component used in the present invention are soybean meal and / or corn, and the most preferred example is a mixture of soybean meal and corn.
[0017]
The animal feed of the present invention contains at least one or more enzymes. As the enzyme used in the present invention, various carbohydrate degrading enzymes can be used, and the type and number of the enzymes used are not particularly limited. For example, cellulases that hydrolyze cellulose, hemicellulases that hydrolyze hemicellulose, pectinases that hydrolyze pectin, xylanases that hydrolyze xylan, glucanases that hydrolyze glucans, and phytases, include proteases, and the like. Can use at least one or more of these, preferably at least two or more, more preferably at least three or more, and most preferably a mixture of all of these. As the enzyme, an enzyme mixture derived from a microorganism can be used.
[0018]
The amount of the enzyme to be added is not particularly limited, and an appropriate amount can be added to the feed such that the digestibility of the feed can be improved. As an example, in the case of a corn / soybean meal mixed feed, 10 to 100 U of cellulase, 0.1 to 5 U of hemicellulase, 5 to 50 U of pectinase, 5 to 50 U of xylanase, Although 5 U of glucanase and 0.1 to 5 U of phytase can be used, the amount of the enzyme used can be appropriately changed and is not limited to this range.
[0019]
The animal feed of the present invention contains a protease inhibitor. The feed of the present invention is characterized in that the digestibility of crude protein is improved by the addition of a protease inhibitor. The type of protease inhibitor used in the present invention is not particularly limited, and any protease inhibitor can be used as long as the digestibility of the crude protein can be improved.
[0020]
Examples of the protease inhibitor used in the present invention include inhibitors against various proteases, and include, for example, a serine protease inhibitor, a cysteine protease inhibitor, and a metalloprotease inhibitor.
[0021]
Here, examples of the serine protease inhibitor include animal-derived serine protease inhibitors such as α1 antitrypsin, antichymotrypsin, antithrombin, α2 antiplasmin, plasminogen activator inhibitor, pancreatic secretory trypsin inhibitor, hirudin, and trypsin inhibitor. , Subtilisin inhibitors, leupeptin, chymostatin, serine protease inhibitors derived from plants and microorganisms such as elastatinal, serine protease inhibitors derived from organisms such as α2 macroglobulin and ovomacroglobulin, benzamidine, aminocaproic acid, tranexamic acid, Peptidic chloromethine ketone bodies and the like can be mentioned.
[0022]
Examples of cysteine protease inhibitors include those derived from living organisms such as stefin, cystatin and kininogen.
Examples of the metalloprotease inhibitor include metal chelating agents such as EDTA, phenanthroline, and DTPA, and biologically-derived metalloprotease inhibitors such as α2 macroglobulin, ovomacroglobulin, and collagenase inhibitor (TIMP).
[0023]
In addition, inhibitors of both serine and cysteine proteases include leupeptin.
In the present invention, one or a mixture of two or more of the proteases exemplified above can be used.
The protease inhibitor described above can be used as a digestibility improving agent for animal feed containing a feed component and at least one or more enzymes.
[0024]
The animal referred to in the present specification is the one interpreted in the broadest sense including humans, and includes, for example, livestock, poultry, cultured fish and shellfish, pets, and the like.
More specifically, livestock such as pigs, cows, horses, goats, deer, rabbits, mink, sheep, goats, chickens (including both broilers and laying hens), turkeys, ducks, quails, ducks, pheasants or Goats and other poultry, monkeys, mice, rats, guinea pigs and other experimental animals, hammerfish, red sea bream, puffer fish, tuna, flounder, swordfish, mackerel, salmon, coho salmon, carp, eel, rainbow trout, ayu, shrimp (kuruma shrimp, button Cultured aquatic animals such as shrimp, lobster, lobster, black tiger, crabs (such as king crab, snow crab, blue crab, crab, etc.), shellfish (such as abalone, sazae, etc.), pets such as dogs or cats, and elephants, giraffes, Lions and other animals raised at the zoo.
[0025]
The content of the protease inhibitor in the feed of the present invention is not particularly limited, but is generally 0.001% by weight to 1% by weight, preferably 0.01% by weight to 0.1% by weight. is there. However, the content of the protease inhibitor in the feed is not limited to the above amount, the type of protease inhibitor used, the type and content of other enzymes contained in the feed, the type of feed, etc. The required amount can be appropriately selected and added according to the above, and the effect obtained thereby can be adjusted.
The present invention will be described more specifically with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the examples.
[0026]
【Example】
(A) Materials and Method (1) Preparation of Sample 70% by weight of ground corn and 30% by weight of soybean meal were mixed to prepare a corn / soybean meal mixture (hereinafter abbreviated as CSBM).
[0027]
(2) Measurement of Protein Digestibility The protein digestibility was measured by adding one improvement to the previously reported pepsin-pancretin method (Saunders, RM., Et al., (1973) Journal of Nutrition, 103: 530-535). . Pepsin 678U (pepsin 1U, measured as TCA-friendly溶産object using hemoglobin as substrate, produces .DELTA.A 280 of 0.001 per minute at pH2.0 at 37 ℃) (Sigma Chemical, St Louise , MO, USA) was mixed with 250 mg of CSBM sieved through 1 mm and the mixture was gently shaken at 37 ° C. for 3 hours. After neutralization with 0.5N NaOH, the digest was digested with 5 ml of a pancreatin solution (at least activity corresponding to the USP standard, lipase> 8 U / mg, protease> 100 U / mg, amylase> 100 U / mg ) (Porcine pancreas, pancreas, Sigma Chemical, St Louis, MO, USA). Pancreatin (4 mg) was dissolved in 7.5 ml of 0.2 M phosphate buffer (pH 8.0) and the mixture was shaken in a 37 ° C. water bath for 24 hours. The solution was then centrifuged at 1200 rpm for 10 minutes and filtered through a double layer consisting of an upper layer of filter paper (Whatman 5A) and a lower layer of bottle top filter (0.22 μm, Millipore Corporation, Bedford). Using the filtrate, the nitrogen content was analyzed by the Kjeldahl method. Crude protein digestibility was calculated by the following equation.
[0028]
Crude protein (CP) digestibility (%) = (nitrogen in supernatant / total nitrogen in sample) × 100
[0029]
(3) All enzymes except the enzyme glucanase were purchased from Sigma Chemical, St Louis, MO, USA. Glucanase is available from ICN Biochemical Inc. (California, USA). Cellulase (1,4- (1,3: 1,4) -β-D-Glucan 4-glucono-hydrolase) is derived from Trichoderma viride. One unit liberates 1.0 micromole of glucose from cellulose in 1 hour at 37 ° C., pH 5.0. Xylanase (endo-1,3-β-Xylanase 1,4-β-D-Xylanxylanohydrolase) is derived from Trichoderma viride. One unit liberates 1 micromole of reducing sugar as measured as xylose from xylan at 30 ° C. and pH 4.5 for 1 minute. Pectinase (Poly- (1,4-α-D-galacturonide) glycanohydrolase) is derived from Aspergillus niger. One unit liberates 1.0 micromole of galacturonic acid from polygalacturonic acid per minute at 25 ° C. and pH 4.0. Hemicellulase is from Aspergillus niger. One unit liberates 1.0 micromole of D-galactose from hemicellulose in 1 hour at 37 ° C and pH 5.5. Phytase (3-Phytase: myo-Inositol-hexaphosphophosphate 3-phosphohydrolase) is derived from Aspergillus ficusum. One unit releases 1.0 micromole of inorganic P from 0.042M magnesium-potassium phytate per minute at 37 ° C and pH 2.5. Protease (Enzyme Commission (EC)) is from Aspergillus saitoi. One unit hydrolyzes hemoglobin in 1 minute at 37 ° C., pH 2.8, producing a color development equivalent to 1.0 micromolar tyrosine. Glucanase (β-1,3-glucanase) is derived from Arthrobacter luteus. One unit produces a ΔA 800 of 0.001 per minute at pH 7.5 at 25 ° C.
[0030]
Cellulase (46 U), xylanase (15 U), pectinase (12.5 U), hemicellulose (1 U), glucanase (1 U), phytase (1.5 U), and protease (0.9 U) were used. Leupeptin (0.055 mg) (protease inhibitor) (Peptide Institute, Inc. Osaka, Japan) was used for each sample.
[0031]
(2) Results In this example, the effect of various enzymes on the digestibility of proteins in a corn / soybean meal mixture was evaluated in vitro (Saunders, RM., Et al., (1973) Journal of Nutrition, 103: 530-535). Was evaluated using
As can be seen from FIG. 1, cellulase significantly increased the crude protein (CP) digestibility. The corn / soybean meal mixture contains 3.9% cellulose, which corresponds to about 40% of the non-starch polysaccharide. NSP digestion in the cell wall may facilitate digestion of cellular components, including proteins. In this example, protease, pectinase, xylanase, phytase, glucanase and hemicellulase did not affect crude protein digestibility. The combination of various enzymes may be important in completing the digestion of the cell wall components of the corn / soybean meal mixture.
[0032]
As can be seen from the results of FIG. 1, the crude protein digestibility was significantly increased by the combination of various enzymes, and the effect was higher when the protease was removed or when the protease inhibitor was added. These results indicate that the carbohydrate hydrolase used in this example may have been digested by the protease during the incubation. Also, Energex did not affect the crude protein digestibility, but when a protease inhibitor was added to Energex, the crude protein digestibility increased.
[0033]
【The invention's effect】
ADVANTAGE OF THE INVENTION By this invention, it became possible to provide the animal feed which improved the digestibility, especially the crude protein digestibility.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the in vitro effects of various enzymes on the digestibility of crude protein from a corn / soybean meal mixture. Values are shown as mean ± standard deviation. Means with different subscripts indicate significant differences from each other (P <0.05). * Pancreatin
