【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ウイルス混在のおそれのあるフィブリノーゲン含有溶液からウイルス除去膜を用いてウイルスを除去する方法において、濾過助剤と濾過膜を用いた予備濾過工程を行った後ウイルス除去膜処理することにより、単位面積当たりの濾過液量を増加させ、効率的にウイルスを除去する方法を提供することにある。
【０００２】
【従来の技術】
フィブリノーゲンはプラスミノーゲン、トロンビン、フィブロネクチンおよび血小板のような多くの生理学的に重要なタンパク質と相互作用することが知られており、中でもトロンビンにより限定分解され不溶性のフィブリンとなり、血小板の凝集とともに血餅を生成し、血管障害部位にフィブリン塊となって止血に働くことがよく知られている。このフィブリノーゲンはフィブリノーゲン製剤あるいはフィブリン糊の成分として配合されているもので、ヒトのプール血漿あるいは血漿の寒冷沈殿物より精製される。
フィブリノーゲンを含有する製剤など、ヒト血漿、その誘導画分等の血液製剤は、エイズウイルス、各種肝炎ウイルス、ヒトパルボウイルスＢ１９などのウイルスに汚染されている可能性がある。従って血液製剤の製造に際しては、ウイルスを十分に不活化及び／又は除去する工程を組み込むことが必須である。
血液製剤に夾雑してくる危惧のあるウイルスを不活化する方法としては、水溶液状態での加熱処理法（以下、液状加熱という。）が提案され、それ以来この方法は血液製剤のウイルス不活化法として広く採用されている（非特許文献１）。
【０００３】
一方ウイルスを除去する方法としては血液凝固ＶＩＩＩ因子製剤中に意図的に添加したウイルスを再生セルロース製多孔性中空糸フィルターで濾過することにより除去する方法が記載されている（特許文献１）。
また免疫グロブリン製剤製造工程中にウイルス除去用中空糸フィルターによるウイルス除去工程を導入する方法が関口らによって報告されている（非特許文献２）。
しかしながら、これらのウイルス除去フィルターを用いたウイルス除去法は蛋白質がフィブリノーゲンである場合は特に濾過性が悪く、収率の低下及び使用膜量の増大などの問題点があり、工業的生産性の点で大きな課題となっている。また、血漿蛋白質のなかでもフィブリノーゲンは他の蛋白質製剤に比べてウイルス夾雑の危険性が高いと言われている。このためウイルスの不活化や除去については他の蛋白製剤より更に厳重に行う必要がある。
【０００４】
ウイルスの不活化法としては、液状加熱法、乾燥加熱法、ソルベントデタージェント（ＳＤ）法などがあり、ウイルス除去法としてはウイルス除去フィルターによるウイルス除去法がある。またエタノール沈澱法及びカラムクロマトグラフィー法においてもウイルス除去が可能であることが知られている。ウイルスを吸着除去する目的でたんぱく質溶液に珪藻土、ベントナイトなどの吸着剤を混合して遠心分離又は濾過によりウイルスを分離する方法も提案されている（特許文献２）。
ウイルス除去膜を用いる処理時に、フィブリノーゲン含有溶液に塩基性アミノ酸（リジン、アルギニン）および塩化ナトリウムを含有させることによって、ウイルス除去膜処理の濾過性を改善させることも知られている（特許文献３）。
ＳＤ処理後に界面活性剤の濃度を調整して、ウイルス除去膜処理する際のタンパク質の濾過性を改善する報告もなされている（特許文献４）。
【０００５】
【特許文献１】特開平２−１６７２３２号
【特許文献２】特許２９８７５５４号
【特許文献３】特開２００１−３３５５０９号
【特許文献４】特表２００１−５２１９４１号
【非特許文献１】Ｍｕｒｒａｙら，Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３１巻（５）３４１〜３５８（１９５５）
【非特許文献２】Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３４巻（６）６１５〜６１７（１９８８）
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
以上述べた各種の方法を複数組み合わせることはウイルスの不活化、ウイルス除去の完璧を期すための有効な手段であると考えられるが、そのためには各処理工程においてフィブリノーゲンの収率低下を最小限に抑え、効率的に処理することが重要な課題となってくる。
本発明の課題はウイルス夾雑の危惧のあり、かつアルブミン、グロブリン、アンチトロンビン−ＩＩＩ、トロンビンなどの他の血漿蛋白と比べウイルス除去膜を用いる際の濾過工程の濾過性が特に低いフィブリノーゲン溶液から産業的有利にウイルスを除去する方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決するため種々の研究を重ねた結果、フィブリノーゲンを含有する溶液をウイルス除去膜処理する際に、予備濾過を行うことによりウイルス除去膜処理の濾過性が著しく改善されることを知見した。そこでこの予備濾過について種々の条件を検討した結果、濾過助剤を添加して深層濾過膜による予備濾過を行うと、フィブリノーゲンが安定的且つ効果的に濾過されることを見いだし、さらに検討を重ねて本発明を完成した。
【０００８】
すなわち本発明は
（１）ウイルス混在のおそれのあるフィブリノーゲン含有溶液に濾過助剤を加えて濾過膜により濾過し、得られた濾液をウイルス除去膜により濾過するウイルス除去法、
（２）濾過助剤が珪藻土、パーライトおよびベントナイトから選ばれる少なくとも１種である（１）記載のウイルス除去法、
（３）濾過助剤を加えたウイルス混在のおそれのあるフィブリノーゲン含有溶液の濾過に用いる濾過膜が深層濾過膜である（１）記載のウイルス除去法、
（４）ウイルス混在のおそれのあるフィブリノーゲン含有溶液中に濾過助剤を１．０〜５．０重量％添加して濾過を行う請求項１記載のウイルス除去法、
（５）深層濾過膜の濾過孔径が０．１〜０．５μｍである（３）記載のウイルス除去法、
（６）ウイルス除去膜が中空糸フィルターまたはメンブランフィルターである（１）記載のウイルス除去法、
（７）中空糸フィルターまたはメンブランフィルターの平均孔径が２０〜６０ｎｍである（６）記載のウイルス除去法、および
（８）ウイルス混在のおそれのあるフィブリノーゲン含有溶液がヒト血漿由来の画分である（１）記載のウイルス除去法、
である。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の方法における出発原料は、ヒト血漿由来のコーンフラクションＩまたはクリオペーストをクエン酸ナトリウム水溶液に溶解し、必要により濾過助剤を使用して濾過し、濃度の異なるエタノールによる精製によって得られたものが好ましい。
フィブリノーゲン含有溶液の蛋白濃度は１．０重量％以下、好ましくは０．５重量％に調製して濾過助剤を添加する。また、フィブリノーゲン含有溶液には必要により緩衝剤、安定化剤を添加することができ、緩衝剤としてはクエン酸ナトリウムなどが用いられ溶液のｐＨとしては５．５〜７．５、好適には６．０〜６．５に調製しておくことが好ましく、フィブリノーゲンを安定化するための安定化剤としては、糖、アミノ酸、有機酸などを任意に配合することができ、特に塩基性アミノ酸であるアルギニン、リジン、酸性アミノ酸であるグルタミン酸を含んでいることが好ましい。
【００１０】
本発明において使用する濾過助剤としては、珪藻土、パーライト、ベントナイトなどから選ばれる１種以上の混合物を添加することができ、中でも珪藻土を含むセライト（セライト社製）がより好適に用いられる。
濾過助剤の添加濃度は、通常０．５〜５．０重量％、好ましくは１．０〜２．０重量％、さらに好ましくは１．０重量％である。濾過助剤を添加した後にフィブリノーゲン含有溶液を攪拌して予備濾過を施した後ウイルス除去膜処理を施す。また、濾過助剤は予め予備濾過膜上にプレコートしておくことも有効である。ウイルス混在のおそれのあるフィブリノーゲンを含有する溶液に濾過助剤を加えたものを予備濾過する濾過膜は、通常たんぱく質の濾過に用いられるものであればどのようなものでも利用できるが、特に深層濾過膜の使用が望ましい。濾過膜は濾過孔径が０．１〜０．５μｍ程度のものが用いられ、より好ましくは０．１〜０．２μｍのものが用いられる。このような濾過膜としては、例えば、ゼータプラス９０（キュノ社製）、ＳＥＩＴＥＳＵＰＲＡＥＫＳ（Ｐ）（ザイツ社製）などが挙げられる。さらに、深層濾過膜による濾過後、濾過口径０．４５μｍ以下、好ましくは０．１μｍ以下の多孔質膜やメンブランフィルターまたは６０ｎｍ以上の中空糸膜フィルターでの濾過を行うことが好ましい。
【００１１】
本発明に用いるウイルス除去フィルターは、ウイルスを通過させない多孔性膜であれば平膜状でも中空糸状でもよく、またその材料としては銅アンモニア法、ビスコース法、セルロースエステルのけん化法などの再生セルロース、アセテートなどの酢化セルロース、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリスルホン（ＰＳ）及びポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）等の合成高分子化合物があげられる。その中でも銅アンモニア法再生セルロース製多孔膜中空糸及びＰＶＤＦ製メンブランフィルターが特に好ましい。また、銅アンモニア法再生セルロース製多孔膜中空糸は該中空糸の内壁面から外壁面への膜厚方向に層状構造を有しているので、高い蛋白の透過性と高いウイルスの阻止性能を併せ持っている。この中空糸の膜厚は１０〜１００μｍが好ましく、５０〜９０μｍがさらに好ましい。ウイルス除去フィルターの平均孔径は、通常１０〜８０ｎｍ、好ましくは１５〜７５ｎｍ、より好ましくは２０〜６０ｎｍである。平均孔径が２０ｎｍ以下のフィルターを用いると、パルボウイルスＢ１９のような粒子径の小さなウイルスも除去することができる。しかしながら実際の工業スケールで生産する場合にはフィブリノーゲンが短時間で通過できるサイズでなければならず、且つ膜の透過率、透過時間等より２０〜６０ｎｍ程度が好ましく、より好適には３０〜５０ｎｍ程度のものが好適に用いられる。好適に用いられる具体的なフィルターは、プラノバ３５Ｎ（平均孔径 ３５±２ｎｍ、旭化成製）またはＤＶ５０（ポール社製）である。また、場合によってはウイルス除去膜の孔径を７５〜１００ｎｍのウイルス除去膜処理後にさらに３０〜５０ｎｍのウイルス除去膜を使用することも可能であり、当該２段階のウイルス除去膜操作は膜の濾過液量を増加させることができ、フィルターの目詰まりを防止する観点で好ましいが、濾過助剤を用いた予備濾過工程を経ることで、必ずしも２つのウイルス除去フィルターを用いる必要はない。
本発明の各工程は、０〜３０℃の温度で実施することができるが、蛋白の安定性の観点より２〜２５℃が好ましく、より好適には１５〜２５℃で実施することが好ましい。
【００１２】
【実施例】
以下に実施例、比較例および試験例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
実施例１
ヒト血漿由来のコーンフラクションＩ １００ｇを７．５％エタノール含有５５ｍＭのクエン酸ソーダ水溶液（ｐＨ６．４）２リットルにて洗浄し、得られた沈殿物を５５ｍＭクエン酸水溶液ｐＨ６．４にて溶解した。ついで液を０℃まで冷却し、エタノール濃度が２．０ｖ／ｖ％となるようにエタノールを添加した。遠心分離で得られた上清画分に、さらにエタノール濃度８．０ｖ／ｖ％となるようにエタノールを添加し、沈殿物として精製フィブリノーゲン画分を得た。上記フィブリノーゲン画分沈殿物を５５ｍＭ、ｐＨ６．４のクエン酸水溶液に溶解し、得られたフィブリノーゲン溶液に塩化ナトリウム、Ｌリジン塩酸、Ｌアルギニン塩酸をそれぞれ０．９ｗ／ｖ％、１．０ｗ／ｖ％、１．０ｗ／ｖ％の濃度になるように添加して薬液を調製した。
【００１３】
実施例２
実施例１で得られた薬液１００ｍＬに濾過助剤セライトＨＳＣを１．０ｗ／ｖ％濃度になるように添加して攪拌後に予備濾過として９０ＬＡ（キュノ社製）フィルター、濾過孔径０．１μｍメンブランフィルターで濾過した後、０．０６ＭＰａの一次圧でウイルス除去フィルター（プラノバ３５Ｎ、旭化成（株）製）を通過させ、ウイルス除去を行った。
【００１４】
実施例３
実施例１で得られた薬液１００ｍＬに濾過助剤セライトＨＳＣを１．０ｗ／ｖ％濃度になるように添加して攪拌後に予備濾過として９０ＬＡ（キュノ社製）フィルター、０．１μｍメンブランフィルターで濾過した後、０．１４ＭＰａの一次圧でウイルス除去フィルター（ＤＶ５０、日本ポール製）を通過させウイルス除去を行った。
【００１５】
実施例４
実施例１で得られた薬液１００ｍＬに濾過助剤セライト酸洗浄ＨＳＣを１．０ｗ／ｖ％濃度となるように添加し、攪拌後に予備濾過として９０ＬＡ（キュノ社製）フィルター、０．１μｍメンブランフィルターを用いて濾過した後、０．１４ＭＰａの一次圧でウイルス除去フィルター（ＤＶ５０、日本ポール（株）製）を通過させ、ウイルス除去を行った。
【００１６】
実施例５
実施例１で得られた薬液１００ｍＬに濾過助剤セライト“Ｃｅｌｐｕｒｅ ３０００”を１．０ｗ／ｖ％濃度となるように添加し、攪拌後に予備濾過として９０ＬＡ（キュノ社製）フィルター、０．１μｍメンブランフィルターを用いて濾過した後、０．１４ＭＰａの一次圧でウイルス除去フィルター（ＤＶ５０、日本ポール（株）製）を通過させ、ウイルス除去を行った。
【００１７】
比較例１（濾過助剤処理なし）
実施例１で得られた薬液１００ｍＬを予備濾過として９０ＬＡ（キュノ社製）フィルター、０．１μｍメンブランフィルターで濾過した後、０．０６ＭＰａの一次圧でウイルス除去フィルター（プラノバ３５Ｎ、旭化成製）を通過させウイルス除去を行った。
【００１８】
比較例２（濾過助剤処理なし）
実施例１で得られた薬液１００ｍＬを予備濾過として０．４５μｍ、０．１μｍのメンブランフィルターで順次濾過した後、０．０６ＭＰａの一次圧でウイルス除去フィルター（プラノバ３５Ｎ、旭化成製）を通過させウイルス除去を行った。
【００１９】
比較例３（濾過助剤処理なし）
実施例１で得られた薬液１００ｍＬを予備濾過として９０ＬＡ（キュノ社製）フィルター、０．１μｍメンブランフィルターで濾過した後、０．１４ＭＰａの一次圧でウイルス除去フィルター（ＤＶ５０、日本ポール製）を通過させウイルス除去を行った。
【００２０】
比較例４（濾過助剤処理なし）
実施例１で得られた薬液１００ｍＬを予備濾過として０．４５μｍ、０．１μｍのメンブランフィルターで順次濾過した後、０．１４ＭＰａの一次圧でウイルス除去フィルター（ＤＶ５０、日本ポール製）を通過させウイルス除去を行った。
【００２１】
試験例１
実施例２〜５および比較例１〜４において、ウイルス除去膜処理前のフィブリノーゲン濃度およびウイルス除去膜処理後のフィブリノーゲン濃度をＬａｋｉ法及びＢｌｏｍｂａｃｋ法を組み合わせて測定した。ウイルス除去膜処理前後のフィブリノーゲン濃度から、濾過前の濃度を１００とした時の処理後の濃度を濃度回収率（％）として示した。また、ウイルス除去膜処理前後のフィブリノーゲン濃度に容量を乗じたフィブリノーゲン量から、濾過前に対する濾過後のフィブリノーゲンの収量を算出した。さらに、使用したウイルス除去膜の膜面積と濾過できた液量からウイルス除去膜１ｍ２当たりの液量を濾過液量として算出した。それらの結果を〔表１〕に示す。
【００２２】
【表１】
〔表１〕に示すように、実施例２〜５のフィブリノーゲン溶液は、同条件で濾過助剤添加を行わない比較例１〜４の溶液に比してウイルス除去膜を用いた時の濾過性が遙かに優れていた。
【００２３】
【発明の効果】
このようにして濾過助剤を添加して予備濾過調製したフィブリノーゲンを含有する溶液は、従来にない高い濾過性並びにフィブリノーゲン回収性を示す。これはフィブリノーゲン含有溶液中に含まれる凝集体が濾過助剤と深層濾過膜の組み合わせにより高度に吸着除去され、かつフィルターを目詰まりさせることなく効率的にウイルスが除去されるからである。また、単なる予備濾過だけでは予備濾過後にウイルス除去膜処理する工程において新たな凝集体が生成してくることがあるが、本発明の濾過助剤を用いた予備濾過処理後にウイルス除去膜を通過させることにより、この問題点も解決された。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention is a method for removing viruses from a fibrinogen-containing solution that may contain viruses by using a virus removal membrane, and then performing a virus removal membrane treatment after performing a preliminary filtration step using a filter aid and a filtration membrane. An object of the present invention is to provide a method for efficiently removing viruses by increasing the amount of filtrate per unit area.
[0002]
[Prior art]
Fibrinogen is known to interact with many physiologically important proteins such as plasminogen, thrombin, fibronectin, and platelets, among which it is limited to thrombin to become insoluble fibrin that clots with platelet aggregation. It is well known that it forms a fibrin clot at the site of vascular injury and works for hemostasis. This fibrinogen is blended as a component of a fibrinogen preparation or fibrin glue and purified from human pooled plasma or a cold precipitate of plasma.
Blood preparations such as human plasma and derivatives thereof, such as preparations containing fibrinogen, may be contaminated with viruses such as AIDS virus, various hepatitis viruses, and human parvovirus B19. Therefore, in the production of blood products, it is essential to incorporate a process that sufficiently inactivates and / or removes viruses.
As a method for inactivating viruses that are likely to be contaminated in blood products, a heat treatment method in an aqueous solution (hereinafter referred to as liquid heating) has been proposed. Since then, this method has been used to inactivate viruses in blood products. (Non-Patent Document 1).
[0003]
On the other hand, as a method for removing viruses, there is described a method for removing viruses intentionally added to a blood coagulation factor VIII preparation by filtering with a porous hollow fiber filter made of regenerated cellulose (Patent Document 1).
Sekiguchi et al. Reported a method of introducing a virus removal step using a hollow fiber filter for virus removal during the immunoglobulin preparation process (Non-patent Document 2).
However, the virus removal methods using these virus removal filters have poor filterability, particularly when the protein is fibrinogen, and have problems such as a decrease in yield and an increase in the amount of membrane used. It is a big issue. Among plasma proteins, fibrinogen is said to have a higher risk of virus contamination than other protein preparations. For this reason, virus inactivation and removal must be performed more strictly than other protein preparations.
[0004]
Examples of the virus inactivation method include a liquid heating method, a drying heating method, and a solvent detergent (SD) method, and a virus removal method includes a virus removal method using a virus removal filter. It is also known that virus removal is possible by ethanol precipitation and column chromatography. For the purpose of adsorbing and removing viruses, a method has also been proposed in which adsorbents such as diatomaceous earth and bentonite are mixed with a protein solution and the viruses are separated by centrifugation or filtration (Patent Document 2).
It is also known to improve the filterability of the virus removal membrane treatment by containing a basic amino acid (lysine, arginine) and sodium chloride in the fibrinogen-containing solution during the treatment using the virus removal membrane (Patent Document 3). .
There has also been a report of improving the filterability of proteins during the virus removal membrane treatment by adjusting the surfactant concentration after SD treatment (Patent Document 4).
[0005]
[Patent Document 1] JP-A-2-167232 [Patent Document 2] Patent 2987554 [Patent Document 3] JP-A-2001-335509 [Patent Document 4] Special Table 2001-521194 [Non-Patent Document 1] Murray et al., The New York Academy of Medicine, Vol. 31, (5) 341-358 (1955)
[Non-Patent Document 2] Japan Journal of Transfusion Medicine, Vol. 34 (6) 615-617 (1988)
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
Combining multiple methods described above is considered to be an effective means for perfecting virus inactivation and virus removal. To that end, the decrease in fibrinogen yield is minimized in each processing step. Suppressing and processing efficiently is an important issue.
An object of the present invention is to produce a fibrinogen solution which is likely to be contaminated with viruses and has a particularly low filterability in the filtration step when using a virus removal membrane compared to other plasma proteins such as albumin, globulin, antithrombin-III and thrombin. It is an object of the present invention to provide a method for removing viruses.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
As a result of various studies to solve the above problems, the present inventors have remarkably improved the filterability of the virus removal membrane treatment by performing preliminary filtration when the solution containing fibrinogen is treated with the virus removal membrane. I found out that Therefore, as a result of examining various conditions for this prefiltration, it was found that fibrinogen was stably and effectively filtered by adding a filter aid and performing prefiltration with a depth filtration membrane. The present invention has been completed.
[0008]
That is, the present invention includes (1) a virus removal method in which a filter aid is added to a fibrinogen-containing solution that may contain viruses, and the filtrate is filtered through a filtration membrane, and the resulting filtrate is filtered through a virus removal membrane,
(2) The virus removal method according to (1), wherein the filter aid is at least one selected from diatomaceous earth, perlite, and bentonite.
(3) The virus removal method according to (1), wherein the filtration membrane used for filtration of a fibrinogen-containing solution that may contain a virus containing a filter aid is a deep-layer filtration membrane,
(4) The virus removal method according to claim 1, wherein 1.0 to 5.0% by weight of a filter aid is added to the fibrinogen-containing solution that may contain virus, and filtration is performed.
(5) The virus removal method according to (3), wherein the filtration pore size of the depth filtration membrane is 0.1 to 0.5 μm,
(6) The virus removal method according to (1), wherein the virus removal membrane is a hollow fiber filter or a membrane filter,
(7) The virus removal method according to (6), wherein the hollow fiber filter or membrane filter has an average pore size of 20 to 60 nm, and (8) a fibrinogen-containing solution that may contain virus is a fraction derived from human plasma ( 1) The virus removal method described in the
It is.
[0009]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The starting material in the method of the present invention was obtained by dissolving corn fraction I derived from human plasma or cryopaste in an aqueous solution of sodium citrate and, if necessary, using a filter aid and purifying with ethanol having different concentrations. Those are preferred.
The protein concentration of the fibrinogen-containing solution is adjusted to 1.0% by weight or less, preferably 0.5% by weight, and a filter aid is added. Moreover, a buffering agent and a stabilizer can be added to the fibrinogen-containing solution as necessary. Sodium citrate or the like is used as the buffering agent, and the pH of the solution is 5.5 to 7.5, preferably 6 It is preferable to prepare it in a range from 0.0 to 6.5, and as a stabilizer for stabilizing fibrinogen, sugars, amino acids, organic acids and the like can be arbitrarily mixed, and particularly basic amino acids. It preferably contains arginine, lysine and glutamic acid which is an acidic amino acid.
[0010]
As the filter aid used in the present invention, one or more mixtures selected from diatomaceous earth, perlite, bentonite and the like can be added, and among them, celite containing diatomaceous earth (manufactured by Celite) is more preferably used.
The addition concentration of the filter aid is usually 0.5 to 5.0% by weight, preferably 1.0 to 2.0% by weight, and more preferably 1.0% by weight. After adding the filter aid, the fibrinogen-containing solution is stirred and subjected to preliminary filtration, followed by a virus removal membrane treatment. It is also effective to pre-coat the filter aid on the preliminary filtration membrane in advance. The filtration membrane that preliminarily filters the solution containing fibrinogen that may contain viruses may be used as long as it is normally used for protein filtration. The use of a membrane is desirable. The filtration membrane having a filtration pore size of about 0.1 to 0.5 μm is used, and more preferably 0.1 to 0.2 μm. Examples of such a filtration membrane include Zeta Plus 90 (manufactured by Kuno Co., Ltd.), SEITESUPRAEKS (P) (manufactured by Zeitz Co., Ltd.) and the like. Furthermore, it is preferable to carry out filtration with a porous membrane or membrane filter having a pore size of 0.45 μm or less, preferably 0.1 μm or less, or a hollow fiber membrane filter having a thickness of 60 nm or more after filtration with a deep layer membrane.
[0011]
The virus removal filter used in the present invention may be in the form of a flat membrane or a hollow fiber as long as it is a porous membrane that does not allow virus to pass through. Recycled cellulose such as copper ammonia method, viscose method, cellulose ester saponification method, etc. And synthetic polymer compounds such as acetylated cellulose such as acetate, polyvinylidene difluoride (PVDF), polyacrylonitrile (PAN), polysulfone (PS), and polymethyl methacrylate (PMMA). Among them, a copper ammonia method regenerated cellulose porous membrane hollow fiber and a PVDF membrane filter are particularly preferable. Moreover, the porous membrane hollow fiber made of copper ammonia regenerated cellulose has a layered structure in the film thickness direction from the inner wall surface to the outer wall surface of the hollow fiber, so it has both high protein permeability and high virus blocking performance. ing. The thickness of the hollow fiber is preferably 10 to 100 μm, and more preferably 50 to 90 μm. The average pore size of the virus removal filter is usually 10 to 80 nm, preferably 15 to 75 nm, and more preferably 20 to 60 nm. When a filter having an average pore size of 20 nm or less is used, a virus having a small particle size such as parvovirus B19 can also be removed. However, when it is produced on an actual industrial scale, it must be of a size that allows fibrinogen to pass in a short time, and is preferably about 20 to 60 nm, more preferably about 30 to 50 nm from the membrane transmittance, transmission time, etc. Are preferably used. A specific filter preferably used is Planova 35N (average pore size 35 ± 2 nm, manufactured by Asahi Kasei) or DV50 (manufactured by Paul). In some cases, it is also possible to use a virus removal membrane of 30 to 50 nm after the virus removal membrane treatment with a virus removal membrane having a pore size of 75 to 100 nm. Although the amount can be increased and it is preferable from the viewpoint of preventing clogging of the filter, it is not always necessary to use two virus removal filters through a preliminary filtration step using a filter aid.
Although each process of this invention can be implemented at the temperature of 0-30 degreeC, 2-25 degreeC is preferable from a viewpoint of protein stability, and it is preferable to implement at 15-25 degreeC more suitably.
[0012]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, Comparative Examples and Test Examples.
Example 1
100 g of corn fraction I derived from human plasma was washed with 2 liters of a 55 mM sodium citrate aqueous solution (pH 6.4) containing 7.5% ethanol, and the resulting precipitate was dissolved in a 55 mM aqueous citric acid solution pH 6.4. . Subsequently, the liquid was cooled to 0 ° C., and ethanol was added so that the ethanol concentration became 2.0 v / v%. Ethanol was further added to the supernatant fraction obtained by centrifugation so that the ethanol concentration became 8.0 v / v%, and a purified fibrinogen fraction was obtained as a precipitate. The fibrinogen fraction precipitate was dissolved in an aqueous citric acid solution of 55 mM and pH 6.4, and sodium chloride, L lysine hydrochloric acid and L arginine hydrochloric acid were added to the obtained fibrinogen solution at 0.9 w / v% and 1.0 w / v, respectively. % And 1.0 w / v% were added to prepare a drug solution.
[0013]
Example 2
A filter aid Celite HSC was added to 100 mL of the chemical solution obtained in Example 1 so as to have a concentration of 1.0 w / v%, and after stirring, 90LA (manufactured by Cuno) filter and 0.1 μm membrane filter with a pore size of filtration were used as preliminary filtration. And filtered through a virus removal filter (Pranova 35N, manufactured by Asahi Kasei Co., Ltd.) at a primary pressure of 0.06 MPa.
[0014]
Example 3
Filter aid Celite HSC was added to 100 mL of the chemical solution obtained in Example 1 to a concentration of 1.0 w / v%, and after stirring, filtered through a 90 LA filter (manufactured by Cuno) and a 0.1 μm membrane filter as preliminary filtration. After that, the virus was removed by passing through a virus removal filter (DV50, manufactured by Nippon Pole) at a primary pressure of 0.14 MPa.
[0015]
Example 4
A filter aid Celite acid washed HSC was added to 100 mL of the chemical solution obtained in Example 1 so as to have a concentration of 1.0 w / v%, and after stirring, 90LA (manufactured by Cuno) filter, 0.1 μm membrane filter was used as preliminary filtration. Then, the virus was removed by passing it through a virus removal filter (DV50, manufactured by Nippon Pole Co., Ltd.) at a primary pressure of 0.14 MPa.
[0016]
Example 5
The filter aid Celite “Celpure 3000” was added to 100 mL of the chemical solution obtained in Example 1 so as to have a concentration of 1.0 w / v%, and after stirring, a 90LA filter (manufactured by Cuno), 0.1 μm membrane was used as a preliminary filtration. After filtration using a filter, the virus was removed by passing through a virus removal filter (DV50, manufactured by Nippon Pole Co., Ltd.) at a primary pressure of 0.14 MPa.
[0017]
Comparative Example 1 (no filter aid treatment)
100 mL of the drug solution obtained in Example 1 was filtered through a 90LA filter (manufactured by Cuno) and a 0.1 μm membrane filter as a preliminary filter, and then passed through a virus removal filter (Planova 35N, manufactured by Asahi Kasei) at a primary pressure of 0.06 MPa. The virus was removed.
[0018]
Comparative Example 2 (no filter aid treatment)
100 mL of the drug solution obtained in Example 1 was filtered sequentially through 0.45 μm and 0.1 μm membrane filters as a preliminary filtration, and then passed through a virus removal filter (Planova 35N, manufactured by Asahi Kasei) at a primary pressure of 0.06 MPa. Removal was performed.
[0019]
Comparative Example 3 (no filter aid treatment)
100 mL of the drug solution obtained in Example 1 was filtered through a 90LA (Cuno) filter and a 0.1 μm membrane filter as a preliminary filtration, and then passed through a virus removal filter (DV50, manufactured by Nippon Pole) at a primary pressure of 0.14 MPa. The virus was removed.
[0020]
Comparative Example 4 (no filter aid treatment)
100 mL of the drug solution obtained in Example 1 was filtered sequentially through 0.45 μm and 0.1 μm membrane filters as a preliminary filtration, and then passed through a virus removal filter (DV50, manufactured by Nippon Pole) at a primary pressure of 0.14 MPa. Removal was performed.
[0021]
Test example 1
In Examples 2 to 5 and Comparative Examples 1 to 4, the fibrinogen concentration before the virus removal membrane treatment and the fibrinogen concentration after the virus removal membrane treatment were measured by combining the Laki method and the Bromback method. From the fibrinogen concentration before and after the virus removal membrane treatment, the concentration after treatment when the concentration before filtration was taken as 100 was shown as the concentration recovery rate (%). Moreover, the yield of fibrinogen after filtration relative to that before filtration was calculated from the amount of fibrinogen obtained by multiplying the volume by the fibrinogen concentration before and after the virus removal membrane treatment. Further, the amount of liquid per 1 m 2 of virus removal membrane was calculated as the amount of filtrate from the membrane area of the virus removal membrane used and the amount of liquid that could be filtered. The results are shown in [Table 1].
[0022]
[Table 1]
As shown in [Table 1], the fibrinogen solutions of Examples 2 to 5 have a filterability when a virus removal membrane is used as compared with the solutions of Comparative Examples 1 to 4 in which no filter aid is added under the same conditions. Was much better.
[0023]
【The invention's effect】
A solution containing fibrinogen prepared by prefiltering by adding a filter aid in this manner exhibits unprecedented high filterability and fibrinogen recoverability. This is because the aggregate contained in the fibrinogen-containing solution is highly adsorbed and removed by the combination of the filter aid and the depth filtration membrane, and the virus is efficiently removed without clogging the filter. In addition, a simple aggregate may produce new aggregates in the step of virus removal membrane treatment after the preliminary filtration, but the virus filtration membrane is passed after the preliminary filtration treatment using the filter aid of the present invention. As a result, this problem was also solved.
