JP2004277312A - Fluorescent labeled steroid compound and method for producing the same - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a new ligand which enables the simple and rapid detection of a target base sequence in a homogeneous system not needing a B/F separation treatment in an aptamer method for detecting a target base sequence with the bonding affinity of a nucleic acid aptamer with the ligand as an indicator. <P>SOLUTION: This fluorescent labeled steroid compound is characterized by binding a fluorescent molecule to a steroid skeleton-having compound. The fluorescent labeled steroid compound is, for example, represented by the formula [R<SB>1</SB>and R<SB>2</SB>are each independently H, OH, a 1 to 5C straight chain or branched alkyl, amino, phenyl or benzyl; R<SB>5</SB>, R<SB>6</SB>and R<SB>7</SB>are each independently H or OH; (n) is an integer of 1 or 10]. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

（式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、及びＲ_４はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、ｎ及びｍはそれぞれ１〜１０の整数を表す。）
で示される、上記（３）の蛍光標識ステロイド化合物。
【０００８】
（５）下記の一般式（ＩＶ）：
【化１０】

（式中、Ｒ_１及びＲ_２はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、Ｒ_５、Ｒ_６及びＲ_７はそれぞれ独立して水素原子又は水酸基を表し、ｎは１〜１０の整数を表す。）
で示される蛍光標識ステロイド化合物。
【０００９】
（６）下記の一般式（Ｖ）：
【化１１】

（式中、Ｒ_３及びＲ_４はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、Ｒ_８は水素原子、直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、フェニル基、ベンジル基を表し、ｎ及びｍはそれぞれ１〜１０の整数を表す。）
で示される蛍光標識ステロイド化合物。
【００１０】
（７）以下の工程：
（ａ） 官能基としてカルボキシル基を持つステロイド骨格を有する化合物に、下記の一般式（ＶＩ）：
【化１２】

（式中、Ｒ_１及びＲ_２はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、Ｘは保護基を表し、ｎは１〜１０の整数を表す。）
で示される化合物を反応させる工程、
（ｂ） 工程（ａ）の反応生成物のアミノ基の保護基を溶媒中、酸又はアルカリ処理によって脱離する工程、
（ｃ） 工程（ｂ）の反応生成物のアミノ基に蛍光分子を導入する工程、
を含む蛍光標識ステロイド化合物の製造方法。
【００１１】
（８）以下の工程：
（ａ） 官能基としてヒドロキシル基及びカルボキシル基を持つステロイド骨格を有する化合物において、そのカルボキシル基をエステル化する工程、
（ｂ） 上記ヒドロキシル基に一般式（ＶＩＩ）：
【化１３】

（式中、Ｒ_３及びＲ_４はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、Ｙは保護基を表し、ｎは１〜１０の整数を表す。）
で示される化合物を反応させる工程、
（ｃ） 工程（ｂ）の反応生成物のアミノ基の保護基を溶媒中、酸又はアルカリ処理により脱離する工程、
（ｄ） 工程（ｂ）及び工程（ｃ）を少なくとも１回以上繰り返す工程、
（ｅ） 工程（ｄ）の反応生成物のアミノ基に蛍光分子を導入する工程、
を含む蛍光標識ステロイド化合物の製造方法。
【００１２】
（９）被検試料中の標的塩基配列を検出する方法であって、以下の工程：
（ａ）被検試料と、標的塩基配列とハイブリダイズ可能なプローブとを混合することにより、該被検試料中の標的塩基配列とプローブとがハイブリダイズした核酸アプタマーを形成させる工程、
（ｂ）上記核酸アプタマーに蛍光分子を結合させたステロイド骨格を有する化合物を反応させる工程、及び
（ｃ）蛍光分子から発生するシグナル変化を指標として標的塩基配列を検出する工程、
を含む、上記検出方法。
【００１３】
（１０）蛍光分子から発生するシグナル変化が、蛍光偏光度の変化である上記（９）の検出方法。
（１１）ステロイド骨格を有する化合物が、コール酸又はリトコール酸である上記（９）の検出方法。
（１２）ステロイド骨格を有する化合物にスペーサーを介して蛍光分子が結合していることを特徴とする、上記（９）の検出方法。
【００１４】
（１３）スペーサーが 下記の一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、又は（ＩＩＩ）：
【化１４】

（式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、及びＲ_４はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、ｎ及びｍはそれぞれ１〜１０の整数を表す。）
で示される基である、上記（１２）の検出方法。
【００１５】
（１４）蛍光分子を結合させたステロイド骨格を有する化合物が下記の一般式（ＩＶ）：
【化１５】

（式中、Ｒ_１及びＲ_２はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、Ｒ_５、Ｒ_６及びＲ７はそれぞれ独立して水素原子又は水酸基を表し、ｎは１〜１０の整数を表す。）
で示されるものである、上記（９）の検出方法。
【００１６】
（１５）蛍光分子を結合させたステロイド骨格を有する化合物が、下記の一般式（Ｖ）：
【化１６】

（式中、Ｒ_３及びＲ_４はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、Ｒ_８は水素原子、直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、フェニル基、ベンジル基を表し、ｎ及びｍはそれぞれ１〜１０の整数を表す。）
で示されるものである、上記（９）の検出方法。
【００１７】
（１６）核酸プローブ及び上記（１）から（６）のいずれかの蛍光標識ステロイド化合物を含む標的塩基配列検出用キット。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
１．蛍光標識ステロイド化合物
本発明によれば、ステロイド骨格を有する化合物に蛍光分子が結合していることを特徴とする蛍光標識ステロイド化合物が提供される。
【００１９】
本発明における「ステロイド骨格を有する化合物」としては、例えば、コール酸、リトコール酸、コール酸メチルエステル、ケノデオキシコール酸、シス−アンドロステソン、トランス−アンドロステロン、５α−ジヒドロテストステロン、プレグナンジオール、アルドステロン、プロゲステロン、エストロン、エストラジオール、エストリオール、プレグナンジオール、コルチコステロン、１７α−ヒドロキシプレグネノロン、１７α−プロゲステロン、ジハイドロエピアンドロステロン、１１−デオキシコルチソール、コルチソール、コルチソーン、１１−デオキシコルチコステロン、１１−ジハイドロコルチコステロン、１８−ヒドロキシコルチコステロン並びにこれらの誘導体等が挙げられる。
【００２０】
本発明において「蛍光分子」とは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）の他、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ダンシルクロライド、カスケードイエロースクシンイミドエステル、フルオレスカミン、イオシンイソチオシアネート（ＥＩＴＣ）、オレゴングリーン４８８スクシンイミドエステル、ＮＢＤクロライド、ピレン、テキサスレッドスクシンイミドエステル、パシフィックブルースクシンイミドエステル等が挙げられる。。
【００２１】
本発明の蛍光標識ステロイド化合物は、ステロイド骨格を有する化合物にスペーサーを介して蛍光分子が結合していることが好ましい。
【００２２】
上記「スペーサー」とは、上記ステロイド骨格を有する化合物の側鎖に蛍光分子を結合させることができる基であればその種類は特に限定はされず、例えば、下記の一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、又は（ＩＩＩ）：
【化１７】

（式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、及びＲ_４はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、ｎ及びｍはそれぞれ１〜１０の整数を表す。）
で示される基が挙げられる。
【００２３】
上記スペーサーを介して蛍光分子が結合している蛍光標識ステロイド化合物としては、下記の一般式（ＩＶ）又は（Ｖ）で示される化合物が挙げられる。これらの化合物は、核酸アプタマーと高い親和性を持ち、その蛍光偏光特性を評価することにより標的塩基配列中の一塩基のミスマッチを検出することが可能である。
【００２４】
【化１８】

（式中、Ｒ_１及びＲ_２はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、Ｒ_５、Ｒ_６及びＲ_７はそれぞれ独立して水素原子又は水酸基を表し、ｎは１〜１０の整数を表す。）
【００２５】
【化１９】

（式中、Ｒ_３及びＲ_４はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、Ｒ_８は水素原子、直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、フェニル基、ベンジル基を表し、ｎ及びｍはそれぞれ１〜１０の整数を表す。）
また、上記一般式（ＩＶ）又は（Ｖ）で示される化合物の好ましい例としては、具体的には下記化合物Ｃ、Ｆ、Ｊ、Ｍが挙げられ、化合物Ｆ、Ｍがより好ましい。
【００２６】
【化２０】

【００２７】
【化２１】

【００２８】
【化２２】

【００２９】
【化２３】

【００３０】
２．蛍光標識ステロイド化合物の製造方法
本発明の蛍光標識ステロイド化合物である、下記の一般式（ＩＶ）：
【化２４】

（式中、Ｒ_１及びＲ_２はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、Ｒ_５、Ｒ_６及びＲ_７はそれぞれ独立して水素原子又は水酸基を表し、ｎは１〜１０の整数を表す。）で示される化合物は例えば以下のようにして製造することができる。
【００３１】
まず、下記の一般式（ＶＩＩＩ）：
【化２５】

（式中、Ｒ_５、Ｒ_６及びＲ_７はそれぞれ独立して水素原子又は水酸基を表す。）
で示される化合物に、下記の一般式（ＶＩ）：
【化２６】

（式中、Ｒ_１及びＲ_２はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、Ｘは保護基を表し、ｎは１〜１０の整数を表す。）
で示される化合物を反応させる。次いで、酸又はアルカリ処理によってアミノ基の保護基（Ｘ）を脱離し、下記の一般式（ＩＸ）：
【化２７】

（式中、Ｒ_１及びＲ_２はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、Ｒ_５、Ｒ_６及びＲ_７はそれぞれ独立して水素原子又は水酸基を表し、ｎは１〜１０の整数を表す。）
で示されるアミノ基導入中間体を生成する。次いでこの中間体に蛍光分子（フルオレセインイソチオシアネート）を反応させる。
【００３２】
また、下記の一般式（Ｖ）：
【化２８】

（式中、Ｒ_３及びＲ_４はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、Ｒ_８は水素原子、直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、フェニル基、ベンジル基を表し、ｎ及びｍはそれぞれ１〜１０の整数を表す。）
で示される化合物は、例えば以下のようにして製造することができる。
【００３３】
まず、下記式：
【化２９】

で示す化合物にＲ_８−ＯＨを反応させ、該化合物中のＣＯＯＨ基をエステル化する。次いでこの反応生成物に下記の一般式（ＶＩＩ）：
【化３０】

（式中、Ｒ_３及びＲ_４はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、Ｙは保護基を表し、ｎは１〜１０の整数を表す。）
で示される化合物を反応させた後、酸又はアルカリ処理を行ってアミノ基の保護基（Ｙ）を脱離する。
【００３４】
次に、以上の一般式（ＶＩＩ）で示される化合物との反応、保護基の脱離操作をｎ回繰り返すことにより、下記の一般式（Ｘ）：
【化３１】

（式中、Ｒ_３及びＲ_４はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、Ｒ_８は水素原子、直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、フェニル基、ベンジル基を表し、ｎ及びｍはそれぞれ１〜１０の整数を表す。）
で示されるアミノ基導入中間体を生成し、次いでこの中間体に蛍光分子（フルオレセインイソチオシアネート）を反応させる。
【００３５】
上記各式において、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等が挙げられる。また、上記各式においてｎで表される整数は、例えば１〜１０、好ましくは２〜５、ｍで表される整数は、例えば１〜１０、好ましくは１〜５が挙げられる。
【００３６】
上記各式においてＸ，Ｙで表されるアミノ基の保護基としては、例えばＢＯＣ基またはＦＭＯＣ基、Ｚ基、ＣｌＺ基等を用いることができる。
【００３７】
３．標的塩基配列の検出方法
本発明の標的塩基配列の検出方法は、アプタマー法に基づくものであり、被検試料中の標的塩基配列と該塩基配列にハイブリダイズできるプローブによって形成される核酸アプタマーとリガンドとして使用する上記蛍光標識ステロイド化合物との結合親和性を指標に該標的塩基配列を検出する方法である。
【００３８】
本発明の標的塩基配列の検出方法は、以下の工程を含む。
（ａ）被検試料と、標的塩基配列とハイブリダイズ可能なプローブとを混合することにより、該被検試料中の標的塩基配列とプローブとがハイブリダイズした核酸アプタマーを形成させる工程、
（ｂ）上記核酸アプタマーに蛍光分子を結合させたステロイド骨格を有する化合物を反応させる工程、及び
（ｃ）蛍光分子から発生するシグナル変化を指標として標的塩基配列を検出する工程。
【００３９】
工程（ａ）においては、被検試料と、標的塩基配列とハイブリダイズ可能なプローブとを混合する。それにより、該被検試料中に標的塩基配列が存在する場合にはその標的塩基配列とプローブとがハイブリダイズした核酸アプタマーが形成される。
【００４０】
本発明において「核酸アプタマー」又は「アプタマー」とは、特定のリガンドに対する結合活性を有する核酸であり、分子内又は分子間に少なくとも１組の相補的な塩基配列を備え、この相補的な塩基配列のハイブリダイズによって構成された核酸分子を指す。本発明において好適な構造の核酸アプタマーとしては、例えば、前記相補的な塩基配列のハイブリダイズによる二本鎖部分（ハイブリッド）と、ハイブリッドを形成しない一本鎖部分とで構成され、前記一本鎖部分が水素結合、スタッキング、疎水性相互作用などにより形成されるそのアプタマーに固有の高次構造を有するものが挙げられる。かかる高次構造としては、一般的に知られている、ステム−ループ、ステム−バルジ、及びシュードノット構造のほか、特許文献１に記載されているステム−ループとステム−バルジの両者の特徴を併せ持つステム−ジャンクション構造（スリーウェイジャンクションなど）などをいい、本発明における核酸アプタマーはこれらの高次構造を有するものであれば特に限定はされないが、スリーウェイジャンクション構造を有するものが好ましい。
【００４１】
本発明において「被検試料」とは、標的塩基配列が存在するか否かを判定することが望まれる試料を指し、代表的には、生体試料（例えば全血、血漿、血清、尿、体液、唾液など）や、動物又は植物の細胞又は組織の培養物など、核酸を含有するものであれば特に限定はされない。被検試料は、当技術分野で周知の方法を適宜使用して調製することができる。一般的には、被検試料は、核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を抽出して調製する。例えば、ＤＮＡを抽出する場合には、フェノール抽出及びエタノール沈殿を行う方法、ガラスビーズを用いる方法など、またＲＮＡを抽出する場合には、グアニジン−塩化セシウム超遠心法、ホットフェノール法、又はＡＧＰＣ法などを利用することができる。
【００４２】
また「標的塩基配列」とは、検出が望まれる特定の配列を含む塩基配列をいい、そのような検出が望まれる特定の配列としては、例えば変異配列、多型配列などが挙げられる。「多型」とは、遺伝子又はその一部について１種以上の形態が同時に存在することを指し、遺伝子において少なくとも２つの異なる形態、すなわち２つの異なる塩基配列が存在する部分は、多型領域と呼ばれる。多型領域としては、例えば一塩基多型（ＳＮＰ）等の遺伝子多型があり、これは種々のアレルにおいて異なる。本発明において標的塩基配列としては、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む配列が好ましい。
【００４３】
また「プローブ」又は「核酸プローブ」とは、被検試料中に含まれる標的塩基配列とハイブリダイズ可能な核酸を指す。
【００４４】
プローブは、標的塩基配列とプローブとにより形成される核酸アプタマーの構造が、標的塩基配列の特定の配列の有無によって変わり、リガンドとの結合親和性が変化するように設計する。例えば、形成される核酸アプタマーの構造がスリーウェイジャンクション構造の場合には、ジャンクション部分にある３つの塩基対の結合が３つとも完全に相補的である必要がある。プローブの設計は、当業者であれば標的塩基配列の種類及びアプタマー構造を考慮して、適切なものを設計することができる。
【００４５】
例えば、標的塩基配列がＳＮＰを含み、形成される核酸アプタマーがスリーウェイジャンクション構造をとるとした場合のプローブの設計について、図１に参照しながら簡単に説明する。スリーウェイジャンクションは、３本の核酸鎖が相互に二本鎖を形成することによって、結果的に３つの二本鎖核酸が１ヶ所で交錯した構造をいう（図１Ａ）。すなわち、３本のステム（二本鎖）が１ヶ所で交差しており、６つの塩基による３組の相補塩基対がスリーウェイジャンクションを構成する。標的塩基配列の検出においては、この３本の核酸鎖のうち１本を標的塩基配列とし、２本をプローブとすることによって、アプタマー構造（すなわちスリーウェイジャンクション構造）を形成させる。そして、ジャンクション部分の相補塩基対の結合が３組とも完全に相補的である場合に、このスリーウェイジャンクション構造にリガンドが結合することができる。従って、ジャンクション部分の相補塩基対の結合が完全に相補的になるようにプローブを設計する。
【００４６】
図１Ａに示すように、ポジティブ標的塩基配列のＳＮＰ（塩基Ｇ）が検出対象となる場合、この標的塩基配列と相補的となるようなプローブＡ及びプローブａを設計する。このとき、標的塩基配列におけるＳＮＰに相当する塩基Ｇはスリーウェイジャンクションのジャンクション部分を構成し、かつジャンクション部分の結合は全て完全に相補的となる。プローブＡは、標的塩基配列と相補的である部分と、プローブａと相補的である部分から構成される。プローブａは、標的塩基配列と相補的である部分と、プローブＡと相補的である部分から構成される。このプローブＡとプローブａは、別々の核酸分子であってもよいし、例えばヘアピン構造をもった１本の核酸分子であってもよい。当業者であれば、標的塩基配列の塩基配列に基づいて、手動で又は公知のプローブ設計用ソフトウエアを用いて、特定の条件下にてハイブリダイズ可能なプローブの塩基配列を決定することができる。
【００４７】
以上のように設計したプローブを用いて標的塩基配列と接触させた場合、それらがハイブリダイズして図１Ａに示すアプタマー構造が形成される。このアプタマー構造のジャンクション部分は完全な相補性により結合し、アプタマーの高次構造が特定の構造に保持されるため、この構造にリガンドは結合することができる。一方、標的とするＳＮＰ（塩基Ｇ）とは異なるＳＮＰ（塩基Ｃ）を有する塩基配列（ネガティブ塩基配列）は、図１Ｂに示すように、標的塩基配列により形成されるアプタマー構造とは異なるアプタマー構造を形成する。すなわち、スリーウェイジャンクション構造のジャンクション部分において、ＳＮＰに相当する塩基Ｃが相補性によりプローブと結合していない。このようなアプタマー構造に対するリガンドの結合親和性は、上記図１Ａのものとは異なり、その親和性は低くなる。
【００４８】
また設計するプローブの長さ（サイズ）は、標的塩基配列の種類、核酸アプタマーの構造の種類、ハイブリダイゼーション条件などに応じて適宜変更する必要がある。例えば、標的塩基配列がＳＮＰを含み、核酸アプタマーがスリーウェイジャンクション構造をとるように２本のプローブを設計する場合には、各プローブの長さは、６塩基長以上、好ましくは１０塩基長以上とすることができる。
【００４９】
設計したプローブが標的塩基配列と適切にハイブリダイズするか否かは、公知のプローブ設計用ソフトウエアを用いて確認することができ、そのようなソフトウエアとしては、例えばＧＥＮＥＴＹＸ（ゼネティックス社製）などが挙げられる。
【００５０】
プローブは、標的塩基配列とハイブリダイズして核酸アプタマーを形成することができるものであれば、どのような核酸分子又はその誘導体であってもよい。具体的には、天然源から単離された核酸分子（例えばＤＮＡ、ＲＮＡなど）又は化学的に合成された核酸分子（例えば増幅産物など）、合成ヌクレオチド誘導体を含む核酸の誘導体、あるいは骨格がペプチド結合又はアルキル鎖などからなる核酸の誘導体などが挙げられる。プローブは、当技術分野で公知の任意の手法、例えば化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、ＰＣＲ、又はこれらの組み合わせにより作成することができる。
【００５１】
本発明において「ハイブリダイズ」又は「ハイブリダイゼーション」とは、２つ以上の核酸がそれらの相補性に基づいて特異的に結合することを指す。従って、標的塩基配列と「ハイブリダイズ可能なプローブ」とは、標的塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸といえる。「相補的」又は「相補性」とは、塩基対合則の関係を有する核酸について用いられる概念であり、相補性は、「部分的」、すなわち核酸中のある程度の数の塩基のみが塩基対合則により一致しているようなものであってもよいし、全体が完全に相補的であってもよい。他の核酸類似体（例えば、ＩｓｏＣ／ＩｓｏＧ塩基対）又は天然の核酸と塩基対を形成するために使用される核酸類似体もまた、上記「相補性」及び「相補的」の定義内に含まれ、塩基対合するパートナーに対し相補的であるといえる。
【００５２】
上述のように調製された被検試料とプローブとを混合する方法は、特に限定されない。例えば被検試料をプローブを含有する溶液に添加する方法、被検試料とプローブ含有溶液とを混合する方法が挙げられる。また混合する条件は、被検試料中の標的塩基配列とプローブとがハイブリダイズ可能な条件下であれば特に限定されない。ハイブリダイゼーションは、核酸間の相補性、採用する条件のストリンジェンシー、及び形成されるハイブリッドのＴ_ｍなどの要因により影響を受けるため、これらの要因を考慮して適宜ハイブリダイゼーション条件を決定する。「ストリンジェンシー」とは、ハイブリダイゼーションを実施する際の、温度、イオン強度及び他の化合物に関する条件をいう。「高ストリンジェンシー」条件では、相補的な塩基を高頻度で有する配列からなる核酸の間でのみ塩基対合が起こる。例えばＳＮＰなどの一塩基の差を検出することが必要な場合には、この「高ストリンジェンシー条件」を採用する。ストリンジェンシーを含むハイブリダイゼーション条件とその決定は当技術分野で周知であり、一般的な実験プロトコールに記載されている。
【００５３】
工程（ｂ）においては、上記で形成された核酸アプタマーと、蛍光分子を結合させたステロイド骨格を有する化合物（以下、蛍光標識リガンドという）を反応させる。
【００５４】
ここで、蛍光標識リガンドの量は、反応させる核酸アプタマーの量を考慮して適宜決定することができる。また、核酸アプタマーと蛍光標識リガンドとを混合する方法・条件は、核酸アプタマーと蛍光標識リガンドとが結合することが可能な条件下であれば特に限定されない。
【００５５】
工程（ｃ）においては、核酸アプタマーと蛍光標識リガンドとの結合親和性を指標として標的塩基配列を検出する。ここで、「検出」とは、被検試料中に標的塩基配列が存在しているか否かを判定することを指し、場合により被検試料中に含まれる標的塩基配列の量（又は割合）を測定することをも指す。
【００５６】
本発明においては、核酸アプタマーとリガンドの結合親和性の変化の検出、すなわち標的塩基配列の検出は、蛍光分子から発生するシグナル変化を指標として行うことできる。蛍光分子から発生するシグナル変化とは、蛍光分子と他の分子（ここでは核酸アプタマー）との結合によって生じる蛍光偏光度をいう。蛍光偏光法による検出では、溶液中に（均一系）おいて核酸アプタマーと蛍光標識リガンドとの相互作用を解析することが可能であり、Ｂ／Ｆ分離の必要もなく、簡便かつ迅速に標的塩基配列を検出することができる。
ここで、蛍光標識リガンドとしては、上記化合物Ｃ、Ｆ、Ｊ、Ｍを用いることができる。
【００５７】
４．標的塩基配列検出用キット
本発明によれば、標的塩基配列検出用キットもまた提供される。本発明の標的塩基配列検出用キットは、アプタマー法にて標的塩基配列を検出するための反応試薬として上記蛍光標識リガンドと核酸プローブを含み、また補助物質として、限定されるものではないが、緩衝液、溶解液、使用説明書などを含んでいてもよい。
【００５８】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は下記実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
【００５９】
（実施例１） 蛍光標識ステロイド化合物の製造（１）
コール酸（和光純薬工業社製）（１．２２ ｍｍｏｌ）を無水塩化メチレンに溶解し、ｔｅｒｔ−ブチルＮ−（３−アミノプロピル） カルバメート （１．３４ ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（以下ＨＯＢｔ）（０．１２ ｍｍｏｌ）を加えた。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド（以下ＥＤＣ）（１．５９ ｍｍｏｌ）反応液に滴下し、室温にて攪拌した。反応液を水洗し、有機層を乾燥した後、溶媒を留去した。残渣を精製することにより下式で示される化合物Ａを得た。
【００６０】
【化３２】

【００６１】
化合物Ａの物理化学的性質は以下の通りである。
ＭＳ ｍ／ｚ （％）：５６５（２２）、４６５（１００）、４４７（７２）、４３０（７２）、４１２（６３）、３９４（５３）
次に、化合物Ａ （３００ ｍｇ）をトリフルオロ酢酸／塩化メチレン溶液に溶解し、攪拌した後、溶媒留去した。残渣にメタノールと水酸化ナトリウム水溶液を加え、室温にて攪拌し、その後有機溶媒を減圧留去した。有機層を水洗し、乾燥した後、溶媒を留去した。残渣を精製し、下式で示される化合物Ｂを得た。
【００６２】
【化３３】

【００６３】
化合物Ｂの物理化学的性質は以下の通りである。
ＭＳ ｍ／ｚ （％）：４６５（８０）、３０７（１８）
化合物Ｂ（０．０２ ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（以下ＤＭＦ）に溶解し、フルオレセインイソチオシアネート（以下ＦＩＴＣ） （７．８ ｍｇ）とジイソプロピルエチルアミン（以下ＤＩＥＡ）０．０４ ｍｌを加え、室温にて攪拌し、反応液を水で洗浄し、有機層を乾燥後、溶媒を留去した。得られた残渣を精製し、下式で示される核酸アプタマー法において蛍光標識リガンドとなる化合物Ｃを得た。
【００６４】
【化３４】

【００６５】
化合物Ｃの物理化学的性質は以下の通りである。
ＭＳ ｍ／ｚ （％）：８５４（１２）、３９０（１００）
（実施例２） 蛍光標識ステロイド化合物の製造（２）
リトコール酸（和光純薬工業社製）（２．０ ｍｍｏｌ）を塩化メチレンに溶かし、ｔｅｒｔ−ブチルＮ−（３−アミノプロピル） カルバメート （ ２．２ ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．２ ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（２．０ ｍｍｏｌ）を加え、室温にて攪拌した。反応液を水洗し、有機層を乾燥した後、溶媒を留去した。残渣を精製し、下式で示される化合物Ｄを得た。
【００６６】
【化３５】

【００６７】
化合物Ｄの物理化学的性質は以下の通りである。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）：６．１０１ （ｍ， １Ｈ ）， ４．９０７ （ｍ， １Ｈ）， ３．６１８ （ｍ， １Ｈ ）， ３．６３２ （ｍ， ２Ｈ ）， ２．３５４ （ｍ， ２Ｈ）， ２．２５０ （ｍ， １Ｈ）， ２．０７３ （ｍ， １Ｈ）， １．９７４〜１．９４４ （ｍ， １Ｈ）， １．９１６〜０．９６３ （ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅｔｓ， ３７Ｈ）， ０．９３４ （ｓ， ３Ｈ）， ０．９１７ （ｓ， ３Ｈ）， ０．６４１ （ｓ， ３Ｈ）
次いで、化合物Ｄ（０．５３ ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸／塩化メチレン溶液に溶解し、攪拌した後、溶媒留去した。残渣にメタノールと水酸化ナトリウム水溶液を加え、攪拌し、その後有機溶媒を減圧留去した。有機層を水洗し、乾燥した後、溶媒を留去した。残渣を精製し、下式で示される化合物Ｅを得た。
【００６８】
【化３６】

【００６９】
化合物Ｅの物理化学的性質は以下の通りである。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）： ３．５９４ （ｍ， １Ｈ）， ３．４１〜３．２１ （ｍ， ３Ｈ ）， ２．８９８ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ＝６．８ ）， ２．２６５ （ｍ， １Ｈ）， ２．０８６ （ｍ， １Ｈ）， １．９７９〜１．９４８ （ｍ， １Ｈ）， １．８６２〜０．９７１ （ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅｔｓ， ３０Ｈ）， ０．９５５ （ｓ， ３Ｈ）， ０．９４１ （ｓ， ３Ｈ）， ０．６８７ （ｓ， ３Ｈ）ＭＳ ｍ／ｚ （％）：４３３（１００）、４１６（２０）、１５４（６５）、１３６（４７）
化合物Ｅ（０．０５７ｍｍｏｌ）を塩化メチレンに溶解し、トリエチルアミン（１６ μＬ）及びＦＩＴＣ （０．１１４ ｍｍｏｌ）を加え、室温にて攪拌した。反応液を水で洗浄し、有機層を乾燥後、溶媒を留去した。得られた残渣を精製し、下式で示される核酸アプタマー法において蛍光標識リガンドとなる化合物Ｆを得た。
【００７０】
【化３７】

【００７１】
化合物Ｆの物理化学的性質は以下の通りである。
ＭＳ ｍ／ｚ （％）：８２２（５０）、４８２（２７）、４６０（６３）、３９０（５５）
【００７２】
（実施例３）蛍光標識ステロイド化合物の製造（３）
リトコール酸（１．３２ ｍｍｏｌ）をメタノールに溶解させ、塩化アセチル（１．９９ ｍｍｏｌ）を加え、室温にて攪拌した。反応液を水で洗浄し、有機層を乾燥後、溶媒を留去した。残渣を精製し、下式で示される化合物Ｇを得た。
【００７３】
【化３８】

【００７４】
化合物Ｇの物理化学的性質は以下の通りである。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）：３．６６４ （ｓ， ３Ｈ ）， ３．６３２ （ｍ， １Ｈ ）， ２．３５４ （ｍ， １Ｈ）， ２．２１５ （ｍ， １Ｈ）， １．９７１〜１．９４１ （ｍ， １Ｈ）， １．８７７〜０．９７２ （ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅｔｓ， ２６Ｈ）， ０．９１７〜０．９０２ （ｍ， ６Ｈ）， ０．６４１ （ｓ， ３Ｈ）
化合物Ｇ （０．５１２ ｍｍｏｌ ）を塩化メチレンに溶かし、Ｎ−ボックグリシン （１．２０ｍｍｏｌ） 、ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．０２ ｍｍｏｌ ）、４−（ジメチルアミノ）及びピリジン（６２ ｍｇ， ０．５１２ ｍｍｏｌ ）を加え、室温にて攪拌した。反応液を水にて洗浄し、有機層を乾燥後、溶媒を留去した。残渣を精製し、下式で示される化合物Ｈを得た。
【００７５】
【化３９】

化合物Ｈの物理化学的性質は以下の通りである。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）：４．９８９ （ｍ， １Ｈ ）， ４．７３９ （ｍ， １Ｈ ）， ３．６５２ （ｄ Ｊ＝８．２， １Ｈ ）， ３．６６５ （ｓ， ３Ｈ ）， ２．３５３ （ｍ， １Ｈ）， ２．２１６ （ｍ， １Ｈ）， １．９７８〜１．９４８ （ｍ， １Ｈ）， １．８９６〜０．９８３ （ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅｔｓ， ３５Ｈ）， ０．９２８ （ｓ， ３Ｈ）， ０．９１１ （ｄ， Ｊ＝６．４， ３Ｈ）， ０．６４３ （ｓ， ３Ｈ）
化合物Ｈ（０．１８ ｍｍｏｌ ）をトリフルオロ酢酸／塩化メチレンに溶かし、攪拌後、溶媒を留去した。そこに水酸化ナトリウム水溶液とメタノールを加え、攪拌した。反応液を水で洗浄し、有機層を乾燥後、溶媒を留去した。残渣を精製し、下式で示される化合物Ｉを得た。
【００７６】
【化４０】

【００７７】
化合物Ｉの物理化学的性質は以下の通りである。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）：４．７８３ （ｍ， １Ｈ ）， ３．６６５ （ｓ， ３Ｈ ）， ３．３９４ （ｓ， ２Ｈ ）， ２．３５２ （ｍ， １Ｈ）， ２．２１５ （ｍ， １Ｈ）， １．９７９〜１．９４９ （ｍ， １Ｈ）， １．９４０〜０．９９６ （ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅｔｓ， ２８Ｈ）， ０．９３２ （ｓ， ３Ｈ）， ０．９１０ （ｄ， Ｊ＝６．４， ３Ｈ）， ０．６４４ （ｓ， ３Ｈ）
化合物Ｉ（０．０６７ ｍｍｏｌ）を塩化メチレンに溶解して、トリエチルアミン（ １９ μｌ）、ＦＩＴＣ（５２ ｍｇ， ０．１３４ ｍｍｏｌ）を加え、室温にて攪拌した。反応液を水にて洗浄し、有機層を乾燥後、溶媒を留去した。残渣を精製し、下式に示されるスペーサーとしてアミノ酸であるグリシンが１分子付加し、アプタマー法において蛍光標識リガンドとなる化合物Ｊを得た。
【００７８】
【化４１】

【００７９】
化合物Ｊの物理化学的性質は以下の通りである。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）：１０．２７９ （ｍ， １Ｈ ）， １０．１１３ （ｍ， ２Ｈ ）， ８．３１５〜８．２１１（ａｒｏｍ．， ２Ｈ）， ７．７２５ （ａｒｏｍ．， １Ｈ）， ７．２１２ （ａｒｏｍ．，１Ｈ）， ６．６７５〜６．５４５（ａｒｏｍ．， ５Ｈ）， ４．７１２ （ｍ， １Ｈ ）， ３．３９４ （ｄ， Ｊ＝５．１， ２Ｈ ）， ３．５７３ （ｓ， ３Ｈ ）， ３．３９４ （ｓ， ２Ｈ ）， ２．３０５ （ｍ， １Ｈ）， ２．２７９ （ｍ， １Ｈ）， １．９０９〜１．０４４（ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅｔｓ， ２９Ｈ）， ０．９３２ （ｓ， ３Ｈ）， ０．８４９（ｄ， Ｊ＝６．４， ３Ｈ）， ０．６０５ （ｓ， ３Ｈ）
【００８０】
（実施例４）蛍光標識ステロイド化合物の製造（４）
上記で調製した化合物Ｉ（０．２３ ｍｍｏｌ） を塩化メチレンに溶解し、Ｎ−ボックグリシン （０．２９ ｍｍｏｌ）， ＨＯＢｔ（０．０２３ ｍｍｏｌ） を加え０℃に冷却した。次にＥＤＣ （０．３２ ｍｍｏｌ）を添加し、室温に戻し、攪拌した。反応液を水にて洗浄し、有機層を乾燥後、溶媒を留去した。残渣を精製し、下式に示される化合物Ｋを得た。
【００８１】
【化４２】

【００８２】
化合物Ｋの物理化学的性質は以下の通りである。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）：６．５４５ （ｍ， １Ｈ ）， ５．１０８ （ｍ， １Ｈ ）， ４．７９５ （ｍ， １Ｈ ）， ４．１２１ （ｄ， Ｊ＝７．０， ２Ｈ）， ３．８５５ （ｄ， Ｊ＝５．７， ２Ｈ）， ３．６６５ （ｓ， ３Ｈ ）， ２．３５８ （ｍ， １Ｈ）， ２．２１５ （ｍ， １Ｈ）， １．９７９〜１．９５０ （ｍ， １Ｈ）， １．９０５〜０．９９６ （ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅｔｓ， ３５Ｈ）， ０．９３０ （ｓ， ３Ｈ）， ０．９１１ （ｄ， Ｊ＝６．４， ３Ｈ）， ０．６４５ （ｓ， ３Ｈ）
化合物Ｋ（０．２９ ｍｍｏｌ ）をトリフルオロ酢酸／ 塩化メチレン溶液に溶かし、室温にて攪拌した。反応溶媒を減圧留去し、水酸化ナトリウム／ メタノール溶液を加え攪拌した。反応液を水にて洗浄し、有機層を乾燥後、溶媒を留去した。残渣を精製し、下式に示される化合物Ｌを得た。
【００８３】
【化４３】

【００８４】
化合物Ｌの物理化学的性質は以下の通りである。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）：７．６６４ （ｍ， １Ｈ ）， ４．７９０ （ｍ， １Ｈ ）， ４．１４９ （ｍ， ２Ｈ）， ３．６６３ （ｓ， ３Ｈ ）， ３．５５１ （ｍ， ２Ｈ）， ２．３５３ （ｍ， １Ｈ）， ２．２１６ （ｍ， １Ｈ）， ２．０７８ （ｍ， １Ｈ）， １．９５１〜１．０７０ （ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅｔｓ， ２８Ｈ）， ０．９２７〜０．９０６ （ｍ， ６Ｈ）， ０．６４５ （ｓ， ３Ｈ）
化合物Ｌ（０．１０ ｍｍｏｌ）を塩化メチレンに溶解した後、トリエチルアミン （０．２０ ｍｍｏｌ）及び ＦＩＴＣ（ ７８ ｍｇ， ０．２０ ｍｍｏｌ） を加え、室温で攪拌した。反応液を水にて洗浄し、有機層を乾燥後、溶媒を留去した。残渣を精製し、下式で示されるスペーサーとしてグリシンが２分子付加し、核酸アプタマー法において蛍光標識リガンドとなる化合物Ｍを得た。
【００８５】
【化４４】

【００８６】
化合物Ｍの物理化学的性質は以下の通りである。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）：１０．２９３ （ｍ， １Ｈ ）， １０．１０２ （ｍ， ２Ｈ ）， ８．５１６ （ｍ， １Ｈ ）， ８．３５０ （ｍ， １Ｈ ）， ８．１３２ （ｍ， １Ｈ ）， ７．７７８（ａｒｏｍ．， ３Ｈ）， ７．１９０ （ａｒｏｍ．， １Ｈ）， ７．２１２ （ａｒｏｍ．，１Ｈ）， ６．６７４〜６．５４４（ａｒｏｍ．， ５Ｈ）， ４．６５８ （ｍ， １Ｈ ）， ４．２５４ （ｄ， Ｊ＝４．９， ２Ｈ ）， ４．０９３ （ｄ， Ｊ＝５．３， ２Ｈ ）， ３．５６９ （ｓ， ３Ｈ ）， ３．３９４ （ｓ， ２Ｈ ）， ２．３１８ （ｍ， １Ｈ）， ２．１９５ （ｍ， １Ｈ）， １．９１６〜１．９０９ （ｍ， １Ｈ）， １．８９９〜０．９８１（ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅｔｓ， ２８Ｈ）， ０．９００ （ｓ， ３Ｈ）， ０．８５９（ｄ， Ｊ＝６．４， ３Ｈ）， ０．６０８ （ｓ， ３Ｈ）
【００８７】
（実施例５） 核酸アプタマーと蛍光標識リガンドとの結合親和性を蛍光偏光度による測定
下記の標的塩基配列（下線部分がＳＮＰに対応）にそれぞれ下記の２分子のプローブとスリーウェイジャンクション構造を含む核酸アプタマーを結合させ、核酸アプタマーと化合物Ｃ，Ｆ，Ｊ，Ｍとのそれぞれの結合親和性の差異を蛍光偏光度により評価した。
ポジティブ標的塩基配列’（ポジティブコントロール用）：
５’−ＣＣＴＡＧＣＡＧＣＧＧＧＡＧＣＧＧＴＧＧ−３’（配列番号１）
ネガティブ標的塩基配列（ネガティブコントロール用）：
５’−ＣＣＴＡＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＣＧＧＴＧＧ−３’ （配列番号２）
プローブａ： ５’−ＣＣＡＣＣＧＣＴＣＣＡＣＴＣＡＡＣＴＧＧ−３’ （配列番号３）
プローブＡ： ５’−ＣＣＡＧＴＴＧＡＧＴＣＧＣＴＧＣＴＡＧＧ−３’ （配列番号４）
【００８８】
操作を簡単に説明すると、上記ポジティブ標的塩基配列又はネガティブ標的塩基配列と、プローブａ及びプローブＡの３分子のＤＮＡをそれぞれ１０μＭ含有するバッファー（組成：ｐＨ＝７．６， ５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， １Ｍ ＮａＣｌ， ３０ ｍＭ ＫＣｌ， ５ ｍＭ ＭｇＣｌ_２）溶液を作成し、９５℃で５分間かけて上記ＤＮＡを変性させ、３０分間かけて２０℃まで徐冷することによりスリーウェイジャンクション構造をとるアプタマーを形成した（図１）。このＤＮＡ溶液に実施例１から４の方法で製造したフルオレセインイソチオシアネート （ＦＩＴＣ）を標識したリガンド（化合物Ｃ，Ｆ，Ｊ，Ｍ）を加え、ＤＮＡとリガンドのモル比が２０対１又は２対１になる溶液を調製した。この溶液の蛍光偏光度を測定したところ、表１のような結果になった。
【００８９】
【表１】

【００９０】
ポジティブ標的塩基配列又はネガティブ標的塩基配列の場合により形成されるアプタマーをそれぞれ図１Ａ及び図Ｂに示す。ポジティブ標的塩基配列の場合にはＳＮＰの塩基においてプローブとの結合が起こり、このスリーウェイジャンクション構造にリガンドが結合する。一方、ネガティブ標的塩基配列の場合にはＳＮＰの塩基においてプローブとの結合がおこらず、リガンドは結合しない。したがってポジティブ標的塩基配列とネガティブ標的塩基配列とではリガンドの結合親和性が異なる。表１から明らかなように、ポジティブ配列又はネガティブ配列を用いた場合に、核酸アプタマーとリガンドとの結合親和性の変化が、リガンドを標識した蛍光分子の蛍光偏光度の差により確認できた。すなわち、一塩基の違い（ポジティブ配列とネガティブ配列の差）により、核酸アプタマーとリガンドとの結合親和性が変化することが示された。表１の番号１と番号２より、ステロイド骨格の７位と１２位の水酸基を取り除き分子の疎水性を高めることで、核酸アプタマーとリガンドとの結合親和性が強くなることが確認された。さらに、番号６と番号７の比較により、ステロイド骨格と蛍光分子の間にスペーサーとしてグリシンを２分子付加したリガンドの方が、グリシンを１分子付加したリガンドよりも、核酸アプタマーとリガンドとの結合親和性が強くなることが確認された。
【００９１】
【発明の効果】
本発明によれば、アプタマー法を用いて標的塩基配列を均一系において検出するのに適した、蛍光分子を結合させたステロイド骨格を有する化合物が提供される。該化合物をアプタマー法においてリガンドとして用いると、ＳＰＲや不均一系のようにＢ／Ｆ分離を行く、また核酸アプタマーと該化合物を混合するだけで良いことから、操作が簡便で、解析作業を短時間で行うことができ、スループットを飛躍的に向上させることができる。さらに、洗浄の工程で除去しきれない残渣の影響もなく、感度も格段に向上する。
【００９２】
【配列表】

【００９３】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１〜４：合成オリゴヌクレオチド
【図面の簡単な説明】
【図１】標的塩基配列とプローブとにより形成されるアプタマーの構造を示す図である。Ａはポジティブ標的塩基配列の場合、Ｂはネガティブ標的塩基配列の場合のアプタマーの構造を示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a fluorescent-labeled steroid compound characterized in that a fluorescent molecule is bound to a compound having a steroid skeleton. The fluorescent-labeled steroid compound of the present invention can be used as a ligand in an aptamer method for detecting a target base sequence using the binding affinity between a nucleic acid aptamer and a ligand as an index.
[0002]
[Prior art]
As a method for detecting a target base sequence, there is a method utilizing hybridization between complementary base sequences represented by the Southern hybridization method. However, a nucleic acid having a complementary base sequence causes hybridization even if both base sequences are not completely complementary, so that a single nucleotide such as a single nucleotide polymorphism (hereinafter, referred to as SNP) is generated. Cannot be directly detected by the method using hybridization. As a SNP detection method, for example, a PCR-SSCP method or the like is known, but it is not suitable for processing a large amount of a sample because electrophoresis is required.
[0003]
As a completely new approach to target nucleic acid detection, a method of detecting a target nucleotide sequence using the binding affinity between a nucleic acid aptamer and a ligand without using hybridization between complementary nucleotide sequences so far (hereinafter, referred to as “ (Referred to as “aptamer method”) (see Patent Document 1). The aptamer method is a method of forming a nucleic acid aptamer containing a target base sequence and a probe capable of hybridizing thereto, reacting the nucleic acid aptamer with a ligand, and detecting the target base sequence using the binding affinity as an index. In the aptamer method, a phenomenon in which the structure of an aptamer formed by a specific base sequence and a probe changes depending on whether or not the target base sequence is included, and also changes the binding affinity between the aptamer and the ligand. Is used to detect the target nucleotide sequence. The magnitude of the binding affinity between a nucleic acid aptamer and a ligand depends on the base sequence that maintains the structure of the nucleic acid aptamer, and even a single nucleotide substitution in the base sequence greatly changes the binding affinity. Then, mutation such as SNP in the target base sequence can be detected. As described above, in the aptamer method, detection is performed using the binding affinity between a nucleic acid aptamer and a ligand as an index, and the detection is performed by a heterogeneous system, a homogeneous system, and a surface plasmon resonance (SPR) method. However, detection by SPR requires not only a step of immobilizing a ligand or a nucleic acid aptamer on a metal thin film, but also B / F separation. Therefore, it takes several hours or more to detect only one target base sequence. In a heterogeneous system, a nucleic acid aptamer resulting from the hybridization between a labeled probe and a target base sequence is captured by a ligand on a solid phase, and the target base sequence is bound to the ligand, and free (unbound) substances are removed. Perform detection after washing. As described above, in a heterogeneous system, the analysis is performed by separating the bound form (B) and the free form (F), so that high sensitivity can be expected in principle. However, it is necessary to go through a B / F separation step. As with SPR, the analysis operation is complicated, requires much time and labor, and it is difficult to increase the throughput. On the other hand, in a homogeneous system, detection is performed using a signal change generated from a labeling substance based on the binding between a nucleic acid aptamer and a ligand, and examples thereof include a fluorescence polarization method. The fluorescence polarization method utilizes the fact that the degree of rotation (fluorescence polarization degree) between the time when a fluorescent molecule in a liquid is excited by plane polarized light and the time when it emits fluorescence varies depending on the binding molecule. This is a method for analyzing the interaction between substances such as antibodies and proteins. Since the homogeneous system does not require B / F separation, the operation is simple, and there is also an advantage that measurement reproducibility is easily ensured.
[0004]
[Patent Document 1]
International Publication Number WO01 / 44509 A1
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
Accordingly, the present invention provides a novel aptamer method for detecting a target base sequence by using the binding affinity between a nucleic acid aptamer and a ligand as an index, which enables simple and rapid detection of the target base sequence with high accuracy. To provide ligands
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, by using a compound having a steroid skeleton to which a fluorescent substance is bound as a ligand, detection of a target base sequence in the aptamer method is simple and rapid, In addition, they have found that they can be performed with high accuracy, and have completed the present invention.
[0007]
That is, the present invention includes the following inventions.
(1) A fluorescently labeled steroid compound, wherein a fluorescent molecule is bound to a compound having a steroid skeleton.
(2) The fluorescently labeled steroid compound of (1) above, wherein the compound having a steroid skeleton is cholic acid or lithocholic acid.
(3) The fluorescently labeled steroid compound of (1) or (2), wherein a fluorescent molecule is bonded to the compound having a steroid skeleton via a spacer.
(4) The spacer has the following general formula (I), (II) or (III):
Embedded image

(Where R ₁ , R ₂ , R ₃ , And R ₄ Each independently represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, an amino group, a phenyl group, or a benzyl group, and n and m each represent an integer of 1 to 10 Represent. )
The fluorescently labeled steroid compound of the above (3), which is represented by:
[0008]
(5) The following general formula (IV):
Embedded image

(Where R ₁ And R ₂ Each independently represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, an amino group, a phenyl group, or a benzyl group; ₅ , R ₆ And R ₇ Each independently represents a hydrogen atom or a hydroxyl group, and n represents an integer of 1 to 10. )
A fluorescently labeled steroid compound represented by
[0009]
(6) The following general formula (V):
Embedded image

(Where R ₃ And R ₄ Each independently represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, an amino group, a phenyl group, or a benzyl group; ₈ Represents a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group, a phenyl group, or a benzyl group, and n and m each represent an integer of 1 to 10. )
A fluorescently labeled steroid compound represented by
[0010]
(7) The following steps:
(A) Compounds having a steroid skeleton having a carboxyl group as a functional group are represented by the following general formula (VI):
Embedded image

(Where R ₁ And R ₂ Each independently represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, an amino group, a phenyl group, or a benzyl group; X represents a protecting group; Represents an integer of 10. )
Reacting a compound represented by
(B) removing the protecting group for the amino group of the reaction product of step (a) by treatment with an acid or alkali in a solvent;
(C) introducing a fluorescent molecule into the amino group of the reaction product of step (b),
A method for producing a fluorescently labeled steroid compound comprising:
[0011]
(8) The following steps:
(A) in a compound having a steroid skeleton having a hydroxyl group and a carboxyl group as a functional group, a step of esterifying the carboxyl group;
(B) General formula (VII):
Embedded image

(Where R ₃ And R ₄ Each independently represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, an amino group, a phenyl group, or a benzyl group; Y represents a protecting group; Represents an integer of 10. )
Reacting a compound represented by
(C) removing an amino-protecting group of the reaction product of the step (b) by treatment with an acid or an alkali in a solvent;
(D) repeating step (b) and step (c) at least once or more;
(E) introducing a fluorescent molecule into the amino group of the reaction product of step (d),
A method for producing a fluorescently labeled steroid compound comprising:
[0012]
(9) A method for detecting a target base sequence in a test sample, comprising the following steps:
(A) mixing a test sample and a probe capable of hybridizing with the target base sequence to form a nucleic acid aptamer in which the target base sequence and the probe in the test sample are hybridized;
(B) reacting a compound having a steroid skeleton with a fluorescent molecule bound to the nucleic acid aptamer; and
(C) a step of detecting a target base sequence using a signal change generated from a fluorescent molecule as an index,
The above-mentioned detection method, comprising:
[0013]
(10) The detection method according to (9), wherein the change in the signal generated from the fluorescent molecule is a change in the degree of fluorescence polarization.
(11) The detection method according to the above (9), wherein the compound having a steroid skeleton is cholic acid or lithocholic acid.
(12) The detection method according to the above (9), wherein a fluorescent molecule is bonded to a compound having a steroid skeleton via a spacer.
[0014]
(13) The spacer has the following general formula (I), (II) or (III):
Embedded image

(Where R ₁ , R ₂ , R ₃ , And R ₄ Each independently represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, an amino group, a phenyl group, or a benzyl group, and n and m each represent an integer of 1 to 10 Represent. )
The detection method according to the above (12), which is a group represented by:
[0015]
(14) A compound having a steroid skeleton bonded with a fluorescent molecule is represented by the following general formula (IV):
Embedded image

(Where R ₁ And R ₂ Each independently represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, an amino group, a phenyl group, or a benzyl group; ₅ , R ₆ And R7 each independently represent a hydrogen atom or a hydroxyl group, and n represents an integer of 1 to 10. )
The detection method according to (9) above,
[0016]
(15) A compound having a steroid skeleton bonded with a fluorescent molecule is represented by the following general formula (V):
Embedded image

(Where R ₃ And R ₄ Each independently represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, an amino group, a phenyl group, or a benzyl group; ₈ Represents a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group, a phenyl group, or a benzyl group, and n and m each represent an integer of 1 to 10. )
The detection method according to (9) above,
[0017]
(16) A kit for detecting a target base sequence comprising a nucleic acid probe and the fluorescently labeled steroid compound according to any one of the above (1) to (6).
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0018]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
1. Fluorescently labeled steroid compounds
According to the present invention, there is provided a fluorescence-labeled steroid compound, wherein a fluorescent molecule is bound to a compound having a steroid skeleton.
[0019]
Examples of the "compound having a steroid skeleton" in the present invention include, for example, cholic acid, lithocholic acid, cholic acid methyl ester, chenodeoxycholic acid, cis-androsterone, trans-androsterone, 5α-dihydrotestosterone, pregnanediol, aldosterone, progesterone, Estrone, estradiol, estriol, pregnanediol, corticosterone, 17α-hydroxypregnenolone, 17α-progesterone, dihydroepiandrosterone, 11-deoxycortisol, cortisol, cortisone, 11-deoxycorticosterone, 11-dihydrocorti. Costosterone, 18-hydroxycorticosterone and derivatives thereof, and the like.
[0020]
In the present invention, "fluorescent molecule" refers to fluorescein isothiocyanate (FITC), tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC), dansyl chloride, cascade yellow succinimide ester, fluorescamine, iosine isothiocyanate (EITC), Oregon green 488 succinimide ester, NBD chloride, pyrene, Texas Red succinimide ester, Pacific Blue succinimide ester and the like. .
[0021]
The fluorescent-labeled steroid compound of the present invention preferably has a fluorescent molecule bound to a compound having a steroid skeleton via a spacer.
[0022]
The type of the “spacer” is not particularly limited as long as it is a group capable of binding a fluorescent molecule to the side chain of the compound having a steroid skeleton. For example, the following general formulas (I) and (II) ) Or (III):
Embedded image

(Where R ₁ , R ₂ , R ₃ , And R ₄ Each independently represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, an amino group, a phenyl group, or a benzyl group, and n and m each represent an integer of 1 to 10 Represent. )
The group shown by these is mentioned.
[0023]
Examples of the fluorescent-labeled steroid compound to which a fluorescent molecule is bound via the spacer include compounds represented by the following general formula (IV) or (V). These compounds have a high affinity for nucleic acid aptamers, and it is possible to detect a single base mismatch in the target base sequence by evaluating the fluorescence polarization characteristics.
[0024]
Embedded image

(Where R ₁ And R ₂ Each independently represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, an amino group, a phenyl group, or a benzyl group; ₅ , R ₆ And R ₇ Each independently represents a hydrogen atom or a hydroxyl group, and n represents an integer of 1 to 10. )
[0025]
Embedded image

(Where R ₃ And R ₄ Each independently represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, an amino group, a phenyl group, or a benzyl group; ₈ Represents a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group, a phenyl group, or a benzyl group, and n and m each represent an integer of 1 to 10. )
Preferred examples of the compound represented by the general formula (IV) or (V) specifically include the following compounds C, F, J, and M, and compounds F and M are more preferable.
[0026]
Embedded image

[0027]
Embedded image

[0028]
Embedded image

[0029]
Embedded image

[0030]
2. Method for producing fluorescently labeled steroid compound
The following general formula (IV), which is the fluorescently labeled steroid compound of the present invention:
Embedded image

(Where R ₁ And R ₂ Each independently represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, an amino group, a phenyl group, or a benzyl group; ₅ , R ₆ And R ₇ Each independently represents a hydrogen atom or a hydroxyl group, and n represents an integer of 1 to 10. The compound represented by the formula (1) can be produced, for example, as follows.
[0031]
First, the following general formula (VIII):
Embedded image

(Where R ₅ , R ₆ And R ₇ Each independently represents a hydrogen atom or a hydroxyl group. )
Has the following general formula (VI):
Embedded image

(Where R ₁ And R ₂ Each independently represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, an amino group, a phenyl group, or a benzyl group; X represents a protecting group; Represents an integer of 10. )
Are reacted. Subsequently, the protecting group (X) of the amino group is removed by an acid or alkali treatment, and the following general formula (IX):
Embedded image

(Where R ₁ And R ₂ Each independently represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, an amino group, a phenyl group, or a benzyl group; ₅ , R ₆ And R ₇ Each independently represents a hydrogen atom or a hydroxyl group, and n represents an integer of 1 to 10. )
To produce an amino group-introduced intermediate represented by The intermediate is then reacted with a fluorescent molecule (fluorescein isothiocyanate).
[0032]
Also, the following general formula (V):
Embedded image

(Where R ₃ And R ₄ Each independently represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, an amino group, a phenyl group, or a benzyl group; ₈ Represents a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group, a phenyl group, or a benzyl group, and n and m each represent an integer of 1 to 10. )
Can be produced, for example, as follows.
[0033]
First, the following formula:
Embedded image

The compound represented by R ₈ -OH is reacted to esterify the COOH group in the compound. The reaction product is then added to the following general formula (VII):
Embedded image

(Where R ₃ And R ₄ Each independently represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, an amino group, a phenyl group, or a benzyl group; Y represents a protecting group; Represents an integer of 10. )
Is reacted with an acid or an alkali to remove the protecting group (Y) for the amino group.
[0034]
Next, the above reaction with the compound represented by the general formula (VII) and the operation of removing the protecting group are repeated n times to obtain the following general formula (X):
Embedded image

(Where R ₃ And R ₄ Each independently represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, an amino group, a phenyl group, or a benzyl group; ₈ Represents a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group, a phenyl group, or a benzyl group, and n and m each represent an integer of 1 to 10. )
Is produced, and a fluorescent molecule (fluorescein isothiocyanate) is reacted with the intermediate.
[0035]
In each of the above formulas, examples of the linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, a butyl group, a pentyl group, an isopropyl group, an isobutyl group, and a sec-butyl group. Group, tert-butyl group and the like. In each of the above formulas, the integer represented by n is, for example, 1 to 10, preferably 2 to 5, and the integer represented by m is, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5.
[0036]
In the above formulas, as the protecting group for the amino group represented by X and Y, for example, a BOC group, an FMOC group, a Z group, a ClZ group, or the like can be used.
[0037]
3. Target nucleotide sequence detection method
The method for detecting a target base sequence of the present invention is based on the aptamer method, and the nucleic acid aptamer formed by a probe capable of hybridizing to a target base sequence in a test sample and the base sequence, and the above-described fluorescent label used as a ligand. This is a method of detecting the target base sequence using the binding affinity to a steroid compound as an index.
[0038]
The method for detecting a target base sequence of the present invention includes the following steps.
(A) mixing a test sample and a probe capable of hybridizing with the target base sequence to form a nucleic acid aptamer in which the target base sequence and the probe in the test sample are hybridized;
(B) reacting a compound having a steroid skeleton with a fluorescent molecule bound to the nucleic acid aptamer; and
(C) a step of detecting a target base sequence using a signal change generated from the fluorescent molecule as an index.
[0039]
In the step (a), a test sample and a probe capable of hybridizing with a target base sequence are mixed. Thereby, when the target base sequence is present in the test sample, a nucleic acid aptamer in which the target base sequence is hybridized with the probe is formed.
[0040]
In the present invention, “nucleic acid aptamer” or “aptamer” is a nucleic acid having a binding activity to a specific ligand, and has at least one set of complementary base sequences within a molecule or between molecules. Refers to a nucleic acid molecule constituted by hybridization. The nucleic acid aptamer having a suitable structure in the present invention includes, for example, a double-stranded portion (hybrid) formed by hybridization of the complementary base sequence, and a single-stranded portion that does not form a hybrid. Those having a higher-order structure unique to the aptamer in which the moiety is formed by hydrogen bonding, stacking, hydrophobic interaction, and the like. Such higher-order structures include, in addition to generally known stem-loop, stem-bulge, and pseudoknot structures, the features of both the stem-loop and stem-bulge described in Patent Document 1. It refers to a stem-junction structure (such as a three-way junction) and the like, and the nucleic acid aptamer in the present invention is not particularly limited as long as it has these higher-order structures, but a nucleic acid aptamer having a three-way junction structure is preferable.
[0041]
In the present invention, the “test sample” refers to a sample for which it is desired to determine whether or not a target base sequence is present, and is typically a biological sample (eg, whole blood, plasma, serum, urine, body fluid, etc.). , Saliva, etc.) and animal or plant cells or tissue cultures as long as they contain nucleic acids. The test sample can be prepared by appropriately using a method well known in the art. Generally, a test sample is prepared by extracting a nucleic acid (DNA or RNA). For example, when extracting DNA, a method of performing phenol extraction and ethanol precipitation, a method using glass beads, etc., and when extracting RNA, a guanidine-cesium chloride ultracentrifugation method, a hot phenol method, or an AGPC method is used. Etc. can be used.
[0042]
The term “target base sequence” refers to a base sequence containing a specific sequence for which detection is desired, and specific sequences for which such detection is desired include, for example, mutant sequences, polymorphic sequences, and the like. "Polymorphism" refers to the presence of one or more forms of a gene or a part thereof at the same time, and a portion of a gene in which at least two different forms, that is, two different base sequences are present, is defined as a polymorphic region. Called. Polymorphic regions include, for example, genetic polymorphisms such as single nucleotide polymorphisms (SNPs), which differ in various alleles. In the present invention, the target base sequence is preferably a sequence containing a single nucleotide polymorphism (SNP).
[0043]
The term "probe" or "nucleic acid probe" refers to a nucleic acid capable of hybridizing with a target base sequence contained in a test sample.
[0044]
The probe is designed so that the structure of the nucleic acid aptamer formed by the target base sequence and the probe changes depending on the presence or absence of a specific sequence of the target base sequence, and the binding affinity with the ligand changes. For example, when the structure of the nucleic acid aptamer to be formed is a three-way junction structure, it is necessary that all three base pair bonds at the junction are completely complementary. Those skilled in the art can design an appropriate probe in consideration of the type of the target base sequence and the aptamer structure.
[0045]
For example, the design of a probe in the case where the target nucleotide sequence contains an SNP and the nucleic acid aptamer formed has a three-way junction structure will be briefly described with reference to FIG. Three-way junction refers to a structure in which three nucleic acid strands form a double strand with each other, resulting in three double-stranded nucleic acids interleaving at one site (FIG. 1A). That is, three stems (double strands) intersect at one place, and three complementary base pairs of six bases constitute a three-way junction. In the detection of the target base sequence, an aptamer structure (ie, a three-way junction structure) is formed by using one of the three nucleic acid strands as the target base sequence and two as probes. Then, when the binding of the complementary base pairs at the junction portion is completely complementary to all three, the ligand can bind to the three-way junction structure. Therefore, the probe is designed so that the binding of the complementary base pair at the junction is completely complementary.
[0046]
As shown in FIG. 1A, when an SNP (base G) of a positive target base sequence is to be detected, a probe A and a probe a that are complementary to the target base sequence are designed. At this time, the base G corresponding to the SNP in the target base sequence constitutes a junction part of the three-way junction, and all the junctions are completely complementary. Probe A is composed of a portion complementary to the target base sequence and a portion complementary to probe a. Probe a is composed of a part complementary to the target base sequence and a part complementary to probe A. The probe A and the probe a may be separate nucleic acid molecules, or may be, for example, a single nucleic acid molecule having a hairpin structure. Those skilled in the art can determine, based on the base sequence of the target base sequence, the base sequence of a probe that can hybridize under specific conditions manually or by using known probe design software. .
[0047]
When the probe designed as described above is brought into contact with the target base sequence, they hybridize to form the aptamer structure shown in FIG. 1A. The junction of the aptamer structure binds with perfect complementarity, and the ligand can bind to this structure because the higher order structure of the aptamer is retained in a specific structure. On the other hand, a base sequence (negative base sequence) having a SNP (base C) different from the target SNP (base G) has an aptamer structure different from the aptamer structure formed by the target base sequence, as shown in FIG. 1B. To form That is, at the junction of the three-way junction structure, the base C corresponding to the SNP is not bonded to the probe due to complementarity. The binding affinity of the ligand for such aptamer structure differs from that of FIG. 1A above, and the affinity is low.
[0048]
In addition, the length (size) of the designed probe must be appropriately changed according to the type of the target base sequence, the type of the nucleic acid aptamer structure, the hybridization conditions, and the like. For example, when the target base sequence contains an SNP and two probes are designed so that the nucleic acid aptamer takes a three-way junction structure, the length of each probe is 6 bases or more, preferably 10 bases or more. It can be.
[0049]
Whether or not the designed probe appropriately hybridizes to the target nucleotide sequence can be confirmed using known probe design software. Examples of such software include GENETYX (manufactured by Genetics). Is mentioned.
[0050]
The probe may be any nucleic acid molecule or a derivative thereof as long as it can hybridize with the target base sequence to form a nucleic acid aptamer. Specifically, nucleic acid molecules (eg, DNA, RNA, etc.) isolated from natural sources or chemically synthesized nucleic acid molecules (eg, amplification products, etc.), nucleic acid derivatives including synthetic nucleotide derivatives, or skeletons of peptides Derivatives of a nucleic acid comprising a bond or an alkyl chain, and the like. Probes can be made by any technique known in the art, for example, chemical synthesis, DNA replication, reverse transcription, PCR, or a combination thereof.
[0051]
In the present invention, “hybridize” or “hybridization” refers to specific binding of two or more nucleic acids based on their complementarity. Therefore, a “hybridizable probe” can be said to be a nucleic acid having a base sequence complementary to the target base sequence. "Complementary" or "complementarity" is a concept used for nucleic acids having a base-pairing relationship, and complementarity is defined as "partial", that is, only a certain number of bases in a nucleic acid are paired. It may be such that they match according to a rule, or the whole may be completely complementary. Other nucleic acid analogs (eg, IsoC / IsoG base pairs) or nucleic acid analogs used to base pair with natural nucleic acids are also included within the above definitions of “complementary” and “complementary”. Thus, it can be said to be complementary to the base-pairing partner.
[0052]
The method of mixing the test sample and the probe prepared as described above is not particularly limited. For example, there are a method of adding a test sample to a solution containing a probe, and a method of mixing a test sample and a probe-containing solution. The mixing condition is not particularly limited as long as the target base sequence in the test sample and the probe can hybridize. Hybridization depends on the complementarity between the nucleic acids, the stringency of the conditions employed, and the T of the hybrid formed. _m The hybridization conditions are appropriately determined in consideration of these factors. "Stringency" refers to conditions relating to temperature, ionic strength and other compounds at the time of performing hybridization. Under "high stringency" conditions, base pairing occurs only between nucleic acids consisting of sequences having a high frequency of complementary bases. For example, when it is necessary to detect a single base difference such as SNP, the “high stringency condition” is adopted. Hybridization conditions, including stringency, and their determination are well known in the art and are described in general experimental protocols.
[0053]
In step (b), the nucleic acid aptamer formed above is reacted with a compound having a steroid skeleton to which a fluorescent molecule is bound (hereinafter, referred to as a fluorescent labeled ligand).
[0054]
Here, the amount of the fluorescently labeled ligand can be appropriately determined in consideration of the amount of the nucleic acid aptamer to be reacted. The method and conditions for mixing the nucleic acid aptamer and the fluorescently labeled ligand are not particularly limited as long as the nucleic acid aptamer and the fluorescently labeled ligand can be bound.
[0055]
In step (c), the target base sequence is detected using the binding affinity between the nucleic acid aptamer and the fluorescently labeled ligand as an index. Here, “detection” refers to determining whether or not a target base sequence is present in a test sample, and in some cases, determining the amount (or ratio) of the target base sequence contained in the test sample. Also refers to measuring.
[0056]
In the present invention, detection of a change in binding affinity between a nucleic acid aptamer and a ligand, that is, detection of a target base sequence can be performed using a signal change generated from a fluorescent molecule as an index. The signal change generated from the fluorescent molecule refers to the degree of fluorescence polarization generated by the binding of the fluorescent molecule to another molecule (here, a nucleic acid aptamer). In the detection by the fluorescence polarization method, it is possible to analyze the interaction between the nucleic acid aptamer and the fluorescently labeled ligand in a solution (homogeneous system), and it is possible to simply and quickly remove the target base without the need for B / F separation. The sequence can be detected.
Here, the compounds C, F, J, and M can be used as the fluorescent labeling ligand.
[0057]
4. Target nucleotide sequence detection kit
According to the present invention, a kit for detecting a target nucleotide sequence is also provided. The kit for detecting a target base sequence of the present invention includes the above-described fluorescently labeled ligand and a nucleic acid probe as reaction reagents for detecting the target base sequence by the aptamer method.Also, as auxiliary substances, buffering is not limited. It may contain a liquid, a dissolving solution, instructions for use, and the like.
[0058]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to the following examples.
[0059]
(Example 1) Production of fluorescently labeled steroid compound (1)
Cholic acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (1.22 mmol) was dissolved in anhydrous methylene chloride, and tert-butyl N- (3-aminopropyl) carbamate (1.34 mmol) and 1-hydroxybenzotriazole (hereinafter, referred to as “hydroxyl”) were dissolved. HOBt) (0.12 mmol) was added. 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (hereinafter, EDC) (1.59 mmol) was added dropwise to the reaction solution, and the mixture was stirred at room temperature. After the reaction solution was washed with water and the organic layer was dried, the solvent was distilled off. The compound A represented by the following formula was obtained by purifying the residue.
[0060]
Embedded image

[0061]
The physicochemical properties of Compound A are as follows.
MS m / z (%): 565 (22), 465 (100), 447 (72), 430 (72), 412 (63), 394 (53)
Next, the compound A (300 mg) was dissolved in a trifluoroacetic acid / methylene chloride solution, stirred, and then the solvent was distilled off. Methanol and an aqueous sodium hydroxide solution were added to the residue, and the mixture was stirred at room temperature. Thereafter, the organic solvent was distilled off under reduced pressure. After the organic layer was washed with water and dried, the solvent was distilled off. The residue was purified to obtain a compound B represented by the following formula.
[0062]
Embedded image

[0063]
The physicochemical properties of Compound B are as follows.
MS m / z (%): 465 (80), 307 (18)
Compound B (0.02 mmol) is dissolved in dimethylformamide (DMF), fluorescein isothiocyanate (FITC) (7.8 mg) and diisopropylethylamine (DIEA) 0.04 ml are added, and the mixture is stirred at room temperature. The reaction solution was washed with water, the organic layer was dried, and the solvent was distilled off. The obtained residue was purified to obtain a compound C to be a fluorescently labeled ligand in a nucleic acid aptamer method represented by the following formula.
[0064]
Embedded image

[0065]
The physicochemical properties of Compound C are as follows.
MS m / z (%): 854 (12), 390 (100)
(Example 2) Production of fluorescently labeled steroid compound (2)
Lithocholic acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (2.0 mmol) was dissolved in methylene chloride, and tert-butyl N- (3-aminopropyl) carbamate (2.2 mmol), HOBt (0.2 mmol), EDC (2.0 mmol) and stirred at room temperature. After the reaction solution was washed with water and the organic layer was dried, the solvent was distilled off. The residue was purified to obtain a compound D represented by the following formula.
[0066]
Embedded image

[0067]
The physicochemical properties of Compound D are as follows.
1H NMR (400 MHz): 6.101 (m, 1H), 4.907 (m, 1H), 3.618 (m, 1H), 3.632 (m, 2H), 2.354 (m, 2H) , 2.250 (m, 1H), 2.073 (m, 1H), 1.974-1.944 (m, 1H), 1.916-0.963 (series of multiplets, 37H), 0.934 (S, 3H), 0.917 (s, 3H), 0.641 (s, 3H)
Next, compound D (0.53 mmol) was dissolved in a trifluoroacetic acid / methylene chloride solution, stirred, and then the solvent was distilled off. Methanol and an aqueous sodium hydroxide solution were added to the residue and stirred, and then the organic solvent was distilled off under reduced pressure. After the organic layer was washed with water and dried, the solvent was distilled off. The residue was purified to obtain a compound E represented by the following formula.
[0068]
Embedded image

[0069]
The physicochemical properties of Compound E are as follows.
1H NMR (400 MHz): 3.594 (m, 1H), 3.41 to 3.21 (m, 3H), 2.898 (t, 2H, J = 6.8), 2.265 (m, 1H) ), 2.086 (m, 1H), 1.979 to 1.948 (m, 1H), 1.862 to 0.971 (series of multiples, 30H), 0.955 (s, 3H), 0. 941 (s, 3H), 0.687 (s, 3H) MS m / z (%): 433 (100), 416 (20), 154 (65), 136 (47)
Compound E (0.057 mmol) was dissolved in methylene chloride, triethylamine (16 μL) and FITC (0.114 mmol) were added, and the mixture was stirred at room temperature. The reaction solution was washed with water, and after drying the organic layer, the solvent was distilled off. The obtained residue was purified to obtain a compound F to be a fluorescent label ligand in the nucleic acid aptamer method represented by the following formula.
[0070]
Embedded image

[0071]
The physicochemical properties of Compound F are as follows.
MS m / z (%): 822 (50), 482 (27), 460 (63), 390 (55)
[0072]
(Example 3) Production of fluorescently labeled steroid compound (3)
Lithocholic acid (1.32 mmol) was dissolved in methanol, acetyl chloride (1.99 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature. The reaction solution was washed with water, and after drying the organic layer, the solvent was distilled off. The residue was purified to obtain a compound G represented by the following formula.
[0073]
Embedded image

[0074]
The physicochemical properties of Compound G are as follows.
1H NMR (400 MHz): 3.664 (s, 3H), 3.632 (m, 1H), 2.354 (m, 1H), 2.215 (m, 1H), 1.971-1.941 ( m, 1H), 1.877 to 0.972 (series of multiplets, 26H), 0.917 to 0.902 (m, 6H), 0.641 (s, 3H).
Compound G (0.512 mmol) was dissolved in methylene chloride, and N-bockglycine (1.20 mmol), dicyclohexylcarbodiimide (1.02 mmol), 4- (dimethylamino) and pyridine (62 mg, 0.512 mmol) were dissolved. Was added and stirred at room temperature. The reaction solution was washed with water, and after drying the organic layer, the solvent was distilled off. The residue was purified to obtain a compound H represented by the following formula.
[0075]
Embedded image

The physicochemical properties of Compound H are as follows.
1H NMR (400 MHz): 4.989 (m, 1H), 4.739 (m, 1H), 3.652 (dJ = 8.2, 1H), 3.665 (s, 3H), 2.353 (M, 1H), 2.216 (m, 1H), 1.978 to 1.948 (m, 1H), 1.896 to 0.983 (series of multiples, 35H), 0.928 (s, 3H) ), 0.911 (d, J = 6.4, 3H), 0.643 (s, 3H)
Compound H (0.18 mmol) was dissolved in trifluoroacetic acid / methylene chloride, and after stirring, the solvent was distilled off. An aqueous solution of sodium hydroxide and methanol were added thereto, followed by stirring. The reaction solution was washed with water, and after drying the organic layer, the solvent was distilled off. The residue was purified to obtain a compound I represented by the following formula.
[0076]
Embedded image

[0077]
The physicochemical properties of Compound I are as follows.
1H NMR (400 MHz): 4.783 (m, 1H), 3.665 (s, 3H), 3.394 (s, 2H), 2.352 (m, 1H), 2.215 (m, 1H) , 1.979-1.949 (m, 1H), 1.940-0.996 (series of multiples, 28H), 0.932 (s, 3H), 0.910 (d, J = 6.4, 3H), 0.644 (s, 3H)
Compound I (0.067 mmol) was dissolved in methylene chloride, triethylamine (19 μl) and FITC (52 mg, 0.134 mmol) were added, and the mixture was stirred at room temperature. The reaction solution was washed with water, and after drying the organic layer, the solvent was distilled off. The residue was purified, and one molecule of glycine, which is an amino acid, was added as a spacer represented by the following formula to obtain a compound J to be a fluorescent labeling ligand in the aptamer method.
[0078]
Embedded image

[0079]
The physicochemical properties of Compound J are as follows.
1H NMR (400 MHz): 10.279 (m, 1H), 10.113 (m, 2H), 8.315 to 8.211 (arom., 2H), 7.725 (arom., 1H), 7. 212 (arom., 1H), 6.675 to 6.545 (arom., 5H), 4.712 (m, 1H), 3.394 (d, J = 5.1, 2H), 3.573 ( s, 3H), 3.394 (s, 2H), 2.305 (m, 1H), 2.279 (m, 1H), 1.909 to 1.044 (series of multiplets, 29H), 0.932. (S, 3H), 0.849 (d, J = 6.4, 3H), 0.605 (s, 3H)
[0080]
(Example 4) Production of fluorescently labeled steroid compound (4)
Compound I (0.23 mmol) prepared above was dissolved in methylene chloride, N-Bockglycine (0.29 mmol) and HOBt (0.023 mmol) were added, and the mixture was cooled to 0 ° C. Next, EDC (0.32 mmol) was added, the temperature was returned to room temperature, and the mixture was stirred. The reaction solution was washed with water, and after drying the organic layer, the solvent was distilled off. The residue was purified to obtain a compound K represented by the following formula.
[0081]
Embedded image

[0082]
The physicochemical properties of Compound K are as follows.
1H NMR (400 MHz): 6.545 (m, 1H), 5.108 (m, 1H), 4.795 (m, 1H), 4.121 (d, J = 7.0, 2H), 3. 855 (d, J = 5.7, 2H), 3.665 (s, 3H), 2.358 (m, 1H), 2.215 (m, 1H), 1.979 to 1.950 (m, 1H), 1.905 to 0.996 (series of multiples, 35H), 0.930 (s, 3H), 0.911 (d, J = 6.4, 3H), 0.645 (s, 3H)
Compound K (0.29 mmol) was dissolved in a trifluoroacetic acid / methylene chloride solution and stirred at room temperature. The reaction solvent was distilled off under reduced pressure, and a sodium hydroxide / methanol solution was added and stirred. The reaction solution was washed with water, and after drying the organic layer, the solvent was distilled off. The residue was purified to obtain a compound L represented by the following formula.
[0083]
Embedded image

[0084]
The physicochemical properties of Compound L are as follows.
1H NMR (400 MHz): 7.664 (m, 1H), 4.790 (m, 1H), 4.149 (m, 2H), 3.663 (s, 3H), 3.551 (m, 2H). , 2.353 (m, 1H), 2.216 (m, 1H), 2.078 (m, 1H), 1.951 to 1.070 (series of multiplets, 28H), 0.927 to 0.906 (M, 6H), 0.645 (s, 3H)
After dissolving Compound L (0.10 mmol) in methylene chloride, triethylamine (0.20 mmol) and FITC (78 mg, 0.20 mmol) were added, and the mixture was stirred at room temperature. The reaction solution was washed with water, and after drying the organic layer, the solvent was distilled off. The residue was purified, and two molecules of glycine were added as a spacer represented by the following formula to obtain a compound M to be a fluorescent-labeled ligand in the nucleic acid aptamer method.
[0085]
Embedded image

[0086]
The physicochemical properties of Compound M are as follows.
1H NMR (400 MHz): 10.293 (m, 1H), 10.102 (m, 2H), 8.516 (m, 1H), 8.350 (m, 1H), 8.132 (m, 1H) , 7.778 (arom., 3H), 7.190 (arom., 1H), 7.212 (arom., 1H), 6.674-6.544 (arom., 5H), 4.658 (m , 1H), 4.254 (d, J = 4.9, 2H), 4.093 (d, J = 5.3, 2H), 3.569 (s, 3H), 3.394 (s, 2H). ), 2.318 (m, 1H), 2.195 (m, 1H), 1.916-1.909 (m, 1H), 1.899-0.981 (series of multiplets, 28H), 0. 900 (s, 3H), 0. 59 (d, J = 6.4, 3H), 0.608 (s, 3H)
[0087]
(Example 5) Measurement of the binding affinity between a nucleic acid aptamer and a fluorescently labeled ligand by the degree of fluorescence polarization
The following two probes and a nucleic acid aptamer containing a three-way junction structure are respectively bound to the following target base sequences (underlined parts correspond to SNPs), and the nucleic acid aptamer and each of the compounds C, F, J and M are bound. The difference in affinity was evaluated by the degree of fluorescence polarization.
Positive target base sequence '(for positive control):
5'-CCTAGCAGCGGGAGCGGGTGG-3 '(SEQ ID NO: 1)
Negative target nucleotide sequence (for negative control):
5′-CCTAGCAGCCGGAGCGGTGG-3 ′ (SEQ ID NO: 2)
Probe a: 5′-CCACCGCTCCACTCAACTGG-3 ′ (SEQ ID NO: 3)
Probe A: 5'-CCAGTTGAGTCGCTGCTAGGG-3 '(SEQ ID NO: 4)
[0088]
Briefly describing the operation, a buffer (composition: pH = 7.6, 50 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 30 mM KCl, 5 mM MgCl ₂ A) A solution was prepared, the DNA was denatured at 95 ° C. for 5 minutes, and gradually cooled to 20 ° C. for 30 minutes to form an aptamer having a three-way junction structure (FIG. 1). To this DNA solution, a ligand (compounds C, F, J, M) labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) produced by the method of Examples 1 to 4 was added, and the molar ratio of DNA to ligand was 20: 1 or 2: 1. A solution was prepared. When the degree of fluorescence polarization of this solution was measured, the results shown in Table 1 were obtained.
[0089]
[Table 1]

[0090]
Aptamers formed depending on the positive or negative target nucleotide sequence are shown in FIGS. 1A and 1B, respectively. In the case of a positive target base sequence, binding to the probe occurs at the base of the SNP, and a ligand binds to the three-way junction structure. On the other hand, in the case of a negative target base sequence, binding to the probe does not occur at the base of the SNP, and no ligand binds. Therefore, the binding affinity of the ligand differs between the positive target base sequence and the negative target base sequence. As is clear from Table 1, when the positive sequence or the negative sequence was used, the change in the binding affinity between the nucleic acid aptamer and the ligand could be confirmed by the difference in the degree of fluorescence polarization of the ligand-labeled fluorescent molecule. That is, it was shown that the difference in single base (difference between the positive sequence and the negative sequence) changed the binding affinity between the nucleic acid aptamer and the ligand. From Nos. 1 and 2 in Table 1, it was confirmed that the binding affinity between the nucleic acid aptamer and the ligand was enhanced by removing the hydroxyl groups at the 7th and 12th positions of the steroid skeleton and increasing the hydrophobicity of the molecule. Further, from the comparison between No. 6 and No. 7, the binding affinity between the nucleic acid aptamer and the ligand is greater in the ligand in which two molecules of glycine are added as a spacer between the steroid skeleton and the fluorescent molecule than in the ligand in which one molecule of glycine is added. It was confirmed that the property became stronger.
[0091]
【The invention's effect】
According to the present invention, there is provided a compound having a steroid skeleton bonded to a fluorescent molecule, which is suitable for detecting a target base sequence in a homogeneous system using the aptamer method. When the compound is used as a ligand in the aptamer method, B / F separation is performed as in the case of SPR or a heterogeneous system, and since only the nucleic acid aptamer and the compound need to be mixed, the operation is simple and the analysis work is short. This can be performed in a short time, and the throughput can be dramatically improved. Further, there is no influence of residues that cannot be completely removed in the washing step, and the sensitivity is remarkably improved.
[0092]
[Sequence list]

[0093]
[Sequence List Free Text]
SEQ ID NOS: 1-4: synthetic oligonucleotides
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the structure of an aptamer formed by a target base sequence and a probe. A shows the structure of the aptamer in the case of the positive target base sequence, and B shows the structure of the aptamer in the case of the negative target base sequence.

Claims (16)

A fluorescent-labeled steroid compound, wherein a fluorescent molecule is bound to a compound having a steroid skeleton. The fluorescently labeled steroid compound according to claim 1, wherein the compound having a steroid skeleton is cholic acid or lithocholic acid. 3. The fluorescent-labeled steroid compound according to claim 1, wherein a fluorescent molecule is bonded to the compound having a steroid skeleton via a spacer. The spacer has the following general formula (I), (II), or (III):

(Wherein, R ₁ , R ₂ , R ₃ , and R ₄ each independently represent a hydrogen atom, a hydroxyl group, a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, an amino group, a phenyl group, Represents a benzyl group, and n and m each represent an integer of 1 to 10.)
The fluorescently labeled steroid compound according to claim 3, which is represented by: The following general formula (IV):

(Expressed in the formula, R ₁ and R ₂ are each independently a hydrogen atom, a hydroxyl group, a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, an amino group, a phenyl group, a benzyl group, R ₅ , R ₆ and R ₇ each independently represent a hydrogen atom or a hydroxyl group, and n represents an integer of 1 to 10.)
A fluorescently labeled steroid compound represented by The following general formula (V):

(Expressed in the formula, R ₃ and R ₄ each independently represent a hydrogen atom, a hydroxyl group, a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, an amino group, a phenyl group, a benzyl group, R ₈ Represents a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group, a phenyl group, or a benzyl group, and n and m each represent an integer of 1 to 10.)
A fluorescently labeled steroid compound represented by The following steps:
(A) Compounds having a steroid skeleton having a carboxyl group as a functional group are represented by the following general formula (VI):

(Wherein, R ₁ and R ₂ each independently represent a hydrogen atom, a hydroxyl group, a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, an amino group, a phenyl group, or a benzyl group; Represents a protecting group, and n represents an integer of 1 to 10.)
Reacting a compound represented by
(B) removing the protecting group for the amino group of the reaction product of step (a) by treatment with an acid or alkali in a solvent;
(C) introducing a fluorescent molecule into the amino group of the reaction product of step (b),
A method for producing a fluorescently labeled steroid compound comprising: The following steps:
(A) in a compound having a steroid skeleton having a hydroxyl group and a carboxyl group as a functional group, a step of esterifying the carboxyl group;
(B) General formula (VII):

(Wherein, R ₃ and R ₄ each independently represent a hydrogen atom, a hydroxyl group, a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, an amino group, a phenyl group, or a benzyl group; Represents a protecting group, and n represents an integer of 1 to 10.)
Reacting a compound represented by
(C) removing an amino-protecting group of the reaction product of step (b) by treatment with an acid or alkali in a solvent;
(D) repeating step (b) and step (c) at least once or more;
(E) introducing a fluorescent molecule into the amino group of the reaction product of step (d),
A method for producing a fluorescently labeled steroid compound comprising: A method for detecting a target base sequence in a test sample, comprising the following steps:
(A) mixing a test sample and a probe capable of hybridizing with the target base sequence to form a nucleic acid aptamer in which the target base sequence and the probe in the test sample are hybridized;
(B) reacting a compound having a steroid skeleton with a fluorescent molecule bound to the nucleic acid aptamer; and (c) detecting a target base sequence using a signal change generated from the fluorescent molecule as an index,
The detection method described above. The detection method according to claim 9, wherein the change in signal generated from the fluorescent molecule is a change in the degree of fluorescence polarization. The detection method according to claim 9, wherein the compound having a steroid skeleton is cholic acid or lithocholic acid. 10. The detection method according to claim 9, wherein a fluorescent molecule is bonded to a compound having a steroid skeleton via a spacer. The spacer has the following general formula (I), (II), or (III):

(Wherein, R ₁ , R ₂ , R ₃ , and R ₄ each independently represent a hydrogen atom, a hydroxyl group, a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, an amino group, a phenyl group, Represents a benzyl group, and n and m each represent an integer of 1 to 10.)
The detection method according to claim 12, which is a group represented by the formula: The compound having a steroid skeleton to which a fluorescent molecule is bound is represented by the following general formula (IV):

(Expressed in the formula, R ₁ and R ₂ are each independently a hydrogen atom, a hydroxyl group, a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, an amino group, a phenyl group, a benzyl group, R ₅ , R ₆ and R ₇ each independently represent a hydrogen atom or a hydroxyl group, and n represents an integer of 1 to 10.)
The detection method according to claim 9, wherein A compound having a steroid skeleton bonded with a fluorescent molecule is represented by the following general formula (V):

(Expressed in the formula, R ₃ and R ₄ each independently represent a hydrogen atom, a hydroxyl group, a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, an amino group, a phenyl group, a benzyl group, R ₈ Represents a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group, a phenyl group, or a benzyl group, and n and m each represent an integer of 1 to 10.)
The detection method according to claim 9, wherein A kit for detecting a target base sequence, comprising a nucleic acid probe and the fluorescently labeled steroid compound according to any one of claims 1 to 6.

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