JP2004275060A - Hyaluronic acid-cd44 binding inhibitor and method for producing the same - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a new compound which inhibits CD44 being a hyaluronic acid receptor and is useful as a therapeutic agent and/or a prophylactic against osteoarthritis and to provide a method for producing the same. <P>SOLUTION: The compound is obtained by a culture product of Gloeoporus dichrous SANK 30502 strain and its structure is represented by formula (I). <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

はＣａｌｏｐｏｒｕｓ ｄｉｃｈｒｏｕｓが生産する物質として同定された弱い抗菌活性を有する化合物である（例えば、非特許文献７参照。）。一方、グロエオポルス・ダイクロウス （Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ ｄｉｃｈｒｏｕｓ）（Ｆｒ．：Ｆｒ．） Ｂｒｅｓ． ＳＴ００１７１４， ＤＳＭ １３７８４はカロポロサイドの類縁化合物を生産し、該化合物が抗腫瘍活性を有することが報告されている（例えば、特許文献１参照。）。しかしながら、カラポロサイド及びその類縁化合物がＣＤ４４とヒアルロン酸との結合に影響を及ぼすとの報告はない。
【０００６】
【特許文献１】
国際公開第０２／０７２１１０号パンフレット
【非特許文献１】
「ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）」、１９９９年、第３５３巻、ｐ．２１７７−２１７８
【非特許文献２】
「アメリカン・ファミリー・フィジシャン（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆａｍｉｌｙ． Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ）」、２００２年、第６５巻、ｐ．８４１−８４８
【非特許文献３】
「オステオアルスリティス・アンド・カーティリッジ（Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ）」、２００２年、第１０巻、ｐ．７８５−７９１
【非特許文献４】
「関節外科」、１９９６年、第１５巻、ｐ．１１７３−１１７９頁
【非特許文献５】
「日本整形外科学会雑誌」、１９９５年、第６９巻、ｐ．７３５−７４３
【非特許文献６】
「ジャーナル・オブ・セル・サイエンス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９９３年、第１０６巻、ｐ．３６５−３７５
【非特許文献７】
「ジャーナル・オブ・アンチバイオティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）」、１９９４年、第４７巻、ｐ．１１８８−１１９４
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、生体内でヒアルロン酸の分解を阻害し、疼痛抑制・軟骨保護作用を示す新しい変形性関節症治療薬の開発を目指し、ヒアルロン酸とそのレセプターであるＣＤ４４の結合を阻害する物質の探索を、鋭意実施した。その結果、土壌より分離した、グロエオポルス・ダイクロウス （Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ ｄｉｃｈｒｏｕｓ）ＳＡＮＫ ３０５０２株の培養液中に、ヒアルロン酸とＣＤ４４の結合を阻害する活性を有するカロポロサイド類縁化合物であるＡ物質（式（ＩＶ））、
【０００８】
【化４】

Ｂ物質（式（Ｖ））、
【０００９】
【化５】

Ｅ物質（式（ＶＩ））、
【００１０】
【化６】

Ｆ物質（式（ＶＩＩ））、
【００１１】
【化７】

およびＧ物質（式（ＩＩ））、
【００１２】
【化８】

が産生されることを見出して本発明を完成するに至った。
【００１３】
更に、本発明の他の目的は、Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質を有効成分とする変形性関節症治療薬を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、
（１）
下記式（Ｉ）
【００１５】
【化９】

【００１６】
（式中、Ｒ_１は水素原子又はアセチル基を表し、Ｒ_２は水素原子又はマロニル基を表し、Ｒ_３は、水素原子又はアセチル基を表す。）で表される化合物又はその塩、
（２）（１）に記載の式（Ｉ）において、Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３が水素原子である化合物又はその塩、
（３）（１）に記載の式（Ｉ）において、Ｒ_１がアセチル基、Ｒ_２及びＲ_３が水素原子である化合物又はその塩、
（４）（１）に記載の式（Ｉ）において、Ｒ_１及びＲ_３がアセチル基、Ｒ_２が水素原子である化合物又はその塩、
（５）（１）に記載の式（Ｉ）において、Ｒ_１及びＲ_３がアセチル基、Ｒ_２がマロニル基である化合物又はその塩、
（６）下記の物理化学的性状を有する化合物又はその塩：
１）性質：無色粉末；
２）溶解性：メタノール、アセトン、酢酸エチル、ピリジンに可溶；
３）分子式：Ｃ_３８Ｈ_６２Ｏ_１６；
４）分子量：７７４；
５）紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０７（２９７００）、２４３（ｓｈ、４６００）、３０６（３９００）ｎｍに吸収極大を示す；
６）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ ｃｍ^−１
ＫＢｒディスク法で測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである、
３３７７、２９２３、２８５２、１７２６、１６６３、１４６５、１３７９、１２１６、１０７４、１０２９；
７） １Ｈ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、次の通りである、
１．１５−１．３５ （２２Ｈ， ｍ）， １．２９ （３Ｈ， ｄ， ６ Ｈｚ）， １．２９ （２Ｈ， ｍ）， １．４５ （１Ｈ， ｍ）， １．６３ （１Ｈ， ｍ）， １．７２ （２Ｈ， ｍ）， ２．６２ （２Ｈ， ｔ， ７．５ Ｈｚ）， ３．９２ （１Ｈ， ｍ）， ４．０８ （１Ｈ， ｄ， ９．０ Ｈｚ）， ４．２１ （１Ｈ， ｍ）， ４．２５ （２Ｈ， ｓ）， ４．２９ （１Ｈ， ｍ）， ４．４ （１Ｈ， ｍ）， ４．５６−４．６１ （３Ｈ， ｍ）， ４．７７ （１Ｈ， ｂｒ． ｓ）， ４．８８ （１Ｈ， ｄ， ８．０ Ｈｚ）， ５．１６ （１Ｈ， ｄ， ８．５ Ｈｚ）， ５．２ （１Ｈ， ｍ）， ５．２４ （１Ｈ， ｄ， ８．５ Ｈｚ）， ５．３７ （１Ｈ， ｓ）， ６．８５ （１Ｈ， ｄ， ７．５ Ｈｚ）， ７．１７ （１Ｈ， ｄ， ８．５ Ｈｚ）， ７．３９ （１Ｈ， ｄｄ， ７．５ Ｈｚ， ８．０ Ｈｚ）；８）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、次の通りである
２０．２， ２４．２， ２５．８， ２９．７−２９．９ （１１シグナル）， ３６．２， ４２．３， ６３．４， ６３．８， ６９．６， ７０．４， ７１．２， ７２．３ （２シグナル）， ７３．６， ７５．８， ７８．７， ８１．６， １０２．４， １１６．７， １２２．９， １３３．４， １３９．６， １６４．０， １７４．８
９）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム： Ｗａｔｅｒｓ ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ）
移動相： アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ３．０＝３：２
流速： １．０ｍｌ／分
検出波長： ２１０ ｎｍ
保持時間： ３．６分。
（７）下記の物理化学的性状を有する化合物又はその塩：
１）性質：無色粉末；
２）溶解性：メタノール、アセトン、酢酸エチル、ピリジンに可溶；
３）分子式：Ｃ_４０Ｈ_６４Ｏ_１７；
４）分子量：８１６；
５）紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０８（３２０００）、２４２（ｓｈ、４９００）、３０６（４３００）ｎｍに吸収極大を示す；
６）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ ｃｍ^−１
ＫＢｒディスク法で測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである
３３９０、２９２５、２８５３、１７３０、１６７１、１４６５、１３７６、１２４９、１０７５、１０３１；
７） １Ｈ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、次の通りである、
１．１４−１．２６ （２２Ｈ， ｍ）， １．３１ （３Ｈ， ｄ， ６．５ Ｈｚ）， １．３１ （２Ｈ， ｍ）， １．４９ （１Ｈ， ｍ）， １．６４−１．７６ （３Ｈ， ｍ）， ２．１０ （３Ｈ， ｓ）， ２．６０ （２Ｈ， ｔ， ７．５ Ｈｚ）， ３．９７ （１Ｈ， ｍ）， ４．２１ （２Ｈ， ｓ）， ４．２４−４．３４ （３Ｈ， ｍ）， ４．３９ （１Ｈ， ｄｄ， ９．０ Ｈｚ， ９．５ Ｈｚ）， ４．６３ （２Ｈ， ｍ）， ４．７７ （２Ｈ， ｓ）， ５．１６ （２Ｈ， ｓ）， ５．２３ （１Ｈ， ｍ）， ５．６０ （１Ｈ， ｓ）， ６．１４ （１Ｈ， ｄ， ３．５ Ｈｚ）， ６．８６ （１Ｈ， ｄ， ７．５ Ｈｚ）， ７．１６ （１Ｈ， ｄ， ８．０ Ｈｚ）， ７．４０ （１Ｈ， ｔ， ８．０ Ｈｚ）；
８）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、次の通りである、
２０．２， ２１．３， ２４．２， ２５．８， ２９．７−３０．０ （１１シグナル）， ３６．３， ４２．３， ６３．２， ６３．９， ６９．６， ７０．４， ７１．２， ７２．２， ７３．４ （２シグナル）， ７３．７， ７８．６， ８０．４， １００．０， １１６．７， １２２．９， １３３．７， １３９．５， １６３．８， １７１．１， １７４．６９）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム： Ｗａｔｅｒｓ ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ）
移動相： アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ３．０＝３：２
流速： １．０ｍｌ／分
検出波長： ２１０ ｎｍ
保持時間： ４．８分、
（８）下記の物理化学的性状を有する化合物又はその塩：
１）性質：無色油状；
２）溶解性：クロロホルム、メタノール、アセトン、酢酸エチルに可溶；
３）分子式：Ｃ_４２Ｈ_６６Ｏ_１８；
４）分子量：８５８；
５）紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０８（２９９００）、２４２（４７００）、３０６（３９００）ｎｍに吸収極大を示す；
６）赤外線吸収スペクトル（薄膜法）：νｍａｘ ｃｍ^−１
薄膜法で測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：
３４１８、２９２７、２８５５、１７３８、１６７２、１４６５、１３７５、１２３１、１０７５、１０３２；
７） １Ｈ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、次の通りである、
１．１９−１．２６ （２２Ｈ， ｍ）， １．３６ （３Ｈ， ｄ， ５．０ Ｈｚ）， １．３６ （１Ｈ，ｍ）， １．５１ （２Ｈ， ｍ）， １．７２ （３Ｈ， ｍ）， １．８２ （３Ｈ， ｓ）， ２．１９ （３Ｈ， ｓ）， ２．６０ （２Ｈ， ｔ， ７．５ Ｈｚ）， ３．９５ （１Ｈ， ｍ）， ４．２２ （２Ｈ， ｓ）， ４．２２−４．３５ （２Ｈ， ｍ）， ４．３７−４．４ （２Ｈ， ｍ）， ４．４７ （１Ｈ， ｄ， ９．５ Ｈｚ）， ４．６１−４．６４ （２Ｈ， ｍ）， ４．８ （１Ｈ， ｍ）， ５．２３ （１Ｈ， ｄ， ９．５ Ｈｚ）， ５．２８ （１Ｈ， ｍ）， ５．５８ （１Ｈ， ｓ）， ５．６９ （１Ｈ， ｄ， ９．５ Ｈｚ）， ６．１３ （１Ｈ， ｄ， ３．５ Ｈｚ）， ６．８６ （１Ｈ， ｄ， ７．０ Ｈｚ）， ７．１６ （１Ｈ， ｄ， ８．０ Ｈｚ）， ７．４０ （１Ｈ， ｄｄ， ７．５ Ｈｚ， ８．０ Ｈｚ）
８）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、次の通りである、
２０．２ （２シグナル）， ２１．３， ２４．２， ２５．７， ２９．７−３０．０ （１１シグナル）， ３６．３， ４２．３， ４８．６， ６３．１， ６３．２， ６９．６， ６９．８， ７０．４， ７１．９， ７３．５， ７３．６， ７４．０， ７８．５， ７９．０， ９９．６， １１５．３， １１６．８， １２３．０， １３３．７， １３９．６， １６３．９， １７０．３， １７０．９， １７１．１， １７４．６
９）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム： Ｗａｔｅｒｓ ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ）
移動相： アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ３．０＝３：２
流速： １．０ｍｌ／分
検出波長： ２１０ ｎｍ
保持時間： ７．５分、
（９）下記の物理化学的性状を有する化合物又はその塩：
１）性質：無色油状；
２）溶解性：クロロホルム、メタノール、アセトン、酢酸エチルに可溶；
３）分子式：Ｃ_４５Ｈ_６８Ｏ_２１；
４）分子量：９４４；
５）紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０８（２９４００）、２４３（ｓｈ、４７００）、３０７（４２００）ｎｍに吸収極大を示す；
６）赤外線吸収スペクトル（薄膜法）：νｍａｘ ｃｍ^−１
薄膜法で測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：
３４２１、２９２６、２８５５、１７４１、１６７３、１４６５、１３７５、１２２８、１０７１；
７） １Ｈ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、次の通りである、
１．１６−１．３２ （２２Ｈ， ｍ）， １．３６ （３Ｈ， ｄ， ６．０ Ｈｚ）， １．３６ （１Ｈ， ｍ）， １．４９ （２Ｈ， ｍ）， １．７２ （３Ｈ， ｍ）， １．７９ （３Ｈ， ｓ）， ２．１４ （３Ｈ， ｓ）， ２．６１ （２Ｈ， ｔ， ７．５ Ｈｚ）， ３．７８ （２Ｈ， ｓ）， ４．０１ （１Ｈ， ｍ）， ４．２３ （２Ｈ， ｓ）， ４．２３−４．２８ （１Ｈ， ｍ）， ４．３４−４．４１ （３Ｈ， ｍ）， ４．６０ （１Ｈ， ｄ， １０．０ Ｈｚ）， ４．７７ （１Ｈ， ｍ）， ４．９３ （１Ｈ， ｍ）， ５．１１ （１Ｈ， ｄ， ９．５ Ｈｚ）， ５．２８ （２Ｈ， ｍ）， ５．５８ （１Ｈ， ｓ）， ５．６６ （１Ｈ， ｄ， ９．５ Ｈｚ）， ６．２５ （１Ｈ， ｓ）， ６．８６ （１Ｈ， ｄ， ７．５ Ｈｚ）， ７．１７ （１Ｈ， ｄ， ８．０ Ｈｚ）， ７．４０ （１Ｈ， ｄｄ， ７．５ Ｈｚ， ８．０ Ｈｚ）；
８）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、次の通りである、
２０．２ （２シグナル）， ２１．２， ２４．２， ２５．７， ２９．７−３０．０ （１１シグナル）， ３６．３， ４２．３， ４２．８， ４８．８， ６３．３， ６６．６， ６９．７， ６９．８， ７０．１， ７２．０， ７３．２， ７３．６， ７３．９， ７６．０， ７８．４， ９９．７， １１５．４， １１６．８， １２２．９， １３３．６， １３９．６， １６３．９， １６８．０， １７０．０， １７０．３， １７０．８， １７０．８， １７４．６
９）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム： Ｗａｔｅｒｓ ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ）
移動相： アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ３．０＝３：２
流速： １．０ｍｌ／分
検出波長： ２１０ ｎｍ
保持時間： ８．５分、
（１０）グロエオポルス（Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ）属に属し、（２）乃至（９）に記載の化合物並びに下記の１）及び２）に記載の化合物からなる群から選択される少なくとも一つの化合物を生産する能力を有する菌を培養し、その培養物から、（２）乃至（９）に記載の化合物並びに下記の１）及び２）に記載の化合物からなる群から選択される少なくとも一つの化合物を回収することを特徴とする、（２）乃至（９）に記載の化合物並びに下記の１）及び２）に記載の化合物からなる群から選択される少なくとも一つの化合物の製造方法：
１）下記式（ＩＩ）で表される化合物（以下、「化合物Ｇ１」とする。）又はその塩
【００１７】
【化１０】

（式中、Ａｃはアセチル基（ＣＯＣＨ_３）を表す。）、
２）下記の物理化学的性状を有する化合物（以下、「化合物Ｇ２」とする）又はその塩
▲１▼性質：無色粉末；
▲２▼溶解性：メタノール、アセトン、酢酸エチル、ピリジンに可溶。；
▲３▼分子式：Ｃ_４３Ｈ_６６Ｏ_２０；
▲４▼分子量：９０２；
▲５▼紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０８（２９０００）、２４１（ｓｈ、４５００）、３０５（３２００）ｎｍに吸収極大を示す、
▲６▼赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ ｃｍ^−１
ＫＢｒディスク法で測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：
３４０８、２９２４、２８５３、１７３９、１６６１、１４５３、１３７７、１２４２、１０６８；
▲７▼ １Ｈ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、次の通りである、
１．２１−１．３１ （２０Ｈ， ｓ）， １．３６ （３Ｈ， ｄ， ６．０ Ｈｚ）， １．３６ （１Ｈ， ｍ）， １．４８ （４Ｈ， ｍ）， １．７１ （１Ｈ， ｍ）， １．８５ （２Ｈ， ｍ）， １．８８ （３Ｈ， ｓ）， ２．１５ （３Ｈ， ｓ）， ３．３１ （２Ｈ， ｔ， ７．５ Ｈｚ）， ３．７８ （２Ｈ， ｓ）， ４．０１ （１Ｈ， ｍ）， ４．２７ （１Ｈ， ｄｄ， ８．０ Ｈｚ， １０．５ Ｈｚ）， ４．３４−４．４１ （３Ｈ， ｍ）， ４．６０ （１Ｈ， ｄ， ９．５ Ｈｚ）， ４．７７ （１Ｈ， ｄｄ， ７．０ Ｈｚ， １１．５ Ｈｚ）， ４．９３ （１Ｈ， ｍ）， ５．２１ （１Ｈ， ｄ， ９．５ Ｈｚ）， ５．２８ （２Ｈ， ｍ）， ５．５８ （１Ｈ， ｓ）， ５．６６ （１Ｈ， ｄ， １０．０ Ｈｚ）， ６．２４ （１Ｈ， ｓ）， ６．９１ （１Ｈ， ｄ， ７．５ Ｈｚ）， ７．１４ （１Ｈ， ｄ， ８．５ Ｈｚ）， ７．３９ （１Ｈ， ｄｄ， ７．５ Ｈｚ， ８．０ Ｈｚ）、
▲８▼１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、次の通りである、
２０．２ （２シグナル）， ２１．２， ２５．７， ２９．８−３０．０ （１０シグナル）， ３０．３， ３２．７， ３６．２， ３６．３， ４２．８， ６３．３， ６６．６， ６９．７， ６９．８， ７０．１， ７２．０， ７３．２， ７３．６， ７３．９， ７６．０， ７８．５， ９９．６， １１５．５， １１７．１， １２１．８， １３２．８， １４６．４， １６２．６， １６８．０， １７０．０， １７０．３， １７０．８ （２シグナル）， １７５．０、
▲９▼高速液体クロマトグラフィー
分離カラム： Ｗａｔｅｒｓ ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ）
移動相： アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ３．０＝３：２
流速： １．０ｍｌ／分
検出波長： ２１０ ｎｍ
保持時間： １１．４分、
（１１）化合物が（２）に記載の化合物であることを特徴とする、（１０）に記載の製造方法、
（１２）化合物が（３）に記載の化合物であることを特徴とする、（１０）に記載の製造方法、
（１３）化合物が（４）に記載の化合物であることを特徴とする、（１０）に記載の製造方法、
（１４）化合物が（５）に記載の化合物であることを特徴とする、（１０）に記載の製造方法、
（１５）化合物が化合物Ｇ１であることを特徴とする、（１０）に記載の製造方法、
（１６）グロエオポルス（Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ）属に属する菌がグロエオポルス・ダイクロウス （Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ ｄｉｃｈｒｏｕｓ） であることを特徴とする、（１０）乃至（１５）のいずれか一つに記載の製造方法、
（１７）グロエオポルス（Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ）属に属する菌がグロエオポルス・ダイクロウス （Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ ｄｉｃｈｒｏｕｓ （Ｆｒ．：Ｆｒ．）Ｂｒｅｓ．）であることを特徴とする、（１０）乃至（１５）のいずれか一つに記載の製造方法、
（１８）グロエオポルス（Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ）属に属する菌がグロエオポルス・ダイクロウス （Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ ｄｉｃｈｒｏｕｓ （Ｆｒ．：Ｆｒ．）Ｂｒｅｓ．）ＳＡＮＫ ３０５０２株であることを特徴とする、（１０）乃至（１５）のいずれか一つに記載の製造方法、
（１９） グロエオポルス・ダイクロウス （Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ ｄｉｃｈｒｏｕｓ （Ｆｒ．：Ｆｒ．） Ｂｒｅｓ．）ＳＡＮＫ ３０５０２株、
（２０）（２）乃至（９）に記載の化合物群から選択される少なくとも一つの化合物又はその薬理学上許容される塩を有効成分として含有する医薬、
（２１）（２）乃至（９）に記載の化合物群並びに化合物Ｇ１及び化合物Ｇ２に記載の化合物からなる群から選択される少なくとも一つの化合物又はその薬理学上許容される塩を有効成分として含有する変形性関節症の予防薬及び／又は治療薬：
１）下記式（ＩＩ）で表される化合物（以下、「化合物Ｇ１」とする。）又はその塩
【００１８】
【化１１】

（式中、Ａｃはアセチル基（ＣＯＣＨ_３）を表す。）、
２）下記の物理化学的性状を有する化合物（以下、「化合物Ｇ２」とする）又はその塩
▲１▼性質：無色粉末；
▲２▼溶解性：メタノール、アセトン、酢酸エチル、ピリジンに可溶。；
▲３▼分子式：Ｃ_４３Ｈ_６６Ｏ_２０；
▲４▼分子量：９０２；
▲５▼紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０８（２９０００）、２４１（ｓｈ、４５００）、３０５（３２００）ｎｍに吸収極大を示す、
▲６▼赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ ｃｍ^−１
ＫＢｒディスク法で測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：
３４０８、２９２４、２８５３、１７３９、１６６１、１４５３、１３７７、１２４２、１０６８；
▲７▼ １Ｈ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、次の通りである、
１．２１−１．３１ （２０Ｈ， ｓ）， １．３６ （３Ｈ， ｄ， ６．０ Ｈｚ）， １．３６ （１Ｈ， ｍ）， １．４８ （４Ｈ， ｍ）， １．７１ （１Ｈ， ｍ）， １．８５ （２Ｈ， ｍ）， １．８８ （３Ｈ， ｓ）， ２．１５ （３Ｈ， ｓ）， ３．３１ （２Ｈ， ｔ， ７．５ Ｈｚ）， ３．７８ （２Ｈ， ｓ）， ４．０１ （１Ｈ， ｍ）， ４．２７ （１Ｈ， ｄｄ， ８．０ Ｈｚ， １０．５ Ｈｚ）， ４．３４−４．４１ （３Ｈ， ｍ）， ４．６０ （１Ｈ， ｄ， ９．５ Ｈｚ）， ４．７７ （１Ｈ， ｄｄ， ７．０ Ｈｚ， １１．５ Ｈｚ）， ４．９３ （１Ｈ， ｍ）， ５．２１ （１Ｈ， ｄ， ９．５ Ｈｚ）， ５．２８ （２Ｈ， ｍ）， ５．５８ （１Ｈ， ｓ）， ５．６６ （１Ｈ， ｄ， １０．０ Ｈｚ）， ６．２４ （１Ｈ， ｓ）， ６．９１ （１Ｈ， ｄ， ７．５ Ｈｚ）， ７．１４ （１Ｈ， ｄ， ８．５ Ｈｚ）， ７．３９ （１Ｈ， ｄｄ， ７．５ Ｈｚ， ８．０ Ｈｚ）、
▲８▼１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、次の通りである、
２０．２ （２シグナル）， ２１．２， ２５．７， ２９．８−３０．０ （１０シグナル）， ３０．３， ３２．７， ３６．２， ３６．３， ４２．８， ６３．３， ６６．６， ６９．７， ６９．８， ７０．１， ７２．０， ７３．２， ７３．６， ７３．９， ７６．０， ７８．５， ９９．６， １１５．５， １１７．１， １２１．８， １３２．８， １４６．４， １６２．６， １６８．０， １７０．０， １７０．３， １７０．８ （２シグナル）， １７５．０、
▲９▼高速液体クロマトグラフィー
分離カラム： Ｗａｔｅｒｓ ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ）
移動相： アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ３．０＝３：２
流速： １．０ｍｌ／分
検出波長： ２１０ ｎｍ
保持時間： １１．４分、
（２２）（２）乃至（９）に記載の化合物並びに化合物Ｇ１及び化合物Ｇ２からなる群から選択されるいずれか一つの化合物又はその薬理学上許容される塩を有効成分として含有する変形性関節症の予防薬及び／又は治療薬、
（２３）（２）乃至（９）に記載の化合物並びに化合物Ｇ１及び化合物Ｇ２からなる群から選択される少なくとも一つの化合物又はその塩を含有するヒアルロン酸とＣＤ４４との結合阻害剤、
に関する。
【００１９】
本明細書において、「Ｆ−１６４３８Ａ」とは、下記式（ＩＶ）
【００２０】
【化１２】

で表される化合物または上記（２）に記載の物理化学的性状を有する化合物（以下、「Ａ物質」という。）である。
【００２１】
本明細書において、「Ｆ−１６４３８Ｂ」とは、下記式（Ｖ）
【００２２】
【化１３】

で表される化合物または上記（３）に記載の物理化学的性状を有する化合物（以下、「Ｂ物質」という。）である。
【００２３】
本明細書において、「Ｆ−１６４３８Ｅ」とは、下記式（ＶＩ）
【００２４】
【化１４】

で表される化合物または上記（４）に記載の物理化学的性状を有する化合物（以下、「Ｅ物質」という。）である。
【００２５】
本明細書において、「Ｆ−１６４３８Ｆ」とは、下記式（ＶＩＩ）
【００２６】
【化１５】

で表される化合物または上記（５）に記載の物理化学的性状を有する化合物（以下、「Ｆ物質」という。）である。
【００２７】
本明細書において、「Ｆ−１６４３８Ｇ」とは、下記式（ＩＩ）
【００２８】
【化１６】

で表される化合物または上記（６）に記載の物理化学的性状を有する化合物（以下、「Ｇ物質」という。）である。なお、式（ＩＩ）で示される化合物は、前述の国際公開第０２／０７２１１０号パンフレットに記載されている化合物と同一の構造である。なお、Ｇ物質については上記式で表される構造を有する化合物を化合物Ｇ１といい、上記（６）に記載の物理化学的性状を有する化合物を化合物Ｇ２ということがある。
【００２９】
なお、Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質及びＧ物質の分子式は当業者が通常用いる方法によって決定することができるが、例えば、ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルによって決定することができる。また、Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質及びＧ物質の分子量は当業者が通常用いる方法によって決定することができるが、例えば、ＥＳＩ−ＭＳスペクトルによって決定することができる。
本発明のＡ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質及びＧ物質は、神奈川県において採集された担子菌子実体の担子胞子より分離されたグロエオポルス・ダイクロウス ＳＡＮＫ ３０５０２株（以下、単に「ＳＡＮＫ ３０５０２株」という。）の培養液中に生産される。すなわち、Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質及びＧ物質はＳＡＮＫ ３０５０２株を培養し、その培養物からＡ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質及びＧ物質を回収することによって製造することができる。
【００３０】
本発明の前記式（Ｉ）および（ＩＩ）で表される化合物は、種々の異性体を有する。本発明においては、これらの異性体がすべて単一の式で示されているが、本発明はラセミ化合物を含むこれらの異性体およびこれらの異性体の混合物も全て含むものである。立体特異的合成法が使用される場合、または光学活性化合物が原料化合物として使用される場合、個々の異性体は直接的に製造してもよいし、一方、異性体の混合物が製造されれば、個々の異性体は常法により得てもよい。
【００３１】
本発明の前記式（Ｉ）および（ＩＩ）で表される化合物は、当業者に周知の方法を用いて塩にすることができる。本発明はそのような塩も包含する。本発明の前記式（Ｉ）および（ＩＩ）で表される化合物の塩としては、医学的に使用され、薬理学的に許容されるものであれば特に限定はない。なお本発明の前記式（Ｉ）および（ＩＩ）で表される化合物の塩が医薬以外の用途に用いられる場合、例えば中間体として使用される場合には何ら限定はない。そのような塩としては、好適にはナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩等の金属塩；アンモニウム塩のような無機塩；ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニア塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩；および、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、アスパラギン塩のようなアミノ酸塩を挙げることができる。より好適には、薬理学的に許容される塩として好ましく使用されるもの、すなわち、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩等を挙げることができる。
【００３２】
また、本発明の前記式（Ｉ）および（ＩＩ）で表される化合物またはその塩は、溶剤和物となることがある。例えば、大気中に放置したり、または、再結晶をすることにより、水分を吸収し、吸着水が付いたり、水和物となる場合があるが、そのような溶剤和物も本発明に包含される。
【００３３】
さらに本発明は、生体内において代謝されて本発明の前記式（Ｉ）および（ＩＩ）で表される化合物に変換される化合物、いわゆるプロドラッグも全て含むものである。
【００３４】
周知のとおり、放線菌は自然界において、または人工的な操作（例えば、紫外線照射、放射線照射、化学薬品処理等）により、変異を起こしやすく、本発明のＳＡＮＫ ３０５０２株もこの点は同じである。本発明にいうＳＡＮＫ ３０５０２株はその全ての変異株を包含する。また、これらの変異株の中には、遺伝学的方法、例えば、組み替え、形質導入、形質転換等により得られたものも包含される。即ち本発明の前記式（Ｉ）および（ＩＩ）で表される化合物を生産する、ＳＡＮＫ ３０５０２株およびその変異株およびそれらと明確に区別されない菌株は、すべてＳＡＮＫ ３０５０２株に包含されるものである。
【００３５】
【発明の実施の形態】
１．生産菌
Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質の全て又は少なくともいずれか一つを生産する微生物としては、特に限定されるものではないが、例えば、グロエオポルス（Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ）属に属する糸状菌等を挙げることができ、好適にはグロエオポルス・ダイクロウス（Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ ｄｉｃｈｒｏｕｓ （Ｆｒ．：Ｆｒ．）Ｂｒｅｓ．）であり、より好適にはグロエオポルス・ダイクロウス ＳＡＮＫ ３０５０２株（以下、単に「ＳＡＮＫ ３０５０２株」という。）である。ＳＡＮＫ ３０５０２株は、１９９９年６月神奈川県において採集された担子菌子実体の担子胞子より分離された。
【００３６】
本菌の菌学的性状を観察するため、次の各培地上で培養を行った。使用した各培地の組成を以下に記載する。
【００３７】
（ポテトデキストロース寒天培地（Ｐｏｔａｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ａｇａｒ：以下、「ＰＤＡ」という。））
ニッスイ ポテトデキストロース寒天培地（日水製薬（株）製）３９ｇ
寒天 ５ｇ
蒸留水 １０００ｍｌ
（ＷＳＨ培地）
オートミール １０ｇ
硫酸マグネシウム七水和物 １ｇ
リン酸二水素カリウム １ｇ
硝酸ナトリウム １ｇ
寒天 ２０ｇ
蒸留水 １０００ｍｌ
色調の表示は「コーネラップ・ワンスチャー、メチューンハンドブックオブカラー 第３版，エアメチューン、ロンドン、１９７８年」 （Ｋｏｒｎｅｒｕｐ Ａ， Ｗａｎｓｃｈｅｒ ＪＨ （１９７８） Ｍｅｔｈｕｅｎ ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｃｏｌｏｕｒ （３ｒｄ． ｅｄｉｔｉｏｎ）． ＥｒｙｅＭｅｔｈｕｅｎ， Ｌｏｎｄｏｎ）に従った。
【００３８】
ＳＡＮＫ ３０５０２株の培養下での菌学的性状は次の通りである。
【００３９】
ＰＤＡ上での生長は、２３℃、１週間の培養で２５乃至２７ｍｍである。菌そうは細粉状、白色乃至イエロイッシュホワイト（２Ａ２）である。裏面はペールイエロー（２Ａ３）である。ＷＳＨ上での生長は、２３℃、１週間の培養で３１乃至３３ｍｍである。菌そうは短軟毛状、白色乃至ペールイエロー（４Ａ３）である。裏面はペールイエロー（２Ａ３）である。気菌糸は幅２乃至５μｍ、薄壁で平滑、隔壁にかすがい連結を有する。においや分生子はない。
【００４０】
ＳＡＮＫ ３０５０２株を同定するため、分離に供試した子実体乾燥標本の菌学的性状を観察した。その乾燥標本の菌学的性状は次の通りである。
【００４１】
子実体は半円形乃至棚状の傘を有し、下部で背着する。傘は幅３ｃｍ以下、厚さ２ｍｍ以下である。傘の上面は短毛で密に被われ、ペールイエロー（４Ａ３）である。肉は薄く白色である。傘下面の子実層托は管孔状、湿時には膠状、乾燥時には樹脂状でバイオレットブラウン（１１Ｆ５）である。管孔は長さ０．６ｍｍ以下、孔の口は１ｍｍあたり７乃至９個で円形である。菌糸は１菌糸型である。原菌糸は幅３乃至６μｍ、厚壁で隔壁にかすがい連結を有する。担子器は１０乃至１４μｍ×３乃至４μｍ、棍棒状で４つの小柄を有し、基部にかすがい連結を有する。担子胞子は３乃至４μｍ×１μｍ、ソーセージ形で薄壁、平滑で無色、非アミロイドである。
【００４２】
本菌の以上のような菌学的性状は、「今関六也・本郷次雄編、原色日本新菌類図鑑（ＩＩ）、保育社、大阪、１９８９年」の、グロエオポルス・ダイクロウスの菌学的性状に関する記載に一致した。よって、ＳＡＮＫ ３０５０２株をグロエオポルス・ダイクロウス（Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ ｄｉｃｈｒｏｕｓ （Ｆｒ．：Ｆｒ．）Ｂｒｅｓ．）と同定した。
【００４３】
なお、ＳＡＮＫ ３０５０２株は、グロエオポルス・ダイクロウス ＳＡＮＫ ３０５０２株として、平成１５年２月２７日付けで日本国茨城県つくば市東１−１−１の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−８３１０を付与された。
【００４４】
周知の通り、真菌類は自然界において、又は人工的な操作（例えば、紫外線照射、放射線照射、化学薬品処理等）により、変異を起こしやすく、本発明のＳＡＮＫ ３０５０２株もその点は同じである。本発明にいうＳＡＮＫ ３０５０２株はその全ての変異株を包含する。
【００４５】
また、これらの変異株の中には、遺伝的方法、たとえば組み換え、形質導入、形質転換等によりえられたものも包含される。即ち、Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質の全て又は少なくともいずれか一つを生産するＳＡＮＫ ３０５０２株、それらの変異株およびそれらと明確に区別されない菌株は全てＳＡＮＫ ３０５０２株に包含される。また、組換え、形質導入、形質導入、形質転換等により、未変異株と比較してＡ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質及びＧ物質の生産量が変わったり、各物質の生産割合が変わった変異株も全てＳＡＮＫ ３０５０２株に包含される。
【００４６】
ＳＡＮＫ ３０５０２株を培養しＦ−１６４３８Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質の全て又は少なくともいずれか一つを生産させる際、ｐＨ ４．０乃至６．５の範囲の培地で培養を行なうことができる。
【００４７】
２．培養
Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質の全て又は少なくともいずれか一つを得るための、これらの微生物の培養は、他の発酵生成物を生産するために用いられるような培地中で行うことができる。このような培地には、微生物が同化できる炭素源、窒素源および無機塩を含有する。培養は、液体培養や固体培養等周知の方法で行うことができ、液体培養の場合にはバッチ培養や連続培養等周知の方法を適宜選択して行うことができ、固体培養の場合にはフスマ等を用いることができる。
【００４８】
一般に、炭素源としてグルコース、フルクトース、マルトース、シュークロース、マンニルトース、グリセリン、デキストリン、オート麦、ライ麦、トウモロコシデンプン、ジャガイモ、トウモロコシ粉、綿実油、糖蜜、クエン酸、酒石酸等を単一に、あるいは併用して用いることができる。一般には、培地量の１〜１０重量％で変量する。
【００４９】
窒素源としては、一般に蛋白質およびその加水分解物を含有する物質または無機塩を発酵工程に用いる。適当な窒素源としては、大豆粉、フスマ、落花生粉、綿実油、カゼイン加水分解物、ファーマミン、魚粉、コーンスチープリカー、ペプトン、肉エキス、イースト、イーストエキス、マルトエキス、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等である。窒素源は、単一または併用して培地量の０．２〜１０重量％の範囲で用いる。
【００５０】
培地中に取り入れる栄養無機塩は、ナトリウム、アンモニウム、カルシウム、フォスフェート、サルフェート、クロライド、カーボネート等のイオンを得ることのできる通常の塩類である。また、カリウム、カルシウム、コバルト、マンガン、鉄、マグネシウム等の微量の金属も含む。
【００５１】
液体培養に際しては、シリコン油、植物油、界面活性剤等が、消泡剤として使用される。ＳＡＮＫ ３０５０２株を培養し、Ｆ−１６４３８Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質を生産する培地のｐＨは、４．０〜６．５に変化できる。
【００５２】
培養温度はＡ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質の全て又は少なくともいずれか一つを生産する微生物が生育できる限りにおいて特に制限はないが、ＳＡＮＫ ３０５０２株を用いるときは上記培養条件での生育温度は１０℃から３３℃あり、２３℃から３０℃の範囲が生育に良好であり、更にＡ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質の全て又は少なくともいずれか一つの生産には、２３℃から２７℃が好適である。Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質の全て又は少なくともいずれか一つは、これらの微生物を好気的に培養して得られるが、通常用いられる好気的培養法、例えば固体培養法、振とう培養法、通気攪拌培養法等が用いられる。
【００５３】
小規模な培養においては、２３℃で数日間培養を行うのが良好である。培養は、三角フラスコ中で、一段階または複数段階の種の発育工程により開始する。種培養フラスコは定温インキュベーター中で数日間、または充分に成長するまで振とう培養する。成長した種培養液は、その一部または全部を次段階の種培地または生産培地に接種するのに使用される。接種した生産培地を含むフラスコを一定温度で数日間振とう培養し、培養終了後、フラスコの含有物を遠心分離またはろ過により分別する。
【００５４】
大量の培養の場合には、攪拌機、通気装置をつけた適当なタンクで培養するのが好ましい。この方法によれば、栄養培地をタンクの中で作製することができる。栄養培地を１２１℃まで加熱して滅菌し、冷却後この滅菌培地に、あらかじめ成長させてあった種培養液を接種する。培養は２３℃で通気攪拌して行う。この方法は多量の化合物を得るのに適している。
【００５５】
培養の経過にしたがって生産されるＡ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質の全て又は少なくともいずれか一つの生産量の経時変化を知るには、例えば培養液を等量のアセトンで抽出、アセトン留去後、酸性条件下酢酸エチル抽出し、濃縮、乾固した油状物中のＡ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質の量を後述するヒアルロン酸−ＣＤ４４結合阻害試験、または高速液体クロマトグラフィーに付して測定する。通常は２５０時間から３５０時間の培養でＡ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質の全て又は少なくともいずれか一つの生産量は最高値に達する。
【００５６】
３．Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質の回収
培養物にはＡ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質の全て又は少なくともいずれか一つが含まれている。なお、培養物としては、Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質の全て又はは少なくともいずれか一つが含まれている限りにおいて培養中および培養後の菌体と培地の混合物、菌体、培地、培養上清のいずれも用いることができる。培養物中に含まれるＡ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質の量及び各物質の割合は、培養条件等によって変わることがある。
【００５７】
液体培養を行った場合には培養液中の液体部分および菌体に存在するＡ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質は、菌体、その他の固形部分を珪藻土をろ過助剤とするろ過操作または遠心分離によって分別し、菌体およびそのろ液または上清中に存在するＡ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質をその物理化学的性状を利用し抽出精製することにより得られる。
【００５８】
例えば、Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質は、培養上清を水と混和しない有機溶剤、たとえば、ｎ−ブタノール、酢酸エチル、メチレンクロライド等の単独またはそれらの組合せにより、Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質を抽出することにより回収・精製が可能である。
【００５９】
Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質の精製には、活性炭または吸着用樹脂であるアンバーライトＸＡＤ−２、ＸＡＤ−４（以上ローム・アンド・ハース社製）等や、ダイヤイオンＨＰ−１０、ＨＰ−２０、ＨＰ−５０、ＣＨＰ２０Ｐ（以上三菱化学（株）社製）等を使用することができる。Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質の全て又は少なくともいずれか一つを含む培養液を上記のごとき吸着剤の層を通過させて不純物を吸着させて取り除くか、またはこれらの物質を吸着させた後、メタノール水、アセトン水等の水と有機溶剤との混合溶剤を用いて溶出させることによりこれらの物質を回収することができる。イオン交換樹脂としては、ダウエックス ５０Ｗｘ４、ダウエックス１ｘ２、ダウエックス ＳＢＲ−Ｐ（ダウ・ケミカル社製）等が使用される。Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質の全て又は少なくともいずれか一つを含む上記のごときイオン交換樹脂の層を通過させて不純物を吸着させて取り除くか、またはＡ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質の全て又は少なくともいずれか一つを吸着させた後、塩酸やアンモニア水を用いて溶出させることにより得られる。
【００６０】
このようにして得られたＡ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質の全て又は少なくともいずれか一つは、さらにシリカゲル、フロリジルのような担体を用いた吸着カラムクロマトグラフィー、アビセル（旭化成工業（株）社製）、セファデックスＬＨ−２０（ファルマシア社製）等を用いた分配カラムクロマトグラフィーおよび順相、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー等で精製することができる。
【００６１】
本発明の化合物であるＡ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質の精製における所在は次に挙げる方法によって測定することができる。
【００６２】
（高速液体クロマトグラフィー）
分離カラム： Ｗａｔｅｒｓ ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ）
移動相： アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ３．０＝３：２
流速： １．０ｍｌ／分
検出波長： ２１０ ｎｍ
保持時間： Ａ物質 ３．６分、Ｂ物質 ４．８分、Ｅ物質 ７．５分、Ｆ物質８．５分、Ｇ物質 １１．４分
４．ヒアルロン酸−ＣＤ４４結合阻害試験
Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質及びＧ物質はヒアルロン酸がＣＤ４４と結合するのを阻害する活性を有することが本発明者らによって明らかになった。ヒアルロン酸とＣＤ４４との結合阻害試験（「ヒアルロン酸−ＣＤ４４結合阻害試験」という。）はヒアルロン酸とＣＤ４４との結合に対する本発明のＡ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質及びＧ物質の影響を調べることができる限りにおいて特に制限されないが、例えば後の（試験例１）に詳述するように、ヒトＣＤ４４発現細胞懸濁液に蛍光ヒアルロン酸と被験化合物（Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質及びＧ物質から選択される物質）を添加して、蛍光ヒアルロン酸のＣＤ４４への特異的吸着量を測定する方法を用いることができる。
【００６３】
５．作用
Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質及びＧ物質又はその塩は、ヒアルロン酸−ＣＤ４４結合阻害活性を有することが本発明者らによって明らかになった。したがって、Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質またはその塩は、変形性関節症の予防薬および／又は治療薬としての用途に有効である。本発明は特に、Ａ物質又はその塩を有効成分として含有する変形性関節症の予防薬および／又は治療薬、Ｂ物質又はその塩を有効成分として含有する変形性関節症の予防薬および／又は治療薬、Ｅ物質又はその塩を有効成分として含有する変形性関節症の予防薬および／又は治療薬、Ｆ物質又はその塩を有効成分として含有する変形性関節症の予防薬および／又は治療薬並びにＧ物質またはその塩を有効成分として含有する変形性関節症の予防薬および／又は治療薬を提供する。
【００６４】
変形性関節症の予防薬および／又は治療薬の投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤等による経口投与、また注射剤（静脈内、筋肉内、皮下）、点眼剤、座薬等による非経口投与を挙げることができる。
【００６５】
本発明の化合物を、上記疾患の予防薬又は治療薬として使用する場合には、Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質又はＧ物質、その塩若しくはエステルを、それ自体あるいは適宜の薬理学的に許容される、賦形剤、希釈剤等と混合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤若しくはシロップ剤等により経口的に、又は、注射剤、坐剤、貼付剤、若しくは、外用剤等により非経口的に投与することができる。
【００６６】
これらの製剤は、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、葡萄糖、マンニトール、ソルビトールのような糖誘導体；トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、α澱粉、デキストリンのような澱粉誘導体；結晶セルロースのようなセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルランのような有機系賦形剤；及び、軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、珪酸カルシウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウムのような珪酸塩誘導体；燐酸水素カルシウムのような燐酸塩；炭酸カルシウムのような炭酸塩；硫酸カルシウムのような硫酸塩等の無機系賦形剤を挙げることができる。）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムのようなステアリン酸金属塩；タルク；コロイドシリカ；ビーズワックス、ゲイ蝋のようなワックス類；硼酸；アジピン酸；硫酸ナトリウムのような硫酸塩；グリコール；フマル酸；安息香酸ナトリウム；ＤＬロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウムのようなラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物のような珪酸類；及び、上記澱粉誘導体を挙げることができる。）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、及び、前記賦形剤と同様の化合物を挙げることができる。）、崩壊剤（例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース誘導体；カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セルロース類を挙げることができる。）、乳化剤（例えば、ベントナイト、ビーガムのようなコロイド性粘土；水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウムのような金属水酸化物；ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウムのような陰イオン界面活性剤；塩化ベンザルコニウムのような陽イオン界面活性剤；及び、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルのような非イオン界面活性剤を挙げることができる。）、安定剤（メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；及び、ソルビン酸を挙げることができる。）、矯味矯臭剤（例えば、通常使用される、甘味料、酸味料、香料等を挙げることができる。）、希釈剤等の添加剤を用いて周知の方法で製造される。
【００６７】
本発明の化合物を患者へ導入する方法については、上記に加えてコロイド分散系を用いることができる。コロイド分散系は化合物の生体内の安定性を高める効果や、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果が期待される。コロイド分散系は、通常用いられるものであれば限定しないが、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル及びリポソームを包含する脂質をベースとする分散系を挙げる事ができ、好ましくは、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果のある、複数のリポソーム、人工膜の小胞である（Ｍａｎｎｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８８，６，６８２；Ｂｌｕｍｅ ａｎｄ Ｃｅｖｃ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９０，１０２９，９１；Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．，１９９４，２３，１１９；Ｃｈｏｎｎ ａｎｄ Ｃｕｌｌｉｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９９５，６，６９８ ）。
０ ．２−０ ．４ μｍ のサイズ範囲をとる単膜リポソームは、巨大分子を含有する水性緩衝液のかなりの割合を被包化し得、化合物はこの水性内膜に被胞化され、生物学的に活性な形態で脳細胞へ輸送される（Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１９８１，６，７７ ）。リポソームの組成は、通常、脂質、特にリン脂質、とりわけ相転移温度の高いリン脂質を１種又はそれ以上のステロイド、特にコレステロールと通常複合したものである。リポソーム生産に有用な脂質の例は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、ホスファチジルエタノールアミン、セレブロシド及びガングリオシドのようなホスファチジル化合物を包含する。特に有用なのはジアシルホスファチジルグリセロールであり、ここでは脂質部分が１４−１８ の炭素原子、特に１６ −１８ の炭素原子を含有し、飽和している（１４ −１８ の炭素原子鎖の内部に二重結合を欠いている）。代表的なリン脂質は、ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン及びジステアロイルホスファチジルコリンを包含する。
【００６８】
リポソームを包含するコロイド分散系の標的化は、受動的又は能動的のいずれかであってもよい。受動的な標的化は、洞様毛細血管を含有する臓器の網内系細胞へ分布しようとするリポソーム本来の傾向を利用することによって達成される。一方、能動的な標的化は、例えば、ウイルスの蛋白質コート（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．），１９９３，９０，８４７４ ）、モノクローナル抗体（又はその適切な結合部分）、糖、糖脂質又は蛋白質（又はその適切なオリゴペプチドフラグメント）のような特定のリガンドをリポソームへ結合させること、又は天然に存在する局在部位以外の臓器及び細胞型への分布を達成するためにリポソームの組成を変えることによってリポソームを修飾する手法等を挙げる事ができる。標的化されたコロイド分散系の表面は様々なやり方で修飾され得る。リポソームで標的したデリバリーシステムでは、脂質二重層との緊密な会合において標的リガンドを維持するために、リポソームの脂質二重層へ脂質基が取込まれ得る。脂質鎖を標的リガンドと結びつけるために様々な連結基が使用され得る。本発明のオリゴヌクレオチドのデリバリーが所望される細胞の上に支配的に見出される特定の細胞表面分子に結合する標的リガンドは、例えば、（１）デリバリーが所望される細胞によって支配的に発現される特定の細胞受容体と結合している、ホルモン、成長因子又はその適切なオリゴペプチドフラグメント、又は（２）標的細胞上で支配的に見出される抗原性エピトープと特異的に結合する、ポリクローナル又はモノクローナル抗体、又はその適切なフラグメント（例えば、Ｆａｂ ；Ｆ （ａｂ’）２ ）、であり得る。２種又はそれ以上の生物活性剤（例えば、一般式（Ｉ）で示される化合物又はその塩とその他の薬剤）は、単一のリポソーム内部で複合し、投与することもできる。内容物の細胞内安定性及び／又は標的化を高める薬剤をコロイド分散系へ追加することも可能である。
【００６９】
その使用量は症状、年齢等により異なるが、経口投与の場合には、１回当り下限１ｍｇ（好適には、３０ｍｇ）、上限２０００ｍｇ（好適には、１５００ｍｇ）を、静脈内投与の場合には、１回当り下限０．５ｍｇ（好適には、５ｍｇ）、上限５００ｍｇ（好適には、２５０ｍｇ）を成人に対して、１日当り１乃至６回症状に応じて投与することが望ましい。
【００７０】
【実施例】
次に、実施例、試験例及び製剤例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００７１】
（実施例１） Ａ物質の精製
（Ａ）培養
培地組成−１で示される培地３０ｍｌを含む１００ｍｌ容三角フラスコを１２１℃で２０分間加熱滅菌した後、２３℃に冷却した。これにグロエオポルス ダイクロウス（Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ ｄｉｃｈｒｏｕｓ （Ｆｒ．：Ｆｒ．） Ｂｒｅｓ．）ＳＡＮＫ ３０５０２株をスラントより白金耳でかきとり、それを滅菌水３ｍｌでホモジェナイズ後、全量接種し、回転振盪培養機を用いて、２１０ｒｐｍ、２３℃で１６８時間培養したのものを前培養液とした。次に、培地組成−２で示される培地８０ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコ２本に入れ、１２１℃で２０分間加熱滅菌した。これを２３℃に冷却した後、各三角フラスコに前培養液３ｍｌを接種し、回転数２１０ｒｐｍ、２３℃で３３６時間振盪培養した。
【００７２】
［培地組成−１］
グルコース ０．４％
麦芽エキス １．０％
イーストエキス ０．４％
寒天 ０．３％
消泡剤ＣＢ−４４２ ０．００５％
滅菌前ｐＨ５．５
［培地組成−２］
マルトース ２．０％
グルコース １．０％
ポリペプトン ０．２％
イーストエキス ０．０８％
リン酸一カリウム ０．０５％
硫酸マグネシウム７水和物 ０．１％
塩化第二鉄６水和物 ０．００１％
硫酸亜鉛７水和物 ０．０００２％
塩化カルシウム ０．００５５％
消泡剤ＣＢ−４４２ ０．００５％
滅菌前ｐＨ無調整
（Ｂ）単離
得られた培養液１６０ｍｌにアセトン１６０ｍｌを加えて抽出した。これをろ過助剤であるセライト５４５（ジョンズ マンビル プロダクト コーポレーション製）を用いてろ過し、アセトン抽出液３００ｍｌを得た。それを減圧下濃縮してアセトンを留去後、塩酸でｐＨを３．０に調整し、酢酸エチル１５０ｍｌで抽出した。それを飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水してろ紙でろ過後、減圧下濃縮乾固してＡ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質を含む抽出物２０９ｍｇを得た。
【００７３】
次いでこの抽出物をコスモシルカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ １４０Ｃ１８−ＯＰＮ ３０ｍｌ）を用いて精製した。抽出物２０９ｍｇをメタノール３ｍｌに溶解してコスモシル２ｇにコーティングした試料をアセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ３．０＝３：７に懸濁し、あらかじめ、アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ３．０＝３：７で平衡化したコスモシルカラムに重層した。そして、アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ３．０＝２：３、アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ３．０＝１：１各１６０ｍｌで段階溶出し、１０ｍｌずつ３２分画した（分画の順番にフラクションＮｏ．１〜３２とする。）。
【００７４】
Ａ物質およびＢ物質を含むフラクションＮｏ．１９、２０を集め、活性画分２０ｍｌを得た。減圧下濃縮してアセトニトリルを留去後、塩酸でｐＨ３．０に調整して酢酸エチルで抽出した。その抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水してろ紙でろ過後、減圧下濃縮乾固してＡ物質およびＢ物質を含む粗精製物４３．４ｍｇを得た。この粗精製物をＨＰＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１８ φ１９×１００ｍｍ）で分離した。あらかじめ５５％アセトニトリル水−０．０２％ギ酸で平衡化したＨＰＬＣカラムに、粗精製物４３．４ｍｇを０．９ｍｌメタノールに溶解した試料溶液０．３ｍｌを注入後、５５％アセトニトリル水−０．０２％ギ酸を溶媒として流速６ｍｌ／分で溶出した。検出波長２１０ｎｍで溶出液をモニタ−し、保持時間１０．３から１２．０分までを分取した。残りの試料溶液０．６ｍｌについても同様の操作を行い、Ａ物質を含む活性画分を得た。減圧下濃縮してＡ物質の無色粉末６．１ｍｇを得た。
Ａ物質は、以下の物理化学的性状を示した。
１）性質：無色粉末；
２）溶解性：メタノール、アセトン、酢酸エチル、ピリジンに可溶；
３）分子式：Ｃ_３８Ｈ_６２Ｏ_１６；
４）分子量：７７４；
５）紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０７（２９７００）、２４３（ｓｈ、４６００）、３０６（３９００）ｎｍに吸収極大を示す；
６）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ ｃｍ^−１
ＫＢｒディスク法で測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである、
３３７７、２９２３、２８５２、１７２６、１６６３、１４６５、１３７９、１２１６、１０７４、１０２９；
７） １Ｈ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、図１に次の通りであり、以下のシグナルが確認できた；
１．１５−１．３５ （２２Ｈ， ｍ）， １．２９ （３Ｈ， ｄ， ６ Ｈｚ）， １．２９ （２Ｈ， ｍ）， １．４５ （１Ｈ， ｍ）， １．６３ （１Ｈ， ｍ）， １．７２ （２Ｈ， ｍ）， ２．６２ （２Ｈ， ｔ， ７．５ Ｈｚ）， ３．９２ （１Ｈ， ｍ）， ４．０８ （１Ｈ， ｄ， ９．０ Ｈｚ）， ４．２１ （１Ｈ， ｍ）， ４．２５ （２Ｈ， ｓ）， ４．２９ （１Ｈ， ｍ）， ４．４ （１Ｈ， ｍ）， ４．５６−４．６１ （３Ｈ， ｍ）， ４．７７ （１Ｈ， ｂｒ． ｓ）， ４．８８ （１Ｈ， ｄ， ８．０ Ｈｚ）， ５．１６ （１Ｈ， ｄ， ８．５ Ｈｚ）， ５．２ （１Ｈ， ｍ）， ５．２４ （１Ｈ， ｄ， ８．５ Ｈｚ）， ５．３７ （１Ｈ， ｓ）， ６．８５ （１Ｈ， ｄ， ７．５ Ｈｚ）， ７．１７ （１Ｈ， ｄ， ８．５ Ｈｚ）， ７．３９ （１Ｈ， ｄｄ， ７．５ Ｈｚ， ８．０ Ｈｚ）；８）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、図２に示す通りであり、以下に示すシグナルが確認できた。
２０．２， ２４．２， ２５．８， ２９．７−２９．９ （１１シグナル）， ３６．２， ４２．３， ６３．４， ６３．８， ６９．６， ７０．４， ７１．２， ７２．３ （２シグナル）， ７３．６， ７５．８， ７８．７， ８１．６， １０２．４， １１６．７， １２２．９， １３３．４， １３９．６， １６４．０， １７４．８
９）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム： Ｗａｔｅｒｓ ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ）
移動相： アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ３．０＝３：２
流速： １．０ｍｌ／分
検出波長： ２１０ ｎｍ
保持時間： ３．６分。
【００７５】
（実施例２） Ｂ物質の精製
実施例１に記載のＨＰＬＣでの分離にて、保持時間１３．５から１６．２分までを分取し、Ｂ物質を含む活性画分を得た。減圧下濃縮してＢ物質の無色粉末１３．５ｍｇを得た。
【００７６】
Ｂ物質は以下の物理学的性状を示した。
１）性質：無色粉末；
２）溶解性：メタノール、アセトン、酢酸エチル、ピリジンに可溶；
３）分子式：Ｃ_４０Ｈ_６４Ｏ_１７；
４）分子量：８１６；
５）紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０８（３２０００）、２４２（ｓｈ、４９００）、３０６（４３００）ｎｍに吸収極大を示す；
６）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ ｃｍ^−１
ＫＢｒディスク法で測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである
３３９０、２９２５、２８５３、１７３０、１６７１、１４６５、１３７６、１２４９、１０７５、１０３１；
７） １Ｈ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、図３に通りであり、以下に示すシグナルが確認できた；
１．１４−１．２６ （２２Ｈ， ｍ）， １．３１ （３Ｈ， ｄ， ６．５ Ｈｚ）， １．３１ （２Ｈ， ｍ）， １．４９ （１Ｈ， ｍ）， １．６４−１．７６ （３Ｈ， ｍ）， ２．１０ （３Ｈ， ｓ）， ２．６０ （２Ｈ， ｔ， ７．５ Ｈｚ）， ３．９７ （１Ｈ， ｍ）， ４．２１ （２Ｈ， ｓ）， ４．２４−４．３４ （３Ｈ， ｍ）， ４．３９ （１Ｈ， ｄｄ， ９．０ Ｈｚ， ９．５ Ｈｚ）， ４．６３ （２Ｈ， ｍ）， ４．７７ （２Ｈ， ｓ）， ５．１６ （２Ｈ， ｓ）， ５．２３ （１Ｈ， ｍ）， ５．６０ （１Ｈ， ｓ）， ６．１４ （１Ｈ， ｄ， ３．５ Ｈｚ）， ６．８６ （１Ｈ， ｄ， ７．５ Ｈｚ）， ７．１６ （１Ｈ， ｄ， ８．０ Ｈｚ）， ７．４０ （１Ｈ， ｔ， ８．０ Ｈｚ）；
８）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、図４に示す通りであり、以下に示すシグナルが確認できた；
２０．２， ２１．３， ２４．２， ２５．８， ２９．７−３０．０ （１１シグナル）， ３６．３， ４２．３， ６３．２， ６３．９， ６９．６， ７０．４， ７１．２， ７２．２， ７３．４ （２シグナル）， ７３．７， ７８．６， ８０．４， １００．０， １１６．７， １２２．９， １３３．７， １３９．５， １６３．８， １７１．１， １７４．６
９）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム： Ｗａｔｅｒｓ ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ）
移動相： アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ３．０＝３：２
流速： １．０ｍｌ／分
検出波長： ２１０ ｎｍ
保持時間： ４．８分。
【００７７】
（実施例３） Ｅ物質の精製
実施例１に記載のコスモシルカラムを用いての精製にて、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質を含むフラクションＮｏ．２１からＮｏ．２３を集め、活性画分３０ｍｌを得た。減圧下濃縮してアセトニトリルを留去後、塩酸でｐＨ３．０に調整して酢酸エチルで抽出した。その抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水してろ紙でろ過後、減圧下濃縮乾固してＥ物質、Ｆ物質およびＧ物質を含む粗精製物８２．４ｍｇを得た。この粗精製物をＨＰＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１８ φ１９×１００ｍｍ）で分離した。あらかじめ６０％アセトニトリル水−０．０２％ギ酸で平衡化したＨＰＬＣカラムに、粗精製物８２．４ｍｇを１．０ｍｌメタノールに溶解した試料溶液０．２ｍｌを注入後、６０％アセトニトリル水−０．０２％ギ酸を溶媒として流速６ｍｌ／分で溶出した。検出波長２１０ｎｍで溶出液をモニタ−し、保持時間１３．５から１５．０分までを分取した。残りの試料溶液０．８ｍｌについても同様の操作を行い、Ｅ物質を含む活性画分を得た。減圧下濃縮してＥ物質の無色油状物２１．９ｍｇを得た。
【００７８】
Ｅ物質は以下の物理化学的性状を示した。
１）性質：無色油状；
２）溶解性：クロロホルム、メタノール、アセトン、酢酸エチルに可溶；
３）分子式：Ｃ_４２Ｈ_６６Ｏ_１８；
４）分子量：８５８；
５）紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０８（２９９００）、２４２（４７００）、３０６（３９００）ｎｍに吸収極大を示す；
６）赤外線吸収スペクトル（薄膜法）：νｍａｘ ｃｍ^−１
薄膜法で測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：
３４１８、２９２７、２８５５、１７３８、１６７２、１４６５、１３７５、１２３１、１０７５、１０３２；
７） １Ｈ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、図５に示す通りであり、以下のシグナルが確認できた；
１．１９−１．２６ （２２Ｈ， ｍ）， １．３６ （３Ｈ， ｄ， ５．０ Ｈｚ）， １．３６ （１Ｈ，ｍ）， １．５１ （２Ｈ， ｍ）， １．７２ （３Ｈ， ｍ）， １．８２ （３Ｈ， ｓ）， ２．１９ （３Ｈ， ｓ）， ２．６０ （２Ｈ， ｔ， ７．５ Ｈｚ）， ３．９５ （１Ｈ， ｍ）， ４．２２ （２Ｈ， ｓ）， ４．２２−４．３５ （２Ｈ， ｍ）， ４．３７−４．４ （２Ｈ， ｍ）， ４．４７ （１Ｈ， ｄ， ９．５ Ｈｚ）， ４．６１−４．６４ （２Ｈ， ｍ）， ４．８ （１Ｈ， ｍ）， ５．２３ （１Ｈ， ｄ， ９．５ Ｈｚ）， ５．２８ （１Ｈ， ｍ）， ５．５８ （１Ｈ， ｓ）， ５．６９ （１Ｈ， ｄ， ９．５ Ｈｚ）， ６．１３ （１Ｈ， ｄ， ３．５ Ｈｚ）， ６．８６ （１Ｈ， ｄ， ７．０ Ｈｚ）， ７．１６ （１Ｈ， ｄ， ８．０ Ｈｚ）， ７．４０ （１Ｈ， ｄｄ， ７．５ Ｈｚ， ８．０ Ｈｚ）
８）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、図６に示す通りであり、以下のシグナルが確認できた；
２０．２ （２シグナル）， ２１．３， ２４．２， ２５．７， ２９．７−３０．０ （１１シグナル）， ３６．３， ４２．３， ４８．６， ６３．１， ６３．２， ６９．６， ６９．８， ７０．４， ７１．９， ７３．５， ７３．６， ７４．０， ７８．５， ７９．０， ９９．６， １１５．３， １１６．８， １２３．０， １３３．７， １３９．６， １６３．９， １７０．３， １７０．９， １７１．１， １７４．６
９）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム： Ｗａｔｅｒｓ ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ）
移動相： アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ３．０＝３：２
流速： １．０ｍｌ／分
検出波長： ２１０ ｎｍ
保持時間： ７．５分。
【００７９】
（実施例４） Ｆ物質の精製
実施例３に記載のＨＰＬＣでの分離にて、保持時間１５．６から１７．１分までを分取し、Ｆ物質を含む活性画分を得た。減圧下濃縮してＦ物質の無色油状物２９．１ｍｇを得た。
Ｆ物質は以下の物理化学的性状を示した：
１）性質：無色油状；
２）溶解性：クロロホルム、メタノール、アセトン、酢酸エチルに可溶；
３）分子式：Ｃ_４５Ｈ_６８Ｏ_２１；
４）分子量：９４４；
５）紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０８（２９４００）、２４３（ｓｈ、４７００）、３０７（４２００）ｎｍに吸収極大を示す；
６）赤外線吸収スペクトル（薄膜法）：νｍａｘ ｃｍ^−１
薄膜法で測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：
３４２１、２９２６、２８５５、１７４１、１６７３、１４６５、１３７５、１２２８、１０７１；
７） １Ｈ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、図７に示す通りであり、以下に示すシグナルが確認された；
１．１６−１．３２ （２２Ｈ， ｍ）， １．３６ （３Ｈ， ｄ， ６．０ Ｈｚ）， １．３６ （１Ｈ， ｍ）， １．４９ （２Ｈ， ｍ）， １．７２ （３Ｈ， ｍ）， １．７９ （３Ｈ， ｓ）， ２．１４ （３Ｈ， ｓ）， ２．６１ （２Ｈ， ｔ， ７．５ Ｈｚ）， ３．７８ （２Ｈ， ｓ）， ４．０１ （１Ｈ， ｍ）， ４．２３ （２Ｈ， ｓ）， ４．２３−４．２８ （１Ｈ， ｍ）， ４．３４−４．４１ （３Ｈ， ｍ）， ４．６０ （１Ｈ， ｄ， １０．０ Ｈｚ）， ４．７７ （１Ｈ， ｍ）， ４．９３ （１Ｈ， ｍ）， ５．１１ （１Ｈ， ｄ， ９．５ Ｈｚ）， ５．２８ （２Ｈ， ｍ）， ５．５８ （１Ｈ， ｓ）， ５．６６ （１Ｈ， ｄ， ９．５ Ｈｚ）， ６．２５ （１Ｈ， ｓ）， ６．８６ （１Ｈ， ｄ， ７．５ Ｈｚ）， ７．１７ （１Ｈ， ｄ， ８．０ Ｈｚ）， ７．４０ （１Ｈ， ｄｄ， ７．５ Ｈｚ， ８．０ Ｈｚ）；
８）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、図８に示す通りであり、以下に示すシグナルが確認された；
２０．２ （２シグナル）， ２１．２， ２４．２， ２５．７， ２９．７−３０．０ （１１シグナル）， ３６．３， ４２．３， ４２．８， ４８．８， ６３．３， ６６．６， ６９．７， ６９．８， ７０．１， ７２．０， ７３．２， ７３．６， ７３．９， ７６．０， ７８．４， ９９．７， １１５．４， １１６．８， １２２．９， １３３．６， １３９．６， １６３．９， １６８．０， １７０．０， １７０．３， １７０．８， １７０．８， １７４．６
９）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム： Ｗａｔｅｒｓ ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ）
移動相： アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ３．０＝３：２
流速： １．０ｍｌ／分
検出波長： ２１０ ｎｍ
保持時間： ８．５分。
【００８０】
（実施例５） Ｇ物質の精製
実施例３に記載のＨＰＬＣでの分離にて、保持時間２３．７から２７．０分までを分取し、Ｇ物質を含む活性画分を得た。減圧下濃縮してＧ物質の無色粉末２．８ｍｇを得た。
【００８１】
Ｇ物質は以下の物理化学的性状を示した。
１）性質：無色粉末；
２）溶解性：メタノール、アセトン、酢酸エチル、ピリジンに可溶。；
３）分子式：Ｃ_４３Ｈ_６６Ｏ_２０；
４）分子量：９０２；
５）紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０８（２９０００）、２４１（ｓｈ、４５００）、３０５（３２００）ｎｍに吸収極大を示す、
６）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ ｃｍ^−１
ＫＢｒディスク法で測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：
３４０８、２９２４、２８５３、１７３９、１６６１、１４５３、１３７７、１２４２、１０６８；
７） １Ｈ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、図９に示す通りであり、以下に示すシグナルが観察された；
１．２１−１．３１ （２０Ｈ， ｓ）， １．３６ （３Ｈ， ｄ， ６．０ Ｈｚ）， １．３６ （１Ｈ， ｍ）， １．４８ （４Ｈ， ｍ）， １．７１ （１Ｈ， ｍ）， １．８５ （２Ｈ， ｍ）， １．８８ （３Ｈ， ｓ）， ２．１５ （３Ｈ， ｓ）， ３．３１ （２Ｈ， ｔ， ７．５ Ｈｚ）， ３．７８ （２Ｈ， ｓ）， ４．０１ （１Ｈ， ｍ）， ４．２７ （１Ｈ， ｄｄ， ８．０ Ｈｚ， １０．５ Ｈｚ）， ４．３４−４．４１ （３Ｈ， ｍ）， ４．６０ （１Ｈ， ｄ， ９．５ Ｈｚ）， ４．７７ （１Ｈ， ｄｄ， ７．０ Ｈｚ， １１．５ Ｈｚ）， ４．９３ （１Ｈ， ｍ）， ５．２１ （１Ｈ， ｄ， ９．５ Ｈｚ）， ５．２８ （２Ｈ， ｍ）， ５．５８ （１Ｈ， ｓ）， ５．６６ （１Ｈ， ｄ， １０．０ Ｈｚ）， ６．２４ （１Ｈ， ｓ）， ６．９１ （１Ｈ， ｄ， ７．５ Ｈｚ）， ７．１４ （１Ｈ， ｄ， ８．５ Ｈｚ）， ７．３９ （１Ｈ， ｄｄ， ７．５ Ｈｚ， ８．０ Ｈｚ）、
８）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル； δ （ｐｐｍ）
重ピリジン溶液中（ＴＭＳ内部基準 ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、図１０に示す通りであり、以下に示すシグナルが観察された；
２０．２ （２シグナル）， ２１．２， ２５．７， ２９．８−３０．０ （１０シグナル）， ３０．３， ３２．７， ３６．２， ３６．３， ４２．８， ６３．３， ６６．６， ６９．７， ６９．８， ７０．１， ７２．０， ７３．２， ７３．６， ７３．９， ７６．０， ７８．５， ９９．６， １１５．５， １１７．１， １２１．８， １３２．８， １４６．４， １６２．６， １６８．０， １７０．０， １７０．３， １７０．８ （２シグナル）， １７５．０、
９）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム： Ｗａｔｅｒｓ ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１８（φ４．６×１５０ｍｍ）
移動相： アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸バッファーｐＨ３．０＝３：２
流速： １．０ｍｌ／分
検出波長： ２１０ ｎｍ
保持時間： １１．４分。
【００８２】
（試験例１）ヒアルロン酸−ＣＤ４４結合阻害試験
ヒトＣＤ４４のｃＤＮＡはヒトリンパ節由来ｃＤＮＡライブラリー（ＴＡＫＡＲＡ）を鋳型にＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲに用いたプライマーはデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ）より得られたＣＤ４４ｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ）： Ｕ４０３７３：配列表の配列番号１）のヌクレオチド番号６５乃至８５に示されるヌクレオチド配列の５’側にＳａｌ Ｉ切断点とＫｏｚａｃ配列（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１５巻、８１２５‐８１４８頁、１９８７年）を導入したプライマー１：
５’−ＡＧＣＴＡＧＧＴＣＧＡＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＴＧＧＴＧＧＣＡＣ−３’（配列表の配列番号３）と配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１１３０乃至１１５０に示されるヌクレオチド配列の相補鎖の５’側にＨｉｎｄ ＩＩＩ切断点を導入したプライマー２：
５’−ＡＧＣＴＡＧＡＡＧＣＴＴＡＣＡＣＣＣＣＡＡＴＣＴＴＣＡＴＧＴＣ−３’（配列表の配列番号４）を用いた。ＰＣＲ増幅産物を制限酵素Ｓａｌ Ｉ（ＴＡＫＡＲＡ）とＨｉｎｄ ＩＩＩ（ＴＡＫＡＲＡ）により切断し、この断片を発現ベクター、ｐＲＫ５（ファーミンジェン）に組み込んだ。これをリン酸カルシウム法によりｐＳＶ２ｎｅｏ（インビトロジェン）とともにコラーゲンコートシャーレ上で１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（インビトロジェン）を用い培養したヒト腎臓上皮由来細胞株ＨＥＫ２９３（ＣＲＬ−１５７３、アメリカン タイプ カルチャー コレクション）に導入し、抗生物質Ｇ４１８（５００μｇ／ｍｌ）により遺伝子導入細胞を選択した。抗ヒトＣＤ４４モノクローナル抗体（バイオメダ）を用い、一般的なウエスタンブロッティングによりＣＤ４４の発現を確認した。このＣＤ４４発現細胞を４日間培養したあとカルシウムイオン、マグネシウムイオンフリーのダルベッコリン酸バッファー（以下、ＰＢＳと称する。）で洗浄し、２ｍＭ エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）を含むＰＢＳでシャーレからはがした。遠心（１８００×ｇ、５分）により細胞を回収した後、０．２Ｍ 塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ トリス塩酸バッファーｐＨ７．８（以下、バッファーＡと称する。）で２度洗浄した。細胞を再度バッファーＡに懸濁し、２分間の超音波処理による破砕の後、４００×ｇで１０分間遠心した。この上清を２０，０００×ｇで１時間遠心し、沈殿をバッファーＡで１度洗浄後、バッファーＡ中で超音波処理し、均一化したものをＣＤ４４発現細胞膜懸濁液とした。
【００８３】
蛍光ヒアルロン酸はベルダーらの方法（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４４巻、２５１−２５７頁、１９７５年）に若干の修正を加え、以下のように調製した。５０ｍｇのヒアルロン酸ナトリウム（生化学工業、鶏冠由来、分子量７．１×１０^５）を４０ｍｌの蒸留水に溶解し、２０ｍｌのジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯ）と混合した。この混合液にアセトアルデヒド（２５μｌ、フルカ）とシクロヘキシルイソシアニド（２５μｌ、フルカ）を含むＤＭＳＯ（０．５ｍｌ）に溶解したフルオロセインアミン−アイソタイプＩ（２５ｍｇ、アルドリッチ）を加えた。室温（約２５℃）で５時間攪拌した後、２４０ｍｌの塩化ナトリウム飽和エタノールに注ぎ、沈殿した蛍光ヒアルロン酸を遠心（１０００×ｇ、１５分）で回収した。これを６０ｍｌの蒸留水に溶解し、２４０ｍｌの塩化ナトリウム飽和エタノールで沈殿させ、回収する作業を２度繰り返した後、１０ｍｌの蒸留水に溶解し、透析により脱塩を行い、蛍光ヒアルロン酸溶液とした。
上記ＣＤ４４発現細胞膜懸濁液（タンパク質濃度として２００μｇ／ｍｌ）を、９６ウェルガラス繊維濾紙黒色プレート（ユニフィルター、疎水性ＧＦ／Ｃ膜、ワットマン）に１ウェルに対し１００μｌ分注し、ここへメタノールで溶解した被検化合物を１μｌ添加した後、さらに蛍光ヒアルロン酸０．２μｇを添加した。室温で１時間インキュベートした後、液体をマルチスクリーン（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を用いて吸引濾過した。これにバッファーＡを１ウェルあたり２５０μｌ添加し、吸引濾過する操作を６回繰り返すことによりフィルターに吸着した細胞膜を洗浄した。洗浄後、１ウェルに対し０．３Ｎ 水酸化ナトリウムを１００μｌ添加し、アルボ（アマシャム−ファルマシア）により、励起光４８５ｎｍによる発光光５３５ｎｍを測定し、ＣＤ４４発現細胞膜への蛍光ヒアルロン酸の結合量を検出した。蛍光ヒアルロン酸の非特異的結合は過剰量の非標識ヒアルロン酸（終濃度２００μｇ／ｍｌ）を加えることにより検出した。蛍光ヒアルロン酸の全結合と非特異的結合の差を特異的結合とし、特異的結合に対する阻害率（％）を算出した。表１に、Ｆ−１６４３８Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質を終濃度でそれぞれ５０、２５、１２．５および６．２５μｇ／ｍｌ添加した場合の阻害率（％）の平均値と標準偏差を示した。Ｆ−１６４３８Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質およびＧ物質はヒアルロン酸とＣＤ４４との結合を顕著に阻害し、ＩＣ_５０値はそれぞれ８．０、１１．０、２３．４、１１．３、１１．７μｇ／ｍｌであった（表１）。
【００８４】
【表１】

【００８５】
（製剤例）
（製剤例１）ソフトカプセル剤
消化性油状物、例えば、大豆油、綿実油又はオリーブ油中に入れた実施例１で得られたＡ物質の混合物を調製し、正置換ポンプでゼラチン中に注入して、１００ ｍｇの活性成分を含有するソフトカプセルを得、洗浄後、乾燥する。同様に１００ｍｇの実施例２で得られたＢ物質、実施例３で得られたＥ物質、実施例４で得られたＦ物質及び実施例５で得られたＧ物質を活性成分として含有するソフトカプセルを得る。
【００８６】
（製剤例２）錠剤
常法に従って、１００ ｍｇの実施例１で得られたＡ物質、０．２ ｍｇのコロイド性二酸化珪素、５ ｍｇのステアリン酸マグネシウム、２７５ ｍｇの微結晶性セルロース、１１ ｍｇ のデンプン及び９８．８ ｍｇ のラクトースを用いて製造する。尚、所望により、剤皮を塗布した。同様に１００ｍｇの実施例２で得られたＢ物質、実施例３で得られたＥ物質及び実施例４で得られたＦ物質及び実施例５で得られたＧ物質を有効成分として含む錠剤を製造する。
【００８７】
（製剤例３）懸濁剤
５ ｍｌ中に、１００ ｍｇの実施例１で得られたＡ物質、１００ ｍｇのナトリウムカルボキシ基メチルセルロ−ス、５ ｍｇの安息香酸ナトリウム、１．０ ｇ のソルビトール溶液 （日本薬局方） 及び０．０２５ ｍｌのバニリンを含有するように製造する。同様に、実施例２で得られたＢ物質、実施例３で得られたＥ物質、実施例４で得られたＦ物質及び実施例５で得られたＧ物質を含有する懸濁剤を製造する。
（製剤例４）注射剤
１．５ 重量％ の実施例１で得られたＡ物質、１０容量％ のプロピレングリコール中で撹拌し、次いで、注射用水で一定容量にした後、滅菌して製造する。同様に実施例２で得られたＢ物質、実施例３で得られたＥ物質及び実施例４で得られたＦ物質及び実施例５で得られたＧ物質を含有する注射剤を製造する。
【００８８】
【発明の効果】
本発明により、新規化合物であるＦ−１６４３８Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質及びＦ物質、並びにＦ−１６４３８Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質、及びＧ物質を生産する新規微生物グロエオポルス・ダイクロウス （Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ ｄｉｃｈｒｏｕｓ （Ｆｒ．：Ｆｒ．）Ｂｒｅｓ．）ＳＡＮＫ ３０５０２株が提供され、グロエオポルス・ダイクロウス （Ｇｌｏｅｏｐｏｒｕｓ ｄｉｃｈｒｏｕｓ （Ｆｒ．：Ｆｒ．）Ｂｒｅｓ．）ＳＡＮＫ ３０５０２株を用いたＦ−１６４３８Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質及びＦ物質及びＧ物質の製造方法が提供された。また、Ｆ−１６４３８Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質及びＧ物質をおよびＧ物質がヒアルロン酸とＣＤ４４との結合を顕著に阻害する活性を有することを見出し、Ｆ−１６４３８Ａ物質、Ｂ物質、Ｅ物質、Ｆ物質及びＧ物質の少なくともいずれか一つ又はその塩を有効成分として含有する、変形性関節症の予防薬及び／又は治療薬が提供された。
【００８９】
【配列表フリーテキスト】
配列番号３：ＣＤ４４用ＰＣＲセンスプライマー
配列番号４：ＣＤ４４用ＰＣＲアンチセンスプライマー
【００９０】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】Ａ物質の^１Ｈ核磁気共鳴スペクトルを示す図。
【図２】Ａ物質の^１３Ｃ核磁気共鳴スペクトルを示す図。
【図３】Ｂ物質の^１Ｈ核磁気共鳴スペクトルを示す図。
【図４】Ｂ物質の^１３Ｃ核磁気共鳴スペクトルを示す図。
【図５】Ｅ物質の^１Ｈ核磁気共鳴スペクトルを示す図。
【図６】Ｅ物質の^１３Ｃ核磁気共鳴スペクトルを示す図。
【図７】Ｆ物質の^１Ｈ核磁気共鳴スペクトルを示す図。
【図８】Ｆ物質の^１３Ｃ核磁気共鳴スペクトルを示す図。
【図９】Ｇ物質の^１Ｈ核磁気共鳴スペクトルを示す図。
【図１０】Ｇ物質の^１３Ｃ核磁気共鳴スペクトルを示す図。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel compound that inhibits CD44, which is a hyaluronic acid receptor, and is useful as a therapeutic and / or prophylactic agent for osteoarthritis and a method for producing the same.
[0002]
[Prior art]
Osteoarthritis is a disease in which mechanical stimulus is applied based on the aging of articular cartilage and a decrease in muscular strength, resulting in the degeneration and destruction of cartilage that cannot withstand the load on the joint (for example, see Non-Patent Document 1). ). Since pain is often the main complaint, symptomatic treatment of administering a nonsteroidal anti-inflammatory drug as an analgesic has been widely performed as a main treatment (for example, see Non-Patent Document 2). Matrix metalloprotease inhibitors aimed at suppressing cartilage matrix degradation, which is a fundamental cause of osteoarthritis (for example, see Non-Patent Document 3), have not yet been effective in clinical settings. Under these circumstances, Alz (sodium hyaluronate intraarticular injection, Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.), which is a hyaluronic acid preparation, is currently the only drug that is effective against osteoarthritis. Hyaluronic acid, which is a synovial fluid component, is directly administered into a joint and supplemented to suppress pain and provide a protective effect on articular cartilage (for example, see Non-Patent Documents 4 and 5). However, in addition to the general problems of injections, such as the complexity of administration and the burden on the patient, there remains the problem that the site that can be administered is limited to relatively large joints such as shoulders and knees. I have. Therefore, a drug that inhibits the degradation of hyaluronic acid in vivo, rather than directly replenishing hyaluronic acid, has the same effect as Alzia, and has an effect not only on shoulder and knee joints, but also on arthritis of the whole body. There is expected.
[0003]
It is thought that the degradation of hyaluronic acid in a living body is initiated by the binding of hyaluronic acid to CD44, a receptor present on the cell surface (for example, see Non-Patent Document 6). Therefore, a substance that inhibits the binding of CD44 to hyaluronic acid is considered to have an effect of improving joint function by inhibiting the degradation of hyaluronic acid and maintaining or increasing the amount of hyaluronic acid in a living body. No compound having such a pharmacological action has been reported.
[0004]
Caloporoside represented by formula (III)
[0005]
Embedded image

Is a compound having weak antibacterial activity identified as a substance produced by Caloporus dichrous (for example, see Non-Patent Document 7). On the other hand, Gloeoporus dichrous (Fr .: Fr.) Bres. It is reported that ST001714, DSM 13784 produces analogs of caroposide, and these compounds have antitumor activity (for example, see Patent Document 1). However, there is no report that carapoloside and its analogous compounds affect the binding between CD44 and hyaluronic acid.
[0006]
[Patent Document 1]
WO 02/072110 pamphlet
[Non-patent document 1]
"Lancet", 1999, vol. 353, p. 2177-2178
[Non-patent document 2]
"American Family Physician", 2002, Vol. 65, p. 841-848
[Non-Patent Document 3]
"Osteoarthritis and Cartilage", 2002, Vol. 10, p. 785-791
[Non-patent document 4]
"Joint Surgery", 1996, Vol. 15, p. 1173-1179
[Non-Patent Document 5]
"Journal of the Japanese Society of Orthopedic Surgery", 1995, Vol. 69, p. 735-743
[Non-Patent Document 6]
"Journal of Cell Science", 1993, Vol. 106, p. 365-375
[Non-Patent Document 7]
"Journal of Antibiotics", 1994, Vol. 47, p. 1188-1194
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
The present inventors aim to develop a new therapeutic agent for osteoarthritis that inhibits the degradation of hyaluronic acid in vivo and suppresses pain and protects cartilage, and inhibits the binding of hyaluronic acid to its receptor, CD44. The search for substances was carried out diligently. As a result, in a culture solution of Gloeoporus dichrous SANK 30502 strain isolated from the soil, a substance A (formula (IV)), which is a caroboroside analog having an activity of inhibiting the binding of hyaluronic acid to CD44,
[0008]
Embedded image

B substance (formula (V)),
[0009]
Embedded image

E substance (formula (VI)),
[0010]
Embedded image

Substance F (Formula (VII)),
[0011]
Embedded image

And G substance (formula (II)),
[0012]
Embedded image

Was found to be produced, and the present invention was completed.
[0013]
Still another object of the present invention is to provide a remedy for osteoarthritis comprising a substance A, a substance B, a substance E, a substance F and a substance G as active ingredients.
[0014]
[Means for Solving the Problems]
The present invention
(1)
The following formula (I)
[0015]
Embedded image

[0016]
(Where R₁Represents a hydrogen atom or an acetyl group;₂Represents a hydrogen atom or a malonyl group;₃Represents a hydrogen atom or an acetyl group. ) Or a salt thereof,
(2) In the formula (I) described in (1), R₁, R₂And R₃Is a hydrogen atom or a salt thereof,
(3) In the formula (I) described in (1), R₁Is an acetyl group, R₂And R₃Is a hydrogen atom or a salt thereof,
(4) In the formula (I) described in (1), R₁And R₃Is an acetyl group, R₂Is a hydrogen atom or a salt thereof,
(5) In the formula (I) described in (1), R₁And R₃Is an acetyl group, R₂Is a malonyl group or a salt thereof,
(6) Compounds having the following physicochemical properties or salts thereof:
1) Properties: colorless powder;
2) Solubility: soluble in methanol, acetone, ethyl acetate, pyridine;
3) Molecular formula: C₃₈H₆₂O₁₆;
4) Molecular weight: 774;
5) UV absorption spectrum: λmax nm (ε)
UV absorption spectra measured in methanol solution show absorption maxima at 207 (29700), 243 (sh, 4600), 306 (3900) nm;
6) Infrared absorption spectrum (KBr): νmax cm^-1
The infrared absorption spectrum measured by the KBr disk method is as follows:
3377, 2923, 2852, 1726, 1663, 1465, 1379, 1216, 1074, 1029;
7) 1H-nuclear magnetic resonance spectrum; δ (ppm)
The nuclear magnetic resonance spectrum (500 MHz) measured in a heavy pyridine solution (TMS internal standard) is as follows:
1.15-1.35 (22H, m), 1.29 (3H, d, 6 Hz), 1.29 (2H, m), 1.45 (1H, m), 1.63 (1H, m) ), 1.72 (2H, m), 2.62 (2H, t, 7.5 Hz), 3.92 (1H, m), 4.08 (1H, d, 9.0 Hz), 4.0. 21 (1H, m), 4.25 (2H, s), 4.29 (1H, m), 4.4 (1H, m), 4.56-4.61 (3H, m), 4.77 (1H, br.s), 4.88 (1H, d, 8.0 Hz), 5.16 (1H, d, 8.5 Hz), 5.2 (1H, m), 5.24 (1H , D, 8.5 Hz), 5.37 (1H, s), 6.85 (1H, d, 7.5 Hz) , 7.17 (1H, d, 8.5 Hz), 7.39 (1H, dd, 7.5 Hz, 8.0 Hz); 8) 13C-nuclear magnetic resonance spectrum; δ (ppm)
The nuclear magnetic resonance spectrum (125 MHz) measured in a heavy pyridine solution (TMS internal standard) is as follows.
20.2, 24.2, 25.8, 29.7-29.9 (11 signals), 36.2, 42.3, 63.4, 63.8, 69.6, 70.4, 71. 2, 72.3 (2 signals), 73.6, 75.8, 78.7, 81.6, 102.4, 116.7, 122.9, 133.4, 139.6, 164.0, 174.8
9) High performance liquid chromatography
Separation column: Waters SYMMETRY C18 (φ4.6 × 150 mm)
Mobile phase: acetonitrile: 0.3% triethylamine phosphate buffer pH 3.0 = 3: 2
Flow rate: 1.0 ml / min
Detection wavelength: 210 nm
Retention time: 3.6 minutes.
(7) Compounds having the following physicochemical properties or salts thereof:
1) Properties: colorless powder;
2) Solubility: soluble in methanol, acetone, ethyl acetate, pyridine;
3) Molecular formula: C₄₀H₆₄O₁₇;
4) Molecular weight: 816;
5) UV absorption spectrum: λmax nm (ε)
UV absorption spectrum measured in methanol solution shows absorption maxima at 208 (32000), 242 (sh, 4900), 306 (4300) nm;
6) Infrared absorption spectrum (KBr): νmax cm^-1
The infrared absorption spectrum measured by the KBr disk method is as follows.
3390, 2925, 2853, 1730, 1671, 1465, 1376, 1249, 1075, 1031;
7) 1H-nuclear magnetic resonance spectrum; δ (ppm)
The nuclear magnetic resonance spectrum (500 MHz) measured in a heavy pyridine solution (TMS internal standard) is as follows:
1.14 to 1.26 (22H, m), 1.31 (3H, d, 6.5 Hz), 1.31 (2H, m), 1.49 (1H, m), 1.64-1 .76 (3H, m), 2.10 (3H, s), 2.60 (2H, t, 7.5 Hz), 3.97 (1H, m), 4.21 (2H, s), 4 .24-4.34 (3H, m), 4.39 (1H, dd, 9.0 Hz, 9.5 Hz), 4.63 (2H, m), 4.77 (2H, s), 5 .16 (2H, s), 5.23 (1H, m), 5.60 (1H, s), 6.14 (1H, d, 3.5 Hz), 6.86 (1H, d, 7. 5 Hz), 7.16 (1H, d, 8.0 Hz), 7.40 (1H, t, 8.0 Hz) ;
8) 13C-nuclear magnetic resonance spectrum; δ (ppm)
The nuclear magnetic resonance spectrum (125 MHz) measured in a heavy pyridine solution (TMS internal standard) is as follows:
20.2, 21.3, 24.2, 25.8, 29.7-30.0 (11 signals), 36.3, 42.3, 63.2, 63.9, 69.6, 70. 4, 71.2, 72.2, 73.4 (2 signals), 73.7, 78.6, 80.4, 100.0, 116.7, 122.9, 133.7, 139.5. 163.8, 171.1, 174.69) High performance liquid chromatography
Separation column: Waters SYMMETRY C18 (φ4.6 × 150 mm)
Mobile phase: acetonitrile: 0.3% triethylamine phosphate buffer pH 3.0 = 3: 2
Flow rate: 1.0 ml / min
Detection wavelength: 210 nm
Retention time: 4.8 minutes,
(8) A compound having the following physicochemical properties or a salt thereof:
1) Properties: colorless oil;
2) Solubility: soluble in chloroform, methanol, acetone, ethyl acetate;
3) Molecular formula: C₄₂H₆₆O₁₈;
4) Molecular weight: 858;
5) UV absorption spectrum: λmax nm (ε)
UV absorption spectra measured in methanol solution show absorption maxima at 208 (29900), 242 (4700), 306 (3900) nm;
6) Infrared absorption spectrum (thin film method): νmax cm^-1
The infrared absorption spectrum measured by the thin film method is as follows:
3418, 2927, 2855, 1738, 1672, 1465, 1375, 1231, 1075, 1032;
7) 1H-nuclear magnetic resonance spectrum; δ (ppm)
The nuclear magnetic resonance spectrum (500 MHz) measured in a heavy pyridine solution (TMS internal standard) is as follows:
1.19-1.26 (22H, m), 1.36 (3H, d, 5.0 Hz), 1.36 (1H, m), 1.51 (2H, m), 1.72 (3H , M), 1.82 (3H, s), 2.19 (3H, s), 2.60 (2H, t, 7.5 Hz), 3.95 (1H, m), 4.22 (2H , S), 4.22-4.35 (2H, m), 4.37-4.4 (2H, m), 4.47 (1H, d, 9.5 Hz), 4.61-4. 64 (2H, m), 4.8 (1H, m), 5.23 (1H, d, 9.5 Hz), 5.28 (1H, m), 5.58 (1H, s), 5.5. 69 (1H, d, 9.5 Hz), 6.13 (1H, d, 3.5 Hz), 6.86 (1H, d) 7.0 Hz), 7.16 (1H, d, 8.0 Hz), 7.40 (1H, dd, 7.5 Hz, 8.0 Hz)
8) 13C-nuclear magnetic resonance spectrum; δ (ppm)
The nuclear magnetic resonance spectrum (125 MHz) measured in a heavy pyridine solution (TMS internal standard) is as follows:
20.2 (2 signals), 21.3, 24.2, 25.7, 29.7-30.0 (11 signals), 36.3, 42.3, 48.6, 63.1, 63.1. 2, 69.6, 69.8, 70.4, 71.9, 73.5, 73.6, 74.0, 78.5, 79.0, 99.6, 115.3, 116.8, 123.0, 133.7, 139.6, 163.9, 170.3, 170.9, 171.1, 174.6
9) High performance liquid chromatography
Separation column: Waters SYMMETRY C18 (φ4.6 × 150 mm)
Mobile phase: acetonitrile: 0.3% triethylamine phosphate buffer pH 3.0 = 3: 2
Flow rate: 1.0 ml / min
Detection wavelength: 210 nm
Retention time: 7.5 minutes,
(9) A compound having the following physicochemical properties or a salt thereof:
1) Properties: colorless oil;
2) Solubility: soluble in chloroform, methanol, acetone, ethyl acetate;
3) Molecular formula: C₄₅H₆₈O₂₁;
4) Molecular weight: 944;
5) UV absorption spectrum: λmax nm (ε)
UV absorption spectrum measured in methanol solution shows absorption maxima at 208 (29400), 243 (sh, 4700), 307 (4200) nm;
6) Infrared absorption spectrum (thin film method): νmax cm^-1
The infrared absorption spectrum measured by the thin film method is as follows:
3421, 2926, 2855, 1741, 1673, 1465, 1375, 1228, 1071;
7) 1H-nuclear magnetic resonance spectrum; δ (ppm)
The nuclear magnetic resonance spectrum (500 MHz) measured in a heavy pyridine solution (TMS internal standard) is as follows:
1.16-1.32 (22H, m), 1.36 (3H, d, 6.0 Hz), 1.36 (1H, m), 1.49 (2H, m), 1.72 (3H , M), 1.79 (3H, s), 2.14 (3H, s), 2.61 (2H, t, 7.5 Hz), 3.78 (2H, s), 4.01 (1H). , M), 4.23 (2H, s), 4.23-4.28 (1H, m), 4.34-4.41 (3H, m), 4.60 (1H, d, 10.0) Hz), 4.77 (1H, m), 4.93 (1H, m), 5.11 (1H, d, 9.5 Hz), 5.28 (2H, m), 5.58 (1H, m) s), 5.66 (1H, d, 9.5 Hz), 6.25 (1H, s), 6.86 (1 H, d, 7.5 Hz), 7.17 (1H, d, 8.0 Hz), 7.40 (1H, dd, 7.5 Hz, 8.0 Hz);
8) 13C-nuclear magnetic resonance spectrum; δ (ppm)
The nuclear magnetic resonance spectrum (125 MHz) measured in a heavy pyridine solution (TMS internal standard) is as follows:
20.2 (2 signals), 21.2, 24.2, 25.7, 29.7-30.0 (11 signals), 36.3, 42.3, 42.8, 48.8, 63. 3, 66.6, 69.7, 69.8, 70.1, 72.0, 73.2, 73.6, 73.9, 76.0, 78.4, 99.7, 115.4. 116.8, 122.9, 133.6, 139.6, 163.9, 168.0, 170.0, 170.3, 170.8, 170.8, 174.6
9) High performance liquid chromatography
Separation column: Waters SYMMETRY C18 (φ4.6 × 150 mm)
Mobile phase: acetonitrile: 0.3% triethylamine phosphate buffer pH 3.0 = 3: 2
Flow rate: 1.0 ml / min
Detection wavelength: 210 nm
Retention time: 8.5 minutes,
(10) The ability to produce at least one compound selected from the group consisting of the compounds described in (2) to (9) and the compounds described in 1) and 2) below, which belongs to the genus Gloeoporus. Culturing the bacteria having the bacterium, and recovering at least one compound selected from the group consisting of the compounds described in (2) to (9) and the compounds described in 1) and 2) below from the culture. A method for producing at least one compound selected from the group consisting of the compounds described in (2) to (9) and the compounds described in 1) and 2) below:
1) A compound represented by the following formula (II) (hereinafter, referred to as “compound G1”) or a salt thereof
[0017]
Embedded image

(Wherein Ac is an acetyl group (COCH₃). ),
2) A compound having the following physicochemical properties (hereinafter, referred to as "compound G2") or a salt thereof
(1) Properties: colorless powder;
(2) Solubility: soluble in methanol, acetone, ethyl acetate and pyridine. ;
(3) Molecular formula: C₄₃H₆₆O₂₀;
(4) Molecular weight: 902;
(5) UV absorption spectrum: λmax nm (ε)
The ultraviolet absorption spectrum measured in a methanol solution shows an absorption maximum at 208 (29000), 241 (sh, 4500), and 305 (3200) nm.
(6) Infrared absorption spectrum (KBr): νmax cm^-1
The infrared absorption spectrum measured by the KBr disk method is as follows:
3408, 2924, 2853, 1739, 1661, 1453, 1377, 1242, 1068;
{Circle around (7)} 1H-nuclear magnetic resonance spectrum; δ (ppm)
The nuclear magnetic resonance spectrum (500 MHz) measured in a heavy pyridine solution (TMS internal standard) is as follows:
1.21-1.31 (20H, s), 1.36 (3H, d, 6.0 Hz), 1.36 (1H, m), 1.48 (4H, m), 1.71 (1H , M), 1.85 (2H, m), 1.88 (3H, s), 2.15 (3H, s), 3.31 (2H, t, 7.5 Hz), 3.78 (2H) , S), 4.01 (1H, m), 4.27 (1H, dd, 8.0 Hz, 10.5 Hz), 4.34-4.41 (3H, m), 4.60 (1H). , D, 9.5 Hz), 4.77 (1H, dd, 7.0 Hz, 11.5 Hz), 4.93 (1H, m), 5.21 (1H, d, 9.5 Hz) , 5.28 (2H, m), 5.58 (1H, s), 5.66 (1H, d, 0.0 Hz), 6.24 (1H, s), 6.91 (1H, d, 7.5 Hz), 7.14 (1H, d, 8.5 Hz), 7.39 (1H, dd) , 7.5 Hz, 8.0 Hz),
(8) 13C-nuclear magnetic resonance spectrum; δ (ppm)
The nuclear magnetic resonance spectrum (125 MHz) measured in a heavy pyridine solution (TMS internal standard) is as follows:
20.2 (2 signals), 21.2, 25.7, 29.8-30.0 (10 signals), 30.3, 32.7, 36.2, 36.3, 42.8, 63. 3, 66.6, 69.7, 69.8, 70.1, 72.0, 73.2, 73.6, 73.9, 76.0, 78.5, 99.6, 115.5, 117.1, 121.8, 132.8, 146.4, 162.6, 168.0, 170.0, 170.3, 170.8 (2 signals), 175.0,
(9) High performance liquid chromatography
Separation column: Waters SYMMETRY C18 (φ4.6 × 150 mm)
Mobile phase: acetonitrile: 0.3% triethylamine phosphate buffer pH 3.0 = 3: 2
Flow rate: 1.0 ml / min
Detection wavelength: 210 nm
Retention time: 11.4 minutes,
(11) The production method according to (10), wherein the compound is the compound according to (2),
(12) The production method according to (10), wherein the compound is the compound according to (3),
(13) The production method according to (10), wherein the compound is the compound according to (4),
(14) The production method according to (10), wherein the compound is the compound according to (5),
(15) The production method according to (10), wherein the compound is compound G1.
(16) The method according to any one of (10) to (15), wherein the bacterium belonging to the genus Gloeoporus is Gloeoporus dichrous.
(17) The microorganism according to any one of (10) to (15), wherein the bacterium belonging to the genus Gloeoporus is Gloeoporus dichrous (Fr .: Fr.) Bres. Manufacturing method,
(18) Any one of (10) to (15), wherein the bacterium belonging to the genus Gloeoporus is Gloeoporus dichrous (Fr .: Fr.) Bres. SANK 30502 strain. Manufacturing method described in
(19) Gloeoporus dichrous (Fr .: Fr.) Bres. SANK 30502 strain,
(20) a medicament comprising as an active ingredient at least one compound selected from the group of compounds according to (2) to (9) or a pharmacologically acceptable salt thereof;
(21) As an active ingredient, at least one compound selected from the group consisting of the compounds described in (2) to (9) and the compound described in Compound G1 and Compound G2 or a pharmacologically acceptable salt thereof is contained. Prophylactic and / or therapeutic drugs for osteoarthritis:
1) A compound represented by the following formula (II) (hereinafter, referred to as “compound G1”) or a salt thereof
[0018]
Embedded image

(Wherein Ac is an acetyl group (COCH₃). ),
2) A compound having the following physicochemical properties (hereinafter, referred to as "compound G2") or a salt thereof
(1) Properties: colorless powder;
(2) Solubility: soluble in methanol, acetone, ethyl acetate and pyridine. ;
(3) Molecular formula: C₄₃H₆₆O₂₀;
(4) Molecular weight: 902;
(5) UV absorption spectrum: λmax nm (ε)
The ultraviolet absorption spectrum measured in a methanol solution shows an absorption maximum at 208 (29000), 241 (sh, 4500), and 305 (3200) nm.
(6) Infrared absorption spectrum (KBr): νmax cm^-1
The infrared absorption spectrum measured by the KBr disk method is as follows:
3408, 2924, 2853, 1739, 1661, 1453, 1377, 1242, 1068;
{Circle around (7)} 1H-nuclear magnetic resonance spectrum; δ (ppm)
The nuclear magnetic resonance spectrum (500 MHz) measured in a heavy pyridine solution (TMS internal standard) is as follows:
1.21-1.31 (20H, s), 1.36 (3H, d, 6.0 Hz), 1.36 (1H, m), 1.48 (4H, m), 1.71 (1H , M), 1.85 (2H, m), 1.88 (3H, s), 2.15 (3H, s), 3.31 (2H, t, 7.5 Hz), 3.78 (2H) , S), 4.01 (1H, m), 4.27 (1H, dd, 8.0 Hz, 10.5 Hz), 4.34-4.41 (3H, m), 4.60 (1H). , D, 9.5 Hz), 4.77 (1H, dd, 7.0 Hz, 11.5 Hz), 4.93 (1H, m), 5.21 (1H, d, 9.5 Hz) , 5.28 (2H, m), 5.58 (1H, s), 5.66 (1H, d, 0.0 Hz), 6.24 (1H, s), 6.91 (1H, d, 7.5 Hz), 7.14 (1H, d, 8.5 Hz), 7.39 (1H, dd) , 7.5 Hz, 8.0 Hz),
(8) 13C-nuclear magnetic resonance spectrum; δ (ppm)
The nuclear magnetic resonance spectrum (125 MHz) measured in a heavy pyridine solution (TMS internal standard) is as follows:
20.2 (2 signals), 21.2, 25.7, 29.8-30.0 (10 signals), 30.3, 32.7, 36.2, 36.3, 42.8, 63. 3, 66.6, 69.7, 69.8, 70.1, 72.0, 73.2, 73.6, 73.9, 76.0, 78.5, 99.6, 115.5, 117.1, 121.8, 132.8, 146.4, 162.6, 168.0, 170.0, 170.3, 170.8 (2 signals), 175.0,
(9) High performance liquid chromatography
Separation column: Waters SYMMETRY C18 (φ4.6 × 150 mm)
Mobile phase: acetonitrile: 0.3% triethylamine phosphate buffer pH 3.0 = 3: 2
Flow rate: 1.0 ml / min
Detection wavelength: 210 nm
Retention time: 11.4 minutes,
(22) An osteoarthritis containing the compound according to (2) to (9) and any one compound selected from the group consisting of compound G1 and compound G2 or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient Prophylactic and / or therapeutic drugs for diseases,
(23) a binding inhibitor between hyaluronic acid and CD44, comprising the compound according to (2) to (9) and at least one compound selected from the group consisting of compound G1 and compound G2 or a salt thereof,
About.
[0019]
In the present specification, “F-16438A” is represented by the following formula (IV)
[0020]
Embedded image

Or a compound having the physicochemical properties described in (2) above (hereinafter, referred to as “substance A”).
[0021]
In this specification, “F-16438B” is represented by the following formula (V)
[0022]
Embedded image

Or a compound having the physicochemical properties described in (3) above (hereinafter, referred to as “substance B”).
[0023]
In this specification, “F-16438E” is defined by the following formula (VI)
[0024]
Embedded image

Or a compound having the physicochemical properties described in (4) above (hereinafter, referred to as “substance E”).
[0025]
In this specification, “F-16438F” is defined by the following formula (VII)
[0026]
Embedded image

Or a compound having the physicochemical properties described in (5) above (hereinafter, referred to as “substance F”).
[0027]
In the present specification, “F-16438G” is defined by the following formula (II)
[0028]
Embedded image

Or a compound having the physicochemical properties described in (6) above (hereinafter, referred to as “substance G”). The compound represented by the formula (II) has the same structure as the compound described in the pamphlet of WO02 / 072110. As for the substance G, a compound having the structure represented by the above formula may be referred to as a compound G1, and a compound having the physicochemical properties described in the above (6) may be referred to as a compound G2.
[0029]
The molecular formulas of the substance A, the substance B, the substance E, the substance F, and the substance G can be determined by a method usually used by those skilled in the art. For example, the molecular formulas can be determined by an ESI-TOFMS spectrum. The molecular weights of the substance A, the substance B, the substance E, the substance F and the substance G can be determined by a method usually used by those skilled in the art, for example, by ESI-MS spectrum.
The substance A, the substance B, the substance E, the substance F and the substance G according to the present invention are Groeopolus diklaus SANK 30502 strain (hereinafter simply referred to as “SANK 30502 strain”) isolated from basidiospores of basidiomycete fruit bodies collected in Kanagawa Prefecture. Is produced in the culture broth. That is, the substances A, B, E, F and G are produced by culturing the SANK 30502 strain and recovering the substances A, B, E, F and G from the culture. Can be.
[0030]
The compounds of the present invention represented by the formulas (I) and (II) have various isomers. In the present invention, all of these isomers are represented by a single formula, but the present invention includes all of these isomers including racemates and mixtures of these isomers. When a stereospecific synthesis method is used, or when an optically active compound is used as a starting compound, individual isomers may be directly produced, while a mixture of isomers may be produced. The individual isomers may be obtained by a conventional method.
[0031]
The compounds represented by the formulas (I) and (II) of the present invention can be converted into salts using methods well known to those skilled in the art. The present invention also includes such salts. The salts of the compounds represented by the formulas (I) and (II) of the present invention are not particularly limited as long as they are medically used and pharmacologically acceptable. In addition, when the salt of the compound represented by the formula (I) or (II) of the present invention is used for purposes other than medicine, for example, when it is used as an intermediate, there is no limitation. Such salts are preferably alkali metal salts such as sodium, potassium and lithium salts; alkaline earth metal salts such as calcium and magnesium salts; aluminum salts, iron salts, zinc salts and copper salts. , Nickel salts, metal salts such as cobalt salts; inorganic salts such as ammonium salts; t-octylamine salts, dibenzylamine salts, morpholine salts, glucosamine salts, phenylglycine alkyl ester salts, ethylenediamine salts, N-methylglucamine Salt, guanidine salt, diethylamine salt, triethylamine salt, dicyclohexylamine salt, N, N'-dibenzylethylenediamine salt, chloroprocaine salt, procaine salt, diethanolamine salt, N-benzyl-phenethylamine salt, piperazine salt, tetramethylammonium salt, Tris (hydroxyme Le) amine salts of organic salts such as aminomethane salts; and include glycine salts, lysine salts, arginine salts, ornithine salts, amino acid salts such as aspartate salts. More preferably, those preferably used as pharmacologically acceptable salts, that is, sodium salt, potassium salt, lithium salt, calcium salt, magnesium salt and the like can be mentioned.
[0032]
Further, the compounds represented by the above formulas (I) and (II) of the present invention or salts thereof may be solvates. For example, when left in the air or recrystallized, water may be absorbed, adsorbed water may be attached, or a hydrate may be formed. Such a solvate is also included in the present invention. Is done.
[0033]
Furthermore, the present invention also includes all compounds that are metabolized in vivo and converted into the compounds represented by the formulas (I) and (II) of the present invention, so-called prodrugs.
[0034]
As is well known, actinomycetes are liable to be mutated in nature or by artificial operations (for example, ultraviolet irradiation, irradiation, chemical treatment, etc.), and the same applies to the SANK 30502 strain of the present invention. The SANK 30502 strain mentioned in the present invention includes all the mutant strains. These mutants also include those obtained by genetic methods, for example, recombination, transduction, transformation, and the like. That is, the SANK 30502 strain, its mutant strains and the strains which are not clearly distinguished therefrom, which produce the compounds represented by the formulas (I) and (II) of the present invention, are all included in the SANK 30502 strain. .
[0035]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
1. Producing bacteria
The microorganism that produces all or at least one of the substance A, the substance B, the substance E, the substance F, and the substance G is not particularly limited, and is, for example, a filamentous fungus belonging to the genus Gloeoporus. Preferred is Gloeoporus dichrous (Fr .: Fr.) Bres., More preferably, Gloeoporus dichrous SANK 30502 (hereinafter simply referred to as “SANK 30502”). It is. SANK 30502 strain was isolated from basidiospores of basidiomycete fruit bodies collected in Kanagawa Prefecture, June 1999.
[0036]
In order to observe the mycological properties of this bacterium, culturing was performed on each of the following media. The composition of each medium used is described below.
[0037]
(Potato Dextrose Agar: hereinafter referred to as “PDA”)
39 g of Nissui potato dextrose agar medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.)
5g agar
Distilled water 1000ml
(WSH medium)
Oatmeal 10g
Magnesium sulfate heptahydrate 1g
Potassium dihydrogen phosphate 1g
Sodium nitrate 1g
20g agar
Distilled water 1000ml
The display of the color tone is described in "Cornelap Onceture, Metune Handbook of Color, Third Edition, Airmetune, London, 1978" (Kornerup A, Wanscher JH (1978), Method Handbook of Color (3rd. Edition), London, England). Followed.
[0038]
The mycological properties of the SANK 30502 strain under culture are as follows.
[0039]
The growth on PDA is 25-27 mm at 23 ° C. for one week of culture. The fungi are fine powder, white to yellowish white (2A2). The back surface is pale yellow (2A3). The growth on WSH is 31-33 mm after 1 week of culture at 23 ° C. The fungi are short fluffy, white to pale yellow (4A3). The back surface is pale yellow (2A3). The aerial mycelium is 2-5 μm wide, thin and smooth, and has a faint connection to the septum. No smell or conidia.
[0040]
In order to identify the SANK 30502 strain, the mycological properties of the dried fruiting body specimens used for the isolation were observed. The bacteriological properties of the dried specimen are as follows.
[0041]
The fruiting body has a semicircular or shelf-shaped umbrella, and is worn on the lower part. The umbrella is 3 cm or less in width and 2 mm or less in thickness. The upper surface of the umbrella is densely covered with short hairs and is pale yellow (4A3). The meat is thin and white. The grain bed on the underside of the umbrella is tubular, glue-like when wet, and resin-like when dry, and is violet brown (11F5). The tube hole is 0.6 mm or less in length, and the hole has a circular shape with 7 to 9 holes per mm. The mycelium is of one hypha type. The original hyphae are 3 to 6 μm wide, have thick walls, and have a diagonal connection to the partition walls. The basin is 10 to 14 μm × 3 to 4 μm, has a club-like shape, has four petites, and has a lace connection at the base. Basidiospores are 3-4 μm × 1 μm, sausage-shaped, thin-walled, smooth, colorless, non-amyloid.
[0042]
The above mycological properties of the fungus are described in "Groeoporus diklaus" in "Ikuseki Rokuya and Hongo Tsuguo Edition, Primary Color Japanese New Fungi Encyclopedia (II), Hoikusha, Osaka, 1989". Was described. Therefore, the SANK 30502 strain was identified as Gloeoporus dichrous (Fro: Fr.) Bres.
[0043]
SANK 30502 was deposited as Gloeoporus diklaus SANK 30502 with the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan on February 27, 2003. Accession number FERM BP-8310.
[0044]
As is well known, fungi are liable to be mutated in nature or by artificial operations (for example, ultraviolet irradiation, irradiation, chemical treatment, etc.), and the same applies to the SANK 30502 strain of the present invention. The SANK 30502 strain mentioned in the present invention includes all the mutant strains.
[0045]
These mutants also include those obtained by genetic methods, for example, recombination, transduction, transformation and the like. That is, the SANK 30502 strain which produces all or at least one of the substance A, the substance B, the substance E, the substance F and the substance G, mutants thereof and strains which are not clearly distinguished therefrom are all included in the SANK 30502 strain. Is done. In addition, due to recombination, transduction, transduction, transformation, etc., the production amounts of the A substance, B substance, E substance, F substance and G substance are changed as compared with the unmutated strain, and the production ratio of each substance is reduced. All of the unusual mutants are included in the SANK 30502 strain.
[0046]
When the SANK 30502 strain is cultured to produce all or at least one of the F-16438A substance, the B substance, the E substance, the F substance, and the G substance, the culture is performed in a medium having a pH range of 4.0 to 6.5. Can do it.
[0047]
2. culture
The cultivation of these microorganisms to obtain all or at least one of substance A, substance B, substance E, substance F and substance G is carried out in a medium such as that used for producing other fermentation products. Can be done with Such a medium contains a carbon source, a nitrogen source and inorganic salts that can be assimilated by the microorganism. Culture can be performed by a known method such as liquid culture or solid culture. In the case of liquid culture, known methods such as batch culture or continuous culture can be appropriately selected and performed. In the case of solid culture, fusuma is used. Etc. can be used.
[0048]
In general, glucose, fructose, maltose, sucrose, mannylose, glycerin, dextrin, oats, rye, corn starch, potato, corn flour, cottonseed oil, molasses, citric acid, tartaric acid, etc. may be used alone or in combination. Can be used. Generally, the amount is varied from 1 to 10% by weight of the medium volume.
[0049]
As the nitrogen source, a substance containing a protein and its hydrolyzate or an inorganic salt is generally used in the fermentation step. Suitable nitrogen sources include soybean flour, bran, peanut flour, cottonseed oil, casein hydrolyzate, pharmamine, fish meal, corn steep liquor, peptone, meat extract, yeast, yeast extract, malt extract, sodium nitrate, ammonium nitrate, ammonium sulfate And so on. The nitrogen source is used alone or in combination in the range of 0.2 to 10% by weight of the medium volume.
[0050]
The nutrient inorganic salts to be taken into the medium are ordinary salts from which ions such as sodium, ammonium, calcium, phosphate, sulfate, chloride, and carbonate can be obtained. It also contains trace metals such as potassium, calcium, cobalt, manganese, iron and magnesium.
[0051]
In liquid culture, silicone oil, vegetable oil, surfactant and the like are used as an antifoaming agent. The pH of the medium for culturing the SANK 30502 strain and producing F-16438A substance, B substance, E substance, F substance and G substance can be changed to 4.0 to 6.5.
[0052]
The culture temperature is not particularly limited as long as a microorganism capable of producing all or at least one of substance A, substance B, substance E, substance F and substance G can grow, but when the SANK 30502 strain is used, the above culture conditions are used. The growth temperature is 10 ° C to 33 ° C, the range of 23 ° C to 30 ° C is good for growth, and the production of all or at least one of substance A, substance B, substance E, substance F and substance G Is preferably 23 ° C. to 27 ° C. All or at least one of the substance A, the substance B, the substance E, the substance F and the substance G can be obtained by aerobically culturing these microorganisms. A culture method, a shaking culture method, an aeration stirring culture method, or the like is used.
[0053]
In a small-scale culture, it is preferable to perform culture at 23 ° C. for several days. The culture is initiated in an Erlenmeyer flask by one or more stages of seed development. The seed culture flask is shake-cultured in a constant temperature incubator for several days or until it has grown sufficiently. The grown seed culture is used to inoculate part or all of the grown seed culture into the next stage seed or production medium. The flask containing the inoculated production medium is cultured with shaking at a constant temperature for several days, and after completion of the culture, the contents of the flask are separated by centrifugation or filtration.
[0054]
In the case of a large amount of culture, it is preferable to culture in a suitable tank equipped with a stirrer and aeration device. According to this method, the nutrient medium can be prepared in the tank. The nutrient medium is sterilized by heating to 121 ° C., and after cooling, the sterile medium is inoculated with a seed culture that has been grown in advance. Culture is performed at 23 ° C. with aeration and stirring. This method is suitable for obtaining large amounts of compounds.
[0055]
In order to know the time-dependent change in the production amount of all or at least one of the substance A, substance B, substance E, substance F and substance G produced in the course of the culture, for example, the culture solution is extracted with an equal volume of acetone. After distilling off acetone, the mixture was extracted with ethyl acetate under acidic conditions, concentrated, and dried to obtain a hyaluronic acid-CD44 binding inhibition test for the amounts of substance A, substance B, substance E, substance F and substance G, Alternatively, measurement is performed by high performance liquid chromatography. Usually, the production amount of all or at least one of the substance A, the substance B, the substance E, the substance F and the substance G reaches the maximum value in the culture for 250 hours to 350 hours.
[0056]
3. Recovery of substance A, substance B, substance E, substance F and substance G
The culture contains all or at least one of substance A, substance B, substance E, substance F and substance G. The culture may be a mixture of cells and medium during or after culturing, as long as all or at least one of substance A, substance B, substance E, substance F and substance G is contained. Any of a body, a medium, and a culture supernatant can be used. The amounts of the substance A, substance B, substance E, substance F and substance G contained in the culture and the ratio of each substance may vary depending on the culture conditions and the like.
[0057]
When liquid culture is performed, substances A, B, E, F, and G present in the liquid portion and the cells in the culture solution are separated from the cells and other solid portions by diatomaceous earth as a filter aid. To separate and purify the A substance, B substance, E substance, F substance and G substance present in the cells and their filtrate or supernatant by utilizing their physicochemical properties. Is obtained by
[0058]
For example, substance A, substance B, substance E, substance F and substance G can be prepared by using an organic solvent that does not mix the culture supernatant with water, for example, n-butanol, ethyl acetate, methylene chloride, etc., alone or in combination. The substance can be recovered and purified by extracting the substance, the B substance, the E substance, the F substance and the G substance.
[0059]
Substance A, substance B, substance E, substance F and substance G can be purified by activated carbon or Amberlite XAD-2 or XAD-4 (above manufactured by Rohm and Haas Co.) or a HP-10, HP-20, HP-50, CHP20P (all manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation) and the like can be used. The culture solution containing all or at least one of the substance A, the substance B, the substance E, the substance F and the substance G is passed through a layer of the adsorbent as described above to remove impurities by adsorbing the impurities, or After adsorbing, these substances can be recovered by elution using a mixed solvent of water and an organic solvent such as methanol water and acetone water. As the ion exchange resin, Dowex 50Wx4, Dowex 1x2, Dowex SBR-P (manufactured by Dow Chemical Company) or the like is used. A substance, a B substance, an E substance, a F substance and a G substance are passed through a layer of the above-mentioned ion exchange resin containing all or at least one of them to adsorb and remove impurities, or the A substance and the B substance , E substance, F substance and G substance are adsorbed and then eluted with hydrochloric acid or aqueous ammonia.
[0060]
All or at least one of the substance A, substance B, substance E, substance F and substance G thus obtained is further subjected to adsorption column chromatography using a carrier such as silica gel or florisil, Avicel (Asahi Kasei Corporation). It can be purified by distribution column chromatography using Sephadex LH-20 (manufactured by Pharmacia) or high-performance liquid chromatography using normal-phase and reverse-phase columns.
[0061]
The locations of the compounds A, B, E, F and G, which are the compounds of the present invention, in the purification can be determined by the following methods.
[0062]
(High performance liquid chromatography)
Separation column: Waters SYMMETRY C18 (φ4.6 × 150 mm)
Mobile phase: acetonitrile: 0.3% triethylamine phosphate buffer pH 3.0 = 3: 2
Flow rate: 1.0 ml / min
Detection wavelength: 210 nm
Retention time: A substance 3.6 minutes, B substance 4.8 minutes, E substance 7.5 minutes, F substance 8.5 minutes, G substance 11.4 minutes
4. Hyaluronic acid-CD44 binding inhibition test
The present inventors have found that substances A, B, E, F and G have an activity of inhibiting the binding of hyaluronic acid to CD44. The binding inhibition test between hyaluronic acid and CD44 (referred to as "hyaluronic acid-CD44 binding inhibition test") is the effect of substances A, B, E, F and G of the present invention on the binding between hyaluronic acid and CD44. Is not particularly limited as long as it can be examined, for example, as described in detail in (Test Example 1) below, fluorescent hyaluronic acid and test compounds (substances A, B, E , F substance and G substance) and measuring the specific adsorption amount of fluorescent hyaluronic acid to CD44.
[0063]
5. Action
The present inventors have found that substance A, substance B, substance E, substance F and substance G or a salt thereof have a hyaluronic acid-CD44 binding inhibitory activity. Therefore, the substance A, the substance B, the substance E, the substance F and the substance G or a salt thereof is effective for use as a prophylactic and / or therapeutic agent for osteoarthritis. The present invention particularly provides a preventive and / or therapeutic agent for osteoarthritis containing substance A or a salt thereof as an active ingredient, and a preventive and / or therapeutic agent for osteoarthritis containing substance B or a salt thereof as an active ingredient. A preventive and / or therapeutic agent for osteoarthritis containing a therapeutic agent, substance E or a salt thereof as an active ingredient, and a preventive and / or therapeutic agent for osteoarthritis containing substance F or a salt thereof as an active ingredient And a prophylactic and / or therapeutic agent for osteoarthritis comprising a substance G or a salt thereof as an active ingredient.
[0064]
Examples of the dosage form of the preventive and / or therapeutic agent for osteoarthritis include oral administration using tablets, capsules, granules, syrups and the like, injections (intravenous, intramuscular, subcutaneous), eye drops, Parenteral administration using suppositories and the like can be mentioned.
[0065]
When the compound of the present invention is used as a prophylactic or therapeutic agent for the above-mentioned diseases, the substance A, the substance B, the substance E, the substance F or the substance G, its salt or ester can be used by itself or an appropriate pharmacological agent Mixed with excipients, diluents, etc., and orally with tablets, capsules, granules, powders, syrups, etc., or injections, suppositories, patches, or external preparations Can be administered parenterally.
[0066]
These formulations include excipients (e.g., sugar derivatives such as lactose, sucrose, glucose, mannitol, sorbitol; starch derivatives such as corn starch, potato starch, alpha starch, dextrin; cellulose derivatives such as crystalline cellulose; Arabic gum; dextran; organic excipients such as pullulan; and silicate derivatives such as light anhydrous silicic acid, synthetic aluminum silicate, calcium silicate, magnesium metasilicate aluminate; phosphates such as calcium hydrogen phosphate; Inorganic excipients such as carbonates such as calcium; sulfates such as calcium sulfate; and lubricants (eg, metal stearate such as stearic acid, calcium stearate, magnesium stearate). Salt; talc; colloidal silica; beeswax; Boric acid; adipic acid; sulfates such as sodium sulfate; glycol; fumaric acid; sodium benzoate; DL leucine; lauryl sulfates such as sodium lauryl sulfate and magnesium lauryl sulfate; Silicic acids such as silicic acid hydrate; and the above-mentioned starch derivatives.), Binders (for example, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, macrogol, and the same as the above-mentioned excipients) And disintegrants (for example, cellulose derivatives such as low-substituted hydroxypropylcellulose, carboxymethylcellulose, carboxymethylcellulose calcium, and internally cross-linked sodium carboxymethylcellulose); Starch, celluloses such as sodium carboxymethyl starch, crosslinked polyvinylpyrrolidone, and emulsifiers (eg, colloidal clays such as bentonite and veegum); magnesium hydroxide, hydroxide Metal hydroxides such as aluminum; anionic surfactants such as sodium lauryl sulfate and calcium stearate; cationic surfactants such as benzalkonium chloride; and polyoxyethylene alkyl ethers and polyoxyethylene sorbitan fatty acids Esters, nonionic surfactants such as sucrose fatty acid esters, and stabilizers (paraoxybenzoic acid esters such as methylparaben and propylparaben; chlorobutanol, benzyl alcohol, phenylethyl) Alcohols such as alcohol; benzalkonium chloride; phenols, phenols such as cresol; thimerosal; dehydroacetic acid; and sorbic acid and the. ), Flavoring agents (for example, commonly used sweeteners, sour agents, flavors, etc.) and diluents can be used in a well-known method.
[0067]
As for the method of introducing the compound of the present invention into a patient, a colloid dispersion system can be used in addition to the above. The colloidal dispersion system is expected to have the effect of increasing the stability of the compound in vivo and the effect of efficiently transporting the compound to a specific organ, tissue or cell. Colloidal dispersions are not limited as long as they are commonly used, but are based on polymer complexes, nanocapsules, microspheres, beads, and lipids including oil-in-water emulsifiers, micelles, mixed micelles, and liposomes. Dispersed systems can be mentioned, and are preferably a plurality of liposomes and artificial membrane vesicles having an effect of efficiently transporting a compound to a specific organ, tissue or cell (Mannino et al., Biotechniques, 1988). , 6,682; Blume and Cevc, Biochem. Et Biophys. Acta, 1990, 1029, 91; Lappalainen et al., Anti-Viral Res., 1994, 23, 119; Chonn and Callis, Curente. , 1995, 6, 698).
0. 2-0. Unilamellar liposomes, with a size range of 4 μm, can encapsulate a significant proportion of the aqueous buffer containing macromolecules, and the compound is encapsidated in this aqueous inner membrane, and the biologically active form Transported to cells (Fraley et al., Trends Biochem. Sci., 1981, 6, 77). The composition of the liposome is usually a complex of a lipid, especially a phospholipid, especially a phospholipid having a high phase transition temperature, with one or more steroids, especially cholesterol. Examples of lipids useful for liposome production include phosphatidyl compounds such as phosphatidylglycerol, phosphatidylcholine, phosphatidylserine, sphingolipids, phosphatidylethanolamine, cerebroside and ganglioside. Particularly useful are diacylphosphatidylglycerols, wherein the lipid moiety contains 14-18 carbon atoms, especially 16-18 carbon atoms, and is saturated (with a double bond within the 14-18 carbon atom chain). Lack). Representative phospholipids include phosphatidylcholine, dipalmitoyl phosphatidylcholine, and distearoyl phosphatidylcholine.
[0068]
Targeting colloidal dispersions, including liposomes, may be either passive or active. Passive targeting is achieved by taking advantage of the liposome's natural tendency to distribute to cells of the reticuloendothelial system of organs containing sinusoidal capillaries. On the other hand, active targeting can be performed, for example, by using a protein coat of a virus (Morishita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1993, 90, 8474), a monoclonal antibody (or its like). Specific ligands such as sugars, glycolipids or proteins (or suitable oligopeptide fragments thereof) can be attached to liposomes or attached to organs and cell types other than the naturally occurring localization sites. Techniques for modifying the liposome by changing the composition of the liposome to achieve distribution can be mentioned. The surface of the targeted colloidal dispersion can be modified in various ways. In liposome-targeted delivery systems, lipid groups can be incorporated into the lipid bilayer of the liposome to maintain the target ligand in intimate association with the lipid bilayer. Various linking groups can be used to link the lipid chain to the targeting ligand. Target ligands that bind to specific cell surface molecules that are predominantly found on cells where delivery of the oligonucleotides of the invention are desired are, for example, (1) predominantly expressed by cells where delivery is desired Polyclonal or monoclonal antibodies that specifically bind to hormones, growth factors or suitable oligopeptide fragments thereof, or (2) antigenic epitopes predominantly found on target cells, which bind to specific cell receptors Or a suitable fragment thereof (eg, Fab; F (ab ') 2). Two or more bioactive agents (eg, a compound of general formula (I) or a salt thereof and another drug) can also be complexed and administered within a single liposome. Agents that increase the intracellular stability and / or targeting of the contents can also be added to the colloidal dispersion.
[0069]
The dosage varies depending on symptoms, age, etc., but in the case of oral administration, the lower limit is 1 mg (preferably 30 mg) and the upper limit is 2000 mg (preferably 1500 mg), and in the case of intravenous administration, It is desirable that the lower limit of 0.5 mg (preferably 5 mg) and the upper limit of 500 mg (preferably 250 mg) be administered to an adult 1 to 6 times per day depending on the symptoms.
[0070]
【Example】
Next, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, Test Examples and Formulation Examples, but the present invention is not limited thereto.
[0071]
(Example 1) Purification of substance A
(A) Culture
A 100 ml Erlenmeyer flask containing 30 ml of the medium represented by Medium Composition-1 was sterilized by heating at 121 ° C. for 20 minutes, and then cooled to 23 ° C. The Gloeoporus dichrous (Fr .: Fr.) Bres. SANK 30502 strain was scraped from the slant with a platinum loop, homogenized with 3 ml of sterile water, inoculated in its entirety, and rotated at 210 rpm using a rotary shaker. What was cultured at 23 ° C. for 168 hours was used as a pre-culture solution. Next, 80 ml of the medium represented by Medium Composition-2 was placed in two 500 ml Erlenmeyer flasks and sterilized by heating at 121 ° C. for 20 minutes. After cooling to 23 ° C., each Erlenmeyer flask was inoculated with 3 ml of the preculture liquid, and cultured at 210 rpm with shaking at 23 ° C. for 336 hours.
[0072]
[Medium composition-1]
Glucose 0.4%
Malt extract 1.0%
Yeast extract 0.4%
Agar 0.3%
Defoamer CB-442 0.005%
PH 5.5 before sterilization
[Medium composition-2]
Maltose 2.0%
Glucose 1.0%
Polypeptone 0.2%
Yeast extract 0.08%
Monopotassium phosphate 0.05%
Magnesium sulfate heptahydrate 0.1%
Ferric chloride hexahydrate 0.001%
Zinc sulfate heptahydrate 0.0002%
0.0055% calcium chloride
Defoamer CB-442 0.005%
No pH adjustment before sterilization
(B) Isolation
160 ml of acetone was added to 160 ml of the obtained culture solution for extraction. This was filtered using Celite 545 (manufactured by Johns Manville Product Corporation) as a filter aid to obtain 300 ml of an acetone extract. It was concentrated under reduced pressure to remove acetone, and the pH was adjusted to 3.0 with hydrochloric acid, followed by extraction with 150 ml of ethyl acetate. It was washed with saturated saline, dried over anhydrous sodium sulfate, filtered through filter paper, and concentrated to dryness under reduced pressure to obtain 209 mg of an extract containing Substance A, Substance B, Substance E, Substance F and Substance G. .
[0073]
This extract was then purified using a Cosmosil column (30 ml Cosmosil 140C18-OPN). A sample obtained by dissolving 209 mg of the extract in 3 ml of methanol and coating 2 g of Cosmosil was suspended in acetonitrile: 0.3% triethylamine phosphate buffer (pH 3.0 = 3: 7), and acetonitrile: 0.3% triethylamine phosphate buffer was previously prepared. It was overlaid on a Cosmosil column equilibrated at pH 3.0 = 3: 7. Acetonitrile: 0.3% triethylamine phosphate buffer, pH 3.0 = 2: 3, acetonitrile: 0.3% triethylamine phosphate buffer, pH 3.0 = 1: 1, stepwise eluted with 160 ml each, and 32 fractions of 10 ml each were obtained. (Fraction Nos. 1 to 32 in the order of fractionation.)
[0074]
Fraction No. containing substance A and substance B 19 and 20 were collected to obtain 20 ml of an active fraction. After concentration under reduced pressure to remove acetonitrile, the mixture was adjusted to pH 3.0 with hydrochloric acid and extracted with ethyl acetate. The extract was washed with saturated saline, dried over anhydrous sodium sulfate, filtered through a filter paper, and concentrated to dryness under reduced pressure to obtain 43.4 mg of a crude product containing Substance A and Substance B. This crude product was separated by an HPLC column (Waters SYMMETRY C18 φ19 × 100 mm). 0.3 ml of a sample solution obtained by dissolving 43.4 mg of the crude product in 0.9 ml of methanol was injected into an HPLC column previously equilibrated with 55% acetonitrile water-0.02% formic acid. % Formic acid as a solvent at a flow rate of 6 ml / min. The eluate was monitored at a detection wavelength of 210 nm, and a retention time of 10.3 to 12.0 minutes was sampled. The same operation was performed on the remaining sample solution (0.6 ml) to obtain an active fraction containing substance A. It was concentrated under reduced pressure to obtain 6.1 mg of a colorless powder of the substance A.
Substance A exhibited the following physicochemical properties.
1) Properties: colorless powder;
2) Solubility: soluble in methanol, acetone, ethyl acetate, pyridine;
3) Molecular formula: C₃₈H₆₂O₁₆;
4) Molecular weight: 774;
5) UV absorption spectrum: λmax nm (ε)
UV absorption spectra measured in methanol solution show absorption maxima at 207 (29700), 243 (sh, 4600), 306 (3900) nm;
6) Infrared absorption spectrum (KBr): νmax cm^-1
The infrared absorption spectrum measured by the KBr disk method is as follows:
3377, 2923, 2852, 1726, 1663, 1465, 1379, 1216, 1074, 1029;
7) 1H-nuclear magnetic resonance spectrum; δ (ppm)
The nuclear magnetic resonance spectrum (500 MHz) measured in a heavy pyridine solution (TMS internal standard) is as follows in FIG. 1 and the following signals were confirmed;
1.15-1.35 (22H, m), 1.29 (3H, d, 6 Hz), 1.29 (2H, m), 1.45 (1H, m), 1.63 (1H, m) ), 1.72 (2H, m), 2.62 (2H, t, 7.5 Hz), 3.92 (1H, m), 4.08 (1H, d, 9.0 Hz), 4.0. 21 (1H, m), 4.25 (2H, s), 4.29 (1H, m), 4.4 (1H, m), 4.56-4.61 (3H, m), 4.77 (1H, br.s), 4.88 (1H, d, 8.0 Hz), 5.16 (1H, d, 8.5 Hz), 5.2 (1H, m), 5.24 (1H , D, 8.5 Hz), 5.37 (1H, s), 6.85 (1H, d, 7.5 Hz) , 7.17 (1H, d, 8.5 Hz), 7.39 (1H, dd, 7.5 Hz, 8.0 Hz); 8) 13C-nuclear magnetic resonance spectrum; δ (ppm)
The nuclear magnetic resonance spectrum (125 MHz) measured in a heavy pyridine solution (TMS internal standard) was as shown in FIG. 2, and the following signals could be confirmed.
20.2, 24.2, 25.8, 29.7-29.9 (11 signals), 36.2, 42.3, 63.4, 63.8, 69.6, 70.4, 71. 2, 72.3 (2 signals), 73.6, 75.8, 78.7, 81.6, 102.4, 116.7, 122.9, 133.4, 139.6, 164.0, 174.8
9) High performance liquid chromatography
Separation column: Waters SYMMETRY C18 (φ4.6 × 150 mm)
Mobile phase: acetonitrile: 0.3% triethylamine phosphate buffer pH 3.0 = 3: 2
Flow rate: 1.0 ml / min
Detection wavelength: 210 nm
Retention time: 3.6 minutes.
[0075]
(Example 2) Purification of substance B
In the separation by HPLC described in Example 1, a retention time of 13.5 to 16.2 minutes was collected to obtain an active fraction containing substance B. After concentration under reduced pressure, 13.5 mg of a colorless powder of the substance B was obtained.
[0076]
Substance B exhibited the following physical properties.
1) Properties: colorless powder;
2) Solubility: soluble in methanol, acetone, ethyl acetate, pyridine;
3) Molecular formula: C₄₀H₆₄O₁₇;
4) Molecular weight: 816;
5) UV absorption spectrum: λmax nm (ε)
UV absorption spectrum measured in methanol solution shows absorption maxima at 208 (32000), 242 (sh, 4900), 306 (4300) nm;
6) Infrared absorption spectrum (KBr): νmax cm^-1
The infrared absorption spectrum measured by the KBr disk method is as follows.
3390, 2925, 2853, 1730, 1671, 1465, 1376, 1249, 1075, 1031;
7) 1H-nuclear magnetic resonance spectrum; δ (ppm)
The nuclear magnetic resonance spectrum (500 MHz) measured in a heavy pyridine solution (TMS internal standard) is as shown in FIG. 3 and the following signals were confirmed;
1.14 to 1.26 (22H, m), 1.31 (3H, d, 6.5 Hz), 1.31 (2H, m), 1.49 (1H, m), 1.64-1 .76 (3H, m), 2.10 (3H, s), 2.60 (2H, t, 7.5 Hz), 3.97 (1H, m), 4.21 (2H, s), 4 .24-4.34 (3H, m), 4.39 (1H, dd, 9.0 Hz, 9.5 Hz), 4.63 (2H, m), 4.77 (2H, s), 5 .16 (2H, s), 5.23 (1H, m), 5.60 (1H, s), 6.14 (1H, d, 3.5 Hz), 6.86 (1H, d, 7. 5 Hz), 7.16 (1H, d, 8.0 Hz), 7.40 (1H, t, 8.0 Hz) ;
8) 13C-nuclear magnetic resonance spectrum; δ (ppm)
The nuclear magnetic resonance spectrum (125 MHz) measured in a heavy pyridine solution (TMS internal standard) is as shown in FIG. 4 and the following signals were confirmed;
20.2, 21.3, 24.2, 25.8, 29.7-30.0 (11 signals), 36.3, 42.3, 63.2, 63.9, 69.6, 70. 4, 71.2, 72.2, 73.4 (2 signals), 73.7, 78.6, 80.4, 100.0, 116.7, 122.9, 133.7, 139.5. 163.8, 171.1, 174.6
9) High performance liquid chromatography
Separation column: Waters SYMMETRY C18 (φ4.6 × 150 mm)
Mobile phase: acetonitrile: 0.3% triethylamine phosphate buffer pH 3.0 = 3: 2
Flow rate: 1.0 ml / min
Detection wavelength: 210 nm
Retention time: 4.8 minutes.
[0077]
(Example 3) Purification of substance E
In the purification using the cosmosil column described in Example 1, the fraction No. containing substance E, substance F and substance G was used. 21 to No. 21. 23 were collected to obtain 30 ml of an active fraction. After concentrating under reduced pressure to remove acetonitrile, the pH was adjusted to 3.0 with hydrochloric acid and extracted with ethyl acetate. The extract was washed with saturated saline, dried over anhydrous sodium sulfate, filtered through filter paper, and concentrated to dryness under reduced pressure to obtain 82.4 mg of a crude product containing Substances E, F and G. This crude product was separated by an HPLC column (Waters SYMMETRY C18 φ19 × 100 mm). 0.2 ml of a sample solution obtained by dissolving 82.4 mg of the crude product in 1.0 ml methanol was injected into an HPLC column previously equilibrated with 60% acetonitrile water-0.02% formic acid. % Formic acid as a solvent at a flow rate of 6 ml / min. The eluate was monitored at a detection wavelength of 210 nm, and the retention time was collected from 13.5 to 15.0 minutes. The same operation was performed on the remaining 0.8 ml of the sample solution to obtain an active fraction containing substance E. It was concentrated under reduced pressure to obtain 21.9 mg of a colorless oily substance E.
[0078]
Substance E exhibited the following physicochemical properties.
1) Properties: colorless oil;
2) Solubility: soluble in chloroform, methanol, acetone, ethyl acetate;
3) Molecular formula: C₄₂H₆₆O₁₈;
4) Molecular weight: 858;
5) UV absorption spectrum: λmax nm (ε)
UV absorption spectra measured in methanol solution show absorption maxima at 208 (29900), 242 (4700), 306 (3900) nm;
6) Infrared absorption spectrum (thin film method): νmax cm^-1
The infrared absorption spectrum measured by the thin film method is as follows:
3418, 2927, 2855, 1738, 1672, 1465, 1375, 1231, 1075, 1032;
7) 1H-nuclear magnetic resonance spectrum; δ (ppm)
The nuclear magnetic resonance spectrum (500 MHz) measured in a heavy pyridine solution (TMS internal standard) is as shown in FIG. 5 and the following signals were confirmed;
1.19-1.26 (22H, m), 1.36 (3H, d, 5.0 Hz), 1.36 (1H, m), 1.51 (2H, m), 1.72 (3H , M), 1.82 (3H, s), 2.19 (3H, s), 2.60 (2H, t, 7.5 Hz), 3.95 (1H, m), 4.22 (2H , S), 4.22-4.35 (2H, m), 4.37-4.4 (2H, m), 4.47 (1H, d, 9.5 Hz), 4.61-4. 64 (2H, m), 4.8 (1H, m), 5.23 (1H, d, 9.5 Hz), 5.28 (1H, m), 5.58 (1H, s), 5.5. 69 (1H, d, 9.5 Hz), 6.13 (1H, d, 3.5 Hz), 6.86 (1H, d) 7.0 Hz), 7.16 (1H, d, 8.0 Hz), 7.40 (1H, dd, 7.5 Hz, 8.0 Hz)
8) 13C-nuclear magnetic resonance spectrum; δ (ppm)
The nuclear magnetic resonance spectrum (125 MHz) measured in a heavy pyridine solution (TMS internal standard) is as shown in FIG. 6, and the following signals were confirmed;
20.2 (2 signals), 21.3, 24.2, 25.7, 29.7-30.0 (11 signals), 36.3, 42.3, 48.6, 63.1, 63.1. 2, 69.6, 69.8, 70.4, 71.9, 73.5, 73.6, 74.0, 78.5, 79.0, 99.6, 115.3, 116.8, 123.0, 133.7, 139.6, 163.9, 170.3, 170.9, 171.1, 174.6
9) High performance liquid chromatography
Separation column: Waters SYMMETRY C18 (φ4.6 × 150 mm)
Mobile phase: acetonitrile: 0.3% triethylamine phosphate buffer pH 3.0 = 3: 2
Flow rate: 1.0 ml / min
Detection wavelength: 210 nm
Retention time: 7.5 minutes.
[0079]
(Example 4) Purification of substance F
In the separation by HPLC described in Example 3, a retention time of 15.6 to 17.1 minutes was collected to obtain an active fraction containing substance F. It was concentrated under reduced pressure to obtain 29.1 mg of a colorless oily substance F.
Substance F exhibited the following physicochemical properties:
1) Properties: colorless oil;
2) Solubility: soluble in chloroform, methanol, acetone, ethyl acetate;
3) Molecular formula: C₄₅H₆₈O₂₁;
4) Molecular weight: 944;
5) UV absorption spectrum: λmax nm (ε)
UV absorption spectrum measured in methanol solution shows absorption maxima at 208 (29400), 243 (sh, 4700), 307 (4200) nm;
6) Infrared absorption spectrum (thin film method): νmax cm^-1
The infrared absorption spectrum measured by the thin film method is as follows:
3421, 2926, 2855, 1741, 1673, 1465, 1375, 1228, 1071;
7) 1H-nuclear magnetic resonance spectrum; δ (ppm)
The nuclear magnetic resonance spectrum (500 MHz) measured in a heavy pyridine solution (TMS internal standard) is as shown in FIG. 7, and the following signals were confirmed;
1.16-1.32 (22H, m), 1.36 (3H, d, 6.0 Hz), 1.36 (1H, m), 1.49 (2H, m), 1.72 (3H , M), 1.79 (3H, s), 2.14 (3H, s), 2.61 (2H, t, 7.5 Hz), 3.78 (2H, s), 4.01 (1H). , M), 4.23 (2H, s), 4.23-4.28 (1H, m), 4.34-4.41 (3H, m), 4.60 (1H, d, 10.0) Hz), 4.77 (1H, m), 4.93 (1H, m), 5.11 (1H, d, 9.5 Hz), 5.28 (2H, m), 5.58 (1H, m) s), 5.66 (1H, d, 9.5 Hz), 6.25 (1H, s), 6.86 (1 H, d, 7.5 Hz), 7.17 (1H, d, 8.0 Hz), 7.40 (1H, dd, 7.5 Hz, 8.0 Hz);
8) 13C-nuclear magnetic resonance spectrum; δ (ppm)
The nuclear magnetic resonance spectrum (125 MHz) measured in a heavy pyridine solution (TMS internal standard) was as shown in FIG. 8 and the following signals were confirmed;
20.2 (2 signals), 21.2, 24.2, 25.7, 29.7-30.0 (11 signals), 36.3, 42.3, 42.8, 48.8, 63. 3, 66.6, 69.7, 69.8, 70.1, 72.0, 73.2, 73.6, 73.9, 76.0, 78.4, 99.7, 115.4. 116.8, 122.9, 133.6, 139.6, 163.9, 168.0, 170.0, 170.3, 170.8, 170.8, 174.6
9) High performance liquid chromatography
Separation column: Waters SYMMETRY C18 (φ4.6 × 150 mm)
Mobile phase: acetonitrile: 0.3% triethylamine phosphate buffer pH 3.0 = 3: 2
Flow rate: 1.0 ml / min
Detection wavelength: 210 nm
Retention time: 8.5 minutes.
[0080]
(Example 5) Purification of substance G
In the separation by HPLC described in Example 3, a retention time of 23.7 to 27.0 minutes was collected to obtain an active fraction containing substance G. It was concentrated under reduced pressure to obtain 2.8 mg of a colorless powder of the substance G.
[0081]
Substance G exhibited the following physicochemical properties.
1) Properties: colorless powder;
2) Solubility: soluble in methanol, acetone, ethyl acetate and pyridine. ;
3) Molecular formula: C₄₃H₆₆O₂₀;
4) Molecular weight: 902;
5) UV absorption spectrum: λmax nm (ε)
The ultraviolet absorption spectrum measured in a methanol solution shows an absorption maximum at 208 (29000), 241 (sh, 4500), and 305 (3200) nm.
6) Infrared absorption spectrum (KBr): νmax cm^-1
The infrared absorption spectrum measured by the KBr disk method is as follows:
3408, 2924, 2853, 1739, 1661, 1453, 1377, 1242, 1068;
7) 1H-nuclear magnetic resonance spectrum; δ (ppm)
The nuclear magnetic resonance spectrum (500 MHz) measured in a heavy pyridine solution (TMS internal standard) was as shown in FIG. 9 and the following signals were observed;
1.21-1.31 (20H, s), 1.36 (3H, d, 6.0 Hz), 1.36 (1H, m), 1.48 (4H, m), 1.71 (1H , M), 1.85 (2H, m), 1.88 (3H, s), 2.15 (3H, s), 3.31 (2H, t, 7.5 Hz), 3.78 (2H) , S), 4.01 (1H, m), 4.27 (1H, dd, 8.0 Hz, 10.5 Hz), 4.34-4.41 (3H, m), 4.60 (1H). , D, 9.5 Hz), 4.77 (1H, dd, 7.0 Hz, 11.5 Hz), 4.93 (1H, m), 5.21 (1H, d, 9.5 Hz) , 5.28 (2H, m), 5.58 (1H, s), 5.66 (1H, d, 0.0 Hz), 6.24 (1H, s), 6.91 (1H, d, 7.5 Hz), 7.14 (1H, d, 8.5 Hz), 7.39 (1H, dd) , 7.5 Hz, 8.0 Hz),
8) 13C-nuclear magnetic resonance spectrum; δ (ppm)
The nuclear magnetic resonance spectrum (125 MHz) measured in a heavy pyridine solution (TMS internal standard) is as shown in FIG. 10 and the following signals were observed;
20.2 (2 signals), 21.2, 25.7, 29.8-30.0 (10 signals), 30.3, 32.7, 36.2, 36.3, 42.8, 63. 3, 66.6, 69.7, 69.8, 70.1, 72.0, 73.2, 73.6, 73.9, 76.0, 78.5, 99.6, 115.5, 117.1, 121.8, 132.8, 146.4, 162.6, 168.0, 170.0, 170.3, 170.8 (2 signals), 175.0,
9) High performance liquid chromatography
Separation column: Waters SYMMETRY C18 (φ4.6 × 150 mm)
Mobile phase: acetonitrile: 0.3% triethylamine phosphate buffer pH 3.0 = 3: 2
Flow rate: 1.0 ml / min
Detection wavelength: 210 nm
Retention time: 11.4 minutes.
[0082]
(Test Example 1) Hyaluronic acid-CD44 binding inhibition test
The human CD44 cDNA was amplified by PCR using a human lymph node-derived cDNA library (TAKARA) as a template. The primers used for PCR are the 5 'side of the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 65 to 85 of the CD44 cDNA sequence (GenBank accession number: U40373: SEQ ID NO: 1 in the sequence listing) obtained from the database (GenBank). Primer 1 into which Sal I cleavage point and Kozac sequence (Nucleic Acids Research, vol. 15, p. 8125-8148, 1987) were introduced
Primer 2 having a 5′-AGCTAGGTCGACCACCATGGACAAGTTTTTGGTGGCAC-3 ′ (SEQ ID NO: 3 in the sequence listing) and a Hind III cleavage point introduced on the 5 ′ side of the complementary strand of the nucleotide sequence shown in nucleotide numbers 1130 to 1150 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing :
5'-AGCTAGAAGCTTACACCCCAATCTTCATGTC-3 '(SEQ ID NO: 4 in the sequence listing) was used. The PCR amplification product was digested with restriction enzymes Sal I (TAKARA) and Hind III (TAKARA), and this fragment was incorporated into an expression vector, pRK5 (Pharmingen). This was introduced into a human kidney epithelial cell line HEK293 (CRL-1573, American Type Culture Collection) cultured in a collagen-coated Petri dish using a DMEM medium (Invitrogen) containing 10% fetal bovine serum together with pSV2neo (Invitrogen) by the calcium phosphate method. Then, transfected cells were selected with the antibiotic G418 (500 μg / ml). CD44 expression was confirmed by general Western blotting using an anti-human CD44 monoclonal antibody (Biomeda). After culturing the CD44-expressing cells for 4 days, the cells are washed with a calcium ion-free and magnesium ion-free Dulbecco's phosphate buffer (hereinafter, referred to as PBS), and peeled from a Petri dish with PBS containing 2 mM disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA). did. After collecting the cells by centrifugation (1800 × g, 5 minutes), the cells were washed twice with 50 mM Tris-HCl buffer pH 7.8 containing 0.2 M sodium chloride (hereinafter referred to as buffer A). The cells were suspended again in buffer A, disrupted by sonication for 2 minutes, and then centrifuged at 400 × g for 10 minutes. The supernatant was centrifuged at 20,000 × g for 1 hour, and the precipitate was washed once with buffer A, and then subjected to ultrasonic treatment in buffer A to homogenize the suspension to obtain a CD44-expressing cell membrane suspension.
[0083]
Fluorescent hyaluronic acid was prepared as follows, with minor modifications to the method of Werder et al. (Carbohydrate Research, Vol. 44, pp. 251-257, 1975). 50 mg of sodium hyaluronate (Seikagaku Corporation, derived from cockscomb, molecular weight 7.1 × 10⁵) Was dissolved in 40 ml of distilled water, and mixed with 20 ml of dimethyl sulfoxide (hereinafter, DMSO). To this mixture was added fluoresceinamine-isotype I (25 mg, Aldrich) dissolved in DMSO (0.5 ml) containing acetaldehyde (25 μl, Fluka) and cyclohexyl isocyanide (25 μl, Fluka). After stirring at room temperature (about 25 ° C.) for 5 hours, the mixture was poured into 240 ml of sodium chloride-saturated ethanol, and the precipitated fluorescent hyaluronic acid was collected by centrifugation (1000 × g, 15 minutes). This was dissolved in 60 ml of distilled water, precipitated with 240 ml of sodium chloride-saturated ethanol, and the operation of collecting was repeated twice. After that, it was dissolved in 10 ml of distilled water, desalted by dialysis, and combined with a fluorescent hyaluronic acid solution. did.
The above CD44-expressing cell membrane suspension (200 μg / ml in protein concentration) was dispensed into a 96-well glass fiber filter black plate (Unifilter, hydrophobic GF / C membrane, Whatman) in an amount of 100 μl per well, and methanol was added thereto. After 1 μl of the test compound dissolved in the above was added, 0.2 μg of fluorescent hyaluronic acid was further added. After incubating for 1 hour at room temperature, the liquid was suction filtered using a multiscreen (MILLIPORE). To this, 250 μl of buffer A was added per well, and the operation of suction filtration was repeated six times to wash the cell membrane adsorbed on the filter. After washing, 100 μl of 0.3 N sodium hydroxide was added to one well, and 535 nm of light emitted by excitation light of 485 nm was measured with Arbo (Amersham-Pharmacia) to detect the amount of fluorescent hyaluronic acid bound to the CD44-expressing cell membrane. did. Nonspecific binding of fluorescent hyaluronic acid was detected by adding an excess of unlabeled hyaluronic acid (final concentration 200 μg / ml). The difference between the total binding and the non-specific binding of the fluorescent hyaluronic acid was defined as specific binding, and the inhibition rate (%) for the specific binding was calculated. Table 1 shows the average values of the inhibition rates (%) when F-16438A substance, B substance, E substance, F substance and G substance were added at final concentrations of 50, 25, 12.5 and 6.25 μg / ml, respectively. And standard deviation. Substances F-16438A, B, E, F and G markedly inhibit the binding between hyaluronic acid and CD44,₅₀The values were 8.0, 11.0, 23.4, 11.3, and 11.7 μg / ml, respectively (Table 1).
[0084]
[Table 1]

[0085]
(Formulation example)
(Formulation Example 1) Soft capsule
A mixture of the substance A obtained in Example 1 in a digestible oil, for example soybean oil, cottonseed oil or olive oil, is prepared and injected into gelatin with a positive displacement pump and contains 100 mg of active ingredient. Soft capsules are obtained, washed and dried. Similarly, a soft capsule containing 100 mg of the substance B obtained in Example 2, the substance E obtained in Example 3, the substance F obtained in Example 4, and the substance G obtained in Example 5 as active ingredients. Get.
[0086]
(Formulation Example 2) Tablet
In a conventional manner, 100 mg of substance A obtained in Example 1, 0.2 mg of colloidal silicon dioxide, 5 mg of magnesium stearate, 275 mg of microcrystalline cellulose, 11 mg of starch and 98.8 Produced using mg lactose. In addition, the skin was applied as required. Similarly, a tablet containing 100 mg of the substance B obtained in Example 2, the substance E obtained in Example 3, the substance F obtained in Example 4, and the substance G obtained in Example 5 as active ingredients is prepared. To manufacture.
[0087]
(Formulation Example 3) Suspension
In 5 ml, 100 mg of the substance A obtained in Example 1, 100 mg of sodium carboxy group methylcellulose, 5 mg of sodium benzoate, 1.0 g of sorbitol solution (Japanese Pharmacopoeia) and 0. Produced to contain 025 ml vanillin. Similarly, a suspension containing the substance B obtained in Example 2, the substance E obtained in Example 3, the substance F obtained in Example 4, and the substance G obtained in Example 5 was produced. I do.
(Formulation Example 4) Injection
It is manufactured by stirring 1.5% by weight of the substance A obtained in Example 1 in 10% by volume of propylene glycol, then making up to a constant volume with water for injection and sterilizing. Similarly, an injection containing the substance B obtained in Example 2, the substance E obtained in Example 3, the substance F obtained in Example 4, and the substance G obtained in Example 5 is produced.
[0088]
【The invention's effect】
According to the present invention, novel microorganisms Gloeoporus diklaus that produce novel compounds F-16438A, B, E, and F, and F-16438A, B, E, F, and G dichrous (Fr .: Fr.) Bres.) SANK 30502 strain was provided, and F-16438A substance, B substance, and E substance using Gloeoporus dichrous (Fr .: Fr.) Bres. And methods for producing F and G substances. Further, they have found that F-16438A substance, B substance, E substance, F substance and G substance and substance G have an activity of remarkably inhibiting the binding between hyaluronic acid and CD44, and found that F-16438A substance, B substance, A prophylactic and / or therapeutic agent for osteoarthritis, comprising as an active ingredient at least one of substance E, substance F and substance G or a salt thereof is provided.
[0089]
[Sequence List Free Text]
SEQ ID NO: 3: PCR sense primer for CD44
SEQ ID NO: 4: PCR antisense primer for CD44
[0090]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1. Substance A¹The figure which shows a H nuclear magnetic resonance spectrum.
FIG. 2. Substance A^ThirteenThe figure which shows a C nuclear magnetic resonance spectrum.
FIG. 3 of substance B¹The figure which shows a 1 H nuclear magnetic resonance spectrum.
FIG. 4 of substance B^ThirteenThe figure which shows a C nuclear magnetic resonance spectrum.
FIG. 5.¹The figure which shows a H nuclear magnetic resonance spectrum.
FIG. 6.^ThirteenThe figure which shows a C nuclear magnetic resonance spectrum.
FIG. 7.¹The figure which shows a 1 H nuclear magnetic resonance spectrum.
FIG. 8: Substance F^ThirteenThe figure which shows a C nuclear magnetic resonance spectrum.
FIG. 9¹The figure which shows a H nuclear magnetic resonance spectrum.
FIG. 10^ThirteenThe figure which shows a C nuclear magnetic resonance spectrum.

Claims (23)

The following formula (I)

(Wherein, R ₁ represents a hydrogen atom or an acetyl group, R ₂ represents a hydrogen atom or a malonyl group, and R ₃ represents a hydrogen atom or an acetyl group) or a salt thereof. The compound of the formula (I) according to claim 1, wherein R ₁ , R ₂ and R ₃ are hydrogen atoms, or a salt thereof. The compound of the formula (I) according to claim 1, wherein R ₁ is an acetyl group and R ₂ and R ₃ are hydrogen atoms, or a salt thereof. The compound of the formula (I) according to claim 1, wherein R ₁ and R ₃ are acetyl groups and R ₂ is a hydrogen atom, or a salt thereof. The compound of the formula (I) according to claim 1, wherein R ₁ and R ₃ are an acetyl group and R ₂ is a malonyl group, or a salt thereof. Compounds having the following physicochemical properties or salts thereof:
1) Properties: colorless powder;
2) Solubility: soluble in methanol, acetone, ethyl acetate, pyridine;
3) Molecular formula: C ₃₈ H ₆₂ O ₁₆ ;
4) Molecular weight: 774;
5) UV absorption spectrum: λmax nm (ε)
UV absorption spectra measured in methanol solution show absorption maxima at 207 (29700), 243 (sh, 4600), 306 (3900) nm;
6) Infrared absorption spectrum (KBr): νmax cm ^-1
The infrared absorption spectrum measured by the KBr disk method is as follows:
3377, 2923, 2852, 1726, 1663, 1465, 1379, 1216, 1074, 1029;
7) 1H-nuclear magnetic resonance spectrum; δ (ppm)
The nuclear magnetic resonance spectrum (500 MHz) measured in a heavy pyridine solution (TMS internal standard) is as follows:
1.15-1.35 (22H, m), 1.29 (3H, d, 6 Hz), 1.29 (2H, m), 1.45 (1H, m), 1.63 (1H, m) ), 1.72 (2H, m), 2.62 (2H, t, 7.5 Hz), 3.92 (1H, m), 4.08 (1H, d, 9.0 Hz), 4.0. 21 (1H, m), 4.25 (2H, s), 4.29 (1H, m), 4.4 (1H, m), 4.56-4.61 (3H, m), 4.77 (1H, br.s), 4.88 (1H, d, 8.0 Hz), 5.16 (1H, d, 8.5 Hz), 5.2 (1H, m), 5.24 (1H , D, 8.5 Hz), 5.37 (1H, s), 6.85 (1H, d, 7.5 Hz), 7.17 (1H, d, 8.5 Hz), 7.39 ( H, dd, 7.5 Hz, 8.0 Hz);
8) 13C-nuclear magnetic resonance spectrum; δ (ppm)
The nuclear magnetic resonance spectrum (125 MHz) measured in a heavy pyridine solution (TMS internal standard) is as follows: 20.2, 24.2, 25.8, 29.7-29.9 (11 signals), 36.2, 42.3, 63.4, 63.8, 69.6, 70.4, 71.2, 72.3 (2 signals), 73.6, 75.8, 78.7, 81. 6, 102.4, 116.7, 122.9, 133.4, 139.6, 164.0, 174.8.
9) High performance liquid chromatography separation column: Waters SYMMETRY C18 (φ4.6 × 150 mm)
Mobile phase: acetonitrile: 0.3% triethylamine phosphate buffer pH 3.0 = 3: 2
Flow rate: 1.0 ml / min Detection wavelength: 210 nm
Retention time: 3.6 minutes. Compounds having the following physicochemical properties or salts thereof:
1) Properties: colorless powder;
2) Solubility: soluble in methanol, acetone, ethyl acetate, pyridine;
3) Molecular formula: C ₄₀ H ₆₄ O ₁₇ ;
4) Molecular weight: 816;
5) UV absorption spectrum: λmax nm (ε)
UV absorption spectrum measured in methanol solution shows absorption maxima at 208 (32000), 242 (sh, 4900), 306 (4300) nm;
6) Infrared absorption spectrum (KBr): νmax cm ^-1
The infrared absorption spectrum measured by the KBr disk method is as follows: 3390, 2925, 2853, 1730, 1671, 1465, 1376, 1249, 1075, 1031;
7) 1H-nuclear magnetic resonance spectrum; δ (ppm)
The nuclear magnetic resonance spectrum (500 MHz) measured in a heavy pyridine solution (TMS internal standard) is as follows:
1.14 to 1.26 (22H, m), 1.31 (3H, d, 6.5 Hz), 1.31 (2H, m), 1.49 (1H, m), 1.64-1 .76 (3H, m), 2.10 (3H, s), 2.60 (2H, t, 7.5 Hz), 3.97 (1H, m), 4.21 (2H, s), 4 .24-4.34 (3H, m), 4.39 (1H, dd, 9.0 Hz, 9.5 Hz), 4.63 (2H, m), 4.77 (2H, s), 5 .16 (2H, s), 5.23 (1H, m), 5.60 (1H, s), 6.14 (1H, d, 3.5 Hz), 6.86 (1H, d, 7. 5 Hz), 7.16 (1H, d, 8.0 Hz), 7.40 (1H, t, 8.0 Hz);
8) 13C-nuclear magnetic resonance spectrum; δ (ppm)
The nuclear magnetic resonance spectrum (125 MHz) measured in a heavy pyridine solution (TMS internal standard) is as follows:
20.2, 21.3, 24.2, 25.8, 29.7-30.0 (11 signals), 36.3, 42.3, 63.2, 63.9, 69.6, 70. 4, 71.2, 72.2, 73.4 (2 signals), 73.7, 78.6, 80.4, 100.0, 116.7, 122.9, 133.7, 139.5. 163.8, 171.1, 174.69) High performance liquid chromatography separation column: Waters SYMMETRY C18 (φ4.6 × 150 mm)
Mobile phase: acetonitrile: 0.3% triethylamine phosphate buffer pH 3.0 = 3: 2
Flow rate: 1.0 ml / min Detection wavelength: 210 nm
Retention time: 4.8 minutes. Compounds having the following physicochemical properties or salts thereof:
1) Properties: colorless oil;
2) Solubility: soluble in chloroform, methanol, acetone, ethyl acetate;
3) Molecular formula: C ₄₂ H ₆₆ O ₁₈ ;
4) Molecular weight: 858;
5) UV absorption spectrum: λmax nm (ε)
UV absorption spectra measured in methanol solution show absorption maxima at 208 (29900), 242 (4700), 306 (3900) nm;
6) Infrared absorption spectrum (thin film method): νmax cm ^-1
The infrared absorption spectrum measured by the thin film method is as follows:
3418, 2927, 2855, 1738, 1672, 1465, 1375, 1231, 1075, 1032;
7) 1H-nuclear magnetic resonance spectrum; δ (ppm)
The nuclear magnetic resonance spectrum (500 MHz) measured in a heavy pyridine solution (TMS internal standard) is as follows:
1.19-1.26 (22H, m), 1.36 (3H, d, 5.0 Hz), 1.36 (1H, m), 1.51 (2H, m), 1.72 (3H , M), 1.82 (3H, s), 2.19 (3H, s), 2.60 (2H, t, 7.5 Hz), 3.95 (1H, m), 4.22 (2H , S), 4.22-4.35 (2H, m), 4.37-4.4 (2H, m), 4.47 (1H, d, 9.5 Hz), 4.61-4. 64 (2H, m), 4.8 (1H, m), 5.23 (1H, d, 9.5 Hz), 5.28 (1H, m), 5.58 (1H, s), 5.5. 69 (1H, d, 9.5 Hz), 6.13 (1H, d, 3.5 Hz), 6.86 (1H, d, 7.0 Hz), 7.16 (1H, d, 8. 5 Hz). 0 H ), 7.40 (1H, dd, 7.5 Hz, 8.0 Hz)
8) 13C-nuclear magnetic resonance spectrum; δ (ppm)
The nuclear magnetic resonance spectrum (125 MHz) measured in a heavy pyridine solution (TMS internal standard) is as follows:
20.2 (2 signals), 21.3, 24.2, 25.7, 29.7-30.0 (11 signals), 36.3, 42.3, 48.6, 63.1, 63.1. 2, 69.6, 69.8, 70.4, 71.9, 73.5, 73.6, 74.0, 78.5, 79.0, 99.6, 115.3, 116.8, 123.0, 133.7, 139.6, 163.9, 170.3, 170.9, 171.1, 174.6
9) High performance liquid chromatography separation column: Waters SYMMETRY C18 (φ4.6 × 150 mm)
Mobile phase: acetonitrile: 0.3% triethylamine phosphate buffer pH 3.0 = 3: 2
Flow rate: 1.0 ml / min Detection wavelength: 210 nm
Retention time: 7.5 minutes. Compounds having the following physicochemical properties or salts thereof:
1) Properties: colorless oil;
2) Solubility: soluble in chloroform, methanol, acetone, ethyl acetate;
3) Molecular formula: C ₄₅ H ₆₈ O ₂₁ ;
4) Molecular weight: 944;
5) UV absorption spectrum: λmax nm (ε)
UV absorption spectrum measured in methanol solution shows absorption maxima at 208 (29400), 243 (sh, 4700), 307 (4200) nm;
6) Infrared absorption spectrum (thin film method): νmax cm ^-1
The infrared absorption spectrum measured by the thin film method is as follows:
3421, 2926, 2855, 1741, 1673, 1465, 1375, 1228, 1071;
7) 1H-nuclear magnetic resonance spectrum; δ (ppm)
The nuclear magnetic resonance spectrum (500 MHz) measured in a heavy pyridine solution (TMS internal standard) is as follows:
1.16-1.32 (22H, m), 1.36 (3H, d, 6.0 Hz), 1.36 (1H, m), 1.49 (2H, m), 1.72 (3H , M), 1.79 (3H, s), 2.14 (3H, s), 2.61 (2H, t, 7.5 Hz), 3.78 (2H, s), 4.01 (1H). , M), 4.23 (2H, s), 4.23-4.28 (1H, m), 4.34-4.41 (3H, m), 4.60 (1H, d, 10.0) Hz), 4.77 (1H, m), 4.93 (1H, m), 5.11 (1H, d, 9.5 Hz), 5.28 (2H, m), 5.58 (1H, m) s), 5.66 (1H, d, 9.5 Hz), 6.25 (1H, s), 6.86 (1H, d, 7.5 Hz), 7.17 (1H, d, 8) 0 Hz), 7.40 (1H, dd, 7.5 Hz, 8.0 Hz);
8) 13C-nuclear magnetic resonance spectrum; δ (ppm)
The nuclear magnetic resonance spectrum (125 MHz) measured in a heavy pyridine solution (TMS internal standard) is as follows:
20.2 (2 signals), 21.2, 24.2, 25.7, 29.7-30.0 (11 signals), 36.3, 42.3, 42.8, 48.8, 63. 3, 66.6, 69.7, 69.8, 70.1, 72.0, 73.2, 73.6, 73.9, 76.0, 78.4, 99.7, 115.4. 116.8, 122.9, 133.6, 139.6, 163.9, 168.0, 170.0, 170.3, 170.8, 170.8, 174.6
9) High performance liquid chromatography separation column: Waters SYMMETRY C18 (φ4.6 × 150 mm)
Mobile phase: acetonitrile: 0.3% triethylamine phosphate buffer pH 3.0 = 3: 2
Flow rate: 1.0 ml / min Detection wavelength: 210 nm
Retention time: 8.5 minutes. A bacterium which belongs to the genus Gloeoporus and has the ability to produce the compound according to claims 2 to 9 and at least one compound selected from the group consisting of the following compounds 1) and 2) is cultured. Recovering, from the culture, at least one compound selected from the group consisting of the compounds according to claims 2 to 9 and the following compounds 1) and 2). And a method for producing at least one compound selected from the group consisting of the compounds described in 1) and 2) below:
1) A compound represented by the following formula (II) (hereinafter, referred to as “compound G1”) or a salt thereof

(In the formula, Ac represents an acetyl group (COCH ₃ ).)
2) A compound having the following physicochemical properties (hereinafter, referred to as "compound G2") or a salt thereof (1) Properties: colorless powder;
(2) Solubility: soluble in methanol, acetone, ethyl acetate and pyridine. ;
(3) Molecular formula: C ₄₃ H ₆₆ O ₂₀ ;
(4) Molecular weight: 902;
(5) UV absorption spectrum: λmax nm (ε)
The ultraviolet absorption spectrum measured in a methanol solution shows an absorption maximum at 208 (29000), 241 (sh, 4500), and 305 (3200) nm.
(6) Infrared absorption spectrum (KBr): νmax cm ^-1
The infrared absorption spectrum measured by the KBr disk method is as follows:
3408, 2924, 2853, 1739, 1661, 1453, 1377, 1242, 1068;
{Circle around (7)} 1H-nuclear magnetic resonance spectrum; δ (ppm)
The nuclear magnetic resonance spectrum (500 MHz) measured in a heavy pyridine solution (TMS internal standard) is as follows:
1.21-1.31 (20H, s), 1.36 (3H, d, 6.0 Hz), 1.36 (1H, m), 1.48 (4H, m), 1.71 (1H) , M), 1.85 (2H, m), 1.88 (3H, s), 2.15 (3H, s), 3.31 (2H, t, 7.5 Hz), 3.78 (2H) , S), 4.01 (1H, m), 4.27 (1H, dd, 8.0 Hz, 10.5 Hz), 4.34-4.41 (3H, m), 4.60 (1H , D, 9.5 Hz), 4.77 (1H, dd, 7.0 Hz, 11.5 Hz), 4.93 (1H, m), 5.21 (1H, d, 9.5 Hz) , 5.28 (2H, m), 5.58 (1H, s), 5.66 (1H, d, 10.0 Hz), 6.24 (1H, s), 6.91 ( 1H, d, 7.5 Hz), 7.14 (1H, d, 8.5 Hz), 7.39 (1H, dd, 7.5 Hz, 8.0 Hz),
(8) 13C-nuclear magnetic resonance spectrum; δ (ppm)
The nuclear magnetic resonance spectrum (125 MHz) measured in a heavy pyridine solution (TMS internal standard) is as follows:
20.2 (2 signals), 21.2, 25.7, 29.8-30.0 (10 signals), 30.3, 32.7, 36.2, 36.3, 42.8, 63. 3, 66.6, 69.7, 69.8, 70.1, 72.0, 73.2, 73.6, 73.9, 76.0, 78.5, 99.6, 115.5, 117.1, 121.8, 132.8, 146.4, 162.6, 168.0, 170.0, 170.3, 170.8 (2 signals), 175.0,
(9) High performance liquid chromatography separation column: Waters SYMMETRY C18 (4.6 x 150 mm)
Mobile phase: acetonitrile: 0.3% triethylamine phosphate buffer pH 3.0 = 3: 2
Flow rate: 1.0 ml / min Detection wavelength: 210 nm
Retention time: 11.4 minutes. The method according to claim 10, wherein the compound is the compound according to claim 2. The method according to claim 10, wherein the compound is the compound according to claim 3. The method according to claim 10, wherein the compound is the compound according to claim 4. The method according to claim 10, wherein the compound is the compound according to claim 5. The method according to claim 10, wherein the compound is compound G1. The method according to any one of claims 10 to 15, wherein the bacterium belonging to the genus Gloeoporus is Gloeoporus dichrous. The method according to any one of claims 10 to 15, wherein the bacterium belonging to the genus Gloeoporus is Gloeoporus dichrous (Fr .: Fr.) Bres. The method according to any one of claims 10 to 15, wherein the bacterium belonging to the genus Gloeoporus is Gloeoporus dichrous (Fr .: Fr.) Bres. SANK 30502 strain. Method. Gloeoporus dichrous (Fr .: Fr.) Bres. SANK 30502 strain. A medicament comprising at least one compound selected from the group of compounds according to claims 2 to 9 or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient. A prophylactic agent for osteoarthritis, comprising as an active ingredient at least one compound selected from the group consisting of the compounds according to claims 2 to 9, a compound G1 and a compound G2, or a pharmacologically acceptable salt thereof, and / or Or therapeutic drugs: A prophylactic agent for osteoarthritis, comprising as an active ingredient the compound according to any one of claims 2 to 9, and any one compound selected from the group consisting of compound G1 and compound G2 or a pharmacologically acceptable salt thereof. And / or therapeutic agents. 10. A binding inhibitor between hyaluronic acid and CD44, comprising the compound according to claims 2 to 9, and at least one compound selected from the group consisting of compound G1 and compound G2, or a salt thereof.

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