JP2004271330A

JP2004271330A - Extracellular potential measuring device and its manufacturing method

Info

Publication number: JP2004271330A
Application number: JP2003062228A
Authority: JP
Inventors: Masaya Nakatani; 将也中谷; Hiroaki Oka; 弘章岡; Fumiaki Emoto; 文昭江本
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Holdings Corp
Priority date: 2003-03-07
Filing date: 2003-03-07
Publication date: 2004-09-30
Anticipated expiration: 2023-03-07
Also published as: CN1697969A; JP3925439B2; CN100462717C

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To solve such a problem that it is difficult to easily determine whether or not body cells to be tested are surely fixed in dimples used for holding the body cells to be tested in conventional extracellular potential measuring devices. <P>SOLUTION: A diaphragm 2 is disposed on one surface of a substrate 1, and a dimple 3 composed of at least one curved surface is formed on any of surfaces making up the diaphragm 2, and a through hole 4 is formed at a section upper than the deepest section of the dimple 3, and a detection electrode 5 is disposed at an aperture of the through hole 4 on the opposite side of the dimple 3. Therefore, an extracellular potential measuring device which can effectively measure ion concentration of culture fluid in the through hole 4, can be realized. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は細胞外電位あるいは細胞の活動に発生する物理化学的変化を測定するために用いられる細胞外電位測定デバイスおよびその製造方法であり、例えば化学物質によって細胞が発する反応を検出する薬品スクリーニングに用いられる。
【０００２】
【従来の技術】
従来、細胞の電気的活動を指標にして薬品をスクリーニングすることはパッチクランプ法、蛍光色素または発光指示薬を用いる方法により行われている。
【０００３】
このパッチクランプ法はマイクロピペットの先端部分に付けた細胞膜の微小部分（パッチと呼ぶ）を用いて、単一のチャネルタンパク質分子を介するイオンの輸送を微小電極プローブによって電気的に記録する方法であり、この方法は一個のタンパク質分子の機能をリアルタイムで調べることのできる数少ない方法の一つである（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
また、特定のイオンの濃度変化に応じて光を発する蛍光色素または発光指示薬により、細胞内のイオンの移動をモニタすることで細胞の電気的活動を測定する方法もある。
【０００５】
しかし、パッチクランプ法はマイクロピペットの作成および操作に特殊な技術を必要とし、一つの試料の測定に多くの時間を要することから大量の薬品候補化合物を高速でスクリーニングする用途には適していない。
【０００６】
また、蛍光色素などを利用する方法は大量の薬品候補化合物を高速でスクリーニングすることができる。しかしながら細胞を染色する工程が必要になるとともに、用いる色素の影響により測定時に検出されるバックグラウンド・レベルが高くなってしまったり、時間とともにこの色素が脱色するためにＳ／Ｎ比が悪くなるという欠点がある。
【０００７】
これに代わる方法として、細胞の保持手段を有した基板およびこれに設けられた電極によって細胞外電位を測定するデバイスも発明者らのグループにより提案されている（例えば、特許文献１参照）。この方法はパッチクランプ法で得られるデータと同等の高品質なデータが得られ、しかも蛍光色素を用いる方法のように簡易に高速で大量の試料を測定できるものであり、基板上に設けられた細胞の保持手段を有する少なくとも一つのウエルと、このウエルに電気信号を検出するセンサー手段とを有する細胞外電位あるいは細胞が発する物理化学的変化を測定するものである。
【０００８】
上記特許文献１で開示される細胞外電位測定デバイスの動作について図面を用いて詳細に説明する。
【０００９】
図２４は上記特許文献１で開示される細胞外電位測定デバイスのウエル構造を模式断面図で示したものであり、ウエル４０内に培養液４８が入れられ、被験体細胞４７は基板４２に設けられた細胞保持手段によって捕捉または保持されている。細胞保持手段は基板４２に形成された窪み４１および開口部を介して、この窪み４１に連絡する貫通孔４４を備えた構成となっている。
【００１０】
さらに、貫通孔４４の中にはセンサー手段である測定電極４５が配置されており、この測定電極４５は配線を経て信号検出部に連結されている。
【００１１】
そして、測定の際には被験体細胞４７を貫通孔４４側から吸引ポンプなどの手段により、この被験体細胞４７が窪み４１部分に密着保持される。このようにして被験体細胞４７の活動により発生する電気信号はウエル４０中の培養液４８側に漏れることなく、貫通孔４４側に設けた測定電極４５によって検出される。
【００１２】
ここで、被験体細胞４７を保持する窪み４１の大きさは１０〜３０μｍ程度であり、貫通孔４４側の大きさが１〜５μｍと２段階にする必要がある。この形状を正確に実現するためには２種類のマスクを用いる必要があり、第一のマスクによりドライエッチングを行って窪み４１を形成した後、第二のマスクによってドライエッチングを行って貫通孔４４を形成する必要があった。
【００１３】
【非特許文献１】
「細胞の分子生物学、第三版」、ＧａｒｌａｎｄＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＩｎｃ．、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９９４、日本語版、中村桂子ら監訳、１８１〜１８２頁、１９９５年、教育社
【特許文献１】
ＷＯ０２／０５５６５３号公報
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記のような細胞外電位測定デバイスにおいて特に問題となるのは、被験体細胞４７が窪み４１の中に保持された場合でも、貫通孔４４が窪み４１の最深部に形成されていることから、窪み４１の中間部に細胞膜が密着してしまうと貫通孔４４は上部のウエル４０の培養液４８と電気的に導通してしまい、精度の高い測定ができないという問題があった。
【００１５】
さらに、被験体細胞４７が窪み４１の中に保持され、さらに貫通孔４４を覆うように細胞膜が密着しているかどうかを調べる手段がなかった。
【００１６】
また、前述のように２種類のマスクを用いて行うと、第一のマスクによるドライエッチングを行った後第二のマスクを用いてドライエッチングを行う際にマスクのアライメントずれが生じ、さらに２枚のマスクを用意してフォトリソグラフィをそれぞれ別々に行うことから製造的にも手間がかかり、コスト高を招くことがあった。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために本発明の請求項１に記載の発明は、基板の一面側にダイアフラムを設け、このダイアフラムを構成するいずれかの面に少なくとも一つ以上の曲面からなる窪みを設け、この窪みの最深部より上部に貫通孔を設け、この貫通孔の前記窪みと反対側の開口部に検出電極を設けた細胞外電位測定デバイスであり、この貫通孔が窪みの最深部より上部に設けられていることから培養液と被験体細胞をダイアフラムの窪みが形成されている側より投入したとき、被験体細胞は窪み内に保持されるが、この被験体細胞が窪み内の最深部に到達しなくても、より確実に貫通孔を被験体細胞の細胞膜が隙間無く密着することができるので、貫通孔内の培養液とダイアフラムの上面側の培養液は遮断され、細胞が活動する際に発する物理化学的変化を貫通孔側に設けられた検出電極によって効率よく検出することができる細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００１８】
本発明の請求項２に記載の発明は、貫通孔を少なくとも２つ以上設けた請求項１に記載の細胞外電位測定デバイスであり、被験体細胞が窪み内側にある複数の貫通孔のうち、いずれかを細胞膜によって覆うと、その貫通孔からの信号によって細胞外電位を測定することができるので、より確実に測定ができる細胞外電位測定デバイスを実現することができる。さらに同じ窪み内に２つ以上の貫通孔が設けられているので、貫通孔間の抵抗値を測定することで被験体細胞が貫通孔を覆っているかどうかを判断することができる。つまり、細胞膜がいずれの貫通孔も覆っていない場合は培養液によって貫通孔どうしは導通しているため抵抗値は低いが、いずれかあるいは両方の貫通孔が細胞膜によって覆われている場合には貫通孔どうしの抵抗値は大きなものとなる。これによって、被験体細胞の保持時に貫通孔を確実に細胞膜が覆っているかどうかを判断することができる。
【００１９】
本発明の請求項３に記載の発明は、貫通孔にそれぞれの検出電極を設けた請求項２に記載の細胞外電位測定デバイスであり、それぞれの貫通孔に検出電極が設けられているので同じ貫通孔に複数の検出電極が設けられていることになり、この検出電極間の抵抗値を測定することで、貫通孔内の培養液のイオン濃度変化を測定することができるようになる。
【００２０】
さらに、貫通孔が複数に分かれていることから検出電極を設けやすいという製造上の利点も有する。
【００２１】
本発明の請求項４に記載の発明は、基板の一面側にダイアフラムを設け、このダイアフラムを構成するいずれかの面に少なくとも一つ以上の曲面からなる窪みを設け、この窪みの最深部より上部に貫通孔を設け、この貫通孔の前記窪みと反対側の開口部に少なくとも２つ以上の検出電極を設けた細胞外電位測定デバイスであり、この検出電極間の抵抗値を測定することにより貫通孔内の培養液のイオン濃度変化を測定することができる細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００２２】
本発明の請求項５に記載の発明は、基板の一面側にダイアフラムを設け、このダイアフラムを構成するいずれかの面に少なくとも一つ以上の曲面からなる窪みを設け、この窪みに矩形もしくはＵ字形あるいはこれらを組み合わせてなる形状の貫通孔を前記窪みの最深部より上部に設け、この貫通孔の前記窪みと反対側の開口部に検出電極を設けた細胞外電位測定デバイスであり、円形状の貫通孔に比べてその直径サイズよりも狭い幅の貫通孔とすることができることから、被験体細胞が貫通孔内に不用意に引き込まれることなく窪み内にとどまりながら貫通孔を細胞膜が覆うことができる細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００２３】
また、被験体細胞の形状が楕円球状に変形しやすい場合は貫通孔を矩形にすることで窪みの形状を楕円球状にすることができる。
【００２４】
さらに、矩形の長さは円形状の貫通孔の直径サイズより長くなるので、同一の貫通孔に２つ以上の検出電極を形成することが容易であるという製造上の利点も有する。
【００２５】
さらに、貫通孔がＵ字形の場合には外形が丸まっていることから、窪みをより球形にしたい場合に容易に実現できるという製造上の利点を有する。つまり、矩形の場合は矩形の貫通孔を中心とする窪みは楕円球形状になるが、Ｕ字形の場合は貫通孔の開口部を中心に集めることができるので、窪みがより球形に近い形になるのである。
【００２６】
本発明の請求項６に記載の発明は、基板がシリコンである請求項１〜５のいずれか一つに記載の細胞外電位測定デバイスであり、ダイアフラム、窪み、貫通孔をドライエッチングにより高精度に形成した細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００２７】
本発明の請求項７に記載の発明は、基板がＳＯＩ基板である請求項１〜５のいずれか一つに記載の細胞外電位測定デバイスであり、より高精度で生産性に優れた細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００２８】
本発明の請求項８に記載の発明は、窪みの開口部の寸法が１０〜１００μｍであり、貫通孔の最小開口径もしくは幅が１〜１０μｍである請求項１〜５のいずれか一つに記載の細胞外電位測定デバイスであり、このような形状は数〜数十μｍの被験体細胞を効率的に窪み内に保持することができる細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００２９】
本発明の請求項９に記載の発明は、貫通孔の形状が矩形あるいはＵ字形もしくはこれらの組み合わせである請求項１〜５のいずれか一つに記載の細胞外電位測定デバイスであり、貫通孔が矩形となることで、円形状に比べて狭い幅の貫通孔とすることができる。このことにより、被験体細胞が貫通孔内に不用意に引き込まれることなく、窪みの内にとどまりながら貫通孔を細胞膜が覆うことができるようになることから測定が確実にできる細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００３０】
また、被験体細胞の形状が楕円球状に変形しやすい場合は、貫通孔を矩形にすることで窪みの形状を楕円球状に容易にすることができる。
【００３１】
さらに、矩形の長さは円形の貫通孔に比べて長くなるので、同一の貫通孔に２つ以上の検出電極を形成することが容易であるという製造上の利点も有する。
【００３２】
さらに、貫通孔がＵ字形の場合では、上記と同様の効果が得られる上、外形が丸くなっているために窪みをより球形にしたい場合において、容易に実現できるという製造上の利点を有する。つまり、矩形の場合は、矩形の貫通孔を中心とする窪みは楕円球形状になるが、Ｕ字の場合は貫通孔の開口部が中心に集めることができるので、窪みがより球に近い形になるのである。
【００３３】
本発明の請求項１０に記載の発明は、基板の一面側にダイアフラムを設け、このダイアフラムを構成するいずれかの面に少なくとも一つ以上の曲面からなる窪みを設け、この窪みの最深部より上部に貫通孔を設け、この貫通孔の前記窪みと反対側の開口部に検出電極を設けた細胞外電位測定デバイスの製造方法であって、基板の他面側からエッチングによって前記ダイアフラムを形成する工程と、このダイアフラムを構成するいずれかの面の上に１枚のフォトマスクを用いてレジストマスクを形成する工程と、ドライエッチングによって前記窪み、貫通孔の順に形成する工程と、この貫通孔の窪みとは反対側の開口部に薄膜形成技術により検出電極を形成する工程を含む細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、１枚のフォトマスクによってレジストマスクを形成することができるので、窪み内の正確な位置に貫通孔を形成できるようになる細胞外電位測定デバイスの製造方法を提供することができる。
【００３４】
本発明の請求項１１に記載の発明は、窪みを形成する際にはエッチングを促進するガスのみを用い、次に貫通孔を形成する際にはエッチングを抑制するガスとエッチングを促進するガスの２種類を用いて形成する請求項１０に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、エッチングを促進するガスおよびエッチングを抑制するガスを用いることにより、窪みおよび貫通孔の形状を容易に形成できる。
【００３５】
本発明の請求項１２に記載の発明は、少なくとも２回以上基板を異なる方向に傾け、それぞれにエッチングを行うことにより窪みの中に複数の貫通孔を形成する請求項１１に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、これにより貫通孔を窪み内に複数設けることができる細胞外電位測定デバイスの製造方法を提供することができる。
【００３６】
本発明の請求項１３に記載の発明は、レジストマスクのエッチングホールの形状は所望とする貫通孔の形状とほぼ同じになるように形成する請求項１０に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、窪みおよび貫通孔の大きさは被験体細胞の大きさによって決められるものであるがフォトマスクで形成するエッチングホールは必要とする貫通孔の大きさにしておくことにより、窪みの大きさは貫通孔の大きさ以上であれば自由に決めることができるので、窪みおよび貫通孔の形状をより容易に形成することができる。
【００３７】
本発明の請求項１４に記載の発明は、プラズマ中のイオンの進行方向と基板の角度を８９度以下に傾けてエッチングすることにより貫通孔を形成する請求項１３に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、これにより窪みの最深部より上部に貫通孔を形成することができる。
【００３８】
本発明の請求項１５に記載の発明は、基板がシリコンよりなる細胞外電位測定デバイスの製造方法であって、エッチングを促進するガスがＳＦ_６、ＣＦ_４、ＸｅＦ_２のうちいずれか一つを含むガスを用い、エッチングを抑制するガスがＣ_４Ｆ_８、ＣＨＦ_３のいずれかまたはこれらを含むガスを用いる請求項１１に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、所望とする形状を効率よく得ることができる。
【００３９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の細胞外電位測定デバイスおよびその製造方法について実施の形態および図面を用いて説明する。
【００４０】
（実施の形態１）
本発明の実施の形態１および図１〜図２３により請求項１〜１４に記載の発明について説明する。
【００４１】
図１は本発明の実施の形態１における細胞外電位測定デバイスを示す斜視図であり、図２はこれを上面から見た平面図であり、図３、図１０は同断面図である。図４、図５、図１１は貫通孔の周辺部の拡大図であり、図６〜図９は本発明の細胞外電位測定デバイスの動作を説明するための要部拡大断面図である。また図１２〜図２１は製造工程を説明するための断面図であり、図２２、図２３は他の細胞外電位測定デバイスの構成を示す斜視図である。
【００４２】
次に、その構成を説明する。図１〜図３において、基板１はシリコンで形成されており、基板１の一面側にはダイアフラム２が形成されている。このダイアフラム２の材質は基板１と同じシリコンであり、厚みは約２５μｍである。３は窪みであり半球形の曲面で構成されており、開口部の大きさは約２０μｍである。窪み３には貫通孔４がダイアフラム２を貫通するごとく形成されている。この貫通孔４は図３に示すように窪み３の最深部より上部に位置する箇所に設けられており、ダイアフラム２の厚み方向に対して約４５°傾いている。なお、この貫通孔４は円もしくは楕円形状をしており、円または楕円の長径が約５μｍである。さらに、ダイアフラム２の下面側において図４および図５の貫通孔４の周辺部の拡大図に示すように、図４では金を主体とする検出電極５が貫通孔４の開口部に近接して形成されており、図５では複数の検出電極５ａ、５ｂが貫通孔４の開口部に近接して形成されている。
【００４３】
以下、図面を用いて本発明の細胞外電位測定デバイスの動作を説明する。
【００４４】
まず、培養液の物理化学的変化を検出する手順に付いて説明する。図６、図７はダイアフラム２において窪み３、貫通孔４、検出電極５ａ、５ｂが形成された箇所の拡大断面図である。図７に示すように、ダイアフラム２の上部を培養液６で満たすと、窪み３、貫通孔４は培養液６によって順に満たされる。そこで、ダイアフラム２の上部空間を加圧、もしくはダイアフラム２の下部空間を減圧にすると培養液６は貫通孔４から外方へ飛び出すが、加圧あるいは減圧を適度な値にすると貫通孔４の先端においては開口部より培養液６がメニスカス形状を形成して定常状態となる。
【００４５】
これにより、培養液６は検出電極５ａおよび５ｂに安定的に接触することになる。検出電極５ａと５ｂは図５でも明らかなように、電気的には絶縁された箇所に形成されている。しかし、培養液６が貫通孔４からメニスカス形状によって検出電極５ａ、５ｂに接触することにより、電解質である培養液６を介して、両者の電気的接続が行われるのである。ここで検出電極５ａ、５ｂ間の抵抗値は培養液６のイオン濃度と関係している。
【００４６】
つまり、培養液６のイオン濃度の変化は検出電極５ａ、５ｂ間の抵抗値の変化によって検出することができるのである。さらに、この抵抗値を測定すれば培養液６が貫通孔４において適当なメニスカスを形成しているかどうかがわかる。その理由はメニスカスが不十分であれば検出電極５ａ、５ｂへの接触も不十分となり、抵抗値が大きな値を示すからである。
【００４７】
次に、被験体細胞の細胞外電位あるいは細胞が発する物理化学的変化を測定する手順について説明する。
【００４８】
図８に示すように、被験体細胞８を培養液６と共に投入し、ダイアフラム２の上部空間を加圧もしくはダイアフラム２の下部空間を減圧すると、被験体細胞８および培養液６は共に窪み３内へ引き込まれる。さらに引き込みを続けると、ついには図９に示すように貫通孔４側へも引き込まれ、被験体細胞８の細胞膜は貫通孔４の開口部を塞ぐように吸着する。ここで、本実施の形態１では貫通孔４の開口部は窪み３内の最深部より上部に形成されているために被験体細胞８が窪み３の開口部より若干大きいような場合においても、窪み３および貫通孔４側に引き込まれる際、図９のＡ部のように最深部に隙間ができるなど窪み３の最深部に到達しなくても、被験体細胞８が若干の変形を起こすだけで貫通孔４の開口部を塞ぐことができるようになる。つまり、より確実に被験体細胞８の窪み３内への保持を可能にすることができる。
【００４９】
ここで、窪み３は曲面で構成されているので、被験体細胞８を保持するためにより効率的な形状となっている。
【００５０】
さらに、被験体細胞８が窪み３内に保持された後に培養液６が貫通孔４の開口部で適当なメニスカスを形成するように上下の圧力を調整する。このときには前述のように検出電極５ａ、５ｂ間の抵抗値を測定しながら圧力調整を行うことができる。
【００５１】
また、被験体細胞８を窪み３内で貫通孔４の開口部を塞ぐように保持した後は被験体細胞８への刺激となりうる行為を施す。この刺激の種類としては、例えば化学薬品、毒物などの化学的な刺激に加え、機械的変位、光、熱、電気、電磁波などの物理的な刺激などがある。
【００５２】
そして、前記被験体細胞８がこれらの刺激に対して活発に反応する場合、被験体細胞８は細胞膜が保有するイオンチャネルを通じて各種イオンを放出あるいは吸収する。この反応は被験体細胞８が培養液６と接している箇所において起こり、貫通孔４内の培養液６と被験体細胞８の間でもイオン交換が行われる。
【００５３】
この結果として、貫通孔４内の培養液６のイオン濃度は変化し、前述したように検出電極５ａ、５ｂによってその変化を検出することができるようになる。
【００５４】
なお、ここでは検出電極５ａ、５ｂの２つの電極を形成したが、検出電極は一つでも測定は可能である。その方法は図４に示すように、ダイアフラム２の上部を満たす培養液６と同電位の参照電極（図示せず）と検出電極５との間の電圧を測定することで貫通孔４内のイオン濃度の変化を測定することができるので被験体細胞８の細胞外電位あるいは細胞が発する物理化学的変化を測定することができる。
【００５５】
なお、イオン濃度の変化は抵抗値だけではなく、電流値、電荷量、電位などの別の物理量を測定することでも測定可能である。
【００５６】
また、貫通孔４は窪み３内の最深部より上部に設けられ、ダイアフラム２の厚み方向に対して４５°の角度で傾いている。これにより、本実施の形態１の応用として、図１０に示すように貫通孔１０ａ、１０ｂとして窪み３内に複数個設けることが可能である。この場合は図１１に示すように、金を主体とする検出電極１１ａ、１１ｂをそれぞれの貫通孔１０ａ、１０ｂに設けることによって、前記貫通孔が一つの場合と同様にダイアフラム２の上部を培養液６で満たすと、窪み３、貫通孔１０ａ、１０ｂが満たされ、上下の圧力差によって培養液６が貫通孔１０ａ、１０ｂの先端でメニスカス形状を形成し、検出電極１１ａ、１１ｂにそれぞれ接触する。こうして検出電極１１ａ、１１ｂ間の抵抗値を測定することにより、貫通孔１０ａ、１０ｂの先端で適当なメニスカスが形成されているかがわかり、貫通孔１０ａ、１０ｂ内のイオン濃度の変化もわかる。
【００５７】
そして、被験体細胞８を培養液６と共に投入した場合は貫通孔１０ａ、１０ｂを被験体細胞８の細胞膜が覆うように保持されているかどうかが判断できる。たとえば貫通孔１０ａのみを細胞膜が塞ぎ、貫通孔１０ｂは塞がれていない場合は検出電極１１ａとダイアフラム２の上部の培養液６からとる参照電極（図示せず）間の抵抗値は高く、検出電極１１ｂと参照電極間は低くなることで判断できる。
【００５８】
なお、貫通孔１０ａ、１０ｂは離れて形成されているので検出電極１１ａ、１１ｂを容易に形成できるという製造上の利点も有する。
【００５９】
上記の状態で被験体細胞８に外部より刺激を与えると被験体細胞８の活動が起こり、貫通孔１１ａ、１１ｂ内のイオン濃度が変化するので被験体細胞８の細胞外電位あるいは細胞が発する物理化学的変化が測定できる。
【００６０】
また、本実施の形態１では窪み３の最深部より上部に貫通孔４、１０ａ、１０ｂを形成したが、図２１に示すように貫通孔１４を最深部に設けることは後述する製造方法によれば全く難しいことではない。この場合には、被験体細胞８が容易に最深部にまで到達できるように被験体細胞８に応じて適当な窪み３の大きさ、形状のものを選択する必要がある。
【００６１】
次に、本実施の形態１では貫通孔４、１０ａ、１０ｂの大きさは丸形状あるいは楕円形状としたが、矩形あるいはＵ字形状とすることもできる。
【００６２】
図２２、図２３はそれぞれ貫通孔１５、１７を矩形、Ｕ字形状にした細胞外電位測定デバイスの斜視図である。図２２に示すように貫通孔１５が矩形の場合は窪み１６の形状はカマボコ状に丸みを持った形状となり、図２３に示すように貫通孔１７がＵ字形状の場合には窪み１８の形状はほぼ半球状になる。
【００６３】
前記のような形状とすることで、窪み１６がカマボコ状の場合には被験体細胞８の固定形状が細長くなるような場合（例えば、モノアラガイ由来の神経節細胞）に最適であり、窪み１８の形状を半球にして貫通孔１７の形状をＵ字形状にした場合には、例えば被験体細胞８が変形しやすく、丸形状にした貫通孔４では通り抜けてしまうような場合において有効である。つまり、貫通孔１７をＵ字にすると、貫通孔１７内を満たす培養液６の容量をさほど減らすことなく開口部の最小幅部分を小さくできることから、不用意に被験体細胞８が貫通孔１７内に進入して破壊されることが少なくなる。
【００６４】
なお、窪み３、１６、１８、貫通孔４、１５、１７の大きさは測定する被験体細胞８の大きさ、形状、性質によって決められるものであるが、窪み３、１６、１８の大きさを１０〜１００μｍとし、貫通孔４、１５、１７の大きさを１〜１０μｍにすることによって５〜１００μｍ程度の大きさの被験体細胞８を測定することができる。
【００６５】
次に本発明の細胞外電位測定デバイスの製造方法について図１２〜図２１を用いて説明する。
【００６６】
図１２〜図２１は本実施の形態１における細胞外電位測定デバイスの製造方法を説明するための断面図である。
【００６７】
この細胞外電位測定デバイスの製造方法は図１２に示すようにシリコンからなる基板１を用意し、基板１の他面にレジストマスク１２を形成した後、図１３のように下面から所定の深さだけエッチングすることによって、上部にダイアフラム２を形成する。
【００６８】
そして、エッチングした後、前記レジストマスク１２は除去する。
【００６９】
次に、図１４に示すようにダイアフラム２の外表面にレジストマスク１３を形成する。このときのレジストマスク１３のエッチングホールの形状は必要とする貫通孔４の形状とほぼ同じになるよう設計しておく。
【００７０】
その後、図１５に示すようにドライエッチングによってダイアフラム２側からエッチングを行う。このとき、エッチングガスとしてはエッチングを促進するガスのみを用いる。
【００７１】
基板１がシリコンの場合、このエッチングを促進するガスにはＳＦ_６、ＣＦ_４、ＸｅＦ_２などを用いることができる。これらはシリコンのエッチングを深さ方向だけでなく、横方向へのエッチングも促進する作用があるからである。実験ではＸｅＦ_２を用いて効果を確認している。これによって、エッチング形状は図１５に示すように開口部を中心とする半球形となり、窪み３が形成される。またレジストマスク１３はほとんどエッチングされないので、図１５のように最初の形状を保っている。
【００７２】
次に、図１６に示すように基板１をイオンの進行方向に対して４５°傾けて、ドライエッチングを行う。このときのエッチングガスとしてはエッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスを交互に用いる。エッチングを促進するガスとしてはＸｅＦ_２、ＣＦ_４、ＳＦ_６などがある。またエッチングを抑制するガスとしてはＣＨＦ_３、Ｃ_４Ｆ_８などがある。これらのガスを混合してエッチングすることで、エッチングされた壁面にＣＦ_２のポリマーである保護膜を形成するので、ドライエッチングによる貫通孔４の形成をレジストマスク１３の下方のみに進行させることが可能となる。
【００７３】
ここで、エッチングが下方のみに進行する仕組みを少し詳しく説明する。
【００７４】
まず、エッチングを促進するガスによってエッチングを少しだけ行った後、エッチングを抑制するガスによって保護膜を少しだけ形成する工程を繰り返すことで、ほぼ垂直なエッチング形状とすることができる。この工程ではエッチングを促進するガスによるドライエッチングの際に、外部コイルによる誘導結合法によって生成されたプラズマ中で高周波を基板１に加えることで、基板１にマイナスのバイアス電圧が発生することによりプラズマ中のプラスイオンであるＳＦ_５ ^＋やＣＦ_３ ^＋が基板１に向かって衝突するのでドライエッチングは垂直下方方向に進むことになり、ドライエッチングを抑制させる際には基板１に高周波を加えなければ基板１にはバイアス電圧が全く発生しないので、保護膜の材料となるＣＦ^＋が偏向を受けなくなり、基板１のドライエッチング穴の壁面へ均一な保護膜の形成ができることになる。実験ではエッチングを促進するガスとしてＳＦ_６、抑制するガスとしてＣ_４Ｆ_８を用いて確認している。
【００７５】
これによって、エッチングは垂直下方のみに進行し、レジストマスク１３は前述のように最初の形状を保っているので、結果として図１７のようにダイアフラム２の厚み方向に対して４５°傾いて貫通孔４を形成することができる。
【００７６】
また、上記のような構成とすることにより貫通孔４は窪み３内の最深部より上部に形成されることになる。なお、斜めに傾けてエッチングするので貫通孔４の断面形状はレジストマスク１３の開口部の形状より少し歪む。これが問題な場合は斜めにしたときに円形状に見えるようにレジストマスク１３の形状を変えておく必要がある。これにともない、窪み３のエッチング形状も少し変わるので、これらを総合的に鑑み、レジストマスク１３の形状を決定すると良い。
【００７７】
なお、基板１を傾ける場合の可能な角度はレジストマスク１３の開口部の形状と厚みによって決定されるものであり、例えば１μｍの開口部で１μｍの厚みを持つレジストマスクの場合はエッチングの幾何的な位置からして４５°よりも小さな傾きでなければエッチングはできない。
【００７８】
また、基板１を傾けてエッチングを行わない場合には図２１のように窪み３の最深部に貫通孔１４が形成されることになる。これは被験体細胞８の大きさが窪み３に対して適当であり、最深部まで容易に到達するような場合にはこのような形状でも構わない。
【００７９】
なお、レジストマスク１３の形状には丸形や楕円形の他に矩形、Ｕ字形あるいはこれらを組み合わせた形状も形成することができる。レジストマスク１３の形状を矩形とした場合には、エッチングを促進するガスによって、図２２のように窪み１６の形状がカマボコ状となり、貫通孔１５はレジストマスク１３と同じ矩形となる。
【００８０】
また、レジストマスク１３の形状をＵ字形とした場合には、図２３のように窪み１８の形状は半球形になり、貫通孔１７はレジストマスク１３と同じＵ字形となる。
【００８１】
なお、本実施の形態１の別の応用例として上述した同一の窪み３内に複数の貫通孔を形成する場合には、図１９のように貫通孔４を形成する工程を角度を変えてエッチングを行うことで達成される。なお、レジストマスク１３はエッチング後に除去する。
【００８２】
次に、図１８に示すように基板１の下面から通常の薄膜形成工程により、金を主体とする検出電極５ａ、５ｂをそれぞれの貫通孔４に近接して形成する。基板１の下面には凸凹があるが、このような凸凹のある面でもフォトレジストの塗布、露光、パターニングといったことは可能である。しかし、極めて解像度の高いパターンが要求される場合には、基板１にダイアフラム２を形成後、図２０に示すように、窪み３を形成する面をダイアフラム２の下面としても構わない。本発明では窪み３のパターンの方が検出電極５ａ、５ｂのパターンほど解像度が要求されないので、より簡単な製造工程となる。
【００８３】
なお、窪み３内に複数の貫通孔１０ａ、１０ｂが形成されている場合にも上記と同様に、通常の薄膜形成工程によって、図１１に示すように検出電極１１ａ、１１ｂを形成する。この場合は、窪み３内に形成された貫通孔が一つの場合より要求されるパターンの解像度が低いので、より簡単な製造工程である。
【００８４】
なお、本実施の形態１では最初にダイアフラム２を形成した後、窪み３、貫通孔４を形成する方法について説明してきたが、この他の方法として最初に、窪み３、貫通孔４を形成した後、基板１の下部よりエッチングを行ってダイアフラム２を形成する方法によっても同じ構成の細胞外電位測定デバイスを得ることができる。
【００８５】
なお、基板１としてシリコンを用いたが、シリコンの中に酸化シリコンが埋め込まれた基板を用いることもできる。このような基板はＳＯＩ基板と呼ばれ、上部のダイアフラム２の厚みを高精度にしたり、貫通孔４をエッチングによって形成する際、酸化シリコン層がエッチングストップ層となるのでより簡単な製造方法とすることができる。
【００８６】
【発明の効果】
以上のように本発明の細胞外電位測定デバイスの構成によれば、被験体細胞の細胞膜が隙間無く密着するので、細胞が活動する際に発する物理化学的変化を貫通孔側に設けられた検出電極によって効率よく検出することが可能となり、窪み内の正確な位置に容易に貫通孔を形成できるとともに培養液を一定に保つことにより安定して測定することができる細胞外電位測定デバイスおよびその製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態１における細胞外電位測定デバイスの斜視図
【図２】同平面図
【図３】同断面図
【図４】同貫通孔周辺部の拡大断面図
【図５】同拡大断面図
【図６】同動作を説明するための要部拡大断面図
【図７】同要部拡大断面図
【図８】同要部拡大断面図
【図９】同要部拡大断面図
【図１０】本発明の実施の形態１における細胞外電位測定デバイスの断面図
【図１１】同要部拡大図
【図１２】本実施の形態１における製造方法を示すための細胞外電位測定デバイスの断面図
【図１３】同断面図
【図１４】同断面図
【図１５】同断面図
【図１６】同断面図
【図１７】同断面図
【図１８】同断面図
【図１９】同断面図
【図２０】同断面図
【図２１】同細胞外電位測定デバイスの一例を示す断面図
【図２２】同斜視図
【図２３】同斜視図
【図２４】従来の細胞外電位測定デバイスの一例を示す断面図
【符号の説明】
１基板
２ダイアフラム
３窪み
４貫通孔
５検出電極
５ａ、５ｂ検出電極
６培養液
８被験体細胞
１０ａ、１０ｂ貫通孔
１１ａ、１１ｂ検出電極
１２レジストマスク
１３レジストマスク
１４貫通孔
１５貫通孔
１６窪み
１７貫通孔
１８窪み[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to an extracellular potential measurement device used for measuring extracellular potential or a physicochemical change occurring in the activity of a cell and a method for producing the same.For example, the present invention relates to drug screening for detecting a reaction generated by a cell by a chemical substance. Used.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, drug screening using the electrical activity of cells as an index has been performed by a patch clamp method, a method using a fluorescent dye or a luminescence indicator.
[0003]
This patch clamp method is a method in which the transport of ions through a single channel protein molecule is electrically recorded by a microelectrode probe using a microportion (called a patch) of the cell membrane attached to the tip of a micropipette. This method is one of the few methods that can examine the function of one protein molecule in real time (for example, see Non-Patent Document 1).
[0004]
There is also a method of measuring the electrical activity of a cell by monitoring the movement of ions in the cell using a fluorescent dye or a luminescence indicator that emits light in accordance with a change in the concentration of a specific ion.
[0005]
However, the patch clamp method requires a special technique for preparation and operation of a micropipette, and it takes a lot of time to measure one sample. Therefore, the patch clamp method is not suitable for use in screening a large number of drug candidate compounds at high speed.
[0006]
In addition, a method using a fluorescent dye or the like can screen a large amount of drug candidate compounds at high speed. However, a cell staining step is required, and the background level detected at the time of measurement increases due to the effect of the dye used, or the S / N ratio deteriorates due to the decolorization of this dye over time. There are drawbacks.
[0007]
As an alternative, a group of inventors has proposed a substrate having cell holding means and a device for measuring extracellular potential using electrodes provided on the substrate (for example, see Patent Document 1). This method can provide high-quality data equivalent to the data obtained by the patch clamp method, and can measure a large amount of samples easily and at high speed like a method using a fluorescent dye. An extracellular potential or a physicochemical change generated by a cell having at least one well having cell holding means and a sensor means for detecting an electric signal in the well is measured.
[0008]
The operation of the extracellular potential measurement device disclosed in Patent Document 1 will be described in detail with reference to the drawings.
[0009]
FIG. 24 is a schematic cross-sectional view showing a well structure of the extracellular potential measurement device disclosed in Patent Document 1, in which a culture solution 48 is put in a well 40, and a subject cell 47 is provided on a substrate 42. Captured or held by the cell holding means provided. The cell holding means has a configuration in which a depression 41 formed in the substrate 42 and a through-hole 44 communicating with the depression 41 through an opening.
[0010]
Further, a measurement electrode 45 serving as a sensor is disposed in the through hole 44, and the measurement electrode 45 is connected to a signal detection unit via a wiring.
[0011]
Then, at the time of measurement, the subject cells 47 are held in close contact with the recesses 41 from the through-hole 44 side by means such as a suction pump. The electric signal generated by the activity of the subject cell 47 in this manner is detected by the measurement electrode 45 provided on the through hole 44 side without leaking to the culture solution 48 side in the well 40.
[0012]
Here, the size of the depression 41 holding the subject cell 47 is about 10 to 30 μm, and the size of the through hole 44 side needs to be 2 to 5 μm. In order to accurately realize this shape, it is necessary to use two types of masks. After the first mask is dry-etched to form the depression 41, the second mask is dry-etched to form the through hole 44. Had to be formed.
[0013]
[Non-patent document 1]
"Molecular Biology of Cells, Third Edition", Garland Publishing Inc. , New York, 1994, Japanese version, translated by Keiko Nakamura et al., Pp. 181-182, 1995, Kyoikusha
[Patent Document 1]
WO 02/055653
[0014]
[Problems to be solved by the invention]
However, a particular problem in the extracellular potential measuring device as described above is that the through hole 44 is formed at the deepest part of the depression 41 even when the subject cell 47 is held in the depression 41. Therefore, if the cell membrane adheres to the middle portion of the depression 41, the through hole 44 is electrically connected to the culture solution 48 of the upper well 40, and there is a problem that highly accurate measurement cannot be performed.
[0015]
Furthermore, there is no means for checking whether the cell 47 is held in the depression 41 and whether the cell membrane is in close contact with the through hole 44.
[0016]
In addition, when using two types of masks as described above, misalignment of the mask occurs when dry etching is performed using the second mask after performing dry etching using the first mask. Since the photolithography is performed separately by preparing the masks described above, it is troublesome in terms of manufacturing, and the cost may be increased.
[0017]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above-mentioned problem, the invention according to claim 1 of the present invention provides a diaphragm on one surface side of a substrate, and provides at least one or more curved dents on any one of surfaces constituting the diaphragm, An extracellular potential measurement device in which a through hole is provided above the deepest portion of the dent, and a detection electrode is provided in an opening of the through hole opposite to the dent, and the through hole is provided above the deepest portion of the dent. When the culture solution and the test cell are introduced from the side where the depression of the diaphragm is formed, the test cell is retained in the depression, but the test cell is located at the deepest part in the depression. Even if the cells do not reach, the cell membrane of the subject cell can more securely adhere to the through-hole without gaps, so that the culture solution in the through-hole and the culture solution on the upper surface side of the diaphragm are shut off, and when the cells are activated. Things emitted from It is possible to realize an extracellular potential measuring device that can be efficiently detected by a detection electrode provided chemical changes to the through hole side.
[0018]
The invention according to claim 2 of the present invention is the extracellular potential measurement device according to claim 1, wherein at least two or more through-holes are provided. If any of them is covered with a cell membrane, the extracellular potential can be measured by a signal from the through hole, so that an extracellular potential measuring device capable of more reliably measuring can be realized. Further, since two or more through-holes are provided in the same depression, it is possible to determine whether or not the subject cell covers the through-hole by measuring the resistance value between the through-holes. In other words, when the cell membrane does not cover any of the through-holes, the resistance value is low because the through-holes are conducted by the culture solution, but when one or both of the through-holes are covered with the cell membrane, the penetrating occurs. The resistance value between the holes becomes large. This makes it possible to reliably determine whether or not the cell membrane covers the through hole when the subject cell is held.
[0019]
The invention according to claim 3 of the present invention is the extracellular potential measurement device according to claim 2, wherein each of the detection electrodes is provided in the through-hole, and the detection electrode is provided in each of the through-holes. A plurality of detection electrodes are provided in the through hole, and by measuring the resistance value between the detection electrodes, a change in the ionic concentration of the culture solution in the through hole can be measured.
[0020]
Furthermore, since the through hole is divided into a plurality of parts, there is an advantage in manufacturing that a detection electrode can be easily provided.
[0021]
The invention according to claim 4 of the present invention provides a method in which a diaphragm is provided on one surface side of a substrate, and at least one or more curved surfaces are provided on one of the surfaces constituting the diaphragm. Is an extracellular potential measurement device in which a through hole is provided, and at least two or more detection electrodes are provided in an opening of the through hole opposite to the depression, and the through-hole is measured by measuring a resistance value between the detection electrodes. An extracellular potential measurement device capable of measuring a change in ion concentration of a culture solution in a pore can be realized.
[0022]
The invention according to claim 5 of the present invention provides a method in which a diaphragm is provided on one surface side of a substrate, and at least one or more curved dents are provided on any one of the surfaces constituting the diaphragm. Alternatively, a through-hole having a shape formed by combining these is provided above the deepest portion of the dent, and an extracellular potential measurement device provided with a detection electrode in an opening of the through-hole opposite to the dent is a circular shape. Since the through-hole can be narrower than its diameter in comparison with the through-hole, the cell membrane can cover the through-hole while the subject cell stays in the depression without being carelessly drawn into the through-hole. A device capable of measuring extracellular potential can be realized.
[0023]
When the shape of the subject cell is easily deformed into an elliptical sphere, the shape of the depression can be made elliptical by making the through hole rectangular.
[0024]
Furthermore, since the length of the rectangle is longer than the diameter of the circular through-hole, there is an advantage in manufacturing that two or more detection electrodes can be easily formed in the same through-hole.
[0025]
Furthermore, since the outer shape is rounded when the through-hole is U-shaped, there is an advantage in manufacturing that the hollow can be easily realized when a more spherical shape is desired. In other words, in the case of a rectangle, the depression centered on the rectangular through hole has an elliptical spherical shape, but in the case of a U-shape, the opening of the through hole can be gathered at the center, so that the depression is closer to a spherical shape It becomes.
[0026]
The invention according to claim 6 of the present invention is the extracellular potential measurement device according to any one of claims 1 to 5, wherein the substrate is silicon, and the diaphragm, the dent, and the through-hole are formed with high precision by dry etching. The extracellular potential measuring device formed in the above can be realized.
[0027]
According to a seventh aspect of the present invention, there is provided the extracellular potential measuring device according to any one of the first to fifth aspects, wherein the substrate is an SOI substrate. A potential measuring device can be realized.
[0028]
The invention according to claim 8 of the present invention is directed to any one of claims 1 to 5, wherein the size of the opening of the depression is 10 to 100 µm, and the minimum opening diameter or width of the through hole is 1 to 10 µm. It is an extracellular potential measuring device described above, and such a shape can realize an extracellular potential measuring device capable of efficiently holding test cells of several to several tens of μm in a depression.
[0029]
The invention according to claim 9 of the present invention is the extracellular potential measurement device according to any one of claims 1 to 5, wherein the shape of the through hole is rectangular, U-shaped, or a combination thereof. Has a rectangular shape, so that the through hole can have a narrower width than a circular shape. This makes it possible for the cell membrane to cover the through hole while the test cell is not inadvertently drawn into the through hole and to stay in the recess, so that the extracellular potential measuring device can reliably measure the through hole. Can be realized.
[0030]
When the shape of the subject cell is easily deformed into an elliptical sphere, the shape of the depression can be easily made into an elliptical sphere by making the through hole rectangular.
[0031]
Further, since the length of the rectangle is longer than that of the circular through-hole, there is an advantage in manufacturing that two or more detection electrodes can be easily formed in the same through-hole.
[0032]
Further, in the case where the through-hole is U-shaped, the same effect as described above can be obtained, and there is an advantage in manufacturing that, when the recess is more spherical because the outer shape is rounded, it can be easily realized. In other words, in the case of a rectangle, the depression centered on the rectangular through hole has an elliptical spherical shape, but in the case of a U-shape, the opening of the through hole can be gathered at the center, so that the depression is closer to a sphere. It becomes.
[0033]
According to a tenth aspect of the present invention, a diaphragm is provided on one surface side of a substrate, and at least one or more curved surfaces are provided on one of the surfaces constituting the diaphragm. A method of manufacturing an extracellular potential measurement device, wherein a through-hole is provided in a through-hole, and a detection electrode is provided in an opening of the through-hole opposite to the recess, wherein the diaphragm is formed by etching from the other surface side of the substrate Forming a resist mask on one of the surfaces constituting the diaphragm by using one photomask, forming the dent by dry etching, and forming the through-hole in this order; This is a method for manufacturing an extracellular potential measuring device including a step of forming a detection electrode by a thin film forming technique in an opening on the opposite side from the opening, and using a single photomask. It is possible to form a resist mask, it is possible to provide a manufacturing method of an extracellular potential measuring device it is possible to form a through hole in the correct position within the recess.
[0034]
The invention according to claim 11 of the present invention uses only a gas that promotes etching when forming a depression, and uses a gas that suppresses etching and a gas that promotes etching when forming a through-hole next. 11. The method for manufacturing an extracellular potential measurement device according to claim 10, wherein the device is formed using two types, and the shapes of the depression and the through-hole are easily formed by using a gas that promotes etching and a gas that suppresses etching. it can.
[0035]
The invention according to claim 12 of the present invention provides the extracellular potential according to claim 11, wherein the substrate is inclined at least twice or more in different directions, and a plurality of through holes are formed in the depressions by performing etching on each of the substrates. This is a method for manufacturing a measuring device, whereby a method for manufacturing an extracellular potential measuring device in which a plurality of through holes can be provided in a depression can be provided.
[0036]
According to a thirteenth aspect of the present invention, there is provided the method of manufacturing an extracellular potential measuring device according to the tenth aspect, wherein the shape of the etching hole of the resist mask is formed to be substantially the same as the shape of the desired through-hole. The size of the pit and the through hole is determined by the size of the subject cell, but the etching hole formed by the photomask is set to the required size of the through hole, so that the size of the pit is small. Can be freely determined as long as it is equal to or larger than the size of the through hole, so that the shapes of the depression and the through hole can be formed more easily.
[0037]
The invention according to claim 14 of the present invention is the device for measuring extracellular potential according to claim 13, wherein the through-hole is formed by etching with the angle between the direction of travel of the ions in the plasma and the substrate inclined to 89 degrees or less. This allows a through-hole to be formed above the deepest portion of the depression.
[0038]
The invention according to claim 15 of the present invention is a method for manufacturing an extracellular potential measuring device in which a substrate is made of silicon, wherein a gas for promoting etching is SF.₆, CF₄, XeF₂The gas containing any one of the above is used, and the gas for suppressing the etching is C₄F₈, CHF₃12. The method for manufacturing an extracellular potential measurement device according to claim 11, wherein a gas containing any of the above is used, and a desired shape can be efficiently obtained.
[0039]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, an extracellular potential measurement device and a method for manufacturing the same of the present invention will be described with reference to embodiments and drawings.
[0040]
(Embodiment 1)
The first embodiment of the present invention and FIGS.
[0041]
FIG. 1 is a perspective view showing an extracellular potential measuring device according to Embodiment 1 of the present invention, FIG. 2 is a plan view of the device as viewed from above, and FIGS. 3 and 10 are sectional views thereof. FIGS. 4, 5, and 11 are enlarged views of the periphery of the through-hole, and FIGS. 6 to 9 are enlarged cross-sectional views of main parts for explaining the operation of the extracellular potential measuring device of the present invention. 12 to 21 are cross-sectional views for explaining a manufacturing process, and FIGS. 22 and 23 are perspective views showing a configuration of another extracellular potential measuring device.
[0042]
Next, the configuration will be described. 1 to 3, a substrate 1 is formed of silicon, and a diaphragm 2 is formed on one surface side of the substrate 1. The material of the diaphragm 2 is the same silicon as the substrate 1, and the thickness is about 25 μm. Reference numeral 3 denotes a depression, which is constituted by a hemispherical curved surface, and the size of the opening is about 20 μm. In the recess 3, a through hole 4 is formed so as to penetrate the diaphragm 2. As shown in FIG. 3, the through hole 4 is provided at a position above the deepest portion of the depression 3 and is inclined by about 45 ° with respect to the thickness direction of the diaphragm 2. The through hole 4 has a circular or elliptical shape, and the major axis of the circle or ellipse is about 5 μm. Further, as shown in the enlarged view of the periphery of the through hole 4 in FIGS. 4 and 5 on the lower surface side of the diaphragm 2, the detection electrode 5 mainly composed of gold is close to the opening of the through hole 4 in FIG. In FIG. 5, a plurality of detection electrodes 5 a and 5 b are formed near the opening of the through hole 4.
[0043]
Hereinafter, the operation of the extracellular potential measurement device of the present invention will be described with reference to the drawings.
[0044]
First, a procedure for detecting a physicochemical change of a culture solution will be described. FIGS. 6 and 7 are enlarged cross-sectional views of the diaphragm 2 where the depression 3, the through hole 4, and the detection electrodes 5a and 5b are formed. As shown in FIG. 7, when the upper portion of the diaphragm 2 is filled with the culture solution 6, the depression 3 and the through hole 4 are sequentially filled with the culture solution 6. Therefore, when the upper space of the diaphragm 2 is pressurized or the lower space of the diaphragm 2 is depressurized, the culture solution 6 jumps out of the through-hole 4. In, the culture solution 6 forms a meniscus shape from the opening and becomes a steady state.
[0045]
Thus, the culture solution 6 comes into stable contact with the detection electrodes 5a and 5b. As is apparent from FIG. 5, the detection electrodes 5a and 5b are formed at electrically insulated portions. However, when the culture solution 6 comes into contact with the detection electrodes 5a and 5b from the through hole 4 in a meniscus shape, the two are electrically connected via the culture solution 6 which is an electrolyte. Here, the resistance value between the detection electrodes 5 a and 5 b is related to the ion concentration of the culture solution 6.
[0046]
That is, a change in the ion concentration of the culture solution 6 can be detected by a change in the resistance value between the detection electrodes 5a and 5b. Further, by measuring the resistance value, it can be determined whether or not the culture solution 6 has formed an appropriate meniscus in the through hole 4. The reason is that if the meniscus is insufficient, the contact with the detection electrodes 5a and 5b also becomes insufficient, and the resistance value becomes large.
[0047]
Next, a procedure for measuring the extracellular potential of a subject cell or a physicochemical change generated by the cell will be described.
[0048]
As shown in FIG. 8, when the test cells 8 are charged together with the culture solution 6 and the upper space of the diaphragm 2 is pressurized or the lower space of the diaphragm 2 is depressurized, both the test cells 8 and the culture solution 6 Drawn into When the drawing is further continued, the drawing is finally performed toward the through hole 4 as shown in FIG. 9, and the cell membrane of the subject cell 8 is adsorbed so as to close the opening of the through hole 4. Here, in the first embodiment, since the opening of the through-hole 4 is formed above the deepest portion in the depression 3, even when the subject cell 8 is slightly larger than the opening of the depression 3, At the time of being drawn into the dent 3 and the through hole 4 side, the subject cell 8 only slightly deforms even if it does not reach the deepest part of the dent 3 such that a gap is formed at the deepest part as shown in part A of FIG. Thus, the opening of the through hole 4 can be closed. That is, it is possible to more reliably hold the subject cell 8 in the depression 3.
[0049]
Here, since the depression 3 is formed of a curved surface, the depression 3 has a more efficient shape for holding the subject cells 8.
[0050]
Further, after the test cell 8 is held in the depression 3, the upper and lower pressures are adjusted so that the culture solution 6 forms an appropriate meniscus at the opening of the through hole 4. At this time, the pressure can be adjusted while measuring the resistance value between the detection electrodes 5a and 5b as described above.
[0051]
After holding the subject cell 8 in the depression 3 so as to cover the opening of the through hole 4, an action that can be a stimulus to the subject cell 8 is performed. The types of the stimuli include, for example, chemical stimuli such as chemicals and poisons, and physical stimuli such as mechanical displacement, light, heat, electricity, and electromagnetic waves.
[0052]
When the subject cell 8 actively responds to these stimuli, the subject cell 8 emits or absorbs various ions through an ion channel held by the cell membrane. This reaction occurs at a position where the test cell 8 is in contact with the culture solution 6, and ion exchange is also performed between the culture solution 6 in the through hole 4 and the test cell 8.
[0053]
As a result, the ion concentration of the culture solution 6 in the through hole 4 changes, and the change can be detected by the detection electrodes 5a and 5b as described above.
[0054]
Here, two electrodes of the detection electrodes 5a and 5b are formed, but measurement is possible even with one detection electrode. As shown in FIG. 4, the method measures the voltage between a reference electrode (not shown) having the same potential as the culture solution 6 filling the upper part of the diaphragm 2 and the detection electrode 5, thereby obtaining the ion in the through-hole 4. Since the change in the concentration can be measured, the extracellular potential of the subject cell 8 or the physicochemical change generated by the cell can be measured.
[0055]
The change in ion concentration can be measured not only by the resistance value but also by measuring another physical quantity such as a current value, a charge amount, and a potential.
[0056]
Further, the through hole 4 is provided above the deepest part in the depression 3 and is inclined at an angle of 45 ° with respect to the thickness direction of the diaphragm 2. Thus, as an application of the first embodiment, a plurality of through holes 10a and 10b can be provided in the recess 3 as shown in FIG. In this case, as shown in FIG. 11, by providing detection electrodes 11a and 11b mainly composed of gold in the respective through-holes 10a and 10b, the upper part of the diaphragm 2 can be cultivated in the same manner as in the case where only one through-hole is provided. When filled with 6, the depression 3 and the through holes 10a and 10b are filled, and the culture solution 6 forms a meniscus shape at the tips of the through holes 10a and 10b due to a vertical pressure difference, and comes into contact with the detection electrodes 11a and 11b, respectively. By measuring the resistance value between the detection electrodes 11a and 11b in this manner, it is possible to determine whether an appropriate meniscus is formed at the tips of the through holes 10a and 10b, and to know the change in the ion concentration in the through holes 10a and 10b.
[0057]
When the test cell 8 is injected together with the culture solution 6, it can be determined whether or not the through-holes 10a and 10b are held so that the cell membrane of the test cell 8 covers the through-holes 10a and 10b. For example, when only the through-hole 10a is closed by the cell membrane and the through-hole 10b is not closed, the resistance between the detection electrode 11a and the reference electrode (not shown) taken from the culture solution 6 above the diaphragm 2 is high, and It can be determined that the distance between the electrode 11b and the reference electrode is low.
[0058]
Since the through holes 10a and 10b are formed apart from each other, there is also an advantage in manufacturing that the detection electrodes 11a and 11b can be easily formed.
[0059]
When an external stimulus is applied to the subject cell 8 in the above state, the activity of the subject cell 8 occurs, and the ion concentration in the through holes 11a and 11b changes. Chemical changes can be measured.
[0060]
Further, in the first embodiment, the through holes 4, 10a, and 10b are formed above the deepest portion of the depression 3, but the provision of the through hole 14 at the deepest portion as shown in FIG. It is not difficult at all. In this case, it is necessary to select an appropriate size and shape of the depression 3 according to the subject cell 8 so that the subject cell 8 can easily reach the deepest part.
[0061]
Next, in the first embodiment, the sizes of the through holes 4, 10a, and 10b are round or elliptical, but may be rectangular or U-shaped.
[0062]
FIGS. 22 and 23 are perspective views of the extracellular potential measuring device in which the through holes 15 and 17 are rectangular and U-shaped, respectively. When the through-hole 15 is rectangular as shown in FIG. 22, the shape of the recess 16 is rounded in a skewed shape, and when the through-hole 17 is U-shaped as shown in FIG. Is almost hemispherical.
[0063]
By adopting the shape as described above, when the depression 16 is in the shape of a dent, it is most suitable when the fixed shape of the subject cell 8 is elongated (for example, a ganglion cell derived from a mussel). When the shape of the through-hole 17 is made into a U-shape by making the shape into a hemisphere, it is effective when, for example, the subject cell 8 is easily deformed and passes through the round through-hole 4. In other words, when the through-hole 17 is formed in a U-shape, the minimum width of the opening can be reduced without significantly reducing the volume of the culture solution 6 filling the through-hole 17. It is less likely to enter and be destroyed.
[0064]
The size of the depressions 3, 16, 18 and the through holes 4, 15, 17 is determined by the size, shape, and properties of the subject cell 8 to be measured. Is set to 10 to 100 μm, and the size of the through-holes 4, 15, 17 is set to 1 to 10 μm, so that the subject cells 8 having a size of about 5 to 100 μm can be measured.
[0065]
Next, a method for manufacturing the extracellular potential measuring device of the present invention will be described with reference to FIGS.
[0066]
12 to 21 are sectional views for explaining a method of manufacturing the extracellular potential measuring device according to the first embodiment.
[0067]
In the method of manufacturing this extracellular potential measuring device, a substrate 1 made of silicon is prepared as shown in FIG. 12, a resist mask 12 is formed on the other surface of the substrate 1, and a predetermined depth from the lower surface as shown in FIG. By etching only, the diaphragm 2 is formed on the upper portion.
[0068]
After the etching, the resist mask 12 is removed.
[0069]
Next, a resist mask 13 is formed on the outer surface of the diaphragm 2 as shown in FIG. At this time, the shape of the etching hole of the resist mask 13 is designed to be substantially the same as the required shape of the through hole 4.
[0070]
Thereafter, as shown in FIG. 15, etching is performed from the diaphragm 2 side by dry etching. At this time, only a gas that promotes etching is used as an etching gas.
[0071]
When the substrate 1 is silicon, the gas for promoting this etching is SF.₆, CF₄, XeF₂Etc. can be used. This is because these have the effect of promoting the etching of silicon not only in the depth direction but also in the lateral direction. XeF in the experiment₂The effect has been confirmed using. As a result, the etching shape becomes hemispherical with the opening at the center as shown in FIG. Since the resist mask 13 is hardly etched, the initial shape is maintained as shown in FIG.
[0072]
Next, as shown in FIG. 16, the substrate 1 is inclined by 45 ° with respect to the traveling direction of the ions, and dry etching is performed. As the etching gas at this time, a gas for promoting the etching and a gas for suppressing the etching are used alternately. XeF is used as a gas for promoting etching.₂, CF₄, SF₆and so on. CHF is used as a gas for suppressing etching.₃, C₄F₈and so on. By mixing and etching these gases, CF walls are formed on the etched wall surface.₂Since the protective film, which is a polymer, is formed, the formation of the through hole 4 by dry etching can be advanced only below the resist mask 13.
[0073]
Here, the mechanism in which the etching proceeds only downward will be described in some detail.
[0074]
First, by repeating a process of slightly etching with a gas that promotes etching and then slightly forming a protective film with a gas that suppresses etching, a substantially vertical etching shape can be obtained. In this step, a negative bias voltage is generated in the substrate 1 by applying a high frequency to the substrate 1 in plasma generated by an inductive coupling method using an external coil during dry etching with a gas that promotes etching. SF which is a positive ion in₅ ⁺And CF₃ ⁺Collides against the substrate 1 so that the dry etching proceeds vertically downward. When suppressing dry etching, a bias voltage is not generated at all in the substrate 1 unless high frequency is applied to the substrate 1. CF used as film material⁺Is no longer deflected, and a uniform protective film can be formed on the wall surface of the dry etching hole of the substrate 1. In experiments, SF was used as a gas to promote etching.₆, As a suppressing gas C₄F₈Is confirmed using
[0075]
As a result, the etching proceeds only vertically downward, and the resist mask 13 maintains the initial shape as described above. As a result, as shown in FIG. 17, the through-hole is inclined at 45 ° with respect to the thickness direction of the diaphragm 2. 4 can be formed.
[0076]
Further, with the above configuration, the through-hole 4 is formed above the deepest portion in the depression 3. Since the etching is performed obliquely, the cross-sectional shape of the through hole 4 is slightly distorted from the shape of the opening of the resist mask 13. If this is a problem, it is necessary to change the shape of the resist mask 13 so that it looks like a circle when it is inclined. Accordingly, the etching shape of the depression 3 slightly changes. Therefore, it is preferable to determine the shape of the resist mask 13 in consideration of these factors.
[0077]
Note that the possible angle when the substrate 1 is tilted is determined by the shape and thickness of the opening of the resist mask 13. For example, in the case of a resist mask having a thickness of 1 μm with an opening of 1 μm, the geometrical shape of the etching is used. Etching cannot be performed unless the inclination is smaller than 45 ° from a certain position.
[0078]
If the etching is not performed by tilting the substrate 1, the through hole 14 is formed at the deepest portion of the depression 3 as shown in FIG. This is suitable for the size of the subject cell 8 with respect to the depression 3 and such a shape may be used when the test cell 8 easily reaches the deepest part.
[0079]
The shape of the resist mask 13 may be a rectangle, a U-shape, or a combination thereof in addition to a round or an ellipse. When the shape of the resist mask 13 is rectangular, the shape of the dent 16 becomes rugged as shown in FIG. 22 by the gas that promotes etching, and the through hole 15 becomes the same rectangle as the resist mask 13.
[0080]
When the shape of the resist mask 13 is U-shaped, the shape of the recess 18 becomes hemispherical as shown in FIG. 23, and the through hole 17 becomes the same U-shape as the resist mask 13.
[0081]
In the case where a plurality of through holes are formed in the same recess 3 as another application example of the first embodiment, the step of forming the through hole 4 is changed by changing the angle as shown in FIG. Is achieved. Note that the resist mask 13 is removed after the etching.
[0082]
Next, as shown in FIG. 18, detection electrodes 5 a and 5 b mainly composed of gold are formed near the respective through holes 4 by a normal thin film forming process from the lower surface of the substrate 1. Although the lower surface of the substrate 1 has irregularities, it is possible to apply, expose, and pattern a photoresist on such irregular surfaces. However, when a pattern with extremely high resolution is required, the surface on which the depression 3 is formed may be the lower surface of the diaphragm 2 as shown in FIG. In the present invention, since the resolution of the pattern of the depression 3 is not required as much as that of the pattern of the detection electrodes 5a and 5b, the manufacturing process is simpler.
[0083]
In the case where a plurality of through holes 10a and 10b are formed in the depression 3, the detection electrodes 11a and 11b are formed as shown in FIG. In this case, the required resolution of the pattern is lower than in the case where only one through-hole is formed in the depression 3, so that this is a simpler manufacturing process.
[0084]
In the first embodiment, the method of forming the dent 3 and the through hole 4 after forming the diaphragm 2 first has been described. However, as another method, the dent 3 and the through hole 4 are formed first. Thereafter, an extracellular potential measuring device having the same configuration can be obtained by a method of forming the diaphragm 2 by etching from the lower portion of the substrate 1.
[0085]
Although silicon is used as the substrate 1, a substrate in which silicon oxide is embedded in silicon may be used. Such a substrate is called an SOI substrate, and when the thickness of the upper diaphragm 2 is made to be high precision or the through-hole 4 is formed by etching, the silicon oxide layer becomes an etching stop layer, so that a simpler manufacturing method is adopted. be able to.
[0086]
【The invention's effect】
As described above, according to the configuration of the extracellular potential measurement device of the present invention, since the cell membrane of the subject cell adheres without any gap, the physicochemical change occurring when the cell is activated is detected on the through-hole side. An extracellular potential measurement device and a method for manufacturing the same that enable efficient detection by electrodes, facilitate formation of a through hole at an accurate position in a depression, and allow stable measurement by maintaining a constant culture solution A method can be provided.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a perspective view of an extracellular potential measurement device according to a first embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a plan view of the same.
FIG. 3 is a sectional view of the same.
FIG. 4 is an enlarged sectional view of the periphery of the through hole.
FIG. 5 is an enlarged sectional view of the same.
FIG. 6 is an enlarged sectional view of a main part for describing the operation.
FIG. 7 is an enlarged sectional view of a main part of the same.
FIG. 8 is an enlarged sectional view of a main part of the same.
FIG. 9 is an enlarged sectional view of the main part.
FIG. 10 is a cross-sectional view of the extracellular potential measurement device according to the first embodiment of the present invention.
FIG. 11 is an enlarged view of the main part.
FIG. 12 is a cross-sectional view of the extracellular potential measurement device for illustrating the manufacturing method according to the first embodiment.
FIG. 13 is a sectional view of the same.
FIG. 14 is a sectional view of the same.
FIG. 15 is a sectional view of the same.
FIG. 16 is a sectional view of the same.
FIG. 17 is a sectional view of the same.
FIG. 18 is a sectional view of the same.
FIG. 19 is a sectional view of the same.
FIG. 20 is a sectional view of the same.
FIG. 21 is a sectional view showing an example of the extracellular potential measuring device.
FIG. 22 is a perspective view of the same.
FIG. 23 is a perspective view of the same.
FIG. 24 is a sectional view showing an example of a conventional extracellular potential measuring device.
[Explanation of symbols]
1 substrate
2 diaphragm
3 hollow
4 Through hole
5 Detection electrode
5a, 5b detection electrode
6 culture solution
8 Subject cells
10a, 10b through hole
11a, 11b Detection electrode
12 Resist mask
13 Resist mask
14 Through hole
15 Through hole
16 hollow
17 Through hole
18 hollow

Claims

A diaphragm is provided on one surface side of the substrate, a dent made of at least one or more curved surfaces is provided on any of the surfaces constituting the diaphragm, a through hole is provided above the deepest portion of the dent, and the dent of the through hole is provided. Extracellular potential measurement device provided with a detection electrode in the opening opposite to the above.

The extracellular potential measuring device according to claim 1, wherein at least two or more through holes are provided.

The extracellular potential measurement device according to claim 2, wherein each detection electrode is provided in the through hole.

A diaphragm is provided on one surface side of the substrate, a dent made of at least one or more curved surfaces is provided on any of the surfaces constituting the diaphragm, a through hole is provided above the deepest portion of the dent, and the dent of the through hole is provided. Extracellular potential measurement device provided with at least two or more detection electrodes in the opening on the side opposite to the above.

A diaphragm is provided on one surface side of the substrate, a dent formed of at least one or more curved surfaces is provided on any surface constituting the diaphragm, and a through hole having a rectangular or U-shaped or a combination thereof is formed in the dent. An extracellular potential measurement device provided above the deepest part of the depression and provided with a detection electrode in an opening of the through-hole opposite to the depression.

The extracellular potential measuring device according to any one of claims 1 to 5, wherein the substrate is silicon.

The extracellular potential measurement device according to any one of claims 1 to 5, wherein the substrate is an SOI substrate.

The extracellular potential measuring device according to any one of claims 1 to 5, wherein the size of the opening of the depression is 10 to 100 µm, and the minimum opening diameter or width of the through hole is 1 to 10 µm.

The extracellular potential measuring device according to any one of claims 1 to 5, wherein the shape of the through hole is rectangular, U-shaped, or a combination thereof.

A diaphragm is provided on one surface side of the substrate, a dent made of at least one or more curved surfaces is provided on any of the surfaces constituting the diaphragm, a through hole is provided above the deepest portion of the dent, and the dent of the through hole is provided. A method of manufacturing an extracellular potential measurement device provided with a detection electrode in the opening on the opposite side to the step of forming the diaphragm by etching from the other surface side of the substrate, and any of the surfaces constituting the diaphragm Forming a resist mask using one photomask thereon, forming the dent by dry etching, and forming the through-hole in this order; forming a thin-film forming technique on the opening opposite to the dent of the through-hole; A method for producing an extracellular potential measurement device, comprising a step of forming a detection electrode by using the method.

11. The method according to claim 10, wherein only the gas for promoting the etching is used when forming the depression, and the gas for suppressing the etching and the gas for promoting the etching are used when forming the through hole. Method for manufacturing extracellular potential measuring device

The method for manufacturing an extracellular potential measurement device according to claim 11, wherein the substrate is tilted at least twice or more in different directions, and a plurality of through holes are formed in the depressions by etching each of the substrates.

The method for manufacturing an extracellular potential measurement device according to claim 10, wherein the shape of the etching hole of the resist mask is formed so as to be substantially the same as the shape of a desired through hole.

14. The method for manufacturing an extracellular potential measuring device according to claim 13, wherein the through-hole is formed by etching the substrate while inclining the angle between the direction of the ions in the plasma and the substrate to 89 degrees or less.

A method for manufacturing an extracellular potential measurement device in which a substrate is made of silicon, wherein a gas for promoting etching is a gas containing any one of SF ₆ , CF ₄ and XeF ₂ , and a gas for suppressing etching is C _{4 F} _8, the manufacturing method of the extracellular potential measuring device according to claim 11 using any or gas containing these CHF _3.