【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は腹膜透析における腹膜劣化防止剤に関する。また、本発明は腹膜透析に於ける腹膜機能低下の防止、腹膜透過性亢進の抑制もしくは限外濾過能低下防止に関する。さらに、本発明は、腹膜劣化防止剤を含む腹膜透析液に関する。
【０００２】
【従来の技術】
人工透析は、腎機能が低下もしくは喪失した患者に対し、本来腎臓が果たしている血液浄化作用を腎臓に代わって行う血液浄化療法であり、生体内から水を除去することによって体液の組成を一定に保つとともに、体液中の尿素等の老廃物といった溶質を除去することを主な目的としている。現在の人工透析には、主に血液透析療法と腹膜透析療法がある。
【０００３】
腹膜透析療法は、腹膜で囲まれた腹腔内に浸透圧の高い透析溶液を貯留することによって、生体内の余分な水と老廃物といった溶質を取り除くことを基本とする。即ち体液から腹腔内に貯留された透析溶液に水と溶質が移動することによって透析される。この時の水や溶質の移動は、微小血管を介して透析溶液と体液の間に生じた浸透圧格差によって起こる。透析溶液中の浸透圧調節物質はグルコースであり、腹膜透析のドライビングフォースの基である。即ち、腹膜機能を維持するためには、微小血管が正常に機能し、腹膜におけるグルコース等の生体への透過を防止することが重要である。
【０００４】
しかし透析溶液は高浸透圧で、細胞毒性の高いグルコース分解産物（以下ＧＤＰ と略す）を含み、且つｐＨが低いため、透析溶液を反復して腹腔内に貯留することにより、腹膜が非生理的な状態にさらされ、腹膜は傷害を受けやすい。この場合、血管新生とともに腹膜筋線維芽細胞／線維芽細胞が異常増殖・ 遊走して腹膜組織が破壊されることが多い。血管新生時には血管構成組織の再構築が起きるため、正常な血管組織とは異なり、血管の透過性が亢進する。 さらに血管内皮細胞が傷害を受けて、限外濾過能を有する腹膜微小血管が破綻する。この結果、透析液中の浸透圧調節物質であるグルコースの生体内への吸収が促進され、浸透圧が維持できなくなり、透析効率が低下する。即ち腹膜機能の低下がおき、限外濾過不全や溶質除去不全に陥る。
【０００５】
腹膜機能の低下が軽度の場合には、グルコース濃度が高い高浸透圧の腹膜透析液を使用することにより、腹膜透析を続行することが可能である。しかしこのような透析液にはＧＤＰ も高濃度で含まれており、且つ高浸透圧のために腹膜への負担は増える為、一層の腹膜機能の低下を加速することが懸念される。著しく腹膜機能が低下し、溶質除去不全に陥った場合は、現在それに対する有効な治療剤や防止剤は存在しない為、腹膜透析療法の継続を断念しなくてはならない。
【０００６】
３−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｔａｒｙｌ−ＣｏＡ（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ）（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素は肝臓でコレステロールが合成される時の律速酵素であり、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する。コレステロールの合成を阻害する、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤としてシンバスタチン等のスタチン系薬剤が知られている。スタチンはＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を拮抗的に阻害し、血中のＬＤＬ−コレステロールを低下させる作用を有する。 従来スタチンはこの脂質代謝抑制作用により、冠動脈性心疾患や脳血管疾患等の心血管イベント抑制剤として使用されてきた。しかし食事制限等で血中コレステロールを下げるよりも、スタチンの方が強い動脈硬化抑制効果が認められたり、スタチン投与による総コレステロールの低下率と炎症マーカーであるＣＲＰ （Ｃ反応性蛋白質）の低下に相関がみられないことがわかってきた。このことは、スタチンが脂質代謝以外の作用、いわゆるｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ （多面）作用で心血管イベントを防止していることを示唆している。
【０００７】
スタチンのｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ 作用として、例えば、平滑筋細胞増殖抑制効果（Ｎｅｇｕｒｅ−Ａｍｉｍｏｕ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙ Ａｃｔａ． １３４５： ２５９−２６８， １９９７ ）、単球の血管内皮細胞への接着抑制作用（Ｍｅｒｏｎｉ ＰＬ， Ｒａｓｃｈｉ Ｅ， Ｔｅｓｔｏｎｉ Ｃ， Ｔｉｎｃａｎｉ Ａ， Ｂａｌｅｓｔｒｉｅｒｉ Ｇ， Ｍｏｌｔｅｎｉ Ｒ， Ｋｈａｍａｓｈｔａ ＭＡ， Ｔｒｅｍｏｌｉ Ｅ， Ｃａｍｅｒａ Ｍ． Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ４４（１２）：２８７０−８， ２００１） 、マトリックスメタロプロテイナーゼの産生抑制（Ａｉｋａｗａ Ｍ， Ｒａｂｋｉｎ Ｅ， Ｓｕｇｉｙａｍａ Ｓ， Ｖｏｇｌｉｃ ＳＪ， Ｆｕｋｕｍｏｔｏ Ｙ， Ｆｕｒｕｋａｗａ Ｙ， Ｓｈｉｏｍｉ Ｍ， Ｓｃｈｏｅｎ ＦＪ， Ｌｉｂｂｙ Ｐ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０３（２）：２７６−２８３， ２００１ ）、酸化ストレスの低減（Ｇｉｒｏｕｘ ＬＭ， Ｄａｖｉｇｎｏｎ Ｊ， Ｎａｒｕｓｚｅｗｉｃｚ Ｍ． Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ． １１６５（３）：３３５−８， １９９３ ）、抗炎症作用（Ｋｉｅｎｅｒ ＰＡ， Ｄａｖｉｓ ＰＭ， Ｍｕｒｒａｙ ＪＬ， Ｙｏｕｓｓｅｆ Ｓ， Ｒａｎｋｉｎ ＢＭ， Ｋｏｗａｌａ Ｍ． Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ １（１）：１０５−１８， ２００１ ）等の効果が、報告されている。
【０００８】
またスタチンは、内皮細胞の機能を改善すると同時に、一酸化窒素（ＮＯ）の産性を促進すること（Ｌａｕｆｓ Ｕ， Ｌａ Ｆａｔａ Ｖ， Ｐｌｕｔｚｋｙ Ｊ， Ｌｉａｏ ＪＫ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９７（１２）：１１２９−３５， １９９８）も報告されている。ＮＯ産生は、内皮細胞の最も重要な機能であるだけでなく、逆にＮＯは障害をうけた内皮細胞の機能を改善したり、内皮細胞が脱落した血管壁の内皮化を促進する。また、ＮＯは平滑筋細胞の増殖・ 遊走も阻害するため、血管壁の肥厚を防止する。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、腹膜透析において腹膜機能の低下の防止に有用な薬剤を提供することを目的とする。腹膜機能の低下を抑制し、溶質除去不全を防止する薬剤を発明することが、長期にわたる健全な腹膜透析を可能にすると期待されていたが、このような機能をもつ薬剤は知られていない。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤の腹膜透析への適応を試みた結果、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤は腹膜機能の低下を抑制する効果を有することを知見した。従って本発明は、腹膜劣化を予防して腹膜透過性の亢進を抑制し、溶質除去不全を防止することにより、長期の健全な腹膜透析の施行を可能にすることを目的とする腹膜機能低下防止剤を提供しようとするものである。
本発明は下記（１）〜（１０）により達成される。
（１）ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする腹膜劣化防止剤。
（２）前記ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤がスタチン系薬剤であることを特徴とする上記（１）の腹膜劣化防止剤。
（３）前記スタチン系薬剤が、シンバスタチン、セリバスタチン、ピタバスタチン、ロバスタチン、アトルバスタチン、フルバスタチンおよびプラバスタチンおよびそれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも一つの薬剤である上記（２）の腹膜劣化防止剤。
【００１１】
（４）前記スタチン系薬剤がシンバスタチンである上記（３）の腹膜劣化防止剤。
（５）前記腹膜劣化防止が、腹膜機能低下防止、腹膜透過性亢進抑制および／または腹膜限外濾過能低下防止である上記（１）〜（４）のいずれかに記載の腹膜劣化防止剤。
（６）ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を含有することを特徴とする腹膜透析液。
（７）ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を含有することを特徴とする透析効率増強剤。
（８）腹膜劣化防止剤を製造するためのＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤の使用。
（９）予防および／または治療有効量の有効量の上記（１）を宿主に投与することからなる、腹膜劣化の予防および／または治療方法。
（１０）有効量の上記（１）を宿主に投与することからなる、腹膜機能低下、腹膜透過性亢進の抑制および／または腹膜限外濾過能低下の予防および／または防止方法。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明はＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を有効成分として含有する腹膜劣化防止剤を提供する。「腹膜劣化」とは、腹膜の機能が低下することにより腹膜機能の低下、腹膜透過性の亢進または限外濾過量の低下などが生じた状態を意味する。したがって、「腹膜劣化の防止」とは腹膜機能の低下、腹膜透過性の亢進、腹膜限外濾過量の低下などの少なくとも一つの進行が一時的にまたは継続的に遅くなったり、停止したりあるいは改善したりすることをいう。
【００１３】
「腹膜機能」とは、腹膜における溶質の透過性や限外濾過機能をいう。「腹膜における透過性（腹膜透過性）」とは、腹膜を介して溶質が透過することを意味する。したがって、「腹膜透過性の亢進抑制」とは、腹膜を介した溶質の透過速度を一時的または継続的に遅くすることでもよいし、透過速度をゼロにすることでもよい。さらに、腹膜透過性を低下させることにより、腹膜透析における透析効率を改善することも含む。
「腹膜限外濾過量」とは、腹膜を通過する水分量とリンパ管から再吸収される水分量の差であり、一定時間腹腔内に透析液を貯留した後の排液量を調べることにより、判定することができる。 したがって、「腹膜限外濾過量の低下防止」とは、腹膜を介した限外濾過量の低下を一時的または継続的に遅くすることでもよいし、限外濾過量の低下をゼロにすることでもよい。さらに、腹膜限外濾過能を改善することも含む。
【００１４】
本発明の腹膜劣化防止剤は、本発明において「防止剤」と略して表現される。さらに、本発明の「防止剤」は、上記の作用を有することから腹膜の劣化や損傷の予防および／または治療に使用することができる。ここで予防とは、腹膜透析を行う際に腹膜機能の低下が認められない状態で本発明の防止剤を使用し、そのことにより腹膜機能の低下が防止される状態を包含する。
本発明で使用される「ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤」とは、酢酸からコレステロールが合成される過程のメバロン酸代謝経路において、ＨＭＧ−ＣｏＡからメバロン酸に変換される時の反応触媒酵素であるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の拮抗阻害剤である。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤としては、特に限定されないが、スタチン系薬剤が挙げられる。
【００１５】
本発明で使用されるスタチン系薬剤としては、腹膜透析において腹膜機能低下防止効果および／または腹膜透過性亢進抑制効果を有する限り特に限定されないが、シンバスタチン（和光純薬）、セリバスタチン（武田薬品、バイエル）、ピタバスタチン（三共）、ロバスタチン（和光純薬）、アトルバスタチン（ファイザー）、フルバスタチン（和光純薬）、プラバスタチン（和光純薬）およびそれらのナトリウム塩 （プラバスタチンＮａ） 、カルシウム塩（アルトバスタチンＣａ）等の塩が挙げられ、特にシンバスタチンが好ましい。さらに他のスタチン系薬剤も上記の効果を有する限り、スタチン系薬剤の化合物の構造に限定はない。すなわち、上記の効果を有するスタチン系薬剤であるならば、その構造の一部の官能基を修飾して、他の官能基に置換しておよび／または官能基を付して同様の効果を示す誘導体も包含する。かかる理由から、本明細書におけるスタチン系薬剤とは、その全部もしくはその一部、或いはその改変体、誘導体、変異体、アナログ等をすべて含みＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害活性を有する化合物である。
【００１６】
本発明において、有効成分であるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤やスタチン系薬剤は一種または二種以上の複数の化合物を組合せて使用してもよい。
本発明で使用されるスタチン系化合物は医薬品として問題が無い純度が得られれば、合成および／または調製方法は特に限定するものではない。スタチン系薬剤は、その多くが微生物の発酵によって合成されるが、一部は微生物によって合成された天然物質から誘導する半化学合成、もしくは完全な化学合成により製造される。各々のスタチンの製造方法は以下の公知の方法に従い、容易に製造することができる。シンバスタチン：特開昭５６−１２２３７５号（ＵＳＰ４４４４７８４）、セリバスタチン：特開平４−３０８５７３号（ＥＰ４９１２２６）、ピタバスタチン：特開平１−２７９８６６号（ＵＳＰ５８５４２５９及びＵＳＰ５８５６３３６）、ロバスタチン：特開昭５７−１６３３７４号（ＵＳＰ４２３１９３８）、アトルバスタチン：特開平３−５８９６７号（ＵＳＰ５２７３９９５）、フルバスタチン：特表昭６０−５０００１５号（ＵＳＰ４７３９０７３）、プラバスタチン：特開昭５７−２２４０号（ＵＳＰ４３４６２２７）。それらの腹膜機能低下防止効果、腹膜透過性亢進抑制効果および／または腹膜限外濾過能低下効果などの腹膜劣化防止効果は、実施例に記載の動物モデルを用いることにより確認できる。その後、通常用いられる方法により単離、精製することで本発明に供することができる。
【００１７】
本発明の「防止剤」の調製方法としては、特に限定されないが、適当な溶液に溶解後、フィルター等で濾過滅菌してそのまま無菌の容器に封入して「防止剤」として用いることができる。本発明の「防止剤」は、投与経路次第で医薬的に許容される添加物を共に含むものであってもよい。添加剤としては特に限定されないが、担体、賦形剤、防腐剤、安定剤、結合剤、酸化防止剤、膨化剤、等張剤、溶解補助剤、保存剤、緩衝剤、希釈剤等が挙げられる。使用し得る添加剤は、特に限定されないが、例えば、水、生理食塩水、医薬的に許容される有機溶媒、ゼラチン、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、トラガント、カゼイン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、ＰＢＳ、非イオン性界面活性剤、生体内分解性ポリマー、無血清培地、医薬添加物として許容される界面活性剤あるいは生体内で許容し得る生理的ｐＨの緩衝液などが挙げられる。使用される担体は、使用部位に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、これらに限定されるものではない。また、本発明の「防止剤」の保存方法としては、特に限定されないが、適当な容器に封入した後、凍結乾燥してもよい。凍結乾燥にすることにより、長期保存が可能になる。また乾燥させた後、成形して錠剤にしてもよい。
【００１８】
本発明において、「防止」とは、腹膜透析を行う際に腹膜機能の低下が認められる状態で本発明の防止剤を使用し、そのことにより腹膜機能のさらなる低下が防止される状態を包含する。また、「防止剤」はＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を有効成分として含有する。「防止剤」は腹膜劣化の防止のために使用される。したがって、本発明の「防止剤」は、腹膜劣化の低下の予防および／または防止ならびに治療を目的として、また、腹膜機能低下、腹膜透過性亢進の抑制および／または腹膜限外濾過能低下の予防および／または防止を目的として、その有効量を宿主（患者）に投与することができる。投与対象の宿主としては、特に限定されないが、哺乳動物、好ましくはヒト、サル、ネズミ、家畜等が挙げられる。本発明の「防止剤」は、腹膜患部で効率良く本発明の効果が発現する限り投与経路に制限はなく、経口的にまたは非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。投与経路として、腹腔内投与、静脈内投与、経口投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、坐薬、注腸、経口性腸溶剤などを選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。これらのうち、腹腔内投与、静脈内投与および経口投与が好ましい。
【００１９】
直接腹腔に投与する方法として、腹膜透析液に混ぜて腹膜透析時に腹腔内に投与したり、または腹膜透析用カテーテルを介して腹膜透析液に混ぜずに直接投与することができる。静脈注射により投与すれば、透析用カテーテルを介さずに投与することもできる。また経口投与を行えば、特別な器具がなくても摂取可能である。これらの方法をもちいれば、患者に対して低侵襲に且つ効率良く「防止剤」を患部にデリバリーすることが可能である。「防止剤」は、腹腔内に投与すれば、患部である腹膜に直接投与することになり、経口や静脈注射のように有効成分が投与後に患部に到達するまでのロスが無い。この為、本発明の有効成分の濃度は、腹膜で有効な最小限の至適濃度で調剤することができる。すなわち必要最小限の濃度で患部に直接投与できるので、副作用が少ないといった特色を持つ。
【００２０】
「防止剤」の有効投与量は、特に限定されないが、患者あたり１〜１０００ｍｇ、好ましくは５〜５０ｍｇの投与量を選ぶことができる。有効成分がスタチン系薬剤の場合、特に限定されないが、１Ｅ−４Ｍ 〜１Ｅ−１０Ｍが好ましく、１Ｅ−５Ｍ 〜１Ｅ−７Ｍ がさらに好ましい。なお、「Ｅ」とは、指数表示であり、「１０」をマイナスに乗じた数を意味する。例えば、「１Ｅ−４」は「１０−４」を、「１Ｅ−１０ 」は「１０−１０ 」を意味する。なお、「Ｍ 」は「ｍｏｌ／Ｌ 」を意味する。したがって、スタチン系薬剤の濃度は細胞毒性が認められる１Ｅ−４Ｍ より低濃度で、ｅＮＯＳ遺伝子発現亢進が認められる１Ｅ−１０Ｍ以上が好ましい。さらには細胞毒性が認められない１Ｅ−５Ｍ 以下で、ｅＮＯＳ遺伝子発現亢進が認められ且つＶＥＧＦ、ＦＬＴ１、ｃ−Ｍｅｔ 遺伝子の発現が抑制される１Ｅ−７Ｍ 以上がさらに好ましい。
【００２１】
本発明の「防止剤」は、対象患者の症状を治癒するかまたは少なくとも部分的に治癒するために使用される。本発明の「防止剤」は、症状が生じてから治療目的に使用することができ、また発症が予測される時に発症時の症状緩和のために予防目的に使用することができる。
【００２２】
本発明は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を含有することを特徴とする腹膜透析液を提供する。腹膜透析液は腹腔内に貯留される浸透圧の高い溶液であり、生体内の余分な水と老廃物等の溶質を取り除くことを目的とする。本発明の腹膜透析液において、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤は腹膜透析液の目的を妨げないことを前提として、腹膜透析液に含有される。腹膜透析液中に含まれる有効成分の量は、特に限定されないが、１Ｅ−４Ｍ 〜１Ｅ−１０Ｍが好ましく、１Ｅ−５Ｍ 〜１Ｅ−７Ｍ がさらに好ましい。腹膜透析液の組成は、特に限定されず、通常知られているものが使用できる。例えば、１３５ｍＥｑ／Ｌ Ｎａ 、２．５ｍＥｑ／Ｌ（もしくは４ｍＥｑ／Ｌ）Ｃａ、０．５ｍＥｑ／Ｌ Ｍｇ 、９８ｍＥｑ／Ｌ Ｃｌ、４０ｍＥｑ／Ｌ 乳酸、２．５ｇ／ｄｌ （もしくは１．３５ｇ／ｄｌまたは４ｇ／ｄｌ ）Ｇｌｕｃｏｓｅ の透析溶液（ｐＨ６．３ 〜７．３ ）を使用することができる。製造は、Ｇｌｕｃｏｓｅ と乳酸ナトリウムを混合した溶液（ｐＨ５．０ ）と、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２ 、乳酸ナトリウムを混合した液（ｐＨはＮａＣｌでｐＨ９．０ に調整） をそれぞれ高圧蒸気加熱滅菌した後、使用直前に４：１の割合で混合して使用するが、本発明の腹膜透析液では、混合方法は限定されないが、例えばＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を、１Ｅ−４Ｍ 〜１Ｅ−１０Ｍの濃度で使用直前の両液の混合時に混合してもよいし、一方の溶液に予め混合しておいてもよい。
【００２３】
本発明は、また、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を含有することを特徴とする透析効率の作用増強剤を提供する。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤は透析時に透析液に含有されることにより、腹膜の劣化や損傷の予防および／または治療、あるいは腹膜機能低下、腹膜透過性亢進の抑制および／または腹膜限外濾過能低下の予防および／または防止の効果を発揮し、それによって透析効率の作用を増強する。本発明の作用増強剤は、本明細書に開示された量のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を、患者に適宜直接投与したり、腹膜透析液に含有させることにより使用される。
【００２４】
【実施例】
以下に本発明の具体例である実施例を示し、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２５】
実施例１ ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤血管内皮細胞毒性試験
血管内皮細胞に対する毒性は、培養上清中の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ ）濃度を測定することにより検討した。すなわち、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤が血管内皮細胞に毒性を示す場合、細胞の生存に必須なＬＤＨ が細胞内から培養外に放出され、培養上清中のＬＤＨ 濃度が上昇する。
ヒト血管内皮細胞を、９６ｗｅｌｌプレート（ファルコン、ＵＳＡ ）に７０％コンフルエントになるように蒔き（９０００ ｃｅｌｌｓ／ ｗｅｌｌ 、ｎ＝３）、ＣＯ２ インキュベーター（ＥＳＰＥＣ ＢＮＡ−１２１Ｄ：ＴＡＢＡＩ 社）中で３７℃、５％ ＣＯ２存在条件下で５％牛胎児血清／ＥＧＭ−２ＭＶ Ｍｅｄｉｕｍ （ＢｉｏＷｈｉｔａｋｅｒ， ＵＳＡ）中で２４時間培養した。 培養終了後１％牛胎児血清／ＥＧＭ−２ＭＶ Ｍｅｄｉｕｍ で細胞を洗浄した後、１Ｅ−４〜１Ｅ−１１Ｍのシンバスタチン（和光純薬製）を含む１％牛胎児血清／ＥＧＭ−２ＭＶ Ｍｅｄｉｕｍ 培地（１００ μｌ ）を細胞に添加し、２４時間培養した。培養終了後、培養上清を採取し、遠心分離により細胞を除去して上清を回収した。８０μｌの上清に等量のＬＤＨ 試験液（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ （ＬＤＨ）、ロッシュ社）を加え、約３０分間発色反応を行った後、１Ｎ塩酸で発色反応を停止させ、４９２／６２０ ｎｍで吸光度を測定した。
その結果、１Ｅ−４Ｍ 以上の濃度のシンバスタチンで血管内皮細胞に対して毒性があることが明らかとなった。スタチンによる血管内皮細胞に対する細胞毒性の評価結果を図１に示す。この結果から、該当薬剤の濃度が１Ｅ−４Ｍ 未満になるようにコントロールすることが望ましい。
【００２６】
実施例２ ＲＴ−ＰＣＲ 法による血管内皮細胞の遺伝子発現解析
シンバスタチンのＮＯ産生誘導作用を調べるため、ＮＯ合成酵素であるｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ＮＯ ｓｙｎｔｈａｓｅ （ｅＮＯＳ）遺伝子発現に対する影響を検討した。 また、シンバスタチンの血管透過性亢進作用および血管新生作用を調べる為、血管新生因子であるｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）とそのレセプターであるｆｌｋ−１ 、ｆｌｔ−１ 、およびｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ ）のレセプターであるｃ−ｍｅｔ の遺伝子発現に対する影響を検討した。
【００２７】
ヒト血管内皮細胞を、１２ｗｅｌｌプレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， ＮＪ， ＵＳＡ ）に８０％コンフルエントになるように蒔き、ＣＯ２ インキュベーター中で３７℃、５％ ＣＯ２存在条件下で２４時間培養した。 シンバスタチン（１Ｅ−４〜１Ｅ−１３Ｍ）を含む培地に交換してさらに２４時間培養した後、内皮細胞の遺伝子発現を解析した。
培養上清を取捨した後、ＲＮｅａｓｙ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ， Ｈｉｌｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡ を調製した。分離したＲＮＡ の濃度はＧｅｎｅＱｕａｎｔ ＤＮＡ／ＲＮＡ ｃａｌｉｃｕｌａｔｏｒ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｄ．， Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ， ＵＫ）により測定した。 ＲＮＡ（５μｇ）は ２００ ｕｎｉｔｓの Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ （ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ， ＵＳＡ）により逆転写反応を行った。得られたｃＤＮＡはＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ Ｃｏ．， Ｌｔｄ， Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）により、サーマルサイクラー ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ＵＳＡ）でＰｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ （ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲ の条件は以下の通りである。予備熱変性：９４℃、５分、熱変性：９４℃、１分、アニーリング：６０℃、１分、伸長反応：７２℃、１分。ＰＣＲ プライマー配列及びＰＣＲ の好適サイクル数を以下に示した。
【００２８】
ｅＮＯＳ ｓｅｎｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１ ） （配列番号１）
ｅＮＯＳ ａｎｔｉｓｅｎｃｅ ｐｒｉｍｅｒ； ３２ｃｙｃｌｅｓ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２ ） （配列番号２）
ＶＥＧＦ ｓｅｎｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３ ） （配列番号３）
ＶＥＧＦ ａｎｔｉｓｅｎｃｅ ｐｒｉｍｅｒ； ３５ｃｙｃｌｅｓ， （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４ ） （配列番号４）
ＦＬＫ−１ ｓｅｎｓｅ ｐｒｉｍｅｒ （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５ ） （配列番号５）
ＦＬＫ−１ ａｎｔｉｓｅｎｃｅ ｐｒｉｍｅｒ； ２５ｃｙｃｌｅｓ，（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６ ） （配列番号６）
ＦＬＴ−１ ｓｅｎｓｅ ｐｒｉｍｅｒ （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７ ） （配列番号７）
ＦＬＴ−１ ａｎｔｉｓｅｎｃｅ ｐｒｉｍｅｒ； ３１ｃｙｃｌｅｓ， （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８ ） （配列番号８）
Ｃ−Ｍｅｔ ｓｅｎｓｅ ｐｒｉｍｅｒ （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９ ） （配列番号９）
Ｃ−Ｍｅｔ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｐｒｉｍｅｒ； ２８ｃｙｃｌｅｓ，（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０） （配列番号１０）
Ｇ３ＰＤＨ ｓｅｎｓｅ ｐｒｉｍｅｒ （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１） （配列番号１１）
Ｇ３ＰＤＨ ａｎｔｉｓｅｎｃｅ ｐｒｉｍｅｒ； ２２ ｃｙｃｌｅｓ． （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２） （配列番号１２）
【００２９】
内部標準マーカーはｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ （Ｇ３ＰＤＨ）を使用した。ＰＣＲ 産物は ＴＡＥ緩衝液（０．０４Ｍ Ｔｒｉｓ， ０．０４Ｍ ｇｌａｃｉａｌ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ， ０．００１Ｍ ＥＤＴＡ）を用いて１．５％アガロースゲル中でサブマリン電気泳動を行った。泳動終了後、ゲルをエチジウムブロマイド溶液に浸して約１０分間振盪し、ゲル中のＰＣＲ 産物を染色して解析した。
この結果を表１に示す。 ＮＯ合成酵素であるｅＮＯＳは、シンバスタチンの濃度が１Ｅ−１０Ｍ以上で遺伝子発現が亢進し、ＶＥＧＦおよびｆｌｔ−１ 、ｃ−ｍｅｔ の遺伝子発現は１Ｅ−７Ｍ 以上の濃度で抑制された。 ｆｌｋ−１ に関しては、シンバスタチンの効果は認められなかった。
【００３０】
【表１】
【００３１】
内皮細胞の最も重要な機能の一つとしてＮＯ産生がある。 ＮＯは内皮細胞の機能改善や血管拡張機能、血小板凝集阻害、血栓形成抑制、単球をはじめとする炎症細胞の血管壁内への浸潤抑制機能を有する。特に血管拡張機能は血流量の増加をもたらし、透析効率のアップに繋がる。従ってＮＯ産生の亢進によって腹膜機能低下の防止が期待される。 今回、ＮＯ合成酵素であるｅＮＯＳが、１Ｅ−１０Ｍ以上のシンバスタチンで遺伝子発現が亢進したことから、この濃度領域で腹膜機能低下防止効果が期待された。
【００３２】
血管新生時には血管組織の再構築が起きるため、血管での透過性が亢進し、浸透圧調節物質であるグルコースの生体への吸収が促進され、腹膜機能の低下が生じると考えられる。 血管新生因子としてＶａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ （ＶＥＧＦ） とＨｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ （ＨＧＦ）が知られている。このうちＨＧＦ は内皮細胞から産生されないので、ＶＥＧＦとそのレセプターであるｆｌｔ−１ 、ｆｌｋ−１ 、およびＨＧＦ のレセプターであるｃ−ｍｅｔ の発現に対するシンバスタチンの効果を解析した。 この結果、シンバスタチンはｆｌｋ−１ の発現に対する作用は認められなかったが、ＶＥＧＦ、ｆｌｔ−１ 、ｃ−ｍｅｔ の発現を抑制した。 ＶＥＧＦは転写因子であるＮＦ−κＢ の活性化により産生が誘導される。ＮＯはＮＦ−κＢ の活性を抑制するという報告も有り、シンバスタチンによるＶＥＧＦの発現抑制はＮＯによるＮＦ−κＢ 抑制を介して行われていると考えられる。ＶＥＧＦは血管新生を促進するだけでなく、エンドセリンの発現を促進する。 エンドセリンは内皮障害や平滑筋細胞の増殖を促し、血管の狭窄を引き起こし、腹膜機能の低下を誘導すると考えられる。また、ＶＥＧＦは血管の透過性を亢進する作用も有している。 これらの点を考慮すると、シンバスタチンが、１Ｅ−７Ｍ 以上の濃度でＶＥＧＦおよびｆｌｔ−１ 、ｃ−ｍｅｔ の遺伝子発現を抑制したことから、シンバスタチンが１Ｅ−７Ｍ 以上の濃度で、血管新生抑制やエンドセリン発現抑制、血管透過性の抑制を介して腹膜機能低下防止効果を発揮すると期待された。
【００３３】
実施例３ 腹膜機能低下動物モデルの作成
動物はラット（ＳＤ、５週齡、ｎ＝４ 、オス） を用いた。本実験中、ラットには餌および水を十分量供給し、衛生環境にも十分留意し、細菌感染による腹膜炎が起きないように注意した。コントロール群にはｐＨ５．０ に調整した２．５ ％グルコース含有透析溶液ミッドペリックＬ２５０（テルモ社）を１ 回／ 日、１００ｍｌ／ｋｇずつ１５日間投与した。ＭＧＯ 群（メチルグリオキサール投与群）には、ｐＨ５．０ に調整したミッドペリックＬ２５０（テルモ社）に６．６ｍＭ メチルグリオキサールを添加したものを１ 回／日、１００ｍｌ／ｋｇずつ１５日間投与した。スタチン投与群にはｐＨ５．０ に調整したミッドペリックＬ２５０（テルモ社）に６．６ｍＭ メチルグリオキサールおよびシンバスタチンを添加したものを１回／日、１００ｍｌ／ｋｇずつ１５日間投与した。上記検体の投与はエーテル痲酔させた状態で行い、なるべくラットに苦痛を与えない様に配慮した。
【００３４】
実施例４ 腹膜機能低下動物モデルにおける限外濾過能試験
腹膜機能低下動物モデルの限外濾過能を解析する為、ラットに対して実験開始後１６日目に限外濾過能試験を行った。即ち、ラットに対し体重あたり５０ｍｌ／ｋｇ の２．５ ％グルコース含有透析溶液（ミッドペリックＬ２５０、テルモ社）を腹腔内に注液し、９０分後に排液量を測定した。 排液量はラットの体重で除して体重あたりの排液量を算出した。 この結果を図２に示した。 体重あたりの排液量は、コントロール群に比べＭＧＯ 群で体重あたりの排液量が減少し、スタチン投与によって排液量の減少が防止されることがわかった。以上の結果から、スタチンは限外濾過能の低下を防止することが明らかになった。
【００３５】
実施例５ 腹膜機能低下動物モデルにおける腹膜透過性試験
腹膜機能低下動物モデルに対して、腹膜透過性を解析する為、実験開始後１６日目に腹膜透過性試験を行った。腹膜における透過性試験は腹膜におけるグルコース透過性、即ちＤ／Ｄ０グルコース値にて評価した。
Ｄ／Ｄ０グルコース値は以下のようにして求めた。ラットに対し体重あたり５０ｍｌ／ｋｇ の２．５ ％グルコース含有透析溶液（ミッドペリックＬ２５０、テルモ社）を腹腔内に注液し、９０分後に腹腔内残液を採取した。各透析排液のグルコース濃度（Ｄ） を求め、投与時の透析溶液中のグルコース濃度（Ｄ０） で除することによりＤ／Ｄ０グルコース値を算出した。この結果、ＭＧＯ 群はコントロール群に比べて著しくＤ／Ｄ０値が低下し、浸透圧調整物質であるグルコースの生体側への透過性が亢進されたが、スタチン投与により腹膜機能が改善されることが明らかになった。スタチン濃度は１Ｅ−５Ｍ より１Ｅ−７Ｍ の方が透過性亢進防止作用が高かった。 この結果を図３に示した。以上の結果より、スタチンは腹膜における透過性の亢進を防止することが明らかになった。
【００３６】
【発明の効果】
本発明の製剤は、腹膜透析における腹膜劣化の防止効果を有する。さらに詳しくは腹膜の機能低下の防止、腹膜における透過性亢進の抑制および腹膜限外濾過能低下の防止効果を有する。本発明により、腹膜劣化の低下を抑制、防止して溶質除去不全を防止し、長期にわたる健全な腹膜透析の施行が可能となる。
【００３７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の腹膜機能低下防止剤の血管内皮細胞に対する細胞毒性を示すグラフである。
【図２】本発明の腹膜機能低下防止剤の腹膜機能低下動物モデルにおける限外濾過能低下防止効果を示すグラフである。
【図３】本発明の腹膜機能低下防止剤の腹膜機能低下動物モデルにおける腹膜透過性亢進抑制効果を示すグラフである。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to an agent for preventing peritoneal deterioration in peritoneal dialysis. The present invention also relates to the prevention of peritoneal dysfunction in peritoneal dialysis, the suppression of peritoneal permeability enhancement, or the prevention of reduction in ultrafiltration ability. Further, the present invention relates to a peritoneal dialysate containing a peritoneal deterioration inhibitor.
[0002]
[Prior art]
Artificial dialysis is a blood purification therapy that replaces the kidneys for blood purification that the kidneys originally perform for patients with reduced or lost renal function.The body fluid is kept constant by removing water from the body. Its main purpose is to maintain and remove solutes such as waste products such as urea in body fluids. Current artificial dialysis mainly includes hemodialysis therapy and peritoneal dialysis therapy.
[0003]
Peritoneal dialysis therapy is based on removing a solute such as excess water and waste products from a living body by storing a dialysate having a high osmotic pressure in the peritoneal cavity surrounded by the peritoneum. That is, dialysis is performed by transferring water and solutes from a body fluid to a dialysis solution stored in the peritoneal cavity. The movement of water or solute at this time is caused by an osmotic pressure difference generated between the dialysis solution and the body fluid through the microvessels. The osmolyte in the dialysis solution is glucose, which is the basis of the driving force for peritoneal dialysis. That is, in order to maintain the peritoneal function, it is important that the microvessels function normally and prevent permeation of glucose and the like into the living body.
[0004]
However, since the dialysis solution has a high osmotic pressure, contains a highly cytotoxic glucose decomposition product (hereinafter abbreviated as GDP), and has a low pH, repeated storage of the dialysis solution in the peritoneal cavity causes the peritoneum to become non-physiological. And the peritoneum is susceptible to injury. In this case, peritoneal myofibroblasts / fibroblasts are abnormally proliferated and migrate with angiogenesis, and the peritoneal tissue is often destroyed. At the time of angiogenesis, remodeling of the vascular constituent tissue occurs, so that unlike normal vascular tissue, the permeability of blood vessels is enhanced. Further, vascular endothelial cells are damaged, and peritoneal microvessels having ultrafiltration ability are broken. As a result, the absorption of glucose, which is an osmotic pressure regulating substance in the dialysate, into the living body is promoted, so that the osmotic pressure cannot be maintained and the dialysis efficiency is reduced. That is, a decrease in peritoneal function occurs, resulting in insufficient ultrafiltration and insufficient solute removal.
[0005]
If the decrease in peritoneal function is mild, peritoneal dialysis can be continued by using a high osmotic pressure peritoneal dialysate having a high glucose concentration. However, such a dialysate contains a high concentration of GDP, and the load on the peritoneum is increased due to the high osmotic pressure. Therefore, there is a concern that the deterioration of peritoneal function may be further accelerated. If the peritoneal function deteriorates significantly and the solute removal deficiency occurs, there is no effective therapeutic agent or inhibitor for it, and the continuation of peritoneal dialysis therapy must be abandoned.
[0006]
3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA (3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A) (HMG-CoA) reductase is a rate-limiting enzyme when cholesterol is synthesized in the liver, and HMG-CoA is converted to mevalonic acid. Convert to Statin drugs such as simvastatin are known as HMG-CoA reductase inhibitors that inhibit cholesterol synthesis. Statins antagonistically inhibit HMG-CoA reductase and have the effect of lowering blood LDL-cholesterol. Conventionally, statins have been used as inhibitors of cardiovascular events such as coronary heart disease and cerebrovascular disease due to their lipid metabolism inhibitory action. However, compared to lowering blood cholesterol due to dietary restrictions, statins have a stronger inhibitory effect on arteriosclerosis, and statin administration lowers the total cholesterol lowering rate and lowers the inflammatory marker CRP (C-reactive protein). It turns out that there is no correlation. This suggests that statins prevent cardiovascular events by actions other than lipid metabolism, so-called pleotropic (pleiotropic) actions.
[0007]
Pleiotropic effects of statins include, for example, a smooth muscle cell growth inhibitory effect (Negue-Amimu et al. Biochem Biophy Acta. 1345: 259-268, 1997), and an adhesion inhibitory effect of monocytes on vascular endothelial cells (Meroni PL, Ras). E, Testoni C, Tincani A, Balestrieri G, Molteni R, Khamashta MA, Tremoli E, Camera M. Arthritis Rheum 44 (12): 2870-8, 2001, matrix metalloprotease, a metalloprotease of a matrixase Sugiyama S, Vogic SJ, Fukumoto Y, Furukawa Y, Shiomi M, Sc hoen FJ, Libby P. Circulation 103 (2): 276-283, 2001), reduction of oxidative stress (Giroux LM, Davignon J, Naruszewicz M. Biochim Biophys Acta, 1935, 335: 1335). Effects such as an inflammatory effect (Kiener PA, Davis PM, Murray JL, Youssef S, Rankin BM, Kowala M. Int Immunopharmacol 1 (1): 105-18, 2001) and the like have been reported.
[0008]
Statins also improve the function of endothelial cells and promote the production of nitric oxide (NO) at the same time (Laufs U, La Fata V, Plutzky J, Liao JK. Circulation 97 (12): 1129-35). 1998) have also been reported. NO production is not only the most important function of endothelial cells, but also NO improves the function of damaged endothelial cells and promotes endothelialization of vascular walls from which endothelial cells have fallen off. In addition, NO also inhibits the proliferation and migration of smooth muscle cells, and thus prevents thickening of the blood vessel wall.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a drug useful for preventing a decrease in peritoneal function in peritoneal dialysis. It has been expected that inventing a drug that suppresses a decrease in peritoneal function and prevents insufficiency of solute removal will enable long-term healthy peritoneal dialysis, but no drug having such a function is known.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
The present inventor has tried to adapt a HMG-CoA reductase inhibitor to peritoneal dialysis, and found that the HMG-CoA reductase inhibitor has an effect of suppressing a decrease in peritoneal function. Therefore, the present invention is intended to prevent peritoneal deterioration by preventing peritoneal deterioration, suppressing peritoneal permeability increase, and preventing incomplete removal of solutes, thereby enabling long-term healthy peritoneal dialysis. To provide an agent.
The present invention is achieved by the following (1) to (10).
(1) A peritoneal deterioration inhibitor comprising an HMG-CoA reductase inhibitor as an active ingredient.
(2) The peritoneal deterioration inhibitor according to the above (1), wherein the HMG-CoA reductase inhibitor is a statin drug.
(3) The peritoneal degradation inhibitor according to the above (2), wherein the statin drug is at least one drug selected from the group consisting of simvastatin, cerivastatin, pitavastatin, lovastatin, atorvastatin, fluvastatin, pravastatin and salts thereof.
[0011]
(4) The peritoneal deterioration inhibitor according to the above (3), wherein the statin drug is simvastatin.
(5) The peritoneal deterioration inhibitor according to any one of (1) to (4), wherein the prevention of peritoneal deterioration is prevention of peritoneal function deterioration, suppression of peritoneal permeability increase, and / or prevention of peritoneal ultrafiltration ability reduction.
(6) A peritoneal dialysis solution containing an HMG-CoA reductase inhibitor.
(7) A dialysis efficiency enhancer comprising an HMG-CoA reductase inhibitor.
(8) Use of an HMG-CoA reductase inhibitor for producing a peritoneal deterioration inhibitor.
(9) A method for preventing and / or treating peritoneal deterioration, which comprises administering an effective amount of the above (1) to a host in a prophylactically and / or therapeutically effective amount.
(10) A method for preventing and / or preventing a decrease in peritoneal function, an increase in peritoneal permeability and / or a decrease in peritoneal ultrafiltration ability, comprising administering an effective amount of the above (1) to a host.
[0012]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The present invention provides a peritoneal deterioration inhibitor containing an HMG-CoA reductase inhibitor as an active ingredient. “Peritoneal deterioration” means a state in which a decrease in peritoneal function causes a decrease in peritoneal function, an increase in peritoneal permeability, a decrease in ultrafiltration, and the like. Therefore, "prevention of peritoneal degradation" means a decrease in peritoneal function, an increase in peritoneal permeability, a decrease in the amount of peritoneal ultrafiltration, or at least one progression is temporarily or continuously slowed down or stopped or Or to improve.
[0013]
“Peritoneal function” refers to the permeability of a solute and the ultrafiltration function in the peritoneum. "Permeability in the peritoneum (peritoneal permeability)" means that the solute permeates through the peritoneum. Therefore, "suppression of the enhancement of peritoneal permeability" may mean temporarily or continuously reducing the permeate permeation rate of the solute, or zero permeation rate. It also includes improving dialysis efficiency in peritoneal dialysis by reducing peritoneal permeability.
The "peritoneal ultrafiltration volume" is the difference between the amount of water passing through the peritoneum and the amount of water reabsorbed from lymphatic vessels, and is determined by examining the amount of drainage after storing dialysate in the peritoneal cavity for a certain period of time. Can be determined. Therefore, "preventing a decrease in the peritoneal ultrafiltration amount" may mean temporarily or continuously delaying the decrease in the ultrafiltration amount through the peritoneum, or reducing the decrease in the ultrafiltration amount to zero. May be. It also includes improving peritoneal ultrafiltration.
[0014]
The peritoneal deterioration inhibitor of the present invention is abbreviated as “inhibitor” in the present invention. Furthermore, the "inhibitor" of the present invention has the above-mentioned action, and thus can be used for prevention and / or treatment of peritoneal deterioration and damage. The term “prevention” as used herein includes a state in which the inhibitor of the present invention is used in a state in which a decrease in peritoneal function is not observed when performing peritoneal dialysis, thereby preventing a decrease in peritoneal function.
The “HMG-CoA reductase inhibitor” used in the present invention is a reaction catalytic enzyme when HMG-CoA is converted to mevalonic acid in a mevalonate metabolic pathway in the process of cholesterol synthesis from acetic acid. It is a competitive inhibitor of HMG-CoA reductase. HMG-CoA reductase inhibitors include, but are not limited to, statin drugs.
[0015]
The statin drug used in the present invention is not particularly limited as long as it has a peritoneal dialysis prevention effect and / or a peritoneal permeability increase suppression effect in peritoneal dialysis, and simvastatin (Wako Pure Chemical), cerivastatin (Takeda Pharmaceutical, Bayer) ), Pitavastatin (Sankyo), lovastatin (Wako Pure Chemical), atorvastatin (Pfizer), fluvastatin (Wako Pure Chemical), pravastatin (Wako Pure Chemical) and their sodium salts (pravastatin Na), calcium salts (altovastatin Ca) )), And simvastatin is particularly preferred. Furthermore, the structure of the statin drug compound is not limited as long as the other statin drugs also have the above-described effects. That is, if it is a statin drug having the above-mentioned effects, a similar effect can be obtained by modifying some of the functional groups in its structure, substituting with other functional groups and / or adding functional groups. Derivatives are also included. For this reason, a statin drug in the present specification is a compound having HMG-CoA reductase inhibitory activity, including all or a part thereof, or all of its variants, derivatives, mutants, analogs and the like.
[0016]
In the present invention, the HMG-CoA reductase inhibitor or statin drug which is an active ingredient may be used alone or in combination of two or more compounds.
The synthesis and / or preparation method of the statin compound used in the present invention is not particularly limited as long as it has a purity that does not cause a problem as a pharmaceutical. Most statins are synthesized by fermentation of microorganisms, but some are produced by semi-chemical synthesis derived from natural substances synthesized by microorganisms or by complete chemical synthesis. Each statin can be easily produced according to the following known methods. Simvastatin: JP-A-56-122375 (US Pat. No. 4,444,784), cerivastatin: JP-A-4-308573 (EP4912226), pitavastatin: JP-A-1-279866 (USP585854259 and USP58585636), lovastatin: JP-A-57-163374 (USP4231938) ), Atorvastatin: JP-A-3-58967 (US Pat. No. 5,273,995), fluvastatin: JP-T-60-500015 (US Pat. No. 4,739,073), and pravastatin: JP-A-57-2240 (US Pat. No. 4,346,227). The effect of preventing peritoneal deterioration, such as the effect of preventing peritoneal function deterioration, the effect of suppressing peritoneal hyperpermeability, and / or the effect of reducing peritoneal ultrafiltration ability, can be confirmed by using the animal model described in Examples. Then, it can be used for this invention by isolating and refine | purifying by a method usually used.
[0017]
The method for preparing the "inhibitor" of the present invention is not particularly limited, but it can be used as the "inhibitor" by dissolving in an appropriate solution, sterilizing by filtration with a filter or the like, and directly encapsulating in a sterile container. The "inhibitor" of the present invention may contain pharmaceutically acceptable additives depending on the administration route. The additives are not particularly limited, and include carriers, excipients, preservatives, stabilizers, binders, antioxidants, leavening agents, isotonic agents, solubilizing agents, preservatives, buffers, diluents, and the like. Can be The additives that can be used are not particularly limited. For example, water, physiological saline, a pharmaceutically acceptable organic solvent, gelatin, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium carboxymethylcellulose, polyacrylic acid Sodium, sodium alginate, water-soluble dextran, sodium carboxymethyl starch, pectin, methylcellulose, ethylcellulose, xanthan gum, gum arabic, tragacanth, casein, agar, diglycerin, propylene glycol, polyethylene glycol, petrolatum, paraffin, stearyl alcohol, stearic acid, Human serum albumin (HSA), mannitol, sorbitol, lactose, PBS, nonionic surfactant, biodegradable polymer , Serum-free medium, such as a buffer at physiological pH acceptable in the pharmaceutical additives acceptable surfactant or in vivo as can be mentioned. The carrier to be used is appropriately selected from the above or in combination depending on the site to be used, but is not limited thereto. The method for storing the "inhibitor" of the present invention is not particularly limited, but may be freeze-dried after sealing in a suitable container. Freeze-drying allows long-term storage. After drying, it may be formed into tablets.
[0018]
In the present invention, the term "prevention" includes a state in which the inhibitor of the present invention is used in a state in which a decrease in peritoneal function is observed when performing peritoneal dialysis, thereby preventing a further decrease in peritoneal function. . The “inhibitor” contains an HMG-CoA reductase inhibitor as an active ingredient. "Inhibitors" are used to prevent peritoneal deterioration. Therefore, the "inhibitor" of the present invention is intended to prevent and / or prevent and treat peritoneal deterioration, and to prevent peritoneal function deterioration, peritoneal permeability enhancement and / or peritoneal ultrafiltration capacity reduction. An effective amount can be administered to a host (patient) for and / or for prevention. The host to be administered is not particularly limited, but includes mammals, preferably humans, monkeys, rats, livestock, and the like. The "inhibitor" of the present invention is not limited in administration route as long as the effect of the present invention is efficiently exhibited in the affected part of the peritoneum, and can be administered orally or parenterally systemically or locally. The administration route can be selected from intraperitoneal administration, intravenous administration, oral administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, suppository, enema, oral enteric agent, etc., as appropriate according to the patient's age and symptoms. The method of administration can be selected. Of these, intraperitoneal administration, intravenous administration and oral administration are preferred.
[0019]
As a method of direct administration to the peritoneal cavity, it can be mixed with the peritoneal dialysis solution and administered intraperitoneally during peritoneal dialysis, or can be directly administered without mixing with the peritoneal dialysis solution via a peritoneal dialysis catheter. If administered by intravenous injection, it can also be administered without passing through a dialysis catheter. Oral administration allows ingestion without special equipment. If these methods are used, it is possible to deliver the "inhibitor" to the affected part in a minimally invasive manner and efficiently to the patient. If the "inhibitor" is administered intraperitoneally, it will be administered directly to the peritoneum, which is the affected area, and there is no loss until the active ingredient reaches the affected area after administration as in oral or intravenous injection. Therefore, the concentration of the active ingredient of the present invention can be prepared at the minimum optimal concentration effective in the peritoneum. That is, since it can be directly administered to the affected part at a necessary minimum concentration, it has the characteristic that there are few side effects.
[0020]
The effective dose of the "inhibitor" is not particularly limited, but a dose of 1 to 1000 mg, preferably 5 to 50 mg per patient can be selected. When the active ingredient is a statin drug, it is not particularly limited, but preferably 1E-4M to 1E-10M, more preferably 1E-5M to 1E-7M. Note that “E” is an exponential notation and means a number obtained by multiplying “10” by a minus. For example, "1E-4" becomes "10 -4 "And" 1E-10 "is" 10 -10 Means. In addition, "M" means "mol / L". Therefore, the concentration of the statin drug is preferably lower than 1E-4M at which cytotoxicity is observed, and 1E-10M or more at which eNOS gene expression is enhanced. Furthermore, 1E-5M or less, at which no cytotoxicity is observed, is more preferably 1E-7M or more, at which eNOS gene expression is enhanced and expression of VEGF, FLT1, and c-Met genes is suppressed.
[0021]
An "inhibitor" of the invention is used to cure or at least partially cure the condition of a subject patient. The "preventive agent" of the present invention can be used for therapeutic purposes after the onset of symptoms, and can also be used for prophylactic purposes to alleviate symptoms at the onset when the onset is predicted.
[0022]
The present invention provides a peritoneal dialysate containing an HMG-CoA reductase inhibitor. The peritoneal dialysate is a solution having a high osmotic pressure stored in the peritoneal cavity, and is intended to remove extra water and solutes such as waste products in the living body. In the peritoneal dialysate of the present invention, the HMG-CoA reductase inhibitor is contained in the peritoneal dialysate on the premise that it does not interfere with the purpose of the peritoneal dialysate. The amount of the active ingredient contained in the peritoneal dialysis solution is not particularly limited, but is preferably 1E-4M to 1E-10M, more preferably 1E-5M to 1E-7M. The composition of the peritoneal dialysis solution is not particularly limited, and a commonly known composition can be used. For example, 135 mEq / L Na, 2.5 mEq / L (or 4 mEq / L) Ca, 0.5 mEq / L Mg, 98 mEq / L Cl, 40 mEq / L lactic acid, 2.5 g / dl (or 1.35 g / dl or 4 g / dl) Glucose dialysis solution (pH 6.3-7.3) can be used. Production is performed by mixing a solution (pH 5.0) of a mixture of Glucose and sodium lactate with KCl, MgCl 2 And a mixture of sodium lactate (pH adjusted to pH 9.0 with NaCl) was sterilized by high-pressure steam heating, and then mixed and used at a ratio of 4: 1 immediately before use. However, in the peritoneal dialysis solution of the present invention, Although the mixing method is not limited, for example, the HMG-CoA reductase inhibitor may be mixed at a concentration of 1E-4M to 1E-10M at the time of mixing the two solutions immediately before use, or may be previously mixed with one solution. You may keep it.
[0023]
The present invention also provides a dialysis efficiency-enhancing agent comprising an HMG-CoA reductase inhibitor. The HMG-CoA reductase inhibitor is contained in the dialysate at the time of dialysis to prevent and / or treat peritoneal deterioration and damage, or to suppress peritoneal function, suppress peritoneal permeability enhancement, and / or peritoneal ultrafiltration ability. It exerts the effect of preventing and / or preventing reduction, thereby enhancing the effect of dialysis efficiency. The action enhancer of the present invention is used by appropriately administering the HMG-CoA reductase inhibitor in the amount disclosed in the present specification directly to a patient or by including it in a peritoneal dialysate.
[0024]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples which are specific examples of the present invention. However, the present invention is not limited to these Examples.
[0025]
Example 1 HMG-CoA reductase inhibitor vascular endothelial cytotoxicity test
Toxicity to vascular endothelial cells was examined by measuring lactate dehydrogenase (LDH) concentration in the culture supernatant. That is, when the HMG-CoA reductase inhibitor is toxic to vascular endothelial cells, LDH essential for cell survival is released from inside the cells to outside the culture, and the LDH concentration in the culture supernatant increases.
Human vascular endothelial cells were seeded on a 96-well plate (Falcon, USA) at 70% confluence (9000 cells / well, n = 3) and CO 2 37 ° C., 5% CO 2 in an incubator (ESPEC BNA-121D: TABAI) 2 The cells were cultured in 5% fetal calf serum / EGM-2MV Medium (BioWhittaker, USA) for 24 hours under the existing conditions. After completion of the culture, the cells were washed with 1% fetal bovine serum / EGM-2MV Medium, and then 1% fetal bovine serum / EGM-2MV Medium medium containing 1E-4 to 1E-11M simvastatin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) (100 μl) was added to the cells and cultured for 24 hours. After completion of the culture, the culture supernatant was collected, and the cells were removed by centrifugation to collect the supernatant. An equal volume of LDH test solution (Cytotoxicity Detection kit (LDH), Roche) was added to 80 μl of the supernatant, and the color reaction was performed for about 30 minutes. Then, the color reaction was stopped with 1N hydrochloric acid, and the absorbance was measured at 492/620 nm. Was measured.
As a result, it was revealed that simvastatin at a concentration of 1E-4M or more was toxic to vascular endothelial cells. FIG. 1 shows the results of evaluating the cytotoxicity of statins on vascular endothelial cells. From these results, it is desirable to control the concentration of the drug to be less than 1E-4M.
[0026]
Example 2 Gene Expression Analysis of Vascular Endothelial Cells by RT-PCR
In order to investigate the effect of simvastatin on inducing NO production, the effect of simvastatin on the expression of an endothelial NO synthase (eNOS) gene, which is a NO synthase, was examined. Further, in order to examine the vascular permeability enhancing action and the angiogenic action of simvastatin, vascular endothelial growth factor (VEGF), which is an angiogenic factor, and flk-1, flt-1, and hepatocyte growth factor (HGF), which are its receptors, were investigated. The effect of c-met, a receptor, on gene expression was examined.
[0027]
Human vascular endothelial cells were plated on a 12-well plate (Becton Dickinson, NJ, USA) at 80% confluence and 2 37 ° C, 5% CO in an incubator 2 The cells were cultured for 24 hours under the existing conditions. After the medium was replaced with a medium containing simvastatin (1E-4 to 1E-13M) and cultured for further 24 hours, the gene expression of endothelial cells was analyzed.
After discarding the culture supernatant, total RNA was prepared from the cells using RNeasy kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany). The concentration of the separated RNA was measured with a GeneQuant DNA / RNA calculator (Amersham Pharmacia Biotech Ltd., Little Chalfont, UK). The RNA (5 μg) was subjected to a reverse transcription reaction using 200 units of Superscript II reverse transcriptase (GIBCO BRL, Rockville, MD, USA). The obtained cDNA was subjected to thermal cycler GeneAmp PCR System 2400 (PE Biosystems, USA) using Taq DNA polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd., Tokyo, Japan) and a thermal cycler GeneAmp PCR System 2400 (PE Biosystems, USA). The conditions for PCR are as follows. Preliminary heat denaturation: 94 ° C, 5 minutes, heat denaturation: 94 ° C, 1 minute, annealing: 60 ° C, 1 minute, extension reaction: 72 ° C, 1 minute. The PCR primer sequences and the preferred number of cycles for PCR are shown below.
[0028]
eNOS sense primer (SEQ ID No. 1) (SEQ ID NO: 1)
eNOS antisense primer; 32 cycles (SEQ ID No. 2) (SEQ ID NO: 2)
VEGF sense primer (SEQ ID No. 3) (SEQ ID NO: 3)
VEGF antisense primer; 35 cycles, (SEQ ID No. 4) (SEQ ID NO: 4)
FLK-1 sense primer (SEQ ID No. 5) (SEQ ID NO: 5)
FLK-1 antisense primer; 25 cycles, (SEQ ID No. 6) (SEQ ID NO: 6)
FLT-1 sense primer (SEQ ID No. 7) (SEQ ID NO: 7)
FLT-1 antisense primer; 31cycles, (SEQ ID No. 8) (SEQ ID NO: 8)
C-Met sense primer (SEQ ID No. 9) (SEQ ID NO: 9)
C-Met antisense primer; 28 cycles, (SEQ ID No. 10) (SEQ ID NO: 10)
G3PDH sense primer (SEQ ID No. 11) (SEQ ID NO: 11)
G3PDH antisense primer; 22 cycles. (SEQ ID No. 12) (SEQ ID NO: 12)
[0029]
As the internal standard marker, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (G3PDH) was used. The PCR product was subjected to submarine electrophoresis in a 1.5% agarose gel using a TAE buffer (0.04 M Tris, 0.04 M Glacial Acidic Acid, 0.001 M EDTA). After the electrophoresis, the gel was immersed in an ethidium bromide solution and shaken for about 10 minutes, and the PCR products in the gel were stained and analyzed.
Table 1 shows the results. With respect to eNOS, which is a NO synthase, gene expression was enhanced when the concentration of simvastatin was 1E-10M or more, and the gene expression of VEGF, flt-1, and c-met was suppressed at a concentration of 1E-7M or more. No effect of simvastatin was observed on flk-1.
[0030]
[Table 1]
[0031]
One of the most important functions of endothelial cells is NO production. NO has a function of improving the function of endothelial cells, a function of vasodilating, inhibiting platelet aggregation, suppressing thrombus formation, and a function of inhibiting infiltration of inflammatory cells such as monocytes into the blood vessel wall. In particular, the vasodilator function causes an increase in blood flow, leading to an increase in dialysis efficiency. Therefore, prevention of a decrease in peritoneal function is expected by enhancing NO production. This time, since the gene expression of eNOS, which is a NO synthase, was enhanced by simvastatin of 1E-10M or more, the effect of preventing peritoneal function decline was expected in this concentration region.
[0032]
At the time of angiogenesis, vascular tissue is remodeled, so that permeability in blood vessels is enhanced, absorption of glucose, which is an osmotic pressure regulating substance, into the living body is promoted, and peritoneal function is considered to be reduced. Vascular endothelial growth factor (VEGF) and Hepatocyte growth factor (HGF) are known as angiogenic factors. Since HGF is not produced from endothelial cells, the effect of simvastatin on the expression of VEGF and its receptors flt-1, flk-1 and HGF receptor c-met was analyzed. As a result, simvastatin had no effect on the expression of flk-1, but suppressed the expression of VEGF, flt-1, and c-met. VEGF is induced by activation of the transcription factor NF-κB. It has been reported that NO suppresses the activity of NF-κB, and it is considered that the inhibition of VEGF expression by simvastatin is performed through the inhibition of NF-κB by NO. VEGF not only promotes angiogenesis but also promotes expression of endothelin. Endothelin is thought to promote endothelial damage and smooth muscle cell proliferation, cause stenosis of blood vessels, and induce a decrease in peritoneal function. VEGF also has the effect of enhancing vascular permeability. Considering these points, since simvastatin suppressed the expression of VEGF and flt-1 and c-met at a concentration of 1E-7M or more, simvastatin suppressed angiogenesis and endothelin at a concentration of 1E-7M or more. It was expected to exert an effect of preventing peritoneal function decline through suppression of expression and suppression of vascular permeability.
[0033]
Example 3 Creation of an animal model with reduced peritoneal function
The animals used were rats (SD, 5 weeks old, n = 4, male). During the experiment, the rats were supplied with a sufficient amount of food and water, paid due attention to the hygiene environment, and taken care not to cause peritonitis due to bacterial infection. To the control group, a dialysis solution Midperic L250 containing 2.5% glucose adjusted to pH 5.0 (Termo) was administered once a day at 100 ml / kg for 15 days. To the MGO group (methylglyoxal administration group), a mixture of 6.6 mM methylglyoxal added to Midperic L250 (Termo) adjusted to pH 5.0 was administered once a day at a rate of 100 ml / kg for 15 days. To the statin-administered group, a mixture obtained by adding 6.6 mM methylglyoxal and simvastatin to Midperic L250 (Termo) adjusted to pH 5.0 once / day, 100 ml / kg, was administered for 15 days. The administration of the above-mentioned specimen was performed in a state of ether anesthesia, and care was taken so as not to cause any pain to rats.
[0034]
Example 4 Ultrafiltration test in animal model with reduced peritoneal function
To analyze the ultrafiltration ability of the animal model with reduced peritoneal function, rats were subjected to an ultrafiltration ability test 16 days after the start of the experiment. That is, a dialysis solution containing 2.5% glucose (Midperic L250, Terumo) was injected intraperitoneally into rats at 50 ml / kg body weight, and the drainage volume was measured 90 minutes later. The amount of drainage was divided by the weight of the rat to calculate the amount of drainage per body weight. The result is shown in FIG. As for the drainage volume per body weight, it was found that the drainage volume per body weight was decreased in the MGO group as compared with the control group, and the statin administration prevented the drainage volume from decreasing. From the above results, it became clear that statins prevented a decrease in ultrafiltration ability.
[0035]
Example 5 Peritoneal permeability test in an animal model with reduced peritoneal function
In order to analyze the peritoneal permeability of the animal model with reduced peritoneal function, a peritoneal permeability test was performed 16 days after the start of the experiment. The permeability test in the peritoneum was evaluated based on the glucose permeability in the peritoneum, that is, the D / D0 glucose value.
The D / D0 glucose value was determined as follows. A dialysis solution (midperic L250, Terumo Corporation) containing 2.5% glucose at a weight of 50 ml / kg was injected into the peritoneal cavity of the rat, and after 90 minutes, the residual fluid in the peritoneal cavity was collected. The glucose concentration (D) of each dialysis effluent was determined, and the D / D0 glucose value was calculated by dividing by the glucose concentration (D0) in the dialysis solution at the time of administration. As a result, the D / D0 value was significantly reduced in the MGO group as compared with the control group, and the permeability of glucose, which is an osmotic pressure regulating substance, to the living body side was increased. Was revealed. The statin concentration of 1E-7M was higher than that of 1E-5M in preventing permeation enhancement. The result is shown in FIG. From the above results, it became clear that statins prevented the increase in permeability in the peritoneum.
[0036]
【The invention's effect】
The preparation of the present invention has an effect of preventing peritoneal deterioration in peritoneal dialysis. More specifically, it has an effect of preventing a decrease in peritoneal function, suppressing an increase in permeability in the peritoneum, and preventing a decrease in peritoneal ultrafiltration ability. ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, reduction of peritoneal deterioration is suppressed and prevented, solute removal deficiency is prevented, and long-term healthy peritoneal dialysis can be performed.
[0037]
[Sequence list]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing cytotoxicity of a peritoneal function lowering inhibitor of the present invention on vascular endothelial cells.
FIG. 2 is a graph showing the effect of the agent for preventing peritoneal dysfunction of the present invention on the reduction of ultrafiltration ability in a peritoneal dysfunction animal model.
FIG. 3 is a graph showing the effect of the inhibitor of peritoneal dysfunction of the present invention on peritoneal hyperpermeability in a peritoneal dysfunction animal model.
