【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、実験用や医療用に利用することができる軟骨様細胞、該軟骨様細胞の製造方法、および、該軟骨様細胞の製造に用いられる軟骨様細胞誘導用組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
再生医療は、従来の医療では対応しきれなかった不可逆的な臓器損傷を、幹細胞の旺盛な増殖・分化能を用いて克服しようとする新しい医療である。軟骨は再生能力が低く、変形性関節症や先天的軟骨欠損などの疾患は再生医療の大きなターゲットである。
軟骨形成に影響を与える因子のリストは、最近の研究で爆発的に増えている。軟骨の基質を構成する様々な蛋白や、細胞周期を制御する因子、シグナル伝達因子などの変異が、軟骨形成に大きな影響を与えることが知られている（非特許文献１参照）。
【０００３】
このように、現在、軟骨形成に影響を与える因子は数多く知られているが、これらの知見の多くは、これらの因子をノックアウトすると軟骨分化が起こらないというような、分化・増殖のいわゆる必要条件の決定にとどまっており、この因子があれば軟骨細胞に分化するというような、いわゆる十分条件を決定していない。軟骨の再生医療を実現するためには、軟骨の分化・増殖を思いのままに制御する技術が必要であり、従来の基礎研究の知見では、この目的には不十分である。
【０００４】
また、骨髄間葉系幹細胞では、ＴＧＦβ３およびＢＭＰ−２を発現させると、肥大軟骨および骨芽細胞への分化を抑えて、軟骨様細胞に分化誘導できることが知られている（非特許文献２参照）。しかし、このような、間葉系幹細胞などの幹細胞では、臨床応用に足るだけの量を確保するのが困難であるという難点がある。
【０００５】
一方、Ｓｏｘという転写因子は、前述の軟骨形成に影響を与える数多くの因子のなかのひとつである。Ｓｏｘ９遺伝子は軟骨やその前駆細胞で発現されており、また精巣、腎臓およびすい臓でも発現されている。Ｓｏｘ９遺伝子の変異は、軟骨異形成症及び精巣の異常を起こす。Ｓｏｘ９遺伝子のない細胞は、軟骨特有の遺伝子を発現することができない。Ｓｏｘ５および６遺伝子の変異も軟骨異形成症を起こし、Ｓｏｘ５遺伝子とＳｏｘ６遺伝子の複合変異では、さらに重篤な軟骨の異常がおきることが知られている（非特許文献３参照）。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｋａｒａｐｌｉｓ ＡＣ． Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｂｏｎｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ ａｎｄ ｅｎｄｏｃｈｏｎｄｒａｌ ｂｏｎｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｉｎ： Ｂｉｌｅｚｉｋｉａｎ ＪＰ， Ｒａｉｓｚ ＬＧ， Ｒｏｄａｎ ＧＡ， ｅｄｓ． Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｏｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ： Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ２００２：３３−５８．
【非特許文献２】
Ｓｅｋｉｙａ Ｉ， Ｖｕｏｒｉｓｔｏ ＪＴ， Ｌａｒｓｏｎ ＢＬ， Ｐｒｏｃｋｏｐ ＤＪ． Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｙ ｈｕｍａｎ ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａ ｄｅｆｉｎｅｓ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｅｎｔｓ ｄｕｒｉｎｇ ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２００２ Ａｐｒ ２；９９（７）：４３９７−４０２．
【非特許文献３】
ｄｅＣｒｏｍｂｒｕｇｇｈｅ Ｂ， Ｌｅｆｅｂｖｒｅ Ｖ， Ｎａｋａｓｈｉｍａ Ｋ． Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ａｎｄ ｂｏｎｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３：７２１−７２７， ２００１．
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、入手が容易な非軟骨細胞から効率よく軟骨様細胞を製造することができる軟骨様細胞の製造方法、実験用や医療用等に利用することができる軟骨様細胞、および軟骨様細胞誘導用組成物を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、無数の軟骨関連遺伝子の中からＳｏｘ遺伝子に着目し、Ｓｏｘ５、６および９遺伝子を様々に組み合わせて、自然の状態では軟骨分化能を全く持たないヒト皮膚線維芽細胞に遺伝子導入し、軟骨特有の遺伝子発現および基質蛋白産生で軟骨再生を判定した。その結果、Ｓｏｘ５、６および９遺伝子をそれぞれ単独で発現させても効果を示さなかったが、Ｓｏｘ５遺伝子およびＳｏｘ６遺伝子の少なくともいずれかと、Ｓｏｘ９遺伝子とを発現させると、他に特殊な因子等を用いることなく軟骨特有の形質を皮膚線維芽細胞に付与することができた。
【０００９】
本発明は、この新しい知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。
＜１＞ 非軟骨細胞を軟骨様細胞に誘導する工程を含むことを特徴とする軟骨様細胞の製造方法である。
＜２＞ 軟骨様細胞が、ＣＯＬ２Ａ１遺伝子、ＣＯＬ９Ａ１遺伝子、ＣＯＬ１１Ａ２遺伝子、Ａｇｇｒｅｃａｎ遺伝子、Ｍａｔｒｉｌｌｉｎ３遺伝子、およびＣｈｏｎｄｒｏｍｏｄｕｌｉｎ１遺伝子のうち少なくとも１つが、非軟骨細胞よりも高発現する細胞である前記＜１＞に記載の軟骨様細胞の製造方法である。
＜３＞ 非軟骨細胞が、非幹細胞である前記＜１＞および＜２＞のいずれかに記載の軟骨様細胞の製造方法である。
＜４＞ 非軟骨細胞が、間葉系細胞である前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の軟骨様細胞の製造方法である。
＜５＞ 非軟骨細胞が、線維芽細胞、脂肪細胞および筋肉細胞のいずれかである前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の軟骨様細胞の製造方法である。
＜６＞ 非軟骨細胞が、皮膚由来の細胞、皮下脂肪由来の細胞および筋肉由来の細胞のいずれかである前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の軟骨様細胞の製造方法である。
＜７＞ 非軟骨細胞を軟骨様細胞に誘導する工程が、非軟骨細胞に、Ｓｏｘ５遺伝子およびＳｏｘ６遺伝子の少なくともいずれかと、Ｓｏｘ９遺伝子とを発現させることを含む前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の軟骨様細胞の製造方法である。
＜８＞ 発現が遺伝子導入により行われる前記＜７＞に記載の軟骨様細胞の製造方法である。
＜９＞ 遺伝子導入がベクターにより行われる前記＜８＞に記載の軟骨様細胞の製造方法である。
＜１０＞ Ｓｏｘ５遺伝子の転写活性を高活性化する組成物およびＳｏｘ６遺伝子の転写活性を高活性化する組成物の少なくともいずれかと、Ｓｏｘ９遺伝子の転写活性を高活性化する組成物とを添加する前記＜７＞に記載の軟骨様細胞の製造方法である。
＜１１＞ 非軟骨細胞を軟骨様細胞に誘導する工程の少なくとも一部が、３次元培養およびペレット培養のいずれかにより行われる前記＜１＞から＜１０＞のいずれかに記載の軟骨様細胞の製造方法である。
＜１２＞ 非軟骨細胞に由来し、軟骨細胞様形質を有することを特徴とする軟骨様細胞である。
＜１３＞ 前記＜１＞から＜１１＞のいずれかに記載の軟骨様細胞の製造方法により製造される前記＜１２＞に記載の軟骨様細胞である。
＜１４＞ 軟骨を欠損した患部組織の、欠損部位の補填に用いられる前記＜１２＞および＜１３＞のいずれかに記載の軟骨様細胞である。
＜１５＞ 美容に用いられる前記＜１２＞および＜１３＞のいずれかに記載の軟骨様細胞である。
＜１６＞ Ｓｏｘ９遺伝子、Ｓｏｘ５遺伝子およびＳｏｘ６遺伝子の少なくともいずれかの遺伝子を発現するベクターからなることを特徴とする軟骨様細胞誘導用組成物である。
＜１７＞ Ｓｏｘ９遺伝子、Ｓｏｘ５遺伝子およびＳｏｘ６遺伝子の少なくともいずれかの転写活性を高活性化することを特徴とする軟骨様細胞誘導用組成物である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の軟骨様細胞の製造方法は、非軟骨細胞を軟骨様細胞に誘導する工程を含み、更に必要に応じて適宜選択したその他の工程を含む。
前記「軟骨様細胞」とは、ＣＯＬ２Ａ１遺伝子、ＣＯＬ９Ａ１遺伝子、ＣＯＬ１１Ａ２遺伝子、Ａｇｇｒｅｃａｎ遺伝子、Ｍａｔｒｉｌｌｉｎ３遺伝子、およびＣｈｏｎｄｒｏｍｏｄｕｌｉｎ１遺伝子のうち少なくとも１つが、非軟骨細胞よりも高発現する細胞をいう。前記ＣＯＬ２Ａ１遺伝子、前記ＣＯＬ９Ａ１遺伝子、前記ＣＯＬ１１Ａ２遺伝子、前記Ａｇｇｒｅｃａｎ遺伝子、前記Ｍａｔｒｉｌｌｉｎ３遺伝子、および前記Ｃｈｏｎｄｒｏｍｏｄｕｌｉｎ１遺伝子は、軟骨細胞で特徴的に発現する遺伝子であり、正常軟骨細胞のマーカーとして知られている。
【００１１】
ここで、「非軟骨細胞よりも高発現する」とは、軟骨様細胞が、少なくとも１時的に、前記軟骨細胞に特徴的に発現する遺伝子を発現し、軟骨細胞特異的なタンパク質を産生することを意味する。
また、前記軟骨細胞は軟骨に特徴的なタンパク質である軟骨基質を産生するため、トルイジンブルーによる染色で紫色に染まることが経験的に知られており、前記軟骨様細胞は、トルイジンブルーによる染色で紫色に染まる。
【００１２】
前記非軟骨細胞は、軟骨細胞以外の細胞であれば特に制限はなく、目的に合わせて適宜選択することができる。前記非軟骨細胞としては、軟骨細胞以外の間葉系細胞が好ましく、幹細胞である必要は無い。前記非軟骨細胞としては、例えば、皮膚線維芽細胞のような線維芽細胞、脂肪細胞および筋肉細胞などが挙げられ、由来する組織も、皮膚の他、胎盤、皮下脂肪および筋肉などが挙げられる。特に、皮膚由来の細胞は、軟骨芽細胞のような軟骨系の細胞と異なり、生体から得る場合でも、侵襲が軽微であるという利点がある。また、皮膚由来の細胞は、間葉系幹細胞などのように、臨床応用に足るだけの量を確保することが困難である細胞とは異なり、量的にも豊富であるという利点がある。また、間葉系幹細胞を用いた場合よりも、肥大軟骨や骨芽細胞への分化をさらに低く抑えられるという利点もある。このように広い範囲の細胞から材料を選択することができるということは、軟骨系の細胞や、間葉系幹細胞からしか軟骨様細胞を分化させることができない方法に比べて、目的に適合した材料を安定に入手する観点から極めて有利である。
【００１３】
また、軟骨は血管の少ない組織であるため、該軟骨様細胞を治療目的等に用いる場合であっても、「非軟骨細胞」は、必ずしも同一人から採取する必要は無く、目的に応じて、適宜選択することができる。
【００１４】
非軟骨細胞の軟骨様細胞への誘導は、非軟骨細胞に、Ｓｏｘ５遺伝子およびＳｏｘ６遺伝子の少なくともいずれかと、Ｓｏｘ９遺伝子とを発現させることにより行うことができる。すなわち、（１）Ｓｏｘ９遺伝子とＳｏｘ５遺伝子との組合せ、（２）Ｓｏｘ９遺伝子とＳｏｘ６遺伝子との組合せ、または、（３）Ｓｏｘ９遺伝子とＳｏｘ５遺伝子とＳｏｘ６遺伝子との組合せを、ひとつの細胞内で発現させることにより行うことができる。
前記発現には、ひとつの細胞内において前記２つまたは３つの遺伝子が発現する限りは、前記２つまたは３つの遺伝子を同時に発現させる場合の他、例えば先にＳｏｘ９遺伝子を発現させ、続いてＳｏｘ６遺伝子を発現させるというように、時間差がある場合であっても含まれる。
【００１５】
非軟骨細胞においては、Ｓｏｘ５、６、９遺伝子は殆ど発現していないため、これらの遺伝子を発現させるためには、Ｓｏｘ５、６、９遺伝子を遺伝子導入するか、Ｓｏｘ５、６、９遺伝子の転写活性を高活性化する組成物を添加するか、またはその両方を組に合わせることにより行うことができる。
【００１６】
遺伝子導入は、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、人工ウイルス等により行うことができ、ウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが挙げられる。
前記非ウイルスベクターとしては、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、カチオン性脂質等を用いたリポフェクション法などが挙げられる。
これらの中でも、導入効率および安全性を併せ持つ観点から、アデノウイルスベクターを用いることが好ましい。また、Ｓｏｘ５、６、９の遺伝子は、それぞれ別のベクターに組替えられていてもよいし、１つのベクターに２種以上が組替えられていてもよい。
【００１７】
一方、Ｓｏｘ５、６、９遺伝子の転写活性を高活性化する組成物を添加する方法としては、Ｓｏｘ５遺伝子の転写活性を高活性化する組成物およびＳｏｘ６遺伝子の転写活性を高活性化する組成物の少なくともいずれかと、Ｓｏｘ９遺伝子の転写活性を高活性化する組成物とを単体または複合体として添加することが挙げられる。
【００１８】
非軟骨細胞を軟骨様細胞に誘導する工程は、平面培養により行われてもよいが、該工程の少なくとも一部が、３次元培養およびペレット培養のいずれかにより行われることが、分化誘導が大きい観点から好ましい。特に、３次元培養によると、分化誘導の立ち上がりが早い点で有利である。
【００１９】
３次元培養は、コラーゲン、フィブリンおよびヒアルロン酸などの足場素材のゲルの上に、遺伝子導入前または後の細胞を乗せることにより行う。３Ｄコラーゲン細胞培養システム（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ，アメリカ合衆国）等の市販の３次元培養キットを用いることもできる。
ペレット培養は、平面培養した細胞を剥がして培養液中で軽く遠心して培養することにより、自然に丸くペレット状になって培養することができる。
【００２０】
本発明の軟骨様細胞の第一の態様は、非軟骨細胞に由来し、軟骨細胞様形質を有すること以外は特に制限はない。
該軟骨様形質とは、ＣＯＬ２Ａ１遺伝子、ＣＯＬ９Ａ１遺伝子、ＣＯＬ１１Ａ２遺伝子、Ａｇｇｒｅｃａｎ遺伝子、Ｍａｔｒｉｌｌｉｎ３遺伝子およびＣｈｏｎｄｒｏｍｏｄｕｌｉｎ１遺伝子のうち少なくとも１つが、少なくとも一度、非軟骨細胞よりも高発現する時期を有することである。また、前記軟骨様細胞は、トルイジンブルーによる染色で紫色に染まる性質を有する。
【００２１】
軟骨様細胞が由来する非軟骨細胞は、軟骨細胞以外の細胞から、目的に合わせて適宜選択することができる。非軟骨細胞は、前記軟骨様細胞の製造方法において述べたのと同様に、皮膚由来の細胞であることが好ましい。
本発明の軟骨様細胞は、前記軟骨様細胞の製造方法により製造されたことが好ましい。本発明の軟骨様細胞は、軟骨作動性薬物の評価やスクリーニング等の実験用として用いることができる。また、ヒトおよび動物の変形性関節症や、先天性軟骨欠損などの治療用として軟骨を欠損した患部組織の、欠損部位の補填に用いることができる。また、美容整形等の美容用の素材としても用いることができる。
【００２２】
本発明の軟骨様細胞誘導用組成物の第一の態様は、Ｓｏｘ９遺伝子、Ｓｏｘ５遺伝子およびＳｏｘ６遺伝子の少なくともいずれかの遺伝子を発現するベクターからなることを特徴とする。前述したように、これらのベクターは、単体で、または複合体として、軟骨様細胞の製造に用いることができる。
本発明の軟骨様細胞誘導用組成物の第二の態様は、Ｓｏｘ９遺伝子、Ｓｏｘ５遺伝子およびＳｏｘ６遺伝子の少なくともいずれかの転写活性を高活性化することを特徴とする組成物である。該軟骨様細胞誘導用組成物は、非軟骨細胞に単独で、または複合体として適量添加することにより、軟骨様細胞の製造に用いることができる。
【００２３】
【実施例】
（実施例１）
Ｓｏｘ５、６、９遺伝子の発現によるヒト皮膚線維芽細胞の軟骨分化誘導を軟骨特異的遺伝子の発現量で調べた。
ヒト皮膚線維芽細胞（ＤＦＢ）は、米国Ｃａｍｂｒｅｘ社より購入した。ＤＦＢは高グルコースＤＭＥＭ培地に５０ユニット／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１０％の牛胎児血清を加えた培地で維持培養した。
【００２４】
ヒトＳｏｘ５、６、９の全長ｃＤＮＡは、ヒト気管軟骨ｃＤＮＡ（米国クロンテック社より購入）を鋳型にしてポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）により増幅し、哺乳類の発現ベクター（ｐＥＧＦＰＣ１、ｐＥＧＦＰＣ２またはｐＳｈｕｔｔｌｅ、米国クロンテック社）に組み込んだ（図１）。ＰＣＲ増幅に用いたプライマーの配列およびＰＣＲ増幅の条件は以下の通りである。
Ｓｏｘ５（ｐＥＧＦＰＣ２）：センス ＡＧＧＡＴＧＴＣＴＴＣＣＡＡＧＣＧＡＣＣＡ（配列番号１）、アンチセンス ＧＡＴＧＡＡＣＣＡＧＴＴＡＧＧＧＣＴＴＣＴＴＴ（配列番号２）
ＰＣＲは変性９４℃、１分、アニーリング６２℃、４０秒、伸長７２℃、２分、３５サイクルで増幅。ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ（米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にＴＡクローニングした後、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯのＥｃｏＲＩ ｓｉｔｅで切り出して、ｐＥＧＦＰＣ２のＥｃｏＲＩ ｓｉｔｅにサブクローンした。
Ｓｏｘ６（ｐＥＧＦＰＣ１）：センス ＧＴＴＡＧＡＴＣＴ（ＢｇｌＩＩ ｓｉｔｅ）ＧＧＴＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＴＡＴＴＴＴＴ（配列番号３）、アンチセンス ＴＧＴＣＡＧＡＧＴＡＣＴＴＴＡＡＴＴＣＡＧＣＡＡＡＣＡ（配列番号４）
ＰＣＲは変性９４℃、１分、アニーリング６５℃、４０秒、伸長７２℃、３分、３５サイクルで増幅。ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯにＴＡクローニングした後、ＢｇｌＩＩとｐＣＲ２．１ＴＯＰＯのＥｃｏＲＩ ｓｉｔｅで切り出して、ｐＥＧＦＰＣ１のＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩ ｓｉｔｅにサブクローンした。
Ｓｏｘ９（ｐＥＧＦＰＣ１）：センス ＧＴＴＣＴＣＧＡＧ（ＸｈｏＩ ｓｉｔｅ）ＣＧＣＧＴＡＴＧＡＡＴＣＴＣＣＴＧＧＡＣ（配列番号５）、アンチセンス ＡＣＴＡＡＧＣＴＴ（ＨｉｎｄＩＩＩ ｓｉｔｅ）ＡＴＴＴＧＧＧＴＡＣＧＡＧＴＴＧＣＣＴＴＴ（配列番号６）
ＰＣＲは変性９４℃、１分、アニーリング６０℃、４０秒、伸長７２℃、２分、３５サイクルで増幅。ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯにＴＡクローニングした後、ＸｈｏＩ／ＨＩｎｄＩＩＩで切り出して、ｐＥＧＦＰＣ１のＸｈｏＩ／ＨＩｎｄＩＩＩにサブクローンした。
Ｓｏｘ５（ｐＳｈｕｔｔｌｅ）：センスＧＴＴＧＧＧＣＣＣ（ＡｐａＩ ｓｉｔｅ）ＡＧＧＡＴＧＴＣＴＴＣＣＡＡＧＣＧＡＣＣＡ（配列番号７）、アンチセンスＡＣＴＧＧＴＡＣＣ（ＫｐｎＩ ｓｉｔｅ）ＧＡＴＧＡＡＣＣＡＧＴＴＡＧＧＧＣＴＴＣＴＴＴ（配列番号８）
ＰＣＲは変性９４℃、１分、アニーリング６２℃、４０秒、伸長７２℃、２分、３５サイクルで増幅。ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯにＴＡクローニングした後、ＡｐａＩ／ＫｐｎＩで切り出して、ｐＳｈｕｔｔｌｅのＡｐａＩ／ＫｐｎＩにサブクローンした。
Ｓｏｘ６（ｐＳｈｕｔｔｌｅ）：センス ＧＴＴＧＣＴＡＧＣ（ＮｈｅＩ ｓｉｔｅ）ＧＧＴＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＴＡＴＴＴＴＴ（配列番号９）、アンチセンス ＡＣＴＧＧＴＡＣＣ（ＫｐｎＩ ｓｉｔｅ）ＴＧＴＣＡＧＡＧＴＡＣＴＴＴＡＡＴＴＣＡＧＣＡＡＡＣＡ（配列番号１０）
ＰＣＲは変性９４℃、１分、アニーリング６５℃、４０秒、伸長７２℃、３分、３５サイクルで増幅。ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯにＴＡクローニングした後、ＮｈｅＩ／ＫｐｎＩで切り出して、ｐＳｈｕｔｔｌｅのＮｈｅＩ／ＫｐｎＩにサブクローンした。
Ｓｏｘ９（ｐＳｈｕｔｔｌｅ）：センス ＧＴＴＧＣＴＡＧＣ（ＮｈｅＩ ｓｉｔｅ）ＣＧＣＧＴＡＴＧＡＡＴＣＴＣＣＴＧＧＡＣ（配列番号１１）、アンチセンス ＡＣＴＧＧＴＡＣＣ（ＫｐｎＩ ｓｉｔｅ）ＡＴＴＴＧＧＧＴＡＣＧＡＧＴＴＧＣＣＴＴＴ（配列番号１２）
ＰＣＲは変性９４℃、１分、アニーリング６０℃、４０秒、伸長７２℃、２分、３５サイクルで増幅。ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯにＴＡクローニングした後、ＮｈｅＩ／ＫｐｎＩで切り出して、ｐＳｈｕｔｔｌｅのＮｈｅＩ／ＫｐｎＩにサブクローンした。
【００２５】
この発現ベクターとＡｄｅｎｏＸ発現システム（米国クロンテック社）を使って、キットのマニュアルに従い、それぞれの蛋白を発現するアデノウイルスを作製した。アデノウイルスはＨＥＫ２９３細胞を用いて増幅し、アデノウイルス精製キット（米国クロンテック社）を用いて精製した。力価は、ＡｄｅｎｏＸ迅速力価測定キット（米国クロンテック社）を用いて測定した。
【００２６】
ヒト皮膚線維芽細胞は、コンフルエントになるまで１０ｃｍ培養皿で増殖させた後に、組換えアデノウイルスを一細胞当たり約５０ウイルスの割合で感染させた（ＭＯＩ５０）。感染２日後に細胞をトリプシン処理して培養皿からはがし、５０万個の細胞を１５ｃｃ遠心管の中にいれ、軽く（１００ｇ５分程度）遠心をかけてから、培養した。培養には、血清抜きの高グルコースＤＭＥＭ培地、あるいは高グルコースＤＭＥＭに１００ｎＭのデキサメザン、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸、４０μｇ／ｍｌのプロリン、１００μｇ／ｍｌのピルビン酸、１ｘＩＴＳ＋１（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を加えたものにさらに、３００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−２（山之内製薬）と１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ３（Ｔｅｃｈｎｅ、Ｍｉｎｅａｐｏｌｉｓ、ＮＥ、ＵＳＡ）を添加した完全軟骨産生培地を使った。
【００２７】
底に沈んだ皮膚細胞は、ペレット状に自然に丸まった。培養液は３〜４日毎に交換した。この細胞ペレットは、３日、１週，２週，３週間後に回収して、ＲＮｅａｓｙミニキット（キアゲン社）を用いて、添付のプロトコールに従い、ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡ（１００ｎｇから１μｇ）を鋳型とし、ランダムヘキサマーをプライマーとして、ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素（ＡＢＩ社）を用いて、添付のプロトコールに従い、逆転写反応を行った。得られたｃＤＮＡのうち、１μｌを鋳型として、２次のＳＹＢＲグリーンリアルタイムＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲアンプリコン配列を含む標的遺伝子の全長ならびに部分長のｃＤＮＡをＰＣＲにて増幅し、ｐＣＲ−ＴＯＰＯｚｅｒｏＩＩベクターまたはｐＣＲ−ＴＯＰＯＩＩベクター（インビトロジェン社）にクローニングし、リニアライズした後に標準の鋳型として用いた。
【００２８】
２次のＳＹＢＲグリーンリアルタイムＰＣＲ反応はＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（キアゲン社）を用いて、使用説明書に従い行った。２次のＳＹＢＲグリーンリアルタイムＰＣＲ増幅ならびに、リアルタイム蛍光検出はＡＢＩ７７００配列検出システム（ＡＢＩ社）を用いて行った。すべての反応は、４つ同じものを行った。ここの全ＲＮＡ中の標的遺伝子のコピー数は標準曲線を参照することにより計算し、ヒトＧＡＰＤＨを内在性コントロールとしてヒト全ＲＮＡ（ＡＢＩ社）を用いて補正した。
【００２９】
個々のプライマーの標的遺伝子の翻訳領域中の位置は表１のとおりである。Ｓｏｘ５およびＳｏｘ６のプライマーセットは、長いアイソフォームのアミノ末端領域にデザインした。
【表１】
【００３０】
測定結果を図２（ａ）から（ｆ）に表す。（ａ）から（ｆ）は、それぞれ、正常軟骨細胞のマーカーであるＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ９Ａ１、ＣＯＬ１１Ａ２、Ａｇｇｒｅｃａｎ、Ｍａｔｒｉｌｉｎ３、および、Ｃｈｏｎｄｒｏｍｏｄｕｌｉｎ１の遺伝子の発現を、全ＲＮＡ中の標的遺伝子のコピー数を縦軸として表す。
Ｓｏｘ５、６および９遺伝子を発現するアデノウイルスを共に感染させると、測定したすべての正常軟骨細胞のマーカー遺伝子の発現が、無血清ＤＭＥＭ培地で培養したＤＦＢに誘導された（図２（ａ）から（ｆ）のＳｏｘ５／６／９）。しかし、Ｓｏｘ５、６および９遺伝子を発現するアデノウイルスをそれぞれ単独で感染させたときには、これらのマーカー遺伝子の発現は低かった（図２（ａ）から（ｆ）のＳｏｘ９、但し、Ｓｏｘ５、６を単独で感染させた結果についてはマーカー遺伝子の発現が殆ど認められなかったため図示しなかった）。図２（ａ）から（ｆ）のＬａｃＺはＬａｃＺ遺伝子を発現するネガティブコントロールのアデノウイルスを感染させた結果である。
【００３１】
さらに、Ｓｏｘ５、６および９遺伝子のうちの２つを組み合わせて感染させた結果は、Ｓｏｘ９遺伝子とＳｏｘ５遺伝子との組合せ、Ｓｏｘ９遺伝子とＳｏｘ６遺伝子との組合せでは、マーカー遺伝子の発現が誘導されたのに対し（図２（ａ）から（ｆ）のＳｏｘ５／９およびＳｏｘ６／９）、Ｓｏｘ５遺伝子とＳｏｘ６遺伝子との組合せでは、マーカー遺伝子の発現は低かった（図２（ａ）から（ｆ）のＳｏｘ５／６）。
これらのことから、ヒト皮膚線維芽細胞に、Ｓｏｘ５、６および９遺伝子のうち、少なくとも２つの組合せであって、Ｓｏｘ５とＳｏｘ６との組合せを除くものを発現させると、軟骨細胞に特異的なマーカー遺伝子の発現が誘導され、軟骨様細胞が誘導されることが判った。
【００３２】
（実施例２）
Ｓｏｘ５、６、９遺伝子の発現によるヒト皮膚線維芽細胞の軟骨分化誘導を軟骨基質発現で調べた。
実施例１と同じサンプルの一部を、組織学的検索に用いた。細胞塊を４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ中で４℃にて、一晩置くことにより固定した。その後、７０％エタノールで使用時まで４℃にて保存した。標本は、ＯＣＴコンパウンドに包埋して、１０μｍ厚の凍結切片とするか、あるいは脱水の後パラフィンに包埋した後に５μｍ厚の切片とした。軟骨様基質の検出にはアルシアンブルー、トルイジンブルー、またはサフラニンＯ染色を用い、形態の観察にはヘマトキシリンエオジン染色を用いた。トルイジンブルーは、青い染色液であるが、軟骨基質においては異調染色（メタクロマジー）を呈し、紫色になる。このことを利用して軟骨気質の産生を評価した。
【００３３】
結果を図３に示す。ＬａｃＺ遺伝子を発現させたネガティブコントロールのサンプルでは全く異調染色は観られなかった。Ｓｏｘ５やＳｏｘ６を単独で発現させたものでは僅かに、Ｓｏｘ９を発現させたものではさらに少し多く異調染色が観られた。これに対し、Ｓｏｘ５、６、９を共に発現させたサンプルでは、正常の軟骨にも匹敵する強い異調染色を示す部位が広範に観られた。この結果は、アルシアンブルー染色やサフラニンＯ染色など他の軟骨基質染色でも同様であった（データは示さず）。
【００３４】
（実施例３）
３次元培養による軟骨分化促進効果を調べた。
３Ｄコラーゲン細胞培養システム（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ，アメリカ合衆国）またはＩ型アテロコラーゲン（Ｋｏｋｅｎ、東京）を用い、使用説明書に従い、コラーゲンゲル上での３次元培養を実施した。どちらの系でもほぼ同様の結果が得られた。
【００３５】
まず、実施例１で用いたのと同様の、Ｓｏｘ９のみを発現させたヒト皮膚線維芽細胞と、Ｓｏｘ５、６および９を共に発現させたヒト皮膚線維芽細胞を、感染後２日目にトリプシンで剥がし、２４ウェルプレートにいれたコラーゲンを含むＤＭＥＭ上に、２５００００個／ｃｍ２となるように播き、無血清高グルコースＤＭＥＭ培地中で培養した。細胞は、３次元培養にした後、７、１４、２１日目に集めた。正常軟骨細胞のマーカーであるＣＯＬ２Ａ１およびＣｈｏｎｄｒｏｍｏｄｕｌｉｎ １の発現量を実施例１と同様に測定し、軟骨分化促進効果を調べた。また、平面培養や、ペレット培養も行った。結果を図４（ａ）（ｂ）に表す。
【００３６】
Ｓｏｘ５、６および９遺伝子を共に発現させたヒト皮膚線維芽細胞をコラーゲンゲル上で３次元培養した場合（図４中ダイヤ）は、平面培養（図４中四角）やペレット培養（図４中丸）の場合に比して、一週間という早期に軟骨分化マーカーが上昇し、その発現量も高い傾向があった。ただし三週目でのＣｈｏｎｄｒｏｍｏｄｕｌｉｎ １はペレット培養の方が高くなった（図４（ｂ））。Ｓｏｘ９遺伝子のみの発現では全く軟骨分化は起こらなかった（図４中三角）。
【００３７】
３次元培養後一週間のサンプルをトルイジンブルーで染色すると、Ｓｏｘ９遺伝子単独に発現させたものでは異調染色する軟骨基質が殆ど産生されなかったのに対し（図５（ａ））、Ｓｏｘ５、６および９遺伝子を共に発現させたものでは、この一週間という早期に、異調染色する軟骨基質が大量に産生されたのが分かった（図５（ｂ））。
これらのことから、平面培養に比べ、ペレットおよび３次元培養は、分化誘導の観点から優れており、特に、３次元培養によれば、軟骨基質の産生をはやく立ち上げることができることが判った。
【００３８】
（実施例４）
Ｓｏｘ５、６、９遺伝子の発現による肥大軟骨分化と骨芽細胞分化の抑制を調べた。
ヒト骨髄間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）は自然には肥大軟骨分化し、骨芽細胞に分化するが、ＴＧＦβ３およびＢＭＰ−２を発現させると、肥大軟骨分化および骨芽細胞への分化を抑えて、軟骨様細胞に分化誘導できることが知られている。そこで、本発明者等は、Ｓｏｘ５、６、９遺伝子の発現により、このような効果が得られるかを調べた。
【００３９】
ヒト骨髄間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）は、米国Ｃａｍｂｒｅｘ社より購入した。ｈＭＳＣはＭＳＣ増殖培地（ＭＳＣＧＭ）、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。ｈＭＳＣはコンフルエントになるまで１０ｃｍ培養皿で増殖させた後に、それぞれの遺伝子の組換えアデノウイルスベクターを一細胞当たり一遺伝子につき約５０ウイルスの割合で感染させた（ＭＯＩ５０）。すなわち、ＴＧＦβ３の組換えアデノウイルスベクター、ＢＭＰ−２の組換えアデノウイルスベクターおよびＬａｃＺの組換えアデノウイルスベクターをＭＯＩ５０ずつ感染させたもの、ＬａｃＺの組換えアデノウイルスベクターのみＭＯＩ５０で感染させたもの、Ｓｏｘ９の組換えアデノウイルスベクターのみＭＯＩ５０で感染させたもの、Ｓｏｘ５、Ｓｏｘ６、Ｓｏｘ９の組換えアデノウイルスベクターをそれぞれＭＯＩ５０で感染させたものについて、培養した。
【００４０】
また、ヒト皮膚線維芽細胞（ＤＦＢ）についても、ＬａｃＺの組換えアデノウイルスベクターのみＭＯＩ５０で感染させたもの、Ｓｏｘ９の組換えアデノウイルスベクターのみＭＯＩ５０で感染させたもの、Ｓｏｘ５、Ｓｏｘ６、Ｓｏｘ９の組換えアデノウイルスベクターをそれぞれＭＯＩ５０で感染させたものについて、培養した。
感染２日後に細胞をトリプシン処理して培養皿から剥がし、５０万個の細胞を１５ｃｃ遠心管の中に入れ、軽く遠心をかけてから、培養した。
【００４１】
培養には、高グルコースＤＭＥＭに、１００ｎＭのデキサメザン、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸、４０μｇ／ｍｌのプロリン、１００μｇ／ｍｌのピルビン酸、１ｘＩＴＳ＋１（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を加えたものにさらに、３００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−２（山之内製薬）と１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ３（Ｔｅｃｈｎｅ、Ｍｉｎｅａｐｏｌｉｓ、ＮＥ、ＵＳＡ）を添加した完全軟骨産生培地を使った。底に沈んだ皮膚細胞は、ペレット状に自然に丸まった。培養液は３−４日毎に交換した。結果は図６に表す。
ヒト骨髄間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を用いた従来の方法では、ペレット培養して何も加えない状態で、既に骨芽細胞マーカーであるＢＳＰと肥大軟骨のマーカーであるＣＯＬ１０Ａ１の発現が観られる（白丸）。また、ペレット培養してＴＧＦβ３やＢＭＰを加えて軟骨分化を誘導しても、まだ、ＢＳＰとＣＯＬ１０Ａ１の上昇が観られる（黒四角）。この上昇はＳｏｘ９を加えただけでは変化がない（白三角）が、Ｓｏｘ５、６、９を同時に加えると抑制される（黒ダイヤ）。
【００４２】
ヒト皮膚線維芽細胞（ＤＦＢ）においては、何も加えない状態では特に肥大軟骨および骨芽細胞マーカーは上昇しないが（白四角）、Ｓｏｘ９を加えるとＣＯＬ１０Ａ１が上昇する場合がある（図６（ｂ）の黒丸）。しかし、この上昇はＳｏｘ５、６、９を共に発現させることで抑制される（図６（ｂ）の黒三角）。なお、図６（ａ）においては、ヒト皮膚線維芽細胞（ＤＦＢ）に、ＬａｃＺ（白四角）、Ｓｏｘ９単独（黒丸）、Ｓｏｘ５、６、９を共に（黒三角）発現させた場合は、すべてベースライン上に重なっている。
【００４３】
このように、Ｓｏｘ５、６、９を共に発現させると、軟骨様細胞への分化が進むのみならず、軟骨様細胞にとって好ましくない、肥大軟骨および骨芽細胞への分化を抑制できる。この抑制効果は、ヒト骨髄間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を用いた実験においても、従来のＴＧＦβ３およびＢＭＰ−２の発現を用いた方法よりも優れており、皮膚線維芽細胞を用いた実験においては、殆どこの分化は起こらなかった。したがって、本発明の方法が、肥大軟骨分化および骨芽細胞分化の少ない優れた方法であることが判った。
【００４４】
（実施例５）
皮膚線維芽細胞の増殖実験を行った。
皮膚線維芽細胞は、実施例１と同様の条件で培養した場合、一ヶ月で約１００倍増え、その後も２−３ヶ月までは問題なく増殖した。この結果によれば、もし１，０００，０００個の細胞からスタートしたとすると、一ヶ月で１００，０００，０００個、２ヶ月で１０，０００，０００，０００個となり、この最後の数字は、細胞が直径１０μｍの球だと仮定して１０ｃｍ３に相当し、皮膚線維芽細胞が十分量の軟骨様細胞の素材となり得ることを示している。
【００４５】
【発明の効果】
本発明によれば、入手が容易な非軟骨細胞から効率よく軟骨様細胞を製造することができる軟骨様細胞の製造方法、実験用や医療用に利用することができる軟骨様細胞、および軟骨様細胞誘導用組成物を提供することができる。
【００４６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ベクターの構築を表す図である。
【図２】図２は、Ｓｏｘ５、６、９遺伝子の発現によるヒト皮膚線維芽細胞の軟骨分化誘導を、軟骨特異的遺伝子の発現量で表した図である。
【図３】図３は、Ｓｏｘ５、６、９遺伝子の発現によるヒト皮膚線維芽細胞の軟骨分化誘導を、軟骨基質の染色で表した写真である。
【図４】図４は、３次元培養による軟骨分化促進効果を軟骨特異的遺伝子の発現量で表した図である。
【図５】図５は、３次元培養による軟骨分化を軟骨基質の染色で表した写真である。
【図６】図６は、Ｓｏｘ５、６、９遺伝子の発現による肥大軟骨分化と骨芽細胞分化の抑制を表す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a cartilage-like cell that can be used for experiments and medical use, a method for producing the cartilage-like cell, and a composition for inducing cartilage-like cells used for producing the cartilage-like cell.
[0002]
[Prior art]
Regenerative medicine is a new medicine that seeks to overcome irreversible organ damage that cannot be dealt with by conventional medicine by using the viable proliferation and differentiation ability of stem cells. Cartilage has a low regenerative ability, and diseases such as osteoarthritis and congenital cartilage defects are great targets for regenerative medicine.
The list of factors affecting cartilage formation has exploded in recent studies. It is known that mutations of various proteins constituting the matrix of cartilage, factors that control the cell cycle, signal transduction factors, and the like greatly affect cartilage formation (see Non-Patent Document 1).
[0003]
Thus, at present, many factors that affect cartilage formation are known, but many of these findings are based on the so-called necessary conditions for differentiation and proliferation, such that knockout of these factors does not cause cartilage differentiation. And the so-called sufficient conditions, such as differentiation into chondrocytes with this factor, have not been determined. In order to realize cartilage regenerative medicine, a technique for controlling cartilage differentiation / proliferation at will is necessary, and the knowledge of conventional basic research is insufficient for this purpose.
[0004]
In addition, it is known that expression of TGFβ3 and BMP-2 in bone marrow mesenchymal stem cells can suppress differentiation into hypertrophic cartilage and osteoblasts and induce differentiation into cartilage-like cells (see Non-Patent Document 2). ). However, such stem cells such as mesenchymal stem cells have a drawback that it is difficult to secure a sufficient amount for clinical application.
[0005]
On the other hand, the transcription factor Sox is one of many factors affecting cartilage formation described above. The Sox9 gene is expressed in cartilage and its precursor cells, and is also expressed in testis, kidney and pancreas. Mutations in the Sox9 gene cause chondrodysplasia and testicular abnormalities. Cells without the Sox9 gene cannot express cartilage-specific genes. It is known that mutations in Sox5 and Sox6 genes also cause chondrodysplasia, and combined mutations in Sox5 gene and Sox6 gene cause more serious cartilage abnormalities (see Non-Patent Document 3).
[0006]
[Non-patent document 1]
Karaplis AC. Embryonic development of bone and the molecular regulation of intramembraneous and endochondral bone formation. In: Bilezikian JP, Raisz LG, Rodan GA, eds. Principles of Bone Biology. San Diego: Academic Press, 2002: 33-58.
[Non-patent document 2]
Sekiya I, Vouristo JT, Larson BL, Prokop DJ. In vitro cartilage formation by human adult stem cells from bone marlow stroma definitions the sequence of cellular and molecular events. Proc Natl Acad Sci USA. 2002 Apr 2; 99 (7): 4397-402.
[Non-Patent Document 3]
deCrombrugge B, Lefebvre V, Nakashima K. et al. Regulatory mechanisms in the pathways of cartage and bone formation. Current Opinion in Cell Biology 13: 721-727, 2001.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to solve the above-mentioned conventional problems and achieve the following objects. That is, the present invention provides a method for producing cartilage-like cells capable of efficiently producing cartilage-like cells from easily available non-chondrocytes, cartilage-like cells that can be used for experiments, medical use, and the like, and cartilage. It is an object to provide a composition for inducing like cells.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have focused on the Sox gene among countless cartilage-related genes, and variously combined the Sox5, 6 and 9 genes into a human skin fibroblast that has no cartilage differentiation ability in its natural state. The cartilage regeneration was determined based on the expression of cartilage-specific genes and the production of matrix proteins. As a result, the Sox5, 6 and 9 genes had no effect when expressed alone, but when at least one of the Sox5 gene and the Sox6 gene and the Sox9 gene were expressed, other special factors and the like were used. It was possible to impart cartilage-specific traits to skin fibroblasts without the need.
[0009]
The present invention is based on this new finding, and means for solving the above problems are as follows.
<1> A method for producing cartilage-like cells, comprising a step of inducing non-chondrocytes into cartilage-like cells.
<2> The cartilage-like cell according to <1>, wherein at least one of the COL2A1 gene, the COL9A1 gene, the COL11A2 gene, the Aggrecan gene, the Matrillin3 gene, and the Chondromodulin1 gene is more highly expressed than non-chondrocytes. This is a method for producing cartilage-like cells.
<3> The method for producing cartilage-like cells according to any one of <1> and <2>, wherein the non-chondrocytes are non-stem cells.
<4> The method for producing cartilage-like cells according to any one of <1> to <3>, wherein the non-chondrocytes are mesenchymal cells.
<5> The method for producing cartilage-like cells according to any one of <1> to <4>, wherein the non-chondrocytes are any of fibroblasts, adipocytes, and muscle cells.
<6> The method for producing cartilage-like cells according to any one of <1> to <5>, wherein the non-chondrocytes are any of skin-derived cells, subcutaneous fat-derived cells, and muscle-derived cells. .
<7> The method according to any one of <1> to <6>, wherein the step of inducing the non-chondrocytes into cartilage-like cells includes causing the non-chondrocytes to express at least one of the Sox5 gene and the Sox6 gene and the Sox9 gene. Or a method for producing cartilage-like cells.
<8> The method for producing cartilage-like cells according to <7>, wherein the expression is performed by gene transfer.
<9> The method for producing cartilage-like cells according to <8>, wherein the gene is introduced using a vector.
<10> at least one of a composition that highly activates the transcription activity of the Sox5 gene and a composition that highly activates the transcription activity of the Sox6 gene, and a composition that highly activates the transcription activity of the Sox9 gene. <7> The method for producing cartilage-like cells according to <7>.
<11> The chondrocyte-like cell according to any one of <1> to <10>, wherein at least a part of the step of inducing non-chondrocytes into cartilage-like cells is performed by one of three-dimensional culture and pellet culture. It is a manufacturing method.
<12> A chondrocyte that is derived from non-chondrocytes and has a chondrocyte-like trait.
<13> The cartilage-like cell according to <12>, which is produced by the method for producing a cartilage-like cell according to any one of <1> to <11>.
<14> The cartilage-like cell according to any one of <12> and <13>, which is used for filling a defective site in a diseased tissue lacking cartilage.
<15> The cartilage-like cell according to any one of <12> and <13>, which is used for cosmetics.
<16> A cartilage-like cell induction composition comprising a vector that expresses at least one of the Sox9 gene, the Sox5 gene, and the Sox6 gene.
<17> A cartilage-like cell-inducing composition characterized by highly activating the transcription activity of at least one of the Sox9 gene, the Sox5 gene, and the Sox6 gene.
[0010]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The method for producing cartilage-like cells of the present invention includes a step of inducing non-chondrocytes into cartilage-like cells, and further includes other steps appropriately selected as necessary.
The “chondrocyte” refers to a cell in which at least one of the COL2A1, COL9A1, COL11A2, Aggrecan, Matrillin3, and Chondromodulin1 genes is more highly expressed than non-chondrocyte cells. The COL2A1 gene, the COL9A1 gene, the COL11A2 gene, the Aggrecan gene, the Matrillin3 gene, and the Chondromodulin1 gene are genes that are characteristically expressed in chondrocytes and are known as markers for normal chondrocytes.
[0011]
Here, the expression "highly expressed than non-chondrocytes" means that the chondrocyte-like cells express, at least temporarily, a gene characteristically expressed in the chondrocytes and produce a chondrocyte-specific protein. Means that.
In addition, since the chondrocytes produce cartilage matrix, a protein characteristic of cartilage, it is empirically known that the chondrocytes stain purple by staining with toluidine blue, and the chondrocytes are stained with toluidine blue. Stains purple.
[0012]
The non-chondrocytes are not particularly limited as long as they are cells other than the chondrocytes, and can be appropriately selected according to the purpose. The non-chondrocytes are preferably mesenchymal cells other than chondrocytes, and need not be stem cells. The non-chondrocytes include, for example, fibroblasts such as skin fibroblasts, fat cells and muscle cells, and the tissues derived therefrom include not only skin but also placenta, subcutaneous fat and muscle. In particular, skin-derived cells have the advantage that, unlike cells of the cartilage lineage such as chondroblasts, even when obtained from a living body, the invasion is slight. Further, skin-derived cells are advantageous in that they are abundant in quantity, unlike cells that are difficult to secure a sufficient amount for clinical application, such as mesenchymal stem cells. Another advantage is that differentiation into hypertrophic cartilage and osteoblasts can be further suppressed as compared with the case where mesenchymal stem cells are used. The ability to select a material from a wide range of cells in this way means that materials that are more suitable for the purpose than cartilage cells or methods that can differentiate cartilage-like cells only from mesenchymal stem cells Is very advantageous from the viewpoint of obtaining the compound stably.
[0013]
Further, since cartilage is a tissue with few blood vessels, even when the cartilage-like cells are used for the purpose of treatment or the like, `` non-chondrocytes '' do not necessarily need to be collected from the same person, and according to the purpose, It can be selected as appropriate.
[0014]
Induction of non-chondrocytes into cartilage-like cells can be performed by causing non-chondrocytes to express at least one of the Sox5 gene and the Sox6 gene and the Sox9 gene. That is, (1) a combination of the Sox9 gene and the Sox5 gene, (2) a combination of the Sox9 gene and the Sox6 gene, or (3) a combination of the Sox9 gene, the Sox5 gene, and the Sox6 gene in one cell. Can be performed.
In the expression, as long as the two or three genes are expressed in one cell, in addition to the simultaneous expression of the two or three genes, for example, the Sox9 gene is first expressed, and then the Sox6 gene is expressed. This includes even when there is a time lag, such as when expressing a gene.
[0015]
In non-chondrocytes, the Sox5, 6, and 9 genes are hardly expressed. To express these genes, the Sox5, 6, and 9 genes must be introduced or the Sox5, 6, and 9 genes should be transcribed. It can be carried out by adding a composition that enhances the activity, or by combining both.
[0016]
Gene transfer can be performed using a viral vector, a non-viral vector, an artificial virus, and the like. Examples of the viral vector include an adenovirus vector, a retrovirus vector, and a Sendai virus vector.
Examples of the non-viral vector include a calcium phosphate method, a DEAE dextran method, and a lipofection method using a cationic lipid or the like.
Among these, it is preferable to use an adenovirus vector from the viewpoint of having both transduction efficiency and safety. The Sox5, 6, and 9 genes may be recombined into different vectors, respectively, or two or more genes may be recombined into one vector.
[0017]
On the other hand, as a method of adding a composition that highly activates the transcription activity of Sox5, 6, and 9 genes, a composition that highly activates the transcription activity of the Sox5 gene and a composition that highly activates the transcription activity of the Sox6 gene are used. And a composition that highly activates the transcriptional activity of the Sox9 gene may be added alone or as a complex.
[0018]
The step of inducing non-chondrocytes into cartilage-like cells may be performed by planar culture, but at least a part of the step is performed by one of three-dimensional culture and pellet culture, and differentiation induction is large. Preferred from a viewpoint. In particular, three-dimensional culture is advantageous in that the induction of differentiation induction is rapid.
[0019]
The three-dimensional culture is performed by placing cells before or after gene transfer on a gel of a scaffold material such as collagen, fibrin and hyaluronic acid. A commercially available three-dimensional culture kit such as a 3D collagen cell culture system (Chemicon, Temecula, CA, USA) can also be used.
In the pellet culture, the cells cultured on a flat surface are peeled off, and the cells are cultured by lightly centrifuging them in a culture solution, whereby the cells can be naturally formed into a round pellet.
[0020]
The first aspect of the chondrocyte of the present invention is not particularly limited except that it is derived from non-chondrocytes and has a chondrocyte-like trait.
The cartilage-like trait means that at least one of the COL2A1 gene, COL9A1 gene, COL11A2 gene, Aggrecan gene, Matrillin3 gene and Chondromodulin1 gene has at least once a higher level than non-chondrocyte. Further, the cartilage-like cells have a property of being colored purple by staining with toluidine blue.
[0021]
The non-chondrocytes from which the cartilage-like cells are derived can be appropriately selected from cells other than the chondrocytes according to the purpose. The non-chondrocytes are preferably skin-derived cells, as described in the method for producing cartilage-like cells.
The cartilage-like cells of the present invention are preferably produced by the method for producing cartilage-like cells. The cartilage-like cells of the present invention can be used for experiments such as evaluation and screening of cartilage-active drugs. In addition, it can be used for the treatment of osteoarthritis in humans and animals and congenital cartilage defects, and the like, for the replacement of defective sites in diseased tissues with cartilage defects. It can also be used as a material for cosmetics such as cosmetic surgery.
[0022]
A first aspect of the composition for inducing cartilage-like cells of the present invention is characterized by comprising a vector that expresses at least one of the Sox9 gene, the Sox5 gene, and the Sox6 gene. As mentioned above, these vectors can be used alone or as a complex for the production of cartilage-like cells.
A second aspect of the composition for inducing cartilage-like cells of the present invention is a composition characterized by highly activating the transcription activity of at least one of the Sox9 gene, the Sox5 gene and the Sox6 gene. The composition for inducing cartilage-like cells can be used for the production of cartilage-like cells by adding an appropriate amount alone or as a complex to non-chondrocytes.
[0023]
【Example】
(Example 1)
The induction of cartilage differentiation of human dermal fibroblasts by the expression of Sox5, 6, and 9 genes was examined based on the expression level of cartilage-specific genes.
Human dermal fibroblasts (DFB) were purchased from Cambrex, USA. DFB was maintained in a high glucose DMEM medium supplemented with 50 units / ml penicillin, 50 μg / ml streptomycin and 10% fetal calf serum.
[0024]
Human Sox5, 6, and 9 full-length cDNAs were amplified by polymerase chain reaction (PCR) using human tracheal cartilage cDNA (purchased from Clontech, USA) as a template, and expressed in mammalian expression vectors (pEGFPC1, pEGFPC2 or pShuttle, Clonetech, USA). ) (FIG. 1). The sequences of the primers used for PCR amplification and the conditions for PCR amplification are as follows.
Sox5 (pEGFPC2): sense AGGATGTCTTCCAAGCGACCA (SEQ ID NO: 1), antisense GATGAACCAGTTTAGGGCTTCTTTT (SEQ ID NO: 2)
PCR was performed by denaturation at 94 ° C for 1 minute, annealing at 62 ° C for 40 seconds, extension at 72 ° C for 2 minutes and 35 cycles. After TA cloning into pCR2.1TOPO (Invitrogen, USA), it was cut out with EcoRI site of pCR2.1TOPO and subcloned into EcoRI site of pEGFPC2.
Sox6 (pEGFPC1): sense GTTAGATCT (BglII site)GGTGCTGGGGCTGATATTTTTT (SEQ ID NO: 3), antisense TGTCAGAGTACTTTAATTCAGCAAACA (SEQ ID NO: 4)
PCR was performed by denaturation at 94 ° C for 1 minute, annealing at 65 ° C for 40 seconds, extension at 72 ° C for 3 minutes and 35 cycles. After TA cloning into pCR2.1TOPO, it was excised with the EcoRI site of BglII and pCR2.1TOPO, and subcloned into the BglII / EcoRI site of pEGFPC1.
Sox9 (pEGFPC1): sense GTTCTCGAG (XhoI site)CCGGTATGAATCTCCTGGAC (SEQ ID NO: 5), antisense ACTAAGCTT (HindIII site)ATTTGGGTACGAGTTGCCTTT (SEQ ID NO: 6)
PCR was performed by denaturation at 94 ° C for 1 minute, annealing at 60 ° C for 40 seconds, extension at 72 ° C for 2 minutes and 35 cycles. After TA cloning into pCR2.1TOPO, it was excised with XhoI / HindIII and subcloned into XhoI / HindIII of pEGFPC1.
Sox5 (pShuttle): sense GTTGGGCCC (ApaI site)AGGATGTCTTTCCAAGCGACCA (SEQ ID NO: 7), antisense ACTGGTACC (KpnI site)GATGAACCAGTTTAGGGCTTCTTTT (SEQ ID NO: 8)
PCR was performed by denaturation at 94 ° C for 1 minute, annealing at 62 ° C for 40 seconds, extension at 72 ° C for 2 minutes and 35 cycles. After TA cloning into pCR2.1TOPO, it was excised with ApaI / KpnI and subcloned into pShuttle ApaI / KpnI.
Sox6 (pShuttle): Sense GTTGCTAGC (NheI site)GGTGCTGGGGCTGATATTTTTT (SEQ ID NO: 9), antisense ACTGGTACC (KpnI site)TGTCAGAGTACTTTTAATTCAGCAAACA (SEQ ID NO: 10)
PCR was performed by denaturation at 94 ° C for 1 minute, annealing at 65 ° C for 40 seconds, extension at 72 ° C for 3 minutes and 35 cycles. After TA cloning into pCR2.1TOPO, it was excised with NheI / KpnI and subcloned into pShuttle NheI / KpnI.
Sox9 (pShuttle): Sense GTTGCTAGC (NheI site)CCGGTATGAATCTCCTGGAC (SEQ ID NO: 11), antisense ACTGGTACC (KpnI site)ATTTGGGTACGAGTTGCCTTT (SEQ ID NO: 12)
PCR was performed by denaturation at 94 ° C for 1 minute, annealing at 60 ° C for 40 seconds, extension at 72 ° C for 2 minutes and 35 cycles. After TA cloning into pCR2.1TOPO, it was excised with NheI / KpnI and subcloned into pShuttle NheI / KpnI.
[0025]
Using this expression vector and AdenoX expression system (Clontech, USA), adenoviruses expressing each protein were prepared according to the manual of the kit. The adenovirus was amplified using HEK293 cells and purified using an adenovirus purification kit (Clontech, USA). The titer was measured using an AdenoX rapid titer kit (Clontech, USA).
[0026]
Human dermal fibroblasts were grown in 10 cm culture dishes until confluent and then infected with recombinant adenovirus at a rate of about 50 viruses per cell (MOI 50). Two days after the infection, the cells were trypsinized, detached from the culture dish, 500,000 cells were put into a 15 cc centrifuge tube, lightly centrifuged (about 100 g for 5 minutes), and cultured. For cultivation, high glucose DMEM medium without serum or high glucose DMEM in 100 nM dexamezan, 50 μg / ml ascorbic acid, 40 μg / ml proline, 100 μg / ml pyruvate, 1 × ITS + 1 (Sigma, St. Louis, MO) , USA) and BMP-2 at 300 ng / ml (Yamanouchi Pharmaceutical) and TGFβ3 at 10 ng / ml (Techne, Minneapolis, NE, USA) were used as a complete chondrogenic medium.
[0027]
The skin cells that sank to the bottom naturally rolled up into a pellet. The culture was changed every 3-4 days. The cell pellet was collected after three days, one week, two weeks, and three weeks, and RNA was extracted using an RNeasy mini kit (Qiagen) according to the attached protocol. A reverse transcription reaction was performed using total RNA (100 ng to 1 μg) as a template, random hexamer as a primer, and MultiScribe reverse transcriptase (ABI) according to the attached protocol. A secondary SYBR green real-time PCR reaction was performed using 1 μl of the obtained cDNA as a template. The full-length and partial-length cDNA of the target gene including the PCR amplicon sequence was amplified by PCR, cloned into a pCR-TOPOZeroII vector or a pCR-TOPOII vector (Invitrogen), linearized, and used as a standard template.
[0028]
The secondary SYBR green real-time PCR reaction was performed using QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen) according to the instruction manual. Secondary SYBR green real-time PCR amplification and real-time fluorescence detection were performed using an ABI 7700 sequence detection system (ABI). All reactions performed the same four. The copy number of the target gene in the total RNA was calculated by referring to a standard curve, and corrected using human total RNA (ABI) as an endogenous control using human GAPDH.
[0029]
Table 1 shows the positions of the individual primers in the translation region of the target gene. Sox5 and Sox6 primer sets were designed in the amino-terminal region of the long isoform.
[Table 1]
[0030]
The measurement results are shown in FIGS. (A) to (f) show the expression of COL2A1, COL9A1, COL11A2, Aggrecan, Matrilin3, and Chondromodulin1 genes, which are markers of normal chondrocytes, respectively, with the copy number of the target gene in total RNA as the vertical axis. Represent.
When infected together with adenovirus expressing Sox5, 6 and 9 genes, the expression of marker genes of all normal chondrocytes measured was induced in DFB cultured in serum-free DMEM medium (from FIG. 2 (a)). (F) Sox5 / 6/9). However, when the adenoviruses expressing the Sox5, 6 and 9 genes were respectively infected alone, the expression of these marker genes was low (Sox9 in FIGS. 2 (a) to (f); The results of infection alone were not shown because almost no marker gene expression was observed). LacZ in FIGS. 2 (a) to 2 (f) is the result of infection with a negative control adenovirus expressing the LacZ gene.
[0031]
Furthermore, the result of infection by combining two of the Sox5, 6 and 9 genes showed that the expression of the marker gene was induced by the combination of the Sox9 gene and the Sox5 gene, and by the combination of the Sox9 gene and the Sox6 gene. In contrast, (Sox5 / 9 and Sox6 / 9 in FIGS. 2 (a) to (f)), the combination of the Sox5 gene and the Sox6 gene resulted in low marker gene expression (FIGS. 2 (a) to (f)). Sox 5/6).
From these results, when human dermal fibroblasts express at least two combinations of the Sox5, 6 and 9 genes, excluding the combination of Sox5 and Sox6, a marker specific to chondrocytes can be obtained. It was found that gene expression was induced, and chondrocyte-like cells were induced.
[0032]
(Example 2)
The induction of cartilage differentiation of human dermal fibroblasts by the expression of Sox5, 6, 9 genes was examined by cartilage matrix expression.
A portion of the same sample as in Example 1 was used for histological search. Cell clumps were fixed by placing overnight in 4% paraformaldehyde / PBS at 4 ° C. Thereafter, it was stored at 70C in 70% ethanol until use. Specimens were embedded in OCT compound to give frozen sections of 10 μm thickness, or embedded in paraffin after dehydration and made into sections of 5 μm thickness. Alcian blue, toluidine blue, or safranin O staining was used to detect the cartilage-like matrix, and hematoxylin eosin staining was used to observe the morphology. Toluidine blue is a blue staining solution, but in the cartilage matrix, it exhibits metachromatic staining and becomes purple. Utilizing this, the production of cartilage temperament was evaluated.
[0033]
The results are shown in FIG. No abnormal staining was observed in the negative control sample expressing the LacZ gene. Slight staining was observed slightly in those expressing Sox5 or Sox6 alone, and a little more in those expressing Sox9. In contrast, in the sample in which Sox5, 6, and 9 were both expressed, sites showing strong abnormal staining comparable to that of normal cartilage were widely observed. The same results were obtained with other cartilage matrix stainings such as Alcian blue staining and Safranin O staining (data not shown).
[0034]
(Example 3)
The effect of promoting cartilage differentiation by three-dimensional culture was examined.
Using a 3D collagen cell culture system (Chemicon, Temecula, CA, USA) or type I atelocollagen (Koken, Tokyo), three-dimensional culture on collagen gel was performed according to the instruction manual. Nearly similar results were obtained with both systems.
[0035]
First, human dermal fibroblasts expressing only Sox9 and human dermal fibroblasts expressing both Sox5, 6 and 9 were used in the same manner as that used in Example 1, and trypsin on day 2 after infection. 250,000 cells / cm on collagen-containing DMEM in a 24-well plate2And cultured in a serum-free high glucose DMEM medium. Cells were collected on days 7, 14, and 21 after three-dimensional culture. The expression levels of COL2A1 and Chondromodulin 1 which are markers of normal chondrocytes were measured in the same manner as in Example 1, and the cartilage differentiation promoting effect was examined. In addition, planar culture and pellet culture were also performed. The results are shown in FIGS.
[0036]
When human skin fibroblasts expressing both Sox5, 6 and 9 genes are three-dimensionally cultured on collagen gel (diamond in FIG. 4), planar culture (square in FIG. 4) or pellet culture (circle in FIG. 4) As compared to the case of (1), the cartilage differentiation marker increased as early as one week, and the expression level thereof also tended to be high. However, Chondromodulin 1 at the third week was higher in the pellet culture (FIG. 4 (b)). Cartilage differentiation did not occur at all with the expression of the Sox9 gene alone (triangle in FIG. 4).
[0037]
When the sample one week after the three-dimensional culture was stained with toluidine blue, the cartilage matrix to be stained abnormally was hardly produced by the expression of the Sox9 gene alone (FIG. 5 (a)). It was found that the cartilage matrix to be stained abundantly was produced in the early one week in the case of expressing both the and 9 genes (FIG. 5 (b)).
From these results, it was found that the pellet and the three-dimensional culture are superior to the planar culture from the viewpoint of differentiation induction, and in particular, the three-dimensional culture can quickly start the production of the cartilage matrix.
[0038]
(Example 4)
The suppression of hypertrophic cartilage differentiation and osteoblast differentiation by the expression of Sox5, 6, and 9 genes was examined.
Human bone marrow mesenchymal stem cells (hMSCs) spontaneously differentiate into hypertrophic cartilage and differentiate into osteoblasts. When TGFβ3 and BMP-2 are expressed, differentiation into hypertrophic cartilage and differentiation into osteoblasts are suppressed. It is known that differentiation can be induced in cartilage-like cells. Therefore, the present inventors examined whether such effects can be obtained by the expression of Sox5, 6, and 9 genes.
[0039]
Human bone marrow mesenchymal stem cells (hMSCs) were purchased from Cambrex, USA. hMSC is MSC growth medium (MSCGM), 5% CO2And 37 ° C. hMSCs were grown in 10 cm culture dishes until confluent and then infected with the recombinant adenoviral vectors of each gene at a rate of about 50 viruses per gene per cell (MOI 50). That is, a recombinant adenovirus vector of TGFβ3, a recombinant adenovirus vector of BMP-2 and a recombinant adenovirus vector of LacZ were infected at an MOI of 50, and a recombinant adenovirus vector of LacZ alone was infected at a MOI of 50, The cells infected with only the Sox9 recombinant adenovirus vector at the MOI of 50 and those infected with the Sox5, Sox6, and Sox9 recombinant adenovirus vectors at the MOI of 50 were cultured.
[0040]
Human skin fibroblasts (DFB) were also infected with the LacZ recombinant adenovirus vector at MOI 50 only, Sox 9 recombinant adenovirus vector was infected at MOI 50 alone, and Sox5, Sox6, and Sox9. The cells infected with the recombinant adenovirus vectors at an MOI of 50 were cultured.
Two days after infection, the cells were trypsinized and detached from the culture dish, 500,000 cells were placed in a 15 cc centrifuge tube, lightly centrifuged, and cultured.
[0041]
For culture, high glucose DMEM supplemented with 100 nM dexamezan, 50 μg / ml ascorbic acid, 40 μg / ml proline, 100 μg / ml pyruvate, 1 × ITS + 1 (Sigma, St. Louis, MO, USA) Further, a complete chondrogenic medium supplemented with 300 ng / ml BMP-2 (Yamanouchi Pharmaceutical) and 10 ng / ml TGFβ3 (Techne, Minneapolis, NE, USA) was used. The skin cells that sank to the bottom naturally rolled up into a pellet. The culture medium was changed every 3-4 days. The results are shown in FIG.
In the conventional method using human bone marrow mesenchymal stem cells (hMSCs), expression of BSP, an osteoblast marker, and COL10A1, a marker of hypertrophic cartilage, is already observed in a pellet culture without addition. White circle). In addition, even if cartilage differentiation is induced by adding TGFβ3 or BMP in pellet culture, BSP and COL10A1 are still elevated (closed squares). This increase is not changed only by adding Sox9 (white triangle), but is suppressed by adding Sox5, 6, 9 simultaneously (black diamond).
[0042]
In human dermal fibroblasts (DFB), hypertrophic cartilage and osteoblast markers are not particularly increased when nothing is added (open squares), but COL10A1 may be increased when Sox9 is added (FIG. 6 (b)). )). However, this increase is suppressed by expressing Sox5, 6, and 9 together (closed triangles in FIG. 6B). In FIG. 6 (a), when LacZ (open squares), Sox9 alone (solid circles), and Sox5, 6, and 9 were all expressed (solid triangles) in human skin fibroblasts (DFB), Overlaps the baseline.
[0043]
Thus, when both Sox5, 6, and 9 are expressed, not only the differentiation into cartilage-like cells proceeds, but also the differentiation into hypertrophic cartilage and osteoblasts, which is not preferable for cartilage-like cells, can be suppressed. This inhibitory effect is superior to the conventional method using the expression of TGFβ3 and BMP-2 also in the experiment using human bone marrow mesenchymal stem cells (hMSC), and in the experiment using skin fibroblasts. Hardly this differentiation occurred. Therefore, it was found that the method of the present invention is an excellent method with less hypertrophic cartilage differentiation and osteoblast differentiation.
[0044]
(Example 5)
A skin fibroblast proliferation experiment was performed.
When cultured under the same conditions as in Example 1, the skin fibroblasts increased about 100-fold in one month, and thereafter proliferated without any problem until 2-3 months. According to the results, if we start with 1,000,000 cells, we get 100,000,000 cells in one month, 10,000,000 cells in two months, and this last figure is Assuming that the cells are spheres with a diameter of 10 μm, 10 cm3This indicates that dermal fibroblasts can be used as a material for a sufficient amount of cartilage-like cells.
[0045]
【The invention's effect】
According to the present invention, a method for producing cartilage-like cells capable of efficiently producing cartilage-like cells from easily available non-chondrocytes, cartilage-like cells that can be used for experiments and medical use, and cartilage-like A composition for cell induction can be provided.
[0046]
[Sequence list]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the construction of a vector.
FIG. 2 is a graph showing the induction of cartilage differentiation of human dermal fibroblasts by the expression of Sox5, 6, and 9 genes, as expressed by the amount of cartilage-specific gene expression.
FIG. 3 is a photograph showing the induction of cartilage differentiation of human dermal fibroblasts by the expression of Sox5, 6, and 9 genes, expressed by staining of cartilage matrix.
FIG. 4 is a diagram showing the cartilage differentiation promoting effect of three-dimensional culture in terms of the amount of cartilage-specific gene expression.
FIG. 5 is a photograph showing cartilage differentiation by three-dimensional culture by staining of cartilage matrix.
FIG. 6 is a diagram showing suppression of hypertrophic cartilage differentiation and osteoblast differentiation by expression of Sox5, 6, and 9 genes.
