【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、パラヒドロキノン化合物（すなわち、パラヒドロキノン及びその誘導体）の製造法に関する。より具体的には、本発明は、フェノール化合物（すなわち、フェノール及びその誘導体）を基質として、微生物又は酵素による位置選択的な水酸化によりパラヒドロキノン化合物を製造する方法に関する。製造されるパラヒドロキノン化合物は、例えば、医薬、農薬、又は染料の各中間体として極めて有用な化合物である（国際公開第ＷＯ０２／０５３５５２号パンフレット）。
【０００２】
【従来の技術】
２位に置換基（例えば、ハロゲン原子、メトキシ基、又はベンジルオキシ基）を有するキノン類又はヒドロキノン類の合成は、従来困難であり、それらの合成法としては、例えば、以下の方法が知られていた。
すなわち、ベンゾキノンを無水酢酸中にて臭化亜鉛で処理することにより、２−ブロモヒドロキノンジアセテートに導いた後、加水分解により２−ブロモヒドロキノンを合成する方法（非特許文献１）、あるいは、２−メトキシフェノール（非特許文献２）又はｏ−ベンジルオキシフェノールをフレミー（Ｆｒｅｍｙ）塩で酸化して２−メトキシパラキノン又は２−ベンジルオキシパラキノンとした後、無水酢酸中にて亜鉛で処理することにより、２−メチルオキシヒドロキノン又は２−ベンジルオキシヒドロキノンを合成する方法（非特許文献３）等が公知である。
しかし、これらの方法は、高価なベンゾキノンや爆発性のフレミー塩を使用しており、コスト又は工程上の面で問題を有しており、工業化には種々の検討を要するため、新たな製造方法が求められていた。
【０００３】
一方、微生物を用いたヒドロキノンの製造方法としては、例えば、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物（特許文献１）、あるいは、メチロシヌス・スポリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｓｐｏｒｉｕｍ）（特許文献２）を用いて、ベンゼン又はフェノールからヒドロキノンを製造する方法が提案されているが、置換基を有するヒドロキノンの製造に関しては何等記載されていない。
【０００４】
本発明の製造方法で使用することのできるバシルス属に属する微生物として、例えば、バシルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）が知られている。
本発明の製造方法において用いることのできる、バシルス属に属する微生物由来のシトクロムＰ４５０として、例えば、バシルス・メガテリウム由来のシトクロムＰ４５０（ＢＭ−３）（非特許文献４）が知られている。また、シトクロムＰ４５０（ＢＭ−３）の変異型酵素シトクロムＰ４５０（Ｆ８７Ｖ）（非特許文献５）も知られている。
【０００５】
更に、シトクロムＰ４５０（Ｆ８７Ｖ）とシトクロムＰ４５０（ＢＭ−３）とを比較して、次のような報告がなされている。
（１）シトクロムＰ４５０（Ｆ８７Ｖ）は、シトクロムＰ４５０（ＢＭ−３）よりも過酸化水素による阻害を受けにくい（非特許文献５）。
（２）複素環化合物又は多環式化合物に対する活性が上昇している（非特許文献６）。
（３）プロピルベンゼン又はクロロスチレンに対する立体選択性が変化している（非特許文献７）。
しかしながら、フェノール化合物からパラヒドロキノン化合物を製造する方法については何等報告されていない。
【０００６】
【特許文献１】
特開昭６０−２１０９９１号公報
【特許文献２】
特開昭６１−７８３９４号公報
【非特許文献１】
「シンセシス（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」，（ドイツ），１９９０年，ｐ．９３５
【非特許文献２】
「ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，（米国），１９８５年，第５０巻，ｐ．１９６３
【非特許文献３】
「薬学雑誌」，１９７０年，第９０巻，ｐ．１２８３
【非特許文献４】
「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，（米国），１９８９年，第１９巻，ｐ．１０９８７−１０９９５
【非特許文献５】
「バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）」，（米国），２００１年，第２８０巻，ｐ．１２５８−１２６１
【非特許文献６】
「アプライド・アンド・エンバイアロンメンタル・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」，（米国），２００１年，第６７巻，ｐ．５７３５−５７３９
【非特許文献７】
「フェブス・レターズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ）」，２００１年，第５０８巻，ｐ．２４９−２５２
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、従来技術の前記の欠点を解消し、フェノール化合物のパラ位を選択的に水酸化することによりパラヒドロキノン化合物を製造する方法であって、しかも、特別な設備装置又は操作法が必要でなく、安全衛生又は環境対策の面でも問題がなく、従って、工業的に有利な前記製造方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
前記課題は、本発明による、４位に置換基を有さないフェノール化合物に、バシルス属に属する微生物由来のシトクロムＰ４５０若しくはその機能的等価改変体、又は前記シトクロムＰ４５０若しくはその機能的等価改変体を発現可能な微生物を作用させることにより、前記フェノール化合物のパラ位を選択的に水酸化する、パラヒドロキノン化合物の製造方法により解決することができる。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の製造方法では、基質であるフェノール化合物に、
（ａ）バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物由来のシトクロムＰ４５０
（ｂ）前記シトクロムＰ４５０（ａ）の機能的等価改変体、又は
（ｃ）前記シトクロムＰ４５０（ａ）若しくは前記機能的等価改変体（ｂ）の少なくとも１つを発現可能な微生物
の少なくとも１つを作用させ、前記フェノール化合物のパラ位を選択的に水酸化することによって、生成物としてパラヒドロキノン化合物を得ることができる。
以下、前記シトクロムＰ４５０（ａ）と、その機能的等価改変体（ｂ）とを併せて、本発明における「水酸化用酵素」と称することがあり、また、前記水酸化用酵素を含む微生物（ｃ）を、本発明における「水酸化用微生物」と称することがある。
【００１０】
バシルス属に属する微生物としては、例えば、バシルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）を挙げることができる。
本発明の製造方法において水酸化用酵素として用いることのできる、バシルス属に属する微生物由来のシトクロムＰ４５０は、フェノール化合物のパラ位を選択的に水酸化することによってパラヒドロキノン化合物を生成することのできる酵素である限り、特に限定されるものではなく、例えば、バシルス・メガテリウム由来のシトクロムＰ４５０（ＢＭ−３）（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９， １０９８７−１０９９５， １９８９）を挙げることができる。
シトクロムＰ４５０（ＢＭ−３）は、配列番号１で表されるアミノ酸配列（アミノ酸残基数＝１０４８個）からなるポリペプチドである。シトクロムＰ４５０（ＢＭ−３）は、Ｎ末端にメチオニン（Ｍｅｔ）が付加された前駆体（アミノ酸残基数＝１０４９個）として翻訳され、翻訳後修飾により前記メチオニンが除去された成熟体（アミノ酸残基数＝１０４８個）に変換される。
【００１１】
本発明の製造方法において水酸化用酵素として用いることのできる機能的等価改変体としては、例えば、
（ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、フェノール化合物のパラ位を選択的に水酸化することによってパラヒドロキノン化合物を生成することのできる酵素活性（以下、パラ位選択的水酸化活性と称する）を有するポリペプチド、あるいは、
（ｉｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、全体として１又は複数個（好ましくは１〜数個、特に好ましくは１個）のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、パラ位選択的水酸化活性を有するポリペプチド
を挙げることができる。
【００１２】
これらの機能的改変体は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の情報に基づいて、遺伝子工学的に調製することができる。例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを出発材料として、例えば、部位特異的突然変異誘発法（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ； Ｍａｒｋ， Ｄ． Ｆ． ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１， ５６６２−５６６６， １９８４）により、変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを取得し、そのポリヌクレオチドを適当な発現系を用いて発現させ、パラ位選択的水酸化活性を示す、所望のポリペプチドを取得することができる。
【００１３】
例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、パラ位選択的水酸化活性を有するポリペプチドとしては、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列、あるいは、開始コドンＡＴＧに由来するメチオニン等を付加したポリペプチド（すなわち、融合ポリペプチド）も、パラ位選択的水酸化活性を有する限り、使用することができる。前記マーカー配列としては、例えば、ポリペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、あるいは、精製等を容易に行なうための配列を用いることができ、例えば、ＦＬＡＧタグ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができる。
【００１４】
機能的等価改変体の例としては、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列における第８７番目のフェニルアラニンがバリンに置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを挙げることができる。より具体的には、例えば、（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列における第８７番目のフェニルアラニンがバリンに置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは、後述の実施例で使用する、（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列における第８７番目のフェニルアラニンがバリンに置換されたアミノ酸配列であって、更に、そのＮ末端側にメチオニンが付加され、Ｃ末端側にヒスチジンタグが付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド［以下、シトクロムＰ４５０（Ｆ８７Ｖ）と称する；Ｌｉ， Ｑ．Ｓ．， Ｊ． Ｏｇａｗａ， ａｎｄ Ｓ． Ｓｈｉｍｉｚｕ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ２８０， １２５８−１２６１， ２００１］を挙げることができる。
【００１５】
本発明の製造方法では、配列番号１で表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上（好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上）であるアミノ酸配列を含み、パラ位選択的水酸化活性を有するポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと称する）も、水酸化用酵素として使用することができる。
また、シトクロムＰ４５０（ＢＭ−３）の部分断片又はシトクロムＰ４５０（Ｆ８７Ｖ）の部分断片も、パラ位選択的水酸化活性を有する限り、使用することができる。前記相同ポリペプチド及び前記部分断片も、機能的等価改変体に含まれる。
【００１６】
本発明の製造方法において水酸化用微生物として用いることのできる微生物は、基質と作用させる際に、基質と作用可能な状態で水酸化用酵素を発現可能な微生物である限り、特に限定されるものではなく、例えば、水酸化用酵素をコードするポリヌクレオチドを遺伝子工学的に導入した形質転換体であることもできるし、あるいは、水酸化用酵素を発現することが知られている天然の微生物（例えば、バシルス属に属する微生物、好ましくはバシルス・メガテリウム）であることもできる。水酸化用微生物中に含まれる水酸化用酵素の量を人為的に増加させることができる点で、形質転換体であることが好ましい。
【００１７】
水酸化用微生物として用いることのできる各種形質転換体（以下、水酸化用形質転換体と称する）を作成するために使用することのできる宿主細胞は、基質と作用可能な状態で水酸化用酵素を発現することができる限り、特に限定されるものではなく、例えば、通常使用される公知の微生物、例えば、大腸菌又は酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、あるいは、公知の培養細胞、例えば、脊椎動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞又はＣＯＳ細胞）又は昆虫細胞を挙げることができる。増殖速度が速く、取り扱いが容易な点で、大腸菌が好ましい。
また、水酸化用形質転換体を作成するために使用することのできる発現ベクターは、基質と作用可能な状態で水酸化用酵素を発現することができる限り、特に限定されるものではなく、使用する宿主細胞の種類に応じて、適宜選択することができる。
【００１８】
本発明の製造方法では、前記水酸化用微生物をそのまま基質と作用させることもできるし、あるいは、前記水酸化用微生物及び／又はその培養液から、公知の分離精製操作を用いて分離精製した水酸化用酵素の状態で、基質と作用させることもできる。前記分離精製操作としては、例えば、通常のタンパク質沈殿剤による処理、限外濾過、各種液体クロマトグラフィー［例えば、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換体クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等］、若しくは透析法、又はこれらの組合せ等を挙げることができる。
【００１９】
本発明の製造方法において基質として用いることのできるフェノール化合物は、４位（パラ位）に置換基を有さず（すなわち、４位が水素原子である）、前記水酸化用酵素又は水酸化用微生物により、そのパラ位を選択的に水酸化され、パラヒドロキノン化合物を生成することのできる化合物である限り、特に限定されるものではなく、例えば、式（１）で表されるフェノール化合物を挙げることができる。
式（１）：
【化２】
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数１〜５のアルコキシ基、アリール基、ベンジルオキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、又はアミノ基である］で表されるフェノール化合物に、水酸化用酵素又は水酸化用微生物を作用させることにより、式（２）：
【化３】
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、前記と同じ意味である］で表されるパラヒドロキノン化合物を製造することができる。
【００２０】
炭素数１〜５のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｉ−ペンチル基、ネオペンチル基、ｔ−ペンチル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、１，２−ジメチルプロピル基、又は１−エチルプロピル基を挙げることができる。前記アルキル基としては、炭素数１〜３のアルキル基が好ましく、炭素数１又は２のアルキル基（すなわち、メチル基又はエチル基）がより好ましく、メチル基が特に好ましい。
【００２１】
炭素数１〜５のアルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、ｉ−プロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｉ−ブトキシ基、ｓ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、ｉ−ペンチルオキシ基、ネオペンチルオキシ基、ｔ−ペンチルオキシ基、１−メチルブトキシ基、２−メチルブトキシ基、１，２−ジメチルプロポキシ基、又は１−エチルプロポキシ基を挙げることができる。前記アルコキシ基としては、炭素数１〜３のアルコキシ基が好ましく、炭素数１又は２のアルコキシ基（すなわち、メトキシ基又はエトキシ基）がより好ましく、メトキシ基が特に好ましい。
【００２２】
本明細書におけるアリール基には、非置換アリール基及び置換アリール基の両方が含まれる。前記アリール基としては、特に限定されるものではないが、置換基を除いた骨格部分の炭素数が６であるアリール基が好ましく、例えば、非置換又は置換のフェニル基、トリル基、又はキシリル基などを挙げることができる。
【００２３】
ハロゲン原子としては、例えば、塩素原子、臭素原子、フッ素原子、又はヨウ素原子を挙げることができる。
【００２４】
本発明の製造方法において基質として用いることのできるフェノール化合物において、その置換基の数は、前記水酸化用酵素又は水酸化用微生物により、そのパラ位が選択的に水酸化され、パラヒドロキノン化合物を生成することのできる限り、特に限定されるものではなく、１〜４個であることができ、１〜２個であることが好ましく、１個であることがより好ましい。なお、本明細書において、フェノール化合物における置換基の数とは、１位の水酸基を除いた置換基の数を意味する。
置換基の数が２個である場合には、それらの置換基の位置は、２位及び６位であることが好ましい。置換基の数が１個である場合には、その置換基の位置は、２位又は３位であることが好ましい。
【００２５】
本発明の製造方法において基質として用いることのできる式（１）で表されるフェノール化合物としては、
（ａ）Ｒ１又はＲ２のいずれか一方が、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数１〜５のアルコキシ基、アリール基、ベンジルオキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、又はアミノ基であり［より好ましくは、炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、アリール基、ベンジルオキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、又はアミノ基であり、更に好ましくは、メチル基、メトキシ基、ベンジルオキシ基、ハロゲン原子（特には塩素原子）、又はニトロ基であり］、Ｒ１又はＲ２の残る一方並びにＲ３及びＲ４が水素原子であるフェノール化合物；あるいは、
（ｂ）Ｒ１及びＲ４が、それぞれ独立に、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数１〜５のアルコキシ基、アリール基、ベンジルオキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、又はアミノ基であり［より好ましくは、炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、アリール基、ベンジルオキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、又はアミノ基であり、更に好ましくは、メチル基、メトキシ基、ベンジルオキシ基、ハロゲン原子（特には塩素原子）、又はニトロ基であり］、Ｒ２及びＲ３が水素原子であるフェノール化合物
が好ましい。
【００２６】
本発明の製造方法において、基質に水酸化用酵素又は水酸化用微生物を作用させる際の反応条件は、例えば、使用する基質及び水酸化用酵素又は水酸化用微生物の種類などに応じて適宜決定することができる。以下、水酸化用酵素としてシトクロムＰ４５０（ＢＭ−３）又はシトクロムＰ４５０（Ｆ８７Ｖ）を用いる場合を例にとって、反応条件について説明する。なお、水酸化用微生物を用いる場合も、これに準ずる。
溶媒としては、水酸化用酵素の活性を維持可能な、あるいは、大幅に低下させることのない溶媒である限り、特に限定されるものではなく、例えば、水又は水系溶媒を用いることができる。前記水系溶媒としては、酵素反応に一般的に使用される公知の緩衝液、例えば、トリス塩酸緩衝液又はリン酸カリウム緩衝液を用いることができる。
【００２７】
反応温度は、水酸化用酵素の至適温度、並びに、基質及び生成物の安定温度などを考慮して適宜決定することができ、例えば、１０〜４５℃、好ましくは１５〜４０℃、更に好ましくは２０〜４０℃、特に好ましくは２５〜３５℃で実施することができる。
反応ｐＨも、水酸化用酵素の至適ｐＨ、並びに、基質及び生成物の安定ｐＨなどを考慮して適宜決定することができ、例えば、４〜１０、好ましくは５〜９、更に好ましくは６〜９、特に好ましくは７〜８で実施することができる。
反応時間は、前記各種条件（すなわち、使用する溶媒、反応温度、又は反応ｐＨ）、あるいは、使用する基質及び水酸化用酵素又は水酸化用微生物の種類などに応じて適宜決定することができ、例えば、１〜１００時間、好ましくは５〜４８時間、より好ましくは１２〜３６時間である。
使用する水酸化用酵素の量は、特に限定されるものではないが、例えば、０．５〜２０μｍｏｌ／Ｌの濃度で実施することができる。
【００２８】
本発明の製造方法では、フェノール化合物に水酸化用酵素又は水酸化用微生物を作用させる際に、所望により、補酵素（例えば、ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨ、好ましくはＮＡＤＰＨ）を共存させることができ、更に、前記補酵素の再生系を共存させることができる。
本発明の製造方法で使用する水酸化用酵素は、その反応において補酵素を必要とし、例えば、シトクロムＰ４５０（ＢＭ−３）及びシトクロムＰ４５０（Ｆ８７Ｖ）は、ＮＡＤＰＨを補酵素として要求する。従って、本発明の製造方法では、使用する水酸化用酵素の種類に応じて、適当な補酵素を共存させることにより、その反応性を向上させることができる。
【００２９】
また、反応の進行に伴って、補酵素が消費される［例えば、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが消費され、ＮＡＤ（Ｐ）＋に変換される］ため、更に、前記補酵素の再生系を共存させることにより、その反応性を向上させることができる。補酵素再生系としては、各補酵素毎に種々の再生系が公知であり、例えば、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生系としては、例えば、グルコースとグルコースデヒドロゲナーゼとの組み合わせ、ギ酸とギ酸デヒドロゲナーゼとの組み合わせ、又はプロパノールとアルコールデヒドロゲナーゼとの組み合わせなどを挙げることができる。
【００３０】
また、本発明の製造方法では、フェノール化合物に水酸化用酵素又は水酸化用微生物を作用させる際に、所望により、過酸化水素消去系を共存させることができる。本発明の製造方法で使用する水酸化用酵素、例えば、シトクロムＰ４５０（ＢＭ−３）及びシトクロムＰ４５０（Ｆ８７Ｖ）は、反応副生物として過酸化水素を生成することがある。前記過酸化水素は、水酸化用酵素による反応系に阻害的に作用するため、過酸化水素消去系を共存させることにより、反応の効率を向上させることができる。前記過酸化水素消去系としては、例えば、カタラーゼ又はペルオキシダーゼを挙げることができる。
【００３１】
本発明の製造方法において共存させることのできるこれらの補酵素、補酵素再生系、又は過酸化水素消去系の添加量は、使用する基質及び水酸化用酵素又は水酸化用微生物の種類などに応じて適宜決定することができる。例えば、補酵素としてＮＡＤＰＨを使用し、補酵素再生系としてグルコースとグルコースデヒドロゲナーゼとの組み合わせを使用し、過酸化水素消去系としてカタラーゼを使用する場合には、通常、ＮＡＤＰＨは０．００２〜０．２％（ｗ／ｖ）、グルコースは０．１〜１０％（ｗ／ｖ）、グルコースデヒドロゲナーゼは１〜２００Ｕ／ｍＬ、及びカタラーゼは１〜８００Ｕ／ｍＬの量で、それぞれ、共存させることができる。
【００３２】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
《天然型酵素ＢＭ−３又は変異型酵素Ｆ８７Ｖによるパラヒドロキノン化合物の製造》
本実施例では、バシルス・メガテリウムから精製した天然型酵素Ｐ４５０（ＢＭ−３）、前記天然型酵素Ｐ４５０（ＢＭ−３）を大腸菌で発現して得られた組換え型酵素Ｐ４５０（ＢＭ−３）、及び大腸菌で発現して得られた変異型酵素Ｐ４５０（Ｆ８７Ｖ）を用いて、各種フェノール化合物を基質としてパラヒドロキノン化合物の製造を行った。
【００３３】
本実施例の以下の操作で用いた天然型酵素Ｐ４５０（ＢＭ−３）は、バシルス・メガテリウム（ＡＴＣＣ １４５８１）から、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ， ３１０， １２６−１３３， １９９４に記載の方法に従って調製した。
また、組換え型酵素Ｐ４５０（ＢＭ−３）は、前記バシルス・メガテリウムから天然型Ｐ４５０（ＢＭ−３）をコードするＤＮＡを単離し、前記ＤＮＡで形質転換することにより得られた形質転換体から調製した。
【００３４】
変異型酵素Ｐ４５０（Ｆ８７Ｖ）は、前記バシルス・メガテリウムからＰ４５０（ＢＭ−３）をコードするＤＮＡを単離し、そのＤＮＡを用いて、部位特異的突然変異誘発法により、第８７番目のフェニルアラニンをバリンに置換した改変体をコードするＤＮＡを作製し、得られたＤＮＡで大腸菌を形質転換することにより形質転換体ＦＥＲＭ Ｐ−１９１８７株を得、前記形質転換体から調製した（Ｌｉ， Ｑ．Ｓ．， Ｊ． Ｏｇａｗａ， ａｎｄ Ｓ． Ｓｈｉｍｉｚｕ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ２８０， １２５８−１２６１， ２００１）。
前記大腸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１９１８７株は、２００３年（平成１５年）１月１７日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（あて名：〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に国内寄託されたものであり、その受託番号は、ＦＥＲＭ Ｐ−１９１８７である。
【００３５】
なお、大腸菌で発現させた組換え型酵素Ｐ４５０（ＢＭ−３）及び変異型酵素Ｐ４５０（Ｆ８７Ｖ）は、そのＮ末端側［すなわち、配列番号１で表されるアミノ酸配列における先頭のスレオニン（Ｔｈｒ）の前］に、開始コドンＡＴＧに由来するメチオニンが付加され、Ｃ末端側にヒスチジンタグが付加されている。
更に、本実施例で用いた基質は、例えば、Ｊ． Ｈ． Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｇ． Ｔ． Ｙｏｕｎｇ， Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ４３６， １９６８； Ｈ． Ｇ． Ｊ． Ｖｉｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， ５０ ３１３３， １９８５に記載の方法により製造した。
【００３６】
０．１ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）０．７ｍＬに、１０％濃度になるように基質（フェノール化合物）を溶解させたジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液１０μＬを加えた。この溶液に、グルコース溶液［０．１ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に１２％（ｗ／ｖ）］８０μＬ、カタラーゼ溶液［０．１ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に０．１％（ｗ／ｖ）］８μＬ、ＮＡＤＰＨ溶液［０．１ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に０．５％（ｗ／ｖ）］５０μＬ、及びグルコースデキドロゲナーゼ［ＧＤＨ：０．１ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に１．０％（ｗ／ｖ）］２０μＬを添加してよく混ぜた。
【００３７】
この混合液に、天然型酵素Ｐ４５０（ＢＭ−３）、組換え型酵素Ｐ４５０（ＢＭ−３）、又は変異型酵素Ｐ４５０（Ｆ８７Ｖ）溶液［０．１ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に１０μｍｏｌ／Ｌ）２００μＬを添加し、３０℃で振蕩しながら２４時間反応させた。反応終了後、酢酸エチル１ｍＬを加えて、よく混和し、反応を停止させた。
この溶液に内部標準溶液［１−ナフトールを２％（ｗ／ｖ）になるように酢酸エチルに溶解］１５０μＬを添加し、ボルテックスミキサーで１分間攪拌した。攪拌後、３０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離を行い、上清の有機層を集めた。有機層を遠心エバポレーターを用いて室温で乾燥（３０〜４０分間）させた。乾燥した残渣に酢酸エチル２００μＬを加えた後、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）により定量を行った。
【００３８】
組換え型酵素Ｐ４５０（ＢＭ−３）及び変異型酵素Ｐ４５０（Ｆ８７Ｖ）に関して、結果を表１に示す。なお、、天然型酵素Ｐ４５０（ＢＭ−３）については、組換え型酵素Ｐ４５０（ＢＭ−３）とほぼ同じ結果を示した。
表１から明らかなように、２位に置換基を有する基質の場合には、Ｐ４５０（Ｆ８７Ｖ）の変換率は、Ｐ４５０（ＢＭ−３）に比べて高い傾向が認められた。特に、２−ベンジルオキシフェノールから２−ベンジルオキシヒドロキノンへの反応に関して、Ｐ４５０（Ｆ８７Ｖ）は高い変換率を示した。
【００３９】
【００４０】
【実施例２】
《変異型酵素Ｐ４５０（Ｆ８７Ｖ）発現大腸菌による２−ベンジルオキシヒドロキノンの製造》
本実施例では、変異型酵素Ｐ４５０（Ｆ８７Ｖ）発現大腸菌として、実施例１に記載の形質転換体ＦＥＲＭ Ｐ−１９１８７株を使用した。形質転換体ＦＥＲＭ Ｐ−１９１８７株は、ジャーファーメンターを用いて、培地［水２．５Ｌ中に、トリプトン３０ｇ、酵母エキス（ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）６０ｇ、及びグリセロール１０ｇ］２．５Ｌにアデカノール（Ａｄｅｃａｎｏｌ Ｂ；旭電化工業）５００μＬ及びリン酸カリウム緩衝液（水１００ｍＬ中に、ＫＨ２ＰＯ４５．８７ｇ及びＫ２ＨＰＯ４３１．３５ｇ）１００ｍＬを加えた培養液中で、１２時間培養することにより調製した。
【００４１】
得られたＰ４５０（Ｆ８７Ｖ）発現大腸菌を、０．８５％塩化ナトリウム水溶液で洗浄した後、表２に示す組成からなる反応溶液中で、振盪（３００ｒｐｍ）しながら２８℃で２４時間反応させた。２−ベンジルオキシフェノール（基質）から２−ベンジルオキシヒドロキノン（生成物）への変換率は、５４．７％であった。
【００４２】
【００４３】
【発明の効果】
本発明の製造方法によれば、フェノール化合物からパラヒドロキノン化合物、例えば、２−ベンジルオキシフェノールから位置選択的に水酸化されて２−ベンジルオキシヒドロキノンを得ることができる。本発明の製造方法は、設備装置類又は操作法に関して特別なものを必要とせず、安全衛生又は環境対策も特別問題はなく、工業的に有利に実施可能である。
【００４４】
【配列表】
[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing parahydroquinone compounds (ie, parahydroquinone and its derivatives). More specifically, the present invention relates to a method for producing a parahydroquinone compound by regioselective hydroxylation by a microorganism or an enzyme using a phenol compound (that is, phenol and its derivatives) as a substrate. The produced parahydroquinone compound is, for example, a compound that is extremely useful as an intermediate of a drug, a pesticide, or a dye (WO02 / 053552).
[0002]
[Prior art]
Synthesis of quinones or hydroquinones having a substituent at the 2-position (eg, a halogen atom, a methoxy group, or a benzyloxy group) has been conventionally difficult, and the following methods are known as methods for synthesizing them. I was
That is, a method of treating benzoquinone with zinc bromide in acetic anhydride to lead to 2-bromohydroquinone diacetate and then synthesizing 2-bromohydroquinone by hydrolysis (Non-Patent Document 1), or -Methoxyphenol (Non-Patent Document 2) or o-benzyloxyphenol is oxidized with Fremy's salt to 2-methoxyparaquinone or 2-benzyloxyparaquinone, and then treated with zinc in acetic anhydride. Thus, a method of synthesizing 2-methyloxyhydroquinone or 2-benzyloxyhydroquinone (Non-Patent Document 3) and the like are known.
However, these methods use expensive benzoquinone or explosive frémy salts, have problems in terms of cost or process, and require various studies for industrialization. Was required.
[0003]
On the other hand, as a method for producing hydroquinone using a microorganism, for example, benzene or phenol can be obtained by using a microorganism belonging to the genus Rhodococcus (Patent Document 1) or Methylosinus sporium (Patent Document 2). Has been proposed, but there is no description about the production of a hydroquinone having a substituent.
[0004]
Bacillus megaterium (Bacillus megaterium) is known as a microorganism belonging to the genus Bacillus that can be used in the production method of the present invention.
As cytochrome P450 derived from a microorganism belonging to the genus Bacillus that can be used in the production method of the present invention, for example, cytochrome P450 (BM-3) derived from Bacillus megaterium (Non-Patent Document 4) is known. In addition, a cytochrome P450 (BM-3) mutant enzyme cytochrome P450 (F87V) (Non-Patent Document 5) is also known.
[0005]
Furthermore, the following reports have been made comparing cytochrome P450 (F87V) and cytochrome P450 (BM-3).
(1) Cytochrome P450 (F87V) is less susceptible to inhibition by hydrogen peroxide than cytochrome P450 (BM-3) (Non-Patent Document 5).
(2) The activity for a heterocyclic compound or a polycyclic compound is increased (Non-Patent Document 6).
(3) The stereoselectivity for propylbenzene or chlorostyrene has changed (Non-Patent Document 7).
However, there is no report on a method for producing a parahydroquinone compound from a phenol compound.
[0006]
[Patent Document 1]
JP-A-60-210991
[Patent Document 2]
JP-A-61-78394
[Non-patent document 1]
"Synthesis", (Germany), 1990, p. 935
[Non-patent document 2]
"Journal of Organic Chemistry", (USA), 1985, vol. 50, p. 1963
[Non-Patent Document 3]
"Pharmaceutical Magazine", 1970, Vol. 90, p. 1283
[Non-patent document 4]
"The Journal of Biological Chemistry", (USA), 1989, Vol. 19, p. 10987-10995
[Non-Patent Document 5]
"Biochemical and Biophysical Research Communications", (USA), 2001, Vol. 280, p. 1258-1261
[Non-Patent Document 6]
"Applied and Environmental Microbiology", (USA), 2001, Vol. 67, p. 5735-5739
[Non-Patent Document 7]
"FEBS Letters", 2001, vol. 508, p. 249-252
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method for producing a parahydroquinone compound by selectively hydroxylating the para-position of a phenol compound, which solves the above-mentioned disadvantages of the prior art, and furthermore, a special equipment or operating method. Therefore, there is no problem in terms of safety and health or environmental measures, and therefore, it is an object of the present invention to provide an industrially advantageous production method.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The object is to provide a phenolic compound having no substituent at the 4-position according to the present invention by adding cytochrome P450 derived from a microorganism belonging to the genus Bacillus or a functionally equivalent variant thereof, or the cytochrome P450 or a functionally equivalent variant thereof. The problem can be solved by a method for producing a parahydroquinone compound, in which a parasite of the phenol compound is selectively hydroxylated by allowing a microorganism capable of expression to act.
[0009]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
In the production method of the present invention, a phenol compound as a substrate
(A) Cytochrome P450 derived from a microorganism belonging to the genus Bacillus
(B) a functionally equivalent variant of the cytochrome P450 (a), or
(C) a microorganism capable of expressing at least one of the cytochrome P450 (a) or the functionally equivalent variant (b)
By reacting at least one of them to selectively hydroxylate the para-position of the phenol compound, thereby obtaining a parahydroquinone compound as a product.
Hereinafter, the cytochrome P450 (a) and its functionally equivalent variant (b) may be collectively referred to as “hydroxylation enzyme” in the present invention, and a microorganism containing the hydroxylation enzyme ( c) may be referred to as the "hydroxylation microorganism" in the present invention.
[0010]
Examples of the microorganism belonging to the genus Bacillus include, for example, Bacillus megaterium.
Cytochrome P450 derived from a microorganism belonging to the genus Bacillus, which can be used as a hydroxylation enzyme in the production method of the present invention, can produce a parahydroquinone compound by selectively hydroxylating the para-position of a phenol compound. The enzyme is not particularly limited as long as it is an enzyme, and examples thereof include cytochrome P450 (BM-3) derived from Bacillus megaterium (J. Biol. Chem., 19, 10987-10995, 1989).
Cytochrome P450 (BM-3) is a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (the number of amino acid residues = 1048). Cytochrome P450 (BM-3) is translated as a precursor (number of amino acid residues = 1049) having methionine (Met) added to the N-terminus, and is a mature form (amino acid residue having the methionine removed by post-translational modification). (Radix = 1048).
[0011]
Functionally equivalent variants that can be used as hydroxylating enzymes in the production method of the present invention include, for example,
(I) an enzymatic activity containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and capable of producing a parahydroquinone compound by selectively hydroxylating the para-position of a phenol compound (hereinafter referred to as a para-selective hydroxylation activity) Or a polypeptide having
(Ii) In one or more positions of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, one or more (preferably 1 to several, particularly preferably 1) amino acids are deleted, substituted, and / or Or a polypeptide comprising an inserted amino acid sequence and having para-selective hydroxylating activity
Can be mentioned.
[0012]
These functional variants can be prepared by genetic engineering based on the information on the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. For example, using a polynucleotide containing a base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 as a starting material, for example, site-specific mutagenesis; Mark, DF et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662-5666, 1984), obtain a polynucleotide encoding a mutant polypeptide, express the polynucleotide using an appropriate expression system, and obtain para-selective water. A desired polypeptide having an oxidizing activity can be obtained.
[0013]
For example, a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having a para-selective hydroxylation activity includes, for example, the N-terminal and / or C-terminal of the polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. A polypeptide having an appropriate marker sequence or a methionine derived from the initiation codon ATG at the end (ie, a fusion polypeptide) can also be used as long as it has para-selective hydroxylation activity. As the marker sequence, for example, a sequence for easily confirming expression of a polypeptide, confirming intracellular localization, or purification or the like can be used. For example, a FLAG tag, a hexa-histidine tag, Examples include a hemagglutinin tag or a myc epitope.
[0014]
Examples of functionally equivalent variants include, for example, a polypeptide comprising an amino acid sequence in which phenylalanine at position 87 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 has been substituted with valine. More specifically, for example, (1) a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which the phenylalanine at position 87 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 has been substituted with valine, or used in the examples described below ( 2) An amino acid sequence in which the phenylalanine at position 87 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 has been substituted with valine, and a methionine has been added to the N-terminal thereof and a histidine tag has been added to the C-terminal thereof. A polypeptide comprising the amino acid sequence [hereinafter referred to as cytochrome P450 (F87V); S. , J. et al. Ogawa, and S.M. Shimizu, Biochem. Biophys. Res. Commun. , 280, 1258-1261, 2001].
[0015]
In the production method of the present invention, the homology to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is 80% or more (preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, particularly preferably 99% or more. Polypeptides having the amino acid sequence of (i) and having para-selective hydroxylation activity (hereinafter, referred to as homologous polypeptides) can also be used as hydroxylases.
In addition, a partial fragment of cytochrome P450 (BM-3) or a partial fragment of cytochrome P450 (F87V) can be used as long as it has a para-selective hydroxylation activity. The homologous polypeptide and the partial fragment are also included in functionally equivalent variants.
[0016]
Microorganisms that can be used as hydroxylating microorganisms in the production method of the present invention are not particularly limited, as long as they are microorganisms that can express a hydroxylating enzyme in a state in which they can act on a substrate when acting on the substrate. Instead, for example, it may be a transformant in which a polynucleotide encoding a hydroxylase is introduced by genetic engineering, or a natural microorganism known to express a hydroxylase ( For example, it may be a microorganism belonging to the genus Bacillus, preferably Bacillus megaterium). Transformants are preferred in that the amount of hydroxylating enzyme contained in the microorganism for hydroxylation can be artificially increased.
[0017]
Host cells that can be used to prepare various transformants that can be used as hydroxylating microorganisms (hereinafter, referred to as hydroxylating transformants) include a hydroxylating enzyme that can act on a substrate. The microorganism is not particularly limited as long as it can express, for example, a commonly used known microorganism such as Escherichia coli or yeast (Saccharomyces cerevisiae), or a known cultured cell such as a vertebrate cell (for example, , CHO cells or COS cells) or insect cells. Escherichia coli is preferred because of its high growth rate and easy handling.
In addition, the expression vector that can be used for preparing a transformant for hydroxylation is not particularly limited as long as the enzyme for hydroxylation can be expressed in a state capable of acting on a substrate. Can be appropriately selected depending on the type of host cell to be used.
[0018]
In the production method of the present invention, the microorganism for hydroxylation can be allowed to act as it is on the substrate, or water separated and purified from the microorganism for hydroxylation and / or a culture thereof using a known separation and purification operation. It can be made to act on a substrate in the state of an oxidizing enzyme. Examples of the separation and purification operation include, for example, treatment with a normal protein precipitant, ultrafiltration, various liquid chromatography [eg, molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchanger chromatography, affinity chromatography Or high performance liquid chromatography (HPLC), etc.], or dialysis, or a combination thereof.
[0019]
The phenolic compound that can be used as a substrate in the production method of the present invention has no substituent at the 4-position (para-position) (that is, the 4-position is a hydrogen atom), and The microorganism is not particularly limited as long as it is a compound that can be selectively hydroxylated at the para-position by a microorganism to produce a parahydroquinone compound. Examples thereof include a phenol compound represented by the formula (1). be able to.
Equation (1):
Embedded image
Embedded image
[Wherein, R 1 , R 2 , R 3 , And R 4 Has the same meaning as described above] can be produced.
[0020]
Examples of the alkyl group having 1 to 5 carbon atoms include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an i-propyl group, an n-butyl group, an i-butyl group, an s-butyl group, a t-butyl group, and n -Pentyl, i-pentyl, neopentyl, t-pentyl, 1-methylbutyl, 2-methylbutyl, 1,2-dimethylpropyl, and 1-ethylpropyl. As the alkyl group, an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms is preferable, an alkyl group having 1 or 2 carbon atoms (that is, a methyl group or an ethyl group) is more preferable, and a methyl group is particularly preferable.
[0021]
Examples of the alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms include a methoxy group, an ethoxy group, an n-propoxy group, an i-propoxy group, an n-butoxy group, an i-butoxy group, an s-butoxy group, a t-butoxy group, and n -Pentyloxy group, i-pentyloxy group, neopentyloxy group, t-pentyloxy group, 1-methylbutoxy group, 2-methylbutoxy group, 1,2-dimethylpropoxy group, or 1-ethylpropoxy group be able to. The alkoxy group is preferably an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms, more preferably an alkoxy group having 1 or 2 carbon atoms (that is, a methoxy group or an ethoxy group), and particularly preferably a methoxy group.
[0022]
The aryl group in the present specification includes both an unsubstituted aryl group and a substituted aryl group. The aryl group is not particularly limited, but is preferably an aryl group having 6 carbon atoms in a skeleton portion excluding a substituent, for example, an unsubstituted or substituted phenyl group, tolyl group, or xylyl group. And the like.
[0023]
Examples of the halogen atom include a chlorine atom, a bromine atom, a fluorine atom, and an iodine atom.
[0024]
In the phenolic compound that can be used as a substrate in the production method of the present invention, the number of the substituents is selectively hydroxylated at the para-position by the hydroxylation enzyme or the microorganism for hydroxylation, and a parahydroquinone compound is obtained. There is no particular limitation as long as it can be produced, and it can be 1 to 4, preferably 1 or 2, and more preferably 1. In the present specification, the number of substituents in the phenol compound means the number of substituents excluding the hydroxyl group at the 1-position.
When the number of the substituents is two, the positions of those substituents are preferably the 2-position and the 6-position. When the number of the substituents is one, the position of the substituent is preferably the 2-position or the 3-position.
[0025]
Examples of the phenol compound represented by the formula (1) that can be used as a substrate in the production method of the present invention include:
(A) R 1 Or R 2 Is an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, an aryl group, a benzyloxy group, a halogen atom, a nitro group, or an amino group [more preferably, 1 to 5 carbon atoms. Or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms, an aryl group, a benzyloxy group, a halogen atom, a nitro group, or an amino group, and more preferably a methyl group, a methoxy group, a benzyloxy group, or a halogen atom. (Especially a chlorine atom) or a nitro group], R 1 Or R 2 The other side and R 3 And R 4 A phenolic compound wherein is a hydrogen atom; or
(B) R 1 And R 4 Are each independently an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, an aryl group, a benzyloxy group, a halogen atom, a nitro group, or an amino group [more preferably, 1 to 5 carbon atoms. Or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms, an aryl group, a benzyloxy group, a halogen atom, a nitro group, or an amino group, and more preferably a methyl group, a methoxy group, a benzyloxy group, or a halogen atom. (Especially a chlorine atom) or a nitro group], R 2 And R 3 Is a hydrogen atom
Is preferred.
[0026]
In the production method of the present invention, the reaction conditions for allowing the hydroxylating enzyme or the hydroxylating microorganism to act on the substrate are appropriately determined, for example, according to the type of the substrate and the hydroxylating enzyme or the hydroxylating microorganism to be used. can do. Hereinafter, the reaction conditions will be described by taking as an example a case where cytochrome P450 (BM-3) or cytochrome P450 (F87V) is used as the hydroxylating enzyme. The same applies to the case where a microorganism for hydroxylation is used.
The solvent is not particularly limited as long as it is a solvent that can maintain the activity of the hydroxylating enzyme or does not significantly reduce the activity, and for example, water or an aqueous solvent can be used. As the aqueous solvent, a known buffer generally used for an enzyme reaction, for example, a Tris-HCl buffer or a potassium phosphate buffer can be used.
[0027]
The reaction temperature can be appropriately determined in consideration of the optimum temperature of the enzyme for hydroxylation, and the stable temperature of the substrate and the product, for example, 10 to 45 ° C, preferably 15 to 40 ° C, more preferably. Can be carried out at 20 to 40C, particularly preferably 25 to 35C.
The reaction pH can also be appropriately determined in consideration of the optimum pH of the enzyme for hydroxylation, the stable pH of the substrate and the product, and is, for example, 4 to 10, preferably 5 to 9, and more preferably 6 to 9. To 9, particularly preferably 7 to 8.
The reaction time can be appropriately determined according to the various conditions (that is, the solvent used, the reaction temperature, or the reaction pH), or the type of the substrate and the enzyme for hydroxylation or the microorganism for hydroxylation, or the like, For example, it is 1 to 100 hours, preferably 5 to 48 hours, more preferably 12 to 36 hours.
The amount of the hydroxylating enzyme to be used is not particularly limited, but for example, it can be carried out at a concentration of 0.5 to 20 μmol / L.
[0028]
In the production method of the present invention, a coenzyme (for example, NADPH or NADH, preferably NADPH) can be allowed to coexist with a phenol compound when the hydroxylating enzyme or the hydroxylating microorganism is allowed to act on the phenol compound. The coenzyme regeneration system can coexist.
The hydroxylating enzyme used in the production method of the present invention requires a coenzyme in the reaction. For example, cytochrome P450 (BM-3) and cytochrome P450 (F87V) require NADPH as a coenzyme. Therefore, in the production method of the present invention, the reactivity can be improved by coexisting an appropriate coenzyme according to the type of the hydroxylating enzyme to be used.
[0029]
In addition, coenzymes are consumed as the reaction proceeds [for example, NAD (P) H is consumed and NAD (P) + The reactivity can be further improved by coexisting the coenzyme regeneration system. As a coenzyme regeneration system, various regeneration systems are known for each coenzyme. For example, as a regeneration system for NAD (P) H, for example, a combination of glucose and glucose dehydrogenase, and a combination of formic acid and formate dehydrogenase Combinations or combinations of propanol and alcohol dehydrogenase can be mentioned.
[0030]
Further, in the production method of the present invention, when a hydroxylating enzyme or a hydroxylating microorganism is allowed to act on the phenol compound, a hydrogen peroxide elimination system can be allowed to coexist, if desired. The hydroxylating enzymes used in the production method of the present invention, for example, cytochrome P450 (BM-3) and cytochrome P450 (F87V) may generate hydrogen peroxide as a reaction by-product. Since the hydrogen peroxide acts on the reaction system by the enzyme for hydroxylation in an inhibitory manner, the coexistence of the hydrogen peroxide elimination system can improve the efficiency of the reaction. Examples of the hydrogen peroxide eliminating system include catalase and peroxidase.
[0031]
The amount of the coenzyme, coenzyme regeneration system, or hydrogen peroxide scavenging system that can be coexisted in the production method of the present invention depends on the type of the substrate and the enzyme for hydroxylation or the microorganism for hydroxylation, etc. Can be determined appropriately. For example, when NADPH is used as a coenzyme, a combination of glucose and glucose dehydrogenase is used as a coenzyme regenerating system, and catalase is used as a hydrogen peroxide scavenging system, NADPH is usually 0.002 to 0. 2% (w / v), glucose is 0.1 to 10% (w / v), glucose dehydrogenase is 1 to 200 U / mL, and catalase is 1 to 800 U / mL. .
[0032]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to Examples, but these do not limit the scope of the present invention.
Embodiment 1
<< Production of parahydroquinone compound using natural enzyme BM-3 or mutant enzyme F87V >>
In this example, a natural enzyme P450 (BM-3) purified from Bacillus megaterium, and a recombinant enzyme P450 (BM-3) obtained by expressing the natural enzyme P450 (BM-3) in Escherichia coli. And a mutant enzyme P450 (F87V) obtained by expression in E. coli and using various phenol compounds as substrates to produce parahydroquinone compounds.
[0033]
The natural enzyme P450 (BM-3) used in the following operations of this example was prepared from Bacillus megaterium (ATCC 14581) according to the method described in Archives of Biochemistry and Biophysics, 310, 126-133, 1994. .
The recombinant enzyme P450 (BM-3) is obtained by isolating a DNA encoding natural P450 (BM-3) from the Bacillus megaterium and transforming the DNA with the DNA. Prepared.
[0034]
The mutated enzyme P450 (F87V) is obtained by isolating DNA encoding P450 (BM-3) from the Bacillus megaterium and using the DNA to convert phenylalanine at position 87 to valine by site-directed mutagenesis. A DNA encoding the variant substituted with E. coli was prepared, and Escherichia coli was transformed with the obtained DNA to obtain a transformant FERM P-19187 strain, which was prepared from the transformant (Li, QS. , J. Ogawa, and S. Shimizu, Biochem. Biophys. Res. Commun., 280, 1258-1261, 2001).
The Escherichia coli FERM P-19187 strain was obtained on January 17, 2003 (Heisei 15) by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary Center (address: 305-8566, 1-1 1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan). 1) Deposited in Japan at Chuo No. 6) and its accession number is FERM P-19187.
[0035]
The recombinant enzyme P450 (BM-3) and the mutant enzyme P450 (F87V) expressed in Escherichia coli were N-terminal [that is, the first threonine (Thr) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1]. ), A methionine derived from the start codon ATG is added, and a histidine tag is added to the C-terminal side.
Further, the substrate used in this example is described, for example, in J. Am. H. Jones and G. T. Young, J.M. Chem. Soc. H., 436, 1968; G. FIG. J. Visser et al, J.A. Org. Chem. , 50 3133, 1985.
[0036]
To 0.7 mL of a 0.1 mol / L Tris-HCl buffer (pH 7.4), 10 μL of a dimethyl sulfoxide (DMSO) solution in which a substrate (phenol compound) was dissolved to a concentration of 10% was added. 80 μL of a glucose solution [12% (w / v) in 0.1 mol / L Tris-HCl buffer (pH 7.4)] and a catalase solution [0.1 mol / L Tris-HCl buffer (pH 7.4)] 0.1% (w / v)] in 8 μL, NADPH solution [0.5% (w / v) in 0.1 mol / L Tris-HCl buffer (pH 7.4)] 50 μL, and glucose dextroge 20 μL of the enzyme [GDH: 1.0% (w / v) in 0.1 mol / L Tris-HCl buffer (pH 7.4)] was added and mixed well.
[0037]
A solution of a natural enzyme P450 (BM-3), a recombinant enzyme P450 (BM-3), or a mutant enzyme P450 (F87V) [0.1 mol / L Tris-HCl buffer (pH 7.4)] (10 μmol / L), and reacted at 30 ° C. with shaking for 24 hours. After completion of the reaction, 1 mL of ethyl acetate was added and mixed well to stop the reaction.
To this solution, 150 μL of an internal standard solution [1-naphthol was dissolved in ethyl acetate to 2% (w / v)] was added, and the mixture was stirred with a vortex mixer for 1 minute. After stirring, centrifugation was performed at 3000 rpm for 10 minutes, and the organic layer of the supernatant was collected. The organic layer was dried (30-40 minutes) at room temperature using a centrifugal evaporator. After adding 200 μL of ethyl acetate to the dried residue, quantification was performed by gas chromatography (GC).
[0038]
The results are shown in Table 1 for the recombinant enzyme P450 (BM-3) and the mutant enzyme P450 (F87V). In addition, about the natural enzyme P450 (BM-3), the result which was almost the same as the recombinant enzyme P450 (BM-3) was shown.
As is clear from Table 1, in the case of the substrate having a substituent at the 2-position, the conversion of P450 (F87V) tended to be higher than that of P450 (BM-3). In particular, for the reaction of 2-benzyloxyphenol to 2-benzyloxyhydroquinone, P450 (F87V) showed high conversion.
[0039]
[0040]
Embodiment 2
<< Production of 2-benzyloxyhydroquinone by Escherichia coli expressing mutant enzyme P450 (F87V) >>
In this example, the transformant FERM P-19187 described in Example 1 was used as Escherichia coli expressing the mutant enzyme P450 (F87V). Transformant FERM P-19187 strain was added to 2.5 L of a medium (2.5 g of water, 30 g of tryptone, 60 g of yeast extract and 10 g of glycerol) using a jar fermenter, and adecanol (Adecanol B; Asahi Denka Kogyo) 500 μL and potassium phosphate buffer (KH in 100 mL of water 2 PO 4 5.87 g and K 2 HPO 4 (31.35 g) was prepared by culturing for 12 hours in a culture solution containing 100 mL.
[0041]
The obtained Escherichia coli expressing P450 (F87V) was washed with a 0.85% aqueous sodium chloride solution, and then reacted at 28 ° C. for 24 hours in a reaction solution having the composition shown in Table 2 with shaking (300 rpm). The conversion from 2-benzyloxyphenol (substrate) to 2-benzyloxyhydroquinone (product) was 54.7%.
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【The invention's effect】
According to the production method of the present invention, 2-benzyloxyhydroquinone can be obtained by regioselectively hydroxylating a phenol compound from a parahydroquinone compound, for example, 2-benzyloxyphenol. The manufacturing method of the present invention does not require any special equipment or operation method, and there is no special problem in safety and health or environmental measures, and can be industrially advantageously implemented.
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[Sequence list]