JP2004261105A

JP2004261105A - New nitrile hydratase

Info

Publication number: JP2004261105A
Application number: JP2003055481A
Authority: JP
Inventors: Akimasa Miyanaga; 顕正宮永; Shinya Fusenobu; 進矢伏信; Takayoshi Wakagi; 高善若木; Kiyoshi Ito; 潔伊藤
Original assignee: Mitsui Chemicals Inc
Current assignee: Mitsui Chemicals Inc
Priority date: 2003-03-03
Filing date: 2003-03-03
Publication date: 2004-09-24

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a cobalt-type nitrile hydratase containing a subunit bonded to a cobalt atom through a specific amino acid sequence: Cys-Thr-Leu-Csi-Ser-Cse (wherein, Csi is cysteinesulfinic acid; and Cse is cysteinesulfenic acid) as a constituent element. <P>SOLUTION: The new nitrile hydratase is obtained by substituting a Thr residue at the 109th position of an α-subunit of a wild-type nitrile hydratase derived from Pseudonocardia thermophila JCM 3095 strain with a Ser residue by using a gene recombination technique. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、コバルト型ニトリルヒドラターゼの新規なアミノ酸配列に関する。さらに、該酵素遺伝子を含有する組換えプラスミドにより形質転換された形質転換菌株を培養して得られる培養液・菌体・菌体処理物を用いてニトリル化合物から対応するアミド化合物を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ニトリル化合物のニトリル基を水和してアミド基に変換し対応するアミド化合物を製造する技術としては、酸またはアルカリの存在下や銅触媒の存在下で加熱処理する化学的な方法が以前より知られていた。
【０００３】
一方、近年ニトリル基を水和しアミド基に変換するニトリル水和活性を有する酵素であるニトリルヒドラターゼが発見され、該酵素または該酵素を含有する微生物菌体等を用いてニトリル化合物より対応するアミド化合物を製造する方法が既に開示されている。この製造方法は従来の化学的な方法と比べて、ニトリル化合物から対応するアミド化合物への転化率及び選択率が高い等のメリットが知られている。
【０００４】
ニトリルヒドラターゼは、活性中心に補欠分子として非ヘム鉄原子、または、非コリン核コバルト原子を有していることが既に知られており、それぞれ鉄型ニトリルヒドラターゼ、及び、コバルト型ニトリルヒドラターゼという呼称で区別されている。
【０００５】
鉄型ニトリルヒドラターゼとしては、ロドコッカス属Ｎ−７７１株由来のものをその代表例として挙げることができる。本酵素の特徴の一つは、該菌に光を照射することによって該酵素活性に変化が見られることである。すなわち、菌体を暗条件下で放置すると該酵素活性が減少するが、再び光を照射することによって該酵素活性は再び上昇する。そのメカニズムは、不活性型酵素の非ヘム鉄センターに一酸化窒素（ＮＯ）が結合しており、光によってＮＯが該非ヘム鉄センターより解離し、酵素が活性化されると考えられている（遠藤ら、バイオサイエンスとインダストリーＶｏｌ．５６，Ｎｏ．８，ｐｐ５１９−５２４，１９９８）。
【０００６】
さらに、この鉄型ニトリルヒドラターゼは、Ｘ線結晶構造解析がなされ、その立体構造が明らかになっている。その結果、該酵素は、活性中心を形成するαサブユニットの１０９番目から１１４番目までのシステインクラスター（Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ）中の４つのアミノ酸残基を介して非へム鉄と結合していることが確認されている。特に、システインクラスター中の２つのシステイン残基（αサブユニットの１１２番目及び１１４番目）が翻訳後修飾を受けて、それぞれシステインスルフィン酸並びにシステインスルフェン酸に変化しており、このことがＮＯの結合に起因する光応答性を生み出していると提唱されている（特開平１１−８０１９４号公報）。
【０００７】
一方、本発明者らは、既にニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物としてシュードノカルディア・サーモフィラを見出し、さらに該酵素を大腸菌内で大量に発現させることに成功している（特開平９−２７５９７８号公報）。
【０００８】
そこで、本発明者らは、本特許記載のＭＴ−１０８２２株（ＦＥＲＭＢＰ−５７８５；原寄託日：１９９６年２月７日）を培養し、該形質転換大腸菌体より、ニトリルヒドラターゼを精製し、得られた精製ニトリルヒドラターゼについて詳細に解析した。その結果、以下の知見を得るに至った（ＭｉｙａｎａｇａＡ．ｅｔａｌ．ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓＶｏｌ．２８８，ｐｐ１１６９−１１７４，２００１）。
【０００９】
第一に、精製した該酵素を用いて、ＩＣＰ（ＩｎｄｕｃｔｉｖｅＣｏｕｐｌｅｄＰｌａｓｍａ）による含有金属量の測定を行った。その結果、本酵素にコバルト原子は含まれているが、鉄原子は含まれていないことが判明した。すなわち、本酵素は、コバルト型ニトリルヒドラターゼであることが確認された。
【００１０】
第二に、精製した酵素を結晶化し、Ｘ線構造解析を行った。尚、構造解析は、Ｘ線構造解析がなされているロドコッカス属Ｎ−７７１株由来の鉄型ニトリルヒドラターゼのα鎖とβ鎖をモデル分子として用い、分子置換法により解を得た。その結果、コバルト原子は、αサブユニットの１０８番目のシステイン残基から１１３番目のシステイン残基までのシステインクラスター部位と結合していた。さらに、αサブユニットの１１１番目のシステイン残基と１１３番目のシステイン残基の回りに余分な電子密度が認められ、鉄型ニトリルヒドラターゼと同様に、両システイン残基が翻訳後修飾を受けてそれぞれシステインスルフィン酸（Ｃｙｓ−ＳＯＯＨ）とシステインスルフェン酸（Ｃｙｓ−ＳＯＨ）になっていることが確認された。
【００１１】
以上の知見より、本発明者らは、シュードノカルディア・サーモフィラ由来のコバルト型ニトリルヒドラターゼでは、αサブユニットの１１１番目のシステイン残基がシステインスルフィン酸に、１１３番目のシステイン残基がシステインスルフェン酸にそれぞれ翻訳後修飾を受け、この修飾アミノ酸残基含むＣｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｓｉ−Ｓｅｒ−Ｃｓｅで示される領域を介してコバルト原子は結合していることを見出している。
【００１２】
一方、Ｐａｙｎｅら（ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＶｏｌ．３６，ｐｐ５４４７−５４５４，１９９７）は、鉄型ニトリルヒドラターゼ及びコバルト型ニトリルヒドラターゼの金属イオン結合領域のアミノ酸配列について、以下のように述べている（第５４５３頁左欄上から９行目〜１９行目）。
【００１３】
「コバルトを含んでいるニトリルヒドラターゼ（ＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓＪ１，ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＮＲＲＬ−１８６６８）は、−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−で示される領域中の３番目の残基がスレオニン残基であるのに対して、鉄を含んでいるニトリルヒドラターゼはセリン残基となっている。〜中略〜我々は、ニトリルヒドラターゼのαサブユニットには２つのクラスが存在しているという仮説を立てている：システインリッチ領域中にスレオニンを含み、コバルトと結合している群と、セリンを含み、鉄と結合している群である。」
以上のとおり、ニトリルヒドラターゼに結合する金属イオンの種類はシステインクラスター中の２番目のアミノ酸の種類により決まっていて、当該アミノ酸がセリンである場合には、結合する金属イオンは鉄イオンになるということが従来から言われていた。
【００１４】
【特許文献１】特開平１１−８０１９４号公報
【００１５】
【特許文献２】特開平９−２７５９７８号公報
【００１６】
【非特許文献１】遠藤ら、「バイオサイエンスとインダストリー」第５６巻、Ｎｏ．８，第５１９〜５２４頁、１９９８年
【００１７】
【非特許文献２】ＭｉｙａｎａｇａＡ．ｅｔａｌ．ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓＶｏｌ．２８８，ｐｐ１１６９−１１７４，２００１
【００１８】
【非特許文献３】Ｐａｙｎｅｅｔａｌ．ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＶｏｌ．３６，ｐｐ５４４７−５４５４，１９９７
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｃｓｉ−Ｓｅｒ−Ｃｓｅ（配列中のＣｓｉはシステインスルフィン酸、Ｃｓｅはシステインスルフェン酸を示す。）で示される領域を介してコバルト原子と結合しているサブユニットを構成要素として含むコバルト型ニトリルヒドラターゼを提供することにある。
【００２０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、シュードノカルディア・サーモフィラ由来のコバルト型ニトリルヒドラターゼについて、αサブユニットの１０９番目のＴｈｒ残基について、遺伝子組換え技術を用いて、Ｓｅｒ残基に置換した変異型ニトリルヒドラターゼを調製し、その金属イオンについて解析を行った。
精製した該変異型酵素を用いたＩＣＰ（ＩｎｄｕｃｔｉｖｅＣｏｕｐｌｅｄＰｌａｓｍａ）による含有金属量の測定の結果、該変異型酵素には、コバルト原子は含まれているが、鉄原子は含まれていないことが判明した。すなわち、該変異型酵素は、コバルト型ニトリルヒドラターゼであることが確認された。
【００２１】
次に、精製した酵素を結晶化し、Ｘ線構造解析を行った。その結果、コバルト原子は、αサブユニットの１０８番目のシステイン残基から１１３番目のシステイン残基までのシステインクラスター部位と結合していた。尚、該変異型酵素においても、αサブユニットの１１１番目のシステイン残基と１１３番目のシステイン残基の回りに余分な電子密度が認められ、野生型の酵素同様、両システイン残基が翻訳後修飾を受けてそれぞれシステインスルフィン酸（Ｃｙｓ−ＳＯＯＨ）とシステインスルフェン酸（Ｃｙｓ−ＳＯＨ）になっていることが確認された。
【００２２】
以上の知見より、本発明者らにより、αサブユニットの１０９番目のＴｈｒ残基をＳｅｒ残基に置換した変異型ニトリルヒドラターゼは、前述のＰａｙｎｅらの仮説とは異なり、システインクラスターの２番目のアミノ酸がセリンであるＣｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｃｓｉ−Ｓｅｒ−Ｃｓｅで示される領域を介してコバルト原子と結合していることが判明した。
【００２３】
即ち、本発明は以下のとおりである。
［１］配列表の配列番号：１記載のアミノ酸配列Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｃｓｉ−Ｓｅｒ−Ｃｓｅ（配列中のＣｓｉはシステインスルフィン酸、Ｃｓｅはシステインスルフェン酸を示す。）で示される領域を介してコバルト原子と結合しているサブユニットを構成要素として含むコバルト型ニトリルヒドラターゼ。
［２］シュードノカルディア・サーモフィラ由来のコバルト型ニトリルヒドラターゼのαサブユニット内にあるＣｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｓｉ−Ｓｅｒ−Ｃｓｅ（配列中のＣｓｉはシステインスルフィン酸、Ｃｓｅはシステインスルフェン酸を示す。）で表されるコバルト原子との結合領域中のＴｈｒ残基をＳｅｒ残基に置換し、配列表の配列番号：１記載のアミノ酸配列Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｃｓｉ−Ｓｅｒ−Ｃｓｅ（配列中のＣｓｉ、Ｃｓｅは前記と同じ。）で示される領域を介してコバルト原子と結合している［１］記載のコバルト型ニトリルヒドラターゼ。
［３］配列表の配列番号：２記載のアミノ酸配列からなり、配列表の配列番号：１記載のアミノ酸配列Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｃｓｉ−Ｓｅｒ−Ｃｓｅ（配列中のＣｓｉはシステインスルフィン酸、Ｃｓｅはシステインスルフェン酸を示す。）で示される領域を介してコバルト原子と結合しているサブユニットを構成要素として含んでいる［１］記載のコバルト型ニトリルヒドラターゼ。
［４］配列表の配列番号：２記載の１０８番目から１１３番目を除くアミノ酸配列のうちの１個又は数個を置換、欠失、削除または挿入して得られるアミノ酸配列からなり、配列表の配列番号：１記載のアミノ酸配列Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｃｓｉ−Ｓｅｒ−Ｃｓｅ（配列中のＣｓｉはシステインスルフィン酸、Ｃｓｅはシステインスルフェン酸を示す。）で示される領域を介してコバルト原子と結合しているサブユニットを構成要素として含んでいる［１］記載のコバルト型ニトリルヒドラターゼ。
［５］［３］又は［４］に記載のサブユニット、および、配列表の配列番号：３記載のアミノ酸配列からなるサブユニットを構成要素として共に含んでいる［１］記載のコバルト型ニトリルヒドラターゼ。
［６］［３］又は［４］に記載のサブユニット、および、配列表の配列番号：３記載のアミノ酸配列のうちの１個又は数個を置換、欠失、削除または挿入して得られるアミノ酸配列からなるサブユニットを構成要素として含んでいる［１］記載のコバルト型ニトリルヒドラターゼ。
［７］［１］から［６］の何れか一項に記載のコバルト型ニトリルヒドラターゼを含有する菌株（形質転換株を含む）、該菌株の培養液、およびそれらの処理物。
［８］［７］に記載の菌株（形質転換株を含む）、該菌株の培養液、およびそれらの処理物、或いはそれらから得られるコバルト型ニトリルヒドラターゼとニトリル化合物とを水性媒体中で接触させて該ニトリル化合物に対応するアミド化合物を製造する方法。
【００２４】
【発明の実施の形態】
本発明において提供されるコバルト型ニトリルヒドラターゼとは、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｃｓｉ−Ｓｅｒ−Ｃｓｅ（配列中のＣｓｉはシステインスルフィン酸、Ｃｓｅはシステインスルフェン酸を示す。）を含む領域を介してコバルト原子と結合しているサブユニットを構成要素として含み、かつ、ニトリル化合物を水和する活性を有する蛋白質であれば特に制限はない。
【００２５】
近年の組換えＤＮＡ技術の進歩により、酵素の作用を変えることなく比較的容易にその構成アミノ酸の１個または２個以上（又は数個）を他のアミノ酸で置換、欠失、削除もしくは挿入できるようにもなっている。かかる技術水準に鑑み、この発明でいうニトリルヒドラターゼとは、Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｓｉ−Ｓｅｒ−Ｃｓｅを含む領域を介してコバルト原子と結合しているコバルト型ニトリルヒドラターゼのＴｈｒ残基を人為的にＳｅｒ残基に置換して得られるサブユニットを構成要素として含む変異型のニトリルヒドラターゼについても、ニトリル化合物を水和する活性を有する場合は、本発明に包含されるものとする。
【００２６】
特に本発明においては、以下の実施例で示すように、シュードノカルディア・サーモフィラ由来のコバルト型ニトリルヒドラターゼのαサブユニット内にあり、１０８番目から１１３番目までアミノ酸残基で構成されるコバルト原子との結合領域（Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｓｉ−Ｓｅｒ−Ｃｓｅ）中のＴｈｒ残基をＳｅｒ残基に置換した変異型コバルト型ニトリルヒドラターゼをその代表例として挙げることができる。すなわち、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなり、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｃｓｉ−Ｓｅｒ−Ｃｓｅを含む領域を介してコバルト原子と結合しているサブユニットを構成要素として含み、同時に配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列により示されるサブユニットを構成要素として含む変異型コバルト型ニトリルヒドラターゼである。
【００２７】
また、同じ塩基配列の遺伝子を鋳型として転写・翻訳された場合であっても、それを導入する宿主の種類、培養に使用する栄養培地の成分や組成、培養時の温度やｐＨ等によっては、遺伝子発現後の宿主内酵素による修飾などにより、所期の酵素作用は保持しているものの配列表におけるＮ末端付近のアミノ酸の１個または２個以上（又は数個）が欠失したり、Ｎ末端に１個または２個以上（又は数個）のアミノ酸が新たに付加した変異体を産生することがある。さらに、近年の組換えＤＮＡ技術を利用して、その構成アミノ酸の１個または２個以上（又は数個）を他のアミノ酸で置換、欠失、削除もしくは挿入することにより、有機溶媒耐性の向上や基質特異性の変化等の産業上の利用価値の高い性質を付加した変異酵素を作出する試みも行われている。かかる技術水準に鑑み、この発明でいうニトリルヒドラターゼとは、配列表における配列番号：２および３に示すアミノ酸配列により示されるサブユニットをそのまま構成要素として含むものは言うにおよばず、１個または２個以上（又は数個）のアミノ酸が他のアミノ酸に置換、欠失、削除もしくは挿入されたアミノ酸配列により示されるサブユニットを構成要素として含む変異体であっても、それが配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｃｓｉ−Ｓｅｒ−Ｃｓｅを含む領域を介してコバルト原子と結合しているサブユニットを構成要素として含み、かつ、ニトリル化合物を水和する活性を有する場合は、本発明に包含されるものとする。
【００２８】
より具体的には、配列表の配列番号２のアミノ酸配列の６番目、１９番目、３６番目、３８番目、７１番目、７７番目、９０番目、１０２番目、１０６番目、１２６番目、１３０番目、１４２番目、１４６番目、１４８番目、１８７番目、１９４番目、２０３番目及び２０４番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換して得られるアミノ酸配列からなり、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｃｓｉ−Ｓｅｒ−Ｃｓｅを含む領域を介してコバルト原子と結合している変異サブユニットを構成要素として含む変異コバルト型ニトリルヒドラターゼが含まれる。また、該変異コバルト型ニトリルヒドラターゼの他方のサブユニットが、配列表の配列番号：３に記載のアミノ酸配列の１０番目、２０番目、２１番目、３２番目、３７番目、４１番目、４６番目、４８番目、５１番目、７２番目、１０８番目、１１８番目、１２７番目、１４６番目、１６０番目、１８６番目、２００番目、２１２番目及び２１７番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換して得られる変異サブユニットである変異コバルト型ニトリルヒドラターゼも含まれる。
【００２９】
本発明におけるコバルト型ニトリルヒドラターゼとは、以下の実施例で示すように、シュードノカルディア・サーモフィラ由来のニトリルヒドラターゼのαサブユニットの１０９番目のＴｈｒをＳｅｒに置換させた変異型コバルト型ニトリルヒドラターゼをその代表例として挙げることができるが、該菌株以外の微生物株由来のコバルト型ニトリルヒドラターゼであり、かつ、コバルト原子との結合領域であるＣｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｓｉ−Ｓｅｒ−Ｃｓｅ内のＴｈｒ残基を人為的にＳｅｒ残基に置換して得られるサブユニットを構成要素として含む変異型のコバルト型ニトリルヒドラターゼについても、ニトリル化合物を水和する活性を有する場合は、本発明に包含されるものとする。そのようなコバルト型ニトリルヒドラターゼは、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、好熱性のバチルス属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロドクロウス（ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）種に代表されるロドコッッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、キサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、エアロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）属、またはサーモフィラ（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）種ＪＣＭ３０９５株以外のシュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属に属する微生物菌株中から見出される可能性がある。
【００３０】
さらに、上記の微生物菌株が本来有している天然型のコバルト型ニトリルヒドラターゼが、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｃｓｉ−Ｓｅｒ−Ｃｓｅを含む領域を介してコバルト原子と結合しているサブユニットを構成要素として含んでいる可能性があるが、この場合も本発明に包含されるものとする。
【００３１】
近年の分子生物学および遺伝子工学の進歩により、シュードノカルディア・サーモフィラに代表される微生物株のコバルト型ニトリルヒドラターゼの分子生物学的な性質やアミノ酸配列等を解析することにより、該蛋白質の遺伝子を該微生物株より取得し、該遺伝子および発現に必要な制御領域が挿入された組換えプラスミドを構築し、これを任意の宿主に導入し、該蛋白質を発現させた遺伝子組換え菌を作出することが可能となり、かつ、比較的容易にもなった。かかる技術水準に鑑み、このようなコバルト型ニトリルヒドラターゼの遺伝子を任意の宿主に導入した遺伝子組換え菌により生産されたコバルト型ニトリルヒドラターゼであっても、該蛋白質が配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列（Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｃｓｉ−Ｓｅｒ−Ｃｓｅ）を含む領域を介してコバルト原子と結合しているサブユニットを構成要素として含み、かつ、ニトリル化合物を水和する活性を有する蛋白質であれば、本発明に包含されるものとする。
【００３２】
尚、ここでいう発現に必要な制御領域とは、プロモーター配列（転写を制御するオペレーター配列を含む）・リボゾーム結合配列（ＳＤ配列）・転写終結配列等を示している。これら制御領域の組換えプラスミド上での配列順序は、５’末端側上流からプロモーター配列、リボゾーム結合配列、コバルト型ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子、転写終結配列の順に並ぶことが望ましい。また、プラスミドの具体例としては、大腸菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＳＣ１０１や、枯草菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１、φ１０５等をベクターとして利用することができる。また、２種類以上の宿主内での自律複製が可能なプラスミドの例として、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７をベクターとして利用することができる。
【００３３】
ここでいう任意の宿主には、後述の実施例のように大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）が代表例として挙げられるが、とくに大腸菌に限定されるものではなく枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属菌、酵母や放線菌等の他の微生物菌株も含まれる。
【００３４】
該プラスミドベクターに本発明のニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子を該遺伝子の発現に必要な領域を有するプラスミドベクターに挿入して本発明の組換えプラスミドを構築する方法、該組換えプラスミドを所望の宿主に形質転換する方法及び該形質転換菌体内でニトリルヒドラターゼを産生させる方法としては、「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ」（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら；ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９）等に記載されている分子生物学・生物工学・遺伝子工学の分野において公知の一般的な方法と宿主を利用すればよい。尚、該形質転換菌株を培養する培地としてＬＢ培地やＭ９培地などが一般的に用いられるが、より好ましくはそのような培地成分にＣｏイオンを０．１μｇ／ｍｌ以上存在させるとよい。
【００３５】
また、本発明のコバルト型ニトリルヒドラターゼまたは形質転換菌株を利用してニトリル化合物から対応するアミド化合物を製造するには、所望のニトリル化合物を該形質転換菌株の培養液、該形質転換菌株を培養して得られる形質転換菌体、形質転換菌体の処理物または形質転換菌体より分離・精製されたニトリルヒドラターゼと水性媒体中で接触させればよい。接触させる温度は特に限定されないが、好ましくは該ニトリルヒドラターゼが失活しない温度範囲内であり、より好ましくは０℃〜５０℃である。ニトリル化合物としては、本発明のニトリルヒドラターゼが基質として作用できる化合物であれば特に限定されないが、好ましくはアセトニトリル、プロピオニトリル、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ｎ−ブチロニトリル、イソブチロニトリル、クロトノニトリル、α−ヒドロキシイソブチロニトリル等といった炭素数２〜４のニトリル化合物がその代表例として挙げられる。該ニトリル化合物の水性媒体中での濃度は、該ニトリル化合物の水性媒体中での最大溶解度を越えない範囲内であれば特に限定されるものではないが、好ましくは該ニトリル化合物による該酵素の失活を考慮して５重量％以下、より好ましくは２重量％以下である。
【００３６】
【実施例】
以下の実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例によって何等限定されるものではない。尚、以下の実施例において、ニトリルヒドラターゼ活性の測定は、次のように行った。
サンプル溶液を２０ｍＭ−Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５：以下、バッファーＡと呼ぶ）により適当に希釈し、これに１重量％のアクリロニトリルを添加して１０℃で１０分間反応させた。反応液にこれと等量の１Ｍリン酸水溶液を添加して反応を停止させ、生成したアクリルアミド濃度をＨＰＬＣ分析により測定した。ＨＰＬＣカラムはＵＬＴＲＯＮ８０ＨＧ（５０×８φｍｍ）を用い、１０ｍＭリン酸水溶液を展開液として使用した。アクリルアミドは２２０ｎｍの吸光度により検出した。
【００３７】
［実施例１］
αサブユニットの１０９番目のＴｈｒをＳｅｒに置換するために、特開平９−２７５９７８号公報に記載のｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、タカラバイオ株式会社製の「ＬＡＰＣＲｉｎｖｉｔｒｏｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ」を用いた部位特異的な変異導入を行った。以後、「ＬＡＰＣＲｉｎｖｉｔｒｏｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ」を単にキットと呼ぶ。以下の実施例では、基本的にキットの原理および操作方法を踏襲した。
【００３８】
３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、ＭＴ−１０８２２株を一白菌耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分間）により該菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡを調製した。
【００３９】
ｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号４記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号５に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒間、アニーリング（５５℃）３０秒間、伸長反応（７２℃）１２０秒間の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号６に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号７に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０質量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。Ｍｉｃｒｏｃｏｎ１００（宝酒造社製）を用いてそれぞれのＰＣＲ反応終了液より過剰なプライマーおよびｄＮＴＰを除去した後、ＴＥを加えて各々５０μｌの溶液を調製した。該ＴＥ溶液を各０．５μｌずつ含む全量４７．５μｌのアニーリング溶液（組成はキットに記載の条件による）を調製し、熱変性処理（９８℃）を１０分間行った後、３７℃まで６０分間かけて一定の速度で冷却を行い、続いて３７℃で１５分間保持することによってアニーリング処理を行った。アニーリング処理液にタカラバイオ株式会社製のＴａｋａｒａＴａｑを０．５μｌ加えて７２℃で３分間加熱処理を行い、ヘテロ２本鎖を完成させた。これにＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号５に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号７に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ加えて全量を５０μｌとした後、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことによるＰＣＲ反応Ｎｏ．３を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．３の反応終了液５μｌを用いたアガロース電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度０．８質量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、約２．０ｋｂｐの増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。続いて、アガロースゲルから約２．０ＫｂｐのＤＮＡ断片のみを切り出し、該アガロース片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍｌのＴＥ溶液に懸濁後、５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解させた。この融解液に対して常法に従ってフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μｌのＴＥに溶解した。精製した約２．０ｋｂｐの増幅ＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより切断した後、この制限酵素処理液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μｌのＴＥに溶解した。同様に、ｐＰＴ−ＤＢ１上の唯一の制限酵素サイトであるＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによりｐＰＴ−ＤＢ１を切断し、アガロースゲル電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度０．７％）を行い、アガロースゲルから約２．７ＫｂｐのＤＮＡ断片のみを切り出した。切り出したアガロース片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍｌのＴＥ溶液に懸濁後、５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解させた。この融解液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μｌのＴＥに溶解した。この様にして得られた増幅ＤＮＡ産物とｐＰＴ−ＤＢ１断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結させた後、大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、大腸菌バンクを調製した。
【００４０】
３０ｍｌの試験管に４０μｇ／ｍｌの硫酸第二鉄・七水和物及び１０μｇ／ｍｌの塩化コバルト・二水和物を含む１０ｍｌのＬＢ液体培地（以後、活性発現培地と呼ぶ）を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、該大腸菌バンクより任意に選別した５クローンを各一白菌耳ずつ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分間）により菌体を分離した。該菌体を２００μｌのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に懸濁し、これに１質量％のアクリロニトリルを添加して１０℃で２分間反応させた。反応液にこれと等量の１Ｍリン酸水溶液を添加して反応を停止させ、生成したアクリルアミド濃度を実施例２と同様のＨＰＬＣ分析により測定した。その結果、５クローン中４クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリルヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。
【００４１】
ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンのプラスミドＤＮＡを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたプライマーエクステンション法により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺伝子の塩基配列を決定した。その結果、表１に示したクローンＮｏ．１においてニトリルヒドラターゼのαサブユニットの１０９番目のＴｈｒがＳｅｒに置換されていた。
【００４２】
【表１】

【００４３】
［実施例２］
αサブユニットの１０９番目のＴｈｒがＳｅｒに置換された変異型ニトリルヒドラターゼの精製並びに含有金属原子の測定
５００ｍｌのバッフル付三角フラスコに下記の組成の培地１００ｍｌを調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌後、終濃度が５０μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加したものを３０本用意した。各々のバッフル付三角フラスコに実施例１で得られたクローンＮｏ．１を一白菌耳ずつ植菌し、３７℃・１３０ｒｐｍにて２０時間培養した。各バッフル付三角フラスコ中の培養液を一まとめにしたのち、遠心分離（１５０００Ｇ×１５分間）により菌体のみを培養液より分離し、続いて、５０ｍｌの生理食塩水に該菌体を再懸濁した後に、再度遠心分離を行って湿菌体１２０ｇを得た。
【００４４】

【００４５】
該菌体１１０ｇを５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ・Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．５）５４０ｍＬに懸濁し、氷冷しながら、超音波破砕機により破砕を１０分間行った。顕微鏡により菌体が完全に破砕されていることを確認した後、遠心分離（２５０００Ｇ×２０分間）により該粗酵素抽出液を得た。該粗酵素抽出液に飽和濃度が４０％になるように硫酸アンモニウムを加え３０分間低温で撹拌した。遠心分離（２５０００Ｇ×１０分間）により上清液に飽和濃度が７０％になるように再度硫酸アンモニウムを加え３０分間低温で撹拌した。その後、遠心分離（２５０００Ｇ×１０分間）により沈殿を得た。
該沈殿を５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ・Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．５）２０ｍＬに懸濁した後、脱塩のためにバッファーＡに対して透析処理を行った。
【００４６】
被透析液をアマシャムファルマシア社製のＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーに供した。展開液はバッファーＡを用い、塩化カリウムによる０Ｍから１．０Ｍまで一定の勾配で増加させてニトリルヒドラターゼ活性を含む画分を得た。さらに、該活性画分液をバッファーＡに対して透析処理を行った後、アマシャムファルマシア社製のＭｏｎｏＱカラム（ＨＲ５／５）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーに供した。展開液はバッファーＡを用い、塩化カリウムによる０Ｍから１．０Ｍまで一定の勾配で増加させてニトリルヒドラターゼ活性を含む画分を得た。最期に、該活性画分液をバッファーＡに対して透析処理を行った後、アミコン社製のセントリコン３０で濃縮し、８．０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度の精製酵素溶液を得た。
【００４７】
次に、該精製酵素溶液５０μＬと純水５０μＬをマイクロチューブに分注した後、マイクロチューブの蓋を開け、アルミ箔をかぶせた状態で８０℃のＤｒｙＴｈｅｒｍｏＵｎｉｔＤＴＵ−２８（ＴＡＩＴＥＣ社製）で３時間静置して乾燥させた。続いて、６１％硝酸を３０μＬずつ加え、８０℃のＤｒｙＴｈｅｒｍｏＵｎｉｔＤＴＵ−２８（ＴＡＩＴＥＣ社製）で１８時間静置して完全に乾燥させた後、０．１Ｎ硝酸を１ｍＬ加え、ＳＰＳ１２００ＶＲｐｌａｓｍａｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｓｅｉｋｏ社製）を用いて、含有金属量の測定を行った。その結果、本酵素１分子（α_２β_２）つき、Ｃｏ原子が約１．０２個入っていることが判明した。また、鉄原子は含まれていなかった。
【００４８】
尚、本測定においては、コントロールとして該精製酵素溶液の代わりにバッファーＡを用い、また、スタンダードとして、和光純薬製のコバルト標準液（Ｃｏ（ＮＯ_３）_２／０．１Ｎ−ＨＮＯ_３、濃度１０００ｐｐｍ）と同鉄標準液（ＦｅＣｌ_３／０．１Ｎ−ＨＣｌ、濃度１０００ｐｐｍ）をそれぞれ０．１ＮのＨＮＯ_３で１０００倍希釈したものを使用した。
【００４９】
［実施例３］結晶化並びにＸ線構造解析
実施例２で得られたαサブユニットの１０９番目のＴｈｒがＳｅｒに置換された変異型ニトリルヒドラターゼの精製酵素溶液と１．２Ｍのクエン酸ナトリウム及び０．１ＭのＨＥＰＥＳナトリウムからなるリザーバー溶液（ｐＨ７．５）を１：１の比率で混合した後、蒸気平衡拡散法により５℃にて該酵素の結晶を生成させた。
得られた結晶は、分解能２．５ÅまでＸ線を回折し、セル寸法ａ＝ｂ＝６５．５７１Å、ｃ＝１８４．５７１Åを有する空間群Ｐ３_２２１に属していた。１つのαβヘテロダイマーが結晶の非対称単位に存在していた。
【００５０】
該酵素の結晶構造は、シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５株由来の野性型ニトリルヒドラターゼの結晶構造（ＰＤＢファイルコード：１ＩＲＥ）をもとに、分子置換（ＭＲ）法により分析した。
【００５１】
コバルト原子は、αサブユニットのアミノ酸配列の１０８番目から１１３番目に位置するシステインクラスター（Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ）部位と結合していた。より具体的には、１０８番目、１１１番目及び１１３番目の３つのＣｙｓ残基の硫黄原子、並びに、１１２番目のＳｅｒ残基と１１３番目のＣｙｓ残基の主鎖の窒素原子と結合していた。
【００５２】
また、１１１番目及び１１３番目のＣｙｓ残基のまわりに余分な電子密度が認められた。Ｆｏ−Ｆｃマップにおいて、１１１番目のＣｙｓ残基のまわりに電子密度が２つ、そして１１３番目のＣｙｓ残基のまわりに電子密度が１つ認められた。すなわち、野性型ニトリルヒドラターゼと同様、１１１番目のＣｙｓ残基はスルフィン酸（Ｃｙｓ−ＳＯ２Ｈ）に、１１３番目のＣｙｓ残基はスルフェン酸（Ｃｙｓ−ＳＯＨ）に、それぞれ翻訳後修飾を受けていた。すなわち、本酵素のαサブユニットの１０８番目から１１３番目に位置するシステインクラスター部位のアミノ酸配列は、Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｃｓｉ−Ｓｅｒ−Ｃｓｅ（配列中のＣｓｉはシステインスルフィン酸、Ｃｓｅはシステインスルフェン酸を示す。）であった。
【００５３】
配列表フリーテキスト
配列番号１：コバルト型ニトリルヒドラターゼ内のコバルト原子結合領域
配列番号２：シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５株由来ニトリルヒドラターゼのαサブユニットのアミノ酸配列
配列番号３：シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５株由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号４：変異型ニトリルヒドラターゼ遺伝子作成用の合成プライマー
配列番号５：変異型ニトリルヒドラターゼ遺伝子作成用のＭ１３プライマーＭ４
配列番号６：変異型ニトリルヒドラターゼ遺伝子作成用のＭＵＴ４プライマー
配列番号７：変異型ニトリルヒドラターゼ遺伝子作成用のＭ１３プライマーＲＶ
【００５４】
【発明の効果】
本発明により、コバルト型ニトリルヒドラターゼ中のコバルト原子結合領域のアミノ酸配列（Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｃｓｉ−Ｓｅｒ−Ｃｓｅ）が提供される。尚、配列中のＣｓｉはシステインスルフィン酸、Ｃｓｅはシステインスルフェン酸を示す。
【００５５】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５株由来ニトリルヒドラターゼのαサブユニットの１０９番目のＴｈｒがＳｅｒに置換された変異型ニトリルヒドラターゼのコバルト原子結合領域のＦｏ−Ｆｃマップを示す。図中、アミノ酸の骨格について、白抜きが炭素原子、黒の塗りつぶしが酸素原子、グレーの塗りつぶしが窒素原子、縞が硫黄原子をそれぞれ示す。また、矢印は、各アミノ酸残基のα位炭素を指している。さらに、網掛けは、Ｆｏ−Ｆｃマップを示し、中心の円はコバルト原子を示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel amino acid sequence of a cobalt-type nitrile hydratase. Further, the present invention relates to a method for producing a corresponding amide compound from a nitrile compound using a culture solution, cells, or treated cells obtained by culturing a transformed strain transformed with a recombinant plasmid containing the enzyme gene. .
[0002]
[Prior art]
As a technique for producing a corresponding amide compound by converting the nitrile group of the nitrile compound to an amide group by hydration, a chemical method of performing heat treatment in the presence of an acid or alkali or a copper catalyst has been known. Had been.
[0003]
On the other hand, in recent years, nitrile hydratase, an enzyme having nitrile hydration activity of hydrating a nitrile group and converting it to an amide group, has been discovered, and is more compatible with nitrile compounds using the enzyme or a microbial cell containing the enzyme. Methods for producing amide compounds have already been disclosed. This production method is known to have advantages such as higher conversion and selectivity from a nitrile compound to a corresponding amide compound as compared with conventional chemical methods.
[0004]
Nitrile hydratase is already known to have a non-heme iron atom or a non-choline core cobalt atom as a prosthetic molecule in the active center, and iron-type nitrile hydratase and cobalt-type nitrile hydratase, respectively. It is distinguished by the name.
[0005]
Examples of the iron nitrile hydratase include those derived from Rhodococcus sp. Strain N-771. One of the features of the present enzyme is that a change in the enzyme activity is observed when the bacteria are irradiated with light. That is, the enzyme activity decreases when the cells are left under dark conditions, but the enzyme activity increases again by irradiating light again. The mechanism is thought to be that nitric oxide (NO) is bound to the non-heme iron center of the inactive enzyme, and NO is dissociated from the non-heme iron center by light to activate the enzyme ( Endo et al., Bioscience and Industry Vol. 56, No. 8, pp. 519-524, 1998).
[0006]
Furthermore, X-ray crystal structure analysis of this iron-type nitrile hydratase has been performed, and the three-dimensional structure has been clarified. As a result, the enzyme is mutated through four amino acid residues in the cysteine cluster from position 109 to position 114 (Cys-Ser-Leu-Cys-Ser-Cys) of the α subunit that forms the active center. It has been confirmed that it is combined with iron. In particular, two cysteine residues in the cysteine cluster (positions 112 and 114 of the α subunit) have undergone post-translational modification and have been changed to cysteine sulfinic acid and cysteine sulfenic acid, respectively. It has been proposed that photoresponsiveness due to the coupling is produced (Japanese Patent Laid-Open No. 11-80194).
[0007]
On the other hand, the present inventors have already found Pseudonocardia thermophila as a microorganism having nitrile hydratase activity, and have succeeded in expressing the enzyme in large amounts in Escherichia coli (Japanese Patent Laid-Open No. 9-275978). Gazette).
[0008]
Therefore, the present inventors cultured the MT-10822 strain described in the present patent (FERM BP-5785; original deposit date: February 7, 1996), and purified nitrile hydratase from the transformed E. coli body. The obtained purified nitrile hydratase was analyzed in detail. As a result, the following findings were obtained (Miyanana A. et al. Biochemical and Biophysical Research Communications Vol. 288, pp 1169-1174, 2001).
[0009]
First, using the purified enzyme, the metal content was measured by ICP (Inductive Coupled Plasma). As a result, it was found that the enzyme contained a cobalt atom but did not contain an iron atom. That is, it was confirmed that the present enzyme was a cobalt-type nitrile hydratase.
[0010]
Second, the purified enzyme was crystallized and subjected to X-ray structural analysis. In the structural analysis, a solution was obtained by a molecular replacement method using α-chain and β-chain of iron-type nitrile hydratase derived from Rhodococcus sp. Strain N-771 for which X-ray structural analysis was performed as model molecules. As a result, the cobalt atom was bonded to the cysteine cluster site from the cysteine residue at position 108 to the cysteine residue at position 113 of the α subunit. Furthermore, extra electron density was observed around the cysteine residues at positions 111 and 113 of the α subunit, and both cysteine residues were subjected to post-translational modification, similar to iron-type nitrile hydratase. It was confirmed that they were cysteine sulfinic acid (Cys-SOOH) and cysteine sulfenic acid (Cys-SOH), respectively.
[0011]
Based on the above findings, the present inventors found that in cobalt-type nitrile hydratase derived from Pseudonocardia thermophila, the cysteine residue at position 111 of the α subunit was replaced with cysteine sulfinic acid, and the cysteine residue at position 113 was replaced with cysteine. It has been found that sulfenic acid undergoes post-translational modification, respectively, and that the cobalt atom is bonded via a region represented by Cys-Thr-Leu-Csi-Ser-Cse containing the modified amino acid residue.
[0012]
On the other hand, Payne et al. (Biochemistry Vol. 36, pp. 5447-5454, 1997) describe the amino acid sequence of the metal ion binding region of iron nitrile hydratase and cobalt nitrile hydratase as follows (page 5453). 9th to 19th lines from the upper left column).
[0013]
"Cobalt-containing nitrile hydratase (Rhodococcus rhodochrous J1, Pseudomonas putida NRRL-18668) has a -Val-Cys- (Ser / Thr) -Leu-Cys-Ser-Cys- 3rd region in the region shown. The residue is a threonine residue, whereas the nitrile hydratase that contains iron is a serine residue .... Omitted ... We have two classes of nitrile hydratase alpha subunits. Hypotheses: a group that contains threonine in the cysteine-rich region and binds cobalt, and a group that contains serine and binds iron. "
As described above, the type of metal ion that binds to nitrile hydratase is determined by the type of the second amino acid in the cysteine cluster, and when the amino acid is serine, the metal ion that binds becomes iron ion. It has been said before.
[0014]
[Patent Document 1] JP-A-11-80194
[0015]
[Patent Document 2] Japanese Patent Application Laid-Open No. 9-275978
[0016]
[Non-Patent Document 1] Endo et al., "Bioscience and Industry," Vol. 8, pp. 519-524, 1998
[0017]
[Non-Patent Document 2] Miyayama A. et al. Biochemical and Biophysical Research Communications Vol. 288, pp 1169-1174, 2001
[0018]
[Non-Patent Document 3] Payne et al. Biochemistry Vol. 36, pp5447-5454, 1997
[0019]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to bind to a cobalt atom via a region represented by Cys-Ser-Leu-Csi-Ser-Cse (Csi in the sequence indicates cysteine sulfinic acid and Cse indicates cysteine sulfenic acid). To provide a cobalt-type nitrile hydratase containing a subunit as a constituent element.
[0020]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have found that, for cobalt-type nitrile hydratase derived from Pseudonocardia thermophila, a mutant nitrile in which the 109th Thr residue of the α subunit has been replaced with a Ser residue using genetic recombination technology. Hydratase was prepared and its metal ions were analyzed.
As a result of measurement of the metal content by ICP (Inductive Coupled Plasma) using the purified mutant enzyme, it was found that the mutant enzyme contained a cobalt atom but did not contain an iron atom. . That is, it was confirmed that the mutant enzyme was a cobalt-type nitrile hydratase.
[0021]
Next, the purified enzyme was crystallized and subjected to X-ray structure analysis. As a result, the cobalt atom was bonded to the cysteine cluster site from the cysteine residue at position 108 to the cysteine residue at position 113 of the α subunit. In this mutant enzyme, extra electron density was observed around the cysteine residue at position 111 and the cysteine residue at position 113 of the α-subunit. After the modification, it was confirmed that cysteine sulfinic acid (Cys-SOOH) and cysteine sulfenic acid (Cys-SOH) were obtained.
[0022]
From the above findings, the present inventors found that the mutant nitrile hydratase in which the 109th Thr residue of the α subunit was replaced with a Ser residue was different from the aforementioned hypothesis of Payne et al. Was linked to a cobalt atom via the region indicated by Cys-Ser-Leu-Csi-Ser-Cse which is a serine.
[0023]
That is, the present invention is as follows.
[1] A region represented by the amino acid sequence Cys-Ser-Leu-Csi-Ser-Cse described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing (Csi in the sequence indicates cysteine sulfinic acid, and Cse indicates cysteine sulfenic acid). Cobalt-type nitrile hydratase containing, as a constituent, a subunit bonded to a cobalt atom through an intermediary.
[2] Cys-Thr-Leu-Csi-Ser-Cse in the α-subunit of cobalt-type nitrile hydratase derived from Pseudonocardia thermophila (Csi in the sequence is cysteine sulfinic acid, and Cse is cysteine sulfenic acid Is replaced with a Ser residue in the binding region to the cobalt atom represented by the following formula, and the amino acid sequence Cys-Ser-Leu-Csi-Ser-Cse (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing) is substituted. Csi and Cse in the sequence are the same as those described above.) [1].
[3] Consists of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and the amino acid sequence Cys-Ser-Leu-Csi-Ser-Cse described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing (Csi in the sequence is cysteine sulfinic acid, Cse Represents a cysteine sulfenic acid.) The cobalt-type nitrile hydratase according to [1], which comprises, as a constituent, a subunit bonded to a cobalt atom via a region represented by the following formula:
[4] It consists of an amino acid sequence obtained by substituting, deleting, deleting or inserting one or several of the amino acid sequences excluding the 108th to 113th positions described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and Coupling to a cobalt atom via a region represented by the amino acid sequence Cys-Ser-Leu-Csi-Ser-Cse described in SEQ ID NO: 1 (Csi in the sequence indicates cysteine sulfinic acid, and Cse indicates cysteine sulfenic acid) [1] The cobalt-type nitrile hydratase according to [1], which comprises the subunit described above as a constituent element.
[5] The cobalt-type nitrile hydra according to [1], which contains both the subunit according to [3] or [4] and the subunit having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing as constituent elements. Taze.
[6] Obtained by substituting, deleting, deleting or inserting one or several of the subunits described in [3] or [4] and the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing. The cobalt-type nitrile hydratase according to [1], comprising a subunit consisting of an amino acid sequence as a constituent element.
[7] A strain (including a transformant) containing the cobalt-type nitrile hydratase according to any one of [1] to [6], a culture solution of the strain, and a processed product thereof.
[8] The strain (including a transformant) according to [7], a culture solution of the strain, a treated product thereof, or a cobalt-type nitrile hydratase obtained therefrom and contact with a nitrile compound in an aqueous medium. To produce an amide compound corresponding to the nitrile compound.
[0024]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The cobalt-type nitrile hydratase provided in the present invention refers to the amino acid sequence Cys-Ser-Leu-Csi-Ser-Cse shown in SEQ ID NO: 1 (Csi in the sequence is cysteine sulfinic acid, and Cse is cysteine sulfen There is no particular limitation as long as the protein contains a subunit bonded to a cobalt atom via a region containing an acid) as a component and has an activity of hydrating a nitrile compound.
[0025]
Recent advances in recombinant DNA technology make it possible to relatively easily replace, delete, delete or insert one or more (or several) of the constituent amino acids with other amino acids without changing the action of the enzyme. It is like that. In view of such a state of the art, the nitrile hydratase referred to in the present invention refers to a Thr residue of a cobalt-type nitrile hydratase bonded to a cobalt atom via a region including Cys-Thr-Leu-Csi-Ser-Cse. Mutant nitrile hydratase containing as an element a subunit obtained by artificially substituting a Ser residue is also included in the present invention if it has an activity of hydrating a nitrile compound.
[0026]
In particular, in the present invention, as shown in the following Examples, cobalt contained in the α-subunit of cobalt-type nitrile hydratase derived from Pseudonocardia thermophila and composed of amino acid residues 108 to 113. A typical example thereof is a mutant cobalt-type nitrile hydratase in which a Thr residue in an atom binding region (Cys-Thr-Leu-Csi-Ser-Cse) is substituted with a Ser residue. That is, a sub-chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and bonded to a cobalt atom via a region containing the amino acid sequence Cys-Ser-Leu-Csi-Ser-Cse shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing A mutant cobalt-type nitrile hydratase containing a unit as a constituent element and, at the same time, a subunit represented by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
[0027]
Further, even when the gene is transcribed and translated using the same nucleotide sequence as a template, depending on the type of host to which the gene is introduced, the components and composition of the nutrient medium used for culture, the temperature and pH during culture, etc. Due to modification by an enzyme in the host after gene expression, the desired enzymatic action is retained, but one or more (or several) of the amino acids near the N-terminal in the sequence listing are deleted, A mutant may be produced in which one or more (or several) amino acids are newly added to the terminal. Further, by utilizing recent recombinant DNA technology, one, two or more (or several) of the constituent amino acids are substituted, deleted, deleted or inserted with another amino acid, thereby improving organic solvent resistance. Attempts have also been made to produce mutant enzymes to which industrially valuable properties such as changes in substrate specificity and the like have been added. In view of the state of the art, the nitrile hydratase referred to in the present invention is not limited to one containing the subunit represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 3 in the sequence listing as it is, or one or more. Even if a mutant contains as a constituent a subunit represented by an amino acid sequence in which two or more (or several) amino acids have been substituted, deleted, deleted or inserted by another amino acid, it is a sequence in the sequence listing When a subunit bonded to a cobalt atom via a region including the amino acid sequence Cys-Ser-Leu-Csi-Ser-Cse shown in No. 1 as a constituent element and has an activity of hydrating a nitrile compound Is included in the present invention.
[0028]
More specifically, the sixth, 19th, 36th, 38th, 71st, 77th, 90th, 102th, 106th, 126th, 130th, and 142th amino acid sequences of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing 146th, 148th, 187th, 194th, 203rd, and 204th amino acids consisting of an amino acid sequence obtained by replacing any one or more amino acids with another amino acid, SEQ ID NO: 1 And a mutant cobalt-type nitrile hydratase containing, as a component, a mutant subunit bonded to a cobalt atom via a region including the amino acid sequence Cys-Ser-Leu-Csi-Ser-Cse shown in (1). Further, the other subunit of the mutant cobalt nitrile hydratase is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 3, 10, 20, 21, 32, 37, 41, 46, 48, 51, 72, 108, 118, 127, 146, 160, 186, 200, 212 and 217 amino acids Mutant cobalt-type nitrile hydratase, which is a mutant subunit obtained by substitution, is also included.
[0029]
The cobalt-type nitrile hydratase in the present invention is, as shown in the following examples, a mutant cobalt-type in which Thr at position 109 of the α-subunit of nitrile hydratase derived from Pseudonocardia thermophila is substituted with Ser. Nitrile hydratase can be cited as a typical example thereof, but it is a cobalt-type nitrile hydratase derived from a microorganism strain other than this strain, and Cys-Thr-Leu-Csi-Ser-, which is a binding region to a cobalt atom. Mutant cobalt-type nitrile hydratase containing a subunit obtained by artificially substituting a Thr residue in Cse for a Ser residue as a constituent element also has an activity to hydrate a nitrile compound. Included in the invention. Such cobalt-type nitrile hydratases include Nocardia, Corynebacterium, Bacillus, thermophilic Bacillus, Pseudomonas, Micrococcus, The genus Rhodococcus, represented by the species rhodochrous, the genus Acinetobacter, the genus Xanthobacter, the genus Streptomyces, the genus Rhizobium, Rhizob, Rhizob, Rhizob, Rhizob The genus Enterobacter, Erwinia ia), Aeromonas, Citrobacter, Achromobacter, Agrobacterium, Amycolatopsis, or Thermophila sp. It may be found in microbial strains belonging to the genus Pseudonocardia other than the strain.
[0030]
Furthermore, the natural cobalt-type nitrile hydratase inherently possessed by the above-mentioned microorganism strain is converted to a cobalt-containing nitrile hydratase via a region containing the amino acid sequence Cys-Ser-Leu-Csi-Ser-Cse shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. A subunit that is bonded to an atom may be included as a component, and this case is also included in the present invention.
[0031]
Recent advances in molecular biology and genetic engineering have led to the analysis of the molecular biological properties and amino acid sequence of the cobalt-type nitrile hydratase of microorganism strains represented by Pseudonocardia thermophila. A gene is obtained from the microorganism strain, a recombinant plasmid into which the gene and a control region necessary for expression are inserted is constructed, and this is introduced into an optional host to produce a genetically modified bacterium expressing the protein. And it has become relatively easy. In view of the state of the art, even if a cobalt-type nitrile hydratase produced by a genetically modified bacterium in which such a cobalt-type nitrile hydratase gene is introduced into an arbitrary host, the protein is represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. A protein comprising, as a component, a subunit bonded to a cobalt atom via a region containing the amino acid sequence (Cys-Ser-Leu-Csi-Ser-Cse) shown in (1), and having an activity of hydrating a nitrile compound. If so, it is included in the present invention.
[0032]
Here, the control region necessary for expression refers to a promoter sequence (including an operator sequence that controls transcription), a ribosome binding sequence (SD sequence), a transcription termination sequence, and the like. The sequence of these control regions on the recombinant plasmid is desirably arranged in the order of the promoter sequence, the ribosome binding sequence, the gene encoding cobalt-type nitrile hydratase, and the transcription termination sequence from the 5 'terminal side upstream. Specific examples of the plasmid include pBR322, pUC18, Bluescript II SK (+), pKK223-3, and pSC101 having an autonomously replicable region in Escherichia coli, and autonomously replicable in Bacillus subtilis. PUB110, pTZ4, pC194, ρ11, φ1, φ105, etc. having a region can be used as vectors. Further, as examples of plasmids capable of autonomous replication in two or more types of hosts, pHV14, TRp7, YEp7, and pBS7 can be used as vectors.
[0033]
Examples of the optional host include Escherichia coli as a representative example as described in Examples below, but are not particularly limited to Escherichia coli, and include Bacillus subtilis such as Bacillus subtilis, and the like. Other microbial strains such as yeasts and actinomycetes are also included.
[0034]
A method for constructing a recombinant plasmid of the present invention by inserting a gene encoding a nitrile hydratase of the present invention into the plasmid vector into a plasmid vector having a region necessary for expression of the gene, And a method for producing nitrile hydratase in the transformed cells are described in "Molecular Cloning 2nd Edition" (T. Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) and the like. General methods and hosts known in the fields of science, biotechnology and genetic engineering may be used. In addition, as a medium for culturing the transformed strain, an LB medium or an M9 medium is generally used. More preferably, 0.1 μg / ml or more of Co ions may be present in such a medium component.
[0035]
Further, in order to produce a corresponding amide compound from a nitrile compound using the cobalt-type nitrile hydratase or the transformed strain of the present invention, a desired nitrile compound is cultured in a culture solution of the transformed strain, and the transformed strain is cultured. The transformant, the treated product of the transformant, or the nitrile hydratase separated and purified from the transformant may be contacted in an aqueous medium. The temperature for the contact is not particularly limited, but is preferably within a temperature range in which the nitrile hydratase is not inactivated, and more preferably 0 ° C to 50 ° C. The nitrile compound is not particularly limited as long as the nitrile hydratase of the present invention can act as a substrate. Typical examples thereof include nitrile compounds having 2 to 4 carbon atoms such as nitriles and α-hydroxyisobutyronitrile. The concentration of the nitrile compound in the aqueous medium is not particularly limited as long as it does not exceed the maximum solubility of the nitrile compound in the aqueous medium. In consideration of activity, the content is 5% by weight or less, more preferably 2% by weight or less.
[0036]
【Example】
The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the following examples. In the following examples, nitrile hydratase activity was measured as follows.
The sample solution was appropriately diluted with a 20 mM Tris · HCl buffer (pH 7.5; hereinafter, referred to as buffer A), and 1% by weight of acrylonitrile was added thereto, followed by a reaction at 10 ° C. for 10 minutes. The reaction was stopped by adding an equal volume of a 1 M aqueous phosphoric acid solution to the reaction solution, and the concentration of the formed acrylamide was measured by HPLC analysis. The HPLC column used was ULTRON 80HG (50 × 8 φmm), and a 10 mM phosphoric acid aqueous solution was used as a developing solution. Acrylamide was detected by absorbance at 220 nm.
[0037]
[Example 1]
In order to replace Thr at position 109 of the α subunit with Ser, a “LA PCR in vitro mutagenesis Kit” manufactured by Takara Bio Inc. was used with the pPT-DB1 plasmid DNA described in JP-A-9-275978 as a template. The site-specific mutagenesis used was performed. Hereinafter, the “LA PCR in vitro mutagenesis Kit” is simply referred to as a kit. In the following examples, the principle and operation method of the kit were basically followed.
[0038]
10 ml of LB liquid medium was prepared in a 30 ml test tube, and sterilized by an autoclave at 121 ° C. for 20 minutes. After ampicillin was added to this medium to a final concentration of 100 μg / ml, the MT-10822 strain was inoculated with a monobacterium ear and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. After 1 ml of the culture solution was collected in a suitable centrifuge tube, the cells were separated by centrifugation (15000 rpm × 5 minutes). Subsequently, plasmid DNA of pPT-DB1 was prepared from the cells by alkaline SDS extraction.
[0039]
Two types of PCR reactions were performed using 1 μg of the plasmid DNA of pPT-DB1 as a template. PCR reaction No. 1 is a heat-denaturing system having a total volume of 50 μl each containing 50 pmol of the primer described in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing) (composition depends on the conditions described in the kit). (98 ° C.) for 15 seconds, annealing (55 ° C.) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C.) for 120 seconds were repeated for 25 cycles. PCR reaction No. 2 is a 50 μl total system containing 50 pmol each of MUT4 primer (sequence described in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing) and M13 primer RV (sequence described in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing) (composition depends on the conditions described in the kit) ), The PCR reaction No. The same operation as in Example 1 was performed. PCR reaction No. 1 and No. 1 When the DNA amplification product was analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration: 1.0% by mass) using 5 μl of each of the reaction completion liquids of 2, the presence of the amplified DNA product was confirmed. Excess primers and dNTPs were removed from each PCR reaction solution using Microcon 100 (manufactured by Takara Shuzo), and TE was added to prepare 50 μl of each solution. A total of 47.5 μl of an annealing solution containing 0.5 μl of the TE solution (composition according to the conditions described in the kit) was prepared, subjected to a heat denaturation treatment (98 ° C.) for 10 minutes, and then to 37 ° C. for 60 minutes. After that, cooling was performed at a constant rate, followed by annealing at 37 ° C. for 15 minutes. 0.5 μl of Takara Taq manufactured by Takara Bio Inc. was added to the annealing solution, and heat treatment was performed at 72 ° C. for 3 minutes to complete a heteroduplex. To this was added 50 pmol of each of M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing) and M13 primer RV (sequence described in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing) to make the total amount 50 μl, and then heat denaturation (98 ° C.) ) For 15 seconds, annealing (55 ° C) for 30 seconds and extension reaction (72 ° C) for 120 seconds were repeated for 25 cycles. 3 was performed. PCR reaction No. The DNA amplification product was analyzed by agarose electrophoresis (using Sigma type VII low-melting point agarose; agarose concentration of 0.8% by mass) using 5 μl of the reaction-finished solution of Example 3, and the amplified DNA product of about 2.0 kbp was obtained. Was confirmed. Subsequently, only a DNA fragment of about 2.0 Kbp was cut out from the agarose gel, and the agarose piece (about 0.1 g) was finely pulverized and suspended in 1 ml of a TE solution, followed by heating at 55 ° C. for 1 hour to complete agarose. Was melted. This melt was subjected to phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation according to a conventional method to purify the DNA fragment, and finally dissolved in 10 μl of TE. After the purified amplified DNA fragment of about 2.0 kbp was digested with restriction enzymes EcoRI and HindIII, this restriction enzyme-treated solution was subjected to phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation to purify the DNA fragment. In TE. Similarly, pPT-DB1 was cleaved with EcoRI and HindIII, which are the only restriction enzyme sites on pPT-DB1, and subjected to agarose gel electrophoresis (using Sigma type VII low melting point agarose; agarose concentration of 0.7%). Only a DNA fragment of about 2.7 Kbp was cut out from the agarose gel. The cut out agarose pieces (about 0.1 g) were finely pulverized and suspended in 1 ml of a TE solution, and then kept at 55 ° C. for 1 hour to completely melt the agarose. The melt was subjected to phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation to purify the DNA fragment, and finally dissolved in 10 μl of TE. The thus obtained amplified DNA product and the pPT-DB1 fragment were ligated using a DNA ligation kit (Takara Shuzo), and then competent cells of Escherichia coli HB101 (Toyobo Co., Ltd.) were transformed. A bank was prepared.
[0040]
In a 30 ml test tube, 10 ml of an LB liquid medium (hereinafter referred to as an activity expression medium) containing 40 μg / ml of ferric sulfate heptahydrate and 10 μg / ml of cobalt chloride dihydrate was prepared, The solution was sterilized by an autoclave at 121 ° C. for 20 minutes. After ampicillin was added to this medium to a final concentration of 100 μg / ml, 5 clones arbitrarily selected from the Escherichia coli bank were inoculated with each white ear, and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. did. After 1 ml of the culture-finished solution was collected in an appropriate centrifuge tube, the cells were separated by centrifugation (15000 rpm × 5 minutes). The cells were suspended in 200 μl of potassium phosphate buffer (pH 7.0), and 1% by mass of acrylonitrile was added thereto, followed by a reaction at 10 ° C. for 2 minutes. The reaction was stopped by adding an equal volume of a 1 M phosphoric acid aqueous solution to the reaction solution, and the concentration of the generated acrylamide was measured by the same HPLC analysis as in Example 2. As a result, generation of acrylamide was detected in 4 out of 5 clones, and it was confirmed that the clone retained nitrile hydratase activity.
[0041]
The cells of each of the four clones were separated from the remaining 1 ml of the culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and plasmid DNA of each clone was prepared by alkaline SDS extraction. Subsequently, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of each clone was determined by a primer extension method using a sequencing kit manufactured by ABI and an auto sequencer 373A. As a result, clone No. 1 shown in Table 1 was obtained. In No. 1, Thr at position 109 of the α subunit of nitrile hydratase was replaced with Ser.
[0042]
[Table 1]

[0043]
[Example 2]
Purification of mutant nitrile hydratase in which Thr at position 109 of the α subunit is substituted with Ser and measurement of contained metal atoms
100 ml of a medium having the following composition was prepared in a 500 ml baffled Erlenmeyer flask, sterilized by autoclaving at 121 ° C. for 20 minutes, and 30 ampicillins were added to a final concentration of 50 μg / ml. The clone No. obtained in Example 1 was placed in each Erlenmeyer flask with baffles. 1 was inoculated at each ear and cultured at 37 ° C. and 130 rpm for 20 hours. After consolidating the culture solution in each baffled Erlenmeyer flask, only the cells were separated from the culture solution by centrifugation (15000 G × 15 minutes), and then the cells were resuspended in 50 ml of physiological saline. After turbidity, centrifugation was performed again to obtain 120 g of wet cells.
[0044]

[0045]
110 g of the cells were suspended in 540 mL of 50 mM Tris · Cl buffer (pH 7.5), and crushed for 10 minutes by an ultrasonic crusher while cooling with ice. After confirming that the cells were completely crushed by a microscope, the crude enzyme extract was obtained by centrifugation (25000 G × 20 minutes). Ammonium sulfate was added to the crude enzyme extract to a saturation concentration of 40%, and the mixture was stirred at a low temperature for 30 minutes. Ammonium sulfate was added again to the supernatant by centrifugation (25000 G × 10 minutes) so that the saturation concentration became 70%, and the mixture was stirred at a low temperature for 30 minutes. Thereafter, a precipitate was obtained by centrifugation (25000 G × 10 minutes).
The precipitate was suspended in 20 mL of a 50 mM Tris · Cl buffer (pH 7.5), and dialysis was performed on buffer A for desalting.
[0046]
The dialysate was subjected to anion exchange chromatography using DEAE-Sepharose manufactured by Amersham Pharmacia. The developing solution was buffer A, and the concentration was increased from 0 M to 1.0 M with potassium chloride at a constant gradient to obtain a fraction containing nitrile hydratase activity. Further, the active fraction was dialyzed against buffer A, and then subjected to anion exchange chromatography using a MonoQ column (HR5 / 5) manufactured by Amersham Pharmacia. The developing solution was buffer A, and the concentration was increased from 0 M to 1.0 M with potassium chloride at a constant gradient to obtain a fraction containing nitrile hydratase activity. At the end, the active fraction was dialyzed against buffer A, and then concentrated with Centricon 30 manufactured by Amicon to obtain a purified enzyme solution having a protein concentration of 8.0 mg / mL.
[0047]
Next, after dispensing 50 μL of the purified enzyme solution and 50 μL of pure water into a microtube, open the lid of the microtube, cover the aluminum tube with an aluminum foil, and use 80 ° C. Dry Thermo Unit DTU-28 (manufactured by TAITEC). It was left to dry for 3 hours. Subsequently, 30% of 61% nitric acid was added thereto, and the mixture was allowed to stand at 80 ° C. with Dry Thermo Unit DTU-28 (manufactured by TAITEC) for 18 hours to be completely dried. Then, 1 mL of 0.1N nitric acid was added, and SPS 1200VR plasma was added. The metal content was measured using a spectrometer (manufactured by Seiko). As a result, one molecule of the present enzyme (α ₂ β ₂ ), It was found that about 1.02 Co atoms were contained. Further, no iron atom was contained.
[0048]
In this measurement, buffer A was used instead of the purified enzyme solution as a control, and a cobalt standard solution (Co (NO ₃ ) ₂ /0.1N-HNO ₃ , Concentration 1000 ppm) and the same iron standard solution (FeCl ₃ /0.1N-HCl, concentration 1000ppm) with 0.1N HNO ₃ Was diluted 1000 times.
[0049]
[Example 3] Crystallization and X-ray structure analysis
A reservoir solution comprising a purified enzyme solution of the mutant nitrile hydratase in which Thr at position 109 of the α subunit obtained in Example 2 was replaced with Ser, 1.2 M sodium citrate and 0.1 M sodium HEPES ( pH 7.5) was mixed at a ratio of 1: 1 and crystals of the enzyme were formed at 5 ° C. by a vapor equilibrium diffusion method.
The obtained crystal diffracts X-rays to a resolution of 2.5 °, and a space group P3 having cell dimensions a = b = 65.571 ° and c = 184.571 °. ₂ 21. One αβ heterodimer was present in the asymmetric unit of the crystal.
[0050]
The crystal structure of the enzyme was analyzed by molecular replacement (MR) based on the crystal structure of wild-type nitrile hydratase derived from Pseudonocardia thermophila JCM3095 strain (PDB file code: 1IRE).
[0051]
The cobalt atom was bonded to a cysteine cluster (Cys-Ser-Leu-Cys-Ser-Cys) site located at positions 108 to 113 of the amino acid sequence of the α subunit. More specifically, it was bonded to the sulfur atom of the 108th, 111th, and 113th Cys residues, and to the nitrogen atom of the main chain of the 112th Ser residue and the 113th Cys residue. .
[0052]
An extra electron density was observed around the 111th and 113th Cys residues. In the Fo-Fc map, two electron densities were observed around the Cys residue at position 111, and one electron density was observed around the Cys residue at position 113. That is, similar to wild-type nitrile hydratase, the Cys residue at position 111 was post-translationally modified to sulfinic acid (Cys-SO2H), and the Cys residue at position 113 was post-translationally modified to sulfenic acid (Cys-SOH). . That is, the amino acid sequence of the cysteine cluster site located at positions 108 to 113 of the α subunit of the present enzyme is Cys-Ser-Leu-Csi-Ser-Cse (Csi in the sequence is cysteine sulfinic acid, and Cse is cysteine sulfinic acid. Phenic acid).
[0053]
Sequence listing free text
SEQ ID NO: 1: Cobalt atom binding region in cobalt-type nitrile hydratase
SEQ ID NO: 2: Amino acid sequence of α-subunit of nitrile hydratase derived from Pseudonocardia thermophila JCM3095 strain
SEQ ID NO: 3: Amino acid sequence of β-subunit of nitrile hydratase derived from Pseudonocardia thermophila JCM3095 strain
SEQ ID NO: 4: Synthetic primer for preparing mutant nitrile hydratase gene
SEQ ID NO: 5: M13 primer M4 for preparing mutant nitrile hydratase gene
SEQ ID NO: 6: MUT4 primer for preparing mutant nitrile hydratase gene
SEQ ID NO: 7: M13 primer RV for preparing mutant nitrile hydratase gene
[0054]
【The invention's effect】
According to the present invention, an amino acid sequence (Cys-Ser-Leu-Csi-Ser-Cse) of a cobalt atom binding region in a cobalt-type nitrile hydratase is provided. Csi in the sequence indicates cysteine sulfinic acid, and Cse indicates cysteine sulfenic acid.
[0055]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows a Fo-Fc map of a cobalt atom binding region of a mutant nitrile hydratase in which Thr at position 109 of the α subunit of the nitrile hydratase derived from Pseudonocardia thermophila JCM3095 strain is substituted with Ser. In the figure, regarding the skeleton of the amino acid, a white outline indicates a carbon atom, a black solid indicates an oxygen atom, a gray solid indicates a nitrogen atom, and a stripe indicates a sulfur atom. Arrows indicate the α-position carbon of each amino acid residue. Further, hatching indicates the Fo-Fc map, and the center circle indicates a cobalt atom.

Claims

Cobalt via a region represented by the amino acid sequence Cys-Ser-Leu-Csi-Ser-Cse described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing (Csi in the sequence indicates cysteine sulfinic acid, and Cse indicates cysteine sulfenic acid). Cobalt-type nitrile hydratase containing as an element a subunit bonded to an atom.

Cys-Thr-Leu-Csi-Ser-Cse in the α-subunit of cobalt-type nitrile hydratase derived from Pseudonocardia thermophila (Csi in the sequence indicates cysteine sulfinic acid, and Cse indicates cysteine sulfenic acid. ) Is replaced with a Ser residue in the binding region to the cobalt atom, and the amino acid sequence Cys-Ser-Leu-Csi-Ser-Cse (SEQ ID NO: 1) described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. The cobalt-type nitrile hydratase according to claim 1, which is bonded to a cobalt atom via a region represented by Csi and Cse as described above.

The amino acid sequence consists of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence list, and the amino acid sequence Cys-Ser-Leu-Csi-Ser-Cse described in SEQ ID NO: 1 in the sequence list (Csi in the sequence is cysteine sulfinic acid, and Cse is cysteine sulfe). The cobalt-type nitrile hydratase according to claim 1, comprising a subunit bonded to a cobalt atom via a region represented by phenic acid).

It consists of an amino acid sequence obtained by substituting, deleting, deleting or inserting one or several of the amino acid sequences excluding the 108th to 113th amino acids described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and comprises: 1 is linked to a cobalt atom via a region represented by the amino acid sequence Cys-Ser-Leu-Csi-Ser-Cse (Csi in the sequence indicates cysteine sulfinic acid and Cse indicates cysteine sulfenic acid). The cobalt-type nitrile hydratase according to claim 1, comprising a subunit as a constituent element.

The cobalt-type nitrile hydratase according to claim 1, which comprises both the subunit according to claim 3 or 4 and the subunit consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing as constituent elements.

The amino acid sequence obtained by substituting, deleting, deleting or inserting one or several of the subunits according to claim 3 or claim 4 and the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 3 in the sequence listing. 2. The cobalt-type nitrile hydratase according to claim 1, which comprises the following subunit as a constituent element.

A strain (including a transformant) containing the cobalt-type nitrile hydratase according to any one of claims 1 to 6, a culture solution of the strain, and a processed product thereof.

The bacterial strain according to claim 7 (including a transformant), a culture solution of the bacterial strain, a treated product thereof, or a cobalt-type nitrile hydratase obtained therefrom and a nitrile compound, which are brought into contact with each other in an aqueous medium. A method for producing an amide compound corresponding to a nitrile compound.