JP2004261040A - Method for removing chemical substance, new dna - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、化学物質を除去するする方法、そのための新規ＤＮＡ、それを含む組み換えベクター、それを含む微生物、微生物の産するタンパク質、該微生物や該タンパク質を用いた化学物質吸着回収および除去法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、世界各地でヒ素による地下水汚染が問題となっている。例えば、インドの西ベンガル地方、台湾、中国内蒙古、ハンガリー、チリのアントンファガスタ、メキシコのラグネラなどでヒ素による水質汚染問題が発生している。特に、インドの西ベンガル地方からバングラディシュにまたがるガンジス川流域ではＵＮＥＳＣなどの国際機関が生活用水または飲料用水として、表流水を利用することによる伝染病の蔓延を避けるために、飲料用水を地下水へ転換するために井戸を掘ることを推奨したことが原因となり、現在では９５％の人々がヒ素に汚染された地下水に頼って生活していると言われている。
【０００３】
ここで、日本における水中のヒ素除去法は確立しており、凝集剤による凝集法、活性アルミナや二酸化マンガンあるいはセリウム担持吸着剤を用いた吸着法などが知られ、これらの方法によって安全な飲料水ができる。
【０００４】
なお、本発明に関連する各種の手法等について開示するものとして、次のような非特許文献１〜５が挙げられる。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｃａｒｌｉｎ Ａ， ｅｔ ａｌ．： Ｔｈｅ ａｒｓ ｏｐｅｒｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｃｏｎｆｅｒｓ ａｒｓｅｎｉｃａｌ ａｎｄ ａｎｔｉｍｏｎｉａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ， Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ （１９９５）， Ｖｏｌ．１７７， ｐｐ．９８１−９８
【非特許文献２】
Ｂｏｕｌａｉｎ Ｊ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ．： Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｒａｎｄｏｍ ｌｉｎｋｅｒ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｌａｍＢ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２， Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ （１９８６） Ｖｏｌ．２０５， ｐｐ．３３９−３４８
【非特許文献３】
Ｓｏｕｓａ Ｃ．， ｅｔ ａｌ．： Ｍｅｔａｌｌｏａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｂｙ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｃｅｌｌｓ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ Ｙｅａｓｔ ａｎｄ Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎｓ ａｎｃｈｏｒｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＬａｍＢ， Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ（１９９８）， ｐｐ．２２８０−２２８４
【非特許文献４】
Ｋｕｒｏｄａ Ｋ， ｅｔ ａｌ．： Ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｙｅａｓｔ ｗｉｔｈ ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｂｉｎｄ， ａｎｄ ｓｅｌｆ−ａｇｇｒｅｇａｔｅ ｉｎ ｔｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｃｏｐｐｅｒ ｉｏｎ， Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００２）， Ｖｏｌ．５９， ｐｐ．２５９−６４．
【非特許文献５】
Ｔａｕｒｉａｉｎｅｎ Ｓ， ｅｔ ａｌ．： Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｂｉｏａｖａｉｌａｂｌｅ ａｒｓｅｎｉｔｅ ａｎｄ ａｎｔｉｍｏｎｉｔｅ， Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９７）， Ｖｏｌ．６３， ｐｐ．４４５６−６１
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、日本で行われている方法は大掛かりな処理装置やプラントを必要とする高価な方法である。一方、ヒ素汚染が深刻なバングラディシュ等では経済的、技術的問題などに起因して日本と同じ方法の適用は難しい。そこで、より安価で簡便に実行できる、ヒ素除去技術が要望されている。
【０００７】
本発明は、ヒ素などの化学物質の除去を効果的に行うことができる方法、そのための新規ＤＮＡ、それを含む組み換えベクター、それを含む微生物、微生物の産するタンパク質、該微生物や該タンパク質を用いた化学物質吸着回収および除去法を提供する。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究の結果、微生物オペロンの調節遺伝子がオペロンの誘導物質と高い親和性で結合する事実を、化学物質の吸着回収および除去法に応用できるのではないかとの推測で実験を試みた。
【０００９】
本発明は、微生物オペロンの調節遺伝子がコードするリプレッサータンパク質と微生物の細胞表層に膜タンパク質との融合タンパク質（キメラタンパク質）を発現し得る微生物細胞に関する。
【００１０】
前記リプレッサータンパク質が特定化学物質と結合することが好適である。
【００１１】
また、好適には、前記リプレッサータンパク質がＡｒｓＲタンパク質である。
【００１２】
また、前記微生物が、ｌａｍＢ−ａｒｓＲ発現ベクターまたはｌａｍＢ−Ｈｉｓ ａｒｓＲ発現ベクターを保持した大腸菌であることが好適である。
【００１３】
また、本発明は、上述した微生物細胞を利用して、特定化学物質を吸着除去する方法に関する。
【００１４】
また、本発明は、微生物オペロンの調節遺伝子のコードするリプレッサータンパク質を用いて特定の化学物質を吸着除去する方法に関する。
【００１５】
また、前記リプレッサータンパク質は、担体に固定されて用いられることが好適である。
【００１６】
また、前記担体が膜またはカラムであることが好適である。
【００１７】
また、前記リプレッサータンパク質は、これを発現する形質転換された微生物から精製して得られたものであることが好適である。
【００１８】
また、前記微生物は、ＡｒｓＲタンパク質にマルトース結合タンパク質およびヒスチジンタグが付加された融合タンパク質を発現し得る大腸菌であることが好適である。
【００１９】
また、前記吸着除去される特定化学物質は、オペロンの誘導物質であることが好適である。
【００２０】
本発明は、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡに関する。
【００２１】
また、前記ＤＮＡは、配列表の配列番号２で示される塩基配列を有することが好適である。
【００２２】
本発明は、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする第１のＤＮＡと、該第１のＤＮＡのコードするタンパク質と融合タンパク質が形成されるようにＤＮＡ配列において同じコドンフレームに連結された膜タンパク質、または膜やカラム担体と親和性や化学反応を介し結合が可能なタンパク質もしくはペプチドをコードする第２のＤＮＡと、を有する組換えベクターに関する。
【００２３】
また、前記第１のＤＮＡは微生物オペロンの調節遺伝子であるａｒｓＲ遺伝子であることが好適である。
【００２４】
また、前記第２のＤＮＡは膜タンパク質をコードするｌａｍＢ遺伝子であることが好適である。
【００２５】
本発明は、ヒ素を吸着する微生物であって、上述した組換えベクターにより形質転換され、膜タンパク質とともに前記第一のＤＮＡがコードするタンパク質が細胞表面に発現され、ヒ素を吸着する微生物に関する。
【００２６】
また、前記微生物は、大腸菌であることが好適である。
【００２７】
また、前記微生物は、ｌａｍＢ−ａｒｓＲ発現ベクターまたはｌａｍＢ−Ｈｉｓ ａｒｓＲ発現ベクターを保持した大腸菌であることが好適である。
【００２８】
また、本発明は、上述した微生物と接触させ、被処理試料からヒ素を吸着除去する方法に関する。
【００２９】
また、前記第２のＤＮＡは、膜またはカラム担体と結合する遺伝子であり、アミロース担体と高い親和性で結合するマルトース結合タンパク質をコードするｍａｌＥ遺伝子であることが好適である。
【００３０】
また、本発明は、上述の組換えベクターにより形質転換され、前記第１のＤＮＡである調節遺伝子とｍａｌＥ遺伝子との発現によりキメラタンパク質を生産する微生物に関する。
【００３１】
また、前記微生物は、大腸菌であるであることが好適である。
【００３２】
また、前記微生物は、ｐＭａｌ−Ｈｉｓ ａｒｓＲを保持した大腸菌であることが好適である。
【００３３】
また、前記第２のＤＮＡにおいて、カラム担体と結合するペプチドは６残基のヒスチジンペプチドをコードするＤＮＡであることが好適である。
【００３４】
また、本発明は、前記組換えベクターにより形質転換され、前記第１のＤＮＡである調節遺伝子と、ヒスチジンペプチドをコードする遺伝子の発現により、キメラタンパク質を生産する微生物に関する。
【００３５】
前記微生物は、大腸菌であることが好適である。
【００３６】
また、本発明は、上述した微生物の生産したキメラタンパク質に関する。
【００３７】
また、本発明は、微生物オペロンの調節遺伝子のコードするリプレッサータンパク質を含む特定化学物質の除去剤に関する。
【００３８】
また、前記特定化学物質はヒ素であることが好適である。
【００３９】
また、前記リプレッサータンパク質は、ａｒｓＲ遺伝子のコードするａｒｓＲタンパク質であることが好適である。
【００４０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施形態について、図面に基づいて説明する。
「本実施形態の概要」
大腸菌のヒ素耐性オペロン（ａｒｓ オペロン）は５価のヒ素を細胞に取り込み、３価のヒ素に還元し、還元した３価ヒ素を細胞外に排出する働きをする。ａｒｓオペロンの調節遺伝子のコードするＡｒｓＲタンパク質は通常オペロンのオペレーター／プロモーター（ｏ／ｐ）部位に結合して、ａｒｓＡ，ａｒｓＢ，ａｒｓＣ遺伝子の発現を抑制している。細胞内に５価のヒ素が侵入し、ＡｒｓＲタンパク質と接触するとＡｒｓＲタンパク質は構造を変化させて、５価のヒ素と結合し、（ｏ／ｐ）部位から解離して、５価ヒ素と結合する。この結果、ａｒｓＡ，ａｒｓＢ，ａｒｓＣ遺伝子は発現し、５価ヒ素を３価のヒ素に還元して細胞外に排出する働きを始めると考えられている（非特許文献１）。
【００４１】
本実施形態では、このＡｒｓＲをコードするＤＮＡ領域を利用する。
【００４２】
次に、ＬａｍＢ、は３層に分かれるペリプラズム層でも最も外側で存在する３量体のマルトース受容体である。ＬａｍＢは膜通過のドメインを５つ持ち、膜通過ドメインは外界に接している。その領域に目的の遺伝子を挿入すれば、Ｎ末端とＣ末端の両方を外膜にアンカーさせた形で外界に露出させることができる。ＬａｍＢタンパク質の外界ドメイン中のアミノ酸１５３−１５４間とアミノ酸２５３−２５４間の２ヶ所はタンパク質の全体構成や３量体形成に影響を与えることなく、長鎖の遺伝子を挿入することができる（非特許文献２）。そのため、目的となる遺伝子を発現させる際のキャリアーとして最も良く研究されている（非特許文献３）。
【００４３】
ＬａｍＢがペリプラズム層へ移動するメカニズムは、Ｎ末端部に７〜１５個の疎水性アミノ酸のクラスターであるシグナル配列（シグナルペプチド）に従っている。ＬａｍＢはペリプラズム層に移動するシグナルペプチドを持つペリプラズム層へ移動するとシグナルペプチドがシグナルペプチターゼと呼ばれる酵素で切断され成熟したタンパク質となる（非特許文献２）。
【００４４】
本開発者らはＬａｍＢの外界と接するアミノ酸１５３−１５４の間にヒ素と結合するａｒｓオペロンのＡｒｓＲタンパク質を融合させたキメラタンパク質を作製し、これを大腸菌の細胞表層に提示することができる大腸菌を作製した。
【００４５】
また、本開発者らはＬａｍＢの外界と接するアミノ酸１５３−１５４の間にＣｄ，Ｃｕ，Ｈｇ，Ｚｎと結合するヒスチジンペプチドとヒ素と結合するａｒｓオペロンのＡｒｓＲタンパク質とを融合させたキメラタンパク質を作製し、これを大腸菌の細胞表層に提示することができる大腸菌を作製した。
【００４６】
ここで、ＡｒｓＲタンパク質は配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるものを挙げることができるが、ヒ素との結合能を保持する範囲で前記アミノ酸配列に欠失、付加、挿入、置換を有するものも含まれる。このＡｒｓＲタンパク質をコードするＤＮＡとしては配列番号２を挙げることができるが、ヒ素との結合能を保持し得るタンパク質をコードしたＤＮＡであれば、配列番号２の塩基配列と高い相同性を有するＤＮＡも含めることができる。また、ＡｒｓＲタンパク質を細胞表層に提示するために用いる融合遺伝子はｌａｍＢ遺伝子に限定されるものではない。他の膜タンパク質をコードする遺伝子でも、ＡｒｓＲタンパク質のヒ素結合能をさまたげないものであれば採用可能である。さらに、このｌａｍＢ遺伝子を用いた場合において、ａｒｓＲ遺伝子を挿入する領域はアミノ酸１５３−１５４をコードした領域に限定されず、ＬａｍＢタンパク質が外界ドメインと接し全体構成に影響を与えないアミノ酸２５３−２５４をコードした領域であってもよい。
【００４７】
ａｒｓＲ遺伝子やｌａｍＢ遺伝子は大腸菌や他の微生物のゲノムから、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーション技術によってクローニングすることが可能であり、またＤＮＡ合成機などを用いて人工的に合成してもよい。なおクローニングの操作については下記実施例に記載されている。また、ａｒｓＲとｌａｍＢの融合遺伝子の構築は例えばＰＣＲによる制限酵素サイト付加とＤＮＡライゲーション酵素を用いて行うことができる。
【００４８】
本組換えベクターは、通常のクローニングベクターと同様に自立複製開始点を有する。また、選択のために、薬剤耐性のような選択マーカーを有することが好ましい。このようなクローニングベクターはこの分野において、周知であり、数多くのものが市販されている。本発明の組換えベクターはこのような市販の組換えベクターに、上記のｌａｍＢとａｒｓＲに融合遺伝子を組込むことにより作製することができる。
【００４９】
このようにして作製されるベクターは、例えば図１に示すような遺伝子地図を有するものである。このベクターは、ｐＴＶ１１８ＮベクターにａｒｓＲが挿入されたｌａｍＢＤＮＡ断片を挿入して形成されている。
【００５０】
そして、本組換えベクターで微生物を形質転換することにより、ヒ素を吸着および除去回収することができる微生物を得ることができる。微生物としては、例えば大腸菌を例示することができるが、ａｒｓＲ遺伝子が発現可能である宿主−ベクター系が確立されているあらゆる微生物を宿主として利用することができる。例えば、宿主大腸菌の場合には、大腸菌用のクローニングベクターにおいてｌａｃプロモーターなど大腸菌で可動するプロモーター下流にｌａｍＢとａｒｓＲを融合した遺伝子を挿入し、得られた組換えベクターで大腸菌を形質転換すればよい。このような形質転換の操作自体はこの分野において周知であり、説明を省略する。
【００５１】
ここで、上述のベクターによって、形質転換された大腸菌としては、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ（適宜Ｅ． ｃｏｌと称する））ＦＥＲＭ Ｐ−１９２２８（受託番号）（Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α＋ｐＴＶ＋ｌａｍＢ−ａｒｓＲという）を例示することができる。
【００５２】
このようにして得た微生物（例えば、大腸菌）は、ヒ素を細胞表層に吸着することができる。培養液中のヒ素吸着量は吸着した微生物が重くなるために早く沈降する。このため、培養液の上清を原子吸光光度計やカルバミン酸銀を用いた既存の方法によって測定して得た値（ヒ素濃度）を予め添加したヒ素量（ヒ素濃度）から差し引くことによって、ヒ素の除去量を求めることができる。
【００５３】
本発明の組換えベクターはａｒｓオペロンのａｒｓＲとオペロンのプロモーターオペレター領域とリポーター遺伝子の連結した遺伝子の発現実験結果（非特許文献５）より３価ヒ素や５価ヒ素および輝安鉱にも反応すると考えられる。従って、本発明の組換えベクターはこれらの組換えベクターは輝安鉱の吸着除去回収にも用いることができる。
【００５４】
また、ヒ素以外の重金属が結合可能な６残基のヒスチジン（ヒスタグ）をコードするＤＮＡを付加したａｒｓＲとｌａｍＢ遺伝子を融合させた遺伝子を挿入した組換えベクターも好適である。この場合、ヒスタグを挿入する工程を付加する工程を追加すれば、上述の場合と同様に作製できる。
【００５５】
このヒスタグを付加したベクターによって、形質転換された大腸菌としては、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ） ＦＥＲＭ Ｐ−１９２２７（受託番号）（Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α＋ｐＴＶ＋ｌａｍＢ−Ｈｉｓ ａｒｓＲという）を例示することができる。
【００５６】
さらに、ａｒｓＲタンパク質をカラムや膜担体に保持して、ヒ素を処理することも可能である。この際には、ａｒｓＲタンパク質にマルトース結合タンパク質（ＭａｌＥ）と６残基のヒスチジン（ヒスタグ）を付加した融合タンパク質を発現し得る組換えベクターを作製し、このベクターによって大腸菌を形質変換し、ここで発現されたキメラタンパク質を精製して用いるとよい。この場合ＭａｌＥが膜などと親和力が高く、固定することが容易となる。
【００５７】
なお、このＡｒｓＲタンパク質マルトース結合タンパク質（ＭａｌＥ）と６残基のヒスチジン（ヒスタグ）を付加した融合タンパク質を大腸菌で生産および精製するための組換えベクターによって、形質転換された大腸菌としては、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ） ＦＥＲＭ Ｐ−１９２２９（受託番号）（Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α＋ｐＭａｌ−Ｈｉｓ ａｒｓＲという）を例示することができる。
【００５８】
以下、本発明を実施例に基づきさらに具体的に説明する。ここで、下記実施例は、例示であって本発明がこれら実施例に限定されるものではない。なお、下記実施例において、特に明示がない限り、個々の操作はすべて、Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ． ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓの記載に従った。
【００５９】
「組換えべクター」
１）ａｒｓＲのＰＣＲクローニングとＢａｍＨＩサイトを導入したインサートの調製
図２に示すように、ＡｒｓＲは大腸菌ＤＨ５α株のゲノムよりＰＣＲによってクローニングした。ゲノミックＤＮＡは約１００ｎｇ用いた。ＰＣＲプライマーはａｒｓオペロンのａｒｓＲ，ａｒｓＢ，ａｒｓＣがコードされているＤＮＡ領域を増幅することができるａｒｓ５’ｐｒｉｍｅｒ（配列：５’−ＴＣＣＧＣＴＴＡＣＴＣＡＴＣＣＡＣＴＧＣＣＴＧＴＣ− ３’：配列番号７）とａｒｓ３’ｐｒｉｍｅｒ（配列５’−ＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＧＡＣＧＣＧＡＴＡＡＴＴＧＧ− ３’：配列番号８）を用いた。
【００６０】
ＰＣＲ反応は、ＬＡ−Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造製）を用いて、Ｈ２Ｏで反応液量を２０μＬに調製して行った。ＰＣＲ条件は９８℃：１０秒、６８℃：１５分を２５ｃｙｃｌｅ行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、ＤＮＡ断片を分離して約３ｋｂｐのバンドを回収した。回収したＤＮＡをｐＧＥＭ−Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ製）に挿入（ライゲーション）した。この作製したプラスミドをｐＧＥＭ−Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ＋ａｒｓＲ＋ａｒｓＢ＋ａｒｓＣとした。
【００６１】
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α株をｐＧＥＭ−Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ＋ａｒｓＲ＋ａｒｓＢ＋ａｒｓＣを用いて形質転換した。形質転換体よりプラスミドを調製した。この結果、インサート方向の異なる２つのプラスミドが得られたが、ｐＧＥＭ−Ｔベクターのｌａｃプロモーターの作用する向きと逆向きにインサートが挿入されたものを実験に用いた。
【００６２】
図３に示すように、ａｒｓＲがコードしてあるｐｌａｓｍｉｄを回収するために、ａｒｓＲ，ａｒｓＢ，ａｒｓＣ遺伝子断片をＨｉｎｃＩＩとＥｃｏＲＶとＢｓｓＨＩで消化した。断片をアガロースゲル電気泳動し、ａｒｓＲをコードしている１．５ｋｂｐ付近の遺伝子断片を回収した。
【００６３】
回収したバンドをｐＢｌｕｓｅｃｒｉｐｔ ＫＳ−ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）をＨｉｎｃＩＩで消化した上で、アルカリフォスファターゼ処理により脱リン酸化したベクターに挿入（ライゲーション）した。この作製したプラスミドをｐＫＳ＋ａｒｓＲとした。
【００６４】
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α株をｐＫＳ＋ａｒｓＲを用いて形質転換した。形質転換体よりプラスミドを調製した。この結果、インサート方向の異なる２つのプラスミドが得られたが、ベクターのｌａｃプロモーターの作用する向きにインサートが挿入されたものを実験に用いた。
【００６５】
図４に示すように、ａｒｓＲ遺伝子をｌａｍＢ遺伝子と連結するために、のりしろであるＢａｍＨＩサイトをａｒｓＲ遺伝子の５’および３’両末端に、次の２回のＰＣＲによって付加した。鋳型ＤＮＡは約１ｎｇのｐＫＳ＋ａｒｓＲを用いた。５’末端にＢａｍＨＩを付加するための１回目のＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒはａｒｓＮＢａｍ１ ｐｒｉｍｅｒ（配列：５’−ＣＣＣＧＣＣＡＴＧＴＣＡＴＴＴＣＴＧＴＴＡＣＣＣＡＴＣＣＡＡＴＴＧＴＴＣ−３’：配列番号９）とＭ１３Ｆ ｐｒｉｍｅｒ（配列：５’−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’：配列番号１０）を用いた。なお、Ｍ１３ ｐｒｉｍｅｒは、Ｍ４ ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造製）ともいう。ＰＣＲ反応はＫＯＤ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （ＴＯＹＯＢＯ製）を用いて、Ｈ２Ｏで反応液量を２０μＬに調製して行った。ＰＣＲ条件は９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７４℃で１分を２５ｃｙｃｌｅ行った。
【００６６】
増幅産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ａｒｓＲを含む約１ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。回収した断片を鋳型に引き続きＰＣＲを行った。５’末端にＢａｍＨＩを付加するための２回目のＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒにａｒｓＮＢａｍ２ ｐｒｉｍｅｒ（配列：５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＣＣＡＴＧＴＣＡＴＴＴＣＴＧＴＴＡＣＣＣＡＴＣＣＡＡ−３’：配列番号１１）とＭ１３Ｆ ｐｒｉｍｅｒを用いた。ＰＣＲ条件は、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７４℃で１分を、２５ｃｙｃｌｅ行った。この２回のＰＣＲによってａｒｓＲのＮ末端にＢａｍＨＩサイトを導入した。このＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで切断し、アクリルアミドゲルに電気泳動して約１ｋｂｐのバンドを回収した。回収したバンドをＢａｍＨＩで切断後に、アルカリフォスファターゼ処理により脱リン酸化した、ｐＵＣ１１９ベクター（宝酒造製）に挿入（ライゲーション）した。この作製したプラスミドをｐＵＣ１１９＋ａｒｓＲとした（図５参照）。
【００６７】
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α株をｐＵＣ１１９＋ａｒｓＲを用いて形質転換した。形質転換体よりプラスミドを調製した。この結果、インサート方向の異なる２つのプラスミドが得られたが、ベクターのｌａｃプロモーターの作用する向きと反対向きにインサートが挿入されたものを実験に用いた。
【００６８】
次に、図５に示すように、ａｒｓＲの３’末端にＢａｍＨＩを付加するためのＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡは約１ｎｇのｐＵＣ１１９＋ａｒｓＲを用いた。３’末端にＢａｍＨＩを付加するための１つ目のｐｒｉｍｅｒはａｒｓＣＢａｍ１ｐｒｉｍｅｒ（配列：５’−ＴＣＣＣＧＡＣＴＧＣＡＡＡＴＧＴＴＣＴＴＡＣＴＧＴＣＣＣＣＧＧＡＡＣＡ−３’：配列番号１２）とＭ１３Ｆ ｐｒｉｍｅｒを用いた。ＰＣＲ反応は、ＫＯＤ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いて、Ｈ２Ｏで反応液量を２０μＬに調製して行った。ＰＣＲ反応条件は９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７４℃で１分を２５ｃｙｃｌｅ行った。引き続きＰＣＲ産物を鋳型にして、ａｒｓＣＢａｍ２ ｐｒｉｍｅｒ（配列：５’−ＴＧＧＧＡＴＣＣＣＧＡＣＴＧＣＡＡＡＴＧＴＴＣＴＴＡＣＴＧＴＣＣＣＣＧ−３’：配列番号１３）とＭ１３Ｆ ｐｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで切断し、ポリアクリルアミドゲルに電気泳動して約３５０ ｂｐのバンドを回収した。
このようにして、ｌａｍＢ遺伝子と融合させるためのインサートが作製された。
【００６９】
２）ｌａｍＢ遺伝子へＢａｍＨＩサイトの導入した組換えベクターの作製
図６に示すように、ｌａｍＢは大腸菌ＤＨ５α株のゲノムよりＰＣＲによってクローニングした。ゲノミックＤＮＡは約１００ｎｇ用いた。ＰＣＲプライマーはｌａｍＢ５’ｐｒｉｍｅｒ（配列：５’−ＴＣＧＡＣＴＧＣＡＴＡＡＧＧＡＧＣＣＧＧＧＣＧＴＴＴ− ３’：配列番号１４）とｌａｍＢ３’ｐｒｉｍｅｒ（配列：５’−ＧＧＴＧＴＣＡＧＧＣＧＣＡＴＡＡＣＧＣＣＴＴＣＣＡ− ３’：配列番号１５）を用いた。ＰＣＲ反応はＥＸ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造製）を用いて、Ｈ２Ｏで反応液量を２０μＬに調製して行った。ＰＣＲ条件は９４℃で４５秒、６０℃で４５秒、７４℃で２分を２５ｃｙｃｌｅで行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、ＤＮＡ断片を分離して約２．１ｋｂｐのバンドを回収した。回収したＤＮＡをｐＧＥＭ−Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ製）に挿入（ライゲーション）した。このようにして作製したプラスミドをｐＧＥＭ−Ｔ＋ＬａｍＢとした。
【００７０】
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α株をｐＧＥＭ−Ｔ＋ＬａｍＢを用いて形質転換した。形質転換体よりプラスミドを調製した。この結果、インサート方向の異なる２つのプラスミドが得られたが、ベクターのｌａｃプロモーターの作用する向きと反対向きにインサートが挿入されたものを実験に用いた。
【００７１】
図７に示すように、ｌａｍＢ遺伝子のインフレームに、ａｒｓＲ遺伝子を挿入するためにｌａｍＢ遺伝子を２つのＤＮＡ断片に分離してそれぞれの断片にのりしろであるＢａｍＨＩサイトを次の手順で付加した。
【００７２】
鋳型ＤＮＡは約１ｎｇのｐＧＥＭ−Ｔ＋ＬａｍＢを用いた。５’側の１つ目のＤＮＡ断片にＢａｍＨＩを付加するための１回目のＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒはｌａｍＢ−１５３Ｎ１ ｐｒｉｍｅｒ（配列：５’−ＴＣＣＣＧＧＧＡＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＴＣＡＧＡＧＧＡＧＣＧ−３’：配列番号１６）とＭ１３Ｆ ｐｒｉｍｅｒを用いた。ＰＣＲ反応はＫＯＤ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いて、Ｈ２Ｏで反応液量を２０μＬに調製して行った。ＰＣＲ条件は９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７４℃で１分を２５ｃｙｃｌｅ行った。増幅産物を鋳型にして、２回目のＰＣＲはｌａｍＢ−１５３Ｎ２ ｐｒｉｍｅｒ（配列：５−ＴＧＧＧＡＴＣＣＣＧＧＧＡＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＴＣＡＧＡＧ−３’：配列番号１７）とＭ１３Ｆ ｐｒｉｍｅｒを用いて同様に行った。このＰＣＲ産物をＢａｍＨＩとＳｐｈＩで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動して、約４５０ｂｐのＤＮＡ断片を分離および回収した。このＤＮＡ断片をＡ断片とした（図８参照）。
【００７３】
次に、３’側の２つ目のＤＮＡ断片に２回のＰＣＲによってＢａｍＨＩサイトを導入した。鋳型ＤＮＡは約１ｎｇのｐＧＥＭ−Ｔ＋ＬａｍＢを用いた。１回目のＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒはｌａｍＢ−１５４Ｃ１ ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＴＣＣＣＧＣＣＴＣＴＴＴＣＧＣＣＡＧＣＡＡＣＡＡＴＡＴＴＴＡＴＧＡ−３’：配列番号１８）とＲＶ ｐｒｉｍｅｒ（配列：５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’：配列番号１９）を用いた。ＰＣＲ反応は、ＫＯＤＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （ＴＯＹＯＢＯ製）を用いて、Ｈ２Ｏで反応液量を２０μＬに調製して行った。ＰＣＲ条件は、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７４℃で１分を２５ｃｙｃｌｅ行った。増幅産物を鋳型にして、２回目のＰＣＲはｌａｍＢ−１５４Ｃ２ ｐｒｉｍｅｒ（配列：５’−ＴＧＧＧＡＴＣＣＣＧＣＣＴＣＴＴＴＣＧＣＣＡＧＣＡＡＣＡＡＴＡＴＴ−３’：配列番号２０）とＲＶ ｐｒｉｍｅｒを用いて同様に行った。このＰＣＲ産物をＢａｍＨＩとＳａｃＩで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動して、約１ＫｂｐのＤＮＡ断片を分離および回収した。このＤＮＡ断片をＢ断片とした（図８参照）。
【００７４】
図８に示すように、ＢａｍＨＩサイトをそれぞれ導入したＡ断片とＢ断片の２つのＤＮＡ断片はｐＴＶ１１８Ｎベクター（宝酒造製）のＳｐｈＩとＳａｃＩサイトに２つの断片がＢａｍＨＩサイトを介して連結した形で挿入した。この作製したプラスミドをｐＴＶ１１８Ｎ＋ｌａｍＢ ｐｒｅ（以後、ｐＴＶ−ｌａｍＢ
ｐｒｅという）とした。
【００７５】
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α株をｐＴＶ１１８Ｎ＋ｌａｍＢ ｐｒｅを用いて形質転換した。形質転換体よりプラスミドを調製した。
【００７６】
なお、得られたｐＴＶ−ｌａｍＢ ｐｒｅを以下により、ネガティブコントロール用ベクター作製のためのｌａｍＢのインサート作製の原料とすると共に、ａｒｓＲを挿入するためのベクターとする。
【００７７】
次に、図９に示すように、ｌａｍＢ遺伝子がｌａｃプロモーターから効率よく転写されるようにするために、新たなｐＴＶ１１８ＮベクターのｌａｃＺ遺伝子の開始コドンの位置に合うように、さらにＰＣＲによってｌａｍＢ遺伝子を修飾した。
【００７８】
鋳型ＤＮＡは、約１ｎｇのｐＴＶ１１８Ｎ＋ｌａｍＢ ｐｒｅを用いた。ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒは、ｌａｍＢ遺伝子の開始コドンを欠いたＤＮＡ配列を有するｌａｍＢ−Ｎ２ ｐｒｉｍｅｒ（配列：５’−ＡＴＧＡＴＴＡＣＴＣＴＧＣＧＣＡＡＡＣＴＴＣＣＴＣＴＧＧＣＧＧ−３’：配列番号２１）とＲＶ−Ｎ ｐｒｉｍｅｒ（配列：５’−ＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧ−３’：配列番号２６）を用いた。ｌａｍＢ−Ｎ２ ｐｒｉｍｅｒは予めＴ４ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ（宝酒造製）を用いてリン酸化した。ＰＣＲ反応は、ＫＯＤ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いて、Ｈ２Ｏで反応液量を２０μＬに調製して行った。ＰＣＲ条件は、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７４℃で１分を２５ｃｙｃｌｅ行った。このＰＣＲ産物をＳａｃＩで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動して、約１ＫｂｐのＤＮＡ断片を分離および回収した。新たなｐＴＶ１１８ＮベクターはｌａｃＺ遺伝子の開始コドンを含むＮｃｏＩで消化した。これを、Ｋｌｅｎｏｗ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を用いて平滑化させた。さらにアルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸化させた。このベクターにＰＣＲ産物を挿入した。この結果作製されたプラスミドをｐＴＶ＋ｌａｍＢ（ｐＴＶ１１８Ｎ＋ｌａｍＢ）とした。
【００７９】
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α株をｐＴＶ＋ｌａｍＢを用いて形質転換した。この大腸菌をＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α−ｐＴＶ＋ｌａｍＢとした。この組換え体を培養液中のヒ素吸着および除去回収実験のネガティブコントロールとして用いた。
【００８０】
３）ｌａｍＢ遺伝子とａｒｓＲ遺伝子を融合させた遺伝子を挿入した組換えベクターの作製
ｐＴＶ＋ｌａｍＢを保有する形質転換体よりプラスミドｐＴＶ−ｌａｍＢ ｐｒｅを調製した。ｐＴＶ＋ｌａｍＢをＢａｍＨＩで消化し、アルカリフォスファターゼ処理により脱リン酸化した（図８参照）。
【００８１】
図１０に示すように、このベクター（ｐＴＶ−ｌａｍＢ ｐｒｅ）に上記記載のＤＮＡ断片の両末端にＢａｍＨＩサイトを付加したａｒｓＲ遺伝子を含むＤＮＡ断片を挿入し、ｌａｍＢとａｒｓＲ遺伝子の融合遺伝子を作製した。この結果作製されたプラスミドをｐＴＶ＋ｌａｍＢ＋ａｒｓＲ−ｐｒｅとした。
【００８２】
ここで、ａｒｓＲは、２通りの方向で挿入されるため、ｌａｃプロモーターが働く方向に対して逆向きにａｒｓＲが挿入されたものを採用した。
【００８３】
そして、上述のｌａｍＢを挿入したときと同様の処理によって、ａｒｓＲを含むｌａｍＢ＋ａｒｓＲを作製した。なお、ｌａｍＢのＮ末端を、ライゲーション時にｌａｃＰプロモーターから効率よく転写されるように開始コドンのフレームがあうように、ＰＣＲによって５’末端を修飾した。
【００８４】
図１１に示すように、得られたｌａｍＢ＋ａｒｓＲを上述の場合と同様にして、ｐＴＶ１１８Ｎベクターに挿入して、ｐＴＶ＋ｌａｍＢ−ａｒｓＲを得た。
【００８５】
このプラスミドベクターｐＴＶ＋ｌａｍＢ−ａｒｓＲ中の、ＬａｍＢタンパク質とＡｒｓＲタンパク質との融合タンパク質をコードする領域の塩基配列を配列表の配列番号１、とそれがコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。
【００８６】
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α株をｐＴＶ＋ｌａｍＢ−ａｒｓＲを用いて形質転換した。この大腸菌をＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α−ｐＴＶ＋ｌａｍＢ−ａｒｓＲとした。この組換え体を用いて培養液中のヒ素吸着および除去回収実験を行った。
【００８７】
４）ヒ素以外の重金属が結合可能な６残基のヒスチジン（ヒスタグ）をコードするＤＮＡを付加したａｒｓＲとｌａｍＢ遺伝子を融合させた遺伝子を挿入した組換えベクターの作製
ヒ素吸着に加えてさらに他の重金属結合能をすることを目的にして、カドミウムや水銀などの結合能力が知られている６残基のヒスチジンをコードするＤＮＡをａｒｓＲの５’末端に付加するプラスミドの構築を２段回のＰＣＲによって行った。１段回目はヒスタグを付加するＰＣＲであり、２段回目はＢａｍＨＩを付加するＰＣＲであり、次のように行った。
【００８８】
始めのヒスタグを付加する１段目のＰＣＲは２回の連続ＰＣＲによって行った。鋳型ＤＮＡは約１ｎｇのｐＴＶ＋ｌａｍＢ−ａｒｓＲを用いた（図１１参照）。
【００８９】
図１２に示すように、１段目の１回目のＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒはａｒｓ Ｈｔｎｔ−１ ｐｒｉｍｅｒ（配列：５’ −ＣＣＡＴＣＡＣＡＴＧＴＣＡＴＴＴＣＴＧＴＴＡＣＣＣＡＴＣＣＡＡＴ−３’：配列番号２２）とＭ１３Ｆｐｒｉｍｅｒ を用いた。ＰＣＲ反応は、ＫＯＤ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いて、Ｈ２Ｏで反応液量を２０μＬに調製して行った。ＰＣＲ条件は、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７４℃で１分を２５ｃｙｃｌｅ行った。２回目のＰＣＲはａｒｓ Ｈｔｎｔ−２ｐｒｉｍｅｒ（配列：５’ −ＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＧＴＣＡＴＴＴＣＴＧＴ−３’：配列番号２３）とＭ１３Ｆ ｐｒｉｍｅｒを用いて同様に行った。このＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動して回収した。この増幅産物は次のＢａｍＨＩを付加する２段目の連続ＰＣＲの鋳型にした。
【００９０】
２段目の１回目のＰＣＲは、Ｈｔｎｔ Ｂａｍ１ ｐｒｉｍｅｒ（配列：５’−ＣＣＣＧＣＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＧ−３’：配列番号２４）とＭ１３Ｆ ｐｒｉｍｅｒを用いて行った。このＤＮＡ断片を鋳型にして、２回目のＰＣＲはＨｔｎｔ Ｂａｍ２ ｐｒｉｍｅｒ（配列：５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＣＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴ−３’：配列番号２５）とＭ１３Ｆ ｐｒｉｍｅｒ を用いて同様に行った。ＰＣＲ産物をＢａｍＨ１で消化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動してで約３５０ ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
【００９１】
次に、図１３に示すように、得られたＨｉｓ−ｔａｇ＋ａｒｓＲのＤＮＡ断片をｐＴＶ１１８Ｎ（適宜ｐＴＶと称する）＋ｌａｍｂ ｐｒｅベクターをＢａｍＨＩで消化し、アルカリフォスファターゼ処理により脱リン酸化したベクターに挿入した。この結果作製されたプラスミドをｐＴＶ１１８Ｎ＋ｌａｍＢ＋ＨｉｓａｒｓＲ−ｐｒｅとした。ここで、Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ ａｒｓＲは２通りの方向で挿入される。ｌａｃプロモーターが働く方向に対して逆向きにＨｉｓ−ｔａｇｕｇｅｄ ａｒｓＲが挿入されたものを使用した。
【００９２】
次に、ｌａｍＢのＮ末端をライゲーション時にｌａｃＰプロモーターから効率よく転写されるように開始コドンのフレームが合うようにＰＣＲによって、５’末端を修飾した。そして、上述の場合と同様の手法で、ｌａｍＢをコードするタンパク質の１５３番目と１５４番目のアミノ酸残基の位置にＨｉｓ−ｔａｇｇｅｄａｒｓＲを挿入し、Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ ａｒｓＲを得た。
【００９３】
また、図１４に示すように、新たなｐＴＶ１１８ＮベクターはｌａｃＺ遺伝子の開始コドンを含むＮｃｏＩで消化した。これを、Ｋｌｅｎｏｗ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を用いて平滑化させた。さらにアルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸化させた。
【００９４】
このようにして得られたベクターに、上述のＰＣＲ産物（ｌａｍＢ＋Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ ａｒｓＲ）を挿入した。この結果作製されたプラスミドをｐＴＶ＋ｌａｍＢ−Ｈｉｓ ａｒｓＲとした。
【００９５】
このプラスミドベクターｐＴＶ＋ｌａｍＢ−Ｈｉｓ ａｒｓＲ中の、ＬａｍＢタンパク質とヒスチジンペプチドおよびＡｒｓＲタンパク質との融合タンパク質をコードする領域の塩基配列を配列表の配列番号３、それがコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号４に示す。
【００９６】
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α株をｐＴＶ＋ｌａｍｂ−Ｈｉｓ ａｒｓＲを用いて形質転換した。この大腸菌をＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α＋ｐＴＶ＋ｌａｍＢ−ＨｉｓＲとした。この組換え体を用いて培養液中のヒ素吸着および除去回収実験を行った。
【００９７】
５）マルトース結合タンパク質（ＭａｌＥ）と６残基のヒスチジン（ヒスタグ）ヒスタグを付加したＡｒｓＲタンパク質の融合タンパク質を大腸菌で生産および精製するための組換えベクターの構築
始めに、図１５に示すように、前記と同様の２回のＰＣＲによってａｒｓＲにヒスタグを付加した。鋳型ＤＮＡは約１ｎｇの前記のｐＫＳ＋ａｒｓＲを用いた。１回目のＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒはａｒｓ Ｈｔｎｔ−１ ｐｒｉｍｅｒ（配列：５’ −ＣＣＡＴＣＡＣＡＴＧＴＣＡＴＴＴＣＴＧＴＴＡＣＣＣＡＴＣＣＡＡＴ−３’：配列番号２２）とＭ１３Ｆｐｒｉｍｅｒ を用いた。ＰＣＲ反応はＫＯＤ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いて、Ｈ２Ｏで反応液量を２０μＬに調製して行った。ＰＣＲ条件は、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７４℃で１分を２５ｃｙｃｌｅ行った。２回目のＰＣＲはＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（宝酒造製）を用いてリン酸化したａｒｓ Ｈｔｎｔ−２ ｐｒｉｍｅｒ（配列：５’−ＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＧＴＣＡＴＴＴＣＴＧＴ−３’：配列番号２３）とＭ１３Ｆ ｐｒｉｍｅｒ を用いて同様に行った。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動してＤＮＡ断片を分離回収した。
【００９８】
このＤＮＡ断片を、ｐＭａｌ−ｃ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ ｌａｂｓ製）をＸｍｎＩとＥｃｏＲＩで消化したうえでアルカリフォスファターゼ処理したベクターに挿入した。図１６に示すように、この結果作製されたプラスミドをｐＭａｌ＋Ｈｉｓ ａｒｓＲとした。
【００９９】
このプラスミドベクターｐＭａｌ＋Ｈｉｓ ａｒｓＲ中の、ＭａｌＥタンパク質とヒスチジンペプチドおよびＡｒｓＲタンパク質との融合タンパク質をコードする領域の塩基配列を配列表の配列番号５、それがコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号６に示す。
【０１００】
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α株をｐＭａｌ＋Ｈｉｓ−ａｒｓＲを用いて形質転換した。この大腸菌をＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α＋ｐＭａｌ＋Ｈｉｓ ａｒｓＲとした。このＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α＋ｐＭａｌ＋Ｈｉｓ ａｒｓＲを用いることによって、ヒスチジンを付加したＡｒｓＲタンパク質はマルトース結合タンパク質と融合したキメラタンパク質として発現され、既製のアミロースを充填したアフィニティーカラムに固定化することが容易にできる。
【０１０１】
また、プロテアーゼＦａｃｔｏｒ Ｘａを用いてマルトース結合タンパク質と分離することが可能で、分離されたヒスタグを付加したＡｒｓＲタンパク質は既製のニッケルを充填したアフィニティーカラムに固定化することが容易にできる。
【０１０２】
６）マルトース結合タンパク質（ＭａｌＥ）とヒスタグを付加したＡｒｓＲタンパク質の融合タンパク質の精製
上述のようにして、大腸菌により発現されたキメラタンパク質（マルトース結合タンパク質（ＭａｌＥ）とヒスタグを付加したＡｒｓＲタンパク質の融合タンパク質）は、次のようにして精製された。
ａ）−８５℃でグリセロール溶液に保存した各々の形質転換体は１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（Ａｍｐ）入りの１ｘＬＢ寒天培地に画線し、３７ ℃で一晩静置培養した。
ｂ）出現した単一のコロニーは２０ｍＬのＡｍｐ入りの１ｘＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で一晩振とう培養した。
ｃ）翌日１０ｍＬの培養液をＡｍｐ入りの１Ｌのグルコースリッチ１ｘＬＢ培地（１０ｇ ｔｒｙｐｔｏｎ，５ｇ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ，５ｇ ＮａＣｌ， ２ｇ ｇｌｕｃｏｓｅ／ｌ）に植え継ぎ３０℃でＯＤ６００ｎｍが０．５になるまで１１０ｒｐｍで振とう培養した。
ｄ）終濃度が０．３ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに２時間培養した。培養液を５００ｍＬ容のチューブに移し、４℃、５，０００ｒｐｍ、５分遠心して集菌した。培地を捨て、菌体は５０ｍＬ容のチューブに移し，次の操作まで−８５℃で保存した。
ｅ）菌体は１ｍＬのｃｏｌｕｍｎ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，２００ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭ β−メルカプトエタノール）に懸濁した。その後、菌体は超音波破砕機で細胞を破壊した。
ｆ）その細胞破壊液は１．５ｍＬ容のマイクロチューブに移し、４℃、１５，０００ｒｐｍ、２０分遠心した。上清（ｃｒｕｄｅ ｅｘｔｒａｃｔ）は新しいマイクロチューブに移した。
ｇ）２．５ｘ１０ｃｍのｃｏｌｕｍｎにアミロースレジンを注いだ。ｃｏｌｕｍｎを４００ｍＬのｃｏｌｕｍｎ ｂｕｆｆｅｒで洗った。ｃｒｕｄｅ ｅｘｔｒａｃｔ（２．５ μｇ ／μＬ）を約１ｍＬ／ｍｉｎの流速でロードした。
ｈ）６００ｍＬのｃｏｌｕｍｎ ｂｕｆｆｅｒで洗った。
ｉ）６０ｍＬの１０ｍＭのマルトース入りのｃｏｌｕｍｎ ｂｕｆｆｅｒでｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎを溶出させた。３ｍＬずつフラクションを回収し、タンパクを含むフラクションをプールした。
ｊ）融合タンパク質はプロテインアッセイキットＩ（ＢＩＯ−ＲＡＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を用いて定量し、後述のｆａｃｔｏｒ Ｘａの消化に用いた。
【０１０３】
７）ヒスタグを付加したＡｒｓＲタンパク質の融合タンパク質の精製
ａ）１ｍｇ／ｍＬのタンパク質溶液１ｍＬは１．５ ｍＬ容のマイクロチューブに移し、４μｇのＦａｃｔｏｒ Ｘａ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ製）を加え１６℃で一晩インキュベートして、消化した。
ｂ）消化した１０ ｍｇのタンパク質はＣｅｎｔｒｉｐｌｕｓ １０（Ａｍｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．製）を用いてＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ｐＨ８．０，３００ｍＭ ＮａＣｌ，１０ ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）に交換した。
ｃ）５ｍＬのＮｉ−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒ ｆｌｏｗ レジン（ＱＩＡＧＥＮ製）を１ｘ１０ｃｍのｃｏｌｕｍｎに注いだ。ｃｏｌｕｍｎを４０ｍＬのＬｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒで平衡化させた。
ｄ）上記でｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒに交換したタンパク質を０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速でｃｏｌｕｍｎにロードした。
ｅ）ｃｏｌｕｍｎを４０ｍＬのＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒで洗浄した。ｃｏｌｕｍｎを４０ ｍＬのＷａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ （５０ ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４，ｐＨ８．０，３００ｍＭ ＮａＣｌ，２０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）で洗浄した。
ｇ）ｃｏｌｕｍｎを４０ｍＬのｐｃｏｌｕｍｎ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ ８．０，２００ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭ β−メルカプトエタノール）に交換し、ヒ素を含む試料を添加するまで４℃に静置した。
【０１０４】
８）Ｈｉｓ ｔａｇｇｅｄ ＡｒｓＲタンパク質を固定化したカラムを用いたヒ素除去
Ｈｉｓ ｔａｇｇｅｄ ＡｒｓＲタンパク質を固定化したカラムを用いたヒ素除去は次の手順で行った。
ａ）ヒ素を含む４０ｍＬの試料を０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速でｃｏｌｕｍｎにロードした。
ｂ）カラムから流出して来た試料のヒ素濃度をジエチルジチオカルバミン酸銀を用いた吸光光度法によって測定した。
【０１０５】
９）作製した組換え体を用いた培養液中のヒ素吸着および除去回収実験
作製した組換え体を用いた培養液中のヒ素吸着および除去回収実験は次の手順で行った。
ａ）−８５℃で３０％グリセロール溶液に保存しておいた、大腸菌ＤＨ５αをｐＴＶ＋ｌａｍＢ−ａｒｓＲ，ｐＴＶｌａｍＢ−Ｈｉｓ ａｒｓＲ，ｐＴＶ＋ｌａｍＢでそれぞれ形質転換した組換え体をアンピシリンを添加した１×ＬＢ寒天培地に画線し、３７℃で一晩静置培養した。
ｂ）翌日、シングルコロニーを白金耳でかき取り、予め５０ｍＬ容の３角フラスコに加えておいたアンピシリンを添加した１０ｍＬの１×ＬＢ培地に植菌し、３７℃で一晩振とう培養した。
ｃ）一晩培養液５００μＬを２００ｍＬ容の３角フラスコに加えた同様の１×ＬＢ培地５０ｍＬに植え継ぎ、３０℃で一晩振とう培養した。
ｄ）翌日、培養液にヒ素終濃度が０．３μｇ／ｍＬまたは０．５μｇ／ｍＬになるように調製したヒ素溶液を５００μＬ加え、全量で１０ｍＬに調製し、ボルテックスミックスチャーを用いて混合した。
ｅ）容器に蓋をした後、パラフィルムを巻き、４℃で２週間程度静置し大腸菌を自然沈下させた。
ｆ）ピペットで沈殿した菌を吸わないように注意しながら上清を８ｍＬ吸引し、３００ｍＬ容のビーカーに移した。この培養液上清に残留したヒ素の濃度を、ジエチルカルバミン酸銀を用いた方法によって測定した。
【０１０６】
「ヒ素濃度の測定」
ヒ素濃度の測定は、次のようにして行った。
【０１０７】
ジエチルジチオカルバミン酸銀を用いた吸光光度法によるヒ素濃度測定法は、ヒ素を水素化ヒ素とし、これをジエチルジチオカルバミン酸銀のピリジン溶液中に吸収させて生じる過溶性錯化合物（ＡｓＨ３＋６Ａｇ（ＤＤＣ）→６Ａｇ＋８ＨＤＤＣ＋Ａｓ（ＤＤＣ）３）が、ジエチルジチオカルバミン酸銀ピリジン溶液を還元し元素状の銀を遊離し、このコロイド状の銀が橙色〜赤紫色を呈する。この色度を５３５ ｎｍの波長の吸光度を分光光度計で測定する方法である。本方法により、各種の濃度のヒ素試料で検量線を描き、検量線から検体の濃度を求めることができる。以下の実験手順は上水試験法（１９９３年日本水道協会）に従った。
ａ）ヒ素を添加した培養液８ｍＬを３００ｍＬ容の三角フラスコに移し、これに蒸留水１７７ｍＬおよび１２Ｎ ＨＣｌを５ｍＬを加える。これを９０℃に加熱し、約３０ｍＬまで濃縮する。
ｂ） 試料を室温まで冷却し、既製の水酸化ヒ素発生ガラス器具にいれ、ビーカーの中を約１０ｍＬの蒸留水で良く洗い、あわせて約４０ｍＬとする。
ｃ）蒸留水で調製した１５％ヨウ化カリウム溶液（ｗ／ｖ）を５ｍＬを加えて混合し、２〜３分静置する。
ｄ）１２Ｎ ＨＣｌで調製した４０％塩化第一スズ溶液（ｗ／ｖ）を１ｍＬを加えて混和し、１５分静置する。
ｅ）３ｇの砂状亜鉛を加え、直ちに水素化ヒ素発生ガラス器具と、予めピリジンで調製した０．５％ジエチルジオカルバミン酸銀溶液（ｗ／ｖ）を５ｍＬを加えておいた、吸収管を導管で連結させる。導管の水酸化ヒ素の入り口付近には酢酸鉛溶液で湿らせたガラスウールを詰めておく。
ｆ）常温で１時間、水素化ヒ素ガスをジエチルジオカルバミン酸銀溶液に通気させる。
ｇ）試料を１ｍＬ取りガラス製キュベットに移し、分光光度計を用いて、ＯＤ５３５ｎｍの吸光度を測定する。
ｈ）同時にヒ素標準液から描いた、検量線を用いて試料のヒ素濃度を求める。
【０１０８】
「ヒ素吸着除去実験結果例」
ｐＴＶ＋ｌａｍＢ，ｐＴＶ＋ｌａｍＢ−ａｒｓＲ，ｐＴＶ＋ｌａｍＢ−ＨｉｓａｒｓＲを保有するすべての大腸菌でヒ素除去が確認された。ヒ素を終濃度０．３μｇ／ｍＬ添加した場合のヒ素除去率はｐＴＶ＋ｌａｍＢ−ａｒｓＲを保有する大腸菌が約１０％の除去率であり、ｐＴＶ＋ｌａｍＢ−ａｒｓＲは約２１％の除去率，ｐＴＶ＋ｌａｍＢ−Ｈｉｓ ａｒｓＲが約１７％の除去率を示した。この結果、ｌａｍＢにａｒｓＲを連結することによるヒ素除去は２倍の除去効果があることが示された。ヒスタグを付加したものが、ヒスタグを付加しないものより除去率が４％低い理由は、ヒシタグがＡｒｓＲタンパク質の立体構造に悪影響を与えて、ヒ素吸着を阻害したことが考えられる（図１７参照）。
【０１０９】
以上の実験結果よりａｒｓオペロンのリプレッサータンパク質を細胞の表層に提示することによって、ヒ素を吸着する能力を向上させた大腸菌の作製に成功し、この大腸菌を用いてヒ素の吸着および除去が可能であることが理解される。
【０１１０】
なお、培養にヒ素を吸着して沈澱した大腸菌を遠心して集菌し、この菌体をＥＤＴＡ溶液などキレート剤による洗浄と遠心分離を行うことによってヒ素を回収することができると考えられる。このような重金属を吸着した菌体から重金属を遊離させて回収する方法はすでに知られている（非特許文献４）ため、その説明は省略する。
【０１１１】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、水中や土壌中に含まれるヒ素などの化学物質を効率的に処理することができる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施形態に係るベクターの一例であるｐＴＶ＋ｌａｍＢ−ａｒｓＲの遺伝子地図を示す図である。
【図２】組換えベクターの実施例であるｐＴＶ＋ｌａｍＢおよびｐＴＶ＋ｌａｍＢ−ａｒｓＲおよびｐＴＶ＋ｌａｍＢ−Ｈｉｓ ａｒｓＲおよびｐＭａｌ＋Ｈｉｓ ａｒｓＲの作製工程の一部を示す図である。
【図３】組換えベクターの実施例であるｐＴＶ＋ｌａｍＢおよびｐＴＶ＋ｌａｍＢ−ａｒｓＲおよびｐＴＶ＋ｌａｍＢ−Ｈｉｓ ａｒｓＲおよびｐＭａｌ＋Ｈｉｓ ａｒｓＲの作製工程の一部であって、図２に示す工程の続きを示す図である。
【図４】本発明の組換えベクターの実施例であるｐＴＶ＋ｌａｍＢおよびｐＴＶ＋ｌａｍＢ−ａｒｓＲおよびｐＴＶ＋ｌａｍＢ−Ｈｉｓ ａｒｓＲおよびｐＭａｌ＋Ｈｉｓ ａｒｓＲの作製工程の一部であって、図３に示す工程の続きを示す図である。
【図５】本発明の組換えベクターの実施例であるｐＴＶ＋ｌａｍＢおよびｐＴＶ＋ｌａｍＢ−ａｒｓＲおよびｐＴＶ＋ｌａｍＢ−Ｈｉｓ ａｒｓＲおよびｐＭａｌ＋Ｈｉｓ ａｒｓＲの作製工程の一部であって、図４に示す工程の続きを示す図である。
【図６】本発明の組換えベクターの実施例であるｐＴＶ＋ｌａｍＢおよびｐＴＶ＋ｌａｍＢ−ａｒｓＲおよびｐＴＶ＋ｌａｍＢ−Ｈｉｓ ａｒｓＲおよびｐＭａｌ＋Ｈｉｓ ａｒｓＲの作製工程の一部であって、図５に示す工程の続きを示す図である。
【図７】本発明の組換えベクターの実施例であるｐＴＶ＋ｌａｍＢおよびｐＴＶ＋ｌａｍＢ−ａｒｓＲおよびｐＴＶ＋ｌａｍＢ−Ｈｉｓ ａｒｓＲおよびｐＭａｌ＋Ｈｉｓ ａｒｓＲの作製工程の一部であって、図６に示す工程の続きを示す図である。
【図８】本発明の組換えベクターの実施例であるｐＴＶ＋ｌａｍＢおよびｐＴＶ＋ｌａｍＢ−ａｒｓＲおよびｐＴＶ＋ｌａｍＢ−Ｈｉｓ ａｒｓＲおよびｐＭａｌ＋Ｈｉｓ ａｒｓＲの作製工程の一部であって、図７に示す工程の続きを示す図である。
【図９】本発明の組換えベクターの実施例であるｐＴＶ＋ｌａｍＢおよびｐＴＶ＋ｌａｍＢ−ａｒｓＲおよびｐＴＶ＋ｌａｍＢ−Ｈｉｓ ａｒｓＲおよびｐＭａｌ＋Ｈｉｓ ａｒｓＲの作製工程の一部であって、図８に示す工程の続きを示す図である。
【図１０】本発明の組換えベクターの実施例であるｐＴＶ＋ｌａｍＢおよびｐＴＶ＋ｌａｍＢ−ａｒｓＲおよびｐＴＶ＋ｌａｍＢ−Ｈｉｓ ａｒｓＲおよびｐＭａｌ＋Ｈｉｓ ａｒｓＲの作製工程の一部であって、図９に示す工程の続きを示す図である。
【図１１】本発明の組換えベクターの実施例であるｐＴＶ＋ｌａｍＢおよびｐＴＶ＋ｌａｍＢ−ａｒｓＲおよびｐＴＶ＋ｌａｍＢ−Ｈｉｓ ａｒｓＲおよびｐＭａｌ＋Ｈｉｓ ａｒｓＲの作製工程の一部であって、図１０に示す工程の続きを示す図である。
【図１２】本発明の組換えベクターの実施例であるｐＴＶ＋ｌａｍＢおよびｐＴＶ＋ｌａｍＢ−ａｒｓＲおよびｐＴＶ＋ｌａｍＢ−Ｈｉｓ ａｒｓＲおよびｐＭａｌ＋Ｈｉｓ ａｒｓＲの作製工程の一部であって、図１１に示す工程の続きを示す図である。
【図１３】本発明の組換えベクターの実施例であるｐＴＶ＋ｌａｍＢおよびｐＴＶ＋ｌａｍＢ−ａｒｓＲおよびｐＴＶ＋ｌａｍＢ−Ｈｉｓ ａｒｓＲおよびｐＭａｌ＋Ｈｉｓ ａｒｓＲの作製工程の一部であって、図１２に示す工程の続きを示す図である。
【図１４】本発明の組換えベクターの実施例であるｐＴＶ＋ｌａｍＢおよびｐＴＶ＋ｌａｍＢ−ａｒｓＲおよびｐＴＶ＋ｌａｍＢ−Ｈｉｓ ａｒｓＲおよびｐＭａｌ＋Ｈｉｓ ａｒｓＲの作製工程の一部であって、図１３に示す工程の続きを示す図である。
【図１５】本発明の組換えベクターの実施例であるｐＴＶ＋ｌａｍＢおよびｐＴＶ＋ｌａｍＢ−ａｒｓＲおよびｐＴＶ＋ｌａｍＢ−Ｈｉｓ ａｒｓＲおよびｐＭａｌ＋Ｈｉｓ ａｒｓＲの作製工程の一部であって、図１４に示す工程の続きを示す図である。
【図１６】本発明の組換えベクターの実施例であるｐＴＶ＋ｌａｍＢおよびｐＴＶ＋ｌａｍＢ−ａｒｓＲおよびｐＴＶ＋ｌａｍＢ−Ｈｉｓ ａｒｓＲおよびｐＭａｌ＋Ｈｉｓ ａｒｓＲの作製工程の一部であって、図１５に示す工程の続きを示す図である。
【図１７】本発明の組換えベクターｐＴＶ＋ｌａｍＢおよびｐＴＶ＋ｌａｍＢ−ａｒｓＲおよびｐＴＶ＋ｌａｍＢ−Ｈｉｓｔａｇｇｄ ａｒｓＲを用いて形質転換した本発明の大腸菌を用いてヒ素の吸着および除去を行った結果を示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for removing a chemical substance, a novel DNA therefor, a recombinant vector containing the same, a microorganism containing the same, a protein produced by the microorganism, and a method for adsorbing and collecting and removing a chemical substance using the microorganism and the protein. .
[0002]
[Prior art]
At present, groundwater pollution by arsenic has become a problem in various parts of the world. For example, arsenic has caused water pollution problems in West Bengal, India, Taiwan, Inner Mongolia, China, Hungary, Anton Fagasta in Chile, and Lagunella in Mexico. In particular, in the Ganges River basin, which stretches from West Bengal in India to Bangladesh, international organizations such as UNESC convert drinking water to groundwater to prevent the spread of infectious diseases caused by surface water as domestic or drinking water. It is said that 95% of the population now lives on arsenic-contaminated groundwater because of their recommendation to dig a well.
[0003]
Here, the method of removing arsenic in water in Japan is well-established, and there are known methods such as a flocculation method using a flocculant and a adsorption method using activated alumina, manganese dioxide, or a cerium-supported adsorbent. Can be.
[0004]
The following
[0005]
[Non-patent document 1]
See Carlin A, et al. The Thes of Opera of Escherichia coli confers arsenical and antimonial resistance, J Bacteriol (1995), Vol. 177, p. 981-98
[Non-patent document 2]
Bourain J. C. , Et al. : Mutagenesis by random linker insertion into the lamB gene of Escherichia coli K12, Mol Gen Genet (1986) Vol. 205, pp. 339-348
[Non-Patent Document 3]
Sousa C.I. , Et al. : Metalloadsolution by Escherichia coli cells displaying Yeast and Mammalian metallothionins anchored to the outer membrane Protein. 2280-2284
[Non-patent document 4]
Kuroda K, et al. : Cell surface-engineered year with availability to bind, and self-aggregate in responses to copper ion, Appl Microbiol Biotechnol, 2002. 59 pp. 259-64.
[Non-Patent Document 5]
Tauriainen S, et al. : Recombinant luminous bacteria for measuring bioavailable arsenite and antimonite, Appl Environ Microbiol (1997), Vol. 63 pp. 4456-61
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
However, the method used in Japan is an expensive method requiring large-scale processing equipment and plants. On the other hand, in Bangladesh where arsenic contamination is serious, it is difficult to apply the same method as in Japan due to economic and technical problems. Therefore, there is a demand for an arsenic removal technique that is cheaper and simpler to carry out.
[0007]
The present invention provides a method capable of effectively removing a chemical substance such as arsenic, a novel DNA therefor, a recombinant vector containing the same, a microorganism containing the same, a protein produced by the microorganism, and a method using the microorganism or the protein. And provide a method for the adsorption and removal of chemicals.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The inventors of the present invention have conducted intensive studies and speculated that the fact that the regulatory gene of the microbial operon binds to the operon inducer with high affinity may be applied to the adsorption and recovery of chemical substances. Tried.
[0009]
The present invention relates to a microbial cell capable of expressing a fusion protein (chimeric protein) of a repressor protein encoded by a regulatory gene of a microbial operon and a membrane protein on a cell surface of the microbe.
[0010]
It is preferable that the repressor protein binds to a specific chemical substance.
[0011]
Preferably, the repressor protein is an ArsR protein.
[0012]
Further, it is preferable that the microorganism is Escherichia coli carrying a lamB-arsR expression vector or a lamB-His arsR expression vector.
[0013]
The present invention also relates to a method for adsorbing and removing a specific chemical substance by using the above-mentioned microorganism cells.
[0014]
The present invention also relates to a method for adsorbing and removing a specific chemical substance using a repressor protein encoded by a regulatory gene of a microorganism operon.
[0015]
It is preferable that the repressor protein is used by being immobilized on a carrier.
[0016]
Further, it is preferable that the carrier is a membrane or a column.
[0017]
Further, it is preferable that the repressor protein is obtained by purifying from a transformed microorganism expressing the repressor protein.
[0018]
Further, the microorganism is preferably Escherichia coli capable of expressing a fusion protein in which a maltose binding protein and a histidine tag are added to an ArsR protein.
[0019]
Further, the specific chemical substance to be adsorbed and removed is preferably an operon inducer.
[0020]
The present invention relates to a DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
[0021]
Further, the DNA preferably has a base sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
[0022]
The present invention relates to a first DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and a DNA sequence linked to the same codon frame in the DNA sequence so as to form a fusion protein with the protein encoded by the first DNA. And a second DNA encoding a protein or peptide capable of binding to a membrane or column carrier via affinity or chemical reaction.
[0023]
Further, it is preferable that the first DNA is an arsR gene which is a regulatory gene of a microorganism operon.
[0024]
Further, the second DNA is preferably a lamB gene encoding a membrane protein.
[0025]
The present invention relates to an arsenic-adsorbing microorganism, which is transformed by the above-described recombinant vector, and in which a protein encoded by the first DNA is expressed on a cell surface together with a membrane protein, thereby adsorbing arsenic.
[0026]
Preferably, the microorganism is Escherichia coli.
[0027]
The microorganism is preferably Escherichia coli carrying a lamB-arsR expression vector or a lamB-His arsR expression vector.
[0028]
Further, the present invention relates to a method for contacting the microorganism with the above-mentioned microorganism to adsorb and remove arsenic from a sample to be treated.
[0029]
Further, the second DNA is a gene that binds to a membrane or column carrier, and is preferably a malE gene that encodes a maltose binding protein that binds to an amylose carrier with high affinity.
[0030]
The present invention also relates to a microorganism which is transformed with the above-mentioned recombinant vector and produces a chimeric protein by expressing the first gene, the regulatory gene and the malE gene.
[0031]
Further, it is preferable that the microorganism is Escherichia coli.
[0032]
The microorganism is preferably Escherichia coli carrying pMal-HisarsR.
[0033]
In the second DNA, the peptide that binds to the column carrier is preferably a DNA encoding a histidine peptide having 6 residues.
[0034]
The present invention also relates to a microorganism which is transformed with the recombinant vector and produces a chimeric protein by expressing the regulatory gene as the first DNA and a gene encoding a histidine peptide.
[0035]
The microorganism is preferably Escherichia coli.
[0036]
The present invention also relates to a chimeric protein produced by the above microorganism.
[0037]
The present invention also relates to an agent for removing a specific chemical substance including a repressor protein encoded by a regulatory gene of a microorganism operon.
[0038]
Further, the specific chemical substance is preferably arsenic.
[0039]
Further, the repressor protein is preferably an arsR protein encoded by an arsR gene.
[0040]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings.
"Overview of the present embodiment"
The arsenic-resistant operon (ars operon) of Escherichia coli functions to take in pentavalent arsenic into cells, reduce it to trivalent arsenic, and discharge the reduced trivalent arsenic outside the cells. The ArsR protein encoded by the regulatory gene of the ars operon usually binds to the operator / promoter (o / p) site of the operon and suppresses the expression of the arsA, arsB, and arsC genes. When pentavalent arsenic enters the cell and comes into contact with the ArsR protein, the ArsR protein changes its structure, binds to pentavalent arsenic, dissociates from the (o / p) site and binds to pentavalent arsenic . As a result, it is thought that the genes arsA, arsB, and arsC are expressed and begin to work to reduce pentavalent arsenic to trivalent arsenic and to excrete them out of cells (Non-Patent Document 1).
[0041]
In the present embodiment, the DNA region encoding ArsR is used.
[0042]
Next, LamB is a trimeric maltose receptor that is present on the outermost side of the periplasmic layer divided into three layers. LamB has five transmembrane domains, and the transmembrane domain is in contact with the outside world. If a target gene is inserted into that region, it can be exposed to the outside world with both the N-terminus and the C-terminus anchored to the outer membrane. Two places between
[0043]
The mechanism by which LamB moves to the periplasm layer follows a signal sequence (signal peptide), which is a cluster of 7 to 15 hydrophobic amino acids at the N-terminal. When LamB moves to the periplasm layer having a signal peptide that moves to the periplasm layer, the signal peptide is cleaved by an enzyme called signal peptidase to become a mature protein (Non-patent Document 2).
[0044]
The present inventors have produced a chimeric protein obtained by fusing the ArsR protein of the ars operon that binds to arsenic between amino acids 153-154 in contact with the outside of LamB, and obtained Escherichia coli capable of displaying this on the cell surface of Escherichia coli. Produced.
[0045]
In addition, the present inventors have produced a chimeric protein in which a histidine peptide that binds to Cd, Cu, Hg, and Zn and an ArsR protein of the ars operon that binds to arsenic are interposed between amino acids 153-154 in contact with the outside of LamB. Then, Escherichia coli capable of displaying this on the cell surface of Escherichia coli was prepared.
[0046]
Here, the ArsR protein may be a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; however, a protein having deletion, addition, insertion, or substitution in the amino acid sequence as long as the ability to bind to arsenic is retained included. As a DNA encoding the ArsR protein, SEQ ID NO: 2 can be mentioned, and a DNA encoding a protein capable of retaining the binding ability to arsenic has a high homology with the base sequence of SEQ ID NO: 2. Can also be included. Further, the fusion gene used for displaying the ArsR protein on the cell surface is not limited to the lamB gene. Genes encoding other membrane proteins can be employed as long as they do not interfere with the arsenic binding ability of the ArsR protein. Furthermore, when this lamB gene is used, the region into which the arsR gene is inserted is not limited to the region encoding amino acids 153-154, and the LamB protein contacts amino acid domains 253-254, which are not in contact with the external domain and do not affect the overall structure. It may be a coded region.
[0047]
The arsR gene and lamB gene can be cloned from the genome of Escherichia coli or other microorganisms by PCR or hybridization technology, or may be artificially synthesized using a DNA synthesizer or the like. The cloning operation is described in the following example. The construction of a fusion gene of arsR and lamB can be performed, for example, by adding a restriction enzyme site by PCR and using a DNA ligation enzyme.
[0048]
This recombinant vector has an autonomous replication origin like a normal cloning vector. In addition, it is preferable to have a selection marker such as drug resistance for selection. Such cloning vectors are well known in the art, and many are commercially available. The recombinant vector of the present invention can be prepared by incorporating a fusion gene into lamB and arsR described above into such a commercially available recombinant vector.
[0049]
The vector thus prepared has, for example, a genetic map as shown in FIG. This vector is formed by inserting a lamB DNA fragment into which arsR has been inserted into a pTV118N vector.
[0050]
Then, by transforming a microorganism with the present recombinant vector, a microorganism capable of adsorbing, removing, and recovering arsenic can be obtained. Examples of the microorganism include Escherichia coli, and any microorganism for which a host-vector system capable of expressing the arsR gene has been established can be used as a host. For example, in the case of host Escherichia coli, a gene obtained by fusing lamB and arsR is inserted downstream of a promoter that is operable in Escherichia coli such as a lac promoter in a cloning vector for Escherichia coli, and Escherichia coli may be transformed with the obtained recombinant vector. . Such a transformation operation itself is well known in this field, and a description thereof will be omitted.
[0051]
Here, Escherichia coli (E. coli (referred to as E. col as appropriate)) FERM P-19228 (accession number) (E. coli DH5α + pTV + lamB-arsR) is exemplified as Escherichia coli transformed by the above-mentioned vector. be able to.
[0052]
The microorganism (eg, Escherichia coli) thus obtained can adsorb arsenic to the cell surface. The amount of arsenic adsorbed in the culture solution sediments quickly because the adsorbed microorganisms become heavier. For this reason, the value obtained by measuring the supernatant of the culture solution by an existing method using an atomic absorption spectrophotometer or silver carbamate (arsenic concentration) is subtracted from the amount of arsenic added beforehand (arsenic concentration) to obtain arsenic. Can be obtained.
[0053]
The recombinant vector of the present invention reacts with trivalent arsenic, pentavalent arsenic, and stibnite based on the results of expression experiments (Non-Patent Document 5) of a gene in which the arsR of the ars operon and the promoter operator region of the operon are linked to a reporter gene. Conceivable. Therefore, the recombinant vectors of the present invention can be used for adsorption removal and recovery of stibnite.
[0054]
Also, a recombinant vector into which a gene obtained by fusing arsR and lamB gene to which DNA encoding histidine (hist tag) of 6 residues capable of binding heavy metals other than arsenic is added is suitable. In this case, if a step of adding a step of inserting a his tag is added, it can be produced in the same manner as in the above-described case.
[0055]
Escherichia coli (E. coli) FERM P-19227 (accession number) (referred to as E. coli DH5α + pTV + lamB-HisarsR) can be exemplified as Escherichia coli transformed by the vector to which the his tag is added.
[0056]
Further, arsenic can be treated by holding the arsR protein on a column or a membrane carrier. In this case, a recombinant vector capable of expressing a fusion protein obtained by adding maltose binding protein (MalE) and 6-residue histidine (histtag) to the arsR protein was prepared, and Escherichia coli was transformed with this vector. The expressed chimeric protein may be purified and used. In this case, MalE has a high affinity with the membrane and the like, and it is easy to fix.
[0057]
Escherichia coli transformed with a recombinant vector for producing and purifying a fusion protein obtained by adding the ArsR protein maltose binding protein (MalE) and histidine (hist tag) having 6 residues to Escherichia coli was used. Coli) FERM P-19229 (accession number) (referred to as E. coli DH5α + pMal-HisarsR).
[0058]
Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples. Here, the following examples are exemplifications, and the present invention is not limited to these examples. In the following examples, unless otherwise specified, all individual operations are described in Maniatis, T .; et al, Molecular Cloning, a Laboratory manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor laboratory Press.
[0059]
"Recombinant vector"
1) PCR cloning of arsR and preparation of insert into which BamHI site was introduced
As shown in FIG. 2, ArsR was cloned by PCR from the genome of Escherichia coli DH5α strain. About 100 ng of genomic DNA was used. The PCR primers are ars5'primer (sequence: 5'-TCCGCTCTACTCATCCACTGCCTGTC-3 ': SEQ ID NO: 7) and ars3'primer (sequence 5') capable of amplifying the DNA region encoding the ars operon arsR, arsB, and arsC. -CACCCATGCTGGACGCGATAATTGG-3 ': SEQ ID NO: 8) was used.
[0060]
The PCR reaction was performed using LA-Taq DNA polymerase (Takara Shuzo). 2 The reaction volume was adjusted to 20 μL with O to perform the reaction. PCR was performed at 98 ° C. for 10 seconds and 68 ° C. for 15 minutes for 25 cycles. The PCR product was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment was separated, and a band of about 3 kbp was recovered. The recovered DNA was inserted (ligated) into pGEM-T Vector (promega). The prepared plasmid was designated as pGEM-T Vector + arsR + arsB + arsC.
[0061]
E. FIG. The E. coli DH5α strain was transformed using pGEM-T Vector + arsR + arsB + arsC. A plasmid was prepared from the transformant. As a result, two plasmids having different insert directions were obtained. The plasmid having the insert inserted in the direction opposite to that of the lac promoter of the pGEM-T vector was used in the experiment.
[0062]
As shown in FIG. 3, the arsR, arsB, and arsC gene fragments were digested with HincII, EcoRV, and BssHI in order to collect plasmid encoded by arsR. The fragment was subjected to agarose gel electrophoresis, and a gene fragment near 1.5 kbp encoding arsR was recovered.
[0063]
The collected band was digested with HincII of a pBluescript KS-vector (manufactured by Stratagene) and inserted (ligated) into a vector dephosphorylated by alkaline phosphatase treatment. This plasmid was designated as pKS + arsR.
[0064]
E. FIG. E. coli DH5α strain was transformed with pKS + arsR. A plasmid was prepared from the transformant. As a result, two plasmids having different insert directions were obtained, and those having the insert inserted in the direction in which the lac promoter of the vector acts were used in the experiment.
[0065]
As shown in FIG. 4, a marginal BamHI site was added to both 5 'and 3' ends of the arsR gene by the following two rounds of PCR in order to ligate the arsR gene with the lamB gene. About 1 ng of pKS + arsR was used as the template DNA. The first PCR primer for adding BamHI to the 5 'end is the arsNBam1 primer (sequence: 5'-CCCGCCATGTCATTTCTGTTTACCCATCCAAATTGTTC-3': SEQ ID NO: 9) and M13F primer (sequence: 5'-GTTCTCCA ) Was used. In addition, M13 primer is also called M4 primer (manufactured by Takara Shuzo). The PCR reaction was performed using KOD DNA polymerase (manufactured by TOYOBO) 2 The reaction volume was adjusted to 20 μL with O to perform the reaction. PCR was performed at 94 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 74 ° C. for 1 minute for 25 cycles.
[0066]
The amplification product was subjected to polyacrylamide gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 1 kbp containing arsR was recovered. Using the recovered fragment as a template, PCR was performed. The arsNBam2 primer (sequence: 5'-CGGGATCCCGCCCATGTCATTTCTGTTCACCCATCCAA-3 ': SEQ ID NO: 11) and M13F primer were used as the second PCR primer for adding BamHI to the 5' end. The PCR conditions were 25 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 74 ° C. for 1 minute. A BamHI site was introduced at the N-terminus of arsR by these two PCRs. This PCR product was cut with BamHI, and electrophoresed on an acrylamide gel to collect a band of about 1 kbp. The cut band was cut with BamHI, and inserted (ligated) into pUC119 vector (Takara Shuzo) dephosphorylated by alkaline phosphatase treatment. The resulting plasmid was designated as pUC119 + arsR (see FIG. 5).
[0067]
E. FIG. E. coli strain DH5α was transformed with pUC119 + arsR. A plasmid was prepared from the transformant. As a result, two plasmids having different insert directions were obtained, but one having the insert inserted in the direction opposite to the direction in which the lac promoter of the vector acts was used in the experiment.
[0068]
Next, as shown in FIG. 5, PCR for adding BamHI to the 3 ′ end of arsR was performed. As a template DNA, about 1 ng of pUC119 + arsR was used. The first primer for adding BamHI to the 3 ′ end used arsCBam1 primer (sequence: 5′-TCCCGACTGCAAATGTTCTTACTGTCCCCGGAACA-3 ′: SEQ ID NO: 12) and M13F primer. The PCR reaction was performed using KOD DNA polymerase (manufactured by TOYOBO) 2 The reaction volume was adjusted to 20 μL with O to perform the reaction. The PCR reaction conditions were 25 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 74 ° C. for 1 minute. Subsequently, using the PCR product as a template, PCR was carried out using arsCBam2 primer (sequence: 5′-TGGGATCCCGACTGCAAATGTTCTTACTGTTCCCCG-3 ′: SEQ ID NO: 13) and M13F primer. The PCR product was cut with BamHI and electrophoresed on a polyacrylamide gel to collect a band of about 350 bp.
Thus, an insert for fusion with the lamB gene was produced.
[0069]
2) Preparation of a recombinant vector having a BamHI site introduced into the lamB gene
As shown in FIG. 6, lamB was cloned by PCR from the genome of E. coli DH5α strain. About 100 ng of genomic DNA was used. As the PCR primers, lamB5'primer (sequence: 5'-TCGACTGCATAAGGAGCCGGGCGTTTT-3 ': SEQ ID NO: 14) and lamB3'primer (sequence: 5'-GGTGTCAGGCGCATAACGCCTTCCA-3': SEQ ID NO: 15) were used. The PCR reaction was carried out using EX Taq DNA polymerase (Takara Shuzo) 2 The reaction volume was adjusted to 20 μL with O to perform the reaction. The PCR conditions were 94 ° C. for 45 seconds, 60 ° C. for 45 seconds, and 74 ° C. for 2 minutes at 25 cycles. The PCR product was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment was separated, and a band of about 2.1 kbp was recovered. The recovered DNA was inserted (ligated) into pGEM-T Vector (promega). The plasmid thus prepared was designated as pGEM-T + LamB.
[0070]
E. FIG. coli DH5α strain was transformed using pGEM-T + LamB. A plasmid was prepared from the transformant. As a result, two plasmids having different insert directions were obtained, but one having the insert inserted in the direction opposite to the direction in which the lac promoter of the vector acts was used in the experiment.
[0071]
As shown in FIG. 7, the lamB gene was separated into two DNA fragments in order to insert the arsR gene in-frame with the lamB gene, and a BamHI site, which was a margin of each fragment, was added in the following procedure.
[0072]
As a template DNA, about 1 ng of pGEM-T + LamB was used. As the first PCR primer for adding BamHI to the first DNA fragment on the 5 ′ side, lamB-153N1 primer (sequence: 5′-TCCCGGGAAGAACCACCAGCTTCAGAGGAGGCG-3 ′: SEQ ID NO: 16) and M13F primer were used. The PCR reaction was performed using KOD DNA polymerase (manufactured by TOYOBO) 2 The reaction volume was adjusted to 20 μL with O to perform the reaction. PCR was performed at 94 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 74 ° C. for 1 minute for 25 cycles. Using the amplification product as a template, the second PCR was carried out in the same manner using lamB-153N2 primer (sequence: 5-TGGGATCCCGGGGAAGAACCACCAGCTTCAGAG-3 ': SEQ ID NO: 17) and M13F primer. This PCR product was digested with BamHI and SphI, and subjected to polyacrylamide gel electrophoresis to separate and collect a DNA fragment of about 450 bp. This DNA fragment was designated as A fragment (see FIG. 8).
[0073]
Next, a BamHI site was introduced into the second DNA fragment on the 3 ′ side by PCR twice. As a template DNA, about 1 ng of pGEM-T + LamB was used. As the first PCR primer, lamB-154C1 primer (5′-TCCCGCCTCTTTCGCCAGCAACAAATTATTATGA-3 ′: SEQ ID NO: 18) and RV primer (sequence: 5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3 ′: SEQ ID NO: 19) were used. The PCR reaction was performed using KODDNA polymerase (manufactured by TOYOBO) 2 The reaction volume was adjusted to 20 μL with O to perform the reaction. As the PCR conditions, 25 cycles were performed at 94 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 74 ° C. for 1 minute. Using the amplification product as a template, the second PCR was carried out in the same manner using lamB-154C2 primer (sequence: 5′-TGGGATCCCGCCTCTTTCGCCACACAAAATTATT-3 ′: SEQ ID NO: 20) and RV primer. This PCR product was digested with BamHI and SacI, and subjected to polyacrylamide gel electrophoresis to separate and collect a DNA fragment of about 1 Kbp. This DNA fragment was designated as B fragment (see FIG. 8).
[0074]
As shown in FIG. 8, two DNA fragments, the A fragment and the B fragment, into which the BamHI sites were introduced, were inserted into the SphI and SacI sites of the pTV118N vector (manufactured by Takara Shuzo) in such a manner that the two fragments were linked via the BamHI site. did. This plasmid thus prepared was called pTV118N + lamB pre (hereinafter, pTV-lamB pre).
pre).
[0075]
E. FIG. E. coli DH5α strain was transformed with pTV118N + lamB pre. A plasmid was prepared from the transformant.
[0076]
The obtained pTV-lamB pre is used as a raw material for preparing a lamB insert for preparing a negative control vector and a vector for inserting arsR in the following.
[0077]
Next, as shown in FIG. 9, in order to efficiently transcribe the lamB gene from the lac promoter, the lamB gene was further subjected to PCR so as to match the position of the start codon of the lacZ gene of the new pTV118N vector. Qualified.
[0078]
As a template DNA, about 1 ng of pTV118N + lamB pre was used. The PCR primers are lamB-N2 primer (sequence: 5'-ATGAATTACTCTGCGCAAACTTCCTCTGGCGGG-3 ': SEQ ID NO: 21) having a DNA sequence lacking the start codon of the lamB gene and RV-N primer (sequence: 5'-TGTGGATGTGTGC : SEQ ID NO: 26) was used. The lamB-N2 primer was phosphorylated in advance using T4 polynucleide kinase (manufactured by Takara Shuzo). The PCR reaction was performed using KOD DNA polymerase (manufactured by TOYOBO) 2 The reaction volume was adjusted to 20 μL with O to perform the reaction. The PCR was performed at 94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, and 74 ° C. for 1 minute for 25 cycles. This PCR product was digested with SacI and subjected to polyacrylamide gel electrophoresis to separate and collect a DNA fragment of about 1 Kbp. The new pTV118N vector was digested with Ncol containing the start codon of the lacZ gene. This was smoothed using Klenow DNA polymerase (Takara Shuzo). Furthermore, dephosphorylation was performed using alkaline phosphatase. The PCR product was inserted into this vector. The resulting plasmid was designated as pTV + lamB (pTV118N + lamB).
[0079]
E. FIG. E. coli DH5α strain was transformed with pTV + lamB. This E. coli was transformed into E. coli. coli DH5α-pTV + lamB. This recombinant was used as a negative control in experiments for adsorption and removal and recovery of arsenic in the culture solution.
[0080]
3) Preparation of a recombinant vector into which a gene obtained by fusing the lamB gene and the arsR gene is inserted
Plasmid pTV-lamB pre was prepared from a transformant having pTV + lamB. pTV + lamB was digested with BamHI and dephosphorylated by alkaline phosphatase treatment (see FIG. 8).
[0081]
As shown in FIG. 10, a DNA fragment containing an arsR gene in which BamHI sites were added to both ends of the above-described DNA fragment was inserted into this vector (pTV-lamB pre) to prepare a fusion gene of lamB and arsR gene. . The resulting plasmid was designated as pTV + lamB + arsR-pre.
[0082]
Here, since arsR is inserted in two directions, the one in which arsR is inserted in a direction opposite to the direction in which the lac promoter works is employed.
[0083]
Then, lamB + arsR containing arsR was produced by the same processing as when lamB was inserted. In addition, the N-terminus of lamB was modified at the 5 'end by PCR so that the initiation codon frame was aligned so that transcription was efficiently performed from the lacP promoter during ligation.
[0084]
As shown in FIG. 11, the obtained lamB + arsR was inserted into the pTV118N vector in the same manner as described above to obtain pTV + lamB-arsR.
[0085]
In the plasmid vector pTV + lamB-arsR, the nucleotide sequence of the region encoding the fusion protein of LamB protein and ArsR protein is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and the amino acid sequence encoded by it is shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
[0086]
E. FIG. E. coli DH5α strain was transformed with pTV + lamB-arsR. This E. coli was transformed into E. coli. coli DH5α-pTV + lamB-arsR. Using this recombinant, experiments on adsorption, removal and recovery of arsenic in the culture solution were performed.
[0087]
4) Preparation of a recombinant vector into which a gene obtained by fusing arsR and lamB genes to which DNA encoding histidine (hist tag) of 6 residues capable of binding heavy metals other than arsenic is added is inserted.
Plasmid that adds a DNA encoding histidine of 6 residues whose binding ability is known to be cadmium or mercury to the 5 'end of arsR for the purpose of binding other heavy metals in addition to arsenic adsorption Was constructed by two rounds of PCR. The first round is a PCR for adding a his tag, and the second round is a PCR for adding BamHI, and performed as follows.
[0088]
The first-stage PCR for adding the first his tag was performed by two consecutive PCRs. As a template DNA, about 1 ng of pTV + lamB-arsR was used (see FIG. 11).
[0089]
As shown in FIG. 12, the first-stage PCR primer of the first step used ars Htnt-1 primer (sequence: 5′-CCATCACATGTCATTTCTGTTACCCATCCAAT-3 ′: SEQ ID NO: 22) and M13Fprimer. The PCR reaction was performed using KOD DNA polymerase (manufactured by TOYOBO) 2 The reaction volume was adjusted to 20 μL with O to perform the reaction. As the PCR conditions, 25 cycles were performed at 94 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 74 ° C. for 1 minute. The second PCR was carried out in the same manner using ars Htnt-2 primer (sequence: 5′-CATCACCATCACCCATCACATGTCATTTCTGT-3 ′: SEQ ID NO: 23) and M13F primer. This PCR product was recovered by agarose gel electrophoresis. This amplification product was used as a template for the second-stage continuous PCR to which the next BamHI was added.
[0090]
The first PCR of the second stage was performed using Htnt Bam1 primer (sequence: 5'-CCCGCCCATCACCCATCCATCACATG-3 ': SEQ ID NO: 24) and M13F primer. Using this DNA fragment as a template, the second PCR was performed in the same manner using Htnt Bam2 primer (sequence: 5'-CGGGATCCCGCCCATCACCCATCACCCAT-3 ': SEQ ID NO: 25) and M13F primer. The PCR product was digested with BamH1 and subjected to polyacrylamide gel electrophoresis to recover a DNA fragment of about 350 bp.
[0091]
Next, as shown in FIG. 13, the obtained His-tag + arsR DNA fragment was digested with pTV118N (preferably called pTV) + lamb pre vector with BamHI and inserted into a vector dephosphorylated by alkaline phosphatase treatment. The resulting plasmid was designated as pTV118N + lamB + HisarsR-pre. Here, His-tagged arsR is inserted in two directions. The one into which His-tagged arsR was inserted in the opposite direction to the direction in which the lac promoter worked was used.
[0092]
Next, the N-terminus of lamB was modified at the 5 ′ end by PCR so that the initiation codon was in frame so that it was efficiently transcribed from the lacP promoter during ligation. Then, in the same manner as described above, His-taggeddarsR was inserted at the positions of the 153rd and 154th amino acid residues of the protein encoding lamB to obtain His-taggedarsR.
[0093]
Further, as shown in FIG. 14, the new pTV118N vector was digested with NcoI containing the start codon of the lacZ gene. This was smoothed using Klenow DNA polymerase (Takara Shuzo). Furthermore, dephosphorylation was performed using alkaline phosphatase.
[0094]
The above PCR product (lamB + His-tagged arsR) was inserted into the vector thus obtained. The resulting plasmid was designated as pTV + lamB-HisarsR.
[0095]
In this plasmid vector pTV + lamB-HisarsR, the nucleotide sequence of the region encoding the fusion protein of LamB protein and histidine peptide and ArsR protein is SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, and the amino acid sequence encoded by this is SEQ ID NO: 4 in the sequence listing. Shown in
[0096]
E. FIG. E. coli DH5α strain was transformed with pTV + lamb-HisarsR. This E. coli was transformed into E. coli. coli DH5α + pTV + lamB-HisR. Using this recombinant, experiments on adsorption, removal and recovery of arsenic in the culture solution were performed.
[0097]
5) Construction of a recombinant vector for producing and purifying in Escherichia coli a fusion protein of maltose binding protein (MalE) and an ArsR protein with a 6-residue histidine (histtag) histag
First, as shown in FIG. 15, a his-tag was added to arsR by two PCRs as described above. As the template DNA, about 1 ng of the aforementioned pKS + arsR was used. The first PCR primer used was ars Htnt-1 primer (sequence: 5′-CCATCACATGTCATTTCTGTTACCCATCCAAT-3 ′: SEQ ID NO: 22) and M13Fprimer. The PCR reaction was performed using KOD DNA polymerase (manufactured by TOYOBO) 2 The reaction volume was adjusted to 20 μL with O to perform the reaction. As the PCR conditions, 25 cycles were performed at 94 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 74 ° C. for 1 minute. The second PCR was performed in the same manner using an ars Htnt-2 primer (sequence: 5′-CATCACCATCCATCATCACATGTCATTTCTGTGT-3 ′: SEQ ID NO: 23) phosphorylated by using T4 Polynucleotide Kinase (manufactured by Takara Shuzo) and M13F primer. The PCR product was digested with EcoRI, and a DNA fragment was separated and recovered by agarose gel electrophoresis.
[0098]
This DNA fragment was inserted into a vector obtained by digesting pMal-c2 (manufactured by New England Bio labs) with XmnI and EcoRI and then treating with alkaline phosphatase. As shown in FIG. 16, the resulting plasmid was designated as pMal + HisarsR.
[0099]
In the plasmid vector pMal + HisarsR, the nucleotide sequence of the region encoding the fusion protein of the MalE protein and the histidine peptide and the ArsR protein is shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing, and the amino acid sequence encoded by it is shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing. .
[0100]
E. FIG. E. coli strain DH5α was transformed with pMal + His-arsR. This E. coli was transformed into E. coli. coli DH5α + pMal + His arsR. This E. By using E. coli DH5α + pMal + HisarsR, the histidine-added ArsR protein is expressed as a chimeric protein fused with maltose binding protein, and can be easily immobilized on an affinity column filled with ready-made amylose.
[0101]
In addition, the protein can be separated from the maltose-binding protein using the protease Factor Xa, and the separated His-tagged ArsR protein can be easily immobilized on an affinity column already filled with nickel.
[0102]
6) Purification of fusion protein of maltose binding protein (MalE) and His-tagged ArsR protein
As described above, the chimeric protein (maltose binding protein (MalE) and a His protein-tagged ArsR protein fusion protein) expressed by Escherichia coli was purified as follows.
a) Each transformant stored in a glycerol solution at −85 ° C. was streaked on a 1 × LB agar medium containing 100 μg / mL ampicillin (Amp), and incubated at 37 ° C. overnight.
b) The single colony that appeared was inoculated into a 1 × LB liquid medium containing 20 mL of Amp, and cultured with shaking at 37 ° C. overnight.
c) On the next day, 10 mL of the culture solution was subcultured into a 1 L glucose-rich 1 × LB medium (10 g trypton, 5 g yeast extract, 5 g NaCl, 2 g glucose / l) containing Amp and shaken at 110 rpm until the OD 600 nm reached 0.5 at 30 ° C. Culture was continued.
d) IPTG was added to a final concentration of 0.3 mM, and the cells were further cultured for 2 hours. The culture was transferred to a 500 mL tube and centrifuged at 5,000 rpm at 4 ° C. for 5 minutes to collect the cells. The medium was discarded, and the cells were transferred to a 50 mL tube and stored at -85 ° C until the next operation.
e) The cells were suspended in 1 mL of column buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM β-mercaptoethanol). Then, the cells destroyed the cells with an ultrasonic crusher.
f) The cell disruption solution was transferred to a 1.5 mL microtube and centrifuged at 4 ° C., 15,000 rpm for 20 minutes. The supernatant (crude extract) was transferred to a new microtube.
g) Amylose resin was poured into a 2.5 x 10 cm column. The column was washed with 400 mL of column buffer. Crude extract (2.5 μg / μL) was loaded at a flow rate of about 1 mL / min.
h) Washed with 600 mL column buffer.
i) The fusion protein was eluted with 60 mL of a column buffer containing 10 mM maltose. Fractions were collected in 3 mL increments, and protein-containing fractions were pooled.
j) The fusion protein was quantified using Protein Assay Kit I (manufactured by BIO-RAD Laboratories) and used for digestion of factor Xa described below.
[0103]
7) Purification of His-tagged ArsR protein fusion protein
a) 1 mL of a 1 mg / mL protein solution was transferred to a 1.5 mL microtube, and 4 μg of Factor Xa (New England biolabs, Inc.) was added thereto, followed by incubation at 16 ° C. overnight to digest the protein.
b) 10 mg of the digested protein was centrifuged in Lysis Buffer (50 mM NaH) using Centriplus 10 (Amicon, Inc.). 2 PO 4 (pH 8.0, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazole).
c) 5 mL of Ni-NTA Super flow resin (manufactured by QIAGEN) was poured into a 1 × 10 cm column. The column was equilibrated with 40 mL of Lysisbuffer.
d) The protein exchanged into the lysis buffer as described above was loaded into the column at a flow rate of 0.5 mL / min.
e) The column was washed with 40 mL of Lysis buffer. The column was washed with 40 mL of Wash buffer (50 mM NaH2PO4, pH 8.0, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole).
g) The column was exchanged for 40 mL of pcolumn buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM β-mercaptoethanol), and left at 4 ° C. until the sample containing arsenic was added.
[0104]
8) Arsenic removal using a column on which His-tagged ArsR protein was immobilized
Arsenic removal using a column on which His-tagged ArsR protein was immobilized was performed in the following procedure.
a) A 40 mL sample containing arsenic was loaded into the column at a flow rate of 0.5 mL / min.
b) The arsenic concentration of the sample flowing out of the column was measured by a spectrophotometric method using silver diethyldithiocarbamate.
[0105]
9) Experiment of adsorption and removal and recovery of arsenic in the culture using the prepared recombinant
Experiments for adsorption, removal and recovery of arsenic in the culture solution using the prepared recombinant were performed in the following procedure.
a) Escherichia coli DH5α, which had been stored in a 30% glycerol solution at −85 ° C., was transformed with pTV + lamB-arsR, pTVlamB-HisarsR, and pTV + lamB on an 1 × LB agar medium supplemented with ampicillin. The cells were cultured at 37 ° C. overnight.
b) On the next day, a single colony was scraped with a platinum loop, inoculated into 10 mL of 1 × LB medium supplemented with ampicillin previously added to a 50 mL triangular flask, and cultured with shaking at 37 ° C. overnight.
c) 500 μL of the overnight culture solution was subcultured in 50 mL of the same 1 × LB medium added to a 200 mL triangular flask, and cultured with shaking at 30 ° C. overnight.
d) On the next day, 500 μL of an arsenic solution adjusted to a final arsenic concentration of 0.3 μg / mL or 0.5 μg / mL was added to the culture solution, adjusted to a total volume of 10 mL, and mixed using a vortex mixture.
e) After the container was covered, a parafilm was wound around the container and allowed to stand at 4 ° C. for about 2 weeks to spontaneously settle the E. coli.
f) 8 mL of the supernatant was aspirated while being careful not to suck the precipitated bacteria with a pipette, and transferred to a 300 mL beaker. The concentration of arsenic remaining in the culture supernatant was measured by a method using silver diethylcarbamate.
[0106]
"Measurement of arsenic concentration"
The measurement of the arsenic concentration was performed as follows.
[0107]
An arsenic concentration measuring method by an absorption spectrophotometric method using silver diethyldithiocarbamate is a method in which arsenic is used as an arsenic hydride, and this is absorbed in a pyridine solution of silver diethyldithiocarbamate to form a supersoluble complex compound (AsH3 + 6Ag (DDC) → 6Ag + 8HDDC + As). (DDC) 3) reduces the silver pyridine solution of diethyldithiocarbamate to release elemental silver, and the colloidal silver exhibits an orange-red-purple color. The chromaticity is measured by measuring the absorbance at a wavelength of 535 nm with a spectrophotometer. According to this method, a calibration curve can be drawn with arsenic samples of various concentrations, and the concentration of the sample can be determined from the calibration curve. The following experimental procedure followed the water supply test method (1993 Japan Water Works Association).
a) Transfer 8 mL of the culture solution containing arsenic to a 300 mL Erlenmeyer flask, and add 177 mL of distilled water and 5 mL of 12N HCl. Heat it to 90 ° C. and concentrate to about 30 mL.
b) Cool the sample to room temperature, put it in a ready-made arsenic hydroxide-producing glassware, and thoroughly wash the inside of the beaker with about 10 mL of distilled water to bring the total to about 40 mL.
c) 5 mL of a 15% potassium iodide solution (w / v) prepared with distilled water is added, mixed, and allowed to stand for 2 to 3 minutes.
d) Add 1 mL of a 40% stannous chloride solution (w / v) prepared with 12N HCl, mix and let stand for 15 minutes.
e) Add 3 g of sandy zinc, immediately add arsenic hydride generating glassware and 5 mL of 0.5% silver diethyldicarbamate solution (w / v) previously prepared with pyridine to the absorption tube. Connect with a conduit. Fill the pipe near the arsenic hydroxide inlet with glass wool moistened with a lead acetate solution.
f) Arsenic hydride gas is passed through the silver diethyldicarbamate solution at room temperature for 1 hour.
g) Take 1 mL of the sample, transfer it to a glass cuvette, and measure the absorbance at OD 535 nm using a spectrophotometer.
h) Simultaneously determine the arsenic concentration of the sample using the calibration curve drawn from the arsenic standard solution.
[0108]
"Example of arsenic adsorption removal experiment"
Arsenic removal was confirmed in all E. coli harboring pTV + lamB, pTV + lamB-arsR and pTV + lamB-HisarsR. When arsenic was added at a final concentration of 0.3 μg / mL, the removal rate of arsenic was about 10% for E. coli having pTV + lamB-arsR, about 21% for pTV + lamB-arsR, and about 21% for pTV + lamB-arsR. The removal rate was about 17%. As a result, it was shown that arsenic removal by linking arsR to lamB had twice the removal effect. The reason why the removal rate of the sample to which the histag was added was 4% lower than that of the sample to which the histag was not added is considered that the hisshitag adversely affected the three-dimensional structure of the ArsR protein and inhibited arsenic adsorption (see FIG. 17).
[0109]
From the above experimental results, Escherichia coli with improved ability to adsorb arsenic was successfully produced by displaying the repressor protein of the ars operon on the cell surface, and it was possible to adsorb and remove arsenic using this E. coli. It is understood that there is.
[0110]
It is considered that arsenic can be recovered by centrifuging and collecting Escherichia coli that has precipitated arsenic by adsorbing arsenic in the culture, and washing and centrifuging the cells with a chelating agent such as an EDTA solution. Since a method of releasing and recovering heavy metals from the cells adsorbing such heavy metals is already known (Non-Patent Document 4), the description thereof is omitted.
[0111]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, chemical substances such as arsenic contained in water and soil can be efficiently treated.
[Sequence list]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a genetic map of pTV + lamB-arsR, which is an example of a vector according to an embodiment.
FIG. 2 is a diagram showing a part of the steps for producing pTV + lamB and pTV + lamB-arsR and pTV + lamB-His arsR and pMal + His arsR, which are examples of recombinant vectors.
FIG. 3 is a diagram showing a continuation of the step shown in FIG. 2, which is a part of the step of preparing recombinant vectors pTV + lamB and pTV + lamB-arsR and pTV + lamB-His arsR and pMal + His arsR.
FIG. 4 is a diagram showing a continuation of the step shown in FIG. 3, which is a part of the steps for producing pTV + lamB and pTV + lamB-arsR and pTV + lamB-His arsR and pMal + His arsR, which are examples of the recombinant vector of the present invention. .
FIG. 5 is a diagram showing a part of the production steps of pTV + lamB and pTV + lamB-arsR and pTV + lamB-His arsR and pMal + His arsR, which are examples of the recombinant vector of the present invention, and show the continuation of the step shown in FIG. 4. .
FIG. 6 is a diagram showing a continuation of the step shown in FIG. 5, which is a part of the steps for producing pTV + lamB and pTV + lamB-arsR and pTV + lamB-His arsR and pMal + His arsR, which are examples of the recombinant vector of the present invention. .
FIG. 7 is a diagram showing a part of the production steps of pTV + lamB and pTV + lamB-arsR and pTV + lamB-HisarsR and pMal + HisarsR, which are examples of the recombinant vector of the present invention, and show the continuation of the step shown in FIG. 6; .
FIG. 8 is a diagram showing a continuation of the step shown in FIG. 7, which is a part of the steps for producing pTV + lamB and pTV + lamB-arsR and pTV + lamB-His arsR and pMal + His arsR, which are examples of the recombinant vector of the present invention. .
FIG. 9 is a diagram showing a part of the production steps of pTV + lamB and pTV + lamB-arsR and pTV + lamB-HisarsR and pMal + HisarsR, which are examples of the recombinant vector of the present invention, and show the continuation of the step shown in FIG. 8; .
FIG. 10 is a diagram illustrating a part of the steps for producing pTV + lamB and pTV + lamB-arsR and pTV + lamB-His arsR and pMal + His arsR, which are examples of the recombinant vector of the present invention, and show the continuation of the step shown in FIG. 9; .
FIG. 11 is a diagram showing a continuation of the step shown in FIG. 10, which is a part of the step of preparing the pTV + lamB and pTV + lamB-arsR and pTV + lamB-His arsR and pMal + His arsR which is an example of the recombinant vector of the present invention. .
FIG. 12 is a diagram showing a part of the step of preparing the pTV + lamB and pTV + lamB-arsR and pTV + lamB-His arsR and pMal + His arsR which is an example of the recombinant vector of the present invention, and shows the continuation of the step shown in FIG. 11. .
FIG. 13 is a diagram showing a continuation of the step shown in FIG. 12, which is a part of the steps for producing pTV + lamB and pTV + lamB-arsR and pTV + lamB-His arsR and pMal + His arsR, which are examples of the recombinant vector of the present invention. .
FIG. 14 is a diagram showing a part of the production steps of pTV + lamB and pTV + lamB-arsR and pTV + lamB-His arsR and pMal + His arsR which are examples of the recombinant vector of the present invention, and show the continuation of the step shown in FIG. 13. .
FIG. 15 is a diagram showing a part of the production steps of pTV + lamB and pTV + lamB-arsR and pTV + lamB-His arsR and pMal + His arsR, which are examples of the recombinant vector of the present invention, and show the continuation of the step shown in FIG. 14. .
FIG. 16 is a diagram showing a continuation of the step shown in FIG. 15, which is a part of the steps for producing pTV + lamB and pTV + lamB-arsR and pTV + lamB-His arsR and pMal + His arsR, which are examples of the recombinant vector of the present invention. .
FIG. 17 shows the results of adsorption and removal of arsenic using the Escherichia coli of the present invention transformed with the recombinant vectors pTV + lamB and pTV + lamB-arsR and pTV + lamB-HistagdarsR of the present invention.
Claims (31)
前記リプレッサータンパク質が特定化学物質と結合する微生物細胞。The microorganism cell according to claim 1,
A microbial cell in which the repressor protein binds to a specific chemical.
前記リプレッサータンパク質がＡｒｓＲタンパク質である微生物細胞。The microbial cell according to claim 1 or 2,
A microbial cell, wherein the repressor protein is an ArsR protein.
前記微生物が、ｌａｍＢ−ａｒｓＲ発現ベクターまたはｌａｍＢ−Ｈｉｓ ａｒｓＲ発現ベクターを保持した大腸菌である微生物細胞。A microbial cell according to any one of claims 1 to 3,
A microorganism cell, wherein the microorganism is Escherichia coli carrying a lamB-arsR expression vector or a lamB-HisarsR expression vector.
前記リプレッサータンパク質は、担体に固定されて用いられる、特定の化学物質を吸着除去する方法。The method of claim 6, wherein
A method for adsorbing and removing a specific chemical substance, wherein the repressor protein is used by being fixed to a carrier.
前記担体が膜またはカラムである方法。The method according to claim 6 or 7,
The method wherein the carrier is a membrane or a column.
前記リプレッサータンパク質は、これを発現する形質転換された微生物から精製して得られたものである方法。The method according to any one of claims 6 to 8,
A method wherein the repressor protein is obtained by purifying from a transformed microorganism that expresses the repressor protein.
前記微生物は、ＡｒｓＲタンパク質にマルトース結合タンパク質およびヒスチジンタグが付加された融合タンパク質を発現し得る大腸菌である方法。The method of claim 9, wherein
The method wherein the microorganism is Escherichia coli capable of expressing a fusion protein in which a maltose binding protein and a histidine tag are added to an ArsR protein.
前記吸着除去される特定化学物質は、オペロンの誘導物質である方法。The method according to any one of claims 5 to 10,
The method in which the specific chemical substance to be adsorbed and removed is an operon inducer.
配列表の配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡ。The DNA according to claim 12, wherein
A DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
該第１のＤＮＡのコードするタンパク質と融合タンパク質が形成されるようにＤＮＡ配列において同じコドンフレームに連結された膜タンパク質、または膜やカラム担体と親和性や化学反応を介し結合が可能なタンパク質もしくはペプチドをコードする第２のＤＮＡと、
を有する組換えベクター。A first DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing;
A membrane protein linked to the same codon frame in the DNA sequence so that a fusion protein is formed with the protein encoded by the first DNA, or a protein capable of binding to a membrane or column carrier through affinity or chemical reaction, or A second DNA encoding a peptide;
A recombinant vector comprising:
前記第１のＤＮＡは微生物オペロンの調節遺伝子であるａｒｓＲ遺伝子である組換えベクター。The recombinant vector according to claim 14, wherein
The recombinant vector, wherein the first DNA is an arsR gene which is a regulatory gene of a microorganism operon.
前記第２のＤＮＡは膜タンパク質をコードするｌａｍＢ遺伝子である組換えベクター。The recombinant vector according to claim 15, wherein
The recombinant vector, wherein the second DNA is a lamB gene encoding a membrane protein.
請求項１０〜１２のいずれか１つの組換えベクターにより形質転換され、膜タンパク質とともに前記第一のＤＮＡがコードするタンパク質が細胞表面に発現され、ヒ素を吸着する微生物。A microorganism that adsorbs arsenic,
A microorganism transformed with the recombinant vector according to any one of claims 10 to 12, wherein the protein encoded by the first DNA is expressed on a cell surface together with a membrane protein, and the microorganism adsorbs arsenic.
前記微生物は、大腸菌である微生物。The microorganism according to claim 17, wherein
The microorganism, wherein the microorganism is Escherichia coli.
前記微生物は、ｌａｍＢ−ａｒｓＲ発現ベクターまたはｌａｍＢ−Ｈｉｓ ａｒｓＲ発現ベクターを保持した大腸菌である微生物。The microorganism according to claim 18, wherein
The microorganism is Escherichia coli carrying a lamB-arsR expression vector or a lamB-HisarsR expression vector.
ヒ素を含む被処理試料を請求項１７〜１９のいずれか１つの微生物と接触させ、被処理試料からヒ素を吸着除去する方法。A method for adsorbing and removing arsenic,
A method for contacting a sample to be treated containing arsenic with the microorganism according to any one of claims 17 to 19 to adsorb and remove arsenic from the sample to be treated.
請求項１７に記載の組換えベクターにより形質転換され、前記第１のＤＮＡである調節遺伝子とｍａｌＥ遺伝子との発現によりキメラタンパク質を生産する微生物。A microorganism,
A microorganism transformed with the recombinant vector according to claim 17 and producing a chimeric protein by expression of the regulatory gene and the malE gene as the first DNA.
前記微生物は、大腸菌である微生物。The microorganism according to claim 22, wherein
The microorganism, wherein the microorganism is Escherichia coli.
前記微生物は、ｐＭａｌ−Ｈｉｓ ａｒｓＲを保持した大腸菌である微生物。The microorganism according to claim 23,
The microorganism is Escherichia coli carrying pMal-HisarsR.
請求項２４に記載の組換えベクターにより形質転換され、前記第１のＤＮＡである調節遺伝子と、ヒスチジンペプチドをコードする遺伝子の発現により、キメラタンパク質を生産する微生物。A microorganism,
A microorganism which is transformed with the recombinant vector according to claim 24 and produces a chimeric protein by expressing the regulatory gene as the first DNA and a gene encoding a histidine peptide.
前記微生物は、大腸菌である微生物。The microorganism according to claim 26,
The microorganism, wherein the microorganism is Escherichia coli.
請求項２２〜２４、２６、２７のいずれか１つの微生物の生産したキメラタンパク質。A chimeric protein,
A chimeric protein produced by the microorganism of any one of claims 22 to 24, 26, and 27.
前記特定化学物質はヒ素である除去剤。The removing agent according to claim 29,
The specific chemical substance is an arsenic removing agent.
前記リプレッサータンパク質は、ａｒｓＲ遺伝子のコードするａｒｓＲタンパク質である除去剤。The removing agent according to claim 29 or 30,
The remover, wherein the repressor protein is an arsR protein encoded by an arsR gene.
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|---|---|---|---|---|
| WO2013173897A2 (en) * | 2012-05-25 | 2013-11-28 | Vale S.A. | Gene, ars-r anchorage cassette, ars-r expression- anchorage cassette, recombinant plasmid, bacterial transgenic lineage, use of said gene, use of said lineage in environmental bioremediation processes |
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| WO2013173897A3 (en) * | 2012-05-25 | 2014-01-23 | Vale S.A. | Gene, ars-r anchorage cassette, ars-r expression- anchorage cassette, recombinant plasmid, bacterial transgenic lineage, use of said gene, use of said lineage in environmental bioremediation processes |
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