【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＲＮＡインターフェアレンス（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；ＲＮＡｉ）によって細胞周期に関与するサイクリンＢ遺伝子の発現を抑制することのできる二本鎖ＲＮＡオリゴヌクオチド、該オリゴヌクレオチドを含む発現ベクター、ならびに細胞周期の異常に起因する疾患の予防及び／又は治療のための医薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞周期は、ＤＮＡ複製を行うＳ期、分裂を行うＭ期とそれぞれの準備期であるＧ１， Ｇ２ 期から成る。サイクリンＢは、細胞周期の進行に関与するタンパク質であるサイクリンのうちのひとつである。サイクリンにはこれまでＡからＨの８タイプが知られているが、Ｇ１／Ｓ期に関わるものはＧ１サイクリン（Ｇ１ｃｙｃｌｉｎ）、Ｇ２／Ｍ期に関わるものは分裂サイクリン（ｍｉｔｏｔｉｃ ｃｙｃｌｉｎ）と呼ばれ、それぞれ特異的なサイクリン依存性プロテインキナーゼ（ｃｄｋ）と結合して活性化し、細胞周期を進行させる働きをもつ。近年の研究で、哺乳類細胞では、サイクリンＤ・ｃｄｋ４／６，サイクリンＥ・ｃｄｋ２，サイクリンＡ・ｃｄｋ２，サイクリンＢ・ｃｄｃ２が順に活性化し、これらのサイクリン・ｃｄｋ複合体が細胞周期の進行の中心的役割を担うことが明らかにされた。細胞周期の進行の調節は、これらのサイクリン・ｃｄｋ複合体活性を様々な因子が調節することによって行われている。また、遺伝情報の不具合を検出し、分裂期（Ｍ期） 前に細胞周期を停止するＧ２／Ｍ チェックポイントは、サイクリンＢ・ｃｄｃ２活性の上昇を抑制することによってなされている。腫瘍の発生は、このサイクリンＢの発現過剰によって惹起される細胞周期の異常が原因と考えられる。ヒトのサイクリンＢをコードする遺伝子の配列は既に公表されているが（ＮＣＢＩ ＮＭ＿０３１９６６）、その発現を抑制する制御配列については特定されていない。
【０００３】
一方、多細胞生物の個体又は培養細胞において、特定の遺伝子発現を抑制する方法として、ＲＮＡインターフェアレンス（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；ＲＮＡｉ）法が知られている。ＲＮＡｉとは、細胞に導入されたＲＮＡが、それと同じ塩基配列を持った遺伝子の発現を抑制する現象をいい、標的遺伝子（ｍＲＮＡ）を破壊することで発現を抑制するため、遺伝子の機能解析に有効な方法として着目されている。抑制効果は一本鎖ＲＮＡより二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の方が大きく、ＲＮＡｉ効果はプロモーター部分やイントロン部分にはなく、エキソン部分で有効であることが確認されている。ＲＮＡｉは１９８６年に線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）で発見され（Ｆｉｒｅ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３９１， ８０６−８１１， １９９８）、その後ショウジョウバエ（Ｋａｎｎｅｒｄｅｌｌ， Ｊ． Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ９５， １０１７−１０２６， １９９８）、ゼブラフィッシュ（Ｗａｒｇｅｌｉｕｓ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ２６３， １５６−１６１， １９９９）、シロイヌナズナ（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ， Ｐ． Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．， ９５， １３９５９−１３９６４， １９９８）、トリパノソーマ（Ｎｇｏ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．， ９５， １４６８７−１４６９２， １９９８）、ヒドラ（Ｌｏｈｍａｎｎ， Ｊ． Ｕ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． ，２１４， ２１１−２１４，１９９９）、プラナリア（Ｓａｎｃｈｅｚ Ａｌｖａｒａｄｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．， ９６， ５０４９−５０５４， １９９９）などの他の生物種でも認められた。ＲＮＡｉは発見された当初、哺乳動物細胞においては約３０ｂｐ以上のｄｓＲＮＡを細胞内に導入すると、細胞が本来持っている免疫機能によりアポトーシスを起こして細胞が死んでしまうため、哺乳動物細胞での利用は困難であると思われてきた。しかし、近年ではマウス初期胚や哺乳動物培養細胞でもＲＮＡｉが起こり得ることが示され、ＲＮＡｉの誘導機構そのものは哺乳動物細胞にも存在することがわかってきた（非特許文献１参照）。その後、さらに短い（２１〜２３ｂｐ）ｄｓＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ；ｓｉＲＮＡ）が哺乳動物細胞系でも細胞毒性を示さずにＲＮＡｉを誘導できることが示された（非特許文献２参照）。ＲＮＡｉによる遺伝子サイレンシング（ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）の原理は、細胞へ導入されたｓｉＲＮＡがマルチ・タンパク質複合体と結合してＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）を形成し、このｓｉＲＮＡ−タンパク質複合体がｓｉＲＮＡと相同性を持つｍＲＮＡに結合し、ＲＩＳＣヌクレアーゼ活性によりｓｉＲＮＡ−ｍＲＮＡの結合部位が切断された結果、標的遺伝子の発現が抑制されるというものである。
【０００４】
アンチセンス法も同じく遺伝子の発現を抑制する方法であり、標的遺伝子のｍＲＮＡに相補的なＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡ）又はＤＮＡを細胞内に導入し、ｍＲＮＡと結合させることによってその転写、及び翻訳を阻害することを原理としている。アンチセンス法では標的遺伝子のｍＲＮＡのある領域に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドがハイブリッド結合することによって遺伝子発現が抑制されるので、元のｍＲＮＡの一本鎖は保存されており、またハイブリッド結合が何らかの理由によりはずれるとその抑制が解除される。これに対し、ＲＮＡｉ法は、標的遺伝子のｍＲＮＡの相同部分を分解（切断）することによって遺伝子発現を配列特異的に抑制するので元のｍＲＮＡは一本鎖ではなくなり、抑制の度合いが高い。しかもＲＮＡｉ法では短い配列（ｄｓＲＮＡでは通常２１〜２３塩基）で制御ができるのでアンチセンス法よりはるかに容易に分子設計できるという点で有利である。しかしながら、標的遺伝子の発現を有意に破壊できる二本鎖ＲＮＡの選択は、これを事前に予測する確立された方法がなく、ＲＮＡｉ法による遺伝子発現抑制技術において大きな障害となっている。例えば、スタートコドンから７５塩基以上下流の最初のＡＡを見つけ、ＡＡに続く配列でＧＣ含量が５０％前後である配列を探索・選択し、その配列が目的遺伝子に対して特異的であることを確認し、実際に目的遺伝子の発現を抑制するかを実験的に確かめてみるという手法（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆａｓｍａｃ．ｃｏ．ｊｐ／ｓｉｒｎａ２．ｈｔｍｌ）など、二本鎖ＲＮＡの選択について幾つかの試みが提案されている。しかしながら、目的とする標的遺伝子により事情が相違し、結局は、試行錯誤による選択によっているのが現状である。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｕｉ−Ｔｅｉ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， ４７９， ７９−８２， ２０００
【非特許文献２】
Ｅｌｂａｓｈｉｒ ＳＭ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ４１１， ４９４−４９８， ２００１
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、細胞内に導入することによって細胞周期に関与するサイクリンＢ遺伝子の発現を配列特異的に抑制することのできる二本鎖ＲＮＡを提供することにある。本発明のさらなる課題は、細胞周期の異常に起因する種々の疾患のための医薬を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべき鋭意研究を重ねた結果、サイクリンＢの遺伝子配列においてＲＮＡｉによる破壊（分解）の標的となる部位を特定し、この部位の塩基配列と相同な塩基配列を有する二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成し、これを細胞に導入したところ、サイクリンＢが発現しないことを確認できた。本発明はかかる知見により完成されたものである。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）配列番号１に記載の塩基配列の塩基番号３３１〜３４９で表される塩基配列と相同な塩基配列を含む二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
（２）長さが３０塩基以下である上記（１）の二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
（３）上記（１）の二本鎖ＲＮＡオリゴヌクオチドを含む発現ベクター。
（４）上記（１）の二本鎖ＲＮＡオリゴヌクオチドを有効成分として含有する細胞周期の異常に起因する疾患の予防及び／又は治療のための医薬。
（５）細胞周期の異常に起因する疾患が、癌、自己免疫疾患、神経変性疾患、及び発生異常や染色体異常に基づく疾患から成る群から選択される疾患である、上記（４）の医薬。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
１．二本鎖ＲＮＡオリゴヌレオチド
本発明の「二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド」（以下、単に二本鎖ＲＮＡという場合もある）はサイクリンＢの遺伝子配列に存在するＲＮＡｉによる破壊（分解）の標的部位の塩基配列と相同な塩基配列を有し、センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖からなる。標的部位の塩基配列と相同な配列を有する鎖はセンスＲＮＡ鎖、アンチセンスＲＮＡ鎖のいずれであってもよいが、通常はセンスＲＮＡ鎖であり、アンチセンスＲＮＡ鎖はセンスＲＮＡ鎖に対して相補である。
ここで、「相同」とはＴ（チミン）がＵ（ウラシル）となる以外は完全に同一であることをいう。
【００１０】
本発明において、サイクリンＢ遺伝子配列中のＲＮＡｉによる破壊（分解）の標的部位の決定は、登録されているサイクリンＢ遺伝子の配列情報に基づいて候補となる２０〜２５塩基の二本鎖ＲＮＡオリゴヌクオチド（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ；ｓｉＲＮＡ）を幾つか設計し、これらのｓｉＲＮＡのサイクリンＢ遺伝子発現抑制を調べることによって行う。具体的には、サイクリンＢをコードする遺伝子が存在する転写翻訳系に該ｓｉＲＮＡを添加してサイクリンＢの発現抑制を調べるか、又はサイクリンＢをコードする遺伝子に対応するｍＲＮＡが存在する系に該ｓｉＲＮＡを添加して、サイクリンＢの発現抑制を調べる。サイクリンＢ遺伝子の塩基配列は既に知られており、例えばヒトサイクリンＢは、ＮＣＢＩ ＮＭ＿０３１９６６の配列情報が利用できる。
【００１１】
ｓｉＲＮＡの設計は、標的遺伝子により異なるが、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｍａｃ．ｃｏ．ｊｐ／ｓｉｒｎａ３．ｈｔｍｌ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｑｂｉｏｇｅｎｅ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ／ａｐｐ−ｓｉｒｎａ．ｓｈｔｍｌ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｐｉｂｐｃ．ｇｗｄｇ．ｄｅ／ａｂｔｅｉｌｕｎｇｅｎ／１００／１０５／ｓｉｒｎａ．ｈｔｍｌ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｍｉｓｃ／ｓｉＲＮＡ＿ｄｅｓｉｇｎ．ｈｔｍｌに記載のプロトコル等を参照して行うことができる。
【００１２】
これまでに報告されるｓｉＲＮＡの一般的な設計方法は、スタートコドンから７５塩基以上下流の最初のＡＡを見つけ、ＡＡに続く配列でＧＣ含量が５０％前後である配列を探索・選択し、その配列が目的遺伝子に対して特異的であることを確認し、実際に目的遺伝子の発現を抑制するかを実験的に確かめるという工程からなる。
また、目的遺伝子に対して特異的であることの確認は、可能性のある標的部位の塩基配列、即ち選択したｓｉＲＮＡ塩基配列をデータベース（ヒト、マウス、ラットなど）と比較し、他のどの遺伝子とも顕著な相同性を有しないことを確かめることによって行う。相同性検索は、例えばｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｈｉ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／を用いることができる。
【００１３】
しかしながら、上記の一般的な方法に従うと、本発明の対象であるサイクリンＢ遺伝子にあっては、ＡＡに続く起点として、配列番号１に示す塩基配列における２７８，２８５，２９７，３０５，３２７位の塩基など、数多くの塩基を起点する配列が候補となる。従って、実際にはこれらの候補から細胞内にタンパク質が発現されていないかに関して細胞生物学的な実験を行って絞り込むという試行錯誤を繰り返す必要がある。
【００１４】
また、完全なｓｉＲＮＡ実験のために適当なネガティブコントロールｓｉＲＮＡも含めることが好ましい。ネガティブコントロールｓｉＲＮＡとしては、設定したｓｉＲＮＡと同じ塩基組成を有するが、ゲノムに対して顕著な配列相同性がないオリゴヌクレオチドが用いられる。典型的にはｓｉＲＮＡの塩基配列をランダムに並び換え、相同性検索をして他のどの遺伝子に対しても相同性がないことを確認することによって設計する。
【００１５】
上記のようにして設計された本発明の二本鎖ＲＮＡは、配列番号１に記載の塩基配列の塩基番号３３１〜３４９で表される塩基配列（５’−ＧＴＣＡＧＴＧＡＡＣＡＡＣＴＧＣＡＧＧ−３’）と相同な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドである。
【００１６】
本発明の二本鎖ＲＮＡは、上記の１９塩基からなる配列を少なくとも含んでいればこれに任意の塩基が付加されていてもよい。しかしながら、創薬の簡便性又は生体内に投与した場合の安定性の観点から、長さが３０塩基以下、好ましくは２５塩基以下、さらに好ましくは２３塩基以下であることが好ましい。
【００１７】
本発明の二本鎖ＲＮＡを構成する少なくとも一つの鎖は１〜６塩基、好ましくは１〜５塩基、さらに好ましくは２〜４塩基の３’オーバーハング（代表的にはＴＴ）を有する。
【００１８】
本発明の二本鎖ＲＮＡは、上記で設計したｓｉＲＮＡの塩基配列に基づいてＲＮＡオリゴヌクレオチド（センスＲＮＡ鎖、アンチセンス鎖）を合成し、それらをアニーリングすることによって作成できる。二本鎖ＲＮＡを構成するセンスＲＮＡ鎖、アンチセンスＲＮＡ鎖の合成は、例えば市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を用いて一般的な方法で行うことができる。合成方法としては、例えば、ホスホロアミダイト法、ハイドロジェンホスフォネート法、ホスホロチオエート法、ホスホトリエステル法が挙げられる。また、合成したＲＮＡ鎖の精製も常法に従うことができ、例えば、通常の高速液体クロマトグラフィーやポリアクリルアミドゲル電気泳動、溶媒抽出、塩析等による方法を適宜採用することができる。
【００１９】
アニーリングは、合成したＲＮＡ鎖一組（センスＲＮＡ鎖、アンチセンス鎖）をそれぞれｄｓＲＮＡ用アニーリングバッファーに溶解し、等量（等ｍｏｌｅ数）混合し、二本鎖が解離する温度まで加熱し、その後徐々に冷却してインキュベートすることにより行う。アニーリングの条件としては、例えば、９０℃にて１分、続いて３７℃にて１時間が静置することが例示される。その後、フェノール／クロロホルム抽出・エタノール沈殿を行う。
【００２０】
本発明の二本鎖ＲＮＡオリゴヌレオチドは、大腸菌等を用いて組換え法によって取得することもできる。具体的には、本発明のＲＮＡ鎖の鋳型となるＤＮＡ断片を、大腸菌内でＲＮＡの転写が行われるのに適当なプロモーターの制御下におかれるように連結されたＤＮＡを作成し、このＤＮＡを含む組換えベクターで大腸菌を形質転換して培養し、ＲＮＡの転写を行わせた後に二本鎖ＲＮＡを菌体から取得する。
【００２１】
２．二本鎖ＲＮＡオリゴヌレオチド発現ベクター
本発明の二本鎖ＲＮＡオリゴヌレオチドは、適当な発現ベクターに挿入して標的細胞内で生成させることもできる。
本発現ベクターとして利用しうるベクターとしては、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡ、レトロトランスポゾンＤＮＡ、酵母人工染色体（ＹＡＣ）ＤＮＡ、Ｐ１ファージ由来人工染色体（ＰＡＣ）ＤＮＡなどが挙げられるが、特に長さが短いｐＵＣ系プラスミド（例えば１〜３ｋｂｐ程度）が好ましい。
【００２２】
本ベクターには、プロモーター及び／又はその他の制御配列を機能しうる形で連結して挿入してもよい。「機能しうる形で連結して挿入する」とは、本ベクターが導入される標的細胞において、プロモーター及び／又はその他の制御配列の制御下に上記二本鎖ＲＮＡが発現されて内在性のサイクリンＢ遺伝子における標的部位のｍＲＮＡが破壊（分解）されるように、プロモーター及び／又はその他の制御配列を連結してベクターに組み込むことを意味する。本ベクターに組み込むことが可能なプロモーター及び／又は制御配列は特に限定されるものではなく、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、時期特異的プロモーター、その他の調節エレメントなど、当技術分野で公知のプロモーター及び／又は制御配列を、導入する標的細胞に応じて適宜選択することができる。上記で用いる適当なプロモーターとは、導入された細胞内でＲＮＡの転写が行われるようなものであれば特に制限はないが、好ましくは特定条件下でのみ発現誘導をかけられるような、Ｔｅｔ誘導プロモーター（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）、Ｅｃｄｙｓｏｎｅ誘導プロモーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＩＰＴＧ誘導プロモーター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）等が挙げられる。
上記のようにして作製された発現ベクターは、標的細胞に導入されるとｓｉＲＮＡが発現され、ＲＮＡｉによるサイクリンＢ遺伝子の破壊（分解）が進行する。
【００２３】
上記の方法によって取得された二本鎖ＲＮＡ又は二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを標的細胞に導入する方法としては、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、ウイルス法、ＨＶＪ−リポソーム法、リポフェクション法、パーティクルガン法等が用いられる。ＲＮＡ導入効率は細胞の種類によって異なるため、細胞によって導入用（トランスフェクション）試薬、ＲＮＡの量、細胞の密度、導入時間を最適化する必要がある。
【００２４】
二本鎖ＲＮＡ、又は二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを導入した標的細胞は、通常の細胞培養と同様の条件下において培養を行う。また、二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを導入した細胞においては、必要に応じてこの培養中に導入したプロモーターを活性化させる。活性化の方法は、それぞれのプロモーターに適した通常行われる方法で行うことができる。培養条件は、使用した細胞に適した条件で行い、培養時間は、該細胞に導入した二本鎖ＲＮＡが充分量転写される時間行う。
【００２５】
二本鎖ＲＮＡ、又は二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを導入した標的細胞におけるサイクリンＢ遺伝子の発現解析は、抗体による免疫蛍光染色、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、Ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法等によって行うことができる。
ここで、標的細胞としては、哺乳動物由来の培養細胞が好適に用いられる。具体的には、ヒトＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−２）、ヒト２９３細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ：ＣＣｌ−１）、アフリカミドリザルＣＯＳ細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５１）、イヌＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−３４）、マウス３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−９６５１）、ラットＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１７２１）等が挙げられる。
【００２６】
３．細胞周期の異常に起因する疾患の予防及び／又は治療用医薬
本発明の二本鎖ＲＮＡは、サイクリンＢの発現を抑制するものであるため、細胞周期の異常に起因すると考えられている疾患、例えば癌、自己免疫疾患、神経変性疾患、発生異常や染色体異常に基づく疾患等の予防及び／又は治療の医薬として有効である。癌としては、例えば胃癌、大腸癌、乳癌、肺癌、食道癌、前立腺癌、肝癌、腎臓癌、膀胱癌、皮膚癌、子宮癌、脳腫瘍、骨肉種、又は骨髄腫瘍等が、自己免疫疾患としては、例えば慢性関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、甲状腺炎、多発性筋炎、全身性エリテマトーデス、ベーチェット病、バセドー病等が、神経変性疾患としては、例えばアルツハイマー病やパーキンソン病等が挙げられる。また、発生異常や染色体異常に基づく疾患としては、例えば遺伝子病、配偶子病、胎芽病、胎児病流産、Ｄｏｗｎ症候群、Ｔｕｒｎｅｒ症候群等が挙げられる。上記の疾患はあくまで例示でありこれらに限定されるものではない。本発明の医薬は、上記疾患の発症を予防することを目的として、あるいは上記疾患を発症した患者に対しては症状の悪化の防止又は症状の軽減などを目的として投与することができる。
【００２７】
本発明の二本鎖ＲＮＡを医薬として用いる場合、細胞への取り込みの促進や標的細胞への指向性を高める目的で、ウイルス性又は非ウイルス性の遺伝子導入用ベクターに担持させた形態とする。ウイルス性ベクターとしては、例えばアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）ベクター、ワクシニアウイルスベクター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター等が挙げられる。また、非ウイルス性ベクターとしては、リポソーム、人工脂質ベシクル、デンドリマーなどの高分子化合物等が挙げられる。この場合、市販の導入用試薬（リポフェクチン、リポフェクトアミン、ＤＭＲＩＥ−Ｃ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｍｅｔａｆｅｃｔｅｎｅ、ＤＯＴＡＰ（ＢｉｏＴｅｘ社製）、Ｔｆｘ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）等が利用できる。また、本発明の医薬は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することもできる。
【００２８】
遺伝子治療の形態としては、標的細胞を体外に取り出して遺伝子導入を行う体外法（ｅｘ ｖｉｖｏ法）、体内に遺伝子を導入する体内法（ｉｎ ｖｉｖｏ法）があるが、本発明の医薬はいずれの治療形態にも適用される。体外法では患者由来の細胞を一旦体外で培養し、本発明の二本鎖ＲＮＡの導入処理をした後に患者に投与すればよいし、体内法では上記の遺伝子導入ベクターを直接患者体内（皮膚、筋肉、肝臓、肺など）へ投与すればよい。
【００２９】
本発明の医薬の投与形態としては、通常の静脈内、動脈内等の全身投与のほか、特に癌治療を目的とする場合は、癌原病巣に対して又は癌種に対応した予想転移部位に対して局所注射等の局所投与を行うことが好ましい。
【００３０】
本発明の医薬の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、一般に、成人では一日あたり二本鎖ＲＮＡの重量にして約 ０．１〜１００ ｍｇの範囲が適当である。
【００３１】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００３２】
（実施例１）ｓｉＲＮＡの調製
ＮＣＢＩ ＮＭ＿０３１９６６に開示されるヒトサイクリンＢ遺伝子の塩基配列（配列番号１）からＲＮＡｉの標的配列を想定し、下記表１に示すｓｉＲＮＡの候補となるＲＮＡオリゴヌレクチド（Ｃｙｃｌｉｎ Ｂ１−１〜Ｂ１−８）のセンスＲＮＡ鎖（センスｓｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ鎖（アンチセンスｓｉＲＮＡ）をそれぞれ自動ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置（株式会社日本バイオサービス社製）にて合成した。合成したオリゴヌレクオチドは通常の方法に従って逆相高速液体クロマトグラフィーにて単離精製し、ＲＮＡサンプルを得た。センスＲＮＡ鎖、アンチセンスＲＮＡ鎖をそれぞれ含む各ＲＮＡサンプルを５０μＭ（５０ｐｍｏｌ／μｌ）に希釈し、時々氷につけながらボルテックスミキサーを使い、浮遊物がなくなるまで十分に溶解した。各ＲＮＡサンプルを３０μｌと、５×アニーリングバッファー（５００ｍＭ酢酸カルシウム、１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ＰＨ７．４、１０ｍＭ 酢酸マグネシウム）１５μｌを混合した（全量７５μｌ）。溶液を９０℃で１分間加熱し、スピンダウン後に３７℃で６０分間静置した。二本鎖のＲＮＡオリゴヌクレオチドが得られた（最終濃度は２０μＭ（２０ｐｍｏｌ／μｌ））。
【００３３】
【表１】
【００３４】
（実施例２） ｓｉＲＮＡによるサイクリンＢ発現解析試験
（１）方法
トランスフェクションする１日前にヒトＨｅｌａ細胞を３．５ｃｍプレートに播いた。細胞量は２０〜５０％コンフルエントになるようにした。細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地で洗浄した後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地を８００μｌ加えた。
実施例１で調製した２０μＭのｓｉＲＮＡ（Ｃｙｃｌｉｎ Ｂ１−１〜Ｂ１−８）各１０μｌにＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地１７０μｌを加え、ｓｉＲＮＡ溶液を調製した。ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＩＮＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）４μｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地１６μｌで希釈し、室温で５分から１０分間静置し、トランスフェクション試薬を調製した。このトランスフェクション試薬に上記ｓｉＲＮＡ溶液を加え、穏やかに混合し、室温で１５〜２０分間静置した。得られたｓｉＲＮＡ−ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＩＮＥ混合液を上記培養細胞に加え（全量１ｍｌ）、軽く混合し、３７℃、５％ＣＯ２で４時間培養後、血清を３００μｌ加え、０、１、３日目にサイクリンＢ抗体による蛍光染色にて細胞内における目的遺伝子の発現を観察した。また、抗体による蛍光染色の対染色としてＤＡＰＩによる核染色も同時に行った。
【００３５】
（２）結果
図１は、ｓｉＲＮＡ導入細胞（ｓｉＲＮＡ＋）、ｓｉＲＮＡ非導入細胞（ｓｉＲＮＡ−）について、サイクリンＢ抗体による蛍光染色及びＤＡＰによる核染色を行った結果を示す。
ＣｙｃｌｉｎＢ１−５（配列番号１に記載の塩基配列の塩基番号３３１〜３４９で表される塩基配列を標的部位とするｓｉＲＮＡ）導入細胞は、１日目でサイクリンＢ抗体による蛍光染色が観察されなかった。また、同導入細胞におけるＤＡＰＩによる核染色によれば、蛍光染色が観察されない部位にも細胞が確かに存在していることがわかる。
従って、ＣｙｃｌｉｎＢ１−５導入細胞ではサイクリンＢの発現が抑制されていることが確認された。これに対し、ｓｉＲＮＡ非導入細胞（ｓｉＲＮＡ−）、ＣｙｃｌｉｎＢ１−７（配列番号１に記載の塩基配列の塩基番号４３１〜４４９で表される塩基配列を標的部位とするｓｉＲＮＡ）導入細胞は、サイクリンＢ抗体による蛍光染色が観察され、サイクリンＢの発現が認められた。従って、ＣｙｃｌｉｎＢ１−５はサイクリンＢ発現の抑制効果があるが、ＣｙｃｌｉｎＢ１−７はその抑制効果がないといえる。また、ＣｙｃｌｉｎＢ１−１， １−２， １−３， １−４， １−６， １−８導入細胞についてもＣｙｃｌｉｎＢ１−７導入細胞同様にサイクリンＢの発現が認められ、サイクリンＢの発現抑制効果がないことを確認した。
【００３６】
図２は、時系列（０日目、１日目、３日目）における細胞数の増加状況を示す。図２で、コントロール（ｓｉＲＮＡ非導入細胞）は、時間が経過しても２Ｎ（Ｇ１）（以下Ｇ１期と呼ぶ）における細胞数が増加し、４Ｎ（Ｇ２／Ｍ）（以下Ｇ２／Ｍ期と呼ぶ）において減少した。これに対して、ｓｉＲＮＡ（Ｃｙｃｌｉｎ Ｂ１−５）導入細胞細胞は、０日目ではコントロールと同じ細胞数の増減（増減形態が同じ）になっているが、１日目、３日目になるにつれて、コントロールとは逆に、Ｇ１期における細胞数が減少し、逆にＧ２／Ｍ期における細胞数が増加した。これは、１日目、３日目ではＧ２／Ｍ期の本来の処理が行われず、細胞が蓄積している状態、つまり細胞周期が停止状態になっていると考えられる。
【００３７】
【発明の効果】
本発明によれば、ＲＮＡインターフェアレンス（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；ＲＮＡｉ）によって細胞周期に関与するサイクリンＢ遺伝子の発現を抑制することのできる二本鎖ＲＮＡオリゴヌクオチドが提供される。本発明の二本鎖ＲＮＡオリゴヌクオチドは、サイクリンＢの発現を有意に抑制できるので、細胞周期の異常に起因する疾患、代表的には癌の予防及び／又は治療のための医薬として有用である。
【００３８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ｓｉＲＮＡ処理細胞（ｓｉＲＮＡ＋）、ｓｉＲＮＡ未処理細胞（ｓｉＲＮＡ−）について、サイクリンＢ抗体による蛍光染色及びＤＡＰによる核染色を行った結果を示す。
【図２】時系列（０日目、１日目、３日目）における細胞数の増加状況を示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a double-stranded RNA oligonucleotide capable of suppressing the expression of a cyclin B gene involved in the cell cycle by RNA interference (RNAi), an expression vector containing the oligonucleotide, and an abnormality in the cell cycle. The present invention relates to a medicament for prevention and / or treatment of a disease caused by.
[0002]
[Prior art]
The cell cycle consists of an S phase for DNA replication, an M phase for division, and a preparatory phase of G. 1 , G 2 Period. Cyclin B is one of the cyclins that are proteins involved in cell cycle progression. There are eight types of cyclins known from A to H, but G 1 G related to / S phase 1 Cyclin (G 1 cyclin), G 2 Those involved in the / M phase are called mitotic cyclins, each of which binds to and activates a specific cyclin-dependent protein kinase (cdk), and has a function of promoting the cell cycle. In recent studies, in mammalian cells, cyclin D / cdk4 / 6, cyclin E / cdk2, cyclin A / cdk2, cyclin B / cdc2 are activated in turn, and these cyclin / cdk complexes are central to cell cycle progression. It was revealed to have a role. Regulation of the progression of the cell cycle is performed by various factors regulating the activity of these cyclin / cdk complex. In addition, it detects a defect in genetic information and stops the cell cycle before the mitotic phase (M phase). 2 The / M checkpoint is performed by suppressing an increase in cyclin B · cdc2 activity. Tumor development is thought to be caused by abnormalities in the cell cycle caused by the overexpression of cyclin B. The sequence of the gene encoding human cyclin B has already been published (NCBI NM_031966), but the regulatory sequence that suppresses its expression has not been identified.
[0003]
On the other hand, an RNA interference (RNAi) method is known as a method for suppressing the expression of a specific gene in an individual or cultured cells of a multicellular organism. RNAi refers to a phenomenon in which RNA introduced into a cell suppresses the expression of a gene having the same nucleotide sequence as the RNA. It suppresses expression by disrupting the target gene (mRNA), and is used for gene function analysis. It is attracting attention as an effective method. The inhibitory effect of double-stranded RNA (dsRNA) is greater than that of single-stranded RNA, and it has been confirmed that the RNAi effect is effective in exons, not in promoters or introns. RNAi was discovered in C. elegans in 1986 (Fire, A., et al., Nature, 391, 806-811, 1998), followed by Drosophila (Kannadell, JR, et al., Et al.). Cell, 95, 1017-1026, 1998), zebrafish (Wargelius, A., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 263, 156-161, 1999), Arabidopsis (P. M.). Natl. Acad. Sci. USA., 95, 13959-13964, 1998), trypanosomes (Ngo, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US). , 95, 14687-14692, 1998), Hydra (Lohmann, JU, et al., Dev. Biol., 214, 211-214, 1999), Planaria (Sanchez Alvarado, et al., Proc. Natl.). Acad.Sci.USA., 96, 5049-5054, 1999). RNAi was initially discovered in mammalian cells. When dsRNA of about 30 bp or more was introduced into mammalian cells, apoptosis was caused by the inherent immune function of the cells and the cells died. Has been considered difficult. However, recently, it has been shown that RNAi can occur in mouse early embryos and cultured mammalian cells, and it has been found that the RNAi induction mechanism itself exists in mammalian cells (see Non-Patent Document 1). Subsequently, it was shown that shorter (21-23 bp) dsRNA (small interfering RNA; siRNA) can induce RNAi without showing cytotoxicity even in mammalian cell lines (see Non-Patent Document 2). The principle of gene silencing by RNAi is that siRNA introduced into cells binds to a multi-protein complex to form RISC (RNA-induced silencing complex), and this siRNA-protein complex is combined with the siRNA. It binds to mRNA having homology and the expression of the target gene is suppressed as a result of cleavage of the siRNA-mRNA binding site by RISC nuclease activity.
[0004]
The antisense method is also a method of suppressing gene expression, in which RNA (antisense RNA) or DNA complementary to mRNA of a target gene is introduced into cells, and transcription and translation are performed by binding to the mRNA. The principle is to inhibit. In the antisense method, since the gene expression is suppressed by hybridizing an oligonucleotide having a sequence complementary to a certain region of the mRNA of the target gene, the single strand of the original mRNA is preserved, and Is released for some reason, the suppression is released. In contrast, the RNAi method suppresses gene expression in a sequence-specific manner by degrading (cleaving) a homologous portion of the mRNA of the target gene, so that the original mRNA is not single-stranded and the degree of suppression is high. Moreover, the RNAi method is advantageous in that it can be controlled with a short sequence (usually 21 to 23 bases in the case of dsRNA), so that the molecular design can be made much easier than in the antisense method. However, selection of a double-stranded RNA that can significantly disrupt the expression of a target gene has no established method for predicting this in advance, and is a major obstacle in gene expression suppression technology by the RNAi method. For example, find the first AA at least 75 bases downstream from the start codon, search for and select a sequence that follows the AA and has a GC content of around 50%, and confirm that the sequence is specific for the target gene. Some methods for selecting double-stranded RNA, such as a method (http://www.fasmac.co.jp/sirna2.html) of confirming and experimentally confirming whether or not the expression of the target gene is actually suppressed. Attempts have been made. However, the situation differs depending on the target gene of interest, and in the end, the current situation is that selection is performed by trial and error.
[0005]
[Non-patent document 1]
Ui-Tei, K .; , Et al. , FEBS Lett. , 479, 79-82, 2000
[Non-patent document 2]
Elbashir SM, et al. , Nature, 411, 494-498, 2001.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a double-stranded RNA capable of sequence-specifically suppressing the expression of a cyclin B gene involved in the cell cycle when introduced into a cell. A further object of the present invention is to provide a medicament for various diseases caused by abnormalities in the cell cycle.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, identified a site targeted for destruction (decomposition) by RNAi in the cyclin B gene sequence, and identified a nucleotide sequence homologous to the nucleotide sequence of this site. When the resulting double-stranded RNA oligonucleotide was synthesized and introduced into cells, it was confirmed that cyclin B was not expressed. The present invention has been completed based on such findings.
[0008]
That is, the present invention includes the following inventions.
(1) A double-stranded RNA oligonucleotide comprising a base sequence homologous to the base sequence represented by base numbers 331 to 349 of the base sequence described in SEQ ID NO: 1.
(2) The double-stranded RNA oligonucleotide according to (1), which has a length of 30 bases or less.
(3) An expression vector containing the double-stranded RNA oligonucleotide of the above (1).
(4) A medicament for preventing and / or treating a disease caused by a cell cycle abnormality, comprising the double-stranded RNA oligonucleotide of (1) as an active ingredient.
(5) The medicament according to the above (4), wherein the disease caused by an abnormality in the cell cycle is a disease selected from the group consisting of cancer, an autoimmune disease, a neurodegenerative disease, and a disease based on a developmental abnormality or a chromosomal abnormality.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0009]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
1. Double-stranded RNA oligonucleotide
The “double-stranded RNA oligonucleotide” (hereinafter sometimes simply referred to as “double-stranded RNA”) of the present invention is a nucleotide sequence homologous to the nucleotide sequence of a target site of destruction (decomposition) by RNAi in the cyclin B gene sequence. And comprises a sense RNA strand and an antisense RNA strand. The strand having a sequence homologous to the base sequence of the target site may be either a sense RNA strand or an antisense RNA strand, but is usually a sense RNA strand, and the antisense RNA strand is complementary to the sense RNA strand. It is.
Here, “homology” means that T (thymine) is completely identical except that it is U (uracil).
[0010]
In the present invention, the determination of the target site of destruction (decomposition) by RNAi in the cyclin B gene sequence is performed based on the registered cyclin B gene sequence information, which is a candidate double-stranded RNA oligonucleotide of 20 to 25 bases ( This is performed by designing several small interfering RNAs (siRNAs) and examining the suppression of cyclin B gene expression by these siRNAs. Specifically, the siRNA is added to a transcription / translation system in which a gene encoding cyclin B is present to examine the suppression of expression of cyclin B, or is added to a system in which mRNA corresponding to the gene encoding cyclin B is present. The suppression of cyclin B expression is examined by adding siRNA. The nucleotide sequence of the cyclin B gene is already known. For example, for human cyclin B, the sequence information of NCBI NM_031966 can be used.
[0011]
The design of siRNA differs depending on the target gene. For example, see http: // fasmac. co. jp / sirna3. html, http: // www. qbiogene. com / products / transfection / app-sirna. http: // www. mpibpc. gwdg. de / abteilungen / 100/105 / sirna. html, http: // www. ambion. com / techlib / misc / siRNA_design. html can be referred to.
[0012]
The general method of designing siRNA reported so far is to find the first AA at least 75 bases downstream from the start codon, search for and select a sequence following the AA and having a GC content of about 50%, It comprises the steps of confirming that the sequence is specific for the target gene and experimentally confirming whether or not the expression of the target gene is actually suppressed.
To confirm that the gene is specific to the target gene, the nucleotide sequence of the potential target site, that is, the selected siRNA nucleotide sequence is compared with a database (human, mouse, rat, etc.), and any other gene is identified. And confirm that they have no significant homology. Homology searches are available, for example, at www. ncbi. nlm. nhi. gov / BLAST / can be used.
[0013]
However, according to the general method described above, in the cyclin B gene, which is the subject of the present invention, as a starting point following AA, positions 278, 285, 297, 305, and 327 in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 Sequences originating from many bases such as bases are candidates. Therefore, it is necessary to repeat trial and error to narrow down by actually performing cell biological experiments on whether or not the protein is expressed in the cells from these candidates.
[0014]
It is also preferable to include a suitable negative control siRNA for a complete siRNA experiment. As the negative control siRNA, an oligonucleotide having the same base composition as the set siRNA but having no significant sequence homology to the genome is used. Typically, the design is performed by rearranging the nucleotide sequence of siRNA at random and performing homology search to confirm that there is no homology to any other gene.
[0015]
The double-stranded RNA of the present invention designed as described above has a base sequence homologous to the base sequence represented by base numbers 331 to 349 of the base sequence described in SEQ ID NO: 1 (5′-GTCAGTTGACACACTGCAGGG-3 ′). An oligonucleotide containing a sequence.
[0016]
An arbitrary base may be added to the double-stranded RNA of the present invention as long as it contains at least the above-mentioned sequence consisting of 19 bases. However, the length is preferably 30 bases or less, preferably 25 bases or less, and more preferably 23 bases or less, from the viewpoint of simplicity of drug discovery or stability when administered in vivo.
[0017]
At least one strand constituting the double-stranded RNA of the present invention has a 3 'overhang (typically, TT) of 1 to 6 bases, preferably 1 to 5 bases, more preferably 2 to 4 bases.
[0018]
The double-stranded RNA of the present invention can be prepared by synthesizing RNA oligonucleotides (sense RNA strand, antisense strand) based on the base sequence of the siRNA designed above and annealing them. The synthesis of the sense RNA strand and the antisense RNA strand constituting the double-stranded RNA can be performed by a general method using, for example, a commercially available automatic DNA / RNA synthesizer. Examples of the synthesis method include a phosphoramidite method, a hydrogenphosphonate method, a phosphorothioate method, and a phosphotriester method. In addition, purification of the synthesized RNA chain can be performed according to a conventional method, and for example, a method using ordinary high performance liquid chromatography, polyacrylamide gel electrophoresis, solvent extraction, salting out, or the like can be appropriately employed.
[0019]
Annealing is performed by dissolving a pair of synthesized RNA strands (sense RNA strand and antisense strand) in an annealing buffer for dsRNA, mixing equal amounts (equal number of moles), and heating to a temperature at which the double strand dissociates. This is done by gradual cooling and incubation. Examples of annealing conditions include, for example, standing at 90 ° C. for 1 minute, followed by standing at 37 ° C. for 1 hour. Then, phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation are performed.
[0020]
The double-stranded RNA oligonucleotide of the present invention can also be obtained by a recombinant method using Escherichia coli or the like. Specifically, a DNA fragment is prepared by ligating a DNA fragment serving as a template of the RNA strand of the present invention under the control of an appropriate promoter for RNA transcription in E. coli. After transforming Escherichia coli with the recombinant vector containing and culturing the RNA, and performing transcription of the RNA, double-stranded RNA is obtained from the cells.
[0021]
2. Double-stranded RNA oligonucleotide expression vector
The double-stranded RNA oligonucleotide of the present invention can also be produced in target cells by inserting it into an appropriate expression vector.
Examples of vectors that can be used as the present expression vector include plasmid DNA, cosmid DNA, bacterial artificial chromosome (BAC) DNA, retrotransposon DNA, yeast artificial chromosome (YAC) DNA, P1 phage-derived artificial chromosome (PAC) DNA, and the like. However, a particularly short pUC-type plasmid (for example, about 1 to 3 kbp) is preferable.
[0022]
A promoter and / or other control sequences may be operably linked and inserted into the vector. The term "functionally linked and inserted" means that the above-mentioned double-stranded RNA is expressed under the control of a promoter and / or other regulatory sequences in a target cell into which the vector is introduced, and the endogenous cyclin This means that a promoter and / or other regulatory sequences are ligated and integrated into a vector so that the mRNA at the target site in the B gene is destroyed (degraded). The promoter and / or control sequence that can be incorporated into the vector is not particularly limited, and promoters known in the art such as a constitutive promoter, a tissue-specific promoter, a stage-specific promoter, and other regulatory elements. And / or the control sequence can be appropriately selected depending on the target cell to be introduced. The appropriate promoter used in the above is not particularly limited as long as the RNA is transcribed in the introduced cell, but is preferably a Tet-inducible promoter capable of inducing expression only under specific conditions. Promoters (manufactured by CLONTECH), Ecdysone inducible promoters (manufactured by Invitrogen), IPTG inducible promoters (manufactured by STRATAGENE) and the like.
When the expression vector prepared as described above is introduced into a target cell, siRNA is expressed, and destruction (degradation) of the cyclin B gene by RNAi proceeds.
[0023]
Methods for introducing the double-stranded RNA or the double-stranded RNA expression vector obtained by the above method into target cells include, for example, the calcium phosphate method, the DEAE-dextran method, the electroporation method, the virus method, and the HVJ-liposome method. Lipofection method, particle gun method and the like are used. Since the efficiency of RNA introduction varies depending on the type of cell, it is necessary to optimize the transfection reagent, the amount of RNA, the cell density, and the introduction time for each cell.
[0024]
The target cells into which the double-stranded RNA or the double-stranded RNA expression vector has been introduced are cultured under the same conditions as in ordinary cell culture. In the cells into which the double-stranded RNA expression vector has been introduced, the promoter introduced during the culture is activated as necessary. The activation can be performed by a commonly used method suitable for each promoter. The culture is performed under conditions suitable for the cells used, and the culture is performed for a time during which a sufficient amount of double-stranded RNA introduced into the cells is transcribed.
[0025]
The expression analysis of the cyclin B gene in the target cell into which the double-stranded RNA or the double-stranded RNA expression vector has been introduced can be performed by immunofluorescence staining with an antibody, Northern blotting, RT-PCR, in situ hybridization, or the like. it can.
Here, cultured cells derived from mammals are suitably used as the target cells. Specifically, human HeLa cells (ATCC: CCL-2), human 293 cells (ATCC: CRL-1573), mouse L cells (ATCC: CCl-1), African green monkey COS cells (ATCC: CRL-1651), Dog MDCK cells (ATCC: CCL-34), mouse 3T3 cells (ATCC: CRL-9651), rat PC12 cells (ATCC: CRL-1721) and the like.
[0026]
3. Preventive and / or therapeutic drug for diseases caused by abnormal cell cycle
Since the double-stranded RNA of the present invention suppresses the expression of cyclin B, diseases considered to be caused by abnormalities in the cell cycle, such as cancer, autoimmune diseases, neurodegenerative diseases, developmental abnormalities, and chromosomal abnormalities It is effective as a medicament for prevention and / or treatment of diseases and the like based on. Examples of the cancer include gastric cancer, colon cancer, breast cancer, lung cancer, esophageal cancer, prostate cancer, liver cancer, kidney cancer, bladder cancer, skin cancer, uterine cancer, brain tumor, osteosarcoma, or bone marrow tumor, and the like. For example, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, myasthenia gravis, thyroiditis, polymyositis, systemic lupus erythematosus, Behcet's disease, Basedow's disease and the like, and examples of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease and Parkinson's disease Can be Examples of diseases based on abnormal development or chromosomal abnormality include, for example, genetic disease, gamete disease, embryo disease, fetal disease abortion, Down syndrome, Turner syndrome, and the like. The above-mentioned diseases are only examples and the present invention is not limited thereto. The medicament of the present invention can be administered for the purpose of preventing the onset of the above-mentioned disease, or for patients who have developed the above-mentioned disease, for the purpose of preventing the worsening of the symptoms or alleviating the symptoms.
[0027]
When the double-stranded RNA of the present invention is used as a medicine, the double-stranded RNA is carried on a viral or non-viral gene transfer vector for the purpose of promoting its uptake into cells and enhancing its directivity to target cells. Examples of the viral vector include an adenovirus vector, a retrovirus vector, a lentivirus vector, an AAV (adeno-associated virus) vector, a vaccinia virus vector, a human immunodeficiency virus (HIV) vector, and a herpes virus vector. Examples of the non-viral vector include liposomes, artificial lipid vesicles, and high molecular compounds such as dendrimers. In this case, commercially available introduction reagents (Lipofectin, Lipofectamine, DMRIE-C (manufactured by Invitrogen), Metafectene, DOTAP (manufactured by BioTex), Tfx reagent (manufactured by Promega), etc. can be used. Pharmaceuticals are used for various preparations such as ordinary pharmaceutically acceptable carriers, binders, stabilizers, excipients, diluents, pH buffers, disintegrants, solubilizers, solubilizers, isotonic agents and the like. Blended components can also be added.
[0028]
Examples of the form of gene therapy include an extracorporeal method (ex vivo method) in which a target cell is taken out of the body to introduce a gene, and an in vivo method (in vivo method) of introducing a gene into the body. It also applies to forms of treatment. In the in vitro method, the cells derived from the patient may be once cultured outside the body and then administered to the patient after the treatment of introducing the double-stranded RNA of the present invention. In the in vivo method, the above gene transfer vector may be directly injected into the patient (skin, Muscle, liver, lungs, etc.).
[0029]
The administration form of the medicament of the present invention includes systemic administration such as ordinary intravenous and intraarterial administration, and particularly, for the purpose of cancer treatment, to a tumor origin lesion or a predicted metastatic site corresponding to a cancer type. On the other hand, it is preferable to perform local administration such as local injection.
[0030]
The dosage of the medicament of the present invention varies depending on age, sex, symptoms, administration route, administration frequency, and dosage form. In general, in adults, about 0.1 to 100 mg per day of double-stranded RNA is used in weight. The range is appropriate.
[0031]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
[0032]
(Example 1) Preparation of siRNA
Assuming a target sequence of RNAi from the base sequence of human cyclin B gene (SEQ ID NO: 1) disclosed in NCBI NM_031966, RNA oligonucleotides (Cyclin B1-1 to B1-8) which are siRNA candidates shown in Table 1 below are assumed. A sense RNA strand (sense siRNA) and an antisense RNA strand (antisense siRNA) were synthesized using an automatic DNA / RNA synthesizer (manufactured by Nippon Bioservice Co., Ltd.). The synthesized oligonucleotide was isolated and purified by reversed-phase high performance liquid chromatography according to a conventional method to obtain an RNA sample. Each RNA sample containing each of the sense RNA strand and the antisense RNA strand was diluted to 50 μM (50 pmol / μl), and thoroughly dissolved using a vortex mixer while occasionally immersing on ice until the suspended matter disappeared. 30 μl of each RNA sample was mixed with 15 μl of 5 × annealing buffer (500 mM calcium acetate, 150 mM HEPES-KOH PH7.4, 10 mM magnesium acetate) (total volume 75 μl). The solution was heated at 90 ° C. for 1 minute and allowed to stand at 37 ° C. for 60 minutes after spin down. A double-stranded RNA oligonucleotide was obtained (final concentration 20 μM (20 pmol / μl)).
[0033]
[Table 1]
[0034]
(Example 2) Cyclin B expression analysis test using siRNA
(1) Method
One day before transfection, human Hela cells were seeded on 3.5 cm plates. The cell volume was 20-50% confluent. After washing the cells with Opti-MEM medium, 800 μl of Opti-MEM medium was added.
170 μl of Opti-MEM medium was added to each 10 μl of the 20 μM siRNA (Cyclin B1-1 to B1-8) prepared in Example 1 to prepare an siRNA solution. 4 μl of OLIGOFECTAMINE (manufactured by Invitrogen) was diluted with 16 μl of Opti-MEM medium and allowed to stand at room temperature for 5 to 10 minutes to prepare a transfection reagent. The siRNA solution was added to the transfection reagent, mixed gently, and allowed to stand at room temperature for 15 to 20 minutes. The obtained siRNA-OLIGOFECTAMINE mixture was added to the above cultured cells (total volume: 1 ml), mixed gently, and heated at 37 ° C., 5% CO 2. 2 After 4 hours, 300 μl of serum was added, and on days 0, 1, and 3, expression of the target gene in the cells was observed by fluorescent staining with a cyclin B antibody. Nuclear staining with DAPI was also performed simultaneously as a counterstain for fluorescent staining with the antibody.
[0035]
(2) Result
FIG. 1 shows the results of fluorescent staining with a cyclin B antibody and nuclear staining with DAP for cells into which siRNA has been introduced (siRNA +) and cells to which siRNA has not been introduced (siRNA-).
CyclinB1-5 (siRNA having a base sequence represented by base numbers 331 to 349 of the base sequence described in SEQ ID NO: 1 as a target site) -transfected cells did not show fluorescence staining with cyclin B antibody on the first day . In addition, according to the nuclear staining with DAPI in the transfected cells, it can be seen that the cells certainly exist at the site where no fluorescent staining is observed.
Therefore, it was confirmed that the expression of cyclin B was suppressed in CyclinB1-5-transfected cells. On the other hand, cells into which siRNA has not been introduced (siRNA-) and cells into which CyclinB1-7 (siRNA having the base sequence represented by base numbers 431 to 449 of the base sequence of SEQ ID NO: 1 as a target site) have been introduced are cyclin B Fluorescent staining with the antibody was observed, and cyclin B expression was observed. Therefore, it can be said that CyclinB1-5 has an inhibitory effect on cyclin B expression, but CyclinB1-7 has no inhibitory effect. Cyclin B1-1, 1-2, 1-3, 1-4, 1-6, and 1-8 transfected cells also showed cyclin B expression similarly to Cyclin B1-7 transfected cells, and the effect of suppressing cyclin B expression. Confirmed that there is no.
[0036]
FIG. 2 shows an increase in the number of cells in a time series (day 0, day 1, day 3). In FIG. 2, the number of cells in 2N (G1) (hereinafter, referred to as G1 phase) increases in the control (cells into which siRNA has not been introduced) over time, and the number of cells in 4N (G2 / M) (hereinafter, G2 / M phase) increases. Call). On the other hand, in the cells introduced with siRNA (Cyclin B1-5), the number of cells increased / decreased on the 0th day (the same increase / decrease morphology) as on the control, but as the day and the 3rd day progressed, Contrary to the control, the number of cells in the G1 phase decreased, and conversely, the number of cells in the G2 / M phase increased. This is considered that the original processing in the G2 / M phase was not performed on the first and third days, and cells were accumulated, that is, the cell cycle was stopped.
[0037]
【The invention's effect】
According to the present invention, there is provided a double-stranded RNA oligonucleotide capable of suppressing the expression of a cyclin B gene involved in the cell cycle by RNA interference (RNAi). Since the double-stranded RNA oligonucleotide of the present invention can significantly suppress the expression of cyclin B, it is useful as a medicament for preventing and / or treating diseases caused by abnormal cell cycles, typically cancer.
[0038]
[Sequence list]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the results of fluorescent staining with a cyclin B antibody and nuclear staining with DAP for cells treated with siRNA (siRNA +) and cells not treated with siRNA (siRNA-).
FIG. 2 shows the increase in the number of cells in a time series (day 0, day 1, day 3).
