JP2004261001A

JP2004261001A - New lipase

Info

Publication number: JP2004261001A
Application number: JP18708999A
Authority: JP
Inventors: Keizo Inoue; 圭三井上; Hiroyoshi Arai; 洋由新井; Atsuyoshi Aoki; 淳賢青木
Original assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1999-06-30
Filing date: 1999-06-30
Publication date: 2004-09-24

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a new PLA<SB>1</SB>(phospholipase A<SB>1</SB>) and a peptide or a polypeptide derived from the new PLA<SB>1</SB>, to provide a polynucleotide encoding the peptide or polypeptide derived from the new PLA<SB>1</SB>, to provide a method for producing the peptide or polypeptide derived from the new PLA<SB>1</SB>, to provide an antibody to the peptide or polypeptide derived from the new PLA<SB>1</SB>, further to identify an inhibitor/an antagonist/an activator of actions possessed by the new PLA<SB>1</SB>utilizing the same and to provide the identified compound and a medicinal composition/a diagnostic method utilizing the same. <P>SOLUTION: The polypeptide having a specific amino acid sequence or a polypeptide having at least about ≥40% homology to the amino acid sequence and an activity of degrading phosphatidic acid is provided. The polynucleotide encoding the polypeptide or its complementary chain is provided. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規なリパーゼ、特にホスフォリパーゼＡ_１（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅＡ_１；以下ＰＬＡ_１と呼ぶこともある）に関するものである。さらに詳しくは、新規ＰＬＡ_１のアミノ酸配列の全部または一部を有するペプチドまたはポリペプチド、該ペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、該組換えベクターで形質転換された形質転換体、該形質転換体を使ったペプチドまたはポリペプチドの製造方法、該ペプチドまたはポリペプチドに対する抗体、これらを利用した化合物の同定方法、該同定された化合物、該ポリペプチド若しくは該ポリヌクレオチドに作用する活性阻害化合物または活性賦活化合物、これらに関係する医薬組成物、およびこれらに関係する疾病診断方法に関係する。
【０００２】
【従来の技術】
ＰＬＡ_１は、グリセロリン脂質のグリセロール１位のエステル結合を加水分解する酵素である。これまでに様々な臓器で、この酵素活性の存在が検出されており、また基質特異性により区別されるいくつかのＰＬＡ_１が報告されている。ｃＤＮＡクロ−ニングされているものとしては、蜂毒のＰＬＡ_１（Ｄｏｌｍ１）、ＰＳ−ＰＬＡ_１〔ホスファチジルセリン（ＰＳ）およびリゾホスファチジルセリン（ｌｙｓｏＰＳ）のグリセロールの１位のエステル結合を特異的に加水分解する（特開平１０−２０１４７９号）（蛋白質核酸酵素，４４，１０３８−１０４２，１９９９）〕、ヒト精巣のＰＡ−ＰＬＡ_１〔ホスファチジン酸（ＰＡ）のグリセロールの１位のエステル結合を特異的に加水分解する（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，５４６８−５４７７，１９９８）〕等がある。また、リパーゼファミリーの分子は、しばしばトリアシルグリセロールを分解する活性以外に、ＰＬＡ_１活性を併せ持つことが知られている（ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ，３２０，１４５−１４９，１９９３）（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，４７０２−４７０７，１９９３）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，２１９２−２１９８，１９９７）。さらに、これまでに見つかっている、リパーゼファミリーに属するＰＬＡ_１は、全て、短いリッド（Ｌｉｄ）（Ｂ．Ｂ．Ａ．，１３７６，４１７−４３２，１９９８）（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，４７０２−４７０７，１９９３）を有するが、その生理的意義は必ずしも明らかになっていない。また、リパーゼ分子上の糖鎖がリパーゼ活性に関与する可能性が示唆されている（Ｊ．ＬｉｐｉｄＲｅｓ．，３５，１５１１−１５２３，１９９４）（Ｊ．ＬｉｐｉｄＲｅｓ．，３６，９３９−９５１，１９９５）。
【０００３】
ＰＬＡ_１の機能の一つに、リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）を分解する作用があるが、生成物のひとつであるリゾホスファチジン酸（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃａｃｉｄ；以下ＬＰＡと略称することもある）（Ｂ．Ｂ．Ａ．，１１９８，１８５−１９６，１９９４）には多くの生理活性が知られており、生物学的有用性において着目されている〔細胞工学，１７，（５），７３９−７４５，１９９８〕。ＬＰＡの主要な作用としては、血圧の上昇作用（Ｌｉｐｉｄｓ，１３，５７２−５７４，１９７８）、血小板凝集作用（Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，９６，４２３−４３８，１９７９）、細胞増殖促進作用（Ｃｅｌｌ，５９，４５−５４，１９８９）があり、またこれら以外にも、ガン細胞の浸潤促進、細胞接着、ストレスファイバーの形成、化学走性誘発、神経突起の退縮、アポトーシスの抑制、創傷治癒への関連等多様な作用が報告されている（Ｂ．Ｂ．Ａ．，１１９８，１８５−１９６，１９９４）。
【０００４】
ホスファチジン酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃａｃｉｄ；以下、ＰＡと略称することもある）に対して特異性を持つＰＬＡ_１としては、ヒト精巣ＰＡ−ＰＬＡ_１が知られており、ｃＤＮＡもクローニングされているが、本酵素は細胞内の酵素であり、リン脂質代謝の中心であるホスファチジン酸のｓｎ−１位の脂肪酸の代謝回転を決定する因子として捉えられている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，５４６８−５４７７，１９９８）。また、ヒト精巣ＰＡ−ＰＬＡ_１は反応条件によっては、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）も加水分解することが報告されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題のひとつは、上記のように多様な、ある局面においてはむしろ悪益な作用の原因物質となりうるＬＰＡの産生触媒たるＰＬＡ_１に関する新規な物質を見いだし、生体内におけるＬＰＡの制御を可能にすることである。より具体的には、本発明の課題は新規な特性をもつ新規ＰＬＡ_１を提供することであり、それに伴い有用性ある新規ＰＬＡ_１由来のペプチドまたはポリペプチドを提供することである。また本発明の別の課題は、新規ＰＬＡ_１由来のペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供し、遺伝子工学手法による、新規ＰＬＡ_１由来のペプチドまたはポリペプチドの製造法を提供することである。さらに本発明の別の課題は、新規ＰＬＡ_１由来のペプチドまたはポリペプチドに対する抗体を提供することである。その他の本発明の課題は、上記のものを利用して新規ＰＬＡ_１の有する作用の阻害剤・拮抗剤・賦活剤の同定をおこなうことであり、同定された化合物を提供することであり、またこれらを利用した医薬組成物・診断方法を提供することである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
（新規ＰＬＡ_１）
本発明において提供される新規ＰＬＡ_１は、ｃＤＮＡライブラリーから、新規なアミノ酸配列を有する物質としてそのｃＤＮＡが取得されたものである。そして、本発明から成る新規ＰＬＡ_１は、ヒトの肺、腎臓、膵臓、前立腺、睾丸、卵巣、結腸において、その存在がノザンブロッティング法によって確認された。本発明からなる新規ＰＬＡ_１の性質は以下である。リン脂質、特にホスファチジン酸に作用してＬＰＡを生成する。基質特異性として、ＰＡに対して高い特異的活性をもつ。リパーゼファミリーに保存されるコンセンサス配列および触媒トライアドならびにリッドと考えられるアミノ酸を有する。また、既知ＰＬＡ_１類との相同性は約４０％未満である。
【０００７】
（ポリペプチドまたはペプチド）
本発明の新規ＰＬＡ_１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１に示すポリペプチドである。さらに本発明のポリペプチドまたはペプチドは、該配列表の配列番号１に示すポリペプチドの少なくとも一部分を含有するポリペプチドまたはペプチドから選択される。その選択されるポリペプチドまたはペプチドは、配列表の配列番号１に示すポリペプチドと、アミノ酸配列上で約４０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％、特に好ましくは約９５％以上の相同性を有する。この相同性をもつポリペプチドまたはペプチドの選択は、リン脂質、特にホスファチジン酸を分解しうる活性および／またはホスファチジン酸に対する基質特異性の存在を指標にして可能である（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１０３，４４２−４４７，１９８８）（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１７，１２８０−１２８７，１９９５）（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，５３−６１，１９８７）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３５，２５９５−２５９９，１９６０）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，２１９２−２１９８，１９９７）。なお、配列表の配列番号１において、Ｍ（Ｍｅｔ）１−Ｅ（Ｇｌｕ）１９はシグナル配列であると推定される。シグナル配列は本発明のペプチド等を分泌する限りにおいては該配列に限定されず、例えば、別の蛋白質由来のシグナルペプチドでもよい。また、シグナルペプチドの有無に拘わらず本発明の範囲に包含される。
【０００８】
アミノ酸配列の相同性を決定する技術は、自体公知であり、例えばアミノ酸配列を直接決定する方法、ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を決定後これにコードされるアミノ酸配列を推定する方法等が可能である。
【０００９】
本発明のポリペプチドまたはペプチドは、配列表の配列番号１に示すポリペプチドの部分配列を有するポリペプチドまたはペプチドを包含し、これらは例えば試薬・標準物質・免疫原として利用できる。その最小単位としては８個以上のアミノ酸、好ましくは１０個以上のアミノ酸、より好ましくは１２個以上、さらに好ましくは１５個以上の連続するアミノ酸で構成されるアミノ酸配列からなり、好ましくは免疫学的に同定しうるポリペプチドまたはペプチドを本発明の対象とする。これらのペプチドは、試薬もしくは標準物質、または後述するように新規ＰＬＡ_１に特異的な抗体を作製するための抗原として単独またはキャリア（例えば、キーホールリンペイトヘモシアニンまたは卵白アルブミン）と結合して使用できるが、これらのように別種の蛋白質または物質を結合したものも本発明の範囲に包含される。
【００１０】
さらに、このように特定されたポリペプチドまたはペプチドを元にして、リン脂質、特にホスファチジン酸を分解しうる活性および／またはホスファチジン酸に対する基質特異性の存在を指標とすることにより、１以上、例えば１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個で特に好ましくは１ないし数個のアミノ酸の欠失・置換・付加あるいは挿入といった変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはペプチドも提供される。欠失・置換・付加あるいは挿入の手段は自体公知であり、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはポリメラーゼ連鎖増幅法（ＰＣＲ）を単独または適宜組み合わせて、例えばサムブルック等編［モレキュラークローニング，アラボラトリーマニュアル第２版］コールドスプリングハーバーラボラトリー，１９８９、村松正實編［ラボマニュアル遺伝子工学］丸善株式会社，１９８８、エールリッヒ，ＨＥ．編［ＰＣＲテクノロジー，ＤＮＡ増幅の原理と応用］ストックトンプレス，１９８９等の成書に記載の方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、例えばＵｌｍｅｒの技術（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１９，６６６，１９８３）を利用することが出来る。
【００１１】
上記のような変異の導入において、当該蛋白質の基本的な性質（物性、活性、または免疫学的活性等）を変化させないという観点からは、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸等）の間での相互置換は容易に想定される。後述するように、リパーゼファミリーのコンセンサス配列およびリッド領域は活性の発現または調節に重要と考えられ、これらを含有する領域、特に触媒トライアドを含むコンセンサス配列は一次配列上および／または立体構造上保持されていることがＰＬＡ_１活性、特にＰＡ−ＰＬＡ_１活性を維持するためには好ましい。また糖鎖の有無に拘わらず本発明の範囲に包含されるが、糖鎖が活性に影響する可能性もあるため、少なくとも１つのグリコシレーションサイトは保持されていることが好ましい。
【００１２】
本発明においては、配列表の配列番号１のアミノ酸配列で示されるポリペプチドと同様のＰＬＡ_１活性を有するポリペプチドまたはその最小活性単位（領域もしくはドメイン）も提供されるが、それら以外にも、活性の強度または基質特異性の変更したポリペプチドが提供される。これらは、例えばＰＬＡ_１活性様物質もしくはＰＬＡ_１拮抗物質として、またはＰＬＡ_１活性を調節する物質のスクリーニング等において有用である。なお、ヒト以外の動物種の相同遺伝子産物も当然本発明の範囲に包含される。
【００１３】
さらに、本発明のポリペプチド等の検出もしくは精製を容易にするために、または別の機能を付加するために、Ｎ末端側やＣ末端側に別の蛋白質、例えばアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ＩｇＧ等の免疫グロブリンＦｃ断片またはＦＬＡＧ−ｔａｇ等のペプチドを直接またはリンカーペプチド等を介して間接的に遺伝子工学的手法等を用いて付加することは当業者には容易であり、これらの別の物質を結合したポリペプチド等も本発明の範囲に包含される。
【００１４】
（ポリヌクレオチド）
一つの態様において、本発明のポリヌクレオチドおよびその相補鎖は、本発明のポリペプチド等、例えば配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドに対する相補鎖を意味する。これらは例えば上記新規ＰＬＡ_１の製造に有用な遺伝子情報を提供するものであり、あるいは核酸に関する試薬・標準品としても利用できる。好ましいポリヌクレオチドを示す配列表の配列番号２において、塩基番号８９のＡ（ａｄｅｎｉｎｅ）から塩基番号１４４１のＧ（ｇｕａｎｉｎｅ）までがコーディング領域と推定される。また、アミノ酸配列Ｍ（Ｍｅｔ）１−Ｅ（Ｇｌｕ）１９をコードしているａｔｇ〜ｇａａはシグナル配列をコードしているものと推定され、産生される蛋白質は分泌型として産生され、プロセッシングを経ることで、成熟型の蛋白質となることが推定される。なお、ヒト個体による塩基配列の多型の存在が認められた。その内の一例では、配列表の配列番号２のヌクレオチド配列の塩基番号１０８８のＧ（ｇｕａｎｉｎｅ）がＴ（ｔｈｙｍｉｎｅ）に置換され、結果としてアミノ酸番号３３４のＤ（Ａｓｐ）がＹ（Ｔｙｒ）に置換されており、別の例では、配列表の配列番号２のヌクレオチド配列の塩基番号１２０４のＡ（ａｄｅｎｉｎｅ）がＧ（ｇｕａｎｉｎｅ）に置換され、この例においてはアミノ酸置換は無いと考えられた。
【００１５】
別の態様において本発明は、本発明のポリペプチドまたはペプチドのアミノ酸配列、例えば配列表の配列番号１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド、好ましくは配列表の配列番号２のヌクレオチド配列で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖の対応する領域にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。ハイブリダイゼーションの条件は、例えばサムブルック等編［モレキュラークローニング，アラボラトリーマニュアル第２版］コールドスプリングハーバーラボラトリー，（１９８９）等に従うことができる。これらのポリヌクレオチドは目的のポリヌクレオチド、特に配列表の配列番号２のヌクレオチド配列で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖にハイブリダイズするものであれば必ずしも相補的配列でなくとも良い。例えば、配列表の配列番号２のヌクレオチド配列またはその相補配列に対する相同性において、少なくとも約４０％、例えば、約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上である。また本発明のポリヌクレオチドは、指定されたヌクレオチド配列の領域に対応する連続する１０個以上のヌクレオチド、好ましくは１５個以上、より好ましくは２０個以上の配列からなるポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび該相補鎖を包含する。
【００１６】
これらのポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチド等の製造において、新規ＰＬＡ_１をコードする核酸、例えば、その遺伝子、もしくはｍＲＮＡの検出のためのプローブもしくはプライマーとして、または遺伝子発現を調節するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド等として有用である。その意味で、本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは翻訳領域のみでなく、非翻訳領域に対応するものも包含する。例えば、アンチセンスによって新規ＰＬＡ_１の発現を特異的に阻害するためには、リパーゼファミリーで保存されているコンセンサス配列領域以外の新規ＰＬＡ_１に固有な領域のヌクレオチド配列を用いることが想定される。一方、保存配列を用いることにより新規ＰＬＡ_１を含む複数のリパーゼの発現を同時に抑制することも可能と考えられる。ここで、新規ＰＬＡ_１または同様の活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の決定は、例えば公知の蛋白質発現系を利用して発現蛋白質の確認を行い、その生理活性特にホスファチジン酸を分解する活性を指標にして選別することにより行うことができる。無細胞蛋白質発現系を利用する場合は、例えば胚芽、家兎網状赤血球等由来のリボソーム系の技術を利用できる（Ｎａｔｕｒｅ、１７９、１６０〜１６１、１９５７）。
【００１７】
（形質転換体）
上記のような無細胞系以外にも、本発明は、大腸菌、酵母、枯草菌、昆虫細胞、動物細胞等の自体公知の宿主を利用した遺伝子組換え技術によっても、本発明からなる新規ＰＬＡ_１およびその由来物からなるペプチドおよびポリペプチドは提供可能である。本発明の具体例においては、昆虫細胞を利用したが、無論これに限定されるものではない（日本国特許第２１２９４８７号および第２６４４４４７号：組み替えバキュウロウィルス発現ベクターの製法とポリペプチドの合成）。なお、本発明の新規およびその由来物からなるペプチドおよびポリペプチドは、分泌型の蛋白質であるため、酵母、動物細胞等の分泌系の機能を保持する宿主が好ましい。
【００１８】
形質転換は、自体公知の手段が応用され、例えばレプリコンとして、プラスミド、染色体、ウイルス等を利用して宿主の形質転換が行われる。より好ましい系としては、遺伝子の安定性を考慮するならば、染色体内へのインテグレート法であるが、簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系の利用である。ベクターは、選択した宿主の種類により選別され、発現目的の遺伝子配列と複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列とを構成要素とする。組合せは原核細胞、真核細胞によって分別され、プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー等を自体公知の方法によって組合せ利用できる。本発明の具体例においては、バキュロウイルス系を利用したが、無論これに限定されるものではない。
【００１９】
形質転換体は、自体公知の各々の宿主の培養条件に最適な条件を選択して培養される。培養は、発現産生される新規ＰＬＡ_１およびその由来物からなるペプチドおよびポリペプチドの酵素活性特にホスファチジン酸を分解する酵素活性をマーカーにしておこなってもよいが、培地中の形質転換体量を指標にして継代培養またはバッチによって、生産してもよい。
【００２０】
（新規ＰＬＡ_１およびその由来物回収）
培地からの新規ＰＬＡ_１およびその由来物からなるペプチドおよびポリペプチドの回収は、ホスファチジン酸を分解する酵素活性を指標にして、分子篩、イオンカラムクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等を組合せるか、溶解度差にもとづく硫安、アルコール等の分画手段によっても精製回収できる。好ましくは、アミノ酸配列の情報に基づき、該アミノ酸配列に対する抗体を作成し、ポリクローナル抗体またはモノクロ−ナル抗体によって、特異的に吸着回収する方法を用いる。簡便には、へパリンを利用したアフィニティクロマトグラフィーが利用できる。
【００２１】
（抗体）
抗体は、本発明の新規ＰＬＡ_１およびその由来物からなるペプチドまたはポリペプチドの抗原決定基を選別し、作製する。抗原は新規ＰＬＡ_１またはその断片でもよく、少なくとも８個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１２個、さらに好ましくは１５個以上のアミノ酸で構成される。新規ＰＬＡ_１に特異的な抗体を作製するためには、リパーゼファミリーのコンセンサス配列領域以外の新規ＰＬＡ_１に固有な配列からなる領域を用いることが好ましい。このアミノ酸配列は、必ずしも配列表の配列番号１と相同である必要はなく、蛋白質の立体構造上の外部への露出部位が好ましく、露出部位が不連続部位であれば、該露出部位について連続的なアミノ酸配列であることも有効である。抗体は、免疫学的に新規ＰＬＡ_１およびその由来物からなるペプチドまたはポリペプチドを結合または認識する限り特に限定されない。この結合または認識の有無は、公知の抗原抗体結合反応によって決定される。
【００２２】
抗体を産生するためには、本発明の新規ＰＬＡ_１およびその由来物からなるペプチドまたはポリペプチドを、アジュバントの存在または非存在下で、単独または担体に結合して、動物に対して体液性応答および／または細胞性応答等の免疫誘導をおこなうことによって行われる。担体は、自身が宿主に対して有害作用をおこさなければ、特に限定されず例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミン等が例示される。免疫される動物は、マウス、ラット、兎、やぎ、馬等が好適に用いられる。ポリクローナル抗体は、自体公知の血清からの抗体回収法によって取得される。好ましい手段としては、免疫アフィニティークロマトグラフィー法である。
【００２３】
モノクロ−ナル抗体を生産するためには、上記の免疫手段が施された動物から抗体産生細胞（例えば、脾臓またはリンパ節由来）を回収し、自体公知の永久増殖性細胞（例えば、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８株等のミエローマ株）への形質転換手段を導入することによって行われる。例えば、ハイブリドーマをクローン化し、本発明のＰＬＡ_１を特異的に認識する抗体を選別し、該ハイブリドーマの培養液から抗体を回収する。
【００２４】
ＰＬＡ_１活性を抑制し得るポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、直接本発明からなる新規ＰＬＡ_１を結合し、活性を制御可能であり、リン脂質特にＰＡからのＬＰＡ産生系の制御を容易に行うことができる。そのため、ＬＰＡが関連する各種悪益的疾患の治療・予防のために有用である。
【００２５】
（同定・スクリーニング）
かくして調製された新規ＰＬＡ_１およびその由来物からなるペプチドまたはポリペプチド、これらをコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖、これらのアミノ酸配列および塩基配列の情報に基づき形質転換させた細胞、またはこれらを用いる蛋白質合成系並びに新規ＰＬＡ_１およびその由来物からなるペプチドまたはポリペプチドを免疫学的に認識する抗体は、単独または複数手段を組合せることによって、新規ＰＬＡ_１およびその由来物からなるペプチドおよびポリペプチドに対する活性阻害剤または活性賦活剤の同定・スクリーニングに有効な手段を提供する。例えば、ペプチドまたはポリペプチドの立体構造に基づくドラッグデザインによる拮抗剤の選別、蛋白質合成系を利用した遺伝子レベルでの発現調整剤の選別、抗体を利用した抗体認識物質の選別等が、自体公知の医薬品スクリーニングシステムにおいて、利用可能である。
【００２６】
また、本発明の新規ＰＬＡ_１およびその由来物からなるペプチドまたはポリペプチドは、スクリーニング候補の化合物とこれらペプチドまたはポリペプチドとの間の相互作用を可能にする条件を選別し、この相互作用の有無を検出することのできるシグナル（マーカー）を使用する系を導入し、このシグナル（マーカー）の存在・不存在を検出することにより、本発明の新規ＰＬＡ_１およびその由来物からなるペプチドおよびポリペプチドの活性を賦活または阻害する化合物を同定可能である。
【００２７】
（化合物、医薬組成物）
このようにして同定された化合物は、新規ＰＬＡ_１およびその由来物からなるペプチドおよびポリペプチドの系に関する活性阻害剤、活性拮抗剤、活性賦活剤の候補化合物として、利用可能である。また、遺伝子レベルでの新規ＰＬＡ_１およびその由来物の系に対する発現阻害剤、発現拮抗剤、発現賦活剤の候補化合物としても利用可能である。その効果は、ＬＰＡに由来する各種悪益的症状の予防・治療を期待できる。
【００２８】
かくして選別された候補化合物は、生物学的有用性と毒性のバランスを考慮して選別することによって、医薬組成物として調製可能である。また本発明からなる新規ＰＬＡ_１およびその由来物からなるペプチドまたはポリペプチド、これらをコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖、これらの塩基配列を含むベクター並びに、新規ＰＬＡ_１およびその由来物からなるペプチドまたはポリペプチドを免疫学的に認識する抗体は、それ自体が、診断マーカー、試薬等の疾病診断手段、または新規ＰＬＡ_１の活性阻害・拮抗・賦活等の機能を利用して治療薬等の医薬手段として使用しうる可能性がある。なお、製剤化にあたっては、自体公知のペプチドまたはポリペプチド、蛋白質、ポリヌクレオチド、抗体等各対象に応じた製剤化手段を導入すればよい。
【００２９】
診断手段としては、本発明の新規ＰＬＡ_１およびその由来物からなるペプチドまたはポリペプチドの発現または活性に関連して疾患の診断手段として有用であり、例えば当該ペプチドをコードしている核酸配列との相互作用・反応性を利用して、相応する核酸配列の存在量を決定すること、および／または当該ペプチドについて個体中の生体内分布を決定すること、および／または当該ペプチドの存在、個体由来の試料中の存在量を決定することによって行われる。詳しくは、新規ＰＬＡ_１を診断マーカーとして検定するのである。その測定法は、自体公知の抗原抗体反応系、酵素反応系、ＰＣＲ反応系等を利用すればよい。さらに、前述したように、個体による多型の存在が認められるので、公知の方法により単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を検出することも有用な診断手段である。
【００３０】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
（遺伝子の単離）
ホスファチジルセリンを特異的に加水分解するラットホスフォリパーゼＡ_１（ＰＳ−ＰＬＡ_１）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，（４），２１９２−２１９８，１９９７）のアミノ酸配列をプローブとして、ｄｂＥＳＴ（ｄａｔａｂａｓｅｏｆＥｘｐｒｅｓｓｅｄＳｅｑｕｅｎｃｅＴａｇｓ）に対して、ホモロジーサーチ（ｔｂｌａｓｔｎｓｅａｒｃｈ）を実施した。その結果、未知の核酸配列で相同性スコアの比較的高かった、受託番号（ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ．）ＡＡ１４９７９１、ＡＡ１０２３２２の２種類のＥＳＴ配列を得た。次に、受託番号（ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ．）ＡＡ１０２３２２の核酸配列をプローブとして、ｄｂＥＳＴに対してホモロジーサーチ（ｂｌａｓｔｎｓｅａｒｃｈ）を実施した。
【００３１】
その結果、受託番号（ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ．）ＡＡ３６７３６８の配列と、ＡＡ１４９７９１の配列とが重なる塩基配列領域を有することが明らかとなった（図１）。これらの配列を、重複する領域で並べたところ、ＡＡ１４９７９１（翻訳開始コドンと予想されるメチオニン残基を含む配列）、ＡＡ１０２３２２（ＡＡ１４９７９１と重なりを有する配列）、ＡＡ３６７３６８（ＡＡ１０２３２２と大幅に重なり、触媒トライアド等を含む配列）の順番で配置することが可能であることが判明した。次に、これらの配列を並べ、その特色を解析した。ＰＳ−ＰＬＡ_１や、リパーゼに特色的な、活性トライアドのアミノ酸残基や立体構造的に活性ポケット近傍にあるリッドと呼ばれるループ構造領域（Ｂ．Ｂ．Ａ．，１３７６，４１７−４３２，１９９８）（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，４７０２−４７０７，１９９３）（蛋白質核酸酵素，４４，１０３８−１０４２，１９９９）が存在することが予測され、その配列上の特色から新規なホスフォリパーゼＡ_１である可能性が推測された。
【００３２】
（新規配列のクローニング）
実際に、上記解析で予測された新規ＰＬＡ_１遺伝子配列を有するｃＤＮＡをクローニングする目的で、開始メチオニンコドンを有すると考えられたヒト大腸由来の部分的なｃＤＮＡ配列（ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ．ＡＡ１４９７９１）を含むクローンを、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手した。
【００３３】
該クローンの核酸配列を確認したところ、全長ｃＤＮＡを含む可能性が示唆された。これがアーティファクトでないことを確認するため、該配列をもとに、ＰＣＲプライマーとして、配列表の配列番号３の５’−ＴＧＣＧＡＡＧＴＡＡＡＴＣＡＴＴＣＴＴＧＴＧＡＡ−３’（フォワードプライマー配列）および配列表の配列番号４の５’−ＴＧＴＧＡＣＡＴＣＣＡＴＡＧＧＡＣＧＣＴＡＣＴＧ−３’（リバースプライマー配列）の塩基配列のオリゴヌクレオチドを作製し、ヒトの大腸、肺、腎臓由来のＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、ＲＴ−ＰＣＲした。増幅された遺伝子断片（約１．５ｋｂｐ）を、プラスミドｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をクローニング用のベクターとし、これのマルチクローニングサイトＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩにクローン化後、塩基配列を決定した。配列は、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩＳＫのマルチクローニングサイトのプライマーを使用し、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｈｏＩの４個所の制限サイトを活用しながら、シークエンスを行った。次に、この配列をもとに、プライマーオリゴマーを設計し、プライマーウオーキングの手法を用いて新規ＰＬＡ_１と考えられた配列表の配列番号２の塩基配列を最終的に確認した（図２）。また、ＲＴ−ＰＣＲ産物のダイレクトシークエンスによっても配列を確認した。これらにより、塩基配列の２カ所に個体による多型を認めた。なお、該塩基配列を含有するプラスミドを含む大腸菌は受託番号ＦＥＲＭＰ−１７４２８として工業技術院生命工学工業技術研究所に１９９９年６月２２付で寄託されている。
【００３４】
この配列表の配列番号２に示すｃＤＮＡは、配列表の配列番号１に示す４５１アミノ酸残基からなる蛋白質を暗号化可能な、１３５３塩基からなるオープンリーディングフレームを含み、Ｎ末端領域に、シグナル配列と予想される領域を有していた。配列的な特色としては、アスパラギングリコシレーションサイトのモチーフであるＮ−｛Ｐ｝−［ＳＴ］−｛Ｐ｝．を４個所（Ｎ（Ａｓｎ）５０−Ｃ（Ｃｙｓ）５３、Ｎ（Ａｓｎ）５８−Ａ（Ａｌａ）６１、Ｎ（Ａｓｎ）６６−Ｋ（Ｌｙｓ）６９、Ｎ（Ａｓｎ）３５７−Ｅ（Ｇｌｕ）３６０））持ち、細胞結合領域のモチーフとして知られるＲＧＤ配列を１個所（Ｒ（Ａｒｇ）３４４−Ｄ（Ａｓｐ）３４６）含み、システイン残基を１３個有していた。
【００３５】
また、下記に記載するバキュロウイルスの発現系を用い細胞外に分泌されることが確認されたので、本発明の酵素は、シグナルペプチドを有し、おそらく分泌蛋白質であると考えられる。シグナルペプチドの部位は、組換え型蛋白質のＮ末端アミノ酸配列を決定していないので確定していないが、Ｍ（Ｍｅｔ）１−Ｅ（Ｇｌｕ）１９までと予測される。
【００３６】
（既存蛋白質との相同性）
塩基配列の翻訳によって予想されるアミノ酸配列を用いて、既存のデータベース（Ｇｅｎｂａｎｋ）に対してｔｂｌａｓｔｎを用いたホモロジーサーチを実施した。その結果、図３に示すように、本発明の新規リパーゼ（ｃｏｌｏｎｌｉｐａｓｅ）はヒトＰＳ−ＰＬＡ_１（ｈＰＳ−ＰＬＡ_１）、膵臓型リパーゼ（ｈｕｍａｎｐａｎｃｒｅａｔｉｃｌｉｐａｓｅ）、肝臓型リパーゼ（ｈｅｐａｔｉｃｌｉｐａｓｅ）、リポプロテインリパーゼ（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｌｉｐａｓｅ）、膵臓リパーゼ関連蛋白質１（ｐｌｒｐ１；ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｌｉｐａｓｅｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ１）および２（ｐｌｒｐ２；ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｌｉｐａｓｅｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ２）と有意な相同性をしめした。その他、立体構造的にリパーゼと相同性が高い領域があるとされるビテロジェニンとの相同性も高かった。これらの相同性が高かった既知蛋白質配列のうちビテロジェニンを除く上記各蛋白質において、酵素活性トライアドと予測されるアミノ酸残基（Ｓ（Ｓｅｒ）１５４、Ｄ（Ａｓｐ）１７８、Ｈ（Ｈｉｓ）２４８）がすべて保存されているのが確認されたので、これらの配列をＧＥＮＥＴＹＸＭｕｌｔｉｐｌｅＡｌｉｇｎｍｅｎｔモジュール（ソフトウエア開発株式会社）を用いて、マルチプルアライメント表を作成した。
【００３７】
その結果、配列表の配列番号１のアミノ酸配列においては、図２に示すように、リパーゼファミリーに保存されているコンセンサス配列ＧＸＳＸＧ（Ｇ（Ｇｌｙ）１５２−Ｇ（Ｇｌｙ）１５６）、ＩＴＧＬＤ（Ｉ（Ｉｌｅ）１７４−Ｄ（Ａｓｐ）１７８）およびＣＸＨ（Ｃ（Ｃｙｓ）２４６−Ｈ（Ｈｉｓ）２４８）（Ｘは任意のアミノ酸を示す）が存在し、これらには触媒活性トライアドと考えられるアミノ酸残基が全て含まれていることが判明した。また、立体構造的に活性トライアドが存在するポケットの近傍に存在し、リパーゼの活性発現を調節しているリッドと呼ばれるループ構造（Ｐ（Ｐｒｏ）２３４−Ｋ（Ｌｙｓ）２４５）が、ＰＳ−ＰＬＡ_１のそれと同じ残基数すなわち１２個存在することが判明した。通常、ＰＳ−ＰＬＡ_１以外のリパーゼ群は、リッド構造のアミノ酸残基数が長く、コリパーゼと呼ばれる蛋白性の因子が結合することによって活性が発現されることが知られている（Ｂ．Ｂ．Ａ．，１３７６，４１７−４３２，１９９８）（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，４７０２−４７０７，１９９３）（蛋白質核酸酵素，４４，１０３８−１０４２，１９９９）が、比較的リッドが短いＰＳ−ＰＬＡ_１は、コリパーゼの必要性は、現在まで明らかにされていない。従って、今回得た塩基配列から翻訳される蛋白質も、ＰＳ−ＰＬＡ_１に似た機構で活性発現する可能性も予測される。
【００３８】
次に、ＧＥＮＥＴＹＸＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｌｔｒｅｅ（ＵＰＧＭＡｍｅｔｈｏｄ）モジュール（ソフトウエア開発株式会社）によって、配列の進化的な系統樹を予測した。その結果、新規配列は、ＰＳ−ＰＬＡ_１と最も進化的に近い配列であることが推測された。以上のことから、新規配列が翻訳された蛋白質は、リパーゼ群に近く、特にホスフォリパーゼに近縁な新規リパーゼであることが推測された。
【００３９】
（発現組織の確認）
新規リパーゼの発現組織を調べる目的で、ヒト正常組織に対してノザンブロッティングを行った。オープンリーディングフレーム内のｃＤＮＡ断片である約０．７ｋｂｐのＰＣＲ断片をプローブとして用いた。すなわち、ＰＣＲプライマーとして、配列表の配列番号５のＣＴＧＣＧＣＡＣＡＡＡＣＣＡＴＣＡＡＣＴＣＣＴＣ（フォワードプライマー配列）および配列表の配列番号６のＡＧＧＧＧＡＣＡＧＧＡＣＴＣＴＴＴＴＴＧＴＧＡＣ（リバースプライマー配列）の塩基配列のオリゴヌクレオチドを合成し、ＰＣＲをおこなうことにより^３２Ｐ標識プローブを調製した。ノザンブロッティングは、ＨｕｍａｎＭｕｌｔｉｐｌｅＴｉｓｓｕｅＮｏｔｈｅｒｎＢｌｏｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてユーザーマニュアル（ＰＴ１２００−１、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に従って実施した。その結果、正常組織においては、肺、腎臓、膵臓、前立腺、睾丸、卵巣、結腸において発現が認められた（図４）。
【００４０】
（新規リパーゼの発現）
完全長ｃＤＮＡを上述のｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）から、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩで切り出し作製した。プラスミドｐＦ_ＡＳＴＢ_ＡＣ１（ライフテックオリエンタル社）中のマルチクローニングサイトにＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩの制限酵素サイトでｃＤＮＡを組み込んだ。Ｃ末端側にＦＬＡＧ−ｔａｇ（ＡｓｐＴｙｒＬｙｓＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐＬｙｓ）（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，１２０５−１２１０，１９８８）をつけたものに関しては、終止コドンを取り除き代わりに、配列表の配列番号８に示すＦＬＡＧ−ｔａｇをコードする核酸配列末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を持った合成オリゴクレオチド（プライマー２）を作製し、また、配列表の配列番号７に示す開始メチオニンの最初にＢａｍＨＩを導入したオリゴヌクレオチド（プライマー１）を作製し、上述のｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）をテンプレートに用いＰＣＲを行い、ｃＤＮＡを増幅した。
【００４１】
プライマー１：５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＴＧＡＧＡＴＴＣＴＡＣＴＴＡＴＴＣＡＴＣ−３’ （配列表の配列番号７）
プライマー２：５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＧＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＣＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＣＴＧＧＧＣＡＡＡＧＡＡＴ−３’（配列表の配列番号８）
【００４２】
プラスミドｐＦ_ＡＳＴＢ_ＡＣ１中のマルチクローニングサイトの、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩの制限酵素サイトにｃＤＮＡを組み込んだ後、大腸菌ＪＭ１０９に、構築したｐＦ_ＡＳＴＢ_ＡＣ１をトランスフェクションし、ポジティブクローンを選択後、該ポジティブクローンの培養を行いプラスミドを回収した。このプラスミドを、ＤＨ１０ＢＡＣ^ＴＭコンピーテントセル（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）にトランスフェクションし、組み換えＢａｃｍｉｄを回収した。得られたＢａｃｍｉｄは、ＣｅｌｌＦＥＣＴＩＮ^ＴＭ（ｐＦ_ＡＳＴＢ_ＡＣ１）とともにＳｆ９細胞（夜盗蛾Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａさなぎ卵巣組織由来）にトランスフェクションした。
【００４３】
その結果、組み換え型バキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）が培養上清中に回収された。次に、蛋白質の発現を確認する目的で、回収したバキュロウイルスをＳｆ９昆虫細胞に感染させ２７℃９６時間培養した。感染細胞の上清から抽出した発現蛋白質をサンプルとしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ウエスタンブロッティングをＦＬＡＧ−ｔａｇに対する抗体を用いて実施したところ予想される新規リパーゼの分子量約５２ｋＤａにバンドが認められた（図５）。従って、新規リパーゼを、昆虫細胞などを用いることによって培養上清中に上記手法により発現させ得ることを確認した。
【００４４】
（新規リパーゼの精製）
組み換え型バキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）（日本国特許第２１２９４８７号および第２６４４４４７号：組み替えバキュウロウィルス発現ベクターの製法とポリペプチドの合成）感染培養上清５００ｍｌを回収し、１００００× ｇ、２０分、４℃の遠心にて細胞断片を除き、更に、フィルターをかけることにより（Ｆａｌｃｏｎポアサイズ０．４５μｍ）さらに培養上清中のゴミを除去した。ＦＰＬＣｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用い、上述した培養上清を、ヘパリンカラム（Ｈｉ−ｔｒａｐＨｅｐａｒｉｎ，Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ，５ｍｌ）に付し最終的に、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）存在下、１００ｍＭから１５００ｍＭのＮａＣｌで濃度勾配溶出を行った。溶出の分画は、２．５ｍｌづつ行い、全部で２０フラクション分画した。次に分画した各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、ＦＬＡＧ−ｔａｇ抗体によってウエスタンブロッティングしたところ、特定の画分に、バンドが検出されることを確認した。
【００４５】
同様に対照として、野生型バキュロウイルス（ｗｉｌｄｔｙｐｅｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）を感染させた培養上清を、上述のようにヘパリンカラムに付し、ＮａＣｌの濃度勾配溶出画分を調製した。この画分を、ウエスタンブロッティングしたが、該画分中にはＦＬＡＧ−ｔａｇ抗体が反応する分子は確認されなかった。
【００４６】
（基質特異性の検討）
ＦＬＡＧ−ｔａｇ抗体でバンドが検出された画分を用いて、脂肪酸が［^１４Ｃ］で放射標識されたホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、トリアシルグリセロール（ＴＧ）を基質として、ホスホリパーゼ活性、リパーゼ活性を測定した（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，２１９２−２１９８，１９９７）。ホスホリパーゼ活性（ＰＡ、ＰＳ、ＰＣ）は、４０ μＭのそれぞれの基質を、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、４ｍＭＣａＣｌ_２存在下、酵素とともに３７℃ １時間インキュベートし、遊離した放射標識脂肪酸をドール法により抽出し、放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。
【００４７】
リパーゼ活性（ＴＧ）は、４０μＭの基質を１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、４ｍＭＣａＣｌ_２存在下、酵素とともに３７℃ １時間インキュベートし、遊離した放射標識脂肪酸をドール法により抽出し、放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。
【００４８】
その結果、Ｆｌａｇ−ｔａｇ抗体で新規リパーゼ組み換え型タンパク質が検出された画分には、ＰＡを切断するホスフォリパーゼ活性が検出された。ＴＧを切断するリパーゼ活性、ＰＣ、ＰＳに対するホスフォリパーゼ活性に関しては有意な活性は検出されなかった。ＰＡを切断するホスフォリパーゼ活性は、野生型バキュロウイルス（ｗｉｌｄｔｙｐｅｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）を感染させたＳｆ９細胞培養上清からのヘパリンカラム溶出画分には検出されなかった。以上の検討により、新規ホスフォリパーゼＡ_１は、ＰＡを加水分解し、細胞の分化・増殖を促進する成長因子であるリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）の生成過程に関与する可能性があることが示唆された。
【００４９】
【発明の効果】
以上説明したように本発明の新規リパーゼは、新規ＰＬＡ_１であり、その基質特異性としてホスファチジン酸を分解する活性が特徴的である。この特性を利用した新規医薬組成物、診療手段の提供は、リパーゼ関連の臨床・基礎の医用領域において大きな有用性を提供する。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】新規リパーゼの塩基配列とＥＳＴの塩基配列の関係を説明する図である。図中、ＡＴＧは開始コドン、Ｓ、Ｄ、Ｈは活性トライアド、Ｃ−Ｃはリッド領域、ＥＳＴ配列中の破線はＥＳＴ配列の欠失がある領域である。
【図２】新規リパーゼの配列およびその配列の特徴を説明する図である。図中、二重下線はシグナル配列、下線は糖鎖付加予測部位、両矢印の下線はリパーゼコンセンサス配列およびリッド領域、四角（斜線入り）で囲んだＳ、Ｄ、Ｈは活性トライアド、四角（白抜き）はＲＧＤ配列を示す。
【図３】新規リパーゼ（ｃｏｌｏｎｌｉｐａｓｅ）と、該新規リパーゼに相同性を有するリパーゼのアミノ酸配列を比較するマルチプルアラインメント図である。
【図４】ヒト組織における新規リパーゼの発現をノザンブロットで確認した図である。
【図５】新規リパーゼの組換え型蛋白質の昆虫細胞における発現をウェスタンブロットで確認した図である。[0001]
[Industrial applications]
The present invention relates to novel lipases, in particular phospholipase A ₁ (Phospholipase A ₁ The following PLA ₁ ). For more information, see New PLA ₁ A peptide or polypeptide having all or a part of the amino acid sequence of, a polynucleotide encoding the peptide or polypeptide, a recombinant vector containing the polynucleotide, a transformant transformed with the recombinant vector, Method for producing peptide or polypeptide using transformant, antibody against the peptide or polypeptide, method for identifying compound using the same, compound identified, activity-inhibiting compound acting on polypeptide or polynucleotide Alternatively, the present invention relates to an activity activating compound, a pharmaceutical composition related thereto, and a method for diagnosing a disease related thereto.
[0002]
[Prior art]
PLA ₁ Is an enzyme that hydrolyzes the ester bond at position 1 of glycerol of glycerophospholipid. The presence of this enzyme activity has been detected in various organs so far, and some PLAs are distinguished by substrate specificity. ₁ Have been reported. Bee venom PLA is cDNA-cloned. ₁ (Dolm1), PS-PLA ₁ [Specifically hydrolyzes the ester bond at position 1 of glycerol of phosphatidylserine (PS) and lysophosphatidylserine (lysoPS) (JP-A-10-201479) (protein nucleic acid enzyme, 44, 1038-1042, 1999)] , PA-PLA of human testis ₁ [Specifically hydrolyzes the ester bond at the 1-position of glycerol of phosphatidic acid (PA) (J. Biol. Chem., 273, 5468-5777, 1998)]. Also, molecules of the lipase family often have PLA activity besides their ability to degrade triacylglycerols. ₁ It is known to have an activity (FEBS Letters, 320, 145-149, 1993) (Biochemistry, 32, 4702-4707, 1993) (J. Biol. Chem., 272, 2192-2198, 1997). Furthermore, PLA belonging to the lipase family has been found so far. ₁ All have a short lid (BBA, 1376, 417-432, 1998) (Biochemistry, 32, 4702-4707, 1993), but their physiological significance is not always clear. Absent. It has also been suggested that sugar chains on lipase molecules may be involved in lipase activity (J. Lipid Res., 35, 1511-1523, 1994) (J. Lipid Res., 36, 939-951, 1995). ).
[0003]
PLA ₁ Has a function of decomposing phospholipids, but one of the products, lysophosphatidic acid (hereinafter sometimes abbreviated as LPA) (BBA, sometimes referred to as LPA). 1198, 185-196, 1994), and many physiological activities are known, and attention is paid to its biological utility [Cell Engineering, 17, (5), 739-745, 1998]. The main actions of LPA include a blood pressure increasing action (Lipids, 13, 572-574, 1978), a platelet aggregation action (Am. J. Pathol., 96, 423-438, 1979), and a cell growth promoting action (Cell). 59, 45-54, 1989). In addition to these, promotion of cancer cell invasion, cell adhesion, formation of stress fibers, chemotaxis induction, neurite regression, suppression of apoptosis, and wound healing Various effects such as association have been reported (BBA, 1198, 185-196, 1994).
[0004]
PLA having specificity for phosphatidic acid (hereinafter sometimes abbreviated as PA) ₁ As human testis PA-PLA ₁ This enzyme is an intracellular enzyme and is considered as a factor that determines the turnover of the fatty acid at the sn-1 position of phosphatidic acid, which is the center of phospholipid metabolism. (J. Biol. Chem., 273, 5468-5777, 1998). In addition, human testis PA-PLA ₁ It has been reported that, depending on the reaction conditions, phosphatidylethanolamine (PE) and phosphatidylinositol (PI) also hydrolyze.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
One of the problems to be solved by the present invention is as described above, a PLA which is a catalyst for producing LPA which can be a causative substance of an adverse effect in various aspects. ₁ And to control LPA in vivo. More specifically, an object of the present invention is to provide a novel PLA having novel properties. ₁ To provide a new PLA ₁ To provide a peptide or polypeptide of origin. Another object of the present invention is to provide a novel PLA ₁ A novel PLA by providing a polynucleotide encoding a peptide or polypeptide derived therefrom, and using genetic engineering techniques ₁ It is an object of the present invention to provide a method for producing a peptide or polypeptide derived therefrom. Still another object of the present invention is to provide a novel PLA ₁ It is an object of the present invention to provide an antibody against the peptide or polypeptide derived therefrom. Another object of the present invention is to provide a novel PLA utilizing the above-mentioned object. ₁ And to provide an identified compound, and to provide a pharmaceutical composition and a diagnostic method using the same.
[0006]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
(New PLA ₁ )
Novel PLA provided in the present invention ₁ Is a cDNA obtained as a substance having a novel amino acid sequence from a cDNA library. And a novel PLA according to the present invention. ₁ Was confirmed by Northern blotting in human lung, kidney, pancreas, prostate, testicle, ovary, and colon. Novel PLA according to the present invention ₁ Are as follows. Acts on phospholipids, especially phosphatidic acid, to produce LPA. As a substrate specificity, it has high specific activity for PA. It has consensus sequences and catalytic triads conserved in the lipase family and amino acids that are considered lids. In addition, known PLA ₁ The homology with the class is less than about 40%.
[0007]
(Polypeptide or peptide)
New PLA of the present invention ₁ Is a polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. Further, the polypeptide or peptide of the present invention is selected from a polypeptide or peptide containing at least a part of the polypeptide shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. The selected polypeptide or peptide differs from the polypeptide shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing by about 40% or more, preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, and still more preferably about 80% or more on the amino acid sequence. It has a homology of 90%, particularly preferably about 95% or more. Selection of a polypeptide or peptide having this homology can be made based on the activity of degrading phospholipids, particularly phosphatidic acid, and / or the presence of substrate specificity for phosphatidic acid (J. Biochem, 103, 442). -47, 1988) (J. Biochem., 117, 1280-1287, 1995) (J. Biochem., 101, 53-61, 1987) (J. Biol. Chem., 235, 2595-2599, 1960) ( J. Biol. Chem., 272, 2192-2198, 1997). In SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, M (Met) 1-E (Glu) 19 is presumed to be a signal sequence. The signal sequence is not limited to this sequence as long as it secretes the peptide of the present invention, and may be, for example, a signal peptide derived from another protein. Further, regardless of the presence or absence of the signal peptide, it is included in the scope of the present invention.
[0008]
Techniques for determining the homology of amino acid sequences are known per se, and include, for example, a method for directly determining an amino acid sequence, a method for determining the nucleotide sequence of cDNA and then estimating the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence.
[0009]
The polypeptide or peptide of the present invention includes a polypeptide or peptide having a partial sequence of the polypeptide shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and these can be used, for example, as reagents, standard substances, and immunogens. The minimum unit is an amino acid sequence composed of 8 or more amino acids, preferably 10 or more amino acids, more preferably 12 or more amino acids, still more preferably 15 or more consecutive amino acids, and Polypeptides or peptides that can be identified in the present invention are the subject of the present invention. These peptides can be used as reagents or standards, or, as described below, new PLA ₁ Can be used alone or in combination with a carrier (for example, keyhole limped hemocyanin or ovalbumin) as an antigen for producing an antibody specific to the antibody. Included in the scope of the invention.
[0010]
Furthermore, based on the polypeptide or peptide identified in this way, by using as an index the activity capable of degrading phospholipids, particularly phosphatidic acid, and / or the presence of substrate specificity for phosphatidic acid, one or more, for example, 1 to 100, preferably 1 to 30, more preferably 1 to 20, still more preferably 1 to 10, particularly preferably 1 to several amino acid mutations such as deletion, substitution, addition or insertion Also provided is a polypeptide or peptide consisting of an amino acid sequence. Means for deletion / substitution / addition or insertion are known per se, and include, for example, site-directed mutagenesis, homologous recombination, primer extension or polymerase chain amplification (PCR) alone or as appropriate in combination. Sambrook et al. [Molecular Cloning, Laboratory Manual 2nd Edition] Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, Masami Muramatsu [Lab Manual Genetic Engineering] Maruzen Co., 1988, Ehrlich, HE. [PCR Technology, Principles and Applications of DNA Amplification] can be carried out according to the methods described in books such as Stockton Press, 1989, or by modifying those methods. For example, the technology of Ulmer (Science, 219, 666, 1983).
[0011]
From the viewpoint of not changing the basic properties (physical properties, activity, immunological activity, etc.) of the protein in the introduction of the above mutation, for example, homologous amino acids (polar amino acids, nonpolar amino acids, hydrophobic Mutual substitution between amino acids, hydrophilic amino acids, positively charged amino acids, negatively charged amino acids, aromatic amino acids, etc.) is readily envisioned. As described below, the consensus sequence and the lid region of the lipase family are considered to be important for the expression or regulation of the activity, and the region containing them, particularly the consensus sequence containing the catalytic triad, is retained on the primary sequence and / or the conformation. PLA ₁ Activity, especially PA-PLA ₁ It is preferable to maintain the activity. Although the present invention is included in the scope of the present invention regardless of the presence or absence of a sugar chain, it is preferable that at least one glycosylation site is retained since the sugar chain may affect the activity.
[0012]
In the present invention, the same PLA as the polypeptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is used. ₁ Also provided are polypeptides having activity or minimal activity units (regions or domains) thereof, as well as polypeptides having altered activity intensity or substrate specificity. These are, for example, PLA ₁ Active-like substance or PLA ₁ As an antagonist or PLA ₁ It is useful in screening for a substance that regulates the activity. In addition, homologous gene products of animal species other than human are naturally included in the scope of the present invention.
[0013]
Furthermore, in order to facilitate detection or purification of the polypeptide of the present invention or to add another function, another protein such as alkaline phosphatase, β-galactosidase, IgG, It is easy for those skilled in the art to add a peptide such as an immunoglobulin Fc fragment or FLAG-tag directly or indirectly via a linker peptide or the like by using a genetic engineering technique or the like. Polypeptides and the like bound to are also included in the scope of the present invention.
[0014]
(Polynucleotide)
In one embodiment, the polynucleotide of the present invention and the complementary strand thereof refer to a polynucleotide encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, such as the polypeptide of the present invention, and a complementary strand to the polynucleotide. . These are, for example, the new PLA ₁ It provides useful genetic information for the production of DNA, or can be used as a reagent or standard for nucleic acids. In SEQ ID NO: 2 of the sequence listing showing a preferred polynucleotide, the region from A (adeneine) at base number 89 to G (guanine) at base number 1441 is assumed to be a coding region. Also, atg-gaa encoding the amino acid sequence M (Met) 1-E (Glu) 19 is presumed to encode a signal sequence, and the produced protein is produced as a secreted form and undergoes processing. It is presumed that the protein becomes a mature protein. In addition, the existence of the polymorphism of the base sequence by the human individual was recognized. In one example, G (guanine) at base number 1088 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing is replaced with T (thine), and as a result, D (Asp) at amino acid number 334 is replaced with Y (Tyr). In another example, A (adeneine) at base number 1204 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing was substituted with G (guanine), and it was considered that there was no amino acid substitution in this example.
[0015]
In another aspect, the present invention provides an amino acid sequence of a polypeptide or peptide of the present invention, for example, a nucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing, preferably a polynucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing. Alternatively, a polynucleotide is provided which hybridizes under stringent conditions to the corresponding region of the complementary strand thereof. Hybridization conditions can be according to, for example, Sambrook et al. [Molecular Cloning, Laboratory Manual, 2nd Edition] Cold Spring Harbor Laboratory, (1989). These polynucleotides need not necessarily be complementary sequences as long as they hybridize to the target polynucleotide, particularly the polynucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing or its complementary strand. For example, at least about 40%, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and still more preferably the homology to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or its complementary sequence in the sequence listing. About 95% or more. In addition, the polynucleotide of the present invention comprises a polynucleotide, an oligonucleotide and its complement comprising a sequence of 10 or more nucleotides, preferably 15 or more, more preferably 20 or more corresponding to the designated nucleotide sequence region. Chain.
[0016]
These polynucleotides are used in the production of the polypeptides and the like of the present invention, ₁ Is useful as a probe or primer for detecting a nucleic acid encoding, for example, the gene or mRNA, or as an antisense oligonucleotide for regulating gene expression. In that sense, the polynucleotides and oligonucleotides of the present invention include those corresponding to untranslated regions as well as translated regions. For example, new PLA by antisense ₁ In order to specifically inhibit the expression of a novel PLA other than the consensus sequence region conserved in the lipase family, ₁ It is envisaged to use the nucleotide sequence of the region unique to. On the other hand, by using a conserved sequence, ₁ It is also considered possible to simultaneously suppress the expression of a plurality of lipases including. Here, the new PLA ₁ Alternatively, the sequence of a polynucleotide encoding a polypeptide having the same activity can be determined by, for example, confirming the expressed protein using a known protein expression system and selecting its physiological activity, particularly the activity of decomposing phosphatidic acid, as an index. Can be performed. When a cell-free protein expression system is used, for example, ribosome-based techniques derived from embryos, rabbit reticulocytes and the like can be used (Nature, 179, 160-161, 1957).
[0017]
(Transformant)
In addition to the above-described cell-free system, the present invention also provides a novel PLA comprising the present invention by a gene recombination technique using a host known per se such as Escherichia coli, yeast, Bacillus subtilis, insect cells, animal cells and the like. ₁ And peptides and polypeptides consisting of the derivatives thereof. In the specific example of the present invention, insect cells were used, but it is needless to say that the present invention is not limited thereto. (Japanese Patent Nos. 2129487 and 2644447: Production of recombinant baculovirus expression vector and synthesis of polypeptide) . Since the novel peptides and polypeptides of the present invention and those derived therefrom are secretory proteins, hosts that retain secretory system functions such as yeast and animal cells are preferred.
[0018]
Transformation is carried out by a means known per se. For example, a host is transformed using a plasmid, chromosome, virus or the like as a replicon. A more preferable system is an integration method into a chromosome in consideration of the stability of the gene, but a simpler method is the use of an autonomous replication system using an extranuclear gene. The vector is selected according to the type of the selected host, and includes a gene sequence to be expressed and a gene sequence carrying information on replication and control as components. Combinations are classified by prokaryotic cells and eukaryotic cells, and promoters, ribosome binding sites, terminators, signal sequences, enhancers, and the like can be used in combination in a manner known per se. In the embodiment of the present invention, a baculovirus system was used, but is not limited to this.
[0019]
The transformant is cultured under conditions that are optimal for the culture conditions of each host known per se. Culture is a novel PLA that is expressed and produced ₁ It may be performed using the enzyme activity of peptides and polypeptides composed of the derivatives thereof and the enzyme activity of decomposing phosphatidic acid in particular as a marker, but may be produced by subculture or batch using the amount of the transformant in the medium as an index. May be.
[0020]
(New PLA ₁ And its origin)
New PLA from medium ₁ And recovery of peptides and polypeptides consisting of their derivatives, using an enzyme activity to degrade phosphatidic acid as an index, combining molecular sieve, ion column chromatography, affinity chromatography, etc., or ammonium sulfate, alcohol, etc. based on the difference in solubility. Can be purified and recovered by the fractionation means. Preferably, a method is used in which an antibody against the amino acid sequence is prepared based on the information on the amino acid sequence, and the antibody is specifically adsorbed and collected using a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. Conveniently, affinity chromatography using heparin can be used.
[0021]
(antibody)
The antibody is a novel PLA of the present invention. ₁ And an antigenic determinant of a peptide or polypeptide consisting of the above-mentioned product and a derivative thereof. Antigen is a new PLA ₁ Alternatively, the fragment may be composed of at least 8, preferably at least 10, more preferably at least 12, and even more preferably at least 15 amino acids. New PLA ₁ In order to produce an antibody specific for lipase, a novel PLA other than the lipase family consensus sequence region ₁ It is preferable to use a region consisting of a sequence unique to This amino acid sequence does not necessarily need to be homologous to SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and is preferably exposed to the outside on the three-dimensional structure of the protein. A unique amino acid sequence is also effective. Antibodies are immunologically novel PLA ₁ There is no particular limitation as long as it binds or recognizes a peptide or polypeptide consisting of a derivative thereof. The presence or absence of this binding or recognition is determined by a known antigen-antibody binding reaction.
[0022]
In order to produce antibodies, the novel PLA of the present invention ₁ And a peptide or polypeptide consisting of a derivative thereof, in the presence or absence of an adjuvant, alone or bound to a carrier, to induce immunity such as a humoral response and / or a cellular response to an animal. Done. The carrier is not particularly limited as long as it does not cause harmful effects on the host, and examples thereof include cellulose, polymerized amino acids, and albumin. As the animal to be immunized, mice, rats, rabbits, goats, horses and the like are preferably used. The polyclonal antibody is obtained by a known antibody recovery method from serum. A preferred means is an immunoaffinity chromatography method.
[0023]
In order to produce a monoclonal antibody, antibody-producing cells (for example, spleen or lymph node-derived) are recovered from an animal to which the above-mentioned immunization method has been applied, and a permanently growing cell known per se (for example, P3X63Ag8 strain or the like) Of a myeloma strain). For example, a hybridoma can be cloned and the PLA of the invention ₁ An antibody that specifically recognizes is selected, and the antibody is recovered from the culture of the hybridoma.
[0024]
PLA ₁ A polyclonal antibody or a monoclonal antibody capable of suppressing the activity can be directly obtained from the novel PLA of the present invention. ₁ , And the activity can be controlled, and the LPA production system from phospholipids, particularly PA, can be easily controlled. Therefore, it is useful for the treatment and prevention of various adverse diseases associated with LPA.
[0025]
(Identification and screening)
Novel PLA thus prepared ₁ And polypeptides or polypeptides derived therefrom, polynucleotides encoding them and their complementary chains, cells transformed based on their amino acid sequence and base sequence information, or protein synthesis systems and novel PLA using these ₁ And an antibody that immunologically recognizes a peptide or polypeptide consisting of a derivative thereof can be used alone or in combination with a plurality of means to produce a novel PLA. ₁ And an effective means for identification and screening of an activity inhibitor or activity activator for peptides and polypeptides derived from the same. For example, selection of antagonists by drug design based on the three-dimensional structure of a peptide or polypeptide, selection of an expression regulator at the gene level using a protein synthesis system, selection of an antibody recognizing substance using an antibody, and the like are known per se. Can be used in drug screening systems.
[0026]
Also, the novel PLA of the present invention ₁ And a peptide or polypeptide consisting of a derivative thereof, by selecting a condition that allows an interaction between the screening candidate compound and the peptide or polypeptide, and a signal (a signal capable of detecting the presence or absence of this interaction) A novel PLA of the present invention can be obtained by introducing a system using a marker) and detecting the presence / absence of this signal (marker). ₁ And compounds that activate or inhibit the activity of peptides and polypeptides derived from the same.
[0027]
(Compound, pharmaceutical composition)
The compound thus identified is a novel PLA ₁ It can be used as a candidate compound for an activity inhibitor, an activity antagonist, or an activity activator for a peptide and polypeptide system composed of a derivative thereof. In addition, a novel PLA at the gene level ₁ It can also be used as a candidate compound for an expression inhibitor, an expression antagonist, or an expression activator for a system of a derivative thereof. The effect can be expected to prevent and treat various adverse symptoms derived from LPA.
[0028]
The candidate compound thus selected can be prepared as a pharmaceutical composition by selecting in consideration of the balance between biological utility and toxicity. Also, a novel PLA according to the present invention ₁ Or a polypeptide or polypeptide derived therefrom, a polynucleotide encoding the same or a complementary strand thereof, a vector containing the base sequence thereof, and a novel PLA ₁ And an antibody that immunologically recognizes a peptide or polypeptide consisting of a derivative thereof, is itself a disease diagnostic means such as a diagnostic marker or a reagent, or a novel PLA. ₁ There is a possibility that it can be used as a medicinal means such as a therapeutic drug by utilizing functions such as activity inhibition, antagonism and activation. In formulating, a formulation means suitable for each subject such as a peptide or polypeptide, a protein, a polynucleotide, and an antibody known per se may be introduced.
[0029]
As a diagnostic means, the novel PLA of the present invention is used. ₁ And useful as a means for diagnosing a disease in relation to the expression or activity of a peptide or polypeptide consisting of a derivative thereof, for example, by utilizing the interaction / reactivity with a nucleic acid sequence encoding the peptide, Determining the abundance of the nucleic acid sequence to be performed and / or determining the biodistribution of the peptide in an individual, and / or determining the presence of the peptide in a sample derived from the individual. Is For details, see New PLA ₁ Is used as a diagnostic marker. The measurement method may use a known antigen-antibody reaction system, enzyme reaction system, PCR reaction system, or the like. Furthermore, as described above, the presence of a polymorphism in an individual is recognized, so that detection of a single nucleotide polymorphism (SNP) by a known method is also a useful diagnostic means.
[0030]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be specifically described based on examples, but the present invention is not limited to the following examples.
(Isolation of gene)
Rat phospholipase A that specifically hydrolyzes phosphatidylserine ₁ (PS-PLA ₁ ) (J. Biol. Chem., 272, (4), 2192-2198, 1997), and a homology search (tblastn search) was performed on dbEST (database of Expressed Sequence Tags) using the amino acid sequence as a probe. As a result, two types of EST sequences having accession numbers AA149971 and AA102322, which had an unknown nucleic acid sequence and a relatively high homology score, were obtained. Next, a homology search (blastn search) was performed on dbEST using the nucleic acid sequence of the accession number (accession no.) AA102322 as a probe.
[0031]
As a result, it was revealed that the sequence of accession number (accession no.) AA369368 and the sequence of AA1499791 had a base sequence region overlapping (FIG. 1). When these sequences were arranged in the overlapping region, AA149971 (sequence containing a methionine residue predicted to be a translation initiation codon), AA102322 (sequence having overlap with AA149971), AA369368 (substantially overlap with AA102322) and a catalytic triad It has been found that they can be arranged in the following order. Next, these sequences were arranged and their characteristics were analyzed. PS-PLA ₁ In addition, a loop structure region called a lid (BBA, 1376, 417-432, 1998), which is characteristic of lipase, is an amino acid residue of an active triad and a steric structure near an active pocket (Biochemistry, 32). , 4702-4707, 1993) (protein nucleic acid enzyme, 44, 1038-1042, 1999), and novel phospholipase A ₁ Was speculated.
[0032]
(Cloning of new sequence)
In fact, the new PLA predicted by the above analysis ₁ For the purpose of cloning the cDNA having the gene sequence, a clone containing a partial cDNA sequence from the human large intestine (accession no. AA149971) which was thought to have an initiation methionine codon was obtained from the American Type Culture Collection (ATCC). .
[0033]
When the nucleic acid sequence of the clone was confirmed, it was suggested that the clone might contain full-length cDNA. In order to confirm that this is not an artifact, based on the sequence, 5′-TGCGGAAGTAAATCATTCTTGTGAA-3 ′ (SEQ ID NO: 3) (forward primer sequence) and 5′-SEQ ID NO: 4 of the sequence listing were used as PCR primers. An oligonucleotide having a nucleotide sequence of TGTGACATCCATAGGACGCTACTG-3 ′ (reverse primer sequence) was prepared and subjected to RT-PCR using RNA (Clontech) derived from human large intestine, lung and kidney. The amplified gene fragment (about 1.5 kbp) was cloned into a multicloning site EcoRI / XhoI using the plasmid pBlueScript II SK (Stratagene) as a cloning vector, and the nucleotide sequence was determined. The sequence was sequenced using the primers of the multicloning site of pBlueScript II SK and utilizing the four restriction sites of EcoRI, PstI, HindIII and XhoI. Next, a primer oligomer is designed based on this sequence, and a novel PLA is ₁ Finally, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing was confirmed (FIG. 2). The sequence was also confirmed by direct sequencing of the RT-PCR product. As a result, polymorphisms due to individuals were observed at two positions in the nucleotide sequence. Escherichia coli containing the plasmid containing the nucleotide sequence has been deposited under Accession No. FERM P-17428 with the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology on June 22, 1999.
[0034]
The cDNA shown in SEQ ID NO: 2 of this Sequence Listing contains an open reading frame consisting of 1353 bases capable of encoding the protein consisting of 451 amino acid residues shown in SEQ ID NO: 1 of the Sequence Listing, and has a signal sequence in the N-terminal region. Had the expected area. Sequence features include N- {P}-[ST]-{P}., Which is a motif of an asparagine glycosylation site. At four locations (N (Asn) 50-C (Cys) 53, N (Asn) 58-A (Ala) 61, N (Asn) 66-K (Lys) 69, N (Asn) 357-E (Glu) 360)), and contained one RGD sequence (R (Arg) 344-D (Asp) 346) known as a motif of the cell binding region, and had 13 cysteine residues.
[0035]
In addition, it was confirmed that the enzyme was secreted extracellularly using the baculovirus expression system described below. Therefore, it is considered that the enzyme of the present invention has a signal peptide and is probably a secreted protein. The site of the signal peptide has not been determined since the N-terminal amino acid sequence of the recombinant protein has not been determined, but is predicted to be M (Met) 1-E (Glu) 19.
[0036]
(Homology with existing proteins)
A homology search using tblastn was performed on an existing database (Genbank) using the amino acid sequence predicted by translation of the nucleotide sequence. As a result, as shown in FIG. 3, the novel lipase of the present invention was obtained from human PS-PLA. ₁ (HPS-PLA ₁ ), Pancreatic lipase, human hepatic lipase, hepatic lipase, lipoprotein lipase, pancreatic lipase related protein 1 (plrp1 replate lipase repase lipase lipase lipase lipase lipase lipase lipase lipase lipase lipase lipase) ) And significant homology. In addition, the homology with vitellogenin, which is considered to have a region having a high homology to lipase in steric structure, was also high. Among the above known protein sequences having high homology, amino acid residues (S (Ser) 154, D (Asp) 178, H (His) 248) predicted as enzyme activity triads in each of the above proteins except vitellogenin. Since it was confirmed that all of the sequences were preserved, a multiple alignment table was created from these sequences using a GENETYX Multiple Alignment module (Software Development Co., Ltd.).
[0037]
As a result, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, as shown in FIG. 2, the consensus sequences GXSXG (G (Gly) 152-G (Gly) 156) and ITGLD (I ( Ile) 174-D (Asp) 178) and CXH (C (Cys) 246-H (His) 248) (X represents any amino acid), and these include amino acid residues considered to be catalytically active triads. It turned out that all were included. In addition, a loop structure (P (Pro) 234-K (Lys) 245), which is present in the vicinity of a pocket where an active triad is present in a steric structure and regulates the expression of lipase activity, is called PS-PLA. ₁ It was found that there were the same number of residues as that of No. 12, ie. Usually PS-PLA ₁ It is known that the lipase group other than lipases has a long number of amino acid residues in the lid structure and is expressed in activity by binding of a proteinaceous factor called colipase (BBA, 1376, 417). -432, 1998) (Biochemistry, 32, 4702-4707, 1993) (protein nucleic acid enzyme, 44, 1038-1042, 1999), and PS-PLA having a relatively short lid. ₁ The need for colipase has not been determined to date. Therefore, the protein translated from the nucleotide sequence obtained this time is also PS-PLA ₁ The possibility of active expression by a mechanism similar to is also expected.
[0038]
Next, the evolutionary phylogenetic tree of the sequence was predicted by the GENETYX Evolutional tree (UPGMA method) module (Software Development Co., Ltd.). As a result, the new sequence is PS-PLA ₁ It was presumed that this was the most evolutionarily close sequence. From the above, it was inferred that the protein into which the novel sequence was translated was a novel lipase that was close to the lipase group, and particularly closely related to phospholipase.
[0039]
(Confirmation of expression tissues)
Northern blotting was performed on normal human tissues in order to examine the tissues expressing the novel lipase. A PCR fragment of about 0.7 kbp, which is a cDNA fragment in the open reading frame, was used as a probe. That is, oligonucleotides having the nucleotide sequences of CTGCCGCACAACCATCAACTCCTC (forward primer sequence) of SEQ ID NO: 5 in the sequence listing and AGGGGACAGGACTCTTTTTTGTGAC (reverse primer sequence) of SEQ ID NO: 6 in the sequence listing are synthesized as PCR primers, and PCR is performed. ³² A P-labeled probe was prepared. Northern blotting was performed using a Human Multiple Tissue Northern Blot (Clontech) according to the user manual (PT1200-1, Clontech). As a result, in normal tissues, expression was observed in lung, kidney, pancreas, prostate, testis, ovary, and colon (FIG. 4).
[0040]
(Expression of new lipase)
A full-length cDNA was cut out from the above-described pBlueScript II SK (-) with EcoRI / XhoI and prepared. Plasmid pF _AST B _AC The cDNA was incorporated into the multiple cloning site of No. 1 (Lifetech Oriental) at the EcoRI / XhoI restriction enzyme site. Regarding FLAG-tag (Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys) (Biotechnology, 6, 1205-1210, 1988) attached to the C-terminal side, the stop codon is removed and the sequence is shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing. A synthetic oligonucleotide having a HindIII site at the end of the nucleic acid sequence encoding FLAG-tag (primer 2) was prepared, and an oligonucleotide in which BamHI was introduced at the beginning of the starting methionine shown in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing (primer 1) ) Was prepared, and PCR was carried out using the above-described pBlueScript II SK (-) as a template to amplify cDNA.
[0041]
Primer 1: 5'-CGC GGA TCC ATG TTG AGA TTC TAC TTA TTC ATC-3 '(SEQ ID NO: 7 in Sequence Listing)
Primer 2: 5'-CCG GAA TTC TTA CTT GTC ATC GTC GTC CTT GTA GTC CAA CTG CAA CTC TGG GCA AAG AAT-3 '(SEQ ID NO: 8 in Sequence Listing)
[0042]
Plasmid pF _AST B _AC After the cDNA was incorporated into the BamHI / EcoRI restriction enzyme site of the multiple cloning site in Example 1, the constructed pF was inserted into E. coli JM109. _AST B _AC After transfecting No. 1 and selecting a positive clone, the positive clone was cultured to recover a plasmid. This plasmid is called DH10BAC ^TM The cells were transfected into competent cells (GIBCO BRL), and the recombinant Bacmid was recovered. Obtained Bacmid is CellFECTIN ^TM (PF _AST B _AC 1) was transfected together with Sf9 cells (from Spodoptera frugiperda pupa ovary tissue).
[0043]
As a result, recombinant baculovirus (Baculovirus) was recovered in the culture supernatant. Next, for the purpose of confirming protein expression, the recovered baculovirus was infected to Sf9 insect cells and cultured at 27 ° C. for 96 hours. SDS-PAGE was performed using the expressed protein extracted from the supernatant of the infected cells as a sample, and Western blotting was performed using an antibody against FLAG-tag. As a result, a band was observed at a molecular weight of about 52 kDa of the expected novel lipase (FIG. 5). Therefore, it was confirmed that the novel lipase can be expressed in the culture supernatant by using the insect cells or the like by the above-mentioned method.
[0044]
(Purification of new lipase)
Recombinant Baculovirus (Japanese Patent Nos. 2129487 and 2644447: Production of Recombinant Baculovirus Expression Vector and Synthesis of Polypeptide) 500 ml of infected culture supernatant was collected and collected at 10,000 × g for 20 minutes and 4 minutes. Cell debris was removed by centrifugation at ℃, and a filter was further applied (Falcon pore size 0.45 μm) to further remove dust in the culture supernatant. Using an FPLC system (Amersham-Pharmacia), the above culture supernatant was applied to a heparin column (Hi-trap Heparin, Amersham-Pharmacia, 5 ml), and finally, in the presence of 10 mM Tris-HCl (pH 7.4). The gradient elution was performed with 100 mM to 1500 mM NaCl. Elution fractionation was performed in 2.5 ml portions, and a total of 20 fractions were fractionated. Next, the fractionated fractions were subjected to SDS-PAGE and subjected to Western blotting with a FLAG-tag antibody. As a result, it was confirmed that a band was detected in a specific fraction.
[0045]
Similarly, as a control, a culture supernatant infected with wild-type baculovirus was applied to a heparin column as described above to prepare a fraction eluted with a NaCl concentration gradient. The fraction was subjected to Western blotting, but no molecule to which the FLAG-tag antibody reacted was found in the fraction.
[0046]
(Examination of substrate specificity)
Using the fraction in which a band was detected with the FLAG-tag antibody, the fatty acid was [ ¹⁴ C], the phospholipase activity and the lipase activity were measured using phosphatidic acid (PA), phosphatidylserine (PS), phosphatidylcholine (PC), and triacylglycerol (TG), which were radiolabeled by J. Biol. Chem., 272, 2192-2198, 1997). Phospholipase activity (PA, PS, PC) was determined by adding 40 μM of each substrate to 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 4 mM CaCl 2 ₂ Incubated with the enzyme for 1 hour at 37 ° C in the presence, the released radiolabeled fatty acids were extracted by the Dole method, and the radioactivity was measured with a liquid scintillation counter.
[0047]
Lipase activity (TG) was determined by adding 40 μM substrate to 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 4 mM CaCl 2 ₂ Incubated with the enzyme for 1 hour at 37 ° C in the presence, the released radiolabeled fatty acids were extracted by the Dole method, and the radioactivity was measured with a liquid scintillation counter.
[0048]
As a result, the phospholipase activity of cleaving PA was detected in the fraction in which the novel lipase recombinant protein was detected by the Flag-tag antibody. No significant activity was detected with respect to the lipase activity for cleaving TG and the phospholipase activity for PC and PS. Phospholipase activity that cleaves PA was not detected in fractions eluted from the heparin column from the culture supernatant of Sf9 cells infected with wildtype baculovirus. From the above examination, the novel phospholipase A ₁ Was suggested to be involved in the production process of lysophosphatidic acid (LPA), a growth factor that promotes cell differentiation and proliferation by hydrolyzing PA.
[0049]
【The invention's effect】
As described above, the novel lipase of the present invention is a novel PLA ₁ And its substrate specificity is characterized by its activity of decomposing phosphatidic acid. The provision of a novel pharmaceutical composition and medical treatment means utilizing this property provides great utility in lipase-related clinical and basic medical fields.
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram illustrating the relationship between the nucleotide sequence of a novel lipase and the nucleotide sequence of EST. In the figure, ATG is an initiation codon, S, D, and H are active triads, CC is a lid region, and a broken line in the EST sequence is a region where the EST sequence is deleted.
FIG. 2 is a diagram illustrating the sequence of a novel lipase and the characteristics of the sequence. In the figure, a double underline indicates a signal sequence, an underline indicates a sugar chain addition predicted site, a double arrow underline indicates a lipase consensus sequence and a lid region, S, D, and H surrounded by squares (shaded) indicate active triads, squares (white (Open) indicates the RGD sequence.
FIG. 3 is a multiple alignment diagram comparing the amino acid sequences of a novel lipase (colon lipase) and a lipase having homology to the novel lipase.
FIG. 4 is a diagram confirming the expression of a novel lipase in human tissues by Northern blot.
FIG. 5 is a diagram confirming expression of a recombinant protein of a novel lipase in insect cells by Western blot.

Claims

A polypeptide selected from the following group;
(1) a polypeptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,
(2) a polypeptide containing the polypeptide of (1),
(3) a polypeptide having at least about 70% amino acid sequence homology with the polypeptide of (1), and having an activity of decomposing phosphatidic acid;
And (4) a polypeptide having a mutation such as deletion, substitution, addition or insertion of one or several amino acids in the amino acid sequence, and having an activity of decomposing phosphatidic acid.

A peptide having at least about 8 consecutive amino acid sequences of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.

A polynucleotide encoding the polypeptide or peptide according to claim 1 or a complement thereof.

A polynucleotide that hybridizes with the polynucleotide of claim 3 or a complementary strand thereof under stringent conditions.

A polynucleotide represented by at least about 15 contiguous nucleotide sequences of the polynucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or its complementary sequence.

A recombinant vector containing the polynucleotide according to claim 3.

A transformant transformed with the recombinant vector according to claim 6.

The method for producing a polypeptide or peptide according to claim 1 or 2, comprising a step of culturing the transformant according to claim 7.

An antibody that immunologically recognizes the polypeptide or peptide according to claim 1 or 2.

The antibody according to claim 9, which suppresses the activity of decomposing phosphatidic acid.

A compound that interacts with the polypeptide according to claim 1 to inhibit or activate its activity and / or a compound that interacts with the polynucleotide according to claim 3 or 4 to inhibit or promote its expression. An identification method, wherein the polypeptide or peptide according to claim 1 or 2, the polynucleotide according to claims 3 to 5, the vector according to claim 6, the transformant according to claim 7, and the transformant according to claim 7. 11. A method comprising using at least one of the antibodies according to 9 or 10.

A method for identifying a compound that interacts with the polypeptide according to claim 1 to inhibit or activate its activity, or a compound that interacts with the polynucleotide according to claim 3 or 4 to inhibit or promote its expression. And evaluating the interaction of the compound by contacting the polypeptide with the compound to be screened under conditions that allow the interaction between the compound and the polypeptide (such interaction is determined by comparing the polypeptide with the compound Related to a second component capable of providing a detectable signal in response to the interaction with the polypeptide) and then detecting the presence or absence of a signal resulting from the interaction of the compound with the polypeptide, A method comprising determining whether a compound interacts with a polypeptide to activate or inhibit its activity.

A compound identified by the method according to claim 11.

A compound that interacts with the polypeptide of claim 1 to inhibit or activate its activity, or a compound that interacts with the polynucleotide of claim 3 or 4 to inhibit or promote its expression.

The polypeptide or peptide according to claim 1 or 2, the polynucleotide according to claims 3 to 5, the vector according to claim 6, the transformant according to claim 7, and the transformant according to claim 9 or 10. A pharmaceutical composition comprising an antibody or at least one of the compounds according to claim 13 or 14.

A method for diagnosing a disease associated with the expression or activity of the polypeptide of claim 1 in an individual, comprising: (a) a nucleic acid sequence encoding said polypeptide; and / or (b) said nucleic acid sequence in an individual-derived sample. A method comprising analyzing a polypeptide as a marker.