JP2004256395A

JP2004256395A - Leukocyte migratory ability regulator

Info

Publication number: JP2004256395A
Application number: JP2003045510A
Authority: JP
Inventors: Kimiyasu Shiraki; 公康白木; Masahiko Kurokawa; 昌彦黒川; Yoshitaka Tamura; 吉隆田村; Koji Yamauchi; 恒治山内; Hiroyuki Wakabayashi; 裕之若林; Koichiro Shin; 光一郎新
Original assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Current assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Priority date: 2003-02-24
Filing date: 2003-02-24
Publication date: 2004-09-16

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a leukocyte migratory ability regulator having effects on inhibition of excessive leukocyte migration considered as a cause of serious complications such as tissue injuries or inflammations caused by infectious diseases with viruses such as influenza. <P>SOLUTION: The leukocyte migratory ability regulator is characterized as comprising a lactoferrin as an active ingredient. The leukocyte migrating to a respirator infected with the influenza viruses and having prophylactic and/or therapeutic effects on tissue injuries, bronchitis, tympanitis and pneumonia is a desired mode. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラクトフェリンを有効成分として含有することを特徴とする白血球遊走能調節剤に関する。さらに詳しくは、本発明は、インフルエンザウイルスに感染した宿主の気管や肺等の呼吸器において誘導される白血球の遊走能を抑制する調節剤であって、インフルエンザウイルス感染症を発症した宿主の症状緩和効果、及びインフルエンザウイルス感染症によって引き起こされる合併症とされる組織傷害、気管支炎、中耳炎、肺炎などの予防及び／又は治療に効果を有する白血球遊走能調節剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ウイルス感染の宿主免疫機構に及ぼす影響が、ウイルス感染症における症状の重篤化と密接に関係していることが明らかにされてきた。例えば、インフルエンザウイルスを感染させたマウスでは、好中球、マクロファージ、リンパ球などの白血球が気管や肺等の呼吸器に過剰に遊走して組織傷害を引き起こし、重篤化の大きな要因となることが明らかにされている（例えば、非特許文献１）。ウイルス感染症には、アシクロビル、アジドチミジン、リバビリン、インターフェロンをはじめとする抗ウイルス剤が使用されているが、これらの薬剤はその副作用と耐性ウイルス出現が臨床上の問題となっている。これらの抗ウイルス剤による根本治療に加えて、ウイルス感染防御能が無い薬剤も症状緩和の目的で対症療法的に使用されている。例えば、Ｃ型慢性肝炎ウイルス感染患者には、抗ウイルス作用の無いグリチルリチンが肝炎の症状緩和の目的で投与されている。
【０００３】
インフルエンザ感染症は、感染した呼吸器へ白血球等の遊走が活発となって組織傷害を引き起こし、中耳炎、気管支炎、インフルエンザ肺炎、インフルエンザ脳炎、インフルエンザ心筋炎、インフルエンザ筋炎等の合併症を併発することがあり、重篤化した場合は死に至ることがある。特に小児や高齢者などのハイリスク群では、それらの合併症による重篤化を防ぐための対策が重要な課題であると考えられている（例えば、非特許文献２）。インフルエンザウイルスを感染させたマウスでは、漢方の有効成分であるイソフェルラ酸の投与によって、抗ウイルス効果は観察されないものの、肺胞および気管内腔への白血球の遊走が抑制され、組織傷害の抑制などの症状緩和作用が認められている（例えば、非特許文献１又は３）。さらに、生体における抗酸化酵素であるヘムオキシゲナーゼを遺伝子導入により呼吸器で発現させたマウスでは、普通のマウスと比較して、肺に検出されるウイルス量に変化は観察されないものの、肺胞および気管内腔への白血球の遊走が抑制され、組織傷害が抑制されるなどの症状緩和作用が認められている（例えば、非特許文献４）。
【０００４】
ラクトフェリンは、哺乳類の乳汁、唾液、涙液、気道粘液等の分泌液に含有される鉄結合性糖タンパク質であり（例えば、非特許文献５）、工業的には牛乳から大量スケールで精製される（例えば、特許文献１）。ラクトフェリンには、抗菌性、抗ウイルス活性、腸管からの鉄吸収調節作用、細胞増殖作用、免疫調節作用等の多様な生物機能が報告されており（例えば、非特許文献５）、すでにインフルエンザウイルス感染防御剤（例えば、特許文献２）、病原性細菌及びウイルス感染防御剤（例えば、特許文献３）、大腸菌付着防止剤（例えば、特許文献４）等に関する技術が開示されている。しかしながら、ラクトフェリンがウイルス感染に伴う組織傷害や炎症を引き起こす可能性がある白血球の遊走を調節する効果は一切報告されていなかった。
【０００５】
【特許文献１】
特公平６−１３５６０号公報
【特許文献２】
特許第３０６１３７６号公報
【特許文献３】
特開平１１−２８６４５２号公報
【特許文献４】
特許第２８３２５１７号公報
【０００６】
【非特許文献１】
ジャーナル・オブ・バイロロジー（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ）、アメリカ、第７４巻、２０００年、ｐ．２４７２−２４７６
【非特許文献２】
日本臨床、第５８巻、２０００年、ｐ．２２４９−２２８１
【非特許文献３】
メディエーター・オブ・インフラメーション（ＭｅｄｉａｔｏｒｓｏｆＩｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）、イギリス、第１０巻、２００１年、ｐ．９３−９６
【非特許文献４】
ジーン・セラピー（ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ）、イギリス、第８巻、２００１年、ｐ．１４９９−１５０７
【非特許文献５】
アニュアル・レビュー・オブ・ニュートリション（ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＮｕｔｒｉｔｉｏｎ）、アメリカ、第１５巻、１９９５年、ｐ．９３−１１０
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上述したように、前記特許文献２又は特許文献３には、ラクトフェリンによるインフルエンザウイルスの感染防御及び感染症の治療効果が開示されていたが、感染症を発症した宿主の呼吸器等において誘導される白血球遊走を調節する効果は示されていなかった。また、感染症に伴って白血球が遊走された呼吸器における炎症反応や組織傷害を予防又は改善する効果についても開示されていなかった。
【０００８】
白血球は本来、外から侵入した異物から体を守るという免疫機能の主役を担い、空気中の細菌やウイルス等の異物が体内に侵入すると、これを認識し、すばやく攻撃して、抗体（異物をキャッチするもの）を作り、体の外に排除しようとする機能を有しており、その際に放出されたメディエーターによって炎症が起こる。本発明者らは、感染症などの際に、白血球が活性化して異常に反応したり、過剰な炎症反応が起きると重篤化して合併症を併発することに注目し、その原因の一つとして考えられる過剰な白血球遊走をコントロールすることが可能な手段を鋭意検討してきた結果、乳中に含まれる蛋白質であるラクトフェリンに白血球遊走能を抑制する効果が存在することを発見し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明は、インフルエンザ等のウイルスによる感染症によって引き起こされる組織傷害や炎症等の重症合併症の原因と考えられる過剰の白血球遊走を抑制する効果を有する白血球遊走能調節剤を提供することを目的としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決する本発明の態様は、ラクトフェリンを有効成分として含有することを特徴とする白血球遊走能調節剤であって、該白血球がインフルエンザウイルス感染呼吸器に遊走される白血球であること、並びに組織傷害、気管支炎、中耳炎、肺炎の予防及び／又は治療に効果を有すること、を望ましい態様としている。
【００１１】
【発明の実施の形態】
次に、本発明の好ましい実施態様について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施態様に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。尚、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示である。
【００１２】
本発明に使用されるラクトフェリンは、ウシ、ヒト、ヤギ、ヒツジ、ウマ等の哺乳類の初乳、移行乳、常乳、末期乳、またはこれらの乳の処理物である脱脂乳、ホエー等から常法（例えば、イオンクロマトグラフィー等）によって分離されたラクトフェリンである。より簡便には、市販のラクトフェリン（例えば森永乳業社製等）を使用することができる。また、遺伝子操作によって微生物、動物細胞、トランスジェニック動物等で生産した各種ラクトフェリンを使用してもよい。
【００１３】
本発明における白血球遊走能調節効果とは、白血球の遊走能を抑制あるいは促進することで、宿主の生理機能を正常に維持する効果を意味する。本発明のラクトフェリンにおいては、特に白血球の遊走能を抑制する効果を有し、これに伴って、インフルエンザウイルス感染症を発症した宿主の症状緩和効果、及びインフルエンザウイルス感染症によって引き起こされる合併症とされる組織傷害、気管支炎、中耳炎、肺炎などの予防及び／又は治療において極めて有効であると考えられる。
【００１４】
ラクトフェリンは、白血球遊走能を調節する作用を有しているので、白血球遊走能調節剤（以下、「本発明の調節剤」という場合がある。）の有効成分として使用することができる。ここで、「有効成分」とは、白血球遊走能を調節する作用を有する成分を意味し、ラクトフェリンが本発明の調節剤の主成分である必要はなく、また、本発明の調節剤にはラクトフェリン以外に白血球遊走能を調節する作用を有する成分が含まれていてもよい。
【００１５】
本発明において、白血球遊走能調節剤とは、インフルエンザ等のウイルスによる感染症によって引き起こされる気管や肺等の呼吸器における組織傷害や炎症等の重症合併症の原因と考えられる過剰の白血球遊走を抑制する効果を有し、白血球の遊走能を調節することによって、インフルエンザウイルス感染症などによって併発される各種重症合併症や炎症性疾患、組織傷害等の症状緩和作用を有する効果も包含するが、過剰の白血球遊走に起因する疾患に対する予防及び／又は治療の使用に限定されるものではない。本発明の白血球遊走能調節剤は、その有効成分が乳タンパク質等の食品素材に含まれるものであるので、ヒトに対する安全性が高く、飲食品に含有させた組成物として日常的に経口摂取することによってインフルエンザウイルスなどの感染症によって引き起こされる重症合併症等に対する予防及び／又は治療に効果が発揮される特徴を併せ持つ。
【００１６】
本発明の白血球遊走能調節剤の形態は特に限定されるものではなく、本発明の形態としては、例えば、医薬組成物が挙げられる。本発明の白血球遊走能調節剤を摂取する形態としては、調製粉乳、経腸栄養食、機能性食品等の各種飲食品組成物に配合して摂取する形態が挙げられる。
【００１７】
本発明の調節剤は、ラクトフェリンそれ自体であってもよいし、ラクトフェリン以外の成分を含有していてもよい。ラクトフェリン以外の成分は、摂取の形態に応じて適宜選択できる。例えば、ラクトフェリン粉末やラクトフェリン水溶液（シロップ等）等を本発明の白血球遊走能調節剤として配合して各種飲食品を調製してもよい。
【００１８】
医薬組成物は、例えば、ラクトフェリンを、薬学的に許容され得る賦形剤その他任意の添加剤を用いて製剤化することにより製造でき、製剤化したラクトフェリンは、インフルエンザウイルスなどの感染症によって引き起こされる重症合併症等に対する予防及び／又は治療剤として使用できる。製剤化する場合、製剤中のラクトフェリンの含有量は、通常０．００１〜２０質量％、好ましくは０．１〜１５質量％である。製剤化にあたっては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、注射剤用溶剤等の添加剤を使用できる。
【００１９】
賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニット、ソルビット等の糖誘導体；トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン、α−デンプン、デキストリン、カルボキシメチルデンプン等のデンプン誘導体；結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等のセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルラン；軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム等の珪酸塩誘導体；リン酸カルシウム等のリン酸塩誘導体；炭酸カルシウム等の炭酸塩誘導体；硫酸カルシウム等の硫酸塩誘導体等が挙げられ、結合剤としては、例えば、上記賦形剤の他、ゼラチン；ポリビニルピロリドン；マグロゴール等が挙げられ、崩壊剤としては、例えば、上記賦形剤の他、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン等の化学修飾されたデンプン又はセルロース誘導体等が挙げられ、滑沢剤としては、例えば、タルク；ステアリン酸；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等のステアリン酸金属塩；コロイドシリカ；ビーガム、ゲイロウ等のワックス類；硼酸；グリコール；フマル酸、アジピン酸等のカルボン酸類；安息香酸ナトリウム等のカルボン酸ナトリウム塩；硫酸ナトリウム等の硫酸類塩；ロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム等のラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物等の珪酸類；デンプン誘導体等が挙げられ、安定剤としては、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン等のパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール等のアルコール類；塩化ベンザルコニウム；無水酢酸；ソルビン酸等が挙げられ、矯味矯臭剤としては、例えば、甘味料、酸味料、香料等が挙げられ、注射剤用溶剤としては、例えば、水、エタノール、グリセリン等が挙げられる。
【００２０】
医薬組成物の投与経路としては、例えば、経口投与、経腸投与等の非経口投与が挙げられ、医薬組成物の投与剤形としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等が挙げられる。また、医薬組成物は、飲食品、飼料等に配合して投与することもできる。投与投与量及び投与回数は、目的とする作用効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、投与量は、成人１日当たり通常１０ｍｇ〜１０ｇの範囲から適宜選択でき、投与回数は、１日１回から数回の範囲から適宜選択できる。
【００２１】
飲食品組成物に配合して摂取する形態としては、例えば、ラクトフェリン粉末やラクトフェリン水溶液（シロップ等）等を本発明の白血球遊走能調節剤として配合した清涼飲料、乳飲料等又はこれらの飲料の濃縮原液及び調整用粉末；加工乳、発酵乳等の乳製品；経腸栄養食；機能性食品等が挙げられる。
【００２２】
飲食品組成物の形状としては、タブレット状のサプリメントを例示することができる。これによって、一日当りの食事量及び摂取カロリーを他の食品の摂取量を加味した上でコントロールする必要が無く、また、有効成分の摂取量を正確に把握できる。
【００２３】
本発明において、ラクトフェリンによる白血球遊走能調節作用を評価するために、以下の報告、『ジャーナル・オブ・バイロロジー（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ）、アメリカ、第７４巻、２０００年、ｐ．２４７２−２４７６』、及び『ジーン・セラピー（ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ）、イギリス、第８巻、２００１年、ｐ．１４９９−１５０７』に基づき、インフルエンザ感染モデルマウスによる、炎症細胞数抑制作用、及び肺コンソリデーション（肺炎症の重症度）として検討した。詳細は、後記する試験例の方法に従った。
【００２４】
次に試験例を示して本発明を詳細に説明する。
［試験例１］
本試験は、インフルエンザウイルス感染症を発症した宿主の呼吸器における白血球遊走、及び組織傷害に対するラクトフェリンの抑制作用を調べるために行った。
【００２５】
（１）試料の調製
ラクトフェリン（森永乳業社製）を、精製水に１２．５％の濃度に溶解して試験試料とした。供試ウイルスとして、インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）株を用いた。
【００２６】
（２）試験方法
７週齢のＢＡＬＢ／Ｃ雌性マウス（日本エス・エル・シー社から購入）１２匹を、糞食防止ネットを設置したケージに入れ、標準固形飼料（日本クレア社製）と飲水で一週間馴化飼育した。次に、マウスを６匹ずつ２群に分け、そのうち試験群としては前記試験試料０．５ｍｌをゾンデで経口投与した。またもう１群には対照群として精製水０．５ｍｌをゾンデで経口投与した。これらの経口投与は、感染１日前から開始し、感染５日後まで一日一回ずつ７日間行った。感染日には、すべてのマウスに麻酔下でインフルエンザウイルス６６０ＰＦＵ（プラーク形成単位）を含むリン酸緩衝液１０μｌを経鼻的に接種した。感染６日後に解剖を行い、気道に注射針を差し込み、１ｍｌの血清無添加イーグルＭＥＭ培地（日水製薬社製）を注射器で注入した後、同じ注射器内に液を回収した。同様の注入と回収を、さらに２回、合計３回繰り返した。このようにして採取した気管支肺胞洗浄液を１０００回転で遠心分離した。この気管支肺胞洗浄液の上清中のウイルス量を定法〔ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジー（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＶｉｒｏｌｏｇｙ）、イギリス、第７１巻、１９９０年、ｐ．２１４９−２１５５〕によって測定した。さらに、気管支肺胞洗浄液の遠心分離の残さに回収された白血球数を細胞数測定装置（日本光電社製）を用いて測定した。さらに、気管支肺胞洗浄液を回収した後のマウスから肺を摘出し、インフルエンザウイルス感染症による組織傷害の指標であるコンソリデーションを観察した。肺コンソリデーションの重症度は、〔ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ）、アメリカ、第９５巻、１９５２年、ｐ．１３５−１４５〕を参考にして、０（コンソリデーションなし）から１０（重篤なコンソリデーション）にスコア化した。これらの測定値は、一群６匹の平均値として表示した。
【００２７】
（３）試験結果
本試験の結果は表１に示すとおりである。表１は、気管支肺胞洗浄液１ｍｌ当りの白血球数及び肺コンソリデーションを表す。表１から明らかなとおり、気管支肺胞洗浄液１ｍｌ当りの白血球数は、対照群で９．６×１０^５であるのに対し、ラクトフェリンを投与した試験群では４．８×１０^５に抑制されたことから、ラクトフェリンによるインフルエンザウイルス感染症に対する白血球遊走調節作用が確認された。また、肺コンソリデーションのスコアは、対照群で５．０であるのに対し、ラクトフェリンを投与した試験群では３．８に抑制されたことから、ラクトフェリンによって、インフルエンザウイルス感染症に対する組織傷害抑制作用が確認された。一方、これとは別に気管支肺胞洗浄液の上清中のウイルス量を計測したところ、対照群と試験群の間でウイルス量の差は観察されなかった。これらの結果から、ラクトフェリンは、インフルエンザウイルス感染症に対して抗ウイルス効果を示さないものの、白血球遊走調節作用および組織傷害抑制作用を示すことが明らかになった。
【００２８】
【表１】

【００２９】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３０】
【実施例】
実施例１
次の組成の白血球遊走能調節効果を有する注射剤を常法により製造した。
ラクトフェリン（森永乳業社製）２．０（％）
アクチノマイシンＤ（シグマ社製）０．００５
塩化ナトリウム（和光純薬社製）０．９
マンニトール（関東化学社製）１．０
注射用蒸留水（大塚製薬社製）９６．０９５
【００３１】
実施例２
乳糖（メグレ社製）６００ｇ、トウモロコシデンプン（日清製粉社製）４００ｇ、結晶セルロース（和光純薬工業社製）４００ｇ及びラクトフェリン（森永乳業社製）６００ｇを５０メッシュのふるい（ヤマト科学社製）により篩い分けし、厚さ０．５ｍｍのポリエチレン製の袋にとり、転倒混合し、全自動カプセル充填機（セセレ・ペディーニ社製。プレス式）を用い、前記粉末をカプセル（日本エランコ社製。１号ゼラチンカプセル、Ｏｐ．ＹｅｌｌｏｗＮｏ．６Ｂｏｄｙ、空重量７５ｍｇ）に内容量２７５ｍｇで充填し、白血球遊走調節効果を有するカプセル剤７０００個を得た。
【００３２】
実施例３
ホエー蛋白酵素分解物（森永乳業社製）１０．８ｋｇ、デキストリン（昭和産業社製）３６ｋｇ、および少量の水溶性ビタミンとミネラルを水２００ｋｇに溶解し、水相をタンク内に調製した。これとは別に、大豆サラダ油（太陽油脂社製）３ｋｇ、パーム油（太陽油脂社製）８．５ｋｇ、サフラワー油（太陽油脂社製）２．５ｋｇ、レシチン（味の素社製）０．２ｋｇ、脂肪酸モノグリセリド（花王社製）０．２ｋｇ、及び少量の脂溶性ビタミンを混合溶解し、油相を調製した。タンク内の水相に油相を添加し、攪拌して混合した後、７０℃に加温し、更に、ホモゲナイザーにより１４．７ＭＰａの圧力で均質化した。次いで、９０℃で１０分間殺菌した後、濃縮し、噴霧乾燥して、中間製品粉末約５９ｋｇを調製した。この中間製品粉末５０ｋｇに、蔗糖（ホクレン社製）６．８ｋｇ、アミノ酸混合粉末（味の素社製）１６７ｇ、およびラクトフェリン（森永乳業社製）６０ｇを添加し、均一に混合して、白血球遊走能調節剤であるラクトフェリンを含有する経腸栄養食粉末約５６ｋｇを製造した。
【００３３】
実施例４
ラクトフェリン（森永乳業社製）１５０ｇ、ラクチュロース粉末（森永乳業社製）１００ｇ、マルツデキストリン（松谷化学工業社製）６３５ｇ、脱脂粉乳（森永乳業社製）８５ｇ、ステビア甘味料（三栄源エフ・エフ・アイ社製）１ｇ、ヨーグルト・フレーバー（三栄源エフ・エフ・アイ社製）５ｇ、グリセリン脂肪酸エステル製剤（理研ビタミン社製）２４ｇの各粉末を添加して均一に混合し、打錠機（畑鉄鋼所社製）を使用して、錠剤１錠当り０．５ｇとし、１２錠／分の打錠速度、９．８ＫＰａの圧力で前記混合粉末を連続的に打錠し、白血球遊走能調節剤であるラクトフェリンを含有するタブレット１８００錠（約９００ｇ）を製造した。
【００３４】
【発明の効果】
以上詳記したとおり、本発明はラクトフェリンを有効成分として含有することを特徴とする白血球遊走能調節剤に関するものであり、本発明により奏される効果は次のとおりである。
（１）インフルエンザウイルス感染症を発症した宿主の呼吸器において誘導される白血球遊走を抑制することができる。
（２）インフルエンザウイルス感染症によって引き起こされる組織傷害、気管支炎、中耳炎、肺炎等の合併症の予防及び／又は治療に効果を有する。
（３）乳等の原料から安価で大量に製造することができる。
（４）ヒトに対する安全性が高く、日常的に摂取することが可能である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
TECHNICAL FIELD The present invention relates to a leukocyte migration regulator, comprising lactoferrin as an active ingredient. More specifically, the present invention relates to a regulator for suppressing the migration of leukocytes induced in the respiratory tract such as the trachea and lungs of a host infected with an influenza virus, which alleviates the symptoms of a host who has developed an influenza virus infection. The present invention relates to a regulator of leukocyte migration ability, which is effective in preventing and / or treating tissue injury, bronchitis, otitis media, pneumonia and the like, which are complications caused by influenza virus infection.
[0002]
[Prior art]
In recent years, it has been revealed that the effects of viral infection on host immune mechanisms are closely related to the severity of symptoms in viral infections. For example, in mice infected with influenza virus, leukocytes such as neutrophils, macrophages, and lymphocytes excessively migrate to the respiratory tract such as the trachea and lungs, causing tissue damage, which is a major factor in the severity of the disease. (For example, Non-Patent Document 1). Antiviral agents such as acyclovir, azidothymidine, ribavirin, and interferon have been used for viral infections, but the side effects of these agents and the emergence of resistant viruses have become clinical problems. In addition to these radical treatments with antiviral agents, drugs that are not protective against viral infections have also been used symptomatically for the purpose of symptomatic relief. For example, glycyrrhizin having no antiviral action is administered to patients with chronic hepatitis C virus infection for the purpose of alleviating the symptoms of hepatitis.
[0003]
Influenza infection can cause leukocyte migration into infected respiratory organs and cause tissue damage, and can cause complications such as otitis media, bronchitis, influenza pneumonia, influenza encephalitis, influenza myocarditis, and influenza myositis. Yes, it can be fatal if severe. In particular, in high-risk groups such as children and the elderly, measures to prevent seriousness due to their complications are considered to be an important issue (for example, Non-Patent Document 2). In mice infected with the influenza virus, administration of isoferulic acid, an active ingredient of Chinese medicine, does not show antiviral effects, but suppresses migration of leukocytes into the alveoli and tracheal lumen, and suppresses tissue damage. A symptom-relieving effect has been observed (for example, Non-Patent Document 1 or 3). Furthermore, in mice in which heme oxygenase, an antioxidant enzyme in the living body, is expressed in the respiratory tract by gene transfer, no change is observed in the amount of virus detected in the lungs compared to normal mice, but alveoli and air. Symptom-relieving effects such as suppression of leukocyte migration into the lumen of the lumen and suppression of tissue injury have been observed (for example, Non-Patent Document 4).
[0004]
Lactoferrin is an iron-binding glycoprotein contained in secretions such as milk, saliva, tears, and airway mucus of mammals (for example, Non-Patent Document 5), and is industrially purified from milk on a large scale. (For example, Patent Document 1). Lactoferrin has been reported to have various biological functions such as antibacterial activity, antiviral activity, regulation of iron absorption from the intestinal tract, cell proliferation and immunoregulation (for example, Non-Patent Document 5). Techniques related to protective agents (for example, Patent Document 2), protective agents for pathogenic bacteria and viruses (for example, Patent Document 3), Escherichia coli adhesion inhibitor (for example, Patent Document 4) and the like are disclosed. However, no effect of lactoferrin on the migration of leukocytes, which may cause tissue damage and inflammation associated with viral infection, has not been reported.
[0005]
[Patent Document 1]
JP-B-6-13560 [Patent Document 2]
Japanese Patent No. 3061376 [Patent Document 3]
JP-A-11-286452 [Patent Document 4]
Japanese Patent No. 2832517 [0006]
[Non-patent document 1]
Journal of Virology, USA, Vol. 74, 2000, p. 2472-2476
[Non-patent document 2]
Japanese clinical study, vol. 58, 2000, p. 2249-2281
[Non-Patent Document 3]
Mediators of Infrastructure, United Kingdom, Volume 10, 2001, p. 93-96
[Non-patent document 4]
Gene Therapy, UK, Vol. 8, 2001, p. 1499-1507
[Non-Patent Document 5]
Annual Review of Nutrition, USA, Vol. 15, 1995, p. 93-110
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, Patent Literature 2 or Patent Literature 3 discloses the effect of lactoferrin to protect against influenza virus infection and treat infectious diseases, but is induced in the respiratory organs of the host that has developed the infectious disease. No effect in modulating leukocyte migration was shown. Further, there is no disclosure of an effect of preventing or ameliorating an inflammatory reaction or tissue injury in a respiratory tract in which leukocytes have migrated in association with an infection.
[0008]
Leukocytes naturally play a major role in the immune function, protecting the body from foreign substances that have entered from the outside. When foreign substances such as bacteria and viruses in the air enter the body, they recognize them and attack them quickly, It has the function of making something that catches and excluding it from the body, and the mediator released at that time causes inflammation. The present inventors have noticed that, during infections, etc., leukocytes are activated and abnormally respond, or that when an excessive inflammatory reaction occurs, they become severe and complications occur. As a result of intensive studies on means capable of controlling excessive leukocyte migration that can be considered as, it was discovered that lactoferrin, a protein contained in milk, has an effect of suppressing leukocyte migration ability, and the present invention It was completed.
[0009]
An object of the present invention is to provide a leukocyte migration regulator which has an effect of suppressing excessive leukocyte migration which is considered to be a cause of severe complications such as tissue injury and inflammation caused by infection by viruses such as influenza. I have.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
An embodiment of the present invention that solves the above-mentioned problem is a leukocyte migration regulator comprising lactoferrin as an active ingredient, wherein the leukocyte is a leukocyte that migrates to an influenza virus-infected respiratory organ, and It is a desirable embodiment to have an effect on the prevention and / or treatment of tissue injury, bronchitis, otitis media, and pneumonia.
[0011]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Next, preferred embodiments of the present invention will be described in detail. However, the present invention is not limited to the following preferred embodiments, and can be freely modified within the scope of the present invention. In addition, in this specification, the percentage is represented by mass unless otherwise specified.
[0012]
The lactoferrin used in the present invention is usually derived from colostrum, transitional milk, normal milk, end-stage milk of mammals such as cows, humans, goats, sheep, and horses, or skim milk, whey, etc. which are processed products of these milks. Lactoferrin separated by a method (eg, ion chromatography). More conveniently, commercially available lactoferrin (for example, manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd.) can be used. In addition, various lactoferrins produced in microorganisms, animal cells, transgenic animals, and the like by genetic manipulation may be used.
[0013]
The effect of regulating leukocyte migration ability in the present invention means an effect of suppressing or promoting leukocyte migration ability, thereby maintaining the normal physiological function of the host. The lactoferrin of the present invention particularly has an effect of suppressing the migration ability of leukocytes, and is thus associated with a symptom-relieving effect of a host who has developed influenza virus infection, and a complication caused by influenza virus infection. It is considered to be extremely effective in the prevention and / or treatment of tissue injury, bronchitis, otitis media, pneumonia and the like.
[0014]
Since lactoferrin has an action of regulating leukocyte migration ability, it can be used as an active ingredient of a leukocyte migration regulator (hereinafter sometimes referred to as “regulator of the present invention”). Here, the “active ingredient” means a component having an action of regulating leukocyte migration ability, and lactoferrin does not need to be the main component of the regulator of the present invention. In addition, a component having an action of regulating leukocyte migration ability may be contained.
[0015]
In the present invention, the leukocyte migration regulator refers to suppresses excessive leukocyte migration which is considered to be a cause of severe complications such as tissue injury and inflammation in respiratory tracts such as trachea and lungs caused by infections by viruses such as influenza. By regulating leukocyte migration ability, it also has the effect of alleviating symptoms such as various severe complications, inflammatory diseases, and tissue injury caused by influenza virus infections, but it Is not limited to the use of prophylaxis and / or treatment for diseases caused by leukocyte migration. Since the leukocyte migration regulator of the present invention has an active ingredient contained in a food material such as milk protein, it is highly safe for humans, and is orally ingested daily as a composition contained in food and drink. Thus, the present invention also has a feature that it is effective in preventing and / or treating severe complications caused by infectious diseases such as influenza virus.
[0016]
The form of the leukocyte migration regulator of the present invention is not particularly limited, and examples of the form of the present invention include a pharmaceutical composition. Examples of the form of ingesting the leukocyte migration-regulating agent of the present invention include forms in which the composition is incorporated into various food and drink compositions such as milk powder, enteral nutritional foods, and functional foods.
[0017]
The regulator of the present invention may be lactoferrin itself or may contain components other than lactoferrin. Components other than lactoferrin can be appropriately selected according to the form of intake. For example, various foods and drinks may be prepared by blending lactoferrin powder, lactoferrin aqueous solution (syrup and the like) and the like as the leukocyte migration regulator of the present invention.
[0018]
Pharmaceutical compositions can be prepared, for example, by formulating lactoferrin with pharmaceutically acceptable excipients and any other additives, wherein the formulated lactoferrin is caused by an infectious disease such as an influenza virus. It can be used as a prophylactic and / or therapeutic agent for severe complications and the like. In the case of formulation, the content of lactoferrin in the formulation is usually 0.001 to 20% by mass, preferably 0.1 to 15% by mass. In formulating, additives such as excipients, binders, disintegrants, lubricants, stabilizers, flavoring agents, diluents, and solvents for injections can be used.
[0019]
Examples of the excipient include sugar derivatives such as lactose, sucrose, glucose, mannitol, and sorbitol; starch derivatives such as corn starch, potato starch, α-starch, dextrin, and carboxymethyl starch; crystalline cellulose, hydroxypropyl cellulose, Cellulose derivatives such as hydroxypropylmethylcellulose, carboxymethylcellulose, and carboxymethylcellulose calcium; gum arabic; dextran; pullulan; silicate derivatives such as light anhydrous silicic acid, synthetic aluminum silicate and magnesium metasilicate aluminate; phosphate derivatives such as calcium phosphate; Carbonate derivatives such as calcium; sulfate derivatives such as calcium sulfate; and examples of the binder include, in addition to the above-mentioned excipients, gelatin; polyvinylpyrrolidone; Examples of the disintegrant include, in addition to the above-mentioned excipients, croscarmellose sodium, sodium carboxymethyl starch, chemically modified starch such as cross-linked polyvinylpyrrolidone, and cellulose derivatives. Examples of the agent include talc; stearic acid; metal stearates such as calcium stearate and magnesium stearate; colloidal silica; waxes such as veegum and gay wax; boric acid; glycol; carboxylic acids such as fumaric acid and adipic acid; Sodium salts such as sodium carboxylate; sulfates such as sodium sulfate; leucine; lauryl sulfates such as sodium lauryl sulfate and magnesium lauryl sulfate; silicic acids such as anhydrous silicic acid and silicic acid hydrate; starch derivatives; As a stabilizer, For example, paraoxybenzoic acid esters such as methylparaben and propylparaben; alcohols such as chlorobutanol, benzyl alcohol, and phenylethyl alcohol; benzalkonium chloride; acetic anhydride; sorbic acid; and the like; And sweeteners, acidulants, flavors and the like, and examples of the solvent for injection include water, ethanol, glycerin and the like.
[0020]
The administration route of the pharmaceutical composition includes, for example, parenteral administration such as oral administration and enteral administration, and the dosage form of the pharmaceutical composition includes, for example, sprays, capsules, tablets, granules, syrups Agents, emulsions, suppositories, injections, ointments, tapes and the like. Further, the pharmaceutical composition can be administered by being blended into foods and drinks, feeds and the like. The administration dose and the number of administrations vary depending on the intended effect, administration method, treatment period, age, body weight, etc., but the dose can be appropriately selected from a range of usually 10 mg to 10 g per adult per day. It can be appropriately selected from a range of once to several times a day.
[0021]
Examples of the form to be ingested in the food or drink composition include, for example, soft drinks, milk drinks, etc., in which lactoferrin powder or lactoferrin aqueous solution (syrup or the like) is mixed as the leukocyte migration regulator of the present invention, or concentration of these drinks Undiluted solution and powder for preparation; dairy products such as processed milk and fermented milk; enteral nutrition; functional foods and the like.
[0022]
As the shape of the food and drink composition, a tablet-shaped supplement can be exemplified. Thus, it is not necessary to control the daily amount of food and calorie intake in consideration of the intake of other foods, and it is possible to accurately grasp the intake of the active ingredient.
[0023]
In the present invention, the following report, "Journal of Virology (Journal of Virology), USA, Vol. 74, 2000, p. 2472-2476, and Gene Therapy, UK, Vol. 8, 2001, p. 1499-1507], the effect of suppressing the number of inflammatory cells in influenza-infected model mice and lung consolidation (severity of lung inflammation) were examined. The details followed the method of the test example described later.
[0024]
Next, the present invention will be described in detail with reference to test examples.
[Test Example 1]
This test was conducted to examine the inhibitory effect of lactoferrin on leukocyte migration and tissue injury in the respiratory tract of a host that developed influenza virus infection.
[0025]
(1) Preparation of Sample Lactoferrin (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd.) was dissolved in purified water to a concentration of 12.5% to prepare a test sample. The influenza virus A / PR / 8/34 (H1N1) strain was used as the test virus.
[0026]
(2) Test method Twelve 7-week-old BALB / C female mice (purchased from SLC, Inc.) were placed in a cage provided with a feces-prevention net, and standard solid feed (manufactured by CLEA Japan) was added. They were bred for 1 week with drinking water. Next, the mice were divided into two groups of six mice, and as a test group, 0.5 ml of the test sample was orally administered via a probe. In the other group, 0.5 ml of purified water was orally administered via a sonde as a control group. These oral administrations were started one day before the infection and performed once a day for 7 days until 5 days after the infection. On the day of infection, all mice were nasally inoculated under anesthesia with 10 μl of phosphate buffer containing 660 PFU of influenza virus (plaque forming units). Six days after infection, dissection was performed, a syringe needle was inserted into the respiratory tract, 1 ml of serum-free Eagle's MEM medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) was injected with a syringe, and the liquid was recovered in the same syringe. The same injection and collection were repeated two more times, for a total of three times. The bronchoalveolar lavage fluid thus collected was centrifuged at 1000 rpm. The amount of virus in the supernatant of the bronchoalveolar lavage fluid was determined by a conventional method [Journal of General Virology, UK, Vol. 71, 1990, p. 2149-2155]. Further, the number of leukocytes collected in the residue of the bronchoalveolar lavage fluid after centrifugation was measured using a cell counting device (manufactured by Nihon Kohden). Furthermore, the lung was removed from the mouse after collecting the bronchoalveolar lavage fluid, and consolidation, which is an indicator of tissue injury due to influenza virus infection, was observed. The severity of pulmonary consolidation is described in [Journal of Experimental Medicine, USA, Vol. 95, 1952, p. 135-145], the score was scored from 0 (no consolidation) to 10 (serious consolidation). These measurements were expressed as the average of 6 animals per group.
[0027]
(3) Test results The results of this test are as shown in Table 1. Table 1 shows the white blood cell count per 1 ml of bronchoalveolar lavage fluid and lung consolidation. As is clear from Table 1, the number of leukocytes per 1 ml of bronchoalveolar lavage fluid was 9.6 × 10 ⁵ in the control group, but was suppressed to 4.8 × 10 ⁵ in the test group to which lactoferrin was administered. Thus, the effect of lactoferrin on regulating leukocyte migration against influenza virus infection was confirmed. In addition, the pulmonary consolidation score was 5.0 in the control group, but was suppressed to 3.8 in the test group to which lactoferrin was administered. Thus, the effect of lactoferrin on tissue injury suppression against influenza virus infection was confirmed. Was confirmed. On the other hand, when the amount of virus in the supernatant of bronchoalveolar lavage fluid was measured separately, no difference in the amount of virus was observed between the control group and the test group. These results revealed that lactoferrin did not show an antiviral effect against influenza virus infection, but showed a leukocyte migration regulating effect and a tissue injury suppressing effect.
[0028]
[Table 1]

[0029]
Next, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples.
[0030]
【Example】
Example 1
An injection having the following composition having the effect of regulating leukocyte migration was prepared by a conventional method.
Lactoferrin (Morinaga Dairy) 2.0 (%)
Actinomycin D (manufactured by Sigma) 0.005
Sodium chloride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) 0.9
Mannitol (Kanto Chemical) 1.0
Distilled water for injection (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) 96.095
[0031]
Example 2
A 50-mesh sieve (manufactured by Yamato Scientific Co., Ltd.) comprising 600 g of lactose (manufactured by Megre Corporation), 400 g of corn starch (manufactured by Nisshin Seifun Co., Ltd.), 400 g of crystalline cellulose (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 600 g of lactoferrin (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd.) The powder was placed in a 0.5 mm thick polyethylene bag, mixed by inversion, and the powder was converted into a capsule (Nippon Elanco. No. 6 gelatin capsule, Op. Yellow No. 6 Body, empty weight of 75 mg) was filled with 275 mg of the content to obtain 7000 capsules having a leukocyte migration regulating effect.
[0032]
Example 3
10.8 kg of whey protein enzyme digest (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd.), 36 kg of dextrin (manufactured by Showa Sangyo Co., Ltd.), and small amounts of water-soluble vitamins and minerals were dissolved in 200 kg of water, and an aqueous phase was prepared in the tank. Separately, 3 kg of soybean salad oil (manufactured by Taiyo Yushi), 8.5 kg of palm oil (manufactured by Taiyo Yushi), 2.5 kg of safflower oil (manufactured by Taiyo Yushi), 0.2 kg of lecithin (manufactured by Ajinomoto), An oil phase was prepared by mixing and dissolving 0.2 kg of fatty acid monoglyceride (manufactured by Kao Corporation) and a small amount of fat-soluble vitamin. The oil phase was added to the aqueous phase in the tank, mixed with stirring, heated to 70 ° C., and homogenized with a homogenizer at a pressure of 14.7 MPa. Next, the mixture was sterilized at 90 ° C. for 10 minutes, concentrated, and spray-dried to prepare about 59 kg of an intermediate product powder. To 50 kg of this intermediate product powder, 6.8 kg of sucrose (manufactured by Hokuren), 167 g of mixed powder of amino acid (manufactured by Ajinomoto Co.), and 60 g of lactoferrin (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd.) are added and uniformly mixed to adjust leukocyte migration ability. About 56 kg of enteral nutritional powder containing lactoferrin as an agent was produced.
[0033]
Example 4
Lactoferrin (Morinaga Dairy Co., Ltd.) 150 g, lactulose powder (Morinaga Dairy Co., Ltd.) 100 g, malt dextrin (Matsuya Chemical Industry Co., Ltd.) 635 g, skim milk powder (Morinaga Dairy Co., Ltd.) 85 g, stevia sweetener (San-Ei Gen F.F. 1 g), 5 g of yogurt flavor (manufactured by Saneigen FFI) and 24 g of glycerin fatty acid ester preparation (manufactured by RIKEN Vitamin Co.) are added and uniformly mixed. 0.5 g per tablet, using a tableting speed of 12 tablets / min, at a pressure of 9.8 KPa, and continuously tableting the mixed powder. 1800 tablets (about 900 g) containing lactoferrin.
[0034]
【The invention's effect】
As described above in detail, the present invention relates to a leukocyte migration regulator comprising lactoferrin as an active ingredient. The effects of the present invention are as follows.
(1) Leukocyte migration induced in the respiratory tract of a host that has developed influenza virus infection can be suppressed.
(2) It is effective in preventing and / or treating complications such as tissue injury, bronchitis, otitis media and pneumonia caused by influenza virus infection.
(3) It can be produced in large quantities at low cost from raw materials such as milk.
(4) It is highly safe for humans and can be taken on a daily basis.

Claims

An agent for regulating leukocyte migration, comprising lactoferrin as an active ingredient.

The leukocyte migration regulator according to claim 1, wherein the leukocyte is a leukocyte which migrates to a respiratory tract infected with an influenza virus.

The leukocyte migration regulator according to claim 1 or 2, which is effective in preventing and / or treating tissue injury, bronchitis, otitis media, and pneumonia.