【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ナチュラルキラーＴ（ＮＫ Ｔ）細胞の増幅方法並びにその方法により増幅されたヒトＮＫ Ｔ細胞およびそのヒトＮＫ Ｔ細胞を含む細胞画分の用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＮＫ Ｔ細胞は、リンパ球サブセットに属し、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）とＮＫ細胞マーカーの両方を発現するユニークな細胞である（Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５， ５３５−５６２， １９９７； Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８２， ６３３−６３８， １９９５）。注目すべき性質の一つとしては、ＮＫ Ｔ細胞に発現しているＴＣＲα鎖は不可変型であり、このα鎖が、ごく限られた種類のβ鎖と対を形成することにより非常に限られたＴＣＲレパトア（不可変型ＴＣＲ）を発現することがあげられる。この不可変型ＴＣＲα鎖は、ヒトではＶα２４、マウスではＶα１４であり、両種間に高い相同性を持つことが知られており、特にＴＣＲの抗原結合部位の中央を形成すると考えられているＣＤＲ３領域では８５％と非常に高いアミノ酸レベルの相同性を示す。また、ＴＣＲβ鎖は、ヒトではＶβ１１、マウスではＶβ８、Ｖβ７又はＶβ２である（Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８０：１０９７， １９９４； Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８８：７５１８， １９９１； Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９：６５０６， １９９２； Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １７６：２６９， １９９２）。一方、ＮＫ細胞マーカーとしては、ＣＤ１６１（ＮＫＲ−Ｐ１又はＮＫ１．１）がＮＫ Ｔ細胞上に発現しているが、その機能は不明な部分が多い。また、ＮＫ Ｔ細胞は、Ｔｈ１型サイトカイン（ＴＨ１細胞（Ｔｈ１）により産生されるサイトカイン）であるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）と、Ｔｈ２型サイトカイン（ＴＨ２細胞（Ｔｈ２）により産生されるサイトカイン）のインターロイキン−４ （ＩＬ−４）の両方を産生することができる（Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １７９：１２８５−１２９５， １９９４； Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８６：１０９， １９９７； Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １６１：３２７１−３２８１， １９９８）ことから、Ｔヘルパー細胞の分化調節に深く関与すると考えられている。なぜなら、ＩＦＮ−γの過剰な産生はＴｈ１への分化を、またＩＬ−４の過剰な産生はＴｈ２への分化を誘導するからである。さらに、ＮＫ Ｔ細胞は、ＮＫ様の殺腫瘍活性の中心的な役割を担うパーフォリンおよびグランザイムを産生することが報告されている（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９５：５６９０−５６９３， １９９８； Ｈｕｍ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ６１：３５７−３６５， １９９９）。
【０００３】
近年、海綿に由来するアゲラスフィン類の誘導体の一つとして合成されたＫＲＮ７０００ （Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， ３４：５５９１−５５９２， １９９３； Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， ３４：５５９３−５５９６， １９９３； Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ， ５０：２７７１−２７８４， １９９４）が、ＮＫ Ｔ細胞に発現する不可変型ＴＣＲのリガンドであることが判明した（Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７８：１６２６−１６２９， １９９７； Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８８：１５２１−１５２８， １９９８； Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８８：１５２９−１５３４， １９９８）。ＫＲＮ７０００に代表されるα−グリコシルセラミド（α−ＧｌｙＣｅｒ）は親水性のガラクトース、グルコースなどの糖類と脂肪酸−スフィンゴシン塩基からなる疎水性セラミドとがα配位にて結合したスフィンゴ糖脂質であり、リガントとしてＮＫ Ｔ細胞を刺激することで強い坑腫瘍活性を示すことが報告された（Ｏｎｃｏｌ． Ｒｅｓ．， ７：５２９−５３４， １９９５； Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５８：１２０２−１２０７， １９９８）。α−ＧｌｙＣｅｒは、糖脂質抗原として樹状細胞（ＤＣ）をはじめとした抗原提示細胞（ＡＰＣ）に取り込まれた後、蛋白抗原のプロセスを担うことで知られるＴＡＰ（ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）経路を介さずプロセスされた後、主要組織適合抗原（ＭＨＣ）クラスＩｂ様の非多形性分子ＣＤ１ｄによってＡＰＣ膜上に提示される。ＮＫ Ｔ細胞は、膜上にある不可変型ＴＣＲが、ＡＰＣ上のＣＤ１ｄにより提示されたＫＲＮ７０００を認識することで活性化される。この原理に基づいて、α−ＧｌｙＣｅｒを取り込ませたヒト単球由来ＤＣを用いたヒトＮＫ Ｔ細胞の効率の良い培養が可能となった（Ｈｕｍ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ６０：１０−１９， １９９９）。さらに、インターロイキン−７ （ＩＬ−７）やＩＬ−１５は、α−ＧｌｙＣｅｒと相乗的にＮＫ Ｔ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させることが報告された（Ｈｕｍ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ６１：３５７−３６５， １９９９）。
【０００４】
最近、自己免疫疾患におけるＮＫ Ｔ細胞の役割が数多く報告されている。自己免疫疾患モデルマウスである（ＮＺＢｘＮＺＷ）Ｆ１マウス、ｌｐｒマウス、ｇｌｄマウスおよびＮＯＤマウスで、疾患が発症してくるとＮＫ Ｔ細胞が減少してくること、ＮＫ Ｔ細胞が発現している不可変型ＴＣＲα鎖に対する抗体を疾患モデルマウスに投与すると、疾患が増悪すること、ＮＯＤマウスに遺伝子工学的手法を用いて、不可変型ＴＣＲα鎖を強制的に発現させることで疾患の発症が抑制されたこと、あるいはＮＯＤマウスへ野生型のＮＫ Ｔ細胞を移植することで発症が抑制されたことなどから、ＮＫ Ｔ細胞が自己免疫に関して調節的Ｔ細胞として機能することが示唆された（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５６：４０３５−４０４０， １９９６； Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２６：２９８９−２９９８， １９９６； Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８８：１８３１−１８３９， １９９８）。実際、種々の自己免疫疾患、例えば、全身性硬化症（Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８２：１１６３−１１６８， １９９５）、１型糖尿病（Ｎａｔｕｒｅ， ３９１：１７７−１８１， １９９８）、慢性関節リュウマチ（Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ， ３８：１８６−１８８， １９９９）、多発性硬化症（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １６４：４３７５−４３８１， ２０００） において、末梢血液中のＮＫ Ｔ細胞の減少が報じられている。さらに、多発性硬化症の病変部位でのＮＫ Ｔ細胞の蓄積は認められなかった（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １６４：４３７５−４３８１， ２０００）。
【０００５】
一般的に、自己免疫疾患の病因としてＴｈ１／Ｔｈ２バランスの不均衡があげられる（Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ， １８：２６３−２６６， １９９７）。Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスの不均衡とＮＫ Ｔ細胞との関わりを、遺伝的背景が同一である一卵性の双生児や三つ子を対象として証明した興味深い報告がある（Ｎａｔｕｒｅ， ３９１：１７７−１８１， １９９８； Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９７：７４１１−７４１６， ２０００）。兄弟の内で、既に１型糖尿病を発症した人のＮＫ Ｔ細胞はＴｈ１型に偏向してＩＦＮ−γのみを産生していたのに対して、発症していない人では偏向がなく、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４ともに産生した。
【０００６】
以上のことは、体内のＴｈ２型のＮＫ Ｔ細胞を増加させることが、新規の自己免疫疾患療法になり得ることを示唆し、ＮＫ Ｔ細胞のリガンドであるα−ＧｌｙＣｅｒが自己免疫疾患に適用可能であることも同時に示唆する。しかしながら、α−ＧｌｙＣｅｒのマウスへの投与は、ＮＫ Ｔ細胞を活性化させるが体内での数を増加させる作用はなく、むしろ一時的にその数を減少させる（Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １９２：７４１−７５２， ２０００）。また、α−ＧｌｙＣｅｒは、マウスに直接投与すると、Ｔｈ１型のＮＫ Ｔ細胞を活性化することで堕胎を促進させることが報告された（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ９７：７４０−７４４， ２０００）。このことから、ｅｘ ｖｉｖｏにて増加させたＴｈ２型のＮＫ Ｔ細胞を移植することが、Ｔｈ１型へのシフトに起因する自己免疫疾患治療法として考えられる。
【０００７】
癌治療領域において、１９８０年代に、ＬＡＫ（Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｌｌｅｒ）細胞療法やＴＩＬ（Ｔｕｍｏｒ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）療法をはじめとする多くの免疫療法が実施されてきた。残念ながら、これらの臨床研究の知見は、細胞医療の臨床効果に関して期待を欠くものであり、臨床上の価値を見出させなかった。１９９０年代に入ると、ヒト癌に対する免疫応答の分子成分の同定において重要な進展があり、ＤＣ療法や細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）療法等、いくつかの異なる免疫療法に関するアプローチが臨床試験において試されている。
【０００８】
上述のように、ＮＫ Ｔ細胞は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞やＢ細胞など他のリンパ球とは異なり、大量のＩＦＮ−γ、パーフォリンおよびグランザイムを産生し、強い殺腫瘍活性を示すことが知られている（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ９９， ２２９−２３４， ２０００）。そのためＮＫ Ｔ細胞の役割は癌の免疫療法において重要であり、この細胞の能力を利用した新しい免疫療法の展開が期待される。ヒト食道癌細胞を植え付けたヌードマウスへの、ｅｘ ｖｉｖｏにおいてＫＲＮ７０００存在下で増幅されたヒトＮＫ Ｔ細胞を含む細胞分画の移植が有効性を示したことから（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５９， ５１０２−５１０５， １９９９）、ＮＫ Ｔ細胞の養子移植療法が有効な癌治療となり得ることが示唆された。
【０００９】
一方、自己免疫疾患にはＴｈ２型のＮＫ Ｔ細胞が有効と予想されるが、ヒト単球を顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）とＩＬ−４存在下で培養して得た未成熟型ＤＣにα−ＧｌｙＣｅｒを取り込ませ、このＤＣと共に自己の末梢血液を培養して得られるＮＫ Ｔ細胞は、既にＴｈ１型にシフトしており（Ｈｕｍ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ６０：１０−１９， １９９９）、自己免疫疾患治療には適さない。一般的なリンパ球のＴｈ１、Ｔｈ２のバランス調節に関わる物質、特に、Ｔｈ２型へのシフトを促す方法を述べた報告がいくつかある。最近、古典的な坑炎症、坑自己免疫疾患、坑アレルギー剤として広く用いられているデキサメサゾンがヒトＮＫ細胞株のＴｈ１型免疫反応を抑制することが報告された（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １６４：１７６８−１７７４， ２０００）。しかしながら、デキサメサゾンは、その濃度と細胞刺激条件の微妙な違いによって、ヒトＮＫ Ｔ細胞株を相乗的に増殖させたり、強い増殖抑制を示すという細胞培養上の欠点がある（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １６３：２５２２−２５２９， １９９９）。また、上述の未成熟型ＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける成熟化期にプロスタグランジン−Ｅ２ （ＰＧＥ２）を添加することで、成熟型ＤＣ２を調製できることが知られている（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５９：２８−３５， １９９７）。この成熟型ＤＣ２は、抗原刺激を受けたことのないナイーブなＴヘルパー細胞をＴｈ２型へ分化させることができる。ただし、ＮＫ Ｔ細胞は一般的なＴ細胞とは異なり、胎児期から既にＣＤ４５ＲＡ−弱陽性でＣＤ４５ＲＯ−強陽性のメモリー／活性化型の表現形を有する非常に特殊な細胞であり（Ｂｌｏｏｄ， ９５：２４４０−２４４２， ２０００）、ナイーブなＴヘルパー細胞と同様の挙動を示すとは限らない。
【００１０】
以上のように、自己免疫疾患治療に適した表現形のＮＫ Ｔ細胞をｅｘ ｖｉｖｏにて大量に増幅させる技術に関する報告はなく、改良の余地がある。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ｅｘ ｖｉｖｏにてより多くの数の、Ｔｈ２型またはＴｈ１型にシフトしたＮＫ Ｔ細胞を得る方法を提供することを目的とする。また、本発明は、細胞を用いることによる疾患の治療法である細胞医療に使用するのに適した、Ｔｈ２型またはＴｈ１型にシフトしたＮＫ Ｔ細胞およびその細胞を含む細胞画分を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、下記のように、αーグリコシルセラミド（α−ＧｌｙＣｅｒ）を提示しているある特定の成熟樹状細胞（ＤＣ）とインターロイキン７（ＩＬ−７）およびデキサメサゾンを特定の様式で用いることにより、末梢血液より得られる単核細胞画分（ＰＢＭＣ）から、Ｔｈ２型にシフトしたＮＫ Ｔ細胞をより多く増幅できるという知見を得た。また、末梢血液より得られるＰＢＭＣに換えて、ヒトＮＫ Ｔ細胞株を用いることによってもＴｈ２型にシフトしたＮＫ Ｔ細胞を得ることができるという知見を得た。これらの知見に基づき、本発明を完成した。
【００１３】
ＤＣは抗原提示細胞（ＡＰＣ）の主体と考えられており、糖脂質抗原であるα−ＧｌｙＣｅｒを取り込み、抗原提示分子であるＣＤ１ｄを介して膜表面上に提示する。単球細胞画分（ＰＢＭＣ）には、Ｔ細胞、単球、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫ Ｔ細胞、顆粒球などが含まれている。単離した単球をＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４の存在下で培養すると、未成熟型ＤＣが得られる。その後、ＩＬ−１βおよび腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）を添加して培養すると成熟型ＤＣ０（註：ここではＤＣ１、ＤＣ２と明確に区別するためにＤＣ０と称する）へと分化する。この成熟過程にＩＦＮ−α又はＰＧＥ２を加えると、それぞれ成熟型ＤＣ１又はＤＣ２へと分化成熟する。α−ＧｌｙＣｅｒを提示している成熟型ＤＣとＰＢＭＣを共培養すると、ＰＢＭＣ中に含まれるＮＫ Ｔ細胞が選択的に増幅し、ＩＬ−７やＩＬ−１５は共にＮＫ Ｔ細胞を相乗的に増幅させる。そして、本発明者らは、ＰＢＭＣと成熟型ＤＣ２との共培養系に、ＩＬ−７およびデキサメサゾンを添加すると、Ｔｈ２型の表現形を持つＮＫ Ｔ細胞が相乗的に増幅されること、ならびに、ＰＢＭＣと成熟型ＤＣ１との共培養系にＩＬ−１５を添加すると、Ｔｈ１型の表現形を持つＮＫ Ｔ細胞が増幅されることを見出した。
【００１４】
本発明は、上記の知見に基づいてなされたものであり、以下の増幅方法および製造方法（該方法により得られる細胞および細胞画分を含む）並びに自己免疫疾患治療剤を提供する。
（１）ヒトＮＫ Ｔ細胞を含む単核細胞画分を、（ａ）α−ＧｌｙＣｅｒを提示している成熟型ＤＣ２または成熟型ＤＣ０、（ｂ）ＮＫ Ｔ細胞の増殖および／または活性化作用を有するサイトカインおよび（ｃ）デキサメサゾンの存在下で培養することを含む、Ｔｈ２型にシフトしたヒトＮＫ Ｔ細胞の増幅方法。
（２）ＮＫ Ｔ細胞の増殖および／または活性化作用を有するサイトカインがＩＬ−７を含む（１）記載の増幅方法。
（３）ヒトＮＫ Ｔ細胞を含む単核細胞画分を、（ａ）α−ＧｌｙＣｅｒを提示している成熟型ＤＣ２または成熟型ＤＣ０、（ｂ）ＮＫ Ｔ細胞の増殖および／または活性化作用を有するサイトカインおよび（ｃ）デキサメサゾンの存在下で培養し、培養された細胞からＴｈ２型にシフトしたＮＫ Ｔ細胞を単離することを含む、Ｔｈ２型にシフトしたヒトＮＫ Ｔ細胞の製造方法。
（４）ＮＫ Ｔ細胞の増殖および／または活性化作用を有するサイトカインがＩＬ−７を含む（３）記載の製造方法。
（５）ヒトＮＫ Ｔ細胞を含む単核細胞画分を、（ａ）α−ＧｌｙＣｅｒを提示している成熟型ＤＣ２または成熟型ＤＣ０、（ｂ）ＮＫ Ｔ細胞の増殖および／または活性化作用を有するサイトカインおよび（ｃ）デキサメサゾンの存在下で培養することを含む、Ｔｈ２型にシフトしたヒトＮＫ Ｔ細胞を含む細胞画分の製造方法。
（６）ＮＫ Ｔ細胞の増殖および／または活性化作用を有するサイトカインがＩＬ−７を含む（５）記載の製造方法。
（７）（３）または（４）記載の製造方法により得られるＴｈ２型にシフトしたヒトＮＫ Ｔ細胞を有効成分とする自己免疫疾患治療剤。
（８）（５）または（６）記載の製造方法により得られる、Ｔｈ２型にシフトしたヒトＮＫ Ｔ細胞を含む細胞画分を有効成分とする自己免疫疾患治療剤。
（９）ヒトＮＫ Ｔ細胞を含む単核細胞画分を、α−ＧｌｙＣｅｒを提示している成熟型ＤＣ１およびＩＬ−１５の存在下で培養することを含む、Ｔｈ１型にシフトしたヒトナチュラルキラーＴ細胞の増幅方法。
（１０）ヒトＮＫ Ｔ細胞を含む単核細胞画分を、α−ＧｌｙＣｅｒを提示している成熟型ＤＣ１およびＩＬ−１５の存在下で培養し、培養された細胞からＴｈ１型にシフトしたナチュラルキラーＴ細胞を単離することを含む、Ｔｈ１型にシフトしたヒトナチュラルキラーＴ細胞の製造方法。
（１１）ヒトＮＫ Ｔ細胞を含む単核細胞画分を、α−ＧｌｙＣｅｒを提示している成熟型ＤＣ１およびＩＬ−１５の存在下で培養することを含む、Ｔｈ１型にシフトしたヒトナチュラルキラーＴ細胞を含む細胞画分の製造方法。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１６】
本発明のＴｈ２型にシフトしたＮＫ Ｔ細胞の増幅方法および製造方法は、ヒトＮＫ Ｔ細胞を含む単核細胞画分を、（ａ）α−ＧｌｙＣｅｒを提示している成熟型ＤＣ２、（ｂ）ＮＫ Ｔ細胞の増殖および／または活性化作用を有するサイトカインおよび（ｃ）デキサメサゾン（ＤＥＸ）存在下で培養することを特徴とする。
【００１７】
ＮＫ Ｔ細胞を含む単核細胞画分は、増幅可能な量のＮＫ Ｔ細胞を含む単核細胞画分であれば、特に限定されない。例えば、ヒト末梢血液から得ることのできるＰＢＭＣ、ヒトＮＫ Ｔ細胞株（全てＮＫ Ｔ細胞からなる単核細胞画分である）等が挙げられる。
【００１８】
ＰＢＭＣは、生理食塩水にて希釈した末梢血液より、密度勾配などの方法を用いることによって調製することができる。末梢血液から得られるＰＢＭＣには、主に単球やリンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫ Ｔ細胞）などの単核細胞と顆粒球が含まれており、赤血球、血小板などは除去されている。
【００１９】
ヒトＮＫ Ｔ細胞株の例としては、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２８：４３９１−４３９７， １９９８、 Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８８（８）：１５２９−１５３４， １９９８、 Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８８（８）：１５２１−１５２８， １９９８、およびＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５８：５６０３−５６１１， １９９７に記載されているヒトＮＫ Ｔ細胞株を挙げることができる。
【００２０】
α−ＧｌｙＣｅｒを提示している成熟型ＤＣ２は、ＰＢＭＣから単離した単球をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４存在下で培養して未成熟型ＤＣを得（例えば、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １７９：１１０９−１１１８， １９９４、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １６２：３２３１−３２３６， １９９９）、得られた未成熟型ＤＣをα−ＧｌｙＣｅｒ、ＰＧＥ２、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αの存在下で培養して、α−ＧｌｙＣｅｒを取り込ませると同時に成熟させることにより調製することができる。
【００２１】
具体的には、以下のような方法で調製することができる。牛胎児血清（ＦＣＳ）を含む、例えばＩＭＤＭなどの培地に約３〜５×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度でけん濁したＰＢＭＣをプラスチック製フラスコ中で約２〜３時間培養してプラスチック付着性の単球を得ることができる。ここで得た単球画分を１０〜１０００ ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１００〜５００ ｎｇ／ｍｌのヒトＧＭ−ＣＳＦと１００〜１００００ Ｕ／ｍｌ、好ましくは５００〜５０００ Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ−４存在下で約７日間培養すると、未成熟型のＤＣへと分化させることができる。ここで得られる未成熟型ＤＣは、抗原取り込みが活発であり、糖脂質抗原であるα−ＧｌｙＣｅｒ（１〜１０００ ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５０〜５００ ｎｇ／ｍｌ）を培養系に添加すると、ＤＣはα−ＧｌｙＣｅｒを取り込むことができる。α−ＧｌｙＣｅｒ添加と同時に、１〜１００ ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜５０ ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１βおよび１〜１００ ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜５０ ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αを添加し、約３日間培養を続けると成熟型ＤＣ０へとさらに分化させることができる。なお、成熟型ＤＣ０は、例えば文献（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １６４：４５０７−４５１２， ２０００）に記載されているようにＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの代わりにＬＰＳを用いた方法でも調製することができる。成熟型ＤＣは抗原の取り込み能は低く、抗原提示能は最大化された状態にある。この成熟期に１×１０−５〜１×１０−９ Ｍ、好ましくは約１×１０−７ ＭのＰＧＥ２を添加すると、未成熟型ＤＣは、α−ＧｌｙＣｅｒを取り込んだ成熟型ＤＣ２へと分化させることができる。成熟型ＤＣ２は、ナイーブなＴヘルパー細胞をＴｈ２型へと分化させることが知られている。
【００２２】
成熟型ＤＣ２の代りに成熟型ＤＣ０を用いることも可能である。本明細書において、「成熟型ＤＣ０」の語は、ナイーブなＴヘルパー細胞をＴｈ１型およびＴｈ２型のいずれにもシフトさせる能力を有する成熟型ＤＣを意味する。成熟型ＤＣ０は、未成熟型ＤＣから分化した直後、および分化後少なくとも８時間は、ナイーブなＴヘルパー細胞をＴｈ１型およびＴｈ２型のいずれにもシフトさせる能力を有するが、未成熟型ＤＣから分化して、例えば４８時間後には、ナイーブなＴヘルパー細胞をＴｈ１型にシフトさせる能力は低下し、Ｔｈ２型にシフトさせる能力のみを有する成熟型ＤＣに変化していくことが報告されている（Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １：３１１−３１６， ２０００）。従って、成熟型ＤＣ２の代わりに成熟型ＤＣ０を用いても、成熟型ＤＣ２を用いる場合と同様に、Ｔｈ２型にシフトしたＮＫ Ｔ細胞が得られると考えられる。また、上記から理解されるように、本明細書における「成熟型ＤＣ２または成熟型ＤＣ０」の語は、成熟型ＤＣ２および成熟型ＤＣ０のいずれかに明確に分類されるものだけでなく、成熟型ＤＣ２と成熟型ＤＣ０の中間的な性質を有する成熟型ＤＣも包含するものである。
【００２３】
α−ＧｌｙＣｅｒは、ガラクトース、グルコースなどの糖類とセラミドとがα配位にて結合したスフィンゴ糖脂質であり、ＷＯ ９３／０５０５５（１９９３年３月１８日公開）、ＷＯ９４／０２１６８（１９９４年２月３日公開）、ＷＯ９４／０９０２０（１９９４年４月２８日公開）、ＷＯ９４／２４１４２（１９９４年１０月２７日公開）、およびＷＯ ９８／４４９２８（１９９８年１０月１５日公開）に開示されているものを挙げることができる。中でも、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−ヘキサコサノイルアミノ−１，３，４−オクタデカントリオール（ （２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−Ｎ−ｈｅｘａｃｏｓａｎｏｙｌ−２−ａｍｉｎｏ−１，３，４−ｏｃｔａｄｅｃａｎｅｔｒｉｏｌ））（以下、ＫＲＮ７０００と称する）が好ましい。
【００２４】
ＮＫ Ｔ細胞の増殖および／または活性化作用を有するサイトカインとしては、ＩＬ−７、ＩＬ−２、ＩＬ−１８などが挙げられる。このサイトカインとしては１種を用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。好ましくは、このサイトカインは、ＩＬ−７を含むもの、すなわち、ＩＬ−７またはＩＬ−７とその他のサイトカインとの組合せである。
【００２５】
ＩＬ−７などの、ＮＫ Ｔ細胞の増殖および／または活性化作用を有するサイトカインは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＮＫ Ｔ細胞の増殖に対して、α−ＧｌｙＣｅｒを提示している成熟型ＤＣ２と共に相乗的に作用する。
【００２６】
培養は、α−ＧｌｙＣｅｒを提示している成熟型ＤＣ２、ＮＫ Ｔ細胞の増殖および／または活性化作用を有するサイトカインおよびデキサメサゾンを培地に添加することの他は、ＰＢＭＣやＮＫ Ｔ細胞株等のＮＫ Ｔ細胞を含む単核細胞画分の通常の培養条件で行うことができる。成熟型ＤＣ２、サイトカインおよびデキサメサゾンの添加量および培養時間は、Ｔｈ２型にシフトしたＮＫ Ｔ細胞が増幅されるのに十分なものであればよく、通常には、成熟型ＤＣ２は、単核細胞数に対して、１／４０〜１／５の細胞数を必要とし、サイトカインの種類によって異なるが、サイトカインの濃度が１〜１０００ｎｇ／ｍｌ、デキサメサゾンの濃度が１×１０−９〜１×１０−３ Ｍ、好ましくは１×１０−８〜１×１０−４ Ｍ、培養時間が５〜１４日である。
【００２７】
培地としては、例えば５〜１０％ヒト血清、０．０１ ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１．６ ｍＭ Ｌ−グルタミン、２５ ｍＭ ヘペス、５０ Ｕ／ｍｌ ペニシリンおよび５０ Ｕ／ｍｌ ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地などが挙げられる。
【００２８】
α−ＧｌｙＣｅｒを提示している成熟型ＤＣ２に換えて、α−ＧｌｙＣｅｒを提示している成熟型ＤＣ０を用いる場合も培養方法は同様である。
【００２９】
Ｔｈ２型にシフトしたＮＫ Ｔ細胞の増幅は、蛍光抗体染色した細胞をフローサイトメトリーにより分析することにより測定することができる。Ｔｈ２型へのシフトは、ＮＫ Ｔ細胞内のサイトカイン産生によって規定することができる。例えば、代表的なＴｈ２型のサイトカインであるＩＬ−４の陽性率と代表的なＴｈ１型のサイトカインであるＩＦＮ−γの産生とを、フローサイトメトリーを用いることで分析することができ、デキサメタゾンを添加しないこと以外は同様の条件で増幅したＮＫ Ｔ細胞に比べて、ＩＬ−４の陽性率が増加（好ましくは、約３０％以上増加）し、ＩＦＮ−γの産生が低下（好ましくは、約３０％以上低下）したことにより、Ｔｈ２型にシフトしたものの増幅を確認することができる。
【００３０】
本発明の増幅方法によれば、Ｔｈ２型にシフトしたＮＫ Ｔ細胞を実用的な程度まで効率よく増殖させることができる。また、本発明の製造方法により得られた、Ｔｈ２型にシフトしたＮＫ Ｔ細胞を含む細胞画分は自己免疫疾患の療法において有用である。
【００３１】
培養された細胞からのＴｈ２型にシフトしたＮＫ Ｔ細胞の単離は、磁気ビーズ法などの公知の方法により行うことができる。
【００３２】
本発明の自己免疫疾患治療剤は、本発明の製造方法により得られる、Ｔｈ２型にシフトしたヒトＮＫ Ｔ細胞またはその細胞を含む細胞画分を有効成分とする。
【００３３】
本発明の自己免疫疾患治療剤の投与方法としては、静脈内、皮下、皮内、リンパ節内投与が考えられる。製剤形態としては、生理食塩水や各種リンゲル液などに懸濁し投与する。投与量は投与経路により異なり、皮下であれば０．１ｍｌから５ｍｌ、静脈内であれば３００ｍｌぐらいまで投与可能である。Ｔｈ２型にシフトしたＮＫ Ｔ細胞の細胞数に換算した投与量は、通常には、体表面積（ｍ２）当たり個体あたり５×１０５〜１×１０７個である。対象疾患としては、多発性筋炎、慢性リュウマチ、全身性エリテマトーシス、全身性硬化症、水ほう症、皮膚エリテマトーシス、乾癬症、クローンズ病、潰瘍性大腸炎、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、１型糖尿病、などがあげられる。
【００３４】
本発明によれば、大量のＩＬ−４を産生できる一方で、ＩＦＮ−γ産生は抑制された自己免疫疾患に有効と思われるＴｈ２型の表現形を有している自家ＮＫ Ｔ細胞を大量にｅｘ ｖｉｖｏで生成することができる。その細胞数は、臨床で使用するのに十分に高い。
【００３５】
本発明のＴｈ１型にシフトしたＮＫ Ｔ細胞の増幅方法および製造方法は、ヒトＮＫ Ｔ細胞を含む単核細胞画分を、α−ＧｌｙＣｅｒを提示している成熟型ＤＣ１およびＩＬ−１５の存在下で培養することを特徴とする。
【００３６】
ヒトＮＫ Ｔ細胞を含む単核細胞画分及びα−ＧｌｙＣｅｒについては、上記のＴｈ２型にシフトしたＮＫ Ｔ細胞の増幅方法および製造方法に関して説明したのと同様である。
【００３７】
α−ＧｌｙＣｅｒを提示している成熟型ＤＣ１は、以下のような方法で調製することができる。上記のＴｈ２型にシフトしたＮＫ Ｔ細胞の増幅方法および製造方法に関して説明した方法で調製した未成熟型ＤＣを、１〜１０００ ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５０〜５００ ｎｇ／ｍｌのα−ＧｌｙＣｅｒ添加と同時に、１〜１００ ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜５０ ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１βおよび１〜１００ ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜５０ ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αと共に１０〜１００００ Ｕ、好ましくは約１０００ Ｕのインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）を添加してさらに約３日間培養を続けると成熟型ＤＣ１へ分化させることができる。この成熟型ＤＣ１は、ナイーブなＴヘルパー細胞をＴｈ１型へと分化させることができる。
【００３８】
培養は、α−ＧｌｙＣｅｒを提示している成熟型ＤＣ１およびＩＬ−１５を培地に添加することの他は、ＰＢＭＣやＮＫ Ｔ細胞株等のＮＫ Ｔ細胞を含む単核細胞画分の通常の培養条件で行うことができる。成熟型ＤＣ１およびＩＬ−１５の添加量および培養時間は、Ｔｈ１型にシフトしたＮＫ Ｔ細胞が増幅されるのに十分なものであればよく、通常には、成熟型ＤＣ１は、単核細胞数に対して、１／４０〜１／５の細胞数を必要とし、ＩＬ−１５の濃度が１〜１０００ ｎｇ／ｍｌ、培養時間が５〜１４日である。
【００３９】
培地は、上記のＴｈ２型にシフトしたＮＫ Ｔ細胞の増幅方法および製造方法に関して説明したのと同様でよい。
【００４０】
Ｔｈ１型にシフトしたＮＫ Ｔ細胞の増幅は、蛍光抗体染色した細胞をフローサイトメトリーにより分析することにより測定することができる。Ｔｈ１型へのシフトは、ＮＫ Ｔ細胞内のサイトカイン産生によって規定することができる。例えば、代表的なＴｈ１型のサイトカインであるＩＦＮ−γの産生を、フローサイトメトリーを用いることで分析することができ、ＩＬ−１５を添加しないこと以外は同様の条件で増幅したＮＫ Ｔ細胞に比べて、ＩＦＮ−γの産生が増加したことにより、Ｔｈ１型にシフトしたものの増幅を確認することができる。
【００４１】
本発明の増幅方法によれば、Ｔｈ１型にシフトしたＮＫ Ｔ細胞を実用的な程度まで効率よく増殖させることができる。また、本発明の製造方法により得られた、Ｔｈ１型にシフトしたＮＫ Ｔ細胞およびそれを含む細胞画分は、癌、並びに、細菌、マラリア等の原虫等による感染症を含む各種感染症、並びに、ＣＭＶ、ＨＩＶ、Ｂ型およびＣ型肝炎ウイルス等によるウイルス性疾患の治療剤の有効成分として使用できる。この治療剤の投与方法及び製剤形態は、上記の自己免疫疾患治療剤と同様でよい。
【００４２】
培養された細胞からのＴｈ１型にシフトしたＮＫ Ｔ細胞の単離は、磁気ビーズ法などの公知の方法により行うことができる。
【００４３】
本発明によれば、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてα−ＧｌｙＣｅｒを取り込んだ特定の成熟型ＤＣの刺激によって、非常に効果的に、Ｔｈ２型またはＴｈ１型にシフトしたヒトＮＫ Ｔ細胞を増幅することが可能となる。具体的には、成熟型ＤＣ１およびＩＬ−１５を添加することでＴｈ１型に、成熟型のＤＣ２またはＤＣ０、ＩＬ−７およびデキサメサゾンを添加することでＴｈ２型にシフトしたＮＫ Ｔ細胞を得ることが可能となる。また、ＮＫ Ｔ細胞は健常人由来であっても自己免疫疾患患者由来であっても同様に増幅し、Ｔｈ１およびＴｈ２の型のいずれにシフトしたＮＫ Ｔ細胞も得ることが可能となる。
【００４４】
【実施例】
以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
【００４５】
【実施例１】ＮＫ Ｔ細胞の増幅
（１） 未成熟型樹状細胞（ＤＣ）の調製
健常人から採取した末梢血液を、生理食塩水にて２倍に希釈した後、比重遠心により末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を得た。１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）、０．０１ ｍＭ ２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）、５０ Ｕ／ｍｌペニシリンおよび５０ Ｕ／ｍｌストレプトマイシンを含むＩＭＤＭ培地に、３×１０６／ｍｌの濃度でけん濁したＰＢＭＣを培養フラスコに入れ、１〜２時間培養した。その後、浮遊性細胞を除去し、主にマクロファージから構成される付着性細胞を１００ ｎｇ／ｍｌのヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）と１０００ Ｕ／ｍｌのヒトインターロイキン−４（ＩＬ−４）の存在下で１週間培養し、未成熟型のＤＣを得た。
【００４６】
（１）−１ ＫＲＮ７０００を取り込んだ成熟型ＤＣ０の調製
（１）で調製した未成熟型ＤＣを含む培養フラスコに、１００ ｎｇ／ｍｌのＫＲＮ７０００、１０ ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１βおよび５０ ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αを加えて３日間培養して、ＫＲＮ７０００を取り込んだ成熟型のＤＣ０を調製した。
【００４７】
（２） ＫＲＮ７０００を取り込んだ成熟型ＤＣ１の調製
（１）で調製した未成熟型ＤＣを含む培養フラスコに、１００ ｎｇ／ｍｌのＫＲＮ７０００、５０ ｎｇ／ｍｌのヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、１０ ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１βおよび１０００ Ｕのインターフェロン（ＩＦＮ）−γを加えて３日間培養して、ＫＲＮ７０００を取り込んだ成熟型のＤＣ１を調製した。
【００４８】
（３） ＫＲＮ７０００を取り込んだ成熟型ＤＣ２の調製
（１）で調製した未成熟型ＤＣを含む培養フラスコに、１００ ｎｇ／ｍｌのＫＲＮ７０００、５０ ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α、１０ ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１βおよび１×１０−７ Ｍのプロスタグランジン（ＰＧＥ２）を加えて３日間培養して、ＫＲＮ７０００を取り込んだ成熟型のＤＣ２を調製した。
【００４９】
（４） Ｔｈ１型にシフトしたＮＫ Ｔ細胞の増幅
（２）で調製したＫＲＮ７０００を取り込んだ成熟型ＤＣ１を培地にて洗浄した後、同一ドナーのＰＢＭＣをＤＣ１と共に１０ ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５存在下で培養皿にて７日間培養した（ＰＢＭＣ数：ＤＣ１数＝１０：１）。ここで用いた培地は、５〜１０％正常ヒト血清（ＨＳ）、０．０１ ｍＭ ２−ＭＥ、５０ Ｕ／ｍｌペニシリンおよび５０ Ｕ／ｍｌストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地である。ＮＫ Ｔ細胞数は、フローサイトメトリー法を用いて検出した。即ち、培養を終えた細胞を培養皿から回収した後、総細胞数を血球計算板を用いて計測した。細胞を生理食塩水にて洗浄した後、抗体の非特異的な反応を阻害するために、過剰量のヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｇを添加して、４℃で１０分間放置した。次に、細胞内の蛋白輸送を阻害するために、細胞を３μＭのモネンシン（Ｓｉｇｍａ社）存在下で４〜１０時間培養した。細胞を、０．５％牛血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ社）と０．１％ＮａＮ（Ｓｉｇｍａ社）を含む生理食塩水（ＰＮ）にけん濁した後、フルオレセンイソチアネート（ＦＩＴＣ）で標識した坑Ｖα２４抗体、フィコエリスリン（ＰＥ）で標識した坑Ｖβ１１抗体（以上Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社）およびＰＥ−Ｃｙ５で標識した坑ＣＤ３抗体（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を添加して、４℃で２０分間反応させた。細胞を生理食塩水（ＰＮ）で洗浄した後、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＮに１０分間けん濁させて固定した。細胞をＰＮにて洗浄した後、０．１％サポニン（Ｍｅｒｋ社）および５０ ｍＭ Ｄ−グルコース（Ｍｅｒｋ社）の溶液にけん濁させて、細胞膜に透過性を持たせた。細胞をＰＮにて軽く洗浄した後、ＰＥで標識した坑ＩＦＮ−γ抗体またはＰＥで標識した坑ＩＬ−４抗体を添加して４℃で１５分間放置して反応させた。細胞のフローサイトメトリー分析はＦＡＣＳｔａｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社， Ｓｕｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）を用いて行った。細胞内グランザイムＢ（ＧｒＢ）の定量は、上記の坑ＩＦＮ−γ抗体や坑ＩＬ−４抗体の代わりにＰＥで標識した坑ＧｒＢ抗体を用いて染色した。なお、培養後のＮＫ Ｔ細胞数の増幅率は、培養前のＰＢＭＣ中に含まれるＮＫ Ｔ細胞数をフローサイトメトリー分析した上で算出した。複数回実施した試験から得られた結果の内から、代表的例を表１に示した。ＩＬ−４陽性率は、全体の細胞の中でＩＬ−４を産生した細胞の割合を、ＩＦＮ−γおよびＧｒＢは、細胞１個あたりに発現されたＩＦＮ−γあるいはＧｒＢの分子数を表す。
【００５０】
（５） Ｔｈ２型にシフトしたＮＫ Ｔ細胞の増幅
（２）で調製したＫＲＮ７０００を取り込んだ成熟型ＤＣ２を培地にて洗浄した後、同一ドナーのＰＢＭＣをＤＣ２と共に、１０ ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７の存在下、または、１０ ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７および１×１０−７ Ｍデキサメサゾン（ＤＥＸ）（Ｓｉｇｍａ社）存在下で培養皿にて７日間培養した（ＰＢＭＣ数：ＤＣ２数＝１０：１）。ここで用いた培地は、５〜１０％正常ヒト血清（ＨＳ）、０．０１ ｍＭ ２−ＭＥ、５０ Ｕ／ｍｌペニシリンおよび５０ Ｕ／ｍｌストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地である。培養後のフローサイトメトリー分析は上記（４）と同様に行った。複数回実施した試験から得られた結果の内から、代表的例を表１に示した。
【００５１】
【表１】
【００５２】
【実施例２】Ｅｘ ｖｉｖｏで増幅したＮＫ Ｔ細胞の殺細胞作用
実施例１の（４）又は（５）に記載の様に１１日間培養して、Ｔｈ１型又はＴｈ２型にシフトしたＮＫ Ｔ細胞を増幅した。同時に、実施例１の（５）の培養方法を修正した方法、すなわちＤＥＸを加えない条件で培養してＮＫ Ｔ細胞を増幅した。ＮＫ Ｔ細胞画分、すなわちＣＤ３陽性Ｖα２４陽性Ｖβ１１陽性の条件を満たす細胞を、ＦＡＣＳｔａｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いてソーティングした。その後、ソーティングしたＮＫ Ｔ細胞のヒト骨髄性白血病細胞Ｕ９３７に対する殺細胞作用を、標準的な５１Ｃｒ遊離測定法を用いて検討した。すなわち、５１Ｃｒで標識したＵ９３７をターゲットとして、イフェクター対ターゲット比（Ｅ／Ｔ比）が１２．５：１（個数比）の条件で４時間培養した後、遊離した放射能をベータカウンターにて測定した。
【００５３】
【表２】
【００５４】
【実施例３】潰瘍性大腸炎患者ＰＢＭＣ由来のＴｈ２型ＮＫ Ｔ細胞の培養
実施例１の（５）に従い、Ｔｈ１型へのシフトに起因するとされる自己免疫疾患の一つに分類される潰瘍性大腸炎患者のＰＢＭＣからの、Ｔｈ２型ＮＫ Ｔ細胞の培養を実施した。同時に、実施例１の（５）の培養方法を修正した方法、すなわちＤＥＸを加えない条件で培養を実施した。代表的な結果を表３に示した。
【００５５】
【表３】
【００５６】
【発明の効果】
本発明によれば、Ｔｈ２型にシフトしたＮＫ Ｔ細胞の増幅された細胞画分を得ることが可能となり、このような細胞画分または細胞を用いることにより、細胞医療による自己免疫疾患治療が可能となる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for amplifying natural killer T (NK T) cells, human NK T cells amplified by the method, and uses of cell fractions containing the human NK T cells.
[0002]
[Prior art]
NK T cells are unique cells that belong to the lymphocyte subset and express both T cell receptor (TCR) and NK cell markers (Annu. Rev. Immunol., 15, 535-562, 1997; J. Exp). Med., 182, 633-638, 1995). One of the notable properties is that the TCR α chain expressed in NK T cells is invariant, and this α chain is very limited by pairing with a very limited type of β chain. Expression of TCR repertoire (non-variable TCR). This invariable TCRα chain is Vα24 in humans and Vα14 in mice, and is known to have high homology between both species, and is particularly considered to form the center of the antigen binding site of TCR. Shows a very high amino acid level homology of 85%. The TCRβ chain is Vβ11 in humans and Vβ8, Vβ7 or Vβ2 in mice (J. Exp. Med., 180: 1097, 1994; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7518, 1991; Proc. Natl.Acad.Sci.USA, 89: 6506, 1992; J. Exp. Med., 176: 269, 1992). On the other hand, as an NK cell marker, CD161 (NKR-P1 or NK1.1) is expressed on NK T cells, but there are many parts whose functions are unknown. In addition, NK T cells are Th1-type cytokines (cytokines produced by TH1 cells (Th1)), interferon-γ (IFN-γ), and Th2-type cytokines (cytokines produced by TH2 cells (Th2)). Both interleukin-4 (IL-4) can be produced (J. Exp. Med., 179: 1285-1295, 1994; J. Exp. Med., 186: 109, 1997; J. Immunol. 161: 3271-3281, 1998), it is considered to be deeply involved in the regulation of T helper cell differentiation. This is because excessive production of IFN-γ induces differentiation into Th1, and excessive production of IL-4 induces differentiation into Th2. Furthermore, NK T cells have been reported to produce perforin and granzyme that play a central role in NK-like tumoricidal activity (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 5690-5893, 1998). Hum. Immunol., 61: 357-365, 1999).
[0003]
Recently, KRN7000 (Tetrahedron Lett., 34: 5591-5592, 1993; Tetrahedron Lett., 34: 5593-5596, 1993; Tetrahedron, 50: 2771-2784, synthesized as one of the derivatives of agerasfins derived from sponges. , 1994) were found to be ligands for invariant TCR expressed on NK T cells (Science, 278: 1626-1629, 1997; J. Exp. Med., 188: 1521-1528, 1998; Exp. Med. 188: 1529-1534, 1998). Α-Glycosylceramide (α-GlyCer) typified by KRN7000 is a glycosphingolipid in which saccharides such as hydrophilic galactose and glucose and a hydrophobic ceramide composed of a fatty acid-sphingosine base are combined in an α-coordinate. As a result, it was reported that strong antitumor activity was demonstrated by stimulating NK T cells (Oncol. Res., 7: 529-534, 1995; Cancer Res., 58: 1202-1207, 1998). α-GlyCer is incorporated into antigen-presenting cells (APC) such as dendritic cells (DC) as glycolipid antigens, and is then known to be responsible for the protein antigen process (TAP (Transport associated associated antigen processing) pathway). After being processed through the cell, it is presented on the APC membrane by the major histocompatibility antigen (MHC) class Ib-like non-polymorphic molecule CD1d. NK T cells are activated when the invariant TCR on the membrane recognizes KRN7000 presented by CD1d on APC. Based on this principle, it became possible to efficiently culture human NK T cells using human monocyte-derived DC incorporating α-GlyCer (Hum. Immunol., 60: 10-19, 1999). Furthermore, interleukin-7 (IL-7) and IL-15 were reported to proliferate NK T cells in vitro synergistically with α-GlyCer (Hum. Immunol., 61: 357-365, 1999).
[0004]
Recently, many roles of NK T cells in autoimmune diseases have been reported. In autoimmune disease model mice (NZBxNZW) F1, lpr, gld and NOD mice, NK T cells decrease when disease develops, and invariant type in which NK T cells are expressed When an antibody against a TCRα chain is administered to a disease model mouse, the disease is exacerbated, and the onset of the disease is suppressed by forcing the NOD mouse to express an invariable TCRα chain using genetic engineering techniques. Alternatively, the onset was suppressed by transplanting wild-type NK T cells into NOD mice, suggesting that NK T cells function as regulatory T cells with respect to autoimmunity (J. Immunol., 156). : 4035-4040, 1996; Eur. J. Immunol., 26: 2989-2998, 1996; J. Exp. Med., 188: 1831-1839, 1998). Indeed, various autoimmune diseases such as systemic sclerosis (J. Exp. Med., 182: 1163-1168, 1995), type 1 diabetes (Nature, 391: 177-181, 1998), rheumatoid arthritis ( Rheumatology, 38: 186-188, 1999), multiple sclerosis (J. Immunol., 164: 4375-4381, 2000), a decrease in NK T cells in peripheral blood has been reported. Furthermore, no accumulation of NK T cells was observed at the lesion site of multiple sclerosis (J. Immunol., 164: 4375-4381, 2000).
[0005]
In general, the pathogenesis of autoimmune diseases includes Th1 / Th2 balance imbalance (Immunol. Today, 18: 263-266, 1997). There is an interesting report demonstrating the relationship between Th1 / Th2 imbalance and NK T cells in monozygotic twins and triplets with the same genetic background (Nature, 391: 177-181, 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 7411-7416, 2000). Among siblings, NK T cells of those who already developed type 1 diabetes were biased toward Th1 and produced only IFN-γ, whereas those who did not develop were unbiased and IFN- Both γ and IL-4 were produced.
[0006]
The above suggests that increasing Th2-type NK T cells in the body can be a novel autoimmune disease therapy, and α-GlyCer, a ligand of NK T cells, can be applied to autoimmune diseases. It also suggests that However, administration of α-GlyCer to mice activates NK T cells but does not increase the number in the body, but rather temporarily decreases the number (J. Exp. Med., 192: 741-752, 2000). In addition, α-GlyCer was reported to promote abortion by activating Th1-type NK T cells when administered directly to mice (J. Immunol., 97: 740-744, 2000). From this, transplantation of Th2-type NK T cells increased ex vivo is considered as a treatment method for autoimmune diseases caused by the shift to Th1-type.
[0007]
In the field of cancer treatment, many immunotherapy such as LAK (Lymphokine-activated killer) cell therapy and TIL (Tumor-infiltrating lymphocyte) therapy have been carried out in the 1980s. Unfortunately, the findings of these clinical studies have been disappointing regarding the clinical effects of cell therapy and have not found clinical value. In the 1990s, significant progress has been made in identifying the molecular components of the immune response to human cancer, and several different immunotherapy approaches such as DC therapy and cytotoxic T cell (CTL) therapy have been tested in clinical trials. Has been.
[0008]
As described above, NK T cells, unlike other lymphocytes such as NK cells, T cells, and B cells, are known to produce large amounts of IFN-γ, perforin, and granzyme and exhibit strong tumoricidal activity. (Immunology, 99, 229-234, 2000). Therefore, the role of NK T cells is important in cancer immunotherapy, and development of new immunotherapy utilizing the ability of these cells is expected. The transplantation of cell fractions containing human NK T cells amplified in the presence of KRN7000 ex vivo into nude mice inoculated with human esophageal cancer cells has shown effectiveness (Cancer Res., 59, 5102-). 5105, 1999), it was suggested that adoptive transplantation of NK T cells could be an effective cancer treatment.
[0009]
On the other hand, Th2-type NK T cells are expected to be effective for autoimmune diseases, but human monocytes obtained by culturing granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and IL-4 are not yet obtained. NK T cells obtained by incorporating α-GlyCer into mature DC and culturing autologous peripheral blood with this DC have already shifted to Th1 type (Hum. Immunol., 60: 10-19, 1999). ), Not suitable for autoimmune disease treatment. There are several reports that describe substances that are involved in the regulation of the balance of Th1 and Th2 in general lymphocytes, particularly methods that promote the shift to the Th2 type. Recently, dexamethasone, widely used as a classic anti-inflammatory, anti-autoimmune disease, anti-allergic agent, was reported to suppress the Th1-type immune response of human NK cell lines (J. Immunol., 164: 1768). -1774, 2000). However, dexamethasone has a drawback in cell culture in which human NK T cell lines can be synergistically grown or exhibit strong growth suppression due to subtle differences in concentration and cell stimulation conditions (J. Immunol., 163). : 2522-2529, 1999). In addition, prostaglandin-E during the maturation period of the above-mentioned immature DC in vitro 2 (PGE 2 It is known that mature DC2 can be prepared by adding (A.) (J. Immunol., 159: 28-35, 1997). This mature DC2 can differentiate naive T helper cells that have not undergone antigenic stimulation into Th2 type. However, unlike general T cells, NK T cells are very special cells having a memory / activated phenotype that is already CD45RA-weakly positive and CD45RO-strongly positive from the fetal stage (Blood, 95). : 2440-2442, 2000), it does not always show the same behavior as naive T helper cells.
[0010]
As described above, there is no report on a technique for amplifying NK T cells having a phenotype suitable for autoimmune disease treatment in a large amount ex vivo, and there is room for improvement.
[0011]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method for obtaining a larger number of NK T cells shifted to Th2 type or Th1 type ex vivo. In addition, the present invention provides a NK T cell shifted to Th2 type or Th1 type and a cell fraction containing the cell, which are suitable for use in cell therapy, which is a method for treating diseases by using cells. With the goal.
[0012]
[Means for Solving the Problems]
We have identified certain mature dendritic cells (DCs) presenting α-glycosylceramide (α-GlyCer) and interleukin 7 (IL-7) and dexamethasone in a specific manner as described below. As a result, it was found that NK T cells shifted to Th2 type can be amplified more from the mononuclear cell fraction (PBMC) obtained from peripheral blood. In addition, it was found that NK T cells shifted to Th2 type can be obtained by using a human NK T cell line instead of PBMC obtained from peripheral blood. Based on these findings, the present invention has been completed.
[0013]
DC is considered to be the main body of antigen-presenting cells (APCs), takes in α-GlyCer, which is a glycolipid antigen, and presents it on the membrane surface via CD1d, which is an antigen-presenting molecule. The monocyte cell fraction (PBMC) includes T cells, monocytes, B cells, NK cells, NK T cells, granulocytes, and the like. When the isolated monocytes are cultured in the presence of GM-CSF and IL-4, immature DCs are obtained. Thereafter, when IL-1β and tumor necrosis factor α (TNF-α) are added and cultured, the cells differentiate into mature DC0 (註: referred to herein as DC0 to clearly distinguish them from DC1 and DC2). This maturation process involves IFN-α or PGE. 2 Is added, differentiation and maturation into mature DC1 or DC2 respectively. When co-cultured with mature DC presenting α-GlyCer and PBMC, NK T cells contained in PBMC are selectively amplified, and IL-7 and IL-15 synergistically amplify NK T cells. Let And, when the present inventors added IL-7 and dexamethasone to a co-culture system of PBMC and mature DC2, NK T cells having a Th2 type phenotype are synergistically amplified, and It was found that when IL-15 was added to a co-culture system of PBMC and mature DC1, NK T cells having a Th1-type phenotype were amplified.
[0014]
The present invention has been made based on the above findings, and provides the following amplification method and production method (including cells and cell fractions obtained by the method) and therapeutic agents for autoimmune diseases.
(1) A mononuclear cell fraction containing human NK T cells is subjected to proliferation and / or activation action of (a) mature DC2 or mature DC0 presenting α-GlyCer, and (b) NK T cells. A method for amplifying human NK T cells shifted to a Th2 type, comprising culturing in the presence of a cytokine having (c) dexamethasone.
(2) The amplification method according to (1), wherein the cytokine having NK T cell proliferation and / or activation action comprises IL-7.
(3) A mononuclear cell fraction containing human NK T cells is subjected to (a) mature DC2 or mature DC0 presenting α-GlyCer, and (b) NK T cell proliferation and / or activation action. A method for producing a human NK T cell shifted to Th2 type, comprising culturing in the presence of (c) dexamethasone, and isolating NK T cells shifted to Th2 type from the cultured cells.
(4) The production method according to (3), wherein the cytokine having NK T cell proliferation and / or activation action comprises IL-7.
(5) A mononuclear cell fraction containing human NK T cells is subjected to proliferation and / or activation action of (a) mature DC2 or mature DC0 presenting α-GlyCer and (b) NK T cells. A method for producing a cell fraction containing human NK T cells shifted to Th2 type, comprising culturing in the presence of cytokine having (c) dexamethasone.
(6) The production method according to (5), wherein the cytokine having NK T cell proliferation and / or activation action comprises IL-7.
(7) A therapeutic agent for an autoimmune disease comprising, as an active ingredient, human NK T cells shifted to Th2 type obtained by the production method according to (3) or (4).
(8) A therapeutic agent for an autoimmune disease comprising, as an active ingredient, a cell fraction containing human NK T cells shifted to Th2-type obtained by the production method according to (5) or (6).
(9) A human natural killer T shifted to a Th1 type, comprising culturing a mononuclear cell fraction containing human NK T cells in the presence of mature DC1 and IL-15 presenting α-GlyCer. Cell amplification method.
(10) A mononuclear cell fraction containing human NK T cells is cultured in the presence of mature DC1 and IL-15 presenting α-GlyCer, and natural killer shifted from the cultured cells to Th1 type A method for producing a human natural killer T cell shifted to Th1 type, comprising isolating the T cell.
(11) A human natural killer T shifted to Th1 type, comprising culturing a mononuclear cell fraction containing human NK T cells in the presence of mature DC1 and IL-15 presenting α-GlyCer. A method for producing a cell fraction containing cells.
[0015]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0016]
The method for amplifying and producing NK T cells shifted to Th2 type of the present invention comprises the steps of: (a) mature DC2 presenting α-GlyCer, (b) a mononuclear cell fraction containing human NK T cells; It is characterized by culturing in the presence of a cytokine having an effect of proliferating and / or activating NK T cells and (c) dexamethasone (DEX).
[0017]
The mononuclear cell fraction containing NK T cells is not particularly limited as long as it is a mononuclear cell fraction containing an amplifiable amount of NK T cells. For example, PBMC which can be obtained from human peripheral blood, human NK T cell line (all are mononuclear cell fractions consisting of NK T cells) and the like.
[0018]
PBMC can be prepared from peripheral blood diluted with physiological saline by using a method such as density gradient. PBMC obtained from peripheral blood mainly contains monocytes and lymphocytes (T cells, B cells, NK cells, NK T cells) and granulocytes, and removes red blood cells and platelets. Has been.
[0019]
Examples of human NK T cell lines include Eur. J. et al. Immunol. , 28: 4391-4397, 1998, J. MoI. Exp. Med. 188 (8): 1529-1534, 1998, J. MoI. Exp. Med. , 188 (8): 1521-1528, 1998; Immunol. 158: 5603-5611, 1997.
[0020]
Mature DC2 presenting α-GlyCer is obtained by culturing monocytes isolated from PBMC in the presence of GM-CSF and IL-4 to obtain immature DC (see, for example, J. Exp. Med., 179: 1109-1118, 1994, J. Immunol., 162: 3231-3236, 1999), and the obtained immature DC was expressed as α-GlyCer, PGE. 2 It can be prepared by culturing in the presence of IL-1β and TNF-α and incorporating α-GlyCer and maturation.
[0021]
Specifically, it can be prepared by the following method. About 3 to 5 x 10 in a medium containing fetal calf serum (FCS), such as IMDM 6 PBMCs suspended at a concentration of cells / ml can be cultured in plastic flasks for about 2-3 hours to obtain plastic adherent monocytes. The monocyte fraction obtained here is 10-1000 ng / ml, preferably 100-500 ng / ml human GM-CSF and 100-10000 U / ml, preferably 500-5000 U / ml human IL-4. When cultured in the presence for about 7 days, it can be differentiated into immature DC. The immature DC obtained here is active in antigen uptake. When α-GlyCer (1 to 1000 ng / ml, preferably 50 to 500 ng / ml), which is a glycolipid antigen, is added to the culture system, Can take in α-GlyCer. Simultaneously with the addition of α-GlyCer, 1-100 ng / ml, preferably 10-50 ng / ml IL-1β and 1-100 ng / ml, preferably 10-50 ng / ml TNF-α are added, If the culture is continued for about 3 days, it can be further differentiated into mature DC0. The mature DC0 can also be prepared by a method using LPS instead of TNF-α and IL-1β as described in, for example, the literature (J. Immunol., 164: 4507-4512, 2000). it can. Mature DCs have a low antigen uptake capacity and the antigen presentation capacity is maximized. 1 × 10 in this mature period -5 ~ 1x10 -9 M, preferably about 1 × 10 -7 M's PGE 2 Is added, the immature DC can be differentiated into mature DC2 incorporating α-GlyCer. Mature DC2 is known to differentiate naive T helper cells into Th2 type.
[0022]
It is also possible to use mature DC0 instead of mature DC2. As used herein, the term “mature DC0” means mature DC having the ability to shift naive T helper cells to both Th1 and Th2 types. Mature DC0 has the ability to shift naive T helper cells to both Th1 and Th2 types immediately after differentiation from immature DCs and for at least 8 hours post-differentiation. For example, after 48 hours, it has been reported that the ability to shift naive T helper cells to the Th1 type decreases, and changes to mature DC having only the ability to shift to the Th2 type (Nature). Immunology, 1: 311-316, 2000). Therefore, it is considered that NK T cells shifted to Th2 type can be obtained even when mature type DC0 is used instead of mature type DC2, as in the case of using mature type DC2. Further, as understood from the above, the term “mature DC2 or mature DC0” in the present specification is not limited to those clearly classified as either mature DC2 or mature DC0, It also includes mature DC having intermediate properties between DC2 and mature DC0.
[0023]
α-GlyCer is a glycosphingolipid in which saccharides such as galactose and glucose and ceramide are bonded in an α-coordinate. WO 93/05055 (published March 18, 1993), WO 94/02168 (February 1994) 3), WO94 / 09020 (published 28th April 1994), WO94 / 24142 (published 27th October 1994), and WO 98/44928 (published 15th October 1998). Things can be mentioned. Among them, (2S, 3S, 4R) -1-O- (α-D-galactopyranosyl) -2-hexacosanoylamino-1,3,4-octadecanetriol ((2S, 3S, 4R) -1 -O- (α-D-galactopyranosyl) -N-hexacanoyl-2-amino-1,3,4-octadecanetriol)) (hereinafter referred to as KRN7000) is preferred.
[0024]
IL-7, IL-2, IL-18, etc. are mentioned as a cytokine which has a proliferation and / or activation effect | action of a NK T cell. One kind of cytokine may be used, or two or more kinds may be used in combination. Preferably, the cytokine comprises IL-7, ie IL-7 or a combination of IL-7 and other cytokines.
[0025]
Cytokines with NK T cell proliferation and / or activation effects, such as IL-7, synergistically with mature DC2 presenting α-GlyCer for NK T cell proliferation in vitro. Works.
[0026]
The culture is performed by adding mature DC2 presenting α-GlyCer, cytokine having an effect of proliferation and / or activation of NK T cells, and dexamethasone to the medium, as well as NK such as PBMC and NK T cell line. It can be performed under normal culture conditions of a mononuclear cell fraction containing T cells. The amount of mature DC2, cytokine, and dexamethasone added and the culture time need only be sufficient to amplify NK T cells that have shifted to the Th2-type. On the other hand, it requires a cell number of 1/40 to 1/5, and the concentration of cytokine is 1-1000 ng / ml, and the concentration of dexamethasone is 1 × 10 10 although it depends on the type of cytokine. -9 ~ 1x10 -3 M, preferably 1 × 10 -8 ~ 1x10 -4 M, culture time is 5 to 14 days.
[0027]
As the medium, for example, RPMI-1640 medium containing 5-10% human serum, 0.01 mM 2-mercaptoethanol, 1.6 mM L-glutamine, 25 mM hepes, 50 U / ml penicillin and 50 U / ml streptomycin. Etc.
[0028]
The culture method is the same when mature DC0 presenting α-GlyCer is used instead of mature DC2 presenting α-GlyCer.
[0029]
Amplification of NK T cells shifted to Th2 type can be measured by analyzing cells stained with fluorescent antibodies by flow cytometry. The shift to Th2 type can be defined by cytokine production in NK T cells. For example, the positive rate of IL-4, which is a typical Th2-type cytokine, and the production of IFN-γ, which is a typical Th1-type cytokine, can be analyzed using flow cytometry. The positive rate of IL-4 is increased (preferably increased by about 30% or more), and the production of IFN-γ is decreased (preferably about A reduction of 30% or more) confirms the amplification of the Th2 type shift.
[0030]
According to the amplification method of the present invention, NK T cells shifted to Th2 type can be efficiently proliferated to a practical level. Further, the cell fraction containing NK T cells shifted to Th2 obtained by the production method of the present invention is useful in the therapy of autoimmune diseases.
[0031]
Isolation of NK T cells shifted to Th2 type from cultured cells can be performed by a known method such as a magnetic bead method.
[0032]
The therapeutic agent for autoimmune diseases of the present invention contains human NK T cells shifted to Th2 type obtained by the production method of the present invention or a cell fraction containing the cells as an active ingredient.
[0033]
As a method for administering the therapeutic agent for autoimmune disease of the present invention, intravenous, subcutaneous, intradermal and intralymphatic administration can be considered. The dosage form is suspended in physiological saline or various Ringer's solutions. The dose varies depending on the route of administration, and 0.1 ml to 5 ml can be administered subcutaneously, and about 300 ml can be administered intravenously. The dose converted to the number of NK T cells shifted to Th2 type is usually the body surface area (m 2 ) 5 x 10 per individual 5 ~ 1x10 7 It is a piece. Target diseases include multiple myositis, chronic rheumatism, systemic lupus erythematosis, systemic sclerosis, bullous disease, cutaneous lupus erythematosis, psoriasis, Crohn's disease, ulcerative colitis, autoimmune hepatitis, multiple sclerosis, 1 Type diabetes and the like.
[0034]
According to the present invention, a large amount of autologous NK T cells having a Th2-type phenotype that is likely to be effective in autoimmune diseases that can produce large amounts of IL-4 while IFN-γ production is suppressed. It can be generated ex vivo. Its cell number is high enough for clinical use.
[0035]
The method for amplifying and producing Th1 type-shifted NK T cells of the present invention comprises a mononuclear cell fraction containing human NK T cells in the presence of mature DC1 and IL-15 presenting α-GlyCer. It is characterized by culturing in.
[0036]
The mononuclear cell fraction containing human NK T cells and α-GlyCer are the same as described for the method for amplifying and producing NK T cells shifted to the above Th2 type.
[0037]
Mature DC1 presenting α-GlyCer can be prepared by the following method. The immature DC prepared by the method described for the method for amplifying and producing NK T cells shifted to Th2 type is added with α-GlyCer at 1 to 1000 ng / ml, preferably 50 to 500 ng / ml. At the same time, 10 to 10000 U, preferably about 10 to 100 ng / ml, preferably 10 to 50 ng / ml IL-1β and 1 to 100 ng / ml, preferably 10 to 50 ng / ml TNF-α, preferably about When 1000 U of interferon-gamma (IFN-γ) is added and the culture is continued for about 3 days, it can be differentiated into mature DC1. This mature DC1 can differentiate naive T helper cells into Th1 type.
[0038]
In addition to adding mature DC1 and IL-15 presenting α-GlyCer to the medium, normal culture of mononuclear cell fractions containing NK T cells such as PBMC and NK T cell lines Can be done under conditions. The amount of addition and the culture time of mature DC1 and IL-15 may be sufficient so that NK T cells shifted to Th1 type can be amplified. Normally, mature DC1 is the number of mononuclear cells. On the other hand, the cell number of 1/40 to 1/5 is required, the concentration of IL-15 is 1-1000 ng / ml, and the culture time is 5-14 days.
[0039]
The medium may be the same as described for the method for amplifying and producing NK T cells shifted to Th2 type.
[0040]
Amplification of NK T cells shifted to Th1 type can be measured by analyzing cells stained with fluorescent antibodies by flow cytometry. The shift to Th1 type can be defined by cytokine production in NK T cells. For example, production of IFN-γ, which is a typical Th1-type cytokine, can be analyzed by using flow cytometry, and NK T cells amplified under the same conditions except that IL-15 is not added. In comparison, the increase in IFN-γ production can confirm the amplification of the Th1-type shift.
[0041]
According to the amplification method of the present invention, NK T cells shifted to Th1 type can be efficiently proliferated to a practical level. In addition, Th1 type-shifted NK T cells obtained by the production method of the present invention and cell fractions containing the same include cancer, various infectious diseases including infections caused by bacteria, malaria and other protozoa, and , CMV, HIV, hepatitis B and hepatitis C viruses can be used as an active ingredient of a therapeutic agent for viral diseases. The administration method and formulation form of this therapeutic agent may be the same as the above-mentioned therapeutic agent for autoimmune diseases.
[0042]
Isolation of NK T cells shifted to Th1 type from cultured cells can be performed by a known method such as a magnetic bead method.
[0043]
According to the present invention, it becomes possible to amplify human NK T cells shifted to Th2 type or Th1 type very effectively by stimulation of specific matured DC incorporating α-GlyCer in vitro. . Specifically, by adding mature DC1 and IL-15, NK T cells shifted to Th2 type can be obtained by adding mature DC2 or DC0, IL-7 and dexamethasone to Th1 type. It becomes possible. In addition, NK T cells can be amplified in the same manner regardless of whether they are derived from healthy individuals or autoimmune disease patients, and it is possible to obtain NK T cells shifted to either Th1 or Th2 type.
[0044]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
[0045]
Example 1 Amplification of NK T cells
(1) Preparation of immature dendritic cells (DC)
Peripheral blood collected from healthy individuals was diluted twice with physiological saline, and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were obtained by specific gravity centrifugation. 3 x 10 in IMDM medium containing 10% fetal calf serum (FCS), 0.01 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 50 U / ml penicillin and 50 U / ml streptomycin. 6 PBMC suspended at a concentration of / ml was placed in a culture flask and cultured for 1-2 hours. Thereafter, floating cells were removed, and adherent cells mainly composed of macrophages were treated with 100 ng / ml human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and 1000 U / ml human interleukin-4 ( The cells were cultured for 1 week in the presence of IL-4) to obtain immature DCs.
[0046]
(1) -1 Preparation of mature DC0 incorporating KRN7000
To the culture flask containing immature DC prepared in (1), 100 ng / ml KRN7000, 10 ng / ml IL-1β and 50 ng / ml TNF-α were added and cultured for 3 days to obtain KRN7000. A mature form of DC0 was prepared.
[0047]
(2) Preparation of mature DC1 incorporating KRN7000
Into a culture flask containing immature DC prepared in (1), 100 ng / ml KRN7000, 50 ng / ml human tumor necrosis factor (TNF) -α, 10 ng / ml IL-1β and 1000 U Interferon (IFN) -γ was added and cultured for 3 days to prepare mature DC1 incorporating KRN7000.
[0048]
(3) Preparation of mature DC2 incorporating KRN7000
Into the culture flask containing immature DC prepared in (1), 100 ng / ml KRN7000, 50 ng / ml TNF-α, 10 ng / ml IL-1β and 1 × 10 -7 M prostaglandin (PGE 2 ) And cultured for 3 days to prepare mature DC2 incorporating KRN7000.
[0049]
(4) Amplification of NK T cells shifted to Th1 type
After washing the mature DC1 incorporating KRN7000 prepared in (2) with a medium, PBMC of the same donor was cultured together with DC1 in the presence of 10 ng / ml IL-15 in a culture dish for 7 days (number of PBMCs). : Number of DC1 = 10: 1). The medium used here is RPMI 1640 medium containing 5-10% normal human serum (HS), 0.01 mM 2-ME, 50 U / ml penicillin and 50 U / ml streptomycin. NK T cell numbers were detected using flow cytometry. That is, after the cultured cells were collected from the culture dish, the total number of cells was counted using a hemocytometer. After the cells were washed with physiological saline, an excess amount of human immunoglobulin (Ig) G was added and left at 4 ° C. for 10 minutes in order to inhibit the non-specific reaction of the antibody. Next, in order to inhibit intracellular protein transport, the cells were cultured for 4 to 10 hours in the presence of 3 μM monensin (Sigma). The cells were suspended in physiological saline (PN) containing 0.5% bovine serum albumin (BSA, Boehringer Manheim) and 0.1% NaN (Sigma), and then fluorescein isothiocyanate (FITC). Anti-Vα24 antibody labeled with, anti-Vβ11 antibody labeled with phycoerythrin (PE) (Immunotech) and anti-CD3 antibody labeled with PE-Cy5 (Beckton Dickinson) were added and reacted at 4 ° C. for 20 minutes. I let you. The cells were washed with physiological saline (PN) and then suspended in PN containing 4% paraformaldehyde for 10 minutes and fixed. The cells were washed with PN and then suspended in a solution of 0.1% saponin (Merk) and 50 mM D-glucose (Merk) to make the cell membrane permeable. After lightly washing the cells with PN, anti-IFN-γ antibody labeled with PE or anti-IL-4 antibody labeled with PE was added and allowed to react at 4 ° C. for 15 minutes. Flow cytometry analysis of the cells was performed using FACStar (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA). Intracellular granzyme B (GrB) was quantified using anti-GrB antibody labeled with PE instead of anti-IFN-γ antibody or anti-IL-4 antibody. The amplification rate of the number of NK T cells after culture was calculated after performing flow cytometry analysis on the number of NK T cells contained in PBMC before culture. A representative example is shown in Table 1 from the results obtained from the test conducted several times. The IL-4 positive rate represents the proportion of cells that produced IL-4 in the whole cells, and IFN-γ and GrB represent the number of IFN-γ or GrB molecules expressed per cell.
[0050]
(5) Amplification of NK T cells shifted to Th2 type
After washing mature DC2 incorporating KRN7000 prepared in (2) with a medium, PBMC of the same donor together with DC2 was present in the presence of 10 ng / ml IL-7, or 10 ng / ml IL- 7 and 1 × 10 -7 The cells were cultured in a culture dish in the presence of M dexamethasone (DEX) (Sigma) for 7 days (PBMC number: DC2 number = 10: 1). The medium used here is RPMI 1640 medium containing 5-10% normal human serum (HS), 0.01 mM 2-ME, 50 U / ml penicillin and 50 U / ml streptomycin. The flow cytometry analysis after the culture was performed in the same manner as (4) above. A representative example is shown in Table 1 from the results obtained from the test conducted several times.
[0051]
[Table 1]
[0052]
Example 2 Cell killing effect of NK T cells amplified in Ex vivo
Culture was performed for 11 days as described in Example 4 (4) or (5) to amplify NK T cells shifted to Th1 or Th2 type. At the same time, the culture method of Example 1 (5) was modified, that is, cultured under the conditions where DEX was not added, and NK T cells were amplified. The NK T cell fraction, that is, cells satisfying the condition of CD3 positive Vα24 positive Vβ11 positive was sorted using FACStar (Becton Dickinson). Thereafter, the killing effect of the sorted NK T cells on human myeloid leukemia cells U937 was 51 A Cr release measurement method was used for examination. That is, 51 After culturing for 4 hours under the condition that the effector-to-target ratio (E / T ratio) was 12.5: 1 (number ratio) using U937 labeled with Cr as a target, the released radioactivity was measured with a beta counter.
[0053]
[Table 2]
[0054]
[Example 3] Culture of Th2-type NK T cells derived from PBMC of ulcerative colitis patient
According to Example 1 (5), Th2-type NK T cells were cultured from PBMCs of ulcerative colitis patients classified as one of the autoimmune diseases caused by the shift to Th1 type. At the same time, the culture was carried out under a method obtained by modifying the culture method of Example 1 (5), that is, without adding DEX. Representative results are shown in Table 3.
[0055]
[Table 3]
[0056]
【The invention's effect】
According to the present invention, it becomes possible to obtain an amplified cell fraction of NK T cells shifted to Th2 type, and by using such cell fraction or cells, autoimmune disease treatment by cell medicine is possible. It becomes.
