【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は有用細菌含有の飲料品又は医薬品の原料用抗菌剤及び炎症性腸疾患の予防治療剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
消化管内には、多種類の宿主由来の抗菌蛋白、ペプチドが分泌されている。その代表的なものとして、唾液中のリゾチームや小腸上皮細胞の一つであるパネート細胞から分泌されるクリプチジン（α−デフェンシン）等がある。デフェンシンは、好中球のリソソーム顆粒から、食胞の中に放出される殺菌蛋白質の一つであり、アルギニン残基が４〜１０個、システイン残基が６個ある２９〜３４個のアミノ酸からなる塩基性の蛋白質である。これら以外にも、抗菌作用を有する多くの蛋白質が存在すると考えられている。
【０００３】
例えば、Ｍａｒｕｔｓｕｋａ らは、すでに血管の弛緩作用をもつことが知られているアドレノメデュリン（ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ）、プロアドレノメデュリンペプチド（ｐｒｏａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎｐｅｐｔｉｄｅ；ＰＡＭＰ）が消化管においても、大腸上皮細胞の管腔側に発現されていること、それらが大腸菌に対して抗菌活性をもつことを報告している（非特許文献１参照）。
【０００４】
このアドレノメデュリンは、降圧蛋白質として１９９３年にクローン化された新しい物質（Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ．誌９３年ｖｏｌ．１９４，ｐ．７２０−）であり、ヒトの褐色細胞からクローン化された前駆体（ＰＡＭＰ）は １８５個のアミノ酸で、そのうち、Ｃ末よりのアミノ酸５２個のペプチドがアドレノメデュリンである。
【０００５】
このアドレノメデュリン及びその前駆体について、最近、皮膚、口腔、気道、及び、消化管の菌叢の細菌に対して抗菌作用があることが本発明者等によって確認された（非特許文献２参照）。
【０００６】
一方、潰瘍性大腸炎やクローン病などの炎症性腸疾患（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓｅａｓｅ：ＩＢＤ）は、未だその原因が明らかにされていない消化管疾患であり、原因の究明、現在様々な治療・予防方法の確立が急務とされている。長期間に亘る腸炎病変の回復と再発が繰り返されるのが炎症性腸疾患の特徴であり、現在のところ治療は長期に亘る薬剤投与法によるしかない。
【０００７】
また、ＩＢＤの発症原因については、特定の腸内細菌の関与が指摘されている。即ち、ある種のバクテロイデス・ブルガタス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｖｕｌｇａｔｕｓ）及び大腸菌のある株が、腸内環境を劣化させ、ＩＢＤの発症、悪性化に寄与していると報告されている（非特許文献３参照）。従って、ＩＢＤの予防治療に当たっては、これら所謂悪玉菌を抑制することが望ましいが、抗菌剤の投与などは、有用腸内細菌であるビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ） 属細菌等までも死滅させてしまい、耐性菌の出現等の問題もあるため、充分且つ完全にＩＢＤを予防治療することは困難であった。
【０００８】
【非特許文献１】
Ｍａｒｕｔｓｕｋａら Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ８６（２００１）：５４３−５４５
【非特許文献２】
ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２３（１９９９）２８９−２９３
【非特許文献３】
Ｂａｍｂａ Ｔ．ら Ｊ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．３０（１９９５）４５−４７
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、本発明者等は、アドレノメデュリン及びその前駆体の抗菌活性について、細菌の種、株等によって抗菌作用の差があることを見出した。即ち、アドレノメデュリン及びそのプレ体は、特定の細菌については強く生存性を抑制するのに対して、別の特定の細菌については生存率を抑制することがなく、更には生存率を助長することが確認された。
【００１０】
本発明は、プロバイオティク（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ） な細菌のように特定の有用細菌については抗菌作用を示さず、病原性細菌を含む多くの細菌については抗菌作用を示す抗菌剤を得ることを目的とする。また、本発明は、ビフィドバクテリウム属細菌等の腸内有用細菌を抑制することなく、所謂悪玉菌を抑制することのできる炎症性腸疾患の予防治療剤を得ることを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
請求項１に記載された発明に係る有用細菌含有飲食品又は医薬品原料用抗菌剤は、アドレノメデュリン（Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ）又はプロアドレノメデュリンペプチド（ＰＡＭＰ）を主成分として含有することを特徴とするものである。
【００１２】
請求項２に記載された発明に係る有用細菌含有飲食品又は医薬品原料用抗菌剤は、請求項１に記載された有用細菌が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ又はＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅであるものである。
【００１３】
請求項３に記載された発明に係る有用細菌含有飲食品又は医薬品原料用抗菌剤は、請求項１に記載された有用細菌が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ＹＩＴ９０２９、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ＹＩＴ９０１８、及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ ＹＩＴ４０６５ から選ばれた１つ以上の株であるものである。
【００１４】
請求項４に記載された発明に係る炎症性腸疾患の予防治療剤は、アドレノメデュリン（Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ）又はプロアドレノメデュリンペプチド（ＰＡＭＰ）を有効成分とするものである。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明においては、アドレノメデュリン（Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ）又はプロアドレノメデュリンペプチド（ＰＡＭＰ）を主成分として含有するものであるため、特定の有用細菌を含有する飲食品原料又は医薬品原料に添加された際に、プロバイオティク（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ） な細菌のように特定の有用細菌については抗菌作用を示さず、病原性細菌を含む多くの細菌については抗菌作用を示す抗菌剤を得ることができる。即ち、本発明では、特定の有用細菌を含有する飲食品又は医薬品の原料に対するアドレノメデュリン又はプロアドレノメデュリンペプチドの抗菌剤としての使用を提案するものである。
【００１６】
本発明でのアドレノメデュリン（Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ）又はプロアドレノメデュリンペプチド（ＰＡＭＰ）は、ペプチド研究所より購入した。
【００１７】
本発明による抗菌剤の使用対象は、１種又は２種以上の特定の有用細菌を含有する飲食品原料又は医薬品原料である。係る特定の有用細菌としては、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ又はＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ が挙げられ、特に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ＹＩＴ９０２９、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ＹＩＴ９０１８、及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ ＹＩＴ４０６５から選ばれた１つ以上の株が挙げられる。特に、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ ＹＩＴ４０６５ に対しては、本発明による抗菌剤は、阻害作用を殆ど示さず、むしろ成長促進作用を示すことが確認されている。
【００１８】
従って、これらＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ又はＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅを含む飲食品原料及び医薬品原料にアドレノメデュリン（Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ）又はプロアドレノメデュリンペプチド（ＰＡＭＰ）を主成分とする抗菌剤を添加することにより、飲食品原料及び医薬品原料に含まれる有用細菌以外の細菌の増殖は阻害され、特に、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ ＹＩＴ４０６５については、増殖も可能な抗菌剤としての使用を得ることができる。
【００１９】
本発明での有用細菌含有飲食品原料としては、前記有用細菌を培養物として含む飲食品原料が挙げられる。例えば、プレーンタイプ、フレーバードタイプ、フルーツタイプ、甘味タイプ、ソフトタイプ、ドリンクタイプ、固形（ハード）タイプ、フローズンタイプ等の発酵乳、乳酸菌飲料、チーズ、発酵豆乳、キムチ等が挙げられる。
【００２０】
また、有用細菌含有医薬品原料としては、前記有用細菌を生菌体として含む医薬品原料が挙げられる。例えば、前記有用細菌を生菌体（乾燥菌体等）として含み、その他に後記するような薬学的に許容される他の製剤で適宜加工し、例えば、カプセルに充填したりタブレットや顆粒にしたものが挙げられる。
【００２１】
また、本発明は、アドレノメデュリン又はプロアドレノメデュリンペプチドを有効成分とする炎症性腸疾患の予防治療剤、即ち、アドレノメデュリン又はプＰＡＭＰの予防治療剤としての使用に関する。炎症性腸疾患の予防（再発予防を含む）には、本疾患との関連が推定されているバクテロイデス・ブルガータス（非特許文献３）に抗菌活性を示し、他の特定の有用細菌に抗菌活性を示さない物質の投与が有効と考えられ、本発明のアドレノメジュリン、プロアドレノメジュリンはこのような物質に該当することが見出されたためである。炎症性腸疾患の予防治療剤として用いるアドレノメデュリン、プロアドレノメデュリンペプチドは特に限定されず、前記の同一の方法にて得たもの等を用いることができる。
【００２２】
薬学的に許容される他の製剤としては、具体的に、剤型としては、カプセル剤、顆粒剤、錠剤、被膜錠剤、散剤等の固形製剤あるいはシロップ剤、内服液剤、エリキシル剤等の液状製剤として経口投与する経口用製剤や、注射剤、直腸投与剤等の非経口用製剤とすることが可能であり、注射剤、直腸投与剤とすることが好ましい。
【００２３】
各製剤（医薬組成物）を製造する場合、例えば経口用製剤であれば、賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を加えた後、定法により上記剤型に加工し製造することができる。そのような添加剤としては、当該分野で一般的に使用されているものを用いることができ、例えば賦形剤としては、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、澱粉、結晶セルロース、微結晶セルロース、炭酸カルシウム、カオリン、乳酸カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、無水ケイ酸等を、結合剤あるいは崩壊剤としては、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、ヒドロキシプロピルスターチ、リン酸カルシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖、白糖等を、滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム等のステアリン酸塩、精製タルク、ホウ酸、ポリエチレングリコール等を、矯味剤としては、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が例示できる。
【００２４】
また、経口用液状製剤を調製する場合は、矯味剤、緩衝剤、安定化剤等を加えて定法により各種製剤化を行なうことができる。緩衝剤としてはクエン酸ナトリウム等が、安定化剤としてはトラガント、アラビアゴム、ゼラチン等を例示でき、その他は上記と同様である。
【００２５】
アドレノメデュリン、プロアドレノメデュリンペプチドを有用細菌含有食品又は医薬品の原料として用いる場合、その添加量に特に限定されない。また、その投与量は１〜５ｍｇ／日／人が、好ましい。
【００２６】
【実施例】
１．実験方法
本実施例で用いた試験菌は次の表１に示す通りである。尚、使用培地については、１）ＴＳ液体培地（ＢＢＬ）／ＴＳ寒天培地（Ｎｉｓｓｕｉ）、２）ＴＳ液体培地（ＢＢＬ）／ＧＡＭ （ＢＢＬ）＋１％Ｇｌｕ，１％Ｌａｃ寒天培地、３）ＧＡＭ（ＢＢＬ）＋１％Ｇｌｕ，１％Ｌａｃ液体培地／ＧＡＭ（ＢＢＬ）＋１％Ｇｌｕ，１％Ｌａｃ寒天培地、嫌気的に調製、培養した。
【００２７】
２．抗菌活性の測定
使用したペプチドについては、アドレノメデュリン（Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ）、プロアドレノメデュリンペプチド（ＰＡＭＰ）、β−デフェンシン（β−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ−２）、α−デフェンシン（α−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ−１）はいずれもペプチド研究所（大阪）から購入した。
【００２８】
【表１】
【００２９】
３．抗菌活性の測定方法
それぞれの菌を上記の液体培地で一夜培養後、新しい培地に植えつぎ対数増殖期まで培養した。約１０５ 菌数／ｍｌになるように、１０ｍＭ リン酸バッファー（＋０．０９％ ＮａＣｌ ＋ ５ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ ７．２）で希釈し、その２００μｌをエッペンチューブ（丸底）に採取し、各種ペプチド（０．１μＭ〜２μＭ）を含む水（５０μｌ）と混合し、緩く攪拌しながら３７℃、３時間反応させた。容器ごと氷冷し、ＰＢＳまたは嫌気的に調製した希釈液で希釈した。その後、それぞれの菌を上記の寒天培地に播種してＣＦＵを求めた。嫌気性菌の各ペプチドとのインキュベーション並びに培養は嫌気的に調整されたグローブボックス内で行った。
【００３０】
４．結果
４．１．抗菌活性測定条件の検討
１） 対数増殖期と静止期の比較
静止期と対数増殖期のＥ． ｃｏｌｉ（ＹＩＴ６０４４）を用いてβ‐Ｄｅｆｅｎｓｉｎの抗菌活性を測定した。図１は静止期及び対数増殖期でのＥ． ｃｏｌｉ（ＹＩＴ６０４４）の生存率に対するβ−デフェンシンの種々の濃度の影響を示したグラフであり、ａ図は静止期での結果を示す線図、ｂ図は対数増殖期での結果を示す線図である。２つの成長期から用意された２つの菌懸濁液は、ＰＢＳ中で抗菌性ペプチドと共に３７℃３時間の振盪培養を行った。抗菌性の活性は、ペプチドと共に３時間のインキュベーションを行う前と後とでＣＦＵを計測することによって評価された。図において、棒グラフはＣＦＵを示し、折れ線グラフは抑制率を示す。尚、後述する図においても同様に、棒グラフはＣＦＵを示し、折れ線グラフは抑制率を示す。
【００３１】
図に示す通り、静止期ではペプチド濃度１μＭで、ペプチド非添加と比較して全く阻害活性がみられなかった。一方、対数増殖期の菌を用いた場合は、１μＭで約６０％の阻害がみられた。
【００３２】
２） 抗菌活性測定のための緩衝液の検討
対数増殖期の菌を用いて、緩衝液（１０ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ‐ｂｕｆｆｅｒ）中のＮａＣｌ濃度を検討した。図２はβ−デフェンシンによるＥ． ｃｏｌｉ ＹＩＴ６０４４ の生存率抑制でのＮａＣｌ濃度の影響を示したグラフであり、ａ図はＮａＣｌが ０．９％、ｂ図はＮａＣｌが０．０９％のものを示す。図において、棒グラフはＣＦＵを示し、折れ線グラフは抑制率を示す。
【００３３】
図に示す通り、Ｅ． ｃｏｌｉに対するβ−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ２の抗菌活性は、ＮａＣｌ濃度０．９％では顕著に抑制され、０．０９％以下ではほとんど影響を与えなかった。
【００３４】
図３はＢ．ｖｕｌｇａｔｕｓ ＹＩＴ６１５９の生存率抑制でのＮａＣｌ濃度の影響を示したグラフであり、ａ図はＮａＣｌが０％、ｂ図はＮａＣｌが０．０９％のものを示す。図に示す通り、Ｂ． ｖｕｌｇａｔｕｓにおいては、抗菌ペプチド不在下でもＮａＣｌを添加しないと３時間の反応時間中の菌数の減少が著しく、０．０９％ＮａＣｌでは菌数の減少が抑制できた。以上の結果より０．０９％ＮａＣｌを採用した。
【００３５】
図４はβ−デフェンシンによるＥ． ｃｏｌｉ ＹＩＴ６０４４ の生存率抑制（０．０９％ＮａＣｌ）でのブドウ糖の影響を示したグラフである。図に示す通り、ブドウ糖の添加による抗菌活性への影響はほとんどなかった。
【００３６】
４．２．４種類のペプチドの抗菌活性
１） 常在性腸内細菌種
図５は４種類のペプチドによるＥ． ｃｏｌｉ の生存率に対する影響を示したグラフである。他の実験の条件は図１で示した通りである。図に示す通り、４種類のペプチドの各々について、有意な阻害が見られた。
【００３７】
図６は４種類のペプチドによるＬ． ｒｅｕｔｅｒｉの生存率に対する影響を示したグラフである。他の実験の条件は図１で示した通りである。図に示す通り、４種類のペプチドの各々について、有意な阻害が見られた。
【００３８】
図７は４種類のペプチドによるＳｔａｐ．ａｕｒｅｕｓ の生存率に対する影響を示したグラフである。他の実験の条件は図１で示した通りである。図に示す通り、４種類のペプチドのうち、プロアドレノメデュリンペプチド、α−デフェンシン、β−デフェンシンについて、有意な阻害が見られた。
【００３９】
図８は２種類のペプチドによるＣｌ． ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ の生存率に対する影響を示したグラフである。他の実験の条件は図１で示した通りである。図に示す通り、２種類のペプチドの各々について、有意な阻害が見られた。
【００４０】
図９は４種類のペプチドによるＣｏ．ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｃｅ の生存率に対する影響を示したグラフである。他の実験の条件は図１で示した通りである。図に示す通り、４種類のペプチドの各々について、有意な阻害が見られた。
【００４１】
図１０は２種類のペプチドによＢａｃｔ．ｖｕｌｇａｔｕｓ の生存率に対する影響を示したグラフである。他の実験の条件は図１で示した通りである。図に示す通り、２種類のペプチドのうち、プロアドレノメデュリンペプチドについて、有意な阻害が見られた。
【００４２】
２） プロバイオティクス
図１１は３種類のペプチドによるＬ． ｃａｓｅｉ ＹＩＴ９０２９の生存率に対する影響を示したグラフである。他の実験の条件は図１で示した通りである。図に示す通り、３種類のペプチドのうち、α−デフェンシン、β−デフェンシンについて、有意な阻害が見られた。
【００４３】
図１２は３種類のペプチドによるＢ． ｂｒｅｖｅ ＹＩＴ４０６５の生存率に対する影響を示したグラフである。他の実験の条件は図１で示した通りである。図に示す通り、３種類のペプチドのうち、アドレノメデュリン、プロアドレノメデュリンペプチドについて、有意な生存率の促進が見られた。
【００４４】
以上の図５〜図１２の結果を要約したものを次の表２に示す。表において、−１〜−３と＋１〜＋３は、生存率抑制と促進の度を示す。±は影響のないことを示す。
【００４５】
以上の通り、ヒトの腸内菌の中で占有率の高い菌種を選択して、各ペプチドの抗菌活性を測定した。アドレノメデュリン及びプロアドレノメデュリンペプチドに対しては、殆どの微生物は程度の差はあるが、ペプチド濃度１‐２μＭで阻害活性がみられたが、Ｌ． ｃａｓｅｉ ＹＩＴ９０２９及びＢ． ｂｒｅｖｅ ＹＩＴ４０６５に関しては殆ど阻害活性がみられなかった。特に、Ｂ． ｂｒｅｖｅ ＹＩＴ４０６５に関しては阻害活性ではなく、生存率促進活性が見られた。炎症性腸疾患の発症や憎悪には常在性腸内細菌の関与が認められており、抗生物質の投与は一定の効果を上げている。従って、各種の常在性腸内細菌に抗菌活性を示し、有用菌である乳酸菌及びビフィズス菌に抗菌活性を示さない本物質の投与は有効と考えられる。
【００４６】
【表２】
【００４７】
【発明の効果】
本発明は以上説明した通り、プロバイオティク（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ ）な細菌のように特定の有用細菌については抗菌作用を示さず、病原性細菌を含む多くの細菌については抗菌作用を示す抗菌剤及び炎症性腸疾患の予防治療剤を得ることができるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】静止期及び対数増殖期でのＥ． ｃｏｌｉ（ＹＩＴ６０４４）の生存率に対するβ−デフェンシンの種々の濃度の影響を示したグラフであり、ａ図は静止期での結果を示す線図、ｂ図は対数増殖期での結果を示す線図である。
【図２】β−デフェンシンによるＥ． ｃｏｌｉ ＹＩＴ６０４４の生存率抑制でのＮａＣｌ濃度の影響を示したグラフであり、ａ図はＮａＣｌが ０．９％、ｂ図はＮａＣｌが０．０９％のものを示す。
【図３】Ｂ．ｖｕｌｇａｔｕｓ ＹＩＴ６１５９の生存率抑制でのＮａＣｌ濃度の影響を示したグラフであり、ａ図はＮａＣｌが０％、ｂ図はＮａＣｌが０．０９％のものを示す。
【図４】β−デフェンシンによるＥ． ｃｏｌｉ ＹＩＴ６０４４ の生存率抑制（０．０９％ＮａＣｌ）でのブドウ糖の影響を示したグラフである。
【図５】４種類のペプチドによるＥ． ｃｏｌｉ の生存率に対する影響を示したグラフである。
【図６】４種類のペプチドによるＬ． ｒｅｕｔｅｒｉの生存率に対する影響を示したグラフである。
【図７】４種類のペプチドによるＳｔａｐ． ａｕｒｅｕｓの生存率に対する影響を示したグラフである。
【図８】２種類のペプチドによるＣｌ． ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ の生存率に対する影響を示したグラフである。
【図９】４種類のペプチドによるＣｏ． ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｃｅの生存率に対する影響を示したグラフである。
【図１０】２種類のペプチドによＢａｃｔ． ｖｕｌｇａｔｕｓの生存率に対する影響を示したグラフである。
【図１１】３種類のペプチドによるＬ． ｃａｓｅｉ ＹＩＴ９０２９の生存率に対する影響を示したグラフである。
【図１２】３種類のペプチドによるＢ． ｂｒｅｖｅ ＹＩＴ４０６５の生存率に対する影響を示したグラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an antibacterial agent for beverages or pharmaceutical raw materials containing useful bacteria and a prophylactic / therapeutic agent for inflammatory bowel disease.
[0002]
[Prior art]
In the digestive tract, various types of host-derived antibacterial proteins and peptides are secreted. Typical examples include lysozyme in saliva and cryptidine (α-defensin) secreted from Panate cells, which are one of the small intestinal epithelial cells. Defensin is one of bactericidal proteins released from neutrophil lysosomal granules into the phagosome, from 29 to 34 amino acids with 4 to 10 arginine residues and 6 cysteine residues. It is a basic protein. In addition to these, it is considered that many proteins having antibacterial action exist.
[0003]
For example, Marutuka et al., Adrenomedullin and proadrenomedullin peptide (PAMP), which are already known to have a relaxing action on blood vessels, are also expressed in the luminal side of large intestine epithelial cells in the digestive tract. It has been reported that they have antibacterial activity against E. coli (see Non-Patent Document 1).
[0004]
This adrenomedullin is a new substance cloned in 1993 as an antihypertensive protein (BBRC 1993 vol. 194, p. 720-), a precursor cloned from human brown cells. The body (PAMP) is 185 amino acids, of which 52 peptides from the C-terminal are adrenomedullin.
[0005]
It has been recently confirmed by the present inventors that this adrenomedullin and its precursor have an antibacterial action against bacteria of the flora of the skin, oral cavity, respiratory tract and gastrointestinal tract (see Non-Patent Document 2).
[0006]
On the other hand, inflammatory bowel diseases (IBD) such as ulcerative colitis and Crohn's disease are gastrointestinal diseases for which the cause has not yet been clarified. It is urgently required to establish A characteristic of inflammatory bowel disease is that the recovery and recurrence of enteropathic lesions over a long period of time is a characteristic of inflammatory bowel disease. At present, treatment is limited to drug administration over a long period of time.
[0007]
In addition, regarding the cause of the onset of IBD, the involvement of specific enteric bacteria has been pointed out. That is, it has been reported that certain strains of Bacteroides bulgatus and E. coli have been degraded in the intestinal environment and contributed to the onset and malignancy of IBD (see Non-Patent Document 3). Therefore, in the prevention and treatment of IBD, it is desirable to suppress these so-called bad bacteria. However, administration of antibacterial agents also kills Bifidobacterium, which is a useful intestinal bacterium, and the like. Since there are also problems such as the emergence of resistant bacteria, it has been difficult to prevent and treat IBD sufficiently and completely.
[0008]
[Non-Patent Document 1]
Marutuka et al. Experimental Physiology 86 (2001): 543-545.
[Non-Patent Document 2]
FEMS Immunology and Medical Microbiology 23 (1999) 289-293
[Non-Patent Document 3]
Bamba T.W. Et al. Gastroenterol. 30 (1995) 45-47
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
By the way, the present inventors have found that the antibacterial activity of adrenomedullin and its precursor varies depending on the bacterial species, strains, and the like. In other words, adrenomedullin and its pre-form strongly inhibit the viability of a specific bacterium, but do not suppress the viability of another specific bacterium, and further promote the survival rate. confirmed.
[0010]
An object of the present invention is to obtain an antibacterial agent that does not exhibit antibacterial activity for specific useful bacteria such as probiotic bacteria, and exhibits antibacterial activity for many bacteria including pathogenic bacteria. . Another object of the present invention is to obtain a prophylactic / therapeutic agent for inflammatory bowel disease that can inhibit so-called bad bacteria without inhibiting useful intestinal bacteria such as Bifidobacterium.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
The useful bacteria-containing food or drink or the antibacterial agent for pharmaceutical raw material according to the invention described in claim 1 is characterized by containing adrenomedullin or proadrenomedullin peptide (PAMP) as a main component.
[0012]
The antibacterial agent containing useful bacteria according to the invention described in claim 2 for food or beverage or pharmaceutical raw material according to claim 2 is such that the useful bacteria described in claim 1 are Lactobacillus casei or Bifidobacterium breve.
[0013]
The antibacterial agent containing useful bacteria according to the invention described in claim 3 is useful bacteria described in claim 1 selected from Lactobacillus casei YIT9029, Lactobacillus casei YIT9018, and Bifidobacterium breve YIT4065. One or more stocks.
[0014]
The prophylactic / therapeutic agent for inflammatory bowel disease according to the invention described in claim 4 comprises adrenomedullin (adrenomedullin) or proadrenomedullin peptide (PAMP) as an active ingredient.
[0015]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the present invention, since it contains adrenomedullin or proadrenomedullin peptide (PAMP) as a main component, when added to a food or beverage material or a pharmaceutical material containing a specific useful bacterium, the probiotic is added. It is possible to obtain an antibacterial agent that does not exhibit antibacterial activity for specific useful bacteria such as (probiotic) bacteria, and exhibits antibacterial activity for many bacteria including pathogenic bacteria. That is, the present invention proposes the use of adrenomedullin or proadrenomedullin peptide as an antibacterial agent for raw materials of foods and drinks or pharmaceuticals containing specific useful bacteria.
[0016]
Adrenomedullin (Adrenomedullin) or proadrenomedullin peptide (PAMP) in the present invention was purchased from Peptide Institute.
[0017]
The object of use of the antibacterial agent according to the present invention is a food or beverage material or a pharmaceutical material containing one or more specific useful bacteria. Such specific useful bacteria include Lactobacillus casei or Bifidobacterium breve, and in particular, Lactobacillus casei YIT9029, Lactobacillus casei YIT9018, and Bifidobacterium Yb40 from the Bifidobacterium ITbrev. In particular, it has been confirmed that the antibacterial agent according to the present invention hardly shows an inhibitory action, but rather shows a growth promoting action against Bifidobacterium breve YIT4065.
[0018]
Therefore, by adding an antibacterial agent mainly composed of adrenomedullin (Adrenomedullin) or proadrenomedullin peptide (PAMP) to food and beverage materials and pharmaceutical materials containing these Lactobacillus casei or Bifidobacterium breve, it is contained in food and beverage materials and pharmaceutical materials. The growth of bacteria other than useful bacteria is inhibited. In particular, Bifidobacterium breve YIT4065 can be used as an antibacterial agent that can also grow.
[0019]
Examples of the useful bacterium-containing food / beverage material in the present invention include a food / beverage material containing the useful bacteria as a culture. Examples thereof include fermented milk such as plain type, flavored type, fruit type, sweet type, soft type, drink type, solid (hard) type, frozen type, lactic acid bacteria beverage, cheese, fermented soy milk, kimchi and the like.
[0020]
In addition, examples of the useful bacterium-containing pharmaceutical raw material include a pharmaceutical raw material containing the useful bacterium as a living cell. For example, the useful bacteria are contained as viable cells (dry cells, etc.) and processed appropriately with other pharmaceutically acceptable formulations as described later, for example, filled into capsules or made into tablets or granules. Things.
[0021]
The present invention also relates to the use of adrenomedullin or proadrenomedullin peptide as an active ingredient for preventing or treating inflammatory bowel disease, that is, adrenomedullin or pAMP. For prevention of inflammatory bowel disease (including prevention of recurrence), antibacterial activity is demonstrated in Bacteroides bulgartas (Non-patent Document 3), which is presumed to be associated with this disease, and antibacterial activity in other specific useful bacteria. This is because administration of a substance not shown is considered effective, and it was found that the adrenomedullin and proadrenomedullin of the present invention correspond to such a substance. Adrenomedullin and proadrenomedullin peptide used as a prophylactic / therapeutic agent for inflammatory bowel disease are not particularly limited, and those obtained by the same method described above can be used.
[0022]
As other pharmaceutically acceptable preparations, specifically, as dosage forms, solid preparations such as capsules, granules, tablets, coated tablets, powders, or liquid preparations such as syrups, liquids for internal use, elixirs, etc. Oral preparations for oral administration and parenteral preparations such as injections and rectal administrations can be used, and injections and rectal administrations are preferred.
[0023]
When manufacturing each preparation (pharmaceutical composition), for example, for oral preparations, excipients, binders, disintegrants, lubricants, coloring agents, flavoring agents, flavoring agents, etc. were added as necessary. Then, it can be processed and manufactured into the above-mentioned dosage form by a conventional method. As such additives, those commonly used in the art can be used. Examples of excipients include lactose, sucrose, sodium chloride, glucose, starch, crystalline cellulose, microcrystalline cellulose, Calcium carbonate, kaolin, calcium lactate, magnesium metasilicate aluminate, anhydrous silicic acid, etc., as binder or disintegrant, water, ethanol, propanol, simple syrup, glucose solution, starch solution, gelatin solution, hydroxypropyl starch, Calcium phosphate, hydroxypropylcellulose, polyvinylpyrrolidone, carboxymethylcellulose, carboxymethylcellulose calcium, dry starch, sodium alginate, agar powder, sodium bicarbonate, calcium carbonate, sodium lauryl sulfate, stearic acid Noglycerides, lactose, sucrose, etc., lubricants include stearates such as magnesium stearate, purified talc, boric acid, polyethylene glycol, etc., and flavoring agents include sucrose, orange peel, citric acid, tartaric acid, etc. It can be illustrated.
[0024]
Moreover, when preparing an oral liquid preparation, various preparations can be prepared by a conventional method by adding a corrigent, a buffer, a stabilizer and the like. Examples of the buffer include sodium citrate and the like, and examples of the stabilizer include tragacanth, gum arabic, and gelatin. Others are the same as above.
[0025]
When adrenomedullin or proadrenomedullin peptide is used as a raw material for useful bacteria-containing foods or pharmaceuticals, the amount added is not particularly limited. The dosage is preferably 1 to 5 mg / day / person.
[0026]
【Example】
1. Experimental Method The test bacteria used in this example are as shown in Table 1 below. Regarding the medium used, 1) TS liquid medium (BBL) / TS agar medium (Nissui), 2) TS liquid medium (BBL) / GAM (BBL) + 1% Glu, 1% Lac agar medium, 3) GAM ( BBL) + 1% Glu, 1% Lac liquid medium / GAM (BBL) + 1% Glu, 1% Lac agar medium, anaerobically prepared and cultured.
[0027]
2. Measurement of Antibacterial Activity Regarding the peptides used, Adrenomedullin, Adrenomedullin peptide (PAMP), β-defensin (β-Defensin-2), and α-defensin (α-Defensin-1) are all peptide laboratories ( Purchased from Osaka).
[0028]
[Table 1]
[0029]
3. Method for Measuring Antibacterial Activity Each bacterium was cultured in the above liquid medium overnight, then planted in a new medium and cultured until the logarithmic growth phase. Dilute with 10 mM phosphate buffer (+ 0.09% NaCl + 5 mM glucose, pH 7.2) to about 10 5 bacteria / ml, collect 200 μl in an Eppendorf tube (round bottom), and add various peptides It was mixed with water (50 μl) containing (0.1 μM to 2 μM) and reacted at 37 ° C. for 3 hours with gentle stirring. The whole container was ice-cooled and diluted with PBS or a diluent prepared anaerobically. Thereafter, each bacterium was seeded on the agar medium to obtain CFU. Incubation and culture with anaerobic bacteria peptides were carried out in an anaerobically adjusted glove box.
[0030]
4). Result 4.1. Examination of antibacterial activity measurement conditions 1) Comparison between logarithmic growth phase and stationary phase E. The antibacterial activity of β-Defensin was measured using E. coli (YIT6044). FIG. 1 shows E. coli in stationary phase and logarithmic growth phase. FIG. 2 is a graph showing the effect of various concentrations of β-defensin on the survival rate of E. coli (YIT6044), where a is a diagram showing results in the stationary phase, and b is a diagram showing results in the logarithmic growth phase. It is. Two bacterial suspensions prepared from the two growth phases were subjected to shaking culture at 37 ° C. for 3 hours in PBS with the antimicrobial peptide. Antibacterial activity was assessed by measuring CFU before and after 3 hours incubation with peptide. In the figure, the bar graph indicates CFU, and the line graph indicates the suppression rate. In addition, also in the figure mentioned later, a bar graph shows CFU and a line graph shows a suppression rate similarly.
[0031]
As shown in the figure, no inhibitory activity was observed in the stationary phase at a peptide concentration of 1 μM as compared to no peptide addition. On the other hand, when a logarithmic growth phase bacterium was used, about 60% inhibition was observed at 1 μM.
[0032]
2) Examination of buffer solution for antibacterial activity measurement The concentration of NaCl in the buffer solution (10 mM Phosphate-buffer) was examined using bacteria in the logarithmic growth phase. FIG. 2 shows E. coli with β-defensin. It is the graph which showed the influence of NaCl density | concentration by survival rate suppression of E. coli YIT6044, a figure shows NaCl 0.9%, b figure shows NaCl 0.09%. In the figure, the bar graph indicates CFU, and the line graph indicates the suppression rate.
[0033]
As shown in FIG. The antibacterial activity of β-Defensin2 against E. coli was remarkably suppressed at a NaCl concentration of 0.9%, and hardly affected at 0.09% or less.
[0034]
FIG. It is the graph which showed the influence of NaCl density | concentration by survival rate suppression of vulgatas YIT6159, a figure shows NaCl 0%, b figure shows NaCl 0.09%. As shown in FIG. In vulgatus, the decrease in the number of bacteria during the reaction time of 3 hours was remarkable when NaCl was not added even in the absence of the antibacterial peptide, and the decrease in the number of bacteria could be suppressed at 0.09% NaCl. From the above results, 0.09% NaCl was adopted.
[0035]
FIG. 4 shows E. coli with β-defensin. It is the graph which showed the influence of glucose in survival rate suppression (0.09% NaCl) of E. coli YIT6044. As shown in the figure, the addition of glucose had little effect on the antibacterial activity.
[0036]
4.2.4 Antibacterial Activity of Four Kinds of Peptides 1) resident intestinal bacterial species FIG. It is the graph which showed the influence with respect to the survival rate of E. coli. Other experimental conditions are as shown in FIG. As shown in the figure, significant inhibition was observed for each of the four types of peptides.
[0037]
FIG. 6 shows L.P. It is the graph which showed the influence with respect to the survival rate of reuteri. Other experimental conditions are as shown in FIG. As shown in the figure, significant inhibition was observed for each of the four types of peptides.
[0038]
FIG. 7 shows a case in which Snap. It is the graph which showed the influence with respect to the survival rate of aureus. Other experimental conditions are as shown in FIG. As shown in the figure, among the four types of peptides, significant inhibition was observed for proadrenomedullin peptide, α-defensin, and β-defensin.
[0039]
FIG. 8 shows Cl. It is the graph which showed the influence with respect to the survival rate of coccoides. Other experimental conditions are as shown in FIG. As shown in the figure, significant inhibition was observed for each of the two types of peptides.
[0040]
FIG. 9 shows Co. It is the graph which showed the influence with respect to the survival rate of aerofaciens. Other experimental conditions are as shown in FIG. As shown in the figure, significant inhibition was observed for each of the four types of peptides.
[0041]
FIG. 10 shows Bact. It is the graph which showed the influence with respect to the survival rate of vulgatus. Other experimental conditions are as shown in FIG. As shown in the figure, significant inhibition was observed for the proadrenomedullin peptide among the two types of peptides.
[0042]
2) Probiotics FIG. 11 shows L. It is the graph which showed the influence with respect to the survival rate of casei YIT9029. Other experimental conditions are as shown in FIG. As shown in the figure, among the three types of peptides, significant inhibition was observed for α-defensin and β-defensin.
[0043]
FIG. 12 shows B. by three types of peptides. It is the graph which showed the influence with respect to the survival rate of breve YIT4065. Other experimental conditions are as shown in FIG. As shown in the figure, among the three types of peptides, significant promotion of survival rate was observed for adrenomedullin and proadrenomedullin peptide.
[0044]
A summary of the results of FIGS. 5 to 12 is shown in Table 2 below. In the table, -1 to -3 and +1 to +3 indicate the degree of survival rate suppression and promotion. ± indicates no effect.
[0045]
As described above, a bacterial species having a high occupation ratio among human enteric bacteria was selected, and the antibacterial activity of each peptide was measured. For adrenomedullin and proadrenomedullin peptide, most microorganisms showed inhibitory activity at a peptide concentration of 1-2 μM, although there was a difference in degree. casei YIT9029 and B.I. With respect to breve YIT4065, almost no inhibitory activity was observed. In particular, B.I. Breve YIT4065 showed not an inhibitory activity but a survival rate promoting activity. Involvement of resident enteric bacteria has been recognized in the onset and exacerbation of inflammatory bowel disease, and administration of antibiotics has a certain effect. Therefore, it is considered effective to administer this substance that exhibits antibacterial activity against various resident intestinal bacteria and does not exhibit antibacterial activity against useful lactic acid bacteria and bifidobacteria.
[0046]
[Table 2]
[0047]
【The invention's effect】
As described above, the present invention does not exhibit an antibacterial action for a specific useful bacterium such as a probiotic bacterium, and an antibacterial agent and an inflammatory substance which show an antibacterial action for many bacteria including a pathogenic bacterium. There is an effect that a prophylactic / therapeutic agent for bowel disease can be obtained.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows E. coli in stationary phase and logarithmic growth phase. FIG. 2 is a graph showing the effect of various concentrations of β-defensin on the survival rate of E. coli (YIT6044), where a is a diagram showing results in the stationary phase, and b is a diagram showing results in the logarithmic growth phase. It is.
FIG. 2 shows E. coli induced by β-defensin. It is the graph which showed the influence of NaCl density | concentration by viability suppression of E. coli YIT6044, a figure shows NaCl 0.9%, b figure shows NaCl 0.09%.
FIG. It is the graph which showed the influence of NaCl density | concentration by survival rate suppression of vulgatas YIT6159, a figure shows NaCl 0%, b figure shows NaCl 0.09%.
FIG. 4 shows E. coli induced by β-defensin. It is the graph which showed the influence of glucose in survival rate suppression (0.09% NaCl) of E. coli YIT6044.
FIG. 5 shows E. coli with four types of peptides. It is the graph which showed the influence with respect to the survival rate of E. coli.
FIG. 6 shows L. It is the graph which showed the influence with respect to the survival rate of reuteri.
FIG. 7 shows a case in which Snap. It is the graph which showed the influence with respect to the survival rate of aureus.
FIG. 8 shows Cl. It is the graph which showed the influence with respect to the survival rate of coccoides.
FIG. 9 shows Co. It is the graph which showed the influence with respect to the survival rate of aerofaciens.
FIG. 10 shows Bact. It is the graph which showed the influence with respect to the survival rate of vulgatus.
FIG. 11 shows L. cerevisiae with three peptides It is the graph which showed the influence with respect to the survival rate of casei YIT9029.
FIG. 12 shows B.3 by three types of peptides. It is the graph which showed the influence with respect to the survival rate of breve YIT4065.
