JP2004242564A

JP2004242564A - Vector of bacterium of genus methylophilus

Info

Publication number: JP2004242564A
Application number: JP2003035079A
Authority: JP
Inventors: Kiyoko Hirano; 聖子平野; Hisashi Yasueda; 寿安枝
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2003-02-13
Filing date: 2003-02-13
Publication date: 2004-09-02

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a plasmid plastid vector useful for gene transfer to a bacterium of the genus Methylophilus. <P>SOLUTION: An autonomously replicating sequence functioning by a bacterium of the genus is isolated by transforming the bacterium of the Methylophilus with a ring-shaped DNA containing a chromosome DNA fragment of the bacterium of the genus Methylophilus and a DNA fragment having a marker gene functioning in the cells of the bacterium, selecting a transformant expressing the marker gene from transformants and isolating the ring-shaped DNA from the selected transformant. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はメチロフィラス属細菌の遺伝子組換えに利用するプラスミドベクターに関する。
【０００２】
【従来の技術】
メチロフィラス属細菌は、メタノールを主たる炭素源として生育することができる細菌であって、グラム陰性の桿菌である。同細菌は、胞子形成はなく、絶対好気性であり、そのメタノール資化経路はリブロースモノ燐酸経路により行われる。
【０００３】
メチロフィラス属細菌において利用され、目的遺伝子を組み込むプラスミドベクターとしては、不和合性グループのＩｎｃＱに属するＲＳＦ１０１０由来のもの、例えば、ｐＡＹＣ３０、及びｐＡＹＣ３６や、ＩｎｃＰに属するＲＰ４由来のもの、例えばｐＲＫ３１０などの広宿主域プラスミドベクターと呼ばれるものが用いられてきた（非特許文献１）。更に、最近ではボルデテラ・ブロンキセプティカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）Ｓ８７から発見されたｐＢＢＲ１系のプラスミド、ｐＢＨＲ１などがある（非特許文献２）。
【０００４】
広宿主域プラスミドベクターの一つの問題点は、一般にプラスミドのサイズが大きいことである。例えば、ＲＳＦ１０１０は約８．６８ｋｂであり、ｐＲＫ３１０では約２０．４ｋｂである。一方、エシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）等で汎用的に利用されるプラスミドベクターは、例えばｐＳＴＶ２９では約３ｋｂ、ｐＵＣ１９では約２．７ｋｂと小型であり、遺伝子組換え技術において、これらのベクターは非常に扱いやすい。尚、ｐＢＢＲ１の大きさは約２．７ｋｂと小型であるが、このプラスミドの選択用に、薬剤耐性遺伝子、例えば、カナマイシン耐性遺伝子を搭載したベクターでは約４ｋｂ程度となる。また、本プラスミドは、メチロフィラス属細菌中で自律複製はするものの、メチロフィラス属細菌への導入頻度が低いという問題がある。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｍｅｔｈａｎｅａｎｄｍｅｔｈａｎｏｌｕｔｉｌｉｚｅｒｓ，ＥｄｔｂｙＬ．ＣｏｌｉｎＭｕｒｒｅｌｌａｎｄＨｏｗａｒｄＤａｌｔｏｎ，ＰｌｅｎｕｍＰｔｒｅｓｓ，（１９９２）ｐｐ１８５
【非特許文献２】
ＡｎｔｏｉｎｅＲ．＆ＬｏｃｈｔＣ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６，ｐｐ１７８５−１７９９（１９９２）
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、メタノール資化性菌への遺伝子導入方法の選択肢を広げるために、従来知られている広宿主域プラスミドベクターに代わる、サイズが小さい新規なプラスミドベクターを提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、メチロフィラス・メチロトロファスの染色体ＤＮＡの複製開始点（ｏｒｉＣ^ｍ）のクローニングに成功し、この領域と、薬剤耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片とを連結させることにより、メチロフィラス・メチロトロファスで機能する新規なプラスミドベクターを作製することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
【０００８】
（１）メチロフィラス属細菌の染色体ＤＮＡ断片と、同細菌細胞内で機能するマーカー遺伝子を含むＤＮＡ断片とを含む環状ＤＮＡでメチロフィラス属細菌を形質転換し、形質転換体から前記マーカー遺伝子が発現する形質転換体を選択し、選択された形質転換体から環状ＤＮＡを単離することによって得ることができるメチロフィラス属細菌で機能する自律複製配列を含み、メチロフィラス属細菌で自律複製可能なプラスミドベクター。
（２）配列番号１１の塩基番号１１６９〜２６１２からなる塩基配列又はその一部を有するメチロフィラス属細菌で機能する自律複製配列を含み、メチロフィラス属細菌で自律複製可能なプラスミドベクター。
（３）配列番号１１の塩基番号１１６９〜２６１２からなる塩基配列又はその一部において、１若しくは数個のヌクレオチドの置換、欠失、又は挿入を含む塩基配列を有するメチロフィラス属細菌で機能する自律複製配列を含み、メチロフィラス属細菌で自律複製可能なプラスミドベクター。
（４）配列番号１１の塩基番号１１６９〜２６１２からなる塩基配列の一部が、配列番号１４に示す塩基配列である（２）又は（３）に記載のプラスミドベクター。
（５）メチロフィラス属細菌で機能する薬剤耐性遺伝子を含む（１）〜（４）のいずれかに記載のプラスミドベクター。
（６）前記メチロフィラス属細菌がメチロフィラス・メチロトロファスである（１）〜（５）のいずれかに記載のプラスミドベクター。
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載のプラスミドベクターを保持するメチロフィラス属細菌。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のプラスミドベクターは、メチロフィラス属細菌で自律複製可能なプラスミドベクターである。同プラスミドベクターは、メチロフィラス属細菌で機能する自律複製配列を含む。
【００１０】
前記自律複製配列は、メチロフィラス属細菌の染色体ＤＮＡの複製開始点（ｏｒｉＣ^ｍ）を含むものであり、例えば、メチロフィラス属細菌の染色体ＤＮＡ断片と、同細菌細胞内で機能するマーカー遺伝子を含むＤＮＡ断片とを含む環状ＤＮＡでメチロフィラス属細菌を形質転換し、形質転換体から前記マーカー遺伝子が発現する形質転換体を選択し、選択された形質転換体から環状ＤＮＡを単離することによって得ることができる。
【００１１】
前記自律複製配列の起源は、メチロフィラス属細菌であれば特に限定されないが、例えば、メチロフィラス・メチロトロファスが挙げられる。より具体的には、メチロフィラス・メチロトロファスの野生株ＡＳ１株（ＮＣＩＭＢＮｏ．１０５１５）が挙げられる。同株は、ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア（ＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌａｎｄＭａｒｉｎｅＢａｃｔｅｒｉａ、住所ＮＣＩＭＢＬｔｓ．，ＴｏｒｒｙＲｅｓｅａｒｃｈＳｔａｔｉｏｎ１３５，ＡｂｂｅｙＲｏａｄ，ＡｂｅｒｄｅｅｎＡＢ９８ＤＧ，ＵｎｉｔｅｄＫｉｎｇｄｏｍ）から入手可能である。そしてこの株の一般的な培養方法は、ＮＣＩＭＢのカタログに記載されているが、また実施例に記載したＳＥＩＩ培地でも生育させることができる。
【００１２】
上記のようにして、メチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１株の染色体ＤＮＡから単離された、メチロフィラス属細菌で機能する自律複製配列を含むＤＮＡ断片の塩基配列の一例を、配列番号１１に示す。
【００１３】
本発明の自律複製配列は、後記実施例に示すように、メチロフィラス属細菌のショットガンクローニングによって取得することができる。
本発明の自律複製配列は、メチロフィラス属細菌における自律複製能が維持される限り、配列番号１１に示す塩基配列の一部であってもよい。このような部分配列は、例えば以下のようにして、特定又は取得することができる。まず、配列番号１１に示す塩基配列を含むＤＮＡ断片を用意する。このＤＮＡ断片の末端の一方又は両方を、エキソヌクレアーゼで段階的に切り縮め、メチロフィラス属細菌細胞内で機能するマーカー遺伝子と連結して、環状の組換えＤＮＡを作製する。これらの組換えＤＮＡでメチロフィラス属細菌を形質転換し、マーカー遺伝子が発現する形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、構造を解析する。
【００１４】
また、配列番号１１の塩基配列の一部を有するＤＮＡ断片は、配列番号１１に示す塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号１１の塩基配列に基づいて作製した所望のプライマーを用いたＰＣＲによっても、調製することができる。
【００１５】
配列番号１１の一部を有する自律複製配列としては、配列番号１１の塩基番号１１６９〜２６１２からなる塩基配列、及び、配列番号１４に示す塩基配列（配列番号１１の塩基番号１５３５〜１８５５）が挙げられる。以下、配列番号１１の塩基番号１１６９〜２６１２からなる塩基配列を「ＯｒｉＣ^ｍ」、配列番号１４に示す塩基配列を「ＯｒｉＣ^ｍＳ」と記載することがある。これらの塩基配列を有するＤＮＡ断片は、例えば、メチロフィラス属細菌の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号７及び８、又は配列番号９及び１０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェーン・リアクション）によって各々取得することができる。また、前記塩基配列を有するＤＮＡ断片は、同塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーとするハイブリダイゼーションによって、メチロフィラス属細菌のゲノムライブラリーから単離することもできる。
【００１６】
本発明の自律複製配列は、メチロフィラス属細菌における自律複製能が維持される限り、ＯｒｉＣ^ｍ、又はＯｒｉＣ^ｍＳを、前記と同様にしてさらに短縮したものであってもよい。ＯｒｉＣ^ｍ、又はＯｒｉＣ^ｍＳを含むプラスミドＤＮＡの適当な位置に制限酵素部位を持たせておき、ＯｒｉＣ^ｍ、又はＯｒｉＣ^ｍＳの外側でプラスミドＤＮＡを切断すると、エキソヌクレアーゼによる反応と、再環状化を容易に行うことができる。
【００１７】
また、本発明のプラスミドベクターが持つ自律複製配列は、メチロフィラス属細菌における自律複製能が損なわれない限り、ＯｒｉＣ^ｍ又はその一部において、１若しくは数個のヌクレオチドの置換、欠失、又は挿入を含む塩基配列を有していてもよい。前記「数個」とは、自律複製配列の位置やヌクレオチドの種類によっても異なるが、具体的には、ＯｒｉＣ^ｍのうち、ＯｒｉＣ^ｍＳ以外の部分においては２〜１１００個、好ましくは、２〜８００個、より好ましくは２〜３００個である。また、ＯｒｉＣ^ｍＳにおいては、２〜２０個、好ましくは、２〜１０個、より好ましくは２〜４個である。
【００１８】
また、上記のような、ＯｒｉＣ^ｍ又はその一部と実質的に同一の塩基配列を有する自律複製配列として具体的には、ＯｒｉＣ^ｍ又はその一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列が挙げられる。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。ＯｒｉＣ^ｍの一部が３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが挙げられる。
【００１９】
上記のような、ＯｒｉＣ^ｍ又はその一部と実質的に同一の塩基配列を有する自律複製配列は、例えば、部位特異的変異法によって、特定の部位のヌクレオチドにおいて置換、欠失、又は挿入を含むようにＯｒｉＣ^ｍ又はその一部を改変することによって取得することができる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、ＯｒｉＣ^ｍ又はその一部を含むＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、および同ＤＮＡを保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくはＥＭＳ等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
【００２０】
上記のような変異を有するＤＮＡが自律複製能を有するか否かは、メチロフィラス属細菌細胞内で機能するマーカー遺伝子と連結して、環状の組換えＤＮＡを作製し、得られた組換えＤＮＡでメチロフィラス属細菌を形質転換し、形質転換体でマーカー遺伝子の発現を検出することによって、調べることができる。
【００２１】
また、上記のようなヌクレオチドの置換、欠失、又は挿入には、メチロフィラス属細菌の菌株による違いなどの天然に生じる変異（ｍｕｔａｎｔ又はｖａｒｉａｎｔ）も含まれる。
【００２２】
本発明のプラスミドベクターは、自律複製配列の他に、マーカー遺伝子を含むことが好ましい。マーカー遺伝子としては、薬剤耐性を宿主に付与できる遺伝子が好ましい。このような薬剤耐性遺伝子としては、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子などが挙げられる。
【００２３】
本発明のプラスミドベクター中には、外部からのＤＮＡ断片を搭載しやすいように、一または複数の制限酵素切断認識部位を組み入れておくことが望ましい。そのような部位としては、例えば、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＳａｌＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｈＩ、ＨｉｎｄＩＩＩなどが挙げられる。制限酵素切断認識部位は、マルチクローニング部位であってもよい。
【００２４】
また、本発明のプラスミドベクターは、さらに、他の細菌、例えばエシェリヒア・コリで機能する自律複製配列を含むシャトルベクターであっても適わない。このようなシャトルベクターは、例えば、本発明のメチロフィラス属細菌の自律複製配列を含むＤＮＡ断片と、エシェリヒア・コリのプラスミドベクター又はその一部とを連結することによって構築することができる。エシェリヒア・コリのプラスミドベクターとしては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＨＳＧ３９６、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＴＳＶ２９、ｐＳＣ１０１、ｐＭＷ２１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳなどが挙げられる。
【００２５】
上記のようなシャトルベクターとして、後記実施例に示すｐＯｒｉＣ^ｍＳ−２が挙げられる。同プラスミドは、カナマイシン耐性遺伝子と、クローニング部位としてＸｂａＩ部位を有している。
【００２６】
本発明のＤＮＡのクローニングに用いるゲノムＤＮＡライブラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断および連結、形質転換等の方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＴｈｉｒｄＥｄｉｔｉｏｎ（２００１）に記載されている。
【００２７】
本発明のプラスミドベクターは、メチロフィラス属細菌に所望の遺伝子を導入するのに用いることができる。すなわち、本発明のプラスミドベクターに目的遺伝子を挿入し、得られた組換えプラスミドでメチロフィラス属細菌を形質転換する。前記遺伝子としては、メチロフィラス属細菌内で発現し得る遺伝子であれば特に制限はないが、炭水化物、脂質、タンパク質、ビタミン、色素、アミノ酸、核酸等の有用物質生成に関わる酵素遺伝子、生体内代謝調節に関与する遺伝子、これらの遺伝子を人為的に改良した遺伝子等が挙げられる。
【００２８】
例えば、Ｌ−リジンの生合成に重要なジヒドロジピコリン酸合成酵素の変異型酵素遺伝子をメチロフィラス・メチロトロファスに導入することにより、Ｌ−リジン生産能が付与される（ＷＯ００／６１７２３参照）。従って、例えば、エシェリヒア・コリのジヒドロジピコリン酸合成酵素の変異体であって、Ｌ−リジンによる酵素活性への阻害が低減した酵素をコードするｄａｐＡ２４遺伝子を、本発明のプラスミドベクターに搭載することも可能である。具体的には、変異型酵素をコードする遺伝子ｄａｐＡ２４が搭載されたプラスミドｐＲＳ−ｄａｐＡ２４（ＷＯ００／６１７２３参照）を制限酵素ＸｂａＩで切断し、ｄａｐＡ２４遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得する。次に、下記実施例で示すプラスミドベクターｐＯｒｉＣ^ｍＳ−２を同じく制限酵素ＸｂａＩで切断し、この部位にｄａｐＡ２４遺伝子を含むＤＮＡ断片をＤＮＡリガーゼにより連結することにより、本プラスミドベクターにｄａｐＡ２４遺伝子を搭載できる。これをメチロフィラス・メチロトロファス株に導入することよって、この株にＬ−リジン生産能を付与又は増強することが可能である。
【００２９】
また、本発明のプラスミドベクターは、メチルフィラス属細菌の染色体上の遺伝子と外来遺伝子との遺伝子置換、又は染色体上の遺伝子の破壊にも用いることができる。
【００３０】
メチロフィラス属細菌に、本発明のプラスミドベクター又はその誘導体を導入して形質転換する方法としては、エレクトロポレーションが挙げられる（Ｃ．Ｇ．Ｇｌｉｅｓｃｈｅ，Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４３，ｐｐ１９７−２０１（１９９７））。また、このプラスミドに接合伝達に必要なＤＮＡ領域（ｍｏｂ領域など）を通常の方法により組み入れることにより、接合伝達によるプラスミド導入も可能となる。
【００３１】
通常、メチロフィラス属細菌の形質転換株は、導入したプラスミド上に存在する薬剤耐性遺伝子の発現による、薬剤耐性をマーカーとして選抜する。例えば、カナマイシン耐性の遺伝子が搭載されたベクターをエレクトロポレーションにより導入した場合は、その菌株を含む溶液をカナマイシン（２０μｇ／ｍＬ）を含むＳＥＩＩ寒天培地（実施例１参照）上に塗布し、３７℃にて２〜４日間培養することで、目的のプラスミドベクターを保持した形質転換体を得ることができる。
【００３２】
上記方法により形質転換して得られるメチロフィラス属細菌は、通気攪拌もしくは振とう等の好気的条件下で、２０〜４３℃、好ましくは３４〜３８℃の温度でｐＨを５〜８に制御して培養し、導入した遺伝子を発現させることができる。使用される培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機微量栄養源を含有する通常の培地である。
【００３３】
主要炭素源は、メタノールであるが、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース、でんぷん加水分解物などの糖類、グリセロール、ソルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸、ピルビン酸等の有機酸類を併用して用いることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素源、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。無機イオンとしては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。これらの他に、有機微量栄養源として、ビタミンＢ_１、または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい場合もある。培養開始時の炭素源濃度は、好ましくは０．０１〜５容量％、より好ましくは、０．１〜２容量％である。また培養期間は通常２〜９０時間とすることができ、好適には２４〜４８時間である。
【００３４】
【実施例】
以下、実施例により、本発明を更に具体的に説明する。
【００３５】
【実施例１】メチロフィラス・メチロトロファスのｏｒｉＣ（ｏｒｉＣ^ｍ）を含むプラスミドの作製
メチロフィラス・メチロトロファス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ）ＡＳ１（ＮＣＩＭＢＮｏ．１０５１５）をＳＥＩＩ培地（（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４５ｇ／Ｌ，Ｋ_２ＨＰＯ_４１．９ｇ／Ｌ，ＮａＨ_２ＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ１．５６ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ２００ｍｇ／Ｌ，ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ７２ｍｇ／Ｌ，ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ５ μｇ／Ｌ，ＭｎＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ２５ μｇ／Ｌ，ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ２３ μｇ／Ｌ，ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ９．７ｍｇ／Ｌ，メタノール０．５％（ｖ／ｖ））、３７℃で一晩培養し、ＥｄｇｅＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社製ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡＰｕｒｉｆ．Ｋｉｔ（ＣａｔＮｏ．８５１７１）を用いて染色体ＤＮＡを調製した。これをＳａｕ３ＡＩ（宝酒造社製）で部分分解した。この反応溶液を、０．７％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供して、ＤＮＡサイズとして２〜３ｋｂｐ（キロ塩基対）の大きさのＤＮＡ断片領域をゲルから回収し精製した。ＤＮＡ断片の精製には、ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製Ｃｏｎｃｅｒｔ^ＴＭＲａｐｉｄＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍを利用し、添付のマニュアルに従って実施した。
【００３６】
一方、ｐＨＳＧ２９８（宝酒造社製）は制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化後、アルカリフォスファターゼ処理（宝酒造社製、Ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ｃａｌｆｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）を使用）を行い、上述で作製したＳａｕ３ＡＩで部分分解後の染色体ＤＮＡと連結した（宝酒造社製、ＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔｖｅｒ．２を使用）。このライゲーション溶液で市販のコンピテントセルＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ寒天培地（ポリペプトン１０ｇ／Ｌ，酵母エキス５ｇ／Ｌｌ，ＮａＣｌ１０ｇ／Ｌ，寒天１５ｇ／Ｌ，カナマイシン５０μｇ／ｍｌ含む）で選択することで、約４５００個の形質転換体を取得した。
【００３７】
次に、これらの形質転換体をまとめてＬＢ液体培地（カナマイシン５０μｇ／ｍｌ含む）で培養し、この培養液からプラスミドＤＮＡを常法（アルカリ法）で抽出し、このプラスミドＤＮＡでメチロフィラス・メチロトロファスをエレクトロポレーション法により形質転換した。エレクトロポレーションは、ＢｉｏＲａｄ社製ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒを使用し、１．８ｋＶ／ｃｍで行った。
【００３８】
形質転換体をＳＥＩＩ寒天培地（寒天１．５％、カナマイシン２０μｇ／ｍｌ含む）で３７℃、約４８時間培養後、約２００個のカナマイシン耐性コロニーが出現した。この中から無作為に６０個のコロニーを選択し、それらをまとめてＳＥＩＩ液体培地で、上記と同様に培養後、この培養液から常法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。
【００３９】
このＤＮＡ溶液でＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９株を形質転換し、ＬＢ寒天培地（カナマイシン５０μｇ／ｍｌ）上でカナマイシン耐性を示すコロニーを多数取得した。この耐性株から無作為に１０株選択し、各々からプラスミドＤＮＡを抽出し、電気泳動によりその大きさを確認したところ、各々のプラスミドＤＮＡはほぼ同一の大きさであり、ｐＨＳＧ２９８に挿入されたＤＮＡ断片の大きさは、約２．７ｋｂと推定できた。次に制限酵素でこれらプラスミドを分解し、その分解パターンの比較を行ったところ、取得した１０株が保持していたプラスミドは全て同一構造のものであることが判明した。なお、ここで取得したプラスミドはｐＯｒｉＣ^ｍＬと命名した。
【００４０】
【実施例２】ｏｒｉＣ^ｍ領域の限定と小型ｏｒｉＣ^ｍプラスミドの作製
実施例１に記載したプラスミドｐＯｒｉＣ^ｍＬの挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。塩基配列は、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、３１０ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（ＡＢ社製）により解析を行った。結果を配列番号１１に示す。塩基配列決定に用いたプライマーの配列を、配列番号１〜６に記載した。
【００４１】
その結果、この挿入ＤＮＡ断片には、いくつかのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在することがわかった。それらのうち２つを、配列番号１１に示してある。第１のＯＲＦは、ｄｎａＡ様遺伝子の後半領域に、第２のＯＲＦはｄｎａＮ様遺伝子の前半領域に、各々類似している（図１）。また、配列表には示されていないが、配列番号１１の塩基配列において、５’末端から、４０１番目の塩基までにも、ＯＲＦが存在している。
【００４２】
次に、最初に単離した上記の約２．７ｋｂ長のＤＮＡ領域にある、ｄｎａＡ様遺伝子からｄｎａＮ様遺伝子までの約１．４４ｋｂ長のＤＮＡ領域のみで、自律複製活性があるか否かの検討を行った。
【００４３】
まず、メチロフィラス・メチロトロファスの染色体ＤＮＡを鋳型にし、配列番号７、８に記載したプライマー（５’末端側にＳａｌＩサイトを連結）を用いたＰＣＲにより、目的ＤＮＡ断片（配列番号１１の塩基番号１１６９〜２６１２）の増幅を行った。増幅反応は、宝酒造社製ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、＜変性工程＞９８℃で１０秒間、＜アニーリング工程＞６０℃で３０秒間、＜ＤＮＡ鎖の伸長反応工程＞７２℃で９０秒間、の反応を２５サイクル実施した。ここで増幅された１４４２ｂｐのＤＮＡ断片をＳａｌＩ（宝酒造）で分解し、同じくＳａｌＩ（宝酒造）分解後、脱リン酸化処理を行ったベクターｐＨＳＧ２９８と連結した（宝酒造社製、ＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔｖｅｒ．２を使用）。そしてベクターに搭載されているｌａｃプロモーターに対して各方向に挿入された２種類のプラスミドを取得した。これらのプラスミドでメチロフィラス・メチロトロファスを形質転換したところ、両タイプのプラスミドからカナマイシン耐性を示す株を取得出来、このＤＮＡ領域に自律複製活性が存在していることが判明した。これら両プラスミドを、各々ｐＯｒｉＣ^ｍ−１（ｄｎａＡ様遺伝子の方向が、ベクターのｌａｃプロモーターと同じ向きのプラスミド）、ｐＯｒｉＣ^ｍ−２（ｄｎａＡ様遺伝子の方向が、ベクターのｌａｃプロモーターと逆向きのもの）と命名した。
【００４４】
更に、自律複製活性を有する領域を特定するために、ｄｎａＡ様遺伝子とｄｎａＮ様遺伝子の間のＤＮＡ領域における自律複製活性の有無を調べることとした。まず、メチロフィラス・メチロトロファスの染色体ＤＮＡを鋳型にし、配列番号９、１０に記載したプライマー（５’末端側にＳａｌＩサイトを連結）を用いたＰＣＲにより、目的ＤＮＡ断片（ＤｎａＡ様タンパク質のＣ末側１０アミノ酸残基とＤｎａＮ様タンパク質のＮ末側１０アミノ酸残基を含む領域をコードするＤＮＡとその両者間のＤＮＡ部分：配列番号１１の塩基番号１５３５〜１８５５）の増幅を行った。増幅反応は、宝酒造社製ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、＜変性工程＞９８℃で１０秒間、＜アニーリング工程＞６０℃で３０秒間、＜ＤＮＡ鎖伸長工程＞７２℃で１分間の一連反応を２５サイクル実施した。
【００４５】
ここで増幅された３２１ｂｐのＤＮＡ断片をＳａｌＩ（宝酒造）で分解し、同じくＳａｌＩ（宝酒造）分解後、脱リン酸化処理を行ったベクターｐＨＳＧ２９８と連結した（宝酒造社製、ＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔｖｅｒ．２を使用）。その結果、ベクターに搭載されているｌａｃプロモーターに対してｄｎａＡ様遺伝子の向きが逆向きに挿入されたプラスミドのみが、多数取得された。
【００４６】
これらのプラスミドでメチロフィラス・メチロトロファスを形質転換したところ、カナマイシン耐性を示す株を多数取得出来、このＤＮＡ領域に自律複製活性が存在しており、また形質転換頻度も高いことが判明した。なお、導入プラスミドとして、ｐＢＨＲ１（ｐＢＢＲ１からの誘導体）を用い、同様な条件にて形質転換したところ、形質転換体の出現頻度は、上で取得されたプラスミドの場合と比べ、数十分の一であった。上記のようにして得られたプラスミドをｐＯｒｉＣ^ｍＳ−２（ｄｎａＡ様遺伝子の向きが、ｌａｃプロモーターと逆向きになっている）と命名した。こうして特定された自律複製能のあるＤＮＡ断片（３２１ｂｐ領域）の塩基配列を、配列番号１４に示した。
【００４７】
なお、前記ｐＯｒｉＣ^ｍＳ−２を保持するメチロフィラス・メチロトロファス株を、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＳＥＩＩ液体培地で、３７℃、２４時間培養後、その菌体から、上記と同様に常法によりプラスミドを調製し、０．７％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供した後、エチジュームブロマイド染色したところ、明瞭なプラスミドＤＮＡのバンドが観察され、メチロフィラス・メチロトロファス内で、複数のコピー数を維持するプラスミドとして機能することがわかった。
【００４８】
【発明の効果】
本発明により、メチロフィラス属細菌においてプラスミドとして機能する新規なベクターが提供される。同ベクターは、メチロフィラス属細菌の育種等に有用である。
【００４９】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の自律複製配列の構造を示す図。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a plasmid vector used for genetic recombination of a bacterium belonging to the genus Methylophilus.
[0002]
[Prior art]
Methylophilus bacteria are bacteria that can grow using methanol as a main carbon source, and are Gram-negative rods. The bacterium has no sporulation and is aerobic, and its methanol assimilation pathway is performed by the ribulose monophosphate pathway.
[0003]
Plasmid vectors used in bacteria of the genus Methylophilus and incorporating the target gene include those derived from RSF1010 belonging to the incompatible group IncQ, such as pAYC30 and pAYC36, and those derived from RP4 belonging to IncP such as pRK310. A so-called host range plasmid vector has been used (Non-Patent Document 1). Furthermore, there is a pBBR1-based plasmid, pBHR1, and the like recently discovered from Bordetella bronchiseptica S87 (Non-patent Document 2).
[0004]
One problem with broad host range plasmid vectors is that they are generally large in size. For example, RSF1010 is about 8.68 kb and pRK310 is about 20.4 kb. On the other hand, plasmid vectors generally used in Escherichia coli (E. coli) and the like are small, for example, about 3 kb for pSTV29 and about 2.7 kb for pUC19. Easy to handle. Although the size of pBBR1 is as small as about 2.7 kb, it is about 4 kb for a vector carrying a drug resistance gene, for example, a kanamycin resistance gene, for selecting this plasmid. In addition, although the present plasmid autonomously replicates in a Methylophilus bacterium, there is a problem that the frequency of introduction into a Methylophilus bacterium is low.
[0005]
[Non-patent document 1]
Methane and methanol utilizers, Edt by L.M. Colin Murrell and Howard Dalton, Plenum Pressure, (1992) pp 185.
[Non-patent document 2]
Antoine R. & Locht C.E. , Mol. Microbiol. , 6, pp1785-1799 (1992).
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a novel plasmid vector having a small size in place of a conventionally known broad host range plasmid vector in order to expand the options of a method for introducing a gene into a methanol-assimilating bacterium.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems, and as a result, the replication origin (oriC) of the chromosomal DNA of Methylophilus methylotrophus. ^m ) Was successfully cloned, and by linking this region with a DNA fragment containing a drug resistance gene, a novel plasmid vector that functions in Methylophilus methylotrophus was successfully produced, thereby completing the present invention. Was.
That is, the gist of the present invention is as follows.
[0008]
(1) Transformation of a Methylophilus bacterium with a cyclic DNA containing a chromosomal DNA fragment of a Methylophilus bacterium and a DNA fragment containing a marker gene that functions in the bacterium, and a trait in which the marker gene is expressed from a transformant A plasmid vector containing an autonomously replicating sequence that functions in a bacterium belonging to the genus Methylophilus and can be autonomously replicated in a bacterium belonging to the genus Methylophilus, which can be obtained by selecting a transformant and isolating a circular DNA from the selected transformant.
(2) A plasmid vector comprising a base sequence consisting of base numbers 1169 to 2612 of SEQ ID NO: 11 or an autonomously replicating sequence that functions in a bacterium belonging to the genus Methylophilus and is autonomously replicable in a bacterium belonging to the genus Methylophilus.
(3) Autonomous replication functioning in a bacterium belonging to the genus Methylophilus having a nucleotide sequence comprising substitution or deletion or insertion of one or several nucleotides in the nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 1169 to 2612 of SEQ ID NO: 11 or a part thereof A plasmid vector containing a sequence and capable of autonomous replication in a Methylophilus bacterium.
(4) The plasmid vector according to (2) or (3), wherein a part of the nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 1169 to 2612 of SEQ ID NO: 11 is the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 14.
(5) The plasmid vector according to any one of (1) to (4), which comprises a drug resistance gene that functions in a Methylophilus bacterium.
(6) The plasmid vector according to any one of (1) to (5), wherein the Methylophilus bacterium is Methylophilus methylotrophus.
(7) A bacterium belonging to the genus Methylophilus, which carries the plasmid vector according to any one of (1) to (6).
[0009]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The plasmid vector of the present invention is a plasmid vector capable of autonomous replication in a Methylophilus bacterium. The plasmid vector contains an autonomously replicating sequence that functions in a Methylophilus bacterium.
[0010]
The autonomously replicating sequence is a replication origin (oriC) of chromosomal DNA of a bacterium belonging to the genus Methylophilus. ^m ), For example, by transforming a bacterium belonging to the genus Methylophilus with a circular DNA containing a chromosomal DNA fragment of the bacterium belonging to the genus Methylophilus and a DNA fragment containing a marker gene that functions in the bacterial cell; It can be obtained by selecting a transformant expressing the marker gene and isolating a circular DNA from the selected transformant.
[0011]
The origin of the autonomously replicating sequence is not particularly limited as long as it is a bacterium belonging to the genus Methylophilus, and includes, for example, Methylophilus methylotrophus. More specifically, a wild-type strain AS1 of Methylophilus methylotrophus (NCIMB No. 10515) can be mentioned. The strain is available from the National Collection of Industrial and Marine Bacteria, located at NCIMB Ltds., Tolly Research Station Station 135, Abbey Road, Canada, available from Abbey Road, Canada. is there. The general culturing method of this strain is described in the catalog of NCIMB, but it can also be grown in the SEII medium described in Examples.
[0012]
An example of the nucleotide sequence of a DNA fragment containing an autonomously replicating sequence that functions in a bacterium belonging to the genus Methylophilus isolated from the chromosomal DNA of Methylophilus methylotrophus AS1 strain as described above is shown in SEQ ID NO: 11.
[0013]
The autonomously replicating sequence of the present invention can be obtained by shotgun cloning of a bacterium belonging to the genus Methylophilus, as described in Examples below.
The autonomously replicating sequence of the present invention may be a part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 11, as long as the autonomous replicating ability in the bacterium belonging to the genus Methylophilus is maintained. Such a partial sequence can be specified or obtained, for example, as follows. First, a DNA fragment containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 is prepared. One or both of the ends of this DNA fragment is stepwise truncated with exonuclease and ligated to a marker gene that functions in Methylophilus bacterial cells to produce a circular recombinant DNA. Methylophilus bacteria are transformed with these recombinant DNAs, a plasmid DNA is isolated from a transformant expressing the marker gene, and its structure is analyzed.
[0014]
In addition, a DNA fragment having a part of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 is obtained by PCR using a DNA fragment containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 as a template and desired primers prepared based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11. Can also be prepared.
[0015]
Examples of the autonomously replicating sequence having a part of SEQ ID NO: 11 include a base sequence consisting of base numbers 1169 to 2612 of SEQ ID NO: 11 and a base sequence shown in SEQ ID NO: 14 (base numbers 1535-1855 of SEQ ID NO: 11). Can be Hereinafter, the base sequence consisting of base numbers 1169 to 2612 of SEQ ID NO: 11 is referred to as “OriC ^m "And the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 14 as" OriC ^m S ". DNA fragments having these nucleotide sequences can be obtained, for example, by PCR using a chromosomal DNA of a bacterium belonging to the genus Methylophilus as a template and primers having oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 7 and 8 or SEQ ID NOs: 9 and 10. Chain reaction). In addition, the DNA fragment having the base sequence can be isolated from a genomic library of a bacterium belonging to the genus Methylophilus by hybridization using an oligonucleotide synthesized based on the base sequence as a primer.
[0016]
The autonomously replicating sequence of the present invention can be used as long as the autonomous replication ability in Methylophilus bacteria is maintained. ^m Or OriC ^m S may be further shortened in the same manner as described above. OriC ^m Or OriC ^m The plasmid DNA containing S has a restriction enzyme site at an appropriate position, and the OriC ^m Or OriC ^m When the plasmid DNA is cut outside of S, the reaction with exonuclease and the recircularization can be easily performed.
[0017]
In addition, the autonomously replicating sequence of the plasmid vector of the present invention may be used as long as the autonomous replicating ability in Methylophilus bacteria is not impaired. ^m Alternatively, a part thereof may have a base sequence containing substitution, deletion, or insertion of one or several nucleotides. The term "several" differs depending on the position of the autonomously replicating sequence and the type of nucleotide. ^m Of which, OriC ^m In the portion other than S, the number is 2 to 1100, preferably 2 to 800, and more preferably 2 to 300. Also, OriC ^m In S, the number is 2 to 20, preferably 2 to 10, and more preferably 2 to 4.
[0018]
Also, as described above, OriC ^m Or an autonomously replicating sequence having a nucleotide sequence substantially identical to a part thereof, specifically OriC ^m Or a base sequence that hybridizes with a part thereof under stringent conditions. "Stringent conditions" refer to conditions under which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed. Although it is difficult to quantify these conditions clearly, as an example, DNAs having high homology, for example, DNAs having a homology of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more Conditions under which DNAs hybridize with each other and DNAs with lower homology do not hybridize with each other. More specifically, at a salt concentration corresponding to 60 ° C., 1 × SSC, 0.1% SDS, preferably 0.1 × SSC, 0.1% SDS, which is a condition for washing in a normal Southern hybridization. Conditions for hybridization are listed. OriC ^m When a DNA fragment having a length of about 300 bp is used, washing conditions for hybridization include 50 ° C., 2 × SSC, and 0.1% SDS.
[0019]
OriC as above ^m Or, an autonomously replicating sequence having a nucleotide sequence substantially identical to a part thereof may be, for example, a site-directed mutagenesis method, which may include a substitution, deletion, or insertion at a nucleotide at a specific site. ^m Alternatively, it can be obtained by modifying a part thereof. The modified DNA as described above can also be obtained by a conventionally known mutation treatment. Mutation treatment includes OriC ^m Or a method of in vitro treating a DNA containing a part thereof with hydroxylamine or the like, and a method of treating a microorganism having the DNA, such as a bacterium belonging to the genus Escherichia, with ultraviolet light or N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) or Examples include a method of treating with a mutagen that is commonly used in mutagenesis such as EMS.
[0020]
Whether or not the DNA having the mutation as described above has autonomous replication ability is determined by linking with a marker gene that functions in a Methylophilus bacterium cell to produce a circular recombinant DNA, and using the obtained recombinant DNA. It can be examined by transforming a Methylophilus bacterium and detecting the expression of a marker gene in the transformant.
[0021]
In addition, the nucleotide substitution, deletion, or insertion as described above also includes a naturally occurring mutation (mutant or variant) such as a difference between strains of a bacterium belonging to the genus Methylophilus.
[0022]
The plasmid vector of the present invention preferably contains a marker gene in addition to the autonomously replicating sequence. As the marker gene, a gene capable of imparting drug resistance to a host is preferable. Examples of such a drug resistance gene include a kanamycin resistance gene, an ampicillin resistance gene, a tetracycline resistance gene, a gentamicin resistance gene, a streptomycin resistance gene, and the like.
[0023]
It is desirable to incorporate one or more restriction enzyme cleavage recognition sites into the plasmid vector of the present invention so that an external DNA fragment can be easily loaded. Examples of such a site include EcoRI, SacI, KpnI, SmaI, BamHI, XbaI, SalI, PstI, SphI, HindIII and the like. The restriction enzyme cleavage recognition site may be a multiple cloning site.
[0024]
Further, the plasmid vector of the present invention is not suitable even if it is a shuttle vector containing an autonomously replicating sequence that functions in another bacterium, for example, Escherichia coli. Such a shuttle vector can be constructed, for example, by ligating a DNA fragment containing an autonomously replicating sequence of the bacterium belonging to the genus Methylophilus with an Escherichia coli plasmid vector or a part thereof. Examples of Escherichia coli plasmid vectors include pBR322, pUC18, pUC19, pHSG396, pACYC177, pTSV29, pSC101, pMW218, pBluescript II KS, and the like.
[0025]
As the shuttle vector as described above, pOriC shown in Examples described later is used. ^m S-2. This plasmid has a kanamycin resistance gene and an XbaI site as a cloning site.
[0026]
Methods for preparing a genomic DNA library for use in cloning the DNA of the present invention, hybridization, PCR, preparation of plasmid DNA, DNA cutting and ligation, transformation, and the like are described in Sambrook, J. Am. Fritsch, E .; F. Maniatis, T .; , Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Third Edition (2001).
[0027]
The plasmid vector of the present invention can be used to introduce a desired gene into a Methylophilus bacterium. That is, a target gene is inserted into the plasmid vector of the present invention, and a bacterium belonging to the genus Methylophilus is transformed with the obtained recombinant plasmid. The gene is not particularly limited as long as it can be expressed in a bacterium belonging to the genus Methylophilus.Enzyme genes involved in the production of useful substances such as carbohydrates, lipids, proteins, vitamins, pigments, amino acids, and nucleic acids, and in vivo metabolic regulation And genes obtained by artificially improving these genes.
[0028]
For example, L-lysine-producing ability is imparted by introducing a mutant enzyme gene of dihydrodipicolinate synthase important for L-lysine biosynthesis into Methylophilus methylotrophus (see WO 00/61723). Thus, for example, the dapA24 gene, which is a mutant of Escherichia coli dihydrodipicolinate synthase and encodes an enzyme with reduced inhibition of enzyme activity by L-lysine, may be mounted on the plasmid vector of the present invention. It is possible. Specifically, the plasmid pRS-dapA24 (see WO 00/61723) carrying the gene dapA24 encoding the mutant enzyme is cleaved with the restriction enzyme XbaI to obtain a DNA fragment containing the dapA24 gene. Next, the plasmid vector pOriC shown in the following Examples ^m S-2 is also cleaved with the restriction enzyme XbaI, and a DNA fragment containing the dapA24 gene is ligated to this site by DNA ligase, whereby the dapA24 gene can be mounted on the plasmid vector. By introducing this into a Methylophilus methylotrophus strain, it is possible to impart or enhance L-lysine-producing ability to this strain.
[0029]
Further, the plasmid vector of the present invention can also be used for gene replacement between a gene on a chromosome of a bacterium belonging to the genus Methylophilus and a foreign gene, or disruption of a gene on a chromosome.
[0030]
Examples of a method for transforming a bacterium belonging to the genus Methylophilus by introducing the plasmid vector of the present invention or a derivative thereof include electroporation (CG Gliesche, Can. J. Microbiol., 43, pp197-201 ( 1997)). In addition, by introducing a DNA region (mob region or the like) necessary for conjugation transfer into this plasmid by a usual method, it becomes possible to introduce the plasmid by conjugation transfer.
[0031]
Usually, a transformed strain of a bacterium belonging to the genus Methylophilus is selected using a drug resistance as a marker by the expression of a drug resistance gene present on the introduced plasmid. For example, when a vector carrying a kanamycin-resistant gene is introduced by electroporation, a solution containing the strain is applied on a SEII agar medium (see Example 1) containing kanamycin (20 μg / mL), and the solution is applied. By culturing at 2 ° C. for 2 to 4 days, a transformant holding the target plasmid vector can be obtained.
[0032]
The Methylophilus bacterium obtained by transformation according to the above method is controlled at a pH of 5 to 8 at a temperature of 20 to 43 ° C, preferably 34 to 38 ° C under aerobic conditions such as aeration and stirring or shaking. And the introduced gene can be expressed. The medium used is a normal medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions and, if necessary, other organic micronutrients.
[0033]
The main carbon source is methanol, but glucose, lactose, galactose, fructose, sugars such as starch hydrolysates, alcohols such as glycerol and sorbitol, fumaric acid, citric acid, succinic acid, and organic acids such as pyruvic acid. They can be used in combination. As the nitrogen source, inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride and ammonium phosphate, organic nitrogen sources such as soybean hydrolysate, ammonia gas, aqueous ammonia and the like can be used. As inorganic ions, potassium phosphate, magnesium sulfate, iron ions, manganese ions and the like are added in small amounts. In addition to these, as an organic micronutrient source, vitamin B ₁ In some cases, it may be desirable to include an appropriate amount of yeast extract or the like. The carbon source concentration at the start of the culture is preferably 0.01 to 5% by volume, and more preferably 0.1 to 2% by volume. The cultivation period can be usually 2 to 90 hours, preferably 24 to 48 hours.
[0034]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
[0035]
Example 1 OriC (oriC) of Methylophilus methylotrophus ^m Preparation of plasmid containing
Methylophilus methylotrophus AS1 (NCIMB No. 10515) was added to SEII medium ((NH ₄ ) ₂ SO ₄ 5g / L, K ₂ HPO ₄ 1.9 g / L, NaH ₂ PO ₄ ・ 2H ₂ O 1.56 g / L, MgSO ₄ ・ 7H ₂ O 200mg / L, CaCl ₂ ・ 2H ₂ O 72mg / L, CuSO ₄ ・ 5H ₂ O 5 μg / L, MnSO ₄ ・ 5H ₂ O 25 μg / L, ZnSO ₄ ・ 7H ₂ O 23 μg / L, FeCl ₃ ・ 6H ₂ O, 9.7 mg / L, methanol 0.5% (v / v)) at 37 ° C. overnight, and the mixture was cultivated at 37 ° C. using a Genomic DNA Purif. Chromosomal DNA was prepared using Kit (Cat No. 85171). This was partially decomposed with Sau3AI (Takara Shuzo). This reaction solution was subjected to 0.7% (w / v) agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment region having a DNA size of 2 to 3 kbp (kilobase pairs) was recovered from the gel and purified. For purification of the DNA fragment, GIBCO BRL's Concert ^TM The measurement was performed using a Rapid Gel Extraction System according to the attached manual.
[0036]
On the other hand, pHSG298 (manufactured by Takara Shuzo) is digested with a restriction enzyme BamHI (manufactured by Takara Shuzo), then treated with alkaline phosphatase (using Alkaline phosphatase (manufactured by Takara Shuzo) using calf intestine), and partially digested with Sau3AI prepared above. (Ligation Kit ver. 2 manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd. was used). A commercially available competent cell E.C. E. coli JM109, and about 4500 cells were transformed by selection on an LB agar medium (containing 10 g / L of polypeptone, 5 g / L of yeast extract, 10 g / L of NaCl, 15 g / L of agar, and 50 μg / ml of kanamycin). I got the body.
[0037]
Next, these transformants were collectively cultured in an LB liquid medium (containing 50 μg / ml of kanamycin), a plasmid DNA was extracted from the culture by a conventional method (alkaline method), and Methylophilus methylotrophus was extracted with the plasmid DNA. Transformation was performed by the electroporation method. Electroporation was performed at 1.8 kV / cm using a GenePulser manufactured by BioRad.
[0038]
After culturing the transformant on a SEII agar medium (agar 1.5%, containing kanamycin 20 μg / ml) at 37 ° C. for about 48 hours, about 200 kanamycin-resistant colonies appeared. Sixty colonies were randomly selected from these, and they were combined and cultured in the SEII liquid medium in the same manner as described above, and plasmid DNA was extracted from the culture by a conventional method.
[0039]
This DNA solution is used for E. coli. E. coli JM109 strain was transformed, and many colonies showing kanamycin resistance were obtained on an LB agar medium (kanamycin 50 μg / ml). Ten strains were randomly selected from these resistant strains, plasmid DNA was extracted from each strain, and the size was confirmed by electrophoresis. The plasmid DNAs were almost the same size, and the DNA inserted into pHSG298 The size of the fragment could be estimated to be about 2.7 kb. Next, these plasmids were digested with restriction enzymes, and their degradation patterns were compared. As a result, it was found that all the plasmids held by the obtained 10 strains had the same structure. The plasmid obtained here was pOriC ^m L.
[0040]
Embodiment 2 oriC ^m Limited area and small oriC ^m Preparation of plasmid
Plasmid pOriC described in Example 1 ^m The base sequence of the L inserted DNA fragment was determined. The nucleotide sequence was analyzed using a BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (manufactured by Applied Biosystems) using a 310 Genetic Analyzer (manufactured by AB). The result is shown in SEQ ID NO: 11. The sequences of the primers used for the nucleotide sequence determination are described in SEQ ID NOs: 1 to 6.
[0041]
As a result, it was found that several open reading frames (ORFs) were present in the inserted DNA fragment. Two of them are shown in SEQ ID NO: 11. The first ORF is similar to the second half of the dnaA-like gene, and the second ORF is similar to the first half of the dnaN-like gene (FIG. 1). Although not shown in the sequence listing, the ORF also exists from the 5 'end to the 401st base in the base sequence of SEQ ID NO: 11.
[0042]
Next, it was determined whether only the approximately 1.44 kb DNA region from the dnaA-like gene to the dnaN-like gene in the above-described approximately 2.7 kb-long DNA region isolated first had autonomous replication activity. Study was carried out.
[0043]
First, using a chromosomal DNA of Methylophilus methylotrophus as a template, PCR using the primers described in SEQ ID NOs: 7 and 8 (a SalI site is linked to the 5 'end) to obtain a target DNA fragment (base Nos. 2612). The amplification reaction was performed using Pyrobest DNA Polymerase manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd. for <denaturation step> at 98 ° C. for 10 seconds, <annealing step> at 60 ° C. for 30 seconds, and <DNA strand extension reaction step> at 72 ° C. for 90 seconds. 25 cycles were performed. The 1442 bp DNA fragment amplified here was digested with SalI (Takara Shuzo), digested with SalI (Takara Shuzo) and ligated to dephosphorylated vector pHSG298 (using Takara Shuzo's Ligation Kit ver. 2). ). Then, two kinds of plasmids inserted in each direction with respect to the lac promoter mounted on the vector were obtained. When Methylophilus methylotrophus was transformed with these plasmids, strains showing kanamycin resistance could be obtained from both types of plasmids, and it was found that autonomous replication activity was present in this DNA region. Both of these plasmids were each constructed with pOriC ^m -1 (a plasmid in which the direction of the dnaA-like gene is in the same direction as the lac promoter of the vector), pOriC ^m -2 (the direction of the dnaA-like gene is opposite to the lac promoter of the vector).
[0044]
Furthermore, in order to identify a region having an autonomous replication activity, the presence or absence of an autonomous replication activity in a DNA region between a dnaA-like gene and a dnaN-like gene was examined. First, using a chromosomal DNA of Methylophilus methylotrophus as a template, PCR using the primers described in SEQ ID NOs: 9 and 10 (with a SalI site connected to the 5 'end) to obtain a target DNA fragment (C-terminal 10 A DNA encoding a region containing the amino acid residue and the N-terminal 10 amino acid residue of the DnaN-like protein, and a DNA part between both (base numbers 1535-1855 of SEQ ID NO: 11) were amplified. The amplification reaction was performed using Pyrobest DNA Polymerase manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd. for 25 cycles of <denaturation step> at 98 ° C. for 10 seconds, <annealing step> at 60 ° C. for 30 seconds, and <DNA strand extension step> at 72 ° C. for 1 minute for 25 minutes. Carried out.
[0045]
The amplified 321 bp DNA fragment was digested with SalI (Takara Shuzo), digested with SalI (Takara Shuzo), and ligated to dephosphorylated vector pHSG298 (using Ligation Kit ver. 2 manufactured by Takara Shuzo). ). As a result, only a large number of plasmids in which the direction of the dnaA-like gene was inserted in the reverse direction to the lac promoter mounted on the vector were obtained.
[0046]
When Methylophilus methylotrophus was transformed with these plasmids, a number of strains exhibiting kanamycin resistance could be obtained, and it was found that this DNA region has an autonomous replication activity and has a high transformation frequency. When pBHR1 (a derivative from pBBR1) was used as the introduced plasmid and transformed under the same conditions, the frequency of appearance of the transformant was several tenths of that of the plasmid obtained above. Met. Plasmid obtained as described above is called pOriC ^m S-2 (the direction of the dnaA-like gene was opposite to that of the lac promoter). The base sequence of the DNA fragment (321 bp region) capable of autonomous replication identified in this manner is shown in SEQ ID NO: 14.
[0047]
The pOriC ^m Methylophilus methylotrophus strain carrying S-2 was cultured in SEII liquid medium containing kanamycin (50 μg / ml) at 37 ° C. for 24 hours, and a plasmid was prepared from the cells by a conventional method in the same manner as described above. After subjecting to 0.7% (w / v) agarose gel electrophoresis and ethidium bromide staining, a clear plasmid DNA band was observed, and as a plasmid maintaining a plurality of copy numbers in Methylophilus methylotrophus. It turned out to work.
[0048]
【The invention's effect】
The present invention provides a novel vector that functions as a plasmid in a Methylophilus bacterium. This vector is useful for the breeding of bacteria of the genus Methylophilus.
[0049]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the structure of an autonomously replicating sequence of the present invention.

Claims

Methylophilus bacteria are transformed with a circular DNA containing a chromosomal DNA fragment of the bacteria belonging to the genus Methylophilus and a DNA fragment containing a marker gene that functions in the bacterial cell, and a transformant expressing the marker gene is transformed from the transformant. A plasmid vector that contains an autonomously replicating sequence that functions in a bacterium belonging to the genus Methylophilus and that can be autonomously replicated in a bacterium belonging to the genus Methylophilus, which can be obtained by isolating a circular DNA from the selected transformant.

A plasmid vector comprising an autonomously replicating sequence having a base sequence consisting of base numbers 1169 to 2612 of SEQ ID NO: 11 or a part thereof and functioning in a bacterium belonging to the genus Methylophilus, and capable of autonomous replication in a bacterium belonging to the genus Methylophilus.

In the base sequence consisting of base numbers 1169 to 2612 of SEQ ID NO: 11 or a part thereof, the base sequence includes an autonomously replicating sequence that functions in a bacterium belonging to the genus Methylophilus having a base sequence containing substitution, deletion, or insertion of one or several nucleotides. , A plasmid vector capable of autonomous replication in Methylophilus bacteria.

The plasmid vector according to claim 2 or 3, wherein a part of the nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 1169 to 2612 of SEQ ID NO: 11 is the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 14.

The plasmid vector according to any one of claims 1 to 4, comprising a drug resistance gene that functions in a bacterium belonging to the genus Methylophilus.

The plasmid vector according to any one of claims 1 to 5, wherein the Methylophilus bacterium is Methylophilus methylotrophus.

A bacterium belonging to the genus Methylophilus, which carries the plasmid vector according to claim 1.