【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、優れた抗腫瘍効果、抗菌効果、免疫増強効果及び滋養強壮効果を有する薬用茸の一種である冬虫夏草用の培地に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
冬虫夏草は、薬用茸の一種で、昆虫などを宿主とし、菌糸が増殖して宿主を死に至らしめた後、該宿主の体内で菌糸が充満すると子実体を形成するコルディセプス（ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ）属の茸の一種であり、冬季には宿主の体内にあり、夏季になると宿主の虫体から穿ち出る子嚢菌に属する茸である。
冬虫夏草は、自然状態では地中または地上に菌糸または胞子として存在する菌であり、寄生する昆虫の幼虫期、蛹期及び成虫期全般にわたって体内に侵入して発生する。
冬虫夏草は、優れた抗腫瘍効果、抗菌効果、免疫増強効果及び滋養強壮効果を有するものとして知られている。冬虫夏草の有効成分はコルディセピン（ｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ）であり、その含有量は、子実体の乾燥体において０．０２〜０．６重量％程度である。
【０００３】
近年、冬虫夏草の菌糸体を人工的に培養する方法としていくつか提案されており、例えば、冬虫夏草の虫体菌糸又は座胞子をセミなどの節足動物の昆虫類の成虫、蛹、幼虫などに定着させて固体培養する方法、米胚を利用した培養液の製造方法などが知られている。しかしながら、成虫、蛹、幼虫などに定着させる固体培養や、米胚を利用した液体培養などの従来の培養方法では、培養方法が複雑であった。また、その収量は、たとえば、さなぎ固体培養による培養生成産物中のコルディセピン含有量は約０．１〜０．５重量％、米胚液体培養の場合は約０．０４重量％といずれも高くなかった（例えば、特許文献１参照。）。
【０００４】
【特許文献１】
特開昭６３−２０９５７９号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような実情に鑑みなされたものであり、その目的は、得られる培養生成物中のコルディセピンの含有量を向上させることができる冬虫夏草用培地を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明の冬虫夏草用培地は、（Ａ）炭素源としてグルコース、スクロース、糖蜜、マルトースから選ばれた少なくとも１種を１〜６重量％、（Ｂ）窒素源としてペプトン、イースト、モルト、ミルクから選ばれた少なくとも１種を１〜７重量％、（Ｃ）アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、ＤＮＡから選ばれた少なくとも１種を０．１〜０．５重量％それぞれ含有してなるものである。
前記冬虫夏草用培地が、さらに（Ｄ）微量のビオチン及び／又はビタミンＢ類を含有することが好ましい。
また、本発明の冬虫夏草用培地は、（Ａ）炭素源としてグルコース、スクロース、糖蜜、マルトースから選ばれた少なくとも１種を１〜６重量％、（Ｂ）窒素源としてペプトン、イースト、モルト、ミルクから選ばれた少なくとも１種を１〜７重量％、（Ｄ）ビオチン及び／又はビタミンＢ類を微量それぞれ含有してなるものである。
前記ビタミンＢ類が、ビタミンＢ１及び／又はビタミンＢ１２であることが好ましい。
前記（Ａ）成分の含有量が１〜３重量％であると共に、前記（Ｂ）成分の含有量が４〜７重量％であることが好ましい。
なお、本発明において重量％とは、水１００重量部に対して、成分ｘ重量部を含有することを意味する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の冬虫夏草用培地は、（Ａ）グルコース、スクロース、糖蜜、マルトースから選ばれた少なくとも１種、（Ｂ）ペプトン、イースト、モルト、ミルクから選ばれた少なくとも１種、（Ｃ）アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、ＤＮＡから選ばれた少なくとも１種及び／又は（Ｄ）ビオチン、ビタミンＢ類を含有してなるものである。
【０００８】
本発明の培地で培養される冬虫夏草としては、コルディセピンを含有するものであれば特に限定されない。例えば、コルディセプス属に属するもので、コルディセプス・ミリタリス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ）等の培養に好ましく用いられる。特にコルディセプス・ミリタリス（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８６５７、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８６５８）の培養に好ましく用いられる。
【０００９】
（Ａ）成分は、冬虫夏草用培地の炭素源として含有するものであり、グルコース、スクロース、糖蜜、マルトースのいずれか１種又は２種以上である。
（Ａ）成分の冬虫夏草用培地中の含有量は１〜６重量％であり、好ましくは１〜３重量％である。（Ａ）成分の含有量が１重量％未満、または、６重量％を超えた場合は、得られる培養生成物の培地の単位重量あたりの菌体重量が減少する傾向がある。
【００１０】
（Ｂ）成分は、冬虫夏草用培地の窒素源として含有するものであり、ペプトン、イースト、モルト、ミルクから選ばれるいずれか１種または２種以上である。イーストまたはモルトはその抽出物を使用してもよい。ミルクとしては、粉乳、脱脂粉乳等が挙げられる。
（Ｂ）成分の冬虫夏草用培地中の含有量は１〜７重量％であり、好ましくは４〜７重量％である。（Ｂ）成分の含有量が１重量％未満、また、７重量％を超えた場合は、得られる培養生成物の培地の単位重量あたりの菌体重量が減少する傾向がある。
【００１１】
（Ｃ）成分は、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、ＤＮＡから選ばれるいずれか１種または２種以上である。
アスパラギン、アスパラギン酸、グリシンは、アミノ酸の１種である。アスパラギンとしてはＬ体、Ｄ体どちらも使用できるが、Ｌ体が好ましい。アスパラギン酸においても、Ｌ体、Ｄ体どちらも使用できる。Ｌ−アスパラギン（和光純薬製のもの等）を用いた場合には、低コストに製造できるので工業的に好ましい。ＤＮＡとしては、例えば、魚等から抽出したＤＮＡが使用でき、鮭精液由来のＤＮＡ等が挙げられる。
（Ｃ）成分の冬虫夏草用培地中の含有量は０．１〜０．５重量％である。（Ｃ）成分の含有量が０．１重量％未満の場合は、コルディセピン含有量の増加効果が少ないので好ましくない。また、（Ｃ）成分の含有量が０．５重量％を超えた場合は、菌体の成長およびコルディセピン含有量の増加効果の極限を超えるため好ましくない。
【００１２】
（Ｄ）成分は、ビタミンとして冬虫夏草用培地に含有させるものであり、ビオチン、ビタミンＢ類のいずれか１種または２種以上である。
ビオチンはビタミンの一種である。
ビタミンＢ類は、ビタミンＢであれば特に限定されず、好ましくは、ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２等であり、これらは単独のものでも、または二種以上の混合物であってもよい。
（Ｄ）成分の含有量は、特に限定されないが、微量であることがよく、例えば冬虫夏草用培地１００ｍｌに対して２〜１０μｇ程度である。（Ｄ）成分の含有量が２μｇ未満の場合は、得られる培養生成物中のコルディセピン含有量の増加効果が少ないので好ましくない。また、（Ｄ）成分の含有量が１０μｇを大きく超えた場合は、菌体の成長およびコルディセピン含有量の増加効果の極限を超えるので好ましくない。
【００１３】
冬虫夏草用培地のｐＨは、２〜９であることがことが好ましく、特に好ましくは、５〜７である。ｐＨの調製は、調製が行えるならばどのようにしてもよく、例えば、塩酸や水酸化ナトリウムを使用する調製方法が挙げられる。
【００１４】
本発明の冬虫夏草用培地は、（Ａ）〜（Ｄ）成分以外はほとんど水であるが、この水としては、特に限定されず、水道水、井戸水、蒸留水等が挙げられる。
このように、本発明の冬虫夏草用培地は、（Ａ）成分、（Ｂ）成分、（Ｃ）成分及び／又は（Ｄ）成分を含有してなることにより、得られる培養生成物中のコルディセピンの含有量を向上させることができる。さらに、（Ａ）〜（Ｄ）成分、水以外にも、コルディセピンの含有量を向上させるために他の成分を含有させてもよい。
他の成分としては、例えば（Ｂ）成分以外の窒素源としてはおから、それ以外には例えばマグネシウム、カルシウム等のミネラルが挙げられる。
【００１５】
【実施例】
以下、実施例及び参考例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれになんら限定されるものではない。
下記実施例及び参考例の各培地を本培養培地として用い、以下のようにして得られる生成物の菌体重量および総コルディセピン量を求めた。
【００１６】
（使用菌株）
菌株としては、コルディセプス・ミリタリス（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８６５７）を、保存菌株用培地（スラント培地：ペプトン１ｇ、グルコース３ｇ、ＤＬ−アスパラギン０．１ｇ、ＭｇＳＯ４ ０．０５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．１ｇ、ビオチン ２μｇ、寒天３ｇ、蒸留水１００ｍｌ、ｐＨ６．８）で保存したものを用いた。この菌株を、種菌培養として下記前々培養および前培養した後、後述の各実施例及び各参考例の培地を用いて本培養した。
【００１７】
（前々培養）
平板寒天培地（ペプトン１ｇ、グルコース３ｇ、ＤＬ−アスパラギン０．１ｇ、ＭｇＳＯ４ ０．０５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．１ｇ、ビオチン２μｇ、寒天３ｇ、蒸留水１００ｍｌ、ｐＨ６．８）をシャーレに２０ｍｌ充填した。このシャーレ培地に、前記保存した菌株を約１５ｍｍ＊１５ｍｍ切り出して接種し、これを２１℃下２週間培養した。
【００１８】
（前培養）
液体培地（ペプトン１ｇ、グルコース３ｇ、ＤＬ−アスパラギン０．１ｇ、ＭｇＳＯ４ ０．０５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．１ｇ、ビオチン２μｇ、蒸留水１００ｍｌ、ｐＨ６．８）１００ｍｌを５００ｍｌ三角フラスコに分注し、１２１℃下２０分間滅菌処理した。処理後、液温度が室温まで下がったとき、この液体培地に、前々培養したシャーレ培地から切り出した約１ｃｍ角のコロニ−三つを接種した。これを回転振盪機を用いて８０ｒｐｍで、２１℃下１０日間培養し、分生子の発生を顕微鏡で確認後、本培養に使用した。
【００１９】
（本培養）
下記実施例及び参考例の各培地１００ｍｌをそれぞれ５００ｍｌ三角フラスコに分注し、１２１℃下２０分間滅菌処理した。なお、各例毎に（１種につき）それぞれ３つ同じ実験を行った。処理後、それぞれ液温度が室温まで下がったとき、この液体培地に、前培養した培地から採取した約１ｍｌを接種し、静置して本培養を行った。
【００２０】
（培養生成物中の総コルディセピン量の測定）
本培養後、各培養液１００ｍｌをろ紙（５Ｂ：アドバンテック東洋社製）を用いてろ過した。得られた菌体を５日間凍結乾燥した後、精密天秤で測定しその重量（以下、菌体重量とする）を測定した。
また、ろ過した培養液を凍結乾燥し、その重量（以下、培養液乾燥重量とする）を測定した。
【００２１】
凍結乾燥した菌体１ｇを水（蒸留水）を用いて１０分間超音波（サンフレックス、ＤＧ−１、５０Ｗ、４３ＫＨｚ）処理した。この処理液をろ紙（５Ｂ：アドバンテック東洋社製）を用いてろ過してコルディセピン含有量分析用試料とした。
この試料を、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ（ＬＣ−１０：株式会社島津製作所製））を用いて分析し、コルディセピンの含有量を測定した（以下、菌体コルディセピン含有量とする）。
【００２２】
ＨＰＬＣの条件は、カラムにＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−２（ＯＤＳ） ２５０Ｌ＊４．６φｍｍ（ジーエルサイエンス株式会社製）を用い、移動相は５０ｍＭリン酸カリウム：アセトニトリル（Ｖ／Ｖ＝９５：５）、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度４０℃、検出波長２６０ｎｍで行った。
前記ろ過培養液の凍結乾燥物についても、同様にしてコルディセピン含有量を測定した（以下、培養液コルディセピン含有量とする）。
【００２３】
これらの値から、次式に基づいて総コルディセピン量を求めた。
（総コルディセピン量）＝（菌体コルディセピン量＊菌体重量）／（菌体重量＋培養液乾燥重量）＋（培養液コルディセピン量＊培養液乾燥重量）／（菌体重量＋培養液乾燥重量）
上記の測定は、前述のように培地１種につき三連で実験して得られた培養物のそれぞれについて行い、３つの値の平均値をその培地における値とした。
【００２４】
〔実施例１〜４〕
下記表１に示した実施例１〜４の各種炭素源３ｇ、窒素源としてペプトン１ｇ、ＤＬ−アスパラギン０．１ｇ、ＭｇＳＯ４ ０．０５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．１ｇ、ビオチン ２μｇ、蒸留水１００ｍｌからなり、ｐＨ６．８の液体培地をそれぞれ作成した。これら作成した培地を前記の本培養の培地として用いて、それぞれ菌体重量および総コルディセピン量を求めた。その結果を表１に示した。なお、本培養は、２１℃下暗所にて５０日間行った。
【００２５】
【表１】
【００２６】
表１に示した結果から、本発明の炭素源としてグルコース、スクロース、マルトース、糖蜜を用いた実施例１〜４の場合、いずれも得られた培養生成物中のコルディセピン量が従来と比較して顕著に増加した。
【００２７】
〔実施例５〜１０〕
下記表２に示した実施例５〜１０の６つの含有量の炭素源としてグルコース、窒素源としてペプトン１ｇ、ＤＬ−アスパラギン０．１ｇ、ＭｇＳＯ４ ０．０５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．１ｇ、ビオチン ２μｇ、蒸留水１００ｍｌからなり、ｐＨ６．８の液体培地をそれぞれ作成した。これら作成した培地を前記の本培養の培地として用いて、それぞれ菌体重量および総コルディセピン量を求めた。その結果を表２に示した。なお、本培養は、２１℃下暗所にて５０日間行った。
【００２８】
【表２】
【００２９】
表２に示した結果から、本発明のグルコースの含有量が１ｇ、２ｇ、３ｇ、４ｇ、５ｇ、６ｇの実施例５〜８の場合、いずれも得られた培養物中のコルディセピン量が従来と比較して顕著に増加した。
【００３０】
〔実施例１１〜１４〕
下記表３に示した実施例１１〜１４の各種窒素源１ｇ、炭素源としてグルコース３ｇ、ＤＬ−アスパラギン０．１ｇ、ＭｇＳＯ４ ０．０５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．１ｇ、ビオチン ２μｇ、蒸留水１００ｍｌからなり、ｐＨ６．８の液体培地をそれぞれ作成した。これら作成した培地を前記の本培養の培地として用いて、それぞれ菌体重量および総コルディセピン量を求めた。その結果を表３に示した。なお、本培養は、２１℃下暗所にて３０日間行った。
【００３１】
【表３】
【００３２】
表３に示した結果から、本発明の窒素源としてペプトン、イースト、モルト、脱脂粉乳を用いた実施例１１〜１４の場合、いずれも得られた培養生成物中のコルディセピン量が従来と比較して顕著に増加した。
【００３３】
〔実施例１５〜１９〕
炭素源としてグルコース３ｇ、窒素源として下記表４に示した実施例１５〜１９のそれぞれの含有量のペプトン、ＤＬ−アスパラギン０．１ｇ、ＭｇＳＯ４ ０．０５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．１ｇ、ビオチン ２μｇ、蒸留水１００ｍｌからなり、ｐＨ６．８の液体培地をそれぞれ作成した。これら作成した培地を前記の本培養の培地として用いて、それぞれ菌体重量および総コルディセピン量を求めた。その結果を表４に示した。なお、本培養は、２１℃下暗所にて３０日間行った。
【００３４】
【表４】
【００３５】
表４に示した結果から、本発明のペプトンの含有量が３ｇ、４ｇ、５ｇ、６ｇ、７ｇとした実施例１５〜１９の場合、いずれも得られた培養物中のコルディセピン量が従来と比較して顕著に増加した。
【００３６】
〔参考例１〜１４〕
下記表５に示した参考例１〜１３の各種アミノ酸又はＤＮＡ（鮭由来）０．１ｇ及び参考例１４のアミノ酸又はＤＮＡ無添加、グルコース３ｇ、蒸留水１００ｍｌを用いて培地を作成した。これら作成した培地を前記の本培養の培地として用いて、それぞれ菌体重量および総コルディセピン量を求めた。各培地を使用した場合の評価は、アミノ酸又はＤＮＡ無添加のコントロール（参考例１４）における総コルディセピン量を１として比を求めることにより行った。その結果を表５に示した。なお、本培養は、２１℃下暗所にて３０日間行った。
【００３７】
【表５】
【００３８】
表５に示した結果から、総コルディセピン量はＤＮＡ、ＤＬ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン、ＤＬ−アスパラギン酸、Ｄ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン酸及びグリシンを添加した場合が顕著に多く、特にＤＮＡが最も多かった。
【００３９】
〔実施例２０〜２２、参考例１５〕
下記表６に示した実施例２０〜２２の各種ビタミン類２μｇ及び参考例１５のビタミン類無添加、炭素源としてグルコース３ｇ、窒素源としてペプトン１ｇ、蒸留水１００ｍｌからなり、ｐＨ６．８の液体培地をそれぞれ作成した。これら作成した培地を前記の本培養の培地として用いて、それぞれ菌体重量および総コルディセピン量を求めた。各培地を使用した場合の評価は、ビタミン類無添加のコントロール（参考例１５）における総コルディセピン量を１として比を求めることにより行った。その結果を表６に示した。なお、本培養は、２１℃下暗所にて３０日間行った。
【００４０】
【表６】
【００４１】
表６に示した結果から、本発明のビタミン類としてビタミンＢ１２、ビタミンＢ１、ビオチンを用いた実施例２０〜２２の場合、いずれも得られた培養生成物中のコルディセピン量が増大した。
【００４２】
【発明の効果】
本発明の培地を使用して冬虫夏草を培養することにより、得られる培養生成物中のコルディセピンの含有量を、従来の培地を使用した場合よりも顕著に向上させることができる。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a medium for cordyceps, which is a kind of medicinal mushroom having an excellent antitumor effect, antibacterial effect, immunopotentiating effect and nutritive tonic effect.
[0002]
[Prior art]
Cordyceps is a kind of medicinal mushroom, which is a kind of medicinal mushroom. The mushroom of the genus cordyceps, which forms a fruiting body when the hypha becomes full in the host after the mycelium grows and the host is killed by using an insect or the like as a host. It is a kind of mushroom that belongs to the ascomycetes that is present in the host body in the winter season and oozes from the host body in the summer season.
Cordyceps is a fungus that exists as a mycelium or a spore in the ground or on the ground in its natural state, and occurs by invading the body throughout the larval, pupal, and adult stages of parasitic insects.
Cordyceps is known to have excellent antitumor, antibacterial, immune-enhancing and nourishing effects. The active ingredient of Cordyceps is cordycepin, and its content is about 0.02 to 0.6% by weight in the dried fruit body.
[0003]
In recent years, several methods have been proposed as a method for artificially cultivating mycelia of cordyceps.For example, the mycelium or spores of cordyceps cordyceps are established in adult, pupa, and larvae of arthropod insects such as cicada. There are known a method of causing a solid culture and a method of producing a culture solution using rice embryos. However, conventional culturing methods such as solid culturing for fixing to adults, pupae, larvae and the like, and liquid culturing using rice embryos, have complicated culturing methods. In addition, the yield is not as high as, for example, the cordycepin content in the product of culturing by pupa solid culture is about 0.1 to 0.5% by weight, and that of rice embryo liquid culture is about 0.04% by weight. (For example, see Patent Document 1).
[0004]
[Patent Document 1]
JP-A-63-209579
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made in view of such circumstances, and an object of the present invention is to provide a medium for Cordyceps sinensis capable of improving the content of cordycepin in the obtained culture product.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
To achieve the above object, the cordyceps medium of the present invention comprises (A) 1 to 6% by weight of at least one selected from glucose, sucrose, molasses and maltose as a carbon source, and (B) peptone as a nitrogen source. , Yeast, malt, milk 1 to 7% by weight, and (C) at least one selected from asparagine, aspartic acid, glycine and DNA 0.1 to 0.5% by weight. It is made.
The cordyceps medium preferably further contains (D) a trace amount of biotin and / or vitamin B.
In addition, the cordyceps medium of the present invention comprises (A) 1 to 6% by weight of at least one selected from glucose, sucrose, molasses and maltose as a carbon source, and (B) peptone, yeast, malt and milk as a nitrogen source. At least one selected from the group consisting of (D) biotin and / or vitamin B in trace amounts.
The vitamin B is preferably a vitamin B 1 and / or vitamin B 12.
It is preferable that the content of the component (A) is 1 to 3% by weight and the content of the component (B) is 4 to 7% by weight.
In the present invention, the term "% by weight" means that 100 parts by weight of water contains x part by weight of a component.
[0007]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The medium for cordyceps of the present invention comprises (A) at least one selected from glucose, sucrose, molasses and maltose, (B) at least one selected from peptone, yeast, malt and milk, (C) asparagine and asparagine. It contains at least one selected from acid, glycine and DNA and / or (D) biotin and vitamin B.
[0008]
Cordyceps sinensis cultured in the medium of the present invention is not particularly limited as long as it contains cordycepin. For example, it belongs to the genus Cordyceps, and is preferably used for culturing Cordyceps militaris and the like. In particular, it is preferably used for culture of Cordyceps militalis (deposit number FERM P-18657, deposit number FERM P-18658).
[0009]
The component (A) is included as a carbon source in a cordyceps medium, and is at least one of glucose, sucrose, molasses, and maltose.
The content of the component (A) in the medium for cordyceps is 1 to 6% by weight, preferably 1 to 3% by weight. When the content of the component (A) is less than 1% by weight or more than 6% by weight, the weight of bacterial cells per unit weight of the medium of the obtained culture product tends to decrease.
[0010]
The component (B) is contained as a nitrogen source in a cordyceps medium, and is at least one selected from peptone, yeast, malt, and milk. Yeast or malt may use its extract. Examples of the milk include milk powder, skim milk powder and the like.
The content of the component (B) in the medium for cordyceps is 1 to 7% by weight, preferably 4 to 7% by weight. When the content of the component (B) is less than 1% by weight or more than 7% by weight, the weight of bacterial cells per unit weight of the culture medium of the obtained culture product tends to decrease.
[0011]
The component (C) is at least one selected from asparagine, aspartic acid, glycine, and DNA.
Asparagine, aspartic acid, and glycine are one type of amino acids. Both L-form and D-form can be used as asparagine, but L-form is preferred. Both L-form and D-form can be used for aspartic acid. The use of L-asparagine (such as that made by Wako Pure Chemical Industries) is industrially preferable because it can be produced at low cost. As the DNA, for example, DNA extracted from fish or the like can be used, and DNA derived from salmon semen and the like can be mentioned.
The content of the component (C) in the medium for cordyceps is 0.1 to 0.5% by weight. When the content of the component (C) is less than 0.1% by weight, the effect of increasing the content of cordycepin is small, which is not preferable. If the content of the component (C) exceeds 0.5% by weight, the growth of the cells and the effect of increasing the content of cordycepin are exceeded, which is not preferable.
[0012]
The component (D) is contained in a cordyceps medium as a vitamin, and is one or more of biotin and vitamin Bs.
Biotin is a type of vitamin.
The vitamin B is not particularly limited as long as it is vitamin B, and is preferably vitamin B 1 , vitamin B 12 or the like, and these may be used alone or as a mixture of two or more.
The content of the component (D) is not particularly limited, but is preferably a very small amount, for example, about 2 to 10 μg per 100 ml of a cordyceps medium. If the content of the component (D) is less than 2 μg, the effect of increasing the cordycepin content in the obtained culture product is small, which is not preferable. Further, when the content of the component (D) greatly exceeds 10 μg, it is not preferable because the growth of bacterial cells and the effect of increasing the content of cordycepin are exceeded.
[0013]
The pH of the medium for cordyceps is preferably 2 to 9, and particularly preferably 5 to 7. The pH may be adjusted as long as it can be adjusted, and examples include a method using hydrochloric acid or sodium hydroxide.
[0014]
The medium for cordyceps of the present invention is almost water except for the components (A) to (D), but the water is not particularly limited, and examples thereof include tap water, well water, and distilled water.
As described above, the medium for cordyceps of the present invention contains the component (A), the component (B), the component (C) and / or the component (D), so that the cordycepin in the obtained culture product is obtained. The content can be improved. Further, in addition to the components (A) to (D) and water, other components may be contained in order to improve the content of cordycepin.
As the other component, for example, as the nitrogen source other than the component (B), there may be mentioned okara, and in addition, minerals such as magnesium and calcium may be mentioned.
[0015]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on Examples and Reference Examples, but the present invention is not limited thereto.
Using each medium of the following Examples and Reference Examples as a main culture medium, the cell weight and the total cordycepin amount of the product obtained as described below were determined.
[0016]
(Used strain)
As the strain, Cordyceps militaris (deposit number: FERM P-18657) was used as a storage strain medium (slant medium: 1 g of peptone, 3 g of glucose, 0.1 g of DL-asparagine, 0.05 g of MgSO 4, 0.05 g of K 2 HPO 40 . 1 g, 2 μg of biotin, 3 g of agar, 100 ml of distilled water, pH 6.8) were used. This strain was pre-cultured and pre-cultured as inoculum culture as described below, and then main-cultured using the medium of each Example and Reference Example described below.
[0017]
(Culture before and after)
Plate agar medium (peptone 1g, glucose 3g, DL-asparagine 0.1g, MgSO 4 0.05g, K 2 HPO 4 0.1g, biotin 2 [mu] g, agar 3g, distilled water 100 ml, pH 6.8) 20 ml packed in a petri dish of did. About 15 mm * 15 mm of the preserved strain was cut out and inoculated into this petri dish, and this was cultured at 21 ° C. for 2 weeks.
[0018]
(Pre-culture)
Liquid medium (peptone 1g, glucose 3 g, DL-asparagine 0.1g, MgSO 4 0.05g, K 2 HPO 4 0.1g, biotin 2 [mu] g, distilled water 100ml, pH 6.8) was dispensed to 100ml to 500ml Erlenmeyer flask min And sterilized at 121 ° C. for 20 minutes. After the treatment, when the liquid temperature dropped to room temperature, the liquid medium was inoculated with three colonies of about 1 cm square cut out from the petri dish cultured beforehand. This was cultured at 80 rpm using a rotary shaker at 21 ° C. for 10 days, and the conidium generation was confirmed under a microscope, and then used for main culture.
[0019]
(Main culture)
100 ml of each medium of the following Examples and Reference Examples was dispensed into a 500 ml Erlenmeyer flask and sterilized at 121 ° C. for 20 minutes. Note that three identical experiments were performed for each example (for each type). After the treatment, when the temperature of each solution dropped to room temperature, about 1 ml collected from the pre-cultured medium was inoculated into this liquid medium, and allowed to stand for main culture.
[0020]
(Measurement of total cordycepin in culture product)
After the main culture, 100 ml of each culture was filtered using filter paper (5B: manufactured by Advantech Toyo). The obtained cells were freeze-dried for 5 days and then measured with a precision balance to determine the weight (hereinafter referred to as cell weight).
The filtered culture was freeze-dried and its weight (hereinafter referred to as the culture liquid dry weight) was measured.
[0021]
1 g of the freeze-dried cells was subjected to ultrasonic treatment (Sunflex, DG-1, 50 W, 43 KHz) for 10 minutes using water (distilled water). This treatment liquid was filtered using a filter paper (5B: manufactured by Advantech Toyo) to obtain a cordisepin content analysis sample.
This sample was analyzed using high performance liquid chromatography (HPLC (LC-10: manufactured by Shimadzu Corporation)), and the content of cordycepin was measured (hereinafter referred to as the bacterial cell cordycepin content).
[0022]
The HPLC conditions used were Inertsil ODS-2 (ODS) 250 L * 4.6 φ mm (manufactured by GL Sciences Inc.) for the column, and the mobile phase was 50 mM potassium phosphate: acetonitrile (V / V = 95: 5). The flow rate was 1.0 ml / min, the column temperature was 40 ° C., and the detection wavelength was 260 nm.
For the freeze-dried product of the filtered culture, the cordycepin content was measured in the same manner (hereinafter referred to as the culture fluid cordycepin content).
[0023]
From these values, the total amount of cordycepin was determined based on the following equation.
(Total cordycepin amount) = (Bacterial cordycepin amount * Bacterium weight) / (Bacterial cell weight + Culture broth dry weight) + (Culture broth cordycepin amount * Culture broth dry weight) / (Bacterial body weight + Culture broth dry weight)
The above measurement was performed for each of the cultures obtained by performing the experiment in triplicate for one type of medium as described above, and the average value of the three values was defined as the value in the medium.
[0024]
[Examples 1 to 4]
Various carbon sources 3g of Examples 1 to 4 shown in Table 1, peptone 1g as a nitrogen source, DL-asparagine 0.1g, MgSO 4 0.05g, K 2 HPO 4 0.1g, biotin 2 [mu] g, distilled water 100ml , And a liquid medium having a pH of 6.8 was prepared. Using the prepared medium as the medium for the main culture, the cell weight and the total cordycepin amount were determined, respectively. The results are shown in Table 1. The main culture was performed at 21 ° C. in a dark place for 50 days.
[0025]
[Table 1]
[0026]
From the results shown in Table 1, in Examples 1-4 using glucose, sucrose, maltose, and molasses as the carbon source of the present invention, the amount of cordycepin in the culture product obtained in each case was lower than that in the conventional case. Noticeably increased.
[0027]
[Examples 5 to 10]
Six content of glucose as a carbon source of Example 5-10 shown in Table 2, peptone 1g as a nitrogen source, DL-asparagine 0.1g, MgSO 4 0.05g, K 2 HPO 4 0.1g, biotin Liquid media of pH 6.8 were prepared, each containing 2 μg and 100 ml of distilled water. Using the prepared medium as the medium for the main culture, the cell weight and the total cordycepin amount were determined, respectively. The results are shown in Table 2. The main culture was performed at 21 ° C. in a dark place for 50 days.
[0028]
[Table 2]
[0029]
From the results shown in Table 2, the glucose content of the present invention is 1 g, 2 g, 3 g, 4 g, 5 g, and 6 g in Examples 5 to 8; It increased remarkably in comparison.
[0030]
[Examples 11 to 14]
Various nitrogen sources 1g of Examples 11-14 shown in Table 3, glucose 3g as a carbon source, DL-asparagine 0.1g, MgSO 4 0.05g, K 2 HPO 4 0.1g, biotin 2 [mu] g, distilled water 100ml , And a liquid medium having a pH of 6.8 was prepared. Using the prepared medium as the medium for the main culture, the cell weight and the total cordycepin amount were determined, respectively. Table 3 shows the results. The main culture was performed at 21 ° C. in a dark place for 30 days.
[0031]
[Table 3]
[0032]
From the results shown in Table 3, in the case of Examples 11 to 14 using peptone, yeast, malt, skim milk powder as the nitrogen source of the present invention, the amount of cordycepin in the culture product obtained in each case was compared with the conventional amount. Significantly increased.
[0033]
[Examples 15 to 19]
Peptone content of each of Examples 15 to 19 shown in Table 4 Glucose 3g, as a nitrogen source as a carbon source, DL-asparagine 0.1g, MgSO 4 0.05g, K 2 HPO 4 0.1g, biotin Liquid media of pH 6.8 were prepared, each containing 2 μg and 100 ml of distilled water. Using the prepared medium as the medium for the main culture, the cell weight and the total cordycepin amount were determined, respectively. Table 4 shows the results. The main culture was performed at 21 ° C. in a dark place for 30 days.
[0034]
[Table 4]
[0035]
From the results shown in Table 4, in the case of Examples 15 to 19 in which the content of the peptone of the present invention was 3 g, 4 g, 5 g, 6 g, and 7 g, the amount of cordycepin in the obtained culture was compared with the conventional one. And increased significantly.
[0036]
[Reference Examples 1 to 14]
A medium was prepared using 0.1 g of each amino acid or DNA (derived from salmon) of Reference Examples 1 to 13 shown in Table 5 below, and 3 g of glucose and 100 ml of distilled water without addition of the amino acid or DNA of Reference Example 14. Using the prepared medium as the medium for the main culture, the cell weight and the total cordycepin amount were determined, respectively. The evaluation when each medium was used was performed by calculating the ratio with the total cordycepin amount in the control (Reference Example 14) to which no amino acid or DNA was added as 1. Table 5 shows the results. The main culture was performed at 21 ° C. in a dark place for 30 days.
[0037]
[Table 5]
[0038]
From the results shown in Table 5, the total cordycepin amount was remarkably large when DNA, DL-asparagine, L-asparagine, DL-aspartic acid, D-aspartic acid, L-aspartic acid and glycine were added. The most.
[0039]
[Examples 20 to 22, Reference Example 15]
A liquid medium having a pH of 6.8, consisting of 2 μg of various vitamins of Examples 20 to 22 shown in Table 6 below, no addition of vitamins of Reference Example 15, 3 g of glucose as a carbon source, 1 g of peptone as a nitrogen source, and 100 ml of distilled water. Was created respectively. Using the prepared medium as the medium for the main culture, the cell weight and the total cordycepin amount were determined, respectively. The evaluation in the case where each medium was used was performed by calculating the ratio with the total amount of cordycepin in the control (Reference Example 15) in which no vitamins were added as 1. Table 6 shows the results. The main culture was performed at 21 ° C. in a dark place for 30 days.
[0040]
[Table 6]
[0041]
From the results shown in Table 6, vitamin B 12 as vitamins of the present invention, vitamin B 1, in Example 20-22 using biotin, either Korudisepin in the culture product obtained is increased.
[0042]
【The invention's effect】
By culturing Cordyceps sinensis using the medium of the present invention, the content of cordycepin in the obtained culture product can be significantly improved as compared with the case where a conventional medium is used.
