JP2004229599A

JP2004229599A - Polynucleotide, polypeptide, recombinant vector, transformant, method for producing proteolytic enzyme, pharmaceuticals and kit for inspection

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Publication number: JP2004229599A
Application number: JP2003024588A
Authority: JP
Inventors: Yuuzo Takahashi; 優三高橋; Isao Nagano; 功長野
Original assignee: Gifu University NUC
Current assignee: Gifu University NUC
Priority date: 2003-01-31
Filing date: 2003-01-31
Publication date: 2004-08-19

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a new polynucleotide, recombinant vector, transformant, pharmaceuticals, each capable of readily utilizing serine protease activity having high substrate specificity. <P>SOLUTION: The present invention provides a polynucleotide having a specific base sequence, a polypeptide encoded thereby, an expression vector in which the polynucleotide is integrated, a transformed cell transformed by introducing the recombinant vector and pharmaceuticals utilized mainly as an antithrombotic medicine containing the polynucleotide or the polypeptide as an active ingredient. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、旋毛虫Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａｓｐｉｒａｌｉｓからクローニングされたタンパク分解酵素遺伝子及びその遺伝子産物としてのタンパク分解酵素に関する知見に基づいて発明されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、組換えベクター、形質転換体、タンパク分解酵素の製造方法、医薬品及び検査用キットに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、この種のセリンプロテアーゼ（ｓｅｒｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅ）活性を有するタンパク分解酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ等の消化酵素や、トロンビン、プラスミン等の血液凝固、血栓溶解作用を持つ酵素が知られている（非特許文献１参照）。
【０００３】
【非特許文献１】
日経バイオ最新用語辞典第５版、日経ＢＰ社、２００２年９月１７日、４６７頁。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
この発明は、本発明者らにより、旋毛虫Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａｓｐｉｒａｌｉｓが産生する新規なタンパク分解酵素のクローニングに成功した結果なされたものである。その目的とするところは、基質特異性の高いセリンプロテアーゼ活性を容易に利用することができるポリヌクレオチド、ポリペプチド、組換えベクター、形質転換体及び医薬品を提供することにある。別の目的とするところは、基質特異性の高いセリンプロテアーゼ活性を備えたタンパク分解酵素を容易に製造することができるタンパク分解酵素の製造方法を提供することにある。その他の目的とするところは、旋毛虫Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａｓｐｉｒａｌｉｓによる感染症の拡大を容易に抑えることができるポリヌクレオチド、医薬品及び検査用キットを提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の発明のポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３で表される塩基配列、又はその配列と実質的に同一の塩基配列からなるものである。
【０００６】
請求項２に記載の発明のポリヌクレオチドは、請求項１に記載のポリヌクレオチドの塩基配列を含有するものである。
請求項３に記載の発明のポリヌクレオチドは、請求項１に記載のポリヌクレオチドの塩基配列の一部を含有するものである。
【０００７】
請求項４に記載の発明のポリペプチドは、請求項１又は請求項２に記載のポリヌクレオチドによりコードされるものである。
請求項５に記載の発明の組換えベクターは、請求項１又は請求項２に記載のポリヌクレオチドが発現可能となるように組込まれたことを特徴とするものである。
【０００８】
請求項６に記載の発明の組換えベクターは、請求項５に記載の発明において、前記ポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームの末端に標識ペプチドをコードするヌクレオチドを組込んだことを特徴とするものである。
【０００９】
請求項７に記載の発明の形質転換体は、請求項５又は請求項６に記載の組換えベクターを導入することにより形質転換されたものである。
請求項８に記載の発明のタンパク分解酵素の製造方法は、タンパク分解酵素を製造する方法であって、請求項７に記載の形質転換体を増殖させた後、該形質転換体から請求項４に記載のポリペプチドを精製することを特徴とするものである。
【００１０】
請求項９に記載の発明の医薬品は、請求項１若しくは請求項２に記載のポリヌクレオチド、請求項４に記載のポリペプチド、又は請求項８に記載のタンパク分解酵素の製造方法により製造されたタンパク分解酵素を含有することを特徴とするものである。
【００１１】
請求項１０に記載の発明の医薬品は、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項３に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドに対する抗体、又は請求項４に記載のポリペプチドに対する抗体を含有することを特徴とするものである。
【００１２】
請求項１１に記載の発明の検査用キットは、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項３に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド若しくはそのポリペプチドに対する抗体、又は請求項４に記載のポリペプチド若しくはそのポリペプチドに対する抗体を含有することを特徴とするものである。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、この発明を具体化した実施形態を詳細に説明する。
実施形態の第一のポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３で表される塩基配列、又はその配列と実質的に同一の塩基配列からなるものである。これら第一のポリヌクレオチドは、いずれもセリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチド（タンパク分解酵素）をコードする。前記実質的に同一の塩基配列とは、各配列番号で表されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードするものを意味する。
【００１４】
また、この実質的に同一の塩基配列としては、各配列番号で表されるアミノ酸配列に対し僅かに異なるアミノ酸配列をコードするものであって、そのアミノ酸配列からなるポリペプチドがセリンプロテアーゼ活性を有するものまでが含まれる。例えば、ＰＣＲ反応により各配列番号で表される塩基配列を増幅したＰＣＲ産物も前記実質的に同一の概念に含まれる。このとき、前記実質的に同一の塩基配列としては、そのアミノ酸配列が各配列番号で表されるアミノ酸配列に対して、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上のホモロジーを有するのが望ましい。以下、配列番号ｎ（ｎ＝１〜３のいずれか）で表される塩基配列又はその配列と実質的に同一の配列からなるポリヌクレオチドを、ＰＮｎ（ポリヌクレオチドｎ）と記載する。
【００１５】
実施形態の第二のポリヌクレオチドは、前記第一のポリヌクレオチド（ＰＮ１、ＰＮ２又はＰＮ３）の塩基配列を含有するものである。即ち、この第二のポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３で表される塩基配列、又はその配列と実質的に同一の塩基配列を含有するものである。前記実質的に同一の塩基配列とは、前記第一のポリヌクレオチドの場合と全く同様のことを意味する。以下、ＰＮ１の塩基配列を含有する第二のポリヌクレオチドをＰＮ１＋、ＰＮ２の塩基配列を含有する第二のポリヌクレオチドをＰＮ２＋、ＰＮ３の塩基配列を含有する第二のポリヌクレオチドをＰＮ３＋と記載する。
【００１６】
実施形態の第三のポリヌクレオチドは、前記第一のポリヌクレオチド（ＰＮ１、ＰＮ２又はＰＮ３）の塩基配列の一部を含有するものであり、第一のポリヌクレオチド（ＰＮ１、ＰＮ２又はＰＮ３）の塩基配列の一部からなるものであってもよい。なお、この第三のポリヌクレオチドは、前記第一のポリヌクレオチドの塩基配列のうち連続した一連の部分配列を含有している。即ち、この第三のポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３で表される塩基配列の一部、又はその配列と実質的に同一の塩基配列を含有するものである。前記実質的に同一の塩基配列とは、各配列番号で表されるアミノ酸配列の一部と同一のアミノ酸配列をコードするものを意味する。また、この実質的に同一の塩基配列としては、そのアミノ酸配列が各配列番号で表されるアミノ酸配列の一部に対して、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上のホモロジーを有するものであってもよい。以下、ＰＮ１の塩基配列の一部を含有する第三のポリヌクレオチドをＰＮ１ｐ、ＰＮ２の塩基配列の一部を含有する第三のポリヌクレオチドをＰＮ２ｐ、ＰＮ３の塩基配列の一部を含有する第三のポリヌクレオチドをＰＮ３ｐと記載する。
【００１７】
これら第一から第三のポリヌクレオチドはいずれも、一本鎖ＤＮＡや二本鎖ＤＮＡ等のＤＮＡ、又は一本鎖ＲＮＡやｍＲＮＡ等のＲＮＡの形態で利用される。また、アンチセンスＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡの形態で利用することもできる。これら第一から第三のポリヌクレオチドは、その全長又はその一部をサザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、インサイチュ（ｉｎｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション等に用いられる標識用のプローブとして利用することができる。また、ＤＮＡチップ（マイクロアレイ）に利用することもできる。
【００１８】
配列番号１で表される塩基配列は、旋毛虫Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａｓｐｉｒａｌｉｓからクローニングされたタンパク分解酵素の遺伝子配列であり、全長１４４５塩基の塩基配列からなる。この塩基配列は、１〜１２６３番目までの１２６３塩基（４２１アミノ酸）からなるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、１２６４〜１２６６番目までの終止コドンと、１２６７〜１４４５番目までの１７８塩基からなる３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）とを備えている。３’ＵＴＲには、１４１１〜１４１６番目までの６塩基からなるポリＡシグナル配列（ＡＡＴＡＡＡ）と、１４２９番目以降のポリＡ配列とが含まれている。
【００１９】
さらに、この塩基配列には、ＶｏｎＨｅｉｊｎｅ，Ｇ．１９８６．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１４：４６８３−４６９０．のアルゴリズムに基づいて、１〜８１番目までの８１塩基からなるＮ端シグナル配列が存在する。その結果、この塩基配列がコードするポリペプチドは、２７番目のＳｅｒと２８番目のＧｌｎとの間で前記Ｎ端シグナル配列が切断される翻訳後修飾を受ける可能性が高い。また、この塩基配列がコードするポリペプチドは、公知のセリンプロテアーゼに対するホモロジー検索の結果より、４７番目のＧｌｎと４８番目のＩｌｅとの間で翻訳後修飾により切断される可能性が高い。また、この塩基配列がコードするポリペプチドには、前記ホモロジー検索の結果より、８８〜９０番目、２３１〜２３３番目、２４７〜２４９番目及び２９３〜２９５番目の４カ所に糖鎖結合部位（Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｓｉｔｅ）が存在し、翻訳後修飾される可能性が高い。
【００２０】
配列番号２で表される塩基配列は、配列番号１で表される塩基配列の１４２〜１２６３番目までの１１２２塩基、即ち配列番号１で表されるアミノ酸配列の４８番目のＩｌｅから４２１番目のＴｙｒまでの３７４アミノ酸からなるポリペプチドをコードする。この塩基配列は、種々の翻訳後修飾を受けた後の成熟（ｍａｔｕｒｅ）タンパクとしてのセリンプロテアーゼ活性を有するタンパク分解酵素をコードしている。このタンパク分解酵素は、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１番目のＩｌｅから２３４番目のＩｌｅまでの２３４アミノ酸からなる触媒ドメインと、２３５番目のＴｙｒから３７４番目のＴｙｒまでの１４０アミノ酸からなるＣ端ドメインとを備えている。Ｃ端ドメインは、触媒ドメインの酵素活性を安定化したり、感染宿主から保護したりする役割を果たすものと推測される。
【００２１】
配列番号３で表される塩基配列は、配列番号１で表される塩基配列の１４２〜８４３番目までの７０２塩基、即ち配列番号１で表されるアミノ酸配列の４８番目のＩｌｅから２８１番目のＩｌｅまでの２３４アミノ酸からなるポリペプチドをコードする。つまり、この塩基配列は、前記タンパク分解酵素の触媒ドメインをコードする。
【００２２】
実施形態の第一のポリペプチドは、前記第一のポリヌクレオチド（ＰＮ１、ＰＮ２又はＰＮ３）によりコードされるアミノ酸配列からなるものであり、例えば配列番号１、配列番号２又は配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるものが挙げられる。これら第一のポリペプチドは、いずれもセリンプロテアーゼ活性を有するタンパク分解酵素として利用することができる。
【００２３】
実施形態の第二のポリペプチドは、前記第二のポリヌクレオチド（ＰＮ１＋、ＰＮ２＋又はＰＮ３＋）によりコードされるアミノ酸配列からなるものである。この第二のポリペプチドは、前記第一のポリペプチドの５’末端又は３’末端（好ましくは３’末端）に融合ペプチド（ポリペプチド）が融合されたものである。前記融合ペプチドとしては、第二のポリヌクレオチドを導入した形質転換体を用いて第二のポリペプチドを産生させたときそのポリペプチドの精製が容易となることから、オリゴヒスチジン、ポリヒスチジン、チオレドキシン（ＴＲＸ）等の標識ペプチドが好適に用いられる。また、前記融合ペプチドとしては、スクリーニング等に利用するのが容易であることから、種々のレポーター遺伝子や薬剤耐性遺伝子の遺伝子産物を用いてもよい。この第二のポリペプチドも、セリンプロテアーゼ活性を有している。
【００２４】
実施形態の第三のポリペプチドは、前記第三のポリヌクレオチド（ＰＮ１ｐ、ＰＮ２ｐ又はＰＮ３ｐ）によりコードされるアミノ酸配列からなるものである。この第三のポリペプチドは、前記第一のポリペプチドのアミノ酸配列のうち連続した一連の部分配列を含有するものである。この第三のポリペプチドは、抗体作製のための抗原やプロテインチップ（マイクロアレイ）等に利用される。
【００２５】
実施形態の組換えベクターは、前記ポリヌクレオチド（ＰＮ１、ＰＮ２、ＰＮ３、ＰＮ１＋、ＰＮ２＋、ＰＮ３＋、ＰＮ１ｐ、ＰＮ２ｐ又はＰＮ３ｐ）をプラスミドベクターやレトロウィルスベクター等の種々の発現ベクター内に発現可能となるように組込んだものである。この組換えベクターは、公知のインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）タンパク合成系を利用して前記ポリペプチドを製造することができる。
【００２６】
実施形態の形質転換体は、前記組換えベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞等の種々の宿主細胞内に導入することにより該細胞を形質転換することにより得られる。なお、前記宿主細胞としては、セリンプロテアーゼ活性の低下を抑えつつ、ＰＮ１〜ＰＮ３及びＰＮ１＋〜ＰＮ３＋がコードするポリペプチドを迅速かつ容易に大量生産できることから、大腸菌や酵母等の微生物を用いるのが好ましく、大量生産に特に適していることから大腸菌を用いるのが最も好ましい。
【００２７】
実施形態のタンパク分解酵素の製造方法は、形質転換体を増殖させる増殖工程と、その増殖工程で増殖した形質転換体からタンパク分解酵素を精製する精製工程とを備えている。前記形質転換体としては、前記第一又は第二のポリヌクレオチド（ＰＮ１、ＰＮ２、ＰＮ３、ＰＮ１＋、ＰＮ２＋又はＰＮ３＋）が発現可能となるように組込まれた組換えベクターを導入して形質転換した細胞が用いられる。この形質転換体としては、セリンプロテアーゼ活性の低下を抑えつつ、ＰＮ１〜ＰＮ３及びＰＮ１＋〜ＰＮ３＋がコードするポリペプチドを迅速かつ容易に大量生産できることから、微生物を用いるのが好ましく、大量生産に特に適していることから大腸菌を用いるのが最も好ましい。また、前記組換えベクター内に導入されるポリヌクレオチドとしては、精製工程が容易であることから、前記標識ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第二のポリヌクレオチドであるのが好ましい。
【００２８】
前記精製工程は、前記形質転換体により産生されたポリペプチドをクロマトグラフィー等の分離精製技術を用いて精製する工程である。この精製工程では、前記形質転換体が産生するポリペプチドを効率的に精製し得る任意の分離精製技術が適用されるが、前記標識ペプチドと特異的に結合するアフィニティクロマトグラフィーを用いて前記タンパク分解酵素を精製するのが最も好ましい。なお、前記形質転換体により産生されたポリペプチドを精製した後、該ポリペプチドから標識ペプチドを分離させてタンパク分解酵素のみを単離する操作を行うとよい。
【００２９】
実施形態の医薬品としては、脳血栓や心筋梗塞等の血栓症の予防若しくは治療に利用される抗血栓薬、又は旋毛虫Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａｓｐｉｒａｌｉｓによる感染症を治療するための感染症治療薬が挙げられる。
【００３０】
抗血栓薬は、前記タンパク分解酵素のセリンプロテアーゼ活性による血栓溶解作用を利用することにより血栓症の予防や治療を行うものである。この抗血栓薬は、前記第一若しくは第二のポリヌクレオチド（ＰＮ１、ＰＮ２、ＰＮ３、ＰＮ１＋、ＰＮ２＋若しくはＰＮ３＋）、前記第一若しくは第二のポリペプチド、又は前記タンパク分解酵素の製造方法により製造されたタンパク分解酵素を有効成分として含有する。
【００３１】
感染症治療薬は、前記タンパク分解酵素の発現抑制、又は該タンパク分解酵素の活性阻害を引き起こすことにより、旋毛虫Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａｓｐｉｒａｌｉｓによる感染症の治療を行うものである。この感染症治療薬は、前記第一、第二若しくは第三のポリヌクレオチド（ＰＮ１、ＰＮ２、ＰＮ３、ＰＮ１＋、ＰＮ２＋、ＰＮ３＋、ＰＮ１ｐ、ＰＮ２ｐ若しくはＰＮ３ｐ）に対するアンチセンスＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡ、或いは前記第一、第二又は第三のポリペプチドに対する抗体を有効成分として含有する。前記抗体としては、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体が挙げられる。前記モノクローナル抗体はハイブリドーマにより容易かつ大量に供給され得る。
【００３２】
実施形態の検査用キットとしては、ヒトや家畜等が旋毛虫症に罹患しているか否かを検査（診断）するための診断キット、又は食肉や食肉加工品等に対する食品検査を行うための食品検査キットが挙げられる。これらの検査用キットは、ヒト、家畜、食肉、食肉加工品等から採取した検査用サンプルに、旋毛虫Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａｓｐｉｒａｌｉｓが産生するタンパク分解酵素が存在するか否かを検査することにより診断又は食品検査を行うものである。これらの検査用キットとしては、遺伝子検査キット又はタンパク検査キットが挙げられる。
【００３３】
遺伝子検査キットは、前記第一、第二又は第三のポリヌクレオチド（ＰＮ１、ＰＮ２、ＰＮ３、ＰＮ１＋、ＰＮ２＋、ＰＮ３＋、ＰＮ１ｐ、ＰＮ２ｐ又はＰＮ３ｐ）、好ましくは第三のポリヌクレオチドを検出用プローブとして利用するものである。この遺伝子検査キットとしては、ＤＮＡチップ、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーション等の公知の検査技術が適用され、迅速かつ簡便に検査を行うことができることからＤＮＡチップが最も好適に適用される。
【００３４】
タンパク検査キットは、前記第一、第二若しくは第三のポリペプチド（検査用サンプルとしてヒトや家畜の血清が用いられる）、又は該ポリペプチドに対する抗体を検出用ツールとして利用するものである。このタンパク検査キットとしては、免疫沈降反応、ゲル内二重拡散法、免疫電気泳動法、定量沈降反応、放射免疫定量法、酵素免疫定量法、ウェスタンブロッティング、プロテインチップ等の公知の検査技術が適用され、迅速かつ簡便に検査を行うことができることからプロテインチップが最も好適に適用される。
【００３５】
上記実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
・実施形態のポリヌクレオチドは、旋毛虫Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａｓｐｉｒａｌｉｓよりクローニングされた配列番号１で表される新規な塩基配列に基づいて提供されたものである。第一及び第二のポリヌクレオチド（ＰＮ１、ＰＮ２、ＰＮ３、ＰＮ１＋、ＰＮ２＋及びＰＮ３＋）は、いずれもセリンプロテアーゼ活性を有する（第一又は第二の）ポリペプチドをコードしていることから、血栓溶解作用を発揮する可能性が高く、抗血栓薬として血栓症の予防や治療に利用することができる。特に、これら第一及び第二のポリペプチドは、新規な基質特異性を備えたセリンプロテアーゼ活性が大いに期待されることから、血栓症の予防や治療を目指した創薬の研究や開発に役立てることができる。
【００３６】
一方、第三のポリヌクレオチド（ＰＮ１＋、ＰＮ２＋又はＰＮ３＋）は、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＤＮＡチップ、検査用プローブ等の感染症治療薬や検査用キットに好適に利用することができる。同様に、第三のポリペプチドは、抗体作製やプロテインチップ等の検査用キットに好適に利用することができる。従って、これら第三のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、旋毛虫Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａｓｐｉｒａｌｉｓによる感染症の早期発見や効果的な治療や予防に役立てることによって、感染症の拡大を容易に抑えることができる。
【００３７】
・実施形態の組換えベクターは、第一、第二又は第三のポリヌクレオチド（ＰＮ１、ＰＮ２、ＰＮ３、ＰＮ１＋、ＰＮ２＋、ＰＮ３＋、ＰＮ１ｐ、ＰＮ２ｐ又はＰＮ３ｐ）が発現可能となるように組込まれたものである。実施形態の形質転換体は、前記組換えベクターが導入されたものである。これら組換えベクター及び形質転換体は、前記第一、第二又は第三のポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを大量生産するのに著しく適していることから、医薬品や検査用キット等の原材料を容易かつ大量に提供することができる。また、取り扱いや保存が極めて容易である。
【００３８】
【実施例】
以下、前記実施形態を具体化した実施例及び比較例について説明する。
＜タンパク分解酵素の同定＞
旋毛虫Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａｓｐｉｒａｌｉｓ（ＩＳＳ４１３）感染３０日後のマウスから筋肉幼虫（ｍｕｓｃｌｅｌａｒｖａｅ）を採取してｍＲＮＡを抽出した。続いて、前記ｍＲＮＡをＴｉｍｅｓａｖｅｒｃＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓｋｉｔ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて、λＺＡＰＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に組込み、ＧｉｇａｐａｃｋＧｏｌｄＩＩＩｐａｃｋａｇｉｎｇｅｘｔｒａｃｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）にパッケージすることにより、ｃＤＮＡライブラリー（２０万プラーク）を作製した。このライブラリーの作製方法の詳細はＮａｇａｎｏ，Ｉ．ｅｔ．ａｌ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ１２３：７７−８３を参照。
【００３９】
次に、前記Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａｓｐｉｒａｌｉｓの幼虫３００匹を２ヶ月間感染させたＢＡＬＢ／ｃマウスから採取した抗Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａｓｐｉｒａｌｉｓ血清にて前記ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによりポジティブクローンが１１個得られた。このスクリーニング法はＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ．ａｌ．Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，２ｎｄｅｄ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ．ｐ．１２．１−１２．４４に従って行った。これらポジティブクローンをｉｎｖｉｖｏｅｘｃｉｓｉｏｎによりプラスミドに組込んだ後、大腸菌ＳＯＬＲ株に導入し、自動シークエンサーとＤＮＡＳＩＳソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉｓｏｆｔｗａｒｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ社製）にてシークエンスして塩基配列を決定した。
【００４０】
これらの塩基配列及びそのアミノ酸配列についてホモロジー検索したところ、１つのクローンＴｓ２３−２が新規な配列を有していることが判明した。このクローンは、配列番号１で表される全長１４４５ｂｐの塩基配列からなるものであった。さらに、このクローンは前記ホモロジー検索からセリンプロテアーゼ活性を有するタンパク分解酵素であるらしいことも判明した。
【００４１】
＜リコンビナントタンパクの発現と精製＞
前記クローンＴｓ２３−２が組込まれたプラスミドからＥｃｏＲＩフラグメントを切り出し、ｐＴｒｃＨｉｓ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にサブクローニングして組換えベクターを作製した後、大腸菌ＤＨ５α株に導入した。この大腸菌の培養液にＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎａｓｉｄｅ）を終濃度１ｍＭ添加して３７℃で３時間インキュベートした。この大腸菌を集菌して２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で超音波処理により破砕した後、同緩衝液中に終濃度６Ｍの尿素を添加して可溶化させ、ＨｉｓＴｒａｐｋｉｔ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ社製）を充填したカラムにヒスチジン標識タンパクを吸着させた。
【００４２】
次に、Ｃｏｌａｎｇｅｌｉ，Ｒ．ｅｔ．ａｌ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｂ，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓｃｅｉｅｎｃｅｓａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ７１４：２２３−２３５の方法に従って、前記カラムに対して尿素を段階的に薄めた緩衝液でゆっくりと洗浄した後、５００ｍＭイミダゾールを含有する溶出液を用いてヒスチジン標識タンパクを溶出させた。この溶出液中のイミダゾールをＰＤ−１０（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ社製）カラムにて取り除くことにより、ポリヒスチジン標識リコンビナントタンパクが得られた。このタンパクは、前記抗Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａｓｐｉｒａｌｉｓ血清により免疫沈降反応を引き起こし、さらにウェスタンブロッティングにても前記抗血清に特異的に反応したことが確認された。
【００４３】
＜活性ドメインの発現と精製＞
前記クローンＴｓ２３−２が組込まれたプラスミドを、配列番号４及び配列番号５で表される塩基配列からなる一対のＰＣＲプライマーにてＰＣＲ反応することによりＰＣＲ産物を得た。このＰＣＲ産物は、配列番号１で表される塩基配列の８２〜８４３番目（配列番号１で表されるアミノ酸配列の２８番目のＧｌｎから２８１番目のＩｌｅ）までの配列からなるポリヌクレオチドである。次に、前記ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで切り出し、チオレドキシン（ＴＲＸ）標識発現ベクターｐＥＴ−３２（ＮｏｖａｇｅｎＩｎｃ．社製）に組込んで組換えベクターを作製した後、大腸菌ＡＤ４９４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株（ＮｏｖａｇｅｎｅＩｎｃ．社製）に導入した。この大腸菌の培養液にＩＰＴＧを終濃度１ｍＭ添加して２０℃で１８時間インキュベートした。
【００４４】
この大腸菌を集菌して２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で超音波処理して破砕した後、遠心上清をＨｉｓＴｒａｐＣｈｅｌａｔｉｎｇＨＰカラムに添加することにより、該カラムにＴＲＸ融合タンパクを吸着させた。次に、５００ｍＭイミダゾールを含有する溶出液で前記カラムからＴＲＸ標識タンパクを溶出させた。この溶出液中のイミダゾールをＰＤ−１０カラムにて取り除くことにより、ＴＲＸ標識リコンビナントタンパクが得られた。このタンパクは、ＳＤＳゲル電気泳動にて純度検定したところ、目的とするタンパクが高純度で得られていたことが確認された。
【００４５】
＜活性ドメインのプロテアーゼ活性＞
前記ポリヒスチジン標識リコンビナントタンパク（Ｔｓ２３−２）及びＴＲＸ標識リコンビナントタンパクのプロテアーゼ活性について、セリンプロテアーゼ活性基質としての合成ペプチドと、プロテアーゼ活性阻害剤とを用いて検証した。なお、コントロールとして、ＴＲＸリコンビナントタンパク（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）及びセリンプロテアーゼ活性を有するトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．社製）を用いた。
【００４６】
（セリンプロテアーゼ活性の測定）
合成ペプチド（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）は、ペプチド研究所製のＬ−ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍｙｌ−Ｇｌｙｃｙｌ−Ｌ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ−４−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｃｏｕｍａｒｙｌ−７−Ａｍｉｄｅ（Ｐｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡ），Ｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ｌ−Ｌｅｕｃｙｌ−Ｌ−Ｌｅｕｃｙｌ−Ｌ−Ｖａｌｙｌ−Ｌ−Ｔｙｒｏｓｉｎｅ−４−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｃｏｕｍａｒｙｌ−７−Ａｍｉｄｅ（Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＭＣＡ），Ｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ｌ−Ａｌａｎｙｌ−Ｌ−Ａｌａｎｙｌ−Ｌ−Ａｌａｎｉｎｅ−４−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｃｏｕｍａｒｙｌ−７−Ａｍｉｄｅ（Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＭＣＡ），ｔ−Ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｙｌ−Ｌ−Ｌｙｓｙｌ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ−４−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｃｏｕｍａｒｙｌ−７−Ａｍｉｄｅ（Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＭＣＡ），ｔ−Ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｙｌ−Ｌ−Ａｌａｎｙｌ−Ｌ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ−４−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｃｏｕｍａｒｙｌ−７−Ａｍｉｄｅ（Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＭＣＡ），ｔ−Ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−Ｌ−Ｖａｌｙｌ−Ｌ−Ｌｅｕｃｙｌ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ−４−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｃｏｕｍａｒｙｌ−７−Ａｍｉｄｅ（Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＭＣＡ），ｔ−Ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−Ｌ−Ｖａｌｙｌ−Ｌ−Ｐｒｏｌｙｌ−Ｌ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ−４−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｃｏｕｍａｒｙｌ−７−Ａｍｉｄｅ（Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＭＣＡ）の７種類を用いた。
【００４７】
５０ｎｇ／μｌのリコンビナントタンパク溶液２０μｌ、１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（１ｍＭＣａＣｌ_２，５０ｍＭＮａＣｌ，（ｐＨ８．０））及び終濃度１００μＭの合成ペプチドを混合した後、３７℃で１６時間インキュベートした。次に、ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｆｌｕｏｒｏｒｅａｄｅｒ（ＴＥＣＡＮ社製）にて３６０ｎｍの波長で励起させて４６５ｎｍの波長の蛍光強度を測定することにより、ＭＣＡの加水分解量（酵素活性（ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ））を定量した。なおこのとき、全ての測定結果は、適切なブランクテストを用いた非酵素的な加水分解を行った際の測定結果を用いて適正に補正した。結果を表１に示す。なお、表１に示される各データは、合計３回試験を行って得られた蛍光強度（×１０^−２）の平均値と標準偏差とが示されている。また、リコンビナントタンパクＴｓ２３−２及びＴＲＸ標識リコンビナントタンパクは終濃度５μｇ／ｍｌ、トリプシンは終濃度０．２μｇ／ｍｌで試験を行った。
【００４８】
【表１】

（プロテアーゼ活性阻害剤による阻害試験）
プロテアーゼ活性阻害剤（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）は、ｔｒａｎｓ−ｅｐｏｘｙｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｙｌａｍｉｄｏ−（４−ｇｕａｎｉｄｉｎｏ）ｂｕｔａｎｅ（Ｅ−６４，５μＭ），４−（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｅｎｅ−ｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＡＥＢＳＦ，２００μＭ），ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ（５０μＭ），ｐｅｐｓｔａｔｉｎ（１０μＭ），１，１０−ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ（１ｍＭ）．の５種類を用いた。ＴＲＸ標識リコンビナントタンパク（１μｇ）、１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（１ｍＭＣａＣｌ_２，５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ８．０））及びプロテアーゼ活性阻害剤を上記括弧内の終濃度となるように混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。次に、基質としての合成ペプチドＰｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡを添加した後、引き続き１６時間インキュベートを行った。酵素活性の測定は上記セリンプロテアーゼ活性の測定と同様に行った。また、各プロテアーゼ活性阻害剤による阻害効果は、該阻害剤なしのブランクテストに対するＴＲＸ標識リコンビナントタンパクのプロテアーゼ活性の割合（％ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）で表した。結果を表２に示す。なお、表２に示される各データは、合計３回試験を行って得られた蛍光強度（×１０^−２）の平均値と標準偏差とが示されている。
【００４９】
【表２】

以上の結果より、ポリヒスチジン標識リコンビナントタンパクＴｓ２３−２及び前記ＴＲＸ標識リコンビナントタンパクはいずれも、ペプチダーゼ活性及びセリンプロテアーゼ活性を発揮することが確認された。また、特異的な基質の存在は未だ不明であるが、セリンプロテイナーゼ活性を発揮する可能性は著しく高い。従って、これらリコンビナントタンパクは、大腸菌にて発現させることにより、酵素活性を保持したまま大量生産が可能であることが示された。また、前記ポリヒスチジン標識リコンビナントタンパクＴｓ２３−２の至適ｐＨを調べたところ約８．０であったことも確認された。
【００５０】
さらに、前記実施形態より把握できる技術的思想について以下に記載する。
・配列番号１で表される塩基配列の８２〜１２６３番目の配列、又はその配列と実質的に同一の塩基配列からなるポリヌクレオチド。配列番号１で表される塩基配列の８２〜８４３番目の配列、又はその配列と実質的に同一の塩基配列からなるポリヌクレオチド。このように構成した場合、基質特異性の高いセリンプロテアーゼ活性を容易に利用することができる。
【００５１】
・請求項１又は請求項２に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであって、セリンプロテアーゼ活性を有することを特徴とするポリペプチド。
【００５２】
・請求項３に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。請求項３に記載のポリヌクレオチドが発現可能となるように組込まれた組換えベクター。請求項３に記載のポリヌクレオチドが発現可能となるように組込まれた組換えベクターが導入された形質転換体。
【００５３】
なお、この明細書において、ポリヌクレオチドとは１０個以上のヌクレオチドからなるものを指し、ポリペプチドとは１０個以上のアミノ酸からなるものを指すものとする。
【００５４】
【発明の効果】
以上詳述したように、この発明によれば、次のような効果を奏する。
請求項１及び請求項２に記載の発明のポリヌクレオチドによれば、基質特異性の高いセリンプロテアーゼ活性を容易に利用することができる。請求項３に記載の発明のポリヌクレオチドによれば、旋毛虫Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａｓｐｉｒａｌｉｓによる感染症の拡大を容易に抑えることができる。
【００５５】
請求項４に記載の発明のポリペプチドによれば、基質特異性の高いセリンプロテアーゼ活性を容易に利用することができる。
請求項５及び請求項６に記載の発明の組換えベクターによれば、基質特異性の高いセリンプロテアーゼ活性を容易に利用することができる。
【００５６】
請求項７に記載の発明の形質転換体によれば、基質特異性の高いセリンプロテアーゼ活性を容易に利用することができる。
請求項８に記載の発明のタンパク分解酵素の製造方法によれば、基質特異性の高いセリンプロテアーゼ活性を備えたタンパク分解酵素を容易に製造することができる。
【００５７】
請求項９に記載の発明の医薬品によれば、基質特異性の高いセリンプロテアーゼ活性を利用することにより血栓症の治療に利用することができる。請求項１０に記載の発明の医薬品によれば、旋毛虫Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａｓｐｉｒａｌｉｓによる感染症の拡大を容易に抑えることができる。
【００５８】
請求項１１に記載の発明の検査用キットによれば、旋毛虫Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａｓｐｉｒａｌｉｓによる感染症の拡大を容易に抑えることができる。
【００５９】
【配列表】

[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to polynucleotides, polypeptides, recombinant vectors, transformants, and proteolytic enzymes invented based on the knowledge of proteolytic enzyme genes cloned from Trichinella spiralis and proteolytic enzymes as their gene products. The present invention relates to a production method, a pharmaceutical product, and a test kit.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, digestive enzymes such as trypsin, chymotrypsin and elastase, and enzymes having a blood coagulation and thrombolytic action such as thrombin and plasmin have been known as proteolytic enzymes having this type of serine protease activity. (See Non-Patent Document 1).
[0003]
[Non-patent document 1]
Nikkei Bio Latest Term Dictionary, 5th edition, Nikkei BP, September 17, 2002, p. 467.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made by the present inventors as a result of successful cloning of a novel proteolytic enzyme produced by Trichinella spiralis. It is an object of the present invention to provide a polynucleotide, a polypeptide, a recombinant vector, a transformant, and a pharmaceutical which can easily utilize a serine protease activity having high substrate specificity. Another object is to provide a method for producing a proteolytic enzyme capable of easily producing a protease having serine protease activity with high substrate specificity. It is another object of the present invention to provide a polynucleotide, a pharmaceutical, and a test kit that can easily suppress the spread of an infection caused by Trichinella spiralis.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve the above object, the polynucleotide of the invention according to claim 1 has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 3, or a nucleotide sequence substantially identical to the sequence. It consists of
[0006]
The polynucleotide according to the second aspect of the present invention contains the nucleotide sequence of the polynucleotide according to the first aspect.
The polynucleotide according to the third aspect of the present invention contains a part of the nucleotide sequence of the polynucleotide according to the first aspect.
[0007]
The polypeptide according to the fourth aspect of the invention is encoded by the polynucleotide according to the first or second aspect.
The recombinant vector according to the fifth aspect of the present invention is characterized in that the polynucleotide according to the first or second aspect has been incorporated so that it can be expressed.
[0008]
A recombinant vector according to a sixth aspect of the present invention is the recombinant vector according to the fifth aspect of the present invention, wherein a nucleotide encoding a labeled peptide is incorporated at the end of the open reading frame of the polynucleotide. .
[0009]
The transformant of the invention according to claim 7 has been transformed by introducing the recombinant vector according to claim 5 or 6.
The method for producing a proteolytic enzyme according to claim 8 is a method for producing a proteolytic enzyme, wherein the transformant according to claim 7 is grown, and then the transformant is produced from the transformant. Characterized in that the polypeptide described in (1) is purified.
[0010]
The pharmaceutical according to the ninth aspect of the invention is produced by the method for producing the polynucleotide according to the first or second aspect, the polypeptide according to the fourth aspect, or the proteolytic enzyme according to the eighth aspect. It is characterized by containing a proteolytic enzyme.
[0011]
The pharmaceutical product of the invention according to claim 10 is the polynucleotide according to any one of claims 1 to 3, an antibody against the polypeptide encoded by the polynucleotide according to claim 3, or claim 4. Characterized by containing an antibody against the polypeptide described in (1).
[0012]
The test kit of the present invention according to claim 11 is directed to a polynucleotide according to any one of claims 1 to 3, a polypeptide encoded by the polynucleotide according to claim 3, or a polypeptide thereof. An antibody, or a polypeptide according to claim 4 or an antibody against the polypeptide.
[0013]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, embodiments embodying the present invention will be described in detail.
The first polynucleotide of the embodiment has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 3, or a nucleotide sequence substantially the same as that sequence. Each of these first polynucleotides encodes a polypeptide (protease) having serine protease activity. The term "substantially the same base sequence" means a sequence which encodes the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by each SEQ ID NO.
[0014]
The substantially identical nucleotide sequence encodes an amino acid sequence slightly different from the amino acid sequence represented by each SEQ ID NO, and the polypeptide comprising the amino acid sequence has serine protease activity. Things are included. For example, a PCR product obtained by amplifying the base sequence represented by each SEQ ID NO by a PCR reaction is also included in the substantially same concept. At this time, the substantially identical base sequence is preferably at least 80%, more preferably at least 90%, even more preferably at least 95% of the amino acid sequence represented by each SEQ ID NO. Is desirable. Hereinafter, a polynucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: n (n = 1 to 3) or a sequence substantially identical to the base sequence is referred to as PNn (polynucleotide n).
[0015]
The second polynucleotide of the embodiment contains the base sequence of the first polynucleotide (PN1, PN2 or PN3). That is, the second polynucleotide contains the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 3, or a nucleotide sequence substantially identical to the sequence. The substantially identical base sequence means exactly the same as in the case of the first polynucleotide. Hereinafter, the second polynucleotide containing the base sequence of PN1 is referred to as PN1 +, the second polynucleotide containing the base sequence of PN2 is referred to as PN2 +, and the second polynucleotide containing the base sequence of PN3 is referred to as PN3 +.
[0016]
The third polynucleotide of the embodiment contains a part of the base sequence of the first polynucleotide (PN1, PN2 or PN3), and contains the base of the first polynucleotide (PN1, PN2 or PN3). It may consist of a part of the sequence. Note that the third polynucleotide contains a continuous series of partial sequences in the base sequence of the first polynucleotide. That is, the third polynucleotide contains a part of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 3, or a nucleotide sequence substantially identical to the sequence. The term "substantially identical base sequence" means a sequence that encodes the same amino acid sequence as a part of the amino acid sequence represented by each SEQ ID NO. Further, as the substantially identical base sequence, the amino acid sequence is preferably at least 80%, more preferably at least 90%, even more preferably at least 95% of a part of the amino acid sequence represented by each SEQ ID NO. %. Hereinafter, a third polynucleotide containing a part of the base sequence of PN1 is called PN1p, and a third polynucleotide containing a part of the base sequence of PN2 is called a third polynucleotide containing a part of the base sequence of PN3. Is described as PN3p.
[0017]
These first to third polynucleotides are all used in the form of DNA such as single-stranded DNA or double-stranded DNA, or RNA such as single-stranded RNA or mRNA. It can also be used in the form of antisense DNA or antisense RNA. These first to third polynucleotides can be used for their full length or a part thereof as a probe for labeling used in Southern hybridization, Northern hybridization, in situ hybridization and the like. It can also be used for a DNA chip (microarray).
[0018]
The nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is the gene sequence of a proteolytic enzyme cloned from Trichinella spiralis, and consists of a nucleotide sequence having a total length of 1445 bases. This base sequence has an open reading frame (ORF) consisting of 1263 to 1263 bases (421 amino acids), a stop codon of 1264 to 1266, and a 3 'non-sense consisting of 178 bases of 1267 to 1445. And a translation region (3′UTR). The 3′UTR contains a poly A signal sequence (AATAAA) consisting of 6 bases from the 1411 to 1416 positions and a poly A sequence after the 1429th position.
[0019]
Furthermore, this base sequence contains Von Heijne, G. et al. 1986. Nucleic Acids Research 14: 4683-4690. Based on the above algorithm, there is an N-terminal signal sequence consisting of 81 bases from the 1st to the 81st. As a result, the polypeptide encoded by this nucleotide sequence is highly likely to undergo post-translational modification in which the N-terminal signal sequence is cleaved between Ser at position 27 and Gln at position 28. In addition, the polypeptide encoded by this nucleotide sequence is highly likely to be cleaved by post-translational modification between Gln at position 47 and Ile at position 48, based on the results of homology search for a known serine protease. In addition, the polypeptide encoded by this nucleotide sequence has a sugar chain binding site (N-position at four positions 88 to 90, 231 to 233, 247 to 249, and 293 to 295, based on the result of the homology search. Glycosylation site exists and is likely to be post-translationally modified.
[0020]
The nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 is composed of 1122 nucleotides from the 142nd to 1263rd nucleotides of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, that is, the Tyr from the 48th Ile to the 421st Tyr of the amino acid sequence represented by the SEQ ID NO: 1. Encodes a polypeptide consisting of up to 374 amino acids. This nucleotide sequence encodes a proteolytic enzyme having serine protease activity as a mature protein after various post-translational modifications. This proteolytic enzyme consists of a catalytic domain consisting of 234 amino acids from the 1st Ile to 234th Ile of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and 140 amino acids from the 235th Tyr to the 374th Tyr. And a C-terminal domain. The C-terminal domain is presumed to play a role in stabilizing the enzymatic activity of the catalytic domain and protecting it from the infected host.
[0021]
The nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 is composed of 702 nucleotides from the 142nd to 843rd nucleotide of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, that is, from the 48th Ile to the 281st Ile of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Encodes a polypeptide consisting of up to 234 amino acids. That is, this base sequence encodes the catalytic domain of the proteolytic enzyme.
[0022]
The first polypeptide of the embodiment has an amino acid sequence encoded by the first polynucleotide (PN1, PN2 or PN3), and is represented by, for example, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 3. And those comprising an amino acid sequence. Any of these first polypeptides can be used as a proteolytic enzyme having serine protease activity.
[0023]
The second polypeptide of the embodiment has an amino acid sequence encoded by the second polynucleotide (PN1 +, PN2 + or PN3 +). This second polypeptide is obtained by fusing a fusion peptide (polypeptide) to the 5 'end or 3' end (preferably 3 'end) of the first polypeptide. As the fusion peptide, oligohistidine, polyhistidine, thioredoxin (since purification of the second polypeptide is facilitated when the second polypeptide is produced using a transformant into which the second polynucleotide has been introduced, A labeled peptide such as TRX) is preferably used. In addition, gene products of various reporter genes or drug resistance genes may be used as the fusion peptide because it is easy to use for screening or the like. This second polypeptide also has serine protease activity.
[0024]
The third polypeptide of the embodiment has an amino acid sequence encoded by the third polynucleotide (PN1p, PN2p or PN3p). The third polypeptide contains a continuous series of partial sequences in the amino acid sequence of the first polypeptide. The third polypeptide is used for an antigen for preparing an antibody, a protein chip (microarray), or the like.
[0025]
The recombinant vector of the embodiment enables the polynucleotide (PN1, PN2, PN3, PN1 +, PN2 +, PN3 +, PN1p, PN2p or PN3p) to be expressed in various expression vectors such as a plasmid vector and a retrovirus vector. It is built into. The polypeptide can be produced from this recombinant vector using a known in vitro protein synthesis system.
[0026]
The transformant of the embodiment can be obtained by introducing the recombinant vector into various host cells such as Escherichia coli, yeast, insect cells, plant cells, and mammalian cells to transform the cells. As the host cell, it is preferable to use a microorganism such as Escherichia coli or yeast, since the polypeptides encoded by PN1 to PN3 and PN1 + to PN3 + can be rapidly and easily mass-produced while suppressing a decrease in serine protease activity. It is most preferable to use Escherichia coli because it is particularly suitable for mass production.
[0027]
The method for producing a protease according to the embodiment includes a growth step of growing a transformant, and a purification step of purifying the protease from the transformant grown in the growth step. As the transformant, a cell transformed by introducing a recombinant vector into which the first or second polynucleotide (PN1, PN2, PN3, PN1 +, PN2 + or PN3 +) can be expressed is introduced. Is used. As such a transformant, a microorganism is preferably used, since the polypeptides encoded by PN1 to PN3 and PN1 + to PN3 + can be rapidly and easily mass-produced while suppressing a decrease in serine protease activity, and are particularly suitable for mass production. Therefore, it is most preferable to use Escherichia coli. In addition, the polynucleotide to be introduced into the recombinant vector is preferably a second polynucleotide containing a polynucleotide encoding the labeled peptide, since the purification step is easy.
[0028]
The purification step is a step of purifying the polypeptide produced by the transformant using a separation and purification technique such as chromatography. In this purification step, any separation and purification technique capable of efficiently purifying the polypeptide produced by the transformant is applied, but the proteolysis is carried out using affinity chromatography that specifically binds to the labeled peptide. Most preferably, the enzyme is purified. In addition, after purifying the polypeptide produced by the transformant, an operation of separating the labeled peptide from the polypeptide and isolating only the proteolytic enzyme may be performed.
[0029]
Examples of the medicament of the embodiment include an antithrombotic drug used for prevention or treatment of thrombosis such as cerebral thrombosis and myocardial infarction, or an infectious disease therapeutic drug for treating an infection caused by Trichinella spiralis.
[0030]
The antithrombotic drug prevents or treats thrombosis by utilizing the thrombolytic action of the proteolytic enzyme by the serine protease activity. The antithrombotic agent is produced by the method for producing the first or second polynucleotide (PN1, PN2, PN3, PN1 +, PN2 + or PN3 +), the first or second polypeptide, or the proteolytic enzyme. Proteolytic enzyme as an active ingredient.
[0031]
The therapeutic agent for infectious diseases is intended to treat infectious diseases caused by Trichinella spiralis by suppressing the expression of the proteolytic enzyme or inhibiting the activity of the proteolytic enzyme. The therapeutic agent for infectious disease comprises antisense DNA or antisense RNA against the first, second or third polynucleotide (PN1, PN2, PN3, PN1 +, PN2 +, PN3 +, PN1p, PN2p or PN3p), or An antibody against the first, second or third polypeptide is contained as an active ingredient. Examples of the antibody include a polyclonal antibody and a monoclonal antibody. Said monoclonal antibodies can be easily and massively supplied by hybridomas.
[0032]
Examples of the test kit of the embodiment include a diagnostic kit for testing (diagnosing) whether or not humans and domestic animals suffer from trichinellosis, or a food for performing a food test on meat or processed meat products. Test kits. These test kits are used for diagnosis or food testing by testing the presence or absence of proteolytic enzymes produced by Trichinella spiralis in test samples collected from humans, livestock, meat, processed meat products, and the like. Is what you do. Examples of these test kits include a genetic test kit and a protein test kit.
[0033]
The genetic test kit uses the first, second or third polynucleotide (PN1, PN2, PN3, PN1 +, PN2 +, PN3 +, PN1p, PN2p or PN3p), preferably the third polynucleotide as a detection probe Is what you do. Known test techniques such as DNA chip, Southern hybridization, Northern hybridization, and in situ hybridization are applied to the gene test kit, and the DNA chip is most suitably applied because the test can be performed quickly and easily. You.
[0034]
The protein test kit uses the first, second or third polypeptide (human or livestock serum is used as a test sample) or an antibody against the polypeptide as a detection tool. Known test techniques such as immunoprecipitation, double-diffusion in gel, immunoelectrophoresis, quantitative precipitation, radioimmunoassay, enzyme immunoassay, western blotting, and protein chip are applied to this protein test kit. In addition, the protein chip is most suitably applied because the test can be performed quickly and easily.
[0035]
The effects exerted by the above embodiment will be described below.
-The polynucleotide of the embodiment is provided based on a novel nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 cloned from Trichinella spiralis. Since the first and second polynucleotides (PN1, PN2, PN3, PN1 +, PN2 + and PN3 +) each encode a (first or second) polypeptide having serine protease activity, thrombolysis It is highly likely to exert its effect and can be used as an antithrombotic agent for the prevention and treatment of thrombosis. In particular, since these first and second polypeptides are expected to have a novel serine protease activity with novel substrate specificity, they will be useful for research and development of drug discovery aimed at preventing or treating thrombosis. Can be.
[0036]
On the other hand, the third polynucleotide (PN1 +, PN2 +, or PN3 +) can be suitably used for an infectious disease therapeutic drug such as antisense DNA, antisense RNA, a DNA chip, a test probe, or a test kit. Similarly, the third polypeptide can be suitably used for an antibody preparation or a test kit such as a protein chip. Therefore, these third polynucleotides and polypeptides can easily suppress the spread of infectious diseases by using them for early detection, effective treatment and prevention of infectious diseases caused by Trichinella spiralis.
[0037]
-The recombinant vector of the embodiment is integrated so that the first, second or third polynucleotide (PN1, PN2, PN3, PN1 +, PN2 +, PN3 +, PN1p, PN2p or PN3p) can be expressed. It is. The transformant of the embodiment is one into which the recombinant vector has been introduced. Since these recombinant vectors and transformants are remarkably suitable for mass-producing the first, second or third polynucleotide, and the polypeptide encoded by the polynucleotide, pharmaceuticals and test kits And other raw materials can be provided easily and in large quantities. Also, handling and storage are extremely easy.
[0038]
【Example】
Hereinafter, examples and comparative examples that embody the above embodiment will be described.
<Identification of proteolytic enzymes>
Muscle larvae were collected from mice 30 days after infection with Trichinella spiralis (ISS413), and mRNA was extracted. Subsequently, the mRNA was incorporated into a λZAPII vector (manufactured by Stratagene) using a Timesaver cDNA synthesis kit (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), and the resulting DNA was packaged into a Gigapack Gold III packaging package. (200,000 plaques). Details of how to make this library are described in Nagano, I .; et. al. See Parasitology 123: 77-83.
[0039]
Next, 11 positive clones were obtained by screening the cDNA library with anti-Trichinella spiralis serum collected from BALB / c mice infected with 300 larvae of Trichinella spiralis for 2 months. This screening method is described in Sambrook, J .; et. al. A laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. p. Performed according to 12.1-12.44. These positive clones were integrated into a plasmid by in vivo excision, introduced into an E. coli SOLR strain, and sequenced with an automatic sequencer and DNASIS software (Hitachi software engineering) to determine the nucleotide sequence.
[0040]
Homology search for these nucleotide sequences and their amino acid sequences revealed that one clone, Ts23-2, had a novel sequence. This clone consisted of a full-length 1445 bp nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1. Furthermore, the homology search revealed that this clone appeared to be a proteolytic enzyme having serine protease activity.
[0041]
<Expression and purification of recombinant protein>
An EcoRI fragment was cut out from the plasmid into which the clone Ts23-2 had been inserted, subcloned into a pTrcHis expression vector (manufactured by Invitrogen) to prepare a recombinant vector, and then introduced into Escherichia coli DH5α strain. IPTG (isopropyl β-D-thiogalactopyranaside) was added to the E. coli culture solution at a final concentration of 1 mM, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 3 hours. The Escherichia coli was collected and disrupted by sonication in a 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), and urea was added to the buffer to a final concentration of 6 M to solubilize the His-Trap kit (Amersham). A histidine-labeled protein was adsorbed on a column packed with Pharmacia Biotech).
[0042]
Next, Colangeli, R.A. et. al. Journal of Chromatography. B, The column was slowly washed with a buffer in which urea was gradually diluted according to the method of Biomedical sciences and applications 714: 223-235, and then the histidine-labeled protein was eluted using an eluate containing 500 mM imidazole. Eluted. The imidazole in this eluate was removed using a PD-10 (Amersham Pharmacia Biotech) column to obtain a polyhistidine-labeled recombinant protein. It was confirmed that this protein caused an immunoprecipitation reaction by the anti-Trichinella spiralis serum and further reacted specifically with the antiserum by Western blotting.
[0043]
<Expression and purification of active domain>
A PCR product was obtained by performing a PCR reaction on the plasmid incorporating the clone Ts23-2 with a pair of PCR primers consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5. This PCR product is a polynucleotide consisting of a sequence from the 82nd to 843rd bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (from Gln at position 28 to Ile at position 281 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1). Next, the PCR product was excised with BamHI and EcoRI, inserted into a thioredoxin (TRX) -labeled expression vector pET-32 (manufactured by Novagen Inc.) to prepare a recombinant vector, and then E. coli AD494 (DE3) pLysS strain ( Novagene Inc.). IPTG was added to the culture solution of E. coli at a final concentration of 1 mM, and the mixture was incubated at 20 ° C. for 18 hours.
[0044]
The Escherichia coli was collected, sonicated in a 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), disrupted, and the centrifuged supernatant was added to a His Trap Chelating HP column to add the TRX fusion protein to the column. Adsorbed. Next, the TRX-labeled protein was eluted from the column with an eluate containing 500 mM imidazole. The TRX-labeled recombinant protein was obtained by removing imidazole from the eluate by a PD-10 column. The purity of this protein was determined by SDS gel electrophoresis, and it was confirmed that the target protein was obtained with high purity.
[0045]
<Protease activity of active domain>
The protease activity of the polyhistidine-labeled recombinant protein (Ts23-2) and the TRX-labeled recombinant protein was verified using a synthetic peptide as a serine protease activity substrate and a protease activity inhibitor. As controls, TRX recombinant protein (Novagen) and trypsin having a serine protease activity (Trypsin, Sigma Chemical Co.) were used.
[0046]
(Measurement of serine protease activity)
Synthetic peptide (Substrate) is made by Peptide Institute L-pyroglutamyl-Glycyl-L-Arginine-4-Methyl-Coumaryl-7-Amide (Pyr-Gly-Arg-MCA), Succinyl-L-Leucyl-L-Leucyl -L-Valyl-L-Tyrosine-4-Methyl-Coumalyl-7-Amide (Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA), Succinyl-L-Alanyl-L-Alanyl-L-Alanine-4-Methyl- Couamyl-7-Amide (Suc-Ala-Ala-Ala-MCA), t-Butyloxycarbonyl-L-Glutamyl-L-Lysyl-L-Lysine- -Methyl-Couamaryl-7-Amide (Boc-Glu-Lys-Lys-MCA), t-Butyloxycarbonyl-L-Glutaminyl-L-Alanyl-L-Arginine-4-Methyl-Co-amyl-Am-n-Amyl-Am-N-Amyl-Am-N-Amyl-Amyl-Amyl-Amyl-Amyl-Amyl-Amyl-Amyl-Amyl-Amyl-Amyl-Amyl-Amyl-Amyl-Amyl-Amyl-Amyl-Amyl-Amyl-Amyl-Amyl-Amyl-Amyl-Amyl-Amyl-Amyl-Amyl-Amyl-Amyl-Amyl-Amyl-Amyl-Amyl-Amyl-Amyl-Amyl-Amyl-Amyl-Amyl-Amyl Ala-Arg-MCA), t-Butyloxycarbonyl-L-Valyl-L-Leucyl-L-Lysine-4-Methyl-Coumaryl-7-Amide (Boc-Val-Leu-Lys-MCA), t-Lubylony Of Valyl-L-Prolyl-L-Arginine-4-Methyl-Coumaryl-7-Amide (Boc-Val-Pro-Arg-MCA) Type was used.
[0047]
20 μl of a 50 ng / μl recombinant protein solution, 100 mM Tris-HCl buffer (1 mM CaCl 2 ₂ , 50 mM NaCl, (pH 8.0)) and a synthetic peptide having a final concentration of 100 μM, and then incubated at 37 ° C. for 16 hours. Next, the amount of hydrolysis of MCA (enzymatic activity) was quantified by exciting with a microplate fluoroleader (manufactured by TECAN) at a wavelength of 360 nm and measuring the fluorescence intensity at a wavelength of 465 nm. At this time, all the measurement results were properly corrected using the measurement results obtained when non-enzymatic hydrolysis was performed using an appropriate blank test. Table 1 shows the results. In addition, each data shown in Table 1 shows the fluorescence intensity (× 10 ^-2 ) Are shown. In addition, the recombinant protein Ts23-2 and the TRX-labeled recombinant protein were tested at a final concentration of 5 μg / ml, and trypsin was tested at a final concentration of 0.2 μg / ml.
[0048]
[Table 1]

(Inhibition test with protease activity inhibitor)
Protease activity inhibitors (inhibitors) are trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido- (4-guanidino) butane (E-64, 5 μM) and 4- (2-aminoethylsulfonic acid-sulfonic acid (200 μF). 50 μM), pepstatin (10 μM), 1,10-phenanthroline (1 mM). Were used. TRX-labeled recombinant protein (1 μg), 100 mM Tris-HCl buffer (1 mM CaCl 2) ₂ , 50 mM NaCl (pH 8.0)) and a protease activity inhibitor were mixed to a final concentration in parentheses above, and incubated at 37 ° C. for 10 minutes. Next, after adding a synthetic peptide Pyr-Gly-Arg-MCA as a substrate, incubation was continued for 16 hours. The measurement of the enzyme activity was performed in the same manner as the measurement of the serine protease activity. The inhibitory effect of each protease activity inhibitor was represented by the ratio (% inhibition) of the protease activity of the TRX-labeled recombinant protein to a blank test without the inhibitor. Table 2 shows the results. In addition, each data shown in Table 2 shows the fluorescence intensity (× 10 ^-2 ) Are shown.
[0049]
[Table 2]

From the above results, it was confirmed that both the polyhistidine-labeled recombinant protein Ts23-2 and the TRX-labeled recombinant protein exhibited peptidase activity and serine protease activity. Further, although the existence of a specific substrate is still unknown, it is extremely likely to exert a serine proteinase activity. Therefore, it was shown that these recombinant proteins can be mass-produced by expressing them in Escherichia coli while retaining the enzyme activity. Further, when the optimum pH of the polyhistidine-labeled recombinant protein Ts23-2 was examined, it was also confirmed that the optimum pH was about 8.0.
[0050]
Further, technical ideas that can be grasped from the embodiment will be described below.
-A polynucleotide consisting of the nucleotide sequence from position 82 to position 1263 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a nucleotide sequence substantially identical to the sequence. A polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of positions 82 to 843 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a nucleotide sequence substantially identical to the sequence. With this configuration, serine protease activity having high substrate specificity can be easily used.
[0051]
A polypeptide encoded by the polynucleotide according to claim 1 or 2, wherein the polypeptide has serine protease activity.
[0052]
-A polypeptide encoded by the polynucleotide of claim 3. A recombinant vector into which the polynucleotide according to claim 3 has been expressed. A transformant into which a recombinant vector into which the polynucleotide according to claim 3 has been expressed has been introduced.
[0053]
In this specification, the term "polynucleotide" refers to one consisting of 10 or more nucleotides, and the term "polypeptide" refers to one consisting of 10 or more amino acids.
[0054]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, the following effects can be obtained.
According to the polynucleotide of the first and second aspects of the present invention, serine protease activity having high substrate specificity can be easily used. According to the polynucleotide of the third aspect of the present invention, the spread of infectious diseases caused by Trichinella spiralis can be easily suppressed.
[0055]
According to the polypeptide of the invention described in claim 4, serine protease activity having high substrate specificity can be easily used.
According to the recombinant vector of the invention described in claims 5 and 6, serine protease activity having high substrate specificity can be easily utilized.
[0056]
According to the transformant of the invention described in claim 7, serine protease activity having high substrate specificity can be easily used.
According to the method for producing a proteolytic enzyme of the invention described in claim 8, a proteolytic enzyme having a serine protease activity with high substrate specificity can be easily produced.
[0057]
According to the pharmaceutical product of the ninth aspect, it can be used for the treatment of thrombosis by utilizing the serine protease activity having high substrate specificity. According to the medicament of the tenth aspect, the spread of infectious diseases caused by Trichinella spiralis can be easily suppressed.
[0058]
According to the test kit of the invention described in claim 11, the spread of an infection caused by Trichinella spiralis can be easily suppressed.
[0059]
[Sequence list]

Claims

A polynucleotide comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 3, or a nucleotide sequence substantially identical to the sequence.

A polynucleotide comprising the nucleotide sequence of the polynucleotide according to claim 1.

A polynucleotide comprising a part of the nucleotide sequence of the polynucleotide according to claim 1.

A polypeptide encoded by the polynucleotide according to claim 1 or 2.

A recombinant vector, wherein the polynucleotide according to claim 1 or 2 is incorporated so as to be capable of expression.

The recombinant vector according to claim 5, wherein a nucleotide encoding a labeling peptide is incorporated at the end of the open reading frame of the polynucleotide.

A transformant transformed by introducing the recombinant vector according to claim 5 or 6.

A method for producing a proteolytic enzyme,
A method for producing a proteolytic enzyme, comprising growing the transformant according to claim 7, and then purifying the polypeptide according to claim 4 from the transformant.

It comprises the polynucleotide according to claim 1 or 2, the polypeptide according to claim 4, or the proteolytic enzyme produced by the method for producing the proteolytic enzyme according to claim 8. Pharmaceuticals.

A polynucleotide comprising the polynucleotide according to any one of claims 1 to 3, an antibody against a polypeptide encoded by the polynucleotide according to claim 3, or an antibody against the polypeptide according to claim 4. Pharmaceuticals characterized by.

The polynucleotide according to any one of claims 1 to 3, a polypeptide encoded by the polynucleotide according to claim 3, or an antibody against the polypeptide, or the polypeptide according to claim 4, or a polypeptide thereof. A test kit comprising an antibody against the polypeptide.