JP2004226176A - Compound(phospholamban deactivator) for inactivating phospholamban function to ca-atpase - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To identify or design a phospholamban deactivator. <P>SOLUTION: The cytoplasm sol domain of phospholamban (PLB) and the three-dimensional structure of the active site are determined from NMR data having fully high resolution for determining the three-dimensional structure. A computer-readable medium is provided for analysis by a computer system having an appropriate computer algorithm. A logical drug design for enabling the design of the phopholamban deactivator is constructed, based on the use of the three-dimensional structure data. The phospholamban deactivator is useful for treating a disease for possibly reducing Ca-pump activity in Ca-ATPase, such as a congestive heart disease. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO&NCIPI

Description

【００１７】
（Ｘは、好ましくはＴｙｒまたはＡｌａである）
を有する。
【００１８】
ＸがＴｙｒである式（ｐＩ）の環状ペプチドは、ｃＰ２２６と命名された。ＰＬＢのリガンド結合部位を決定するために、ｃＰ２２６の三次構造をＮＭＲ分光法により解析した。使用した方法は実施例２に詳細に記述している。ｃＰ２２６の三次元構造は、ベンド−コイル−ベンド モチーフを示している。Ｔｒｙ−３、Ｌｅｕ−５、Ｔｒｐ−７およびＬｅｕ−８の親油性側鎖は、環状ペプチドの一方側にクラスターをなしている。環状ペプチドｃＰ２２６の三次元座標は、本明細書に添付した表Ｉに提示されている。
【００１９】
複合体ｃＰ２２６・ＰＬＢ（１〜３６）の構造
ＰＬＢ（１〜３６）とそのリガンドであるｃＰ２２６の解析した三次構造を基礎にして、分子モデリングにより複合体ｃＰ２２６・ＰＬＢ（１〜３６）のモデルを調製することが可能であった。その三次元モデルはＰＬＢ（１〜３６）とそのリガンドとの相互作用を記述しており、その相互作用はＰＬＢの細胞質ゾルドメインへのリガンドの結合において重要である。
【００２０】
ＰＬＢ（１〜３６）とｃＰ２２６とのＮＭＲで解析された構造を、複合体の構築に対するテンプレートとして用いた。ｃＰ２２６は、分子グラフィック法の助けにより相互作用的に結合され （ｄｏｃｋｅｄ）、２個のペプチド間の起こり得る相互作用により導かれた。ｃＰ２２６の構造は、そのペプチドが一方の側面に２個の負荷電の側鎖（Ｇｌｕ−４およびＧｌｕ−６）を有し、他方の側面が疎水性である（Ｔｒｐ−７、Ｌｅｕ−８およびＰｒｏ−９）ことを示している（図２）。ＰＬＢ（１〜３６）において、Ｃ−末端ヘリックスの主に疎水性の表面（たとえば、Ｌｅｕ−２８、Ｌｅｕ−３１、Ｐｈｅ−３２、Ｐｈｅ−３５）により相対している３個の正に荷電した側鎖（Ａｒｇ−９、Ａｒｇ−１３、Ａｒｇ−１４）のクラスターがある（図３）。ｃＰ２２６は、Ｇｌｕ−４およびＧｌｕ−６がＡｒｇ−９、Ａｒｇ−１３およびＡｒｇ−１４と接触するようにし、同時にＴｒｐ−７，Ｌｅｕ−８およびＰｒｏ−９がＰＢＬ Ｃ−末端ヘリックスの疎水性表面近くになるように、ＰＬＢ（１〜３６）上に手動で結合させた（ｄｏｃｋｅｄ）。これは複合体のエネルギー精密化の出発点を与えた。
【００２１】
得られた複合体のエネルギーは、一般的な荷電力場（ｇｖｆｆ９３）を用いるインサイトＩＩにより最小化した。大まかな最少化は、最急勾配法ついで共役勾配法およびニュートン法により行なった。
【００２２】
エネルギー最少化複合体ｃＰ２２６・ＰＬＢ（１〜３６）の構造を図４に示す。複合体の最終の全エネルギーは１１３ｋｃａｌ／ｍｏｌ（非結合分散エネルギー −１５７４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、クーロンエネルギー −６９０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）であった。
【００２３】
ｃＰ２２６のＰＬＢに対する結合様式の模式図を、図５に示す。該結合は、Ｇｌｕ−４、Ｇｌｕ−６、Ｔｒｐ−７およびＰｒｏ−９をそれぞれ結合する４個の結合部位（Ｓ１〜Ｓ４）により記述し得る（表ＩＩ、図６）。Ｇｌｕ−４はＴｙｒ−６、Ａｒｇ−９およびＡｒｇ−１３（Ｓ１）と静電的／Ｈ−結合相互作用を有し、Ｇｌｕ−６はＡｒｇ−１４（Ｓ２）と結合し、Ｔｒｐ−７は、おもにＭｅｔ−２０、Ｌｙｓ−２７およびＬｅｕ−２８によって形成される疎水性ポケット（Ｓ３）の中に埋まり、Ｐｒｏ−９はおもにＰｈｅ−３２およびＰｈｅ−３５により形成される疎水性の間隙（Ｓ４）に結合する。さらに、Ｌｅｕ−５はＡｒｇ−１３の側鎖の疎水性部分によって裏打ちされており、Ｔｒｙ−７のインドールのＮＨはＡｒｇ−１３のカルボニルとＨ−結合を形成し得る。正に荷電したＮ−末端アミノ基（ＮＨ_３ ^＋）は、疎水性結合部位Ｓ４の近くにある。
【００２４】
【表１】

【００２５】
したがって、用語「結合部位Ｓ１」は、アミノ酸残基Ｔｙｒ−６、Ａｒｇ−９および／またはＡｒｇ−１３、とくにＴｙｒ−６の−ＯＨ基、Ａｒｇ−９のグアニジニウム基および／またはＡｒｇ−１３のグアニジニウム基により囲まれた空間として定義される。
【００２６】
用語「結合部位Ｓ２」は、アミノ酸残基Ａｒｇ−１４、とくにＡｒｇ−１４のグアニジニウム基により囲まれた空間として定義される。
【００２７】
用語「結合部位Ｓ３」は、アミノ酸残基Ｍｅｔ−２０、Ｌｙｓ−２７および／またはＬｅｕ−２８、とくにそれらの側鎖により囲まれた空間として定義される。
【００２８】
用語「結合部位Ｓ４」は、アミノ酸残基Ｐｈｅ−３２および／またはＰｈｅ−３５、とくにそれらのフェニル基により囲まれた空間として定義される。
【００２９】
環状ペプチドｃＰ２２６の結合を許容するコンホメーションでのホスホランバン（１〜３６）の三次元原子座標は、本明細書に添付される表ＩＩＩに開示されている。ホスホランバン（１〜３６）と環状ペプチドｃＰ２２６とのあいだの複合体の三次元原子座標は、本明細書に添付される表ＩＶに記載されている。図８は本発明の方法によってデザインされた１つの化合物をＰＬＢ構造上に重ね合わせた説明図である。
【００３０】
論理的ドラッグデザイン
構造決定方法もＰＬＢリガンドの論理的ドラッグデザインのために本発明により提供される。このようなドラッグデザインは、ＰＬＢの決定された結合部位または他の構造的もしくは機能的なドメインと相互作用すると期待される種々の分子の構造を計算するコンピューターモデリングプログラムを用いる。ついで、これらの分子を製造し、本発明の方法にしたがってＰＬＢを不活性化する活性に対してスクリーニングする。
【００３１】
本発明は、今まで知られていないＰＬＢ細胞質ゾルドメインのリガンド結合部位を表わしており、原子のはっきりした三次元配列からなる。ＰＬＢ不活性化剤のＰＬＢ細胞質ゾルドメインへの結合を許容するコンホメーションにおけるＰＬＢ（１〜３６）の原子座標が表ＩＩＩに開示されている。この構造は、高い活性をもつＰＬＢ不活性化剤の構造ベースのデザインを始めて可能にする。本明細書に提供されているＰＬＢ細胞質ゾルドメインの構造は、コンピュータ化された評価システムの使用により、既知化合物のスクリーニングやＰＬＢ細胞質ゾルドメインのリガンド結合部位に結合する新規分子のデザインを可能にする。たとえば、コンピュータ−モデリングシステムが利用される。そのシステムにおいては、表ＩＩＩで提供されているような、ＰＬＢ細胞質ゾルドメインとそのリガンド結合部位の原子座標が入力データとして使用され得る。したがって、本方法においては、コンピュータ可読媒体が表ＩＩＩの座標を表わしているデータで記号化されていてもよい。
【００３２】
したがって、本発明はホスホランバン不活性化剤を同定またはデザインするための方法を提供するものであって、該方法は：
（ｉ）ホスホランバンの細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の三次元構造を定義する原子座標を提供し、
（ｉｉ）三次元構造を採用して三次元構造の結合部位と相互作用することができるか、または三次元構造の結合部位と良好な立体的および静電気的相補性を有する候補分子を選択し、そして
（ｉｉｉ）潜在的ホスホランバン不活性化剤としての選択された候補分子を同定し、ついで潜在的ホスホランバン不活性化剤を合成し、そしてホスホランバン不活性化剤として機能する能力について試験することからなる。
【００３３】
他の側面では、本発明はホスホランバン不活性化剤を同定する方法を提供するものであって、該方法は：
（ｉ）ホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部位の三次元構造を定義する第一のコンピュータ可読データセットを提供し、
（ｉｉ）第一のコンピュータ可読データセットを候補分子の構造を定義する第二のコンピュータ可読データセットと組み合わせ、
（ｉｉｉ）ホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の少なくとも３つの結合部位と相互作用する候補分子の能力を評価し、ここで、該結合部位はホスホランバン細胞質ゾルドメインのＳ１結合部位、Ｓ２結合部位、Ｓ３結合部位およびＳ４結合部位からなる群から選択され、
（ｉｖ）ホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の少なくとも３つの結合部位と好適に相互作用する候補分子を選択し、そして
（ｖ）該候補分子を潜在的ホスホランバン不活性化剤として同定し、ついで潜在的ホスホランバン不活性化剤を合成し、そしてホスホランバン不活性化剤として機能する能力について試験することからなる。
【００３４】
他の側面において、本発明は、ホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分に結合することができる化合物を化学構造のデータベースから選択する方法を提供するものであって、該方法は：
（ｉ）ホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の三次元構造を定義する原子座標を提供し、
（ｉｉ）ホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の少なくとも３つの結合部位における１つ以上の官能基の相互作用の適合性を評価し、
（ｉｉｉ）化学構造のデータベースから、おのおのの化合物がホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の少なくとも３つの結合部位との好ましい相互作用を有する前工程で評価された１つ以上の官能基を有する１つ以上の化合物の第一セットを選択し、そして
（ｉｖ）第一の化合物セットから、ホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の三次元構造の少なくとも３つの結合部位との相互作用の最適な適合性を有する構造の第二の化合物を選択することからなる。
【００３５】
好ましくは、原子座標は、当該分野でよく知られているいずれかのコンピュータ化されたモデリングシステムで提供される。
【００３６】
一般に、本発明はまた、ホスホランバン不活性化剤をデザインする方法を提供するものであって、該方法は：
（ｉ）コンピュータ化されたモデリングシステムで、ホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の三次元構造を定義する原子座標を提供し、そして
（ｉｉ）該原子座標を使用してホスホランバン不活性化剤候補分子をデサインすることからなる。
【００３７】
また、本方法は標準のコンピュータ支援分子デザイン技術を用いて好適に実行される。本デザイン工程は好適には、
（ｉｉａ）ホスホランバン不活性化剤候補分子の結合のための領域として機能する、ホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の表面における標的領域を選択し、
（ｉｉｂ）該標的領域と会合することができる１つ以上の分子または断片を選択し、
（ｉｉｃ）コンピュータソフトウェアプログラムを用い、標的領域に分子または断片の三次元構造を適合させ、そして
（ｉｉｄ）コンピュータソフトウェアプログラムから得られる結果を使用して標的領域と好ましい立体的または静電気的相互作用を有する分子またはその断片を同定することからなる。
【００３８】
本方法はさらに、
（ｉｉｅ）ホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分と好ましい立体的および静電気的相互作用を有する分子またはその断片を合成する段階、および
（ｉｉｆ）該分子またはその断片を、ホスホランバンを不活性化する能力について試験する段階からなる。
【００３９】
また、前記デザイン工程は、
（ｉｉｅ′）ホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の標的領域と好ましい立体的または静電気的相互作用を有する１つ以上の小さい分子またはその断片を一緒に架橋して単一のより大きな分子を作製する工程、および（ｉｉｆ′）該単一のより大きな分子を、ホスホランバンを不活性化する能力について試験する工程からなっていてもよい。
【００４０】
そのデザイン工程は、あるいは、
（ｉｉａａ）対話型分子グラフィックスシステムを使用して、分子足場をホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の標的領域に適合させる工程、および
（ｉｉｂｂ）官能基またはその断片を分子足場に加えて、標的領域と好ましい立体的または静電気的相互作用を有する、単一のより大きな分子を作製する工程からなっていてもよい。
【００４１】
前記方法で用いられる三次元構造はホスホランバン不活性化剤と複合体を形成したホスホランバン細胞質ゾルドメインの三次元構造であり、とくに結合部位Ｓ１〜Ｓ４および／またはその近傍における三次元構造であるのが好ましい。
【００４２】
前記方法はすべて、さらに潜在的ホスホランバン不活性化剤を合成し、そして合成した潜在的ホスホランバン不活性化剤を、実施例３に詳細に記載されているように、またはその変形でホスホランバンの存在下にＣａＡＴＰａｓｅの活性化について試験することからなっていてもよい。
【００４３】
本発明はまた、ＰＬＢ不活性化剤のＰＬＢ細胞質ゾルドメインへの結合を許容するコンホメーションにおけるＰＬＢ細胞質ゾルドメインまたはその部分の構造の原子座標を保存したコンピュータ可読媒体を提供する。
【００４４】
本明細書において使用されているように、「コンピュータ可読媒体」はコンピュータにより直接読まれまたアクセスされ得るいかなる媒体も意味する。このような媒体としては、限定されるものではないが、たとえば、フロッピィーディスク、ハードディスク保存媒体、磁性テープのような磁性保存媒体；光学ディスクまたはＣＤ−ＲＯＭのような光学保存媒体；ＲＡＭおよびＲＯＭのような電子保存媒体；磁性／光学保存媒体のようなこれらカテゴリーの混成物などがあげられる。熟練技術者であれば、ＰＬＢの構造の原子座標を保存したコンピュータ可読媒体からなる製品を作るのに、現在知られているコンピュータ可読媒体をどのように使用し得るのか容易に評価できる。データ保存構造の選択は、一般に、保存される情報にアクセスするのに選択される手段に基づいている。コンピュータ可読媒体に本発明の原子座標データを保存するために、種々のデータ処理プログラムおよびフォーマットが使用され得る。
【００４５】
ＰＬＢの構造の原子座標データを保存したコンピュータ可読媒体を提供することにより、熟練技術者であればＰＬＢ細胞質ゾルドメインまたはその一部分の構造の原子座標データに日常的にアクセスできる。コンピュータ可読媒体に与えられているこのデータに熟練技術者がアクセスし、そして構造決定および／または論理的ドラッグデザインのためにそれを分析することを許容するコンピュータアルゴリズムは、公におよび市場で入手できる。たとえば、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ， Ｍａｒｙ Ａｎｎ Ｌｉｅｂｅｒｔ Ｐｕｂｌ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９５）を参照。
【００４６】
表ＩＩＩで表わされるＰＬＢ（１〜３６）の構造的原子座標は、三次元形状のようなディスプレイのために、またはそれらが規定する構造座標のコンピュータ支援操作などの他の用途のために、コンピュータ可読保存媒体上に、コンピュータ可読形式で保存され得る。たとえば、ＰＬＢ細胞質ゾルドメインまたはその部分の三次元構造を定義するデータは、コンピュータ可読保存媒体に保存され、また典型的には、該保存媒体からデータを読むことができ、かつこのようなデータから表示を作り出すための指示でプログラムされたコンピュータを使用して、タンパク質構造のグラフィック的な三次元表示としてディスプレイされ得る。したがって、本発明は、追加的な任意のデータおよびそのようなデータを操作するための指示と共に、本発明のＰＬＢタンパク質の構造座標、たとえば表ＩＩＩで表わされるような座標を表わしているデータを含んでいるメモリーを有する、コンピュータのような機械をも包含する。このようなデータは論理的ドラッグデザインのような種々の目的に使用され得る。本発明は、表ＩＩＩの座標、ならびに内部座標を維持する、すなわち内在的な内部関連を維持するそれらの変形（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）またはローテーション（ｒｏｔａｔｉｏｎ）なども包含する。当業者であれば、座標が、たとえば、動的シミュレーション、最小化などのような分子メカニズム計算を含む他のトランスフォーメーションを受けてもよいことを理解するであろう。
【００４７】
たとえば、ＰＬＢ細胞質ゾルドメインまたはその部分の三次元構造を定義する第一のコンピュータ可読データセットは、ＰＬＢ細胞質ゾルドメインタンパク質に会合する候補分子の能力、および／またはそのような会合の位置および／または方向性を評価するための指示と共にプログラムされたコンピュータを使用して、候補分子の構造を定義する第二のコンピュータ可読データセットと組み合わされる。
【００４８】
データによりコード化されたタンパク質構造は、候補分子との構造会合の視覚的検分のみならず、構造の視覚的検分を許容するグラフィック的なフォーマットで表示され得る。また、より定量的な計算法を使用し得る。たとえば、候補分子のＰＬＢ細胞質ゾルドメインとの会合能力を評価するための本発明の１つの方法は、ｉ）候補分子とＰＬＢの結合部位とのあいだの適合操作を実行する計算手段を採用する段階、およびｉｉ）適合操作の結果を分析して候補分子とＰＬＢの結合部位とのあいだの会合を定量する段階からなる。
【００４９】
本発明の１つの方法は、化学構造のデータベースからＰＬＢ細胞質ゾルドメインに結合することができる化合物を選択するために提供される。本方法はＰＬＢ細胞質ゾルドメインまたはその部分の三次元構造を定義する構造座標から始まる。その三次元構造の結合部位は１つ以上の官能基との相互作用の適合性に関して特徴づけられる。化学構造のデータベースはついで、先の特徴づけに基づいて、ＰＬＢとの好ましい相互作用のために配置されている官能基を含む候補化合物を求めて調査される。このようにして、三次元構造との好ましい相互作用のポイントに最も適合する構造を有する化合物が同定される。
【００５０】
三次元構造を見るための、または原子座標を操作ためのコンピュータプログラムは入手可能であり、当業者によく知られている。
【００５１】
ホスホランバン不活性化化合物
本発明は、ＰＬＢ細胞質ゾルドメインの４つの結合部位Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３およびＳ４の少なくとも３つと会合し得る化合物を提供する。このような化合物はホスホランバン不活性化能を有することがわかる。とくに、本発明は、以下のうち少なくともいずれか３つからなるホスホランバン不活性化化合物を提供する。
（ａ）不活性化剤がＰＬＢ細胞質ゾルドメインに結合する際、Ｔｒｙ−６、Ａｒｇ−９および／またはＡｒｇ−１３からなるＳ１結合部位と会合し得る第一電気陰性部分、
（ｂ）不活性化剤がＰＬＢ細胞質ゾルドメインに結合する際、Ａｒｇ−１４からなるＳ２結合部位と会合し得る第二電気陰性部分、
（ｃ）不活性化剤がＰＬＢ細胞質ゾルドメインに結合する際、Ｍｅｔ−２０、Ｌｙｓ−２７および／またはＬｅｕ−２８からなるＳ３結合部位と会合し得る第一疎水性部分、および
（ｄ）不活性化剤がＰＬＢ細胞質ゾルドメインに結合する際、Ｐｈｅ−３２および／またはＰｈｅ−３５からなるＳ４結合部位と会合し得る第二疎水性部分。
【００５２】
とくに、本発明は、以下のうち少なくともいずれか３つからなるホスホランバン不活性化化合物を提供する。
（ａ）不活性化剤がＰＬＢ細胞質ゾルドメインに結合する際、ＰＬＢ細胞質ゾルドメインの、Ｔｙｒ−６の−ＯＨ基との水素結合、Ａｒｇ−９のグアニジニウム基との塩橋および／またはＡｒｇ−１３のグアニジニウム基との塩橋を形成することのできる第一電気陰性部分、
（ｂ）不活性化剤がＰＬＢ細胞質ゾルドメインに結合する際、ＰＬＢ細胞質ゾルドメインのＡｒｇ−１４のグアニジニウム基との塩橋を形成することのできる第二電気陰性部分、
（ｃ）不活性化剤がＰＬＢ細胞質ゾルドメインに結合する際、ＰＬＢ細胞質ゾルドメインのＭｅｔ−２０、Ｌｙｓ−２７および／またはＬｅｕ−２８によって作り出される疎水性ポケットと会合することができる第一疎水性部分、および
（ｄ）不活性化剤がＰＬＢ細胞質ゾルドメインに結合する際、ＰＬＢ細胞質ゾルドメインのＰｈｅ−３２および／またはＰｈｅ−３５により作り出される疎水性ポケットと会合することができる第二疎水性部分。
【００５３】
とくに、本発明は、
（ａ）不活性化剤がＰＬＢ細胞質ゾルドメインに結合する際、ＰＬＢ細胞質ゾルドメインの、Ｔｒｙ−６の−ＯＨ基との水素結合、Ａｒｇ−９のグアニジニウム基との塩橋および／またはＡｒｇ−１３のグアニジニウム基との塩橋を形成することのできる第一電気陰性部分；
（ｂ）不活性化剤がＰＬＢ細胞質ゾルドメインに結合する際、ＰＬＢ細胞質ゾルドメインのＡｒｇ−１４のグアニジニウム基との塩橋を形成することのできる第二電気陰性部分；および
（ｃ）不活性化剤がＰＬＢ細胞質ゾルドメインに結合する際、ＰＬＢ細胞質ゾルドメインのＭｅｔ−２０、Ｌｙｓ−２７および／またはＬｅｕ−２８によって作り出される疎水性ポケットと会合することができる第一疎水性部分
からなるホスホランバン不活性化剤を提供する。
【００５４】
したがって、前記で定義されたような４つの同時相互作用（ａ）〜（ｄ）のうち、少なくとも３つは、ＰＬＢ細胞質ゾルドメインと会合でき、そしてＰＬＢ不活性化剤として作用することができる化合物にとって必要であると思われる。
【００５５】
活性部位に関連する幾何次元およびファーマコフォアー（ ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ ）
活性部位Ｓ１〜Ｓ４のいずれかのあいだの距離は、本明細書で提示されている原子座標から測定できる。同様に、所定の結合部分からそれが会合している活性部位までの距離は、これらの原子座標から演繹できる。
【００５６】
少なくとも３つの会合型が生じる。
【００５７】
塩橋は、リガンドの荷電した基がタンパク質の反対に荷電した基によって引き寄せられるときに形成される。逆に荷電した原子間の最適距離は約２．８Åであるが、逆に荷電した基の重心間の距離は、問題とする基の大きさにしたがって変化し得る。
【００５８】
水素結合は、水素原子が電気陰性の原子（水素原子供与体）に結合し、また他の電気陰性原子（水素結合受容体）により引き寄せられるときに形成される。水素結合における２つの電気陰性原子間の距離は、約２．５Åと約３．３Åのあいだである。
【００５９】
疎水性相互作用は、２つの疎水性基がファンデルワールス力で相互に引き寄せられるときに形成される。２つの疎水性基の重心間の距離は、問題とする基の大きさにしたがって変化し得る。
【００６０】
原子座標からの距離測定は、結合部分とその活性部位とのあいだの相互作用に対してつぎの距離幅を示している。疎水性相互作用に対する距離は、疎水性部分の重心からＰＬＢ−タンパク質の骨格原子（カルボニル酸素、アミド窒素、α炭素）までと下記に定義されており、その理由は骨格原子は空間において静置しているからである。
【００６１】
１．第一電気陰性部分
塩橋を形成することによりＰＬＢのＳ１結合部位と会合している第一電気陰性部分は、好ましくは、つぎのようになるように会合する：
ａ）第一電気陰性部分（陰性に荷電している基）の重心からＡｒｇ−９のＣＺ原子までの距離は、約２．３Åと約６．３Åとのあいだである。
ｂ）第一電気陰性部分（陰性に荷電している基）の重心からＡｒｇ−１３のＣＺ原子までの距離は、約１．６Åと約５．６Åとのあいだである。
【００６２】
水素結合を形成することによりＰＬＢのＳ１結合部位と会合している第一電気陰性部分は、好ましくは、つぎのようになるように会合する：
ｃ）第一電気陰性部分の電気陰性原子（水素結合受容体）からＴｙｒ−６のＯＨ原子までの距離は、約２．５Åと約３．３Åとのあいだである。
ｄ）第一電気陰性部分の電気陰性原子（水素結合受容体）からＡｒｇ−９のグアニジニウム窒素のいずれかまでの距離は、約２．５Åと約３．３Åとのあいだである。
ｅ） 第一電気陰性部分の電気陰性原子（水素結合受容体）からＡｒｇ−１３のグアニジニウム窒素のいずれかまでの距離は、約２．５Åと約３．３Åとのあいだである。
【００６３】
２．第二電気陰性部分
塩橋を形成することによりＰＬＢのＳ２結合部位と会合している第二電気陰性部分は、好ましくは、つぎのようになるように会合する：
ａ）第二電気陰性部分（陰性に荷電している基）の重心からＡｒｇ−１４のＣＺ原子までの距離は、約１．５Åと約５．５Åとのあいだである。
【００６４】
水素結合を形成することによりＰＬＢのＳ２結合部位と会合している第二電気陰性部分は、好ましくは、つぎのようになるように会合する：
ｂ）第二電気陰性部分の電気陰性原子（水素結合受容体）からＡｒｇ−１４のグアニジニウム窒素のいずれかまでの距離は、約２．５Åと約３．３Åとのあいだである。
【００６５】
３．第一疎水性部分
ＰＬＢのＳ３結合部位と会合している第一疎水性部分は、好ましくは、つぎのようになるように会合する：
ａ）Ｓ３結合部位における第一疎水性部分の重心からＭｅｔ−２０のアミド窒素までの距離は、約６．０Åと約１２．０Åとのあいだである。
ｂ）Ｓ３結合部位における第一疎水性部分の重心からＬｙｓ−２７のカルボニル酸素までの距離は、約４．４Åと約１０．４Åとのあいだである。
ｃ）Ｓ３結合部位における第一疎水性部分の重心からＬｅｕ−２８のα炭素までの距離は、約２．９Åと約８．９Åとのあいだである。
【００６６】
４．第二疎水性部分
ＰＬＢのＳ４結合部位と会合している第二疎水性部分は、好ましくは、つぎのようになるように会合する：
ａ）Ｓ４結合部位における第二疎水性部分の重心からＰｈｅ−３２のカルボニル酸素までの距離は、約３．６Åと約９．６Åとのあいだである。
ｂ）Ｓ４結合部位における第二疎水性部分の重心からＰｈｅ−３５のアミド窒素までの距離は、約５．６Åと約１１．６Åとのあいだである。
【００６７】
本明細書で開示されている原子座標から作成されるファーマコフォア、すなわち、１つのクラスのＰＬＢ−不活性化剤の三次元定義は、図１３に示されている。それぞれの球は、それぞれの結合部分の重心が複合体中に位置すべき空間を表わし、球の中心は最適位置である。結合部分間の最適距離も与えられている。
【００６８】
図１４において、実施例１２の化合物がどのようにしてファーマコフォアに適しているかが証明されている。Ｓ２〜Ｓ４に相補的であるこれらの結合部分の位置はかなりよく、一方Ｓ１に相補的な結合部分の位置は最適性に劣ると思われ得る。各結合部分の重心の、ＰＬＢ−タンパク質の選択された骨格原子までの距離が以下に与えられている。

【００６９】
これらの値は、前記で与えられた距離幅の定義と比較され得る。さらに、Ｓ２〜Ｓ４に対する結合部分は、定義された範囲内にあるのに対して、Ｓ１に対する結合部分は、定義された範囲の境界付近にある。
【００７０】
本発明によりデザインされたホスホランバン不活性化剤の例は、式（Ｉ）または（ＩＩ）：
【００７１】
【化５】

【００７２】
（式中、Ｒ_１は水素、アルキル、アルケニル、アリール、アリールアルキル、ヒドロキシアルキル、ハロゲンアルキル、アルコキシ、ＣＯＲ_１０、ＣＯＮＲ_１０Ｒ_１１、ＯＲ_１０、Ｓ（Ｏ）_ｍＲ_１０、ＮＲ_１０ＣＯＲ_１１またはＮＲ_１０Ｒ_１１、ここでＲ_１０は水素、アルキル、アルケニル、アリール、アリールアルキル、ヒドロキシアルキル、ハロゲンアルキル、アルコキシまたはヒドロキシ、そしてＲ_１１は水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、ヒドロキシまたはアシル、またはＸがＮＲ_１１の場合、Ｒ_１はカルボキシアルキル、
Ｒ_６は水素、アルキル、アルケニル、アリール、アリールアルキル、
Ｒ_２およびＲ_７は水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、アルケニル、ＣＯＲ_１０、ＣＯＮＲ_１０Ｒ_１１、ハロゲン、トリフルオロメチル、ニトロまたはシアノ、ここでＲ_１０およびＲ_１１は前記と同じ、
Ｒ_３は水素、アルキル、アリールまたはアリールアルキル、Ａは、アルキルまたは置換アルキルを意味し、ｍは０〜２、およびｎは１〜３、ＹはＯ、ＮＲ_１１またはＳ、ここでＲ_１１は前記と同じ、ＸはＯ、ＮＲ_１１またはＳ、ここでＲ_１１は前記と同じ、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_８およびＲ_９は独立して以下の基：
【００７３】
【化６】

【００７４】
の１つ、またはＸがＮＲ_１１の場合、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_８およびＲ_９は独立して、ＨＯＯＣ−、Ｒ_１２ＯＯＣ−、Ｈ_２ＮＣＯ−またはＨＯＨＮＣＯ−、ここでＲ_１２はアルキル、アリールアルキルまたはアリール、そしてここで、それ自身またはほかの基の一部として定義される各アリール残基は置換されていてもよい）で表される化合物、およびその薬学的に許容し得る塩およびエステルを包含するが、それらに限定されるものではない。
【００７５】
式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物は、それらをＰＬＢ細胞質ドメインのリガンド結合部位に結合させ得る構造的特徴を共有し、それにより心臓のＳＲ Ｃａ^２＋−ＡＴＰａｓｅに対するＰＬＢの阻害作用を軽減する。
【００７６】
式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物は、以下のスキーム１にしたがって、１，３−ジヒドロキシ置換へテロ芳香族化合物から、適当なアルキル化剤、たとえばクロロアセトニトリルまたはブロモ酢酸エステルによってジヒドロキシ化合物のアルキル化によって製造され得る。スキーム１において、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、ＸおよびＹは前記と同じであり、Ｒ′は、ヒドロキシル基の保護基、たとえばメチル、ベンジルまたはテトラヒドロピラニルである。
【００７７】
【化７】

【００７８】
前記シアノ化合物（ＩＶ）は、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １９９６， ３９， ５２２８−５２３５に記載された方法を用いて、１，２，４−オキサジアゾールおよび１，２，４−チアジアゾール誘導体を製造するために使用される。
【００７９】
合成はスキーム２に示す。スキーム２においてＲ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、ＸおよびＹは前記とおなじである。
【００８０】
【化８】

【００８１】
置換基Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_８およびＲ_９のような他のヘテロ環は、Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．， １９９４， ４， ４５−５０に記載されたように製造される。
【００８２】
ジヒドロキシ芳香族化合物（ＩＩＩ）は文献の方法の使用により製造される。クマリン（ＸＩＶ）、（ＸＶＩ）および（ＸＸ）は、スキーム３および４に表わすクネーフェナーゲル（Ｋｎｏｅｖｅｎａｇｅｌ）縮合またはフォン ペヒマン（ｖｏｎ Ｐｅｃｈｍａｎｎ）反応の使用により製造される。スキーム３および４において、Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３は前記と同じ、Ｚはアルキル、アリール、アリールアルキルまたはアルケニル、そしてＲ′はヒドロキシル基の保護基、たとえばメチル、ベンジルまたはテトラヒドロピラニルである。
【００８３】
【化９】

【００８４】
【化１０】

【００８５】
キノリノンは、スキーム５に記載されたクノール（Ｋｎｏｒｒ）反応によって製造される。スキーム５において、Ｒ_１、Ｒ_１１およびＲ_３は前記と同じ、Ｘはハロゲンである。
【００８６】
【化１１】

【００８７】
環状化合物（ＩＩ）は、スキーム６にしたがって製造され得る化合物（ＸＸＸＩ）から相応して製造され得る。スキーム６において、Ｒ_２およびＲ_６は前記と同じ、Ｒ′はヒドロキシル基の保護基、たとえばメチル、ベンジルまたはテトラヒドロピラニルである。
【００８８】
【化１２】

【００８９】
環状キノリノン化合物（ＩＩ）はスキーム５を用いて（ＸＸＶＩ）から相応して製造され得る。
【００９０】
これら化合物の塩およびエステルは、適当な場合、既知の方法によって製造され得る。生理学的に許容し得る塩は活性医薬として有用であるが、アルカリ金属またはアルカリ土類金属との塩が好ましい。生理学的に許容し得るエステルもまた、活性医薬として有用である。その例としては、脂肪族アルコールまたは芳香族アルコールとのエステルがあげられる。
【００９１】
本明細書において、それ自身またはそのほかの基の一部として使用される用語「アルキル」は、炭素数１８まで、好ましくは炭素数１から８、最も好ましくは炭素数１から４の直鎖および分岐鎖の双方の基を包含する。本明細書において、それ自身またはそのほかの基の一部として使用される用語「低級アルキル」は、炭素数１から７、好ましくは炭素数１から４、最も好ましくは炭素数１または２の直鎖および分岐鎖の双方の基を包含する。アルキル基および低級アルキル基それぞれの具体例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、デシルおよびドデシル、ならびにそれらのさまざまな分岐鎖異性体があげられる。
【００９２】
本明細書において、それ自身またはそのほかの基の一部として使用される用語「アシル」は、アルキルカルボニル基またはアルケニルカルボニル基をいい、アルキル基およびアルケニル基は前記で定義されている。
【００９３】
本明細書において、それ自身またはそのほかの基の一部として使用される用語「アリール」は、環部分に６から１０の炭素原子を含む単環式または二環式の基をいう。アリール基の具体例としては、フェニル、ナフチルなどがあげられる。「アロイル」は、対応する方法で酸素原子に結合したアリール基を意味する。
【００９４】
本明細書において、それ自身またはそのほかの基の一部として使用される用語「アルコキシ」は、酸素原子に結合した前記と同じアルキル基を包含する。「アリールオキシ」は、対応する方法で酸素に結合したアリール基を意味する。
【００９５】
本明細書において、さまざまな基と関連して使用される用語「置換」は、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素またはトリフルオロメチル基などのハロゲン置換基、アミノ、アルキル、アルコキシ、アリール、アルキルアリール、ハロゲンアリール、シクロアルキル、アルキルシクロアルキル、ヒドロキシ、アルキルアミノ、アルカノイルアミノ、アリールカルボニルアミノ、ニトロ、シアノ、チオールまたはアルキルチオ置換基をいう。
【００９６】
「置換」基は、前記置換基の１から３、好ましくは１または２、最も好ましくは１を含んでもよい。
【００９７】
本発明にしたがってデザインされた化合物は、患者の年齢、体重、状態、投与経路および使用されるホスホランバン不活性化剤によって、通常、１日当たり約０．１から５００ｍｇの範囲にある、治療に効果的な量で患者に投与され得る。本発明にしたがってデザインされた化合物は、当該分野に既知の原理を使用して投薬形態に製剤化され得る。錠剤、糖衣錠、カプセル、座剤、エマルジョン、懸濁液または溶液の形態で、そのまま、または適当な薬学的賦形剤と組み合わせて患者に与えられ得る。組成物の好適な成分の選択は、通常の当業者にとって決まりきったことである。好適な担体、溶液、ゲル化剤、分散化剤、抗酸化剤、着色料、甘味料、湿潤化合物および通常この技術分野で使用されるほかの成分も使用され得ることは明らかである。活性成分を含有する組成物は、経腸的または非経腸的に投与され得るが、経口ルートが最も好ましい方法である。組成物中の活性化合物の含有量は、全組成物の重量に対して、約０．５から１００％、好ましくは約０．５から約２０％である。
【００９８】
以下の実施例は、単に本発明のさまざまな側面の説明として記載されたものであり、本発明を限定することを意図するものではない。
【００９９】
【実施例】
実施例１ ホスホランバンの細胞質ゾルドメインの構造
ホスホランバン（１〜３６）の合成、精製および特徴づけ
アミノ酸配列ＭＥＫＶＱＹＬＴＲＳＡＩＲＲＡＳＴＩＥＭＰＱＱＡＲＱＫＬＱＮＬＦＩＮＦＣを有する、ホスホランバンペプチドの細胞質ゾル部分は、フルオレニルメトキシカルボニル法を用いて自動ペプチド合成装置（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３１Ａ）で合成した。合成は、疎水性Ｃ−末端から開始した。合成中に使用した側鎖の保護基は、Ａｓｎ、ＧｌｎおよびＣｙｓに対してはトリチル（Ｔｒｔ）、Ｇｌｕに対してはｔｅｒｔ−ブトキシ（ＯｔＢｕ）、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＴｙｒに対してはｔｅｒｔ−ブチル（ｔＢｕ）、Ｌｙｓに対してはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）そしてＡｒｇに対しては２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）であった。
【０１００】
事前に充填した樹脂の量は１００μｍｏｌであり、合成の各工程でのアミノ酸の量は１ｍｍｏｌであった。これは、事前に充填した樹脂の量と比較して１０倍過剰量であった。
【０１０１】
樹脂支持体（通常、Ｗａｎｇ樹脂が事前に充填される）からのペプチドの切断は、５％ＴＦＡ、０．２％β−メルカプトエタノール、０．２％チオアニソールおよび０．２％ジメチルスルフィドを含有する塩化メチレン中で行なわれた。ペプチドの側鎖の脱保護は、エタンジチオール：チオアニソール：水：トリフルオロ酢酸＝２５０μｌ：５００μｌ：５００μｌ：１０ｍｌの混合物中で、１．５時間、室温で行なわれた。そののち、ペプチドを沈殿させ、ジエチルエーテルで３回洗浄し、凍結乾燥した。
【０１０２】
合成した粗ホスホランバン（１〜３６）ペプチドを、分析用逆相（ＲＰ）カラム（Ｃ_８、２０μｍ、直径４．６ｍｍ×３０ｍｍ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｒｏｗｎｌｅｅ ＴＭカラム）を用いて高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製した。０．１％ＴＦＡにおけるアセトニトリル（３０分で０〜１００％）のリニアグラジエントを溶出に使用した。
【０１０３】
再精製ペプチドを、Ｃ_１８ Ｋｒｏｍａｓｉｌ、５μｍ（１．０×２５ｃｍ）カラムを用いてＨＰＬＣ ＲＰ−クロマトグラフィーによりさらに精製した。ペプチドは、０．１％ＴＦＡにおけるアセトニトリル、０．０７５％ＴＦＡ（１０分で３〜３０％、１２０分で３０〜５０％）の段階的グラジエントを用いて溶出した。精製ホスホランバン（１〜３６）ペプチドを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、ついでクーマシーブリリアントブルー染色により特徴付けた。ウエスタンブロット分析を市販のモノクローナル抗ＰＬＢ抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して行なった。ペプチドを含む精製ＲＰ−クロマトグラフィーのピークを、３３７ｎｍ窒素レーザーを使用してＢＩＦＬＥＸ（登録商標）質量分析計を用いて反射型（ｒｅｆｌｅｃｔｏｒ ｍｏｄｅ）で質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）によりさらに分析した。試料を、質量分析用のシナピン酸マトリックスの液滴と共に、３０％ アセトニトリル／０．１％ ＴＦＡを含む溶液中に適用した。精製タンパク質の総量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄにしたがい、さらに標準物質としてβ−ラクトグロブリンを用いたＲＰ−クロマトグラフィーに基づき見積もった。精製ペプチドを凍結乾燥し、乾燥粉末の重量を三次元構造解析の前に測定した。
【０１０４】
ホスホランバン（１〜３６）のＮＭＲスペクトルの獲得
^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＲＸ４００およびＶａｒｉａｎＵＮＩＴＹ６００ＮＭＲ分析計において、それぞれ４００．１３ＭＨｚおよび５９９．８６ＭＨｚで得た。ジスルフィドの形成を防止するため６ｍＭ ｄ_１０−ＤＴＴを含有するＨ_２Ｏ：Ｄ_２Ｏ：ｄ_３−ＴＦＥ（６３：７：３０）の混合溶媒におけるＰＬＢの３６−ａ．ａ．フラグメントの３ｍＭ溶液に対して１Ｄおよび２ＤＮＭＲスペクトルを得た。ｐＨを、マイクロリットル量のＮａＯＤで３．００±０．０２に調整した（重水素同位体効果のため不正確）。ＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ（３０〜９０ｍｓ）およびＮＯＥＳＹ（４０〜４００ｍｓ）スペクトルを、２、７、１７および２７℃で、スペクトル幅８．５ｐｐｍを用いたＳｔａｔｅｓ−ＴＰＰＩ法により記録した。２Ｄデータは加重され、２ｋ×１ｋの実点の行列にフーリエ変換された。残留溶媒系を飽和させた（２．０ｓ）トランスミッターは逆重畳によって換算した。スペクトルは残留溶媒シグナル（２７℃で４．７５ｐｐｍ、−１０ｐｐｂ／℃）を基準とした。一連の１Ｄスペクトルを種々の温度（２から４７℃に変動）で取得した。
【０１０５】
ホスホランバン（１〜３６）のＮＭＲスペクトルの帰属
スピン系の帰属および連続帰属は、１２、１７および２７℃で得られたＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹおよびＮＯＥＳＹスペクトルを使用して、Ｗｅｕｔｈｒｉｃｈ， Ｋ， ｅｔ ａｌ．（１９８６） ”ＮＭＲ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ” Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， ＮｅｗＹｏｒｋにしたがって誘導した。アミドプロトンの化学シフトの温度依存性の相違は、共鳴の重なりを解くのに足るものであった。非変性メチレンに対する立体特異的帰属は、ＣＯＳＹスペクトルから測定される結合定数Ｊ_{Ｈ α Ｈ β}と、残基内ＮＯＥ交差ピーク強度とから演繹された。
【０１０６】
ホスホランバン（１〜３６）構造の発生および精密化
一連のＮＯＥＳＹスペクトルを１７℃にて５種類の混合時間（５０、８０、１２０、１６０および２００ｍｓ）で得た。積算した交差ピーク強度（Ｉ）をＮＯＥＳＹ累積分析（ＮＯＥＳＹ−ｂｕｉｌｔ−ｕｐ−ａｎａｌｙｓｉｓ）において使用した。距離制限（ｄｉｓｔａｎｃｅ ｒｅｓｔｒａｉｎｔ）を、初期条件Ｉ_{（ τ ｍ＝０）}＝０を用いて、一連のＮＯＥから積算された交差ピークの体積に適合させた二次多項曲線の初期勾配から引き出した。内部メチレンＮＯＥおよび連続ＮＯＥが校正に役立った。最初に、第一の構造群の発生のために、距離を、短い（１．８〜２．５Å）、中程度（１．８〜３．５Å）または長い（３．０〜６．０Å）のように分類した。部分的（＞２０％）重なり、不充分なシグナル−ノイズ比または妨害により距離が累積曲線から算出できない場合は、距離を５．０Å未満としたのみであった。各仮の原子に対して１．０Åずつ上限を拡大した。制限データに、１２℃で得られた１５０ｍｓＮＯＥスペクトルからの強、中および弱ＮＯＥに基づく距離制限を加えた。
【０１０７】
結合定数（Ｊ）をＪ−倍加法（ＭｃＩｎｔｙｒｅ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｊ Ｍａｇｎ Ｒｅｓｏｎ ９６， ４２５−４３１）により、ＣＯＳＹ交差ピークの微細構造から算定した。中間Ｊによって特徴付けられた二面φおよびχは拘束しなかったが、小および大Ｊ_{ＮＨ α}およびＪ_{Ｈ α Ｈ β}は、カープラス（Ｋａｒｐｌｕｓ）関数および残基内ＮＯＥに基づいてねじれ型配座（±３０度）に関連づけた（Ｋａｒｐｌｕｓ， Ｍ． （１９６３） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ８５， ２８７０）。Ｈ−Ｈ距離制限および二面角制限を計算し、データをソフトウェアＩｎｓｉｇｈｔＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）に取り込み、構造を発生させ、評価し、精密化した。模擬ＮＯＥＳＹスペクトルを逆算した。タンパク質の座標ファイルを、ソフトウェアＰＲＯＭＯＴＩＦ ｖ２．０（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ， Ｇ． （１９９５）， ｖ２．０ Ｅｄ．， １２８．４０．４６．１１における匿名ｆｔｐより入手）により分析した。
【０１０８】
構造を距離幾何学（ＤＧＩＩ）により発生させ、ついで模擬アニーリングを行なった（力場ＡＭＢＥＲ）（Ｈａｖｅｌ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． （１９７９） Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ １８， ７３）。一組の構造が算定された。制限違反の最も少ない構造を用いて、ＮＯＥマトリックスを逆算した。α−へリックスの典型的なＮＯＥによって特徴付けられたセグメントの後の残基のＨ_α化学シフトが、−０．２ｐｐｍよりも大きい相当するランダムコイルの値から逸脱した場合は、対応する二面Ψも制限された（±６０度）。そののち、新しい一組の構造が算出された。この新しい構造群から、０．２Åを超過しない構造のみを承認した。
【０１０９】
帰属結果
記載した実験条件下で完全なスピン系帰属および連続帰属を得た。帰属を、１７℃で、５４％ Ｈ_２Ｏ／６％ Ｄ_２Ｏ／３０％ ｄ_３−ＴＦＥ、ｐＨ３．０５におけるＰＬＢ（１〜３６）のＨ−化学シフトを示す表Ｖ（本願に添付）にあげる。表Ｖにおいて、ねじれ型配座は、アンチ−配座においてはＣ_βＨの化学シフトに下線を引くことにより示し、Ｃ_αＨに対するゴーシュ型配座（−６０度）においては点線により示した。
【０１１０】
図７は、１７℃で、５４％ Ｈ_２Ｏ／６％ Ｄ_２Ｏ／３０％ ｄ_３−ＴＦＥ、ｐＨ３．０５におけるＰＬＢ（１〜３６）に対する、観測された連続および中位ＮＯＥ連結性の概略であり、帰属は、１２０、１６０および２００ｍｓ混合時間で得られたＮＯＥＳＹスペクトルからなされた。連続ＮＯＥは斜線ブロックで示した。中位ＮＯＥは、適切な残基を結ぶ矢印で表わした。中空円は、７Ｈｚより小さい^３Ｊ_{ＮＨ α ＣＨ}結合定数を意味する。αＣＨの二次シフト（Δδ）は、各残基に対する観測された化学シフトとランダムコイル化学シフトとの差として定義される。Ｗｉｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （１９９２）， ３１， １６４７−１６５１によれば、負（高磁場（ｕｐｆｉｅｌｄ））のΔδ値はα−へリックス二次構造と関連付けられ、正（低磁場（ｄｏｗｎｆｉｅｌｄ））のΔδ値はβ−構造と関連付けられる。
【０１１１】
全部で７２３のＮＯＥを帰属した。３４個の可能な内部ＮＨ−Ｃ_αＨ相関はすべて、フィンガープリント領域において観測された。対応するＮＯＥのほとんどは、かなり強力で、ＮＨ_ｉ＋１−Ｃ_αＨ_ｉＮＯＥ（図７）に匹敵する。多くの連続ＮＨ_ｉ−ＮＨ_ｉ＋１およびＮＨ_ｉ−ＮＨ_ｉ＋２ＮＯＥが存在した。巨大なＣ_αＨ_ｉ−ＮＨ_ｉ＋３およびいくつかのＣ_αＨ_ｉ−ＮＨ_ｉ＋４ＮＯＥは、ＮＯＥＳＹスペクトルのフィンガープリント領域に集中した。さらに、多数のＣ_αＨ_ｉ−Ｃ_βＨ_ｉ＋３交差ピークがあった。ｉ＞ｉ＋４より長い相互作用に由来するＮＯＥがＭｅｔ２０のプロトンに対してのみ観測された。
【０１１２】
ＮＨとＣ_αＨとのあいだのＪ−カップリングは、ほとんどの残基に関して小さかった。ＣＯＳＹ交差ピークの共鳴の重なり、または強度の弱さのために、すべての残基に対して正確な値を測定することは不可能であったが、カップリングは、Ｎ末端およびＣ末端の残基、およびＰＬＢ（１〜３６）の中心の残基を除いて、７〜８Ｈｚを下回っていた。
【０１１３】
ＰＬＢ（１〜３６）の中心領域は、へリックス特性を示さなかった。すなわち、残基Ｇｌｕ１９、Ｍｅｔ２０およびＰｒｏ２１のδ_{Ｃ α Ｈ}値は、それらのランダムコイル値よりも顕著に小さいものではなかった。Ｇｌｕ１９およびＭｅｔ２０は、へリックス構造の典型的なＮＯＥが主に欠けており、Ｇｌｕ１９のＣ_αＨとＭｅｔ２０のＮＨとのあいだ、およびＭｅｔ２０のＣ_αＨとＰｒｏ２１のＣ_δＨｓとのあいだにはっきりとした強い連続ＮＯＥがあった。さらに、混み合ったフィンガープリント領域において部分的に覆い隠されたときでさえ、Ｉｌｅ１８のＣ_αＨとＧｌｕ１９のＮＨとのあいだのＮＯＥは強いものであった。これらはすべて、ＰＬＢ（１〜３６）の中央領域が伸びたコンホメーションをとることを意味する。伸びたセグメントは、伸びているにもかかわらず、短い。Ｔｈｒ１７およびＧｌｎ２２は、αへリックス残基のＮＯＥおよび結合定数特性を示し、Ｇｌｕ１９およびＭｅｔ２０の側鎖プロトンから、Ｎ末端およびＣ末端へリックスの隣接した残基のプロトンへのＮＯＥが存在する。我々は、Ｎ末端およびＣ末端αへリックスがＩｌｅ１８、Ｇｌｕ１９、Ｍｅｔ２０およびＰｒｏ２１でのターンによって分離されていると推論する。プロリンは、トランス型コンホメーションで存在する。Ｎ末端およびＣ末端へリックスの軸が平行になるような堅いターンは不可能である。Ｎ末端へリックスとＣ末端へリックスとのあいだに、不明瞭なＮＯＥが存在する。
【０１１４】
ＰＬＢ（１〜３６）の構造
ＰＬＢ（１〜３６）の構造は、共有構造だけによってより正確に定義されたものを除いた５９９の距離制限および５０の二面制限から決定される。これらの重複ＮＯＥ誘導制限は、共有的に強要された距離制限に合致しており、これは、距離の校正が妥当なものであるということを示唆した。平均して、残基あたり１６．６の有意なＮＯＥ誘導制限が存在した。Ｎ末端へリックスの残基Ｌｙｓ３〜Ｉｌｅ１８は、平均して、Ｃ末端へリックスにおける残基Ｇｌｎ２２〜Ｃｙｓ３６よりも残基あたりの制限が少ない。これは、Ｎ末端へリックスにおけるよりもＣ末端へリックスにおいて、残基あたりの非変性シフトを有するプロトンが平均して多く存在するという事実（表Ｖ）に、少なくとも部分的に起因するものである。ターンを制限する残基Ｉｌｅ１８〜Ｐｒｏ２１に関しては、Ｎ末端へリックスにおける残基と同じほどの残基あたりの制限が存在した。
【０１１５】
構造発生により、すべてへリックス−ターン−へリックスモチーフを示す構造群が得られた。根二乗平均偏差を、０．２Åを超える距離違反や二面違反をもたない２０の構造群から計算した。図９は、ＮＯＥデータから得られたＰＬＢ（１〜３６）の構造の質が示され、残基あたりのＲＭＳＤおよび残基あたりの制限の数を示す。
【０１１６】
あいまいな遠位ＮＯＥがＮ末端へリックスとＣ末端へリックスとのあいだに見られたので、構造群は、Ｎ末端およびＣ末端へリックスの遠く離れた部分において原子座標の分散を表示した。へリックスの相互の方向は、ターンにおける短距離の距離制限によってのみ拘束された。したがって、残基あたりのＲＭＳＤは、ｉ）Ｎ末端へリックスとターン（ａ．ａ．１〜２１）について、およびｉｉ）Ｃ末端へリックスとターン（１８〜３６）について、別々に算定された。ＲＭＳＤは、予想どおり、残基あたりの制限数とおおまかな逆相関を示した。平均して、Ｎ末端へリックスの原子を、１．３Å（骨格のみ）および２．３Å（全原子）の精度に、Ｃ末端へリックスでは０．８Å（骨格のみ）および１．９Å（全原子）の精度に定めた。Ｇｌｕ１９のＣαからＰｒｏ２１のＣαまでのセグメントが伸ばされ、Ｍｅｔ２０の側鎖がＣ末端へリックスにほぼ平行に突出し、そしてＧｌｕ１９の側鎖がほとんど反対方向に向いている構造に対して、最小数の距離違反（０．２Å未満）が観測された。これらの構造において、ペプチド結合Ｉｌｅ１８〜Ｇｌｕ１９の面は、伸びたセグメントの面に対してほぼ直角である。
【０１１７】
ターンの構造的可動性のため、構造群は、Ｎ末端およびＣ末端へリックスの相対位置における分散を示す。分散は、それでもなお制限される。群のさまざまな構造をＣ末端へリックスの残基のＣα上に重ね合わせる場合、Ｎ末端の軸が、約９０度の開口と約８０度の相対角を有する円錐内に分散される。一方が膜貫通であり他方が両親媒性である２つの連続したへリックスに対する同様の相互の方向は、小さな膜結合タンパク質またはペプチドに対して見出されているかまたは仮定されている（Ｓｔｏｐａｒ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３５ （４８）， ５４６７−５４７３）。
【０１１８】
ある構造においては、Ａｒｇ９、Ａｒｇ１３およびＡｒｇ１４の側鎖εＮＨは、その化学シフトがＴとほぼ無関係であり、Ｓｅｒ１０、Ｓｅｒ１６およびＴｈｒ１７の隣接した側鎖の酸素と水素結合を形成する。Ａｒｇ２５に関しては、大きいΔδ_ＮＨ（Ｔ）を有し、明らかな水素結合のドナー候補が存在しなかった。グルタミンおよびアスパラギンの側鎖ＮＨ_２はへリックス軸に平行な水素結合ネットワークを形成し得た。
【０１１９】
ＰＬＢのリン酸化に関して、我々はリン酸化部位Ｓｅｒ１６が容易に利用でき、溶媒にさらされていることが重要であることを見出した。Ｎ末端へリックス上のＴｈｒ１７は、Ｃ末端へリックスに面しており、Ｓｅｒ１６より溶媒に曝されていないように思われる。αへリックスのピッチのため、Ａｒｇ１３およびＡｒｇ１４も、へリックスの同じ側面上のＳｅｒ１６およびＴｈｒ１７に関して位相で６０度遅れる配向性で曝されている。ホスホキナーゼの基質（たとえば、トポロニンＩ）において、セリンまたはトレオニン残基の近傍に正電荷残基の存在がしばしば見られる。
【０１２０】
我々は、Ｎ末端へリックスの一面が、主に極性または親水性であるということを見出した。同じことがＣ末端へリックスについても当てはまり、その極性残基は、親油性側鎖によって占められる他の面から離れて一面に局在化される。ヘリックスの相対的な配向性のため、Ｎ末端へリックスの親水性面は、常にＣ末端へリックスの親油性面に面しているということが注目され得る。これは、両親媒性のアームピットと言われているポケットを定義する。このポケットにおいて、Ｎ末端上の極性残基と、Ｃ末端上の親油性残基との相対位置は、選択された側鎖の座標を平均化することにより計算された２つの重心を用いることによって都合よく定義され得る。Ｎ末端に関連した重心を構築するためにＡｒｇ１３、Ａｒｇ９およびＴｙｒ６の側鎖の座標が使用され、Ｃ末端に関連した重心を構築するためにＰｈｅ３２およびＰｈｅ３５の側鎖の座標が使用された。これら２つの重心のあいだの距離は、群のすべての構造に対して計算され、１８．５±４．５Åであった。ＰＬＢ（１〜３６）の洗練された構造を図３に示す。
【０１２１】
実施例２ 環状ペプチドｃＰ２２６の構造
ペプチドの合成、環化および精製
アミノ酸配列ＣＹＷＥＬＥＷＬＰＣＡを有する線状ペプチドを、フルオレニルメトキシカルボニル法を用いて自動ペプチド合成装置（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３１Ａ）で合成した。合成は、カルボキシ末端から開始した。合成中に使用した側鎖の保護基は、Ｃｙｓに対してはトリチル（Ｔｒｔ）、Ｇｌｕに対してはｔｅｒｔ−ブトキシ（ＯｔＢｕ）そしてＴｙｒに対してはｔｅｒｔ−ブチル（ｔＢｕ）であった。
【０１２２】
事前に充填した樹脂の量は１００μｍｏｌであり、合成の各工程でのアミノ酸の量は１ｍｍｏｌであった。
【０１２３】
樹脂支持体（通常、Ｗａｎｇ樹脂が事前に充填される）からのペプチドの切断、ならびに側鎖の脱保護は、エタンジチオール：チオアニソール：水：トリフルオロ酢酸＝２５０μｌ：５００μｌ：５００μｌ：１０ｍｌの混合物中で、１．５時間、室温で行なった。そののち、ペプチドを沈殿させ、ジエチルエーテルで３回洗浄し、凍結乾燥した。
【０１２４】
ペプチド合成に使用したアミノ酸および事前充填樹脂はＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから入手した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）はＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製で、エタンジチオール（ＥＤＴ）およびチオアニソールはＦｌｕｋａ製であった。
【０１２５】
精製したペプチドを０．５ｍｇ／ｍｌで、１０ｍＭ （ＮＨ_４）_２ＣＯ_３に溶解することにより、環状ペプチドｃＰ２２６を線状ＣＹＷＥＬＥＷＬＰＣＡペプチドから再構成した。そして、その溶液を室温で１〜２日放置することによって、分子内ジスルフィド架橋を形成するための２つのシステイン残基のＳＨ基の酸化を行なった。反応を、時間の関数として変化する線状および環状ペプチドのピークからＨＰＬＣクロマトグラフィーで追跡した。
【０１２６】
線状および環状ｃＰ２２６の両ペプチドを、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー（Ｃ_８、Ａｑｕｑｐｏｒｅ オクチル、３０μｍ、１０×１００ｍｍ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）により、０．１％ＴＦＡから１００％アセトニトリルへの３０分リニアグラジエントを用いて精製し分離した。得られたペプチドを質量分析により特徴付けた。
【０１２７】
ｃＰ２２６のＮＭＲスペクトル
^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＲＸ４００およびＶａｒｉａｎＵＮＩＴＹ６００ＮＭＲ分光計において、それぞれ４００．１３ＭＨｚおよび５９９．８６ＭＨｚで得た。環状ペプチドの１ｍＭ水溶液に対して１Ｄおよび２ＤＮＭＲスペクトルを得た。ｐＨを、マイクロリットル量のＮａＯＤで６．５０±０．０２に調整した（重水素同位体効果のため不正確）。ＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ（３０〜９０ｍｓ）およびＮＯＥＳＹ（２００〜４００ｍｓ）スペクトルを、５、１０、１５および２７℃で、スペクトル幅８．５ｐｐｍを用いたＳｔａｔｅｓ−ＴＰＰＩ法により記録した。２Ｄデータは加重され、２ｋ×１ｋの実点の行列にフーリエ変換された。残留溶媒系を飽和させた（２．０ｓ）トランスミッターは逆重畳によって換算した。スペクトルは残留溶媒シグナル（２７℃で４．７５ｐｐｍ、−１０ｐｐｂ／℃）を基準とした。
【０１２８】
ｃＰ２２６のＮＭＲスペクトルの帰属
スピン系の帰属および連続帰属は、５、１０および２７℃で得られたＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹおよびＮＯＥＳＹスペクトルを使用して、実施例１と同様にＷｅｕｔｈｒｉｃｈにしたがって誘導した。アミドプロトンの化学シフトの温度依存性の相違は、共鳴の重なりを解くのに足るものであった。非変性メチレンに対する立体特異的帰属は、ＣＯＳＹスペクトルから測定される結合定数Ｊ_{Ｈ α Ｈ β}と、残基内ＮＯＥ交差ピーク強度とから演繹された。
【０１２９】
ｃＰ２２６構造の発生および精密化
一連のＮＯＥＳＹスペクトルを１０℃にて種々の混合時間（２００、３００、４００ｍｓ）で得た。積算した交差ピーク強度（Ｉ）をＮＯＥＳＹ累積分析において使用した。距離制限を、初期条件Ｉ_{（ τ ｍ＝０）}＝０を用いて、一連のＮＯＥから積算された交差ピークの体積に適合させた二次多項曲線の初期勾配から引き出した。内部メチレンＮＯＥおよび連続ＮＯＥが校正に役立った。最初に、第一の構造群の発生のために、距離を、短い（１．８〜２．５Å）、中程度（１．８〜３．５Å）または長い（３．０〜６．０Å）のように分類した。部分的（＞２０％）重なり、不充分なシグナル−ノイズ比または妨害により距離が累積曲線から算出できない場合は、距離を５．０Å未満としたのみであった。各仮の原子に対して１．０Åずつ上限を拡大した。制限データに、１０℃で得られた３００ｍｓＮＯＥスペクトルからの強、中および弱ＮＯＥに基づく距離制限を加えた。
【０１３０】
結合定数（Ｊ）をＪ−倍加法により、ＣＯＳＹ交差ピークの微細構造から算定した。中間Ｊによって特徴付けられた二面φおよびχは拘束しなかったが、小および大Ｊ_{ＮＨ α}およびＪ_{Ｈ α Ｈ β}は、カープラス関数および残基内ＮＯＥに基づいてねじれ型配座（±３０度）に関連づけた。Ｈ−Ｈ距離制限および二面角制限を計算した。最終的には、データをソフトウェアＩｎｓｉｇｈｔＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）に取り込み、構造を発生させ、評価し、精密化した。模擬ＮＯＥＳＹスペクトルを逆算した。タンパク質の座標ファイルを、ソフトウェアＰＲＯＭＯＴＩＦ ｖ２．０により分析した。
【０１３１】
構造を距離幾何学（ＤＧＩＩ）により発生させ、ついで模擬アニーリングを行なった（力場ＡＭＢＥＲ）。３０個で一組の構造が算定された。制限違反の最も少ない構造を用いて、ＮＯＥマトリックスを逆算した。逆算したＮＯＥスペクトルと実験的ＮＯＥ巣ペクトルとの比較に基づき、はっきりとより多くのＮＯＥを同定し、対応する距離制限を課すことが可能となった。その後、新しい３０個で１組の構造が算出された。この新しい群から、０．３Åよりも大きい、せいぜい１の違反を有する１２の構造が選択され、さらに検討された。よく分離された交差ピークに対応する距離制限を、制限違反（＞０．２Å、＞０度）をもたない構造に基づく反復緩和マトリックス法（ＩＲＭＡ）により精密化した。τ_ｃの不確定性を考慮に入れるため、ＩＲＭＡによって得られた正確な距離の１０％以上に上限を維持した。ついで、精密化された制限セットを模擬アニーリングによって座標を精密化するために使用した。
【０１３２】
得られた最終的な１２個の構造群を、グラフィックソフトウェアＭＯＬＭＯＬ（Ｋｏｒａｄｉ， Ｒ． ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ Ｍｏｌ Ｇｒａｐｈｉｃｓ １４， ５１−５５）により視覚化した。
【０１３３】
帰属結果
記載した実験条件下で完全なスピン系帰属および連続帰属を得た。充分な磁化伝達（ｔｒａｎｓｆｅｔ）を誘導し交差ピークを視覚化するために、低温（＜１０℃）でのＮＯＥＳＹ実験、および比較的長い混合時間（＞３００ｍｓ）でのＮＯＥＳＹ実験を行なう必要があった。帰属を表ＶＩにあげる。
【０１３４】
ｃＰ２２６スペクトルは、８．５ｐｐｍを超える化学シフト分散を示した。Ｃ_αＨシフトは３．９〜４．７ｐｐｍにおよび、ＮＨシフトの大部分は７．８〜８．５ｐｐｍのあいだに拘束されたが、Ｔｙｒ２およびＬｅｕ８については、ＮＨ共鳴は上場側にそれぞれ６．９ｐｐｍおよび７．３ｐｐｍにシフトした。非常に高い場（＞０ｐｐｍ）にはメチル基のシグナルはなかった。
【０１３５】
図１０は、１０℃で、９０％ Ｈ_２Ｏ／１０％ Ｄ_２Ｏ、ｐＨ６．５０におけるｃＰ２２６に対する、観測された連続および中位ＮＯＥ連結性の概略である。帰属は、３００および４００ｍｓ混合時間で得られたＮＯＥＳＹスペクトルからなされた。連続ＮＯＥは斜線ブロックで示した。中位ＮＯＥは、適切な残基を結ぶ矢印で表わした。中空円は、８Ｈｚより大きい^３Ｊ_{ＮＨ α ＣＨ}結合定数を意味する。αＣＨの二次シフト（Δδ）は、各残基に対する観測された化学シフトとランダムコイル化学シフトとの差として定義される。Ｗｉｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （１９９２）， ３１， １６４７−１６５１によれば、負（高磁場（ｕｐｆｉｅｌｄ））および正（低磁場（ｄｏｗｎｆｉｅｌｄ））のΔδ値は、二次構造に関連付けられる。
【０１３６】
全部で１２０のＮＯＥを帰属した。９個の可能な内部ＮＨ−Ｃ_αＨ相関は、フィンガープリント領域においてすべては観測されなかった。対応するＮＯＥのほとんどは、かなり弱かった。４つの連続ＮＨ_ｉ−ＮＨ_ｉ＋１および１つのＮＨ_ｉ−ＮＨ_ｉ＋２ＮＯＥのみが存在した。いくつかのＮＨ_ｉ＋ｎ−Ｃ_βＨ_ｉがＮＯＥスペクトル中に見られ、連続帰属を容易化した。各残基に対する観測された化学シフトとランダムコイル化学シフトとの差として定義されるαＣＨの二次シフト（Δδ）は、折れ曲がり構造の証拠を与えた（図１０）。ｉ＞ｉ＋４より長い（環を横切る）相互作用から誘導されるＮＯＥが、Ｔｒｐ３およびＬｅｕ８の側鎖のプロトンならびにＴｙｒ２およびＣｙｓ１０のプロトンに対して観測された。
【０１３７】
ＮＨとＣ_αＨとのあいだのＪ−カップリング（ＣＯＳＹ交差ピークから計算される）は、ほとんどの残基に対して大きかった。すべての残基に対するカップリングは、８Ｈｚを上回っており、これは、φ角が大部分は１２０±３０°の値を有するということを示唆した。プロリンは、トランス型コンホメーションで存在した。
【０１３８】
ｃＰ２２６の構造
ｃＰ２２６の構造は、共有構造だけによってより正確に定義されたものを除いた１１０の距離制限および８の二面制限から決定される。これらの重複ＮＯＥ誘導制限は、共有的に強要された距離制限に合致しており、これは、距離の校正が妥当なものであるということを示唆した。平均して、残基あたり１０の有意なＮＯＥ誘導制限が存在した。ペプチドの中央部分の残基（Ｔｒｐ３からＬｅｕ８）は平均よりも残基あたりの制限が多い。これは、その領域の残基あたりの非変性シフトを有するプロトンが平均的に多く存在するという事実に、少なくとも部分的に起因するものである。
【０１３９】
構造発生により、すべてベンド−コイル−ベンド モチーフを示す構造群が得られた（ＭＯＬＭＯＬ）。根二乗平均偏差を、０．３Åを超える距離違反や二面違反をもたない１２の構造群から計算した。小さい距離制限違反は、主に、側鎖、たとえばチロシンの側鎖のあいだに生じる。これは、非同時ＮＯＥを誘発し得るこれらの部分の極端な動きやすさの結果であり得る。残基あたりのＲＭＳＤを計算したところ、予想どおり、残基当たりの制限の数とおおよその逆相関を表わした。平均して、原子は０．９６Å（骨格のみ）および２．０２Å（全原子）の精度に定められ、Ｔｒｐ３からＴｒｐ７までのプロトンに対してのみ計算した場合は、０．７２Å（骨格のみ）および１．８７Å（全原子）の精度に定められた（表ＶＩＩ）。
【０１４０】
Ｔｒｐ３、Ｌｅｕ５、Ｔｒｐ７およびＬｅｕ８の親油性側鎖が、環式ペプチドの一方側に集中し、骨格の極性カルボニルおよびアミン基の大部分がもう一方の側に残った。
【０１４１】
このレポートに示すｃＰ２２６の構造を、前述のＰＬＢ（１〜３６）の構造上に合体させた。２つの構造の比較により、ｃＰ２２６上の２つのグルタミン酸残基が、ＰＬＢ（１〜３６）上のＡｒｇ９およびＡｒｇ１３との連結により結合に関与し、ｃＰ２２６の親油性クラスターがＰＬＢ（１〜３６）のＣ末端ヘリックスの親油性外側部分に曝されるという仮説が確認される。
【０１４２】
図１１は、ＮＭＲデータから推論されるｃＰ２２６の１２個の構造からなる群を示す。骨格、Ｔｒｐ３およびＴｒｐ７側鎖の重原子、Ｇｌｕ４およびＧｌｕ６側鎖の重原子、Ｇｌｕ４およびＧｌｕ６のβ炭素が示される。２つのグルタミン酸残基のベータ炭素間の距離（図１１）は高度に保存されていた（８．３±０．９Å）。この情報は、ｃＰ２２６上のＧｌｕ４およびＧｌｕ６の位置を２つのアセテート残基が模倣する小さな分子の設計に有用であり得る。同様に、２つのグルタミン酸残基からの親油性クラスターの距離も薬物設計工程において有用となる。
【０１４３】
実施例３ 活性アッセイ
実験１ 心臓および速骨筋から調製されたＳＲベジクル中へのカルシウム取り込みに対する効果
ホスホランバンに対する所定化合物の抑制効果を、心臓組織から調製されたＳＲベジクル中へのカルシウムの取り込み、および速骨筋（腰筋）から調製されたＳＲベジクル中へのカルシウムの取り込みに対する、その化合物の効果を測定することにより示した。両方の種類のＳＲベジクルは、Ｃａ^２＋−ＡＴＰａｓｅを含むが、速骨筋由来ベジクルはホスホランバンを含まない（Ｈｏｈ ＪＦＹ， ”Ｍｕｓｃｌｅ ｆｉｂｅｒ ｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ”， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ， ４： ８０１−８０８， １９９２）。速骨筋から調製されたＳＲベジクルではなく、心臓組織から調製されたＳＲ小胞中に取り込まれるカルシウムが増大するということは、その化合物が、ＳＲ Ｃａ^２＋−ＡＴＰａｓｅに対するホスホランバンの抑制効果を軽減し、したがってホスホランバン不活性化剤として作用することを示している。ホスホランバンは、心臓ＳＲ Ｃａ^２＋−ＡＴＰａｓｅに対するその抑制効果をとおして哺乳動物の心臓における弛緩速度と収縮速度との両方を抑制するので、これらの効果を低減する化合物は、心臓疾患の治療において役立つ可能性がある。
【０１４４】
方法
モルモット（１０〜１２）を断頭した。それらの心臓または腰筋を切除し、氷冷０．９％ＮａＣｌ中で洗浄し、２０ｍＭ トリス−マレイン酸塩、０．３Ｍスクロースを含む緩衝液（ｐＨ７．０）中で切断して断片とした。そののち、組織片を、ポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）を用いて、さらにはポッター（Ｐｏｔｔｅｒ）を用いて均質化した（１０ストローク）。ホモジネートを、４℃にて１０００ｇで１５分間遠心分離した。上清を集め、ペレットを５ｍｌの緩衝液（２０ｍＭ トリス−マレイン酸塩、０．３Ｍスクロース、ｐＨ７．０）中に再懸濁させ、４℃にて１０００ｇで１０分間再び遠心分離した。得られた上清を、最初に集めておいた上清と合わせ、もう一度、４℃にて１００００ｇで２０分間遠心分離した。最終上清をろ過して、マグネチックスターラーとともに瓶に入れた。ＫＣｌを最終的濃度０．６Ｍ（４℃で）まで、ろ過した上清に添加した。得られた溶液を、４℃にて１０００００ｇで６０分間遠心分離した。ペレットを２０ｍＭ トリス−マレイン酸塩、０．３Ｍスクロースを含む緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍｌ中に懸濁させ、４℃にて１０００００ｇで６０分間遠心分離した。得られたペレットを、２０ｍＭ トリス−マレイン酸塩、０．３Ｍスクロース、０．１Ｍ ＫＣｌを含む緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍｌ中に懸濁させ、使用まで−８０℃で貯蔵した。別途調製した小胞調製品を標準化するためにタンパク質濃度も測定した。
【０１４５】
カルシウム取り込みアッセイにおいて、ＳＲ Ｃａ^２＋ＡＴＰａｓｅがベジクル外空間からＳＲベジクル中にＣａ^２＋を移動させた場合に、蛍光指示薬ｆｌｕｏ−３を用いてベジクル外Ｃａ^２＋濃度の減少を検出した。
【０１４６】
前記で得られたＳＲベジクル（５０μｇ タンパク質／ｍｌ）を、４０ｍＭイミダゾール、９５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＮａＮ_３、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭシュウ酸カリウム、２μｌルテニウムレッド、５μＭ ｆｌｕｏ−３を含むアッセイ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、試験化合物と共にまたは試験化合物を用いないで、３７℃で５分間予備インキュベーションした。遊離カルシウムを、ＣａＣｌ_２で０．１μＭまたは０．０４μＭに調整した。ＡＴＰ（５ｍＭ）を添加することにより反応を開始した。最終的反応体積は１．５ｍｌであった。反応混合物の蛍光を、それぞれ５１０ｎｍおよび５３０ｎｍの励起および発光波長を用いることにより３分間測定した。
【０１４７】
結果
図１２Ａおよび１２Ｂは、心臓（Ａ）および速骨筋（Ｂ）のＳＲベジクル中へのＣａ^２＋取り込み速度に対する、実施例１ｃの化合物（５０および１００μＭ）の効果を示す。本発明の化合物が、心臓ＳＲベジクル中へのカルシウム取り込みを加速したが、速骨筋から調製されたＳＲベジクル中へのカルシウム取り込みは変化させなかったことがわかる。
【０１４８】
表ＶＩＩＩは、心臓（Ａ）および速骨筋（Ｂ）のＳＲベジクル中へのＣａ^２＋取り込み速度に対する、本発明の種々の化合物の効果を示す。それぞれ０．１μＭおよび０．０４μＭの遊離カルシウム濃度で実験を行なった。
【０１４９】
【表２】

【０１５０】
実験２ 左心室圧誘導への効果
方法
雌雄の３００〜４００ｇのモルモットをこの研究に用いた。頭蓋の殴打によりモルモットを殺し断頭したのち、心臓を素早く切除した。ついで、心臓を冷酸素化灌流緩衝液中で濯いだ。カニューレを大動脈中に挿入し、結紮糸で固定した。ランゲンドルフ装置のサーモスタット制御湿潤チャンバー中に心臓を置くとすぐに、逆行灌流が始まった。サーモスタット制御された球状人工肺（ｏｘｙｇｅｎａｔｏｒ）でカルボゲン（Ｏ_２９５％およびＣＯ_２５％）で平衡化された改変タイロード溶液（３７℃）を灌流緩衝液として用いた。タイロード溶液の組成（ｍＭ）は、ＮａＣｌ １３５；ＭｇＣｌ_２×６Ｈ_２Ｏ １；ＫＣｌ ５；ＣａＣｌ_２×２Ｈ_２Ｏ ２；ＮａＨＣＯ_２ １５；Ｎａ_２ＨＰＯ_４×２Ｈ_２Ｏ １；グルコース１０で、ｐＨ７．３〜７．４であった。一定圧力条件（５０ｍｍＨｇ）下で実験を行なった。短時間（１０分）の予備安定化後、ラテックスバルーン（サイズ４）を、左肺静脈および左心房をとおして左心室に注意深く入れた。ラテックスバルーンを、圧力変換器に連結されたステンレススチールカニューレに取り付けた。ラテックスバルーン、カニューレおよび圧力変換器のチャンバーを、気泡を避けつつエチレングリコール／水（１：１）混合物で満たした。圧力変換器をとおして等体積左心室圧を記録した。実験の最初に、バルーンの体積を、約５ｍｍＨｇの拡張期圧を得るように調節した。実験の開始前に、心臓を、灌流緩衝液中のビヒクル（０．１％ＤＭＳＯ）で３０〜５０分間さらに安定化させた。
【０１５１】
１５分間のベースライン記録後、種々の濃度の試験化合物を１５分の間隔で灌流緩衝液に添加した。０．３〜３０μＭの濃度範囲を試験した。実験をとおして、ビヒクル濃度（０．１％ＤＭＳＯ）を一定に維持した。
【０１５２】
結果
本発明の種々の化合物の左心室収縮期圧に対するＥＣ_５０値および最大効果（ベースラインからの変化％）を表ＩＸに示す。
【０１５３】
【表３】

【０１５４】
実施例４
ＰＬＢ不活性化剤の製造を以下の実施例により説明するが、限定するものではない。
【０１５５】
実施例（１） ３−ベンジル−５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−メトキシ］−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オンの製造
ａ） ３−ベンジル−５，７−ジヒドロキシ−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
フロログルシノール二水和物（２０ｇ）および２−ベンジルアセト酢酸エチル（２７．５ｍｌ）のエタノール（３２０ｍｌ）溶液を、０℃にて無水ＨＣｌで５時間処理し、溶液をこの温度で一晩維持した。黄色の溶液を濃縮し、水で粉砕し、固形分をろ過し、水洗し、乾燥した。得られた水和物をトルエンから３回蒸発乾燥し、石油エーテル（沸点４０〜６０℃）で粉砕し、ろ過した。収量３３．４ｇ（９６％）。融点２５８〜２６０℃。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ４００ＭＨｚ）： ２．５２５ （ｓ， ３Ｈ， ＣＨ_３）， ３．８８７ （ｓ， ２ Ｈ， ＣＨ_２Ｐｈ）， ６．１７１ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．４ Ｈｚ）， ６．２７４ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．４ Ｈｚ）， ７．１６７−７．２７９ （ｍ， ５Ｈ， Ｐｈ）， １０．２ （ｓ， １Ｈ， ＯＨ）， １０．４７ （ｓ， １Ｈ， ＯＨ）．
【０１５６】
ｂ） ３−ベンジル−５，７−ビス（シアノメトキシ）−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
クロロアセトニトリル（６．８６ｇ）、炭酸カリウム（２３．９ｇ）および実施例（１）ａの生成物１２．２ｇを、窒素雰囲気下、１００℃にてＤＭＦ１２０ｍｌ中で２時間攪拌した。反応混合物を冷却し、氷水中に注いだ。固形物をろ過し、水洗した。収量１３．８ｇ（８８％）。融点１４７〜１５４℃。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ４００ＭＨｚ）： ２．５２５ （ｓ， ３Ｈ， ＣＨ_３）， ３．９６９ （ｓ， ２Ｈ， ＣＨ_２Ｐｈ）， ５．３０７ （ｓ， ２Ｈ， ＯＣＨ_２ＣＮ）， ５．３１４ （ｓ， ２Ｈ， ＯＣＨ_２ＣＮ）， ６．８１４ （ｄ， １ Ｈ， Ｊ＝２．５ Ｈｚ）， ６．９４０ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．５ Ｈｚ）， ７．１８−７．２９２ （ｍ， ５Ｈ， Ｐｈ）．
【０１５７】
ｃ） ３−ベンジル−５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
実施例（１）ｂの生成物（１ｇ）、アジ化ナトリウム（０．４２ｇ）および塩化アンモニウム（０．３４ｇ）を、窒素雰囲気下、１００℃にてＤＭＦ（５ｍｌ）中で５時間攪拌した。反応混合物を冷却し、ついで氷水中に注いだ。溶液のｐＨを１０〜１１に調整し、ついで溶液を酢酸エチルで１回抽出するかセライト（ＣＥＬＩＴＥ）をとおしてろ過した。溶液を塩酸でｐＨ２まで酸性化し、５℃に維持し、ろ過した。収量０．９６ｇ（８１％）。融点２２９〜２３３℃。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６， ４００ＭＨｚ）： ２．４６８ （ｓ， ３Ｈ， ＣＨ_３）， ３．９３７ （ｓ， ２Ｈ， ＣＨ_２Ｐｈ）， ５．５９６ （ｓ， ２Ｈ， ＯＣＨ_２Ｔｅｔ）， ５．６０２ （ｓ， ２Ｈ， ＯＣＨ_２Ｔｅｔ）， ６．８３２ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．４ Ｈｚ）， ６．８５１ （ｄ，１Ｈ， Ｊ＝２．４ Ｈｚ）， ７．１７１−７．２８３ （ｍ， ５Ｈ Ｐｈ）．
【０１５８】
実施例（２） ７，８，９，１０−テトラヒドロ−１，３−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−７−フェニル−６Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］ピラン−６−オンの製造
ａ） ７，８，９，１０−テトラヒドロ−１，３−ジヒドロキシ−７−フェニル−６Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］ピラン−６−オン
フロログルシノール（０．７ｇ）および２−エトキシカルボニル−３−フェニルシクロヘキサノン（１．５ｇ）のエタノール溶液を、実施例（１）ａに記載のように無水ＨＣｌで処理した。生成物を、まず、エタノール−水（１：１）から再結晶し、ついでエーテルで粉砕した。収量０．６１ｇ。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ４００ＭＨｚ）： １．３８−１．５２ （ｍ， １Ｈ）， １．５７−１．６６ （ｍ， １Ｈ）， １．６９−１．７８ （ｍ， １Ｈ）， １．８６−１．９６（ｍ， １Ｈ）， ２．９−３．０２ （ｍ， １Ｈ）， ３．３−３．４ （ｍ， １Ｈ）， ４．０５０ （ｂ， １Ｈ）， ６．１５７ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．４ Ｈｚ）， ６．２９７ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．４ Ｈｚ）， ７．０７６−７．２６５ （ｍ， ５Ｈ）， １０．１５３ （ｓ， １Ｈ）， １０．４５６ （ｓ， １Ｈ）．
【０１５９】
ｂ） ７，８，９，１０−テトラヒドロ−１，３−ビス（シアノメトキシ）−７−フェニル−６Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］ピラン−６−オン
実施例（２）ａの生成物（０．５ｇ）を、実施例（１）ｂに記載のように、ＤＭＦ（５ｍｌ）中のクロロアセトニトリル（０．２５ｇ）および炭酸カリウム（１．１２ｇ）で処理した。収量０．６ｇ。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ４００ＭＨｚ）： １．３８−１．５８ （ｍ， １Ｈ）， １．６−１．７ （ｍ， １Ｈ）， １．７−１．７６ （ｍ， １Ｈ）， １．８９−１．９９ （ｍ， １Ｈ）， ２．９−３．０３ （ｍ， １Ｈ）， ３．２−３．２８ （ｍ １Ｈ）， ４．１１１（ｂ， １Ｈ）， ５．３１４ （ｓ， ２Ｈ）， ５．３４９ （ｓ， ２Ｈ）， ６．８４０ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．５ Ｈｚ）， ６．９２５ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．５ Ｈｚ）， ７．１０８−７．２７４ （ｍ， ５Ｈ）．
【０１６０】
ｃ） ７，８，９，１０−テトラヒドロ−１，３−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−７−フェニル−６Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］ピラン−６−オン
実施例（２）ｂの生成物（０．６ｇ）を、実施例（１）ｃに記載のように、ＤＭＦ（５ｍｌ）中のアジ化ナトリウム（０．２ｇ）および塩化アンモニウム（０．１７ｇ）で処理した。生成物を、ＤＭＦ、エタノールおよび水の混合物（約１：２：３）から再結晶した。収量０．４１ｇ。融点１５３〜１５４℃。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ４００ＭＨｚ）： １．３８−１．５ （ｍ， １Ｈ）， １．５−１．６ （ｍ， １Ｈ）， １．６９−１．７６ （ｍ， １Ｈ）， １．８７−１．９６ （ｍ， １Ｈ）， ２．９−３．０５ （ｍ， １Ｈ）， ３．２−３．３ （ｍ， １Ｈ）， ４．０９４ （ｂ， １Ｈ）， ５．６０２ （ｓ， ２Ｈ）， ５．６４３ （ｓ， ２Ｈ）， ６．８３２ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．３ Ｈｚ）， ６．８５１ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．３．Ｈｚ）， ７．０８９−７．２１２ （ｍ， ５Ｈ）．
【０１６１】
実施例（３） ３−ベンジル−５，７−ビス［（２，５−ジヒドロ−５−オキソ−４Ｈ−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）−メトキシ］−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オンの製造
ａ） ３−ベンジル−５，７−ビス［（ヒドロキシアミジノ）メトキシ］−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
トリエチルアミン（１．９４ｍｌ）を、ヒドロキシルアミン塩酸塩（０．９７ｇ）のＤＭＳＯ（２ｍｌ）懸濁液に添加し、得られた混合物を室温で３０分間攪拌した。結晶をろ過し、ＴＨＦで洗浄した。濾液を濃縮し、実施例（１）ｂの生成物（０．５ｇ）を添加した。この溶液を７５℃で一晩維持した。反応混合物を氷水で処理し、ｐＨを１１に調整し、固形物をろ過し、水洗し、乾燥した。収量０．５ｇ。融点１５５〜１６０℃。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ４００ＭＨｚ）： ２．５６ （ｓ， ３Ｈ， ＣＨ_３）， ３．９３８ （ｓ， ２Ｈ）， ４．４６６ （ｓ， ２Ｈ）， ４．４８６ （ｓ， ２Ｈ）， ５．５６５ （ｓ， Ｈ， ＮＨ_２）， ５．７０９ （ｓ， ２Ｈ， ＮＨ_２）， ６．６５８ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．４ Ｈｚ）， ６．６９２ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．４ Ｈｚ）， ７．１６８−７．２８４ （ｍ， ５Ｈ， Ｐｈ）， ９．３４６ （ｓ， １Ｈ， ＯＨ）， ９．３６２ （ｓ， １Ｈ， ＯＨ）．
【０１６２】
ｂ） ３−ベンジル−５，７−ビス［（エトキシカルボニルオキシアミジノ）メトキシ］−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
クロロギ酸エチル（０．４５ｍｌ）を、実施例（３）ａの生成物（１ｇ）およびピリジン（０．３８ｍｌ）のＤＭＦ（５ｍｌ）溶液に０℃にて添加した。反応混合物をこの温度でさらに３０分間維持し、ついで氷水を添加した。固形分をろ過し、水洗した。収量１．６３ｇ。融点８７〜９２℃。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ４００ＭＨｚ）： １．２１５−１．２５６ （ｍ， ６Ｈ）， ２．５５３ （ｓ， ３Ｈ）， ３．９４７ （ｓ， ２Ｈ）， ４．１４０−４．１９８ （ｍ， ４Ｈ）， ４．５６６ （ｓ， ２Ｈ）， ４．５９９ （ｓ， ２Ｈ）， ６．６８８ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．４ Ｈｚ）， ６．７１８ （ｄ， １Ｈ，Ｊ＝２．４ Ｈｚ）， ６．７９２ （ｂ， ２Ｈ， ＮＨ_２）， ６．８１８ （ｂ， ２Ｈ， ＮＨ_２）， ７．１７１−７．２８５ （ｍ， ５Ｈ）．
【０１６３】
ｃ） ３−ベンジル−５，７−ビス［（２，５−ジヒドロ−５−オキソ−４Ｈ−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）−メトキシ］−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
ＤＭＦ（５ｍｌ）中の前実施例の生成物（１．５ｇ）およびＤＢＵ（０．８ｍｌ）を室温で一晩攪拌した。反応混合物を氷水で処理し、酸性化した。固形物をろ過し、水洗した。得られた固体塊を０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液に混入し、活性炭で処理し、最後に酸性化した。収量０．６４ｇ。融点１３０〜１３６℃。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ４００ＭＨｚ）： ２．５２４ （ｓ， ３Ｈ）， ３．９５４ （ｓ， ２Ｈ）， ５．１８７ （ｓ， ２Ｈ）， ５．２１５ （ｓ， ２Ｈ）， ６．７４８ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．４ Ｈｚ）， ６．８３４ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．４ Ｈｚ）， ７．１５８−７．２８９ （ｍ， ５Ｈ）， １２．８ （ｂ， ２Ｈ）．
【０１６４】
実施例（４） ７，８，９，１０−テトラヒドロ−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−１，３−ジヒドロキシ−６Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］ピラン−６−オンの製造
【０１６５】
ａ） ７，８，９，１０−テトラヒドロ−１，３−ジヒドロキシ−６Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］ピラン−６−オン
フロログルシノール（１ｇ）および２−オキソシクロヘキサンカルボン酸エチル（１．３２ｇ）を７５％硫酸（１０ｍｌ）中で一晩攪拌し、混合物を氷水中に注ぎ、ろ過した。収量１．５５ｇ。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ４００ＭＨｚ）： １．６５ （ｂ， ４Ｈ）， ２．３４５ （ｂ， ２Ｈ）， ３．０３７ （ｂ， ２Ｈ）， ６．１３８ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．４ Ｈｚ）， ６．２４５ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．４ Ｈｚ）， １０．０６９ （ｂ， １Ｈ， ＯＨ）， １０．３２２ （ｓ， １Ｈ， ＯＨ）．
【０１６６】
ｂ） ７，８，９，１０−テトラヒドロ−ビス（シアノメトキシ）−１，３−ジヒドロキシ−６Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］ピラン−６−オン
前実施例の生成物（０．５ｇ）、クロロアセトニトリル（０．３４ｇ）および炭酸カリウム（１．５ｇ）を、実施例（１）ｂに記載のように、ＤＭＦ（５ｍｌ）中で反応させた。収量０．４４ｇ。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ４００ＭＨｚ）： １．６８ （ｂ， ４Ｈ）， ２．４１ （ｂ， ２Ｈ）， ３．００ （ｂ， ２Ｈ）， ５．２９７ （ｓ， ２Ｈ）， ５．３０９ （ｓ， ２Ｈ）， ６．７９７ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．４ Ｈｚ）， ６．８９９ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．４ Ｈｚ）．
【０１６７】
ｃ） ７，８，９，１０−テトラヒドロ−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−１，３−ジヒドロキシ−６Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］ピラン−６−オン
前実施例の生成物（０．４ｇ）を、実施例（１）ｃに記載のように、ＤＭＦ（２．５ｍｌ）中のアジ化ナトリウム（０．１８ｇ）および塩化アンモニウム（０．１４ｇ）で処理した。生成物を、エタノール−ＤＭＦ（１：１）から再結晶した。収量０．１７ｇ。融点２８３〜２８６℃。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ４００ＭＨｚ）： １．６２６ （ｂ， ４Ｈ）， ２．３９３ （ｂ， ２Ｈ）， ２．９７１ （ｂ， ２Ｈ）， ５．５８３ （ｓ， ２Ｈ）， ５．５９９ （ｓ， ２Ｈ）， ６．８１１ （ｓ， ２Ｈ）．
【０１６８】
実施例（５） ５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−４−フェニル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オンの製造
ａ） ５，７−ジヒドロキシ−４−フェニル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
フロログルシノール（２．００ｇ）およびベンゾイル酢酸エチル（３．０５ｇ）のエタノール（３０ｍｌ）溶液を、実施例（１）ａに記載のように、無水ＨＣｌで処理した。生成物を、エタノール−水（１：１）から再結晶した。収量３．０ｇ（７５％）。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ３００ ＭＨｚ）： ５．７３９ （ｓ， １Ｈ， ＣＨ＝Ｃ）， ６．１５５ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．３ Ｈｚ）， ６．２６３ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．３ Ｈｚ）， ７．３０５−７．３８１ （ｍ， ５Ｈ， Ｐｈ）， １０．０８４ （ｓ， １Ｈ， ＯＨ）， １０．３６８ （ｓ， １Ｈ， ＯＨ）．
【０１６９】
ｂ） ５，７−ビス（シアノメトキシ）−４−フェニル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
前実施例の生成物（１．００ｇ）を、実施例（１）ｂに記載のように、ＤＭＦ（５ｍｌ）中のクロロアセトニトリル（０．６２ｇ）および炭酸カリウム（２．７２ｇ）で処理した。反応混合物を氷水中に注ぎ、混合物を酢酸エチルで抽出した。酢酸エチルを１Ｍ ＮａＯＨで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させた。生成物をイソプロパノールから再結晶した。収量０．４１ｇ（３１％）。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ３００ ＭＨｚ）： ４．８４５ （ｓ， ２Ｈ， ＯＣＨ_２ＣＮ）， ５．３４４ （ｓ， ２Ｈ， ＯＣＨ_２ＣＮ）， ６．０８６ （ｓ， １Ｈ， ＣＨ＝Ｃ）， ６．７７０ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．４ Ｈｚ）， ７．０４０ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．４ Ｈｚ）， ７．３２０−７．４４３ （ｍ， ５Ｈ， Ｐｈ）．
【０１７０】
ｃ） ５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−４−フェニル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
前実施例の生成物（０．４０ｇ）を、ＤＭＦ（２ｍｌ）中のアジ化ナトリウム（０．１６ｇ）および塩化アンモニウム（０．１４ｇ）で、１００℃にて２時間処理した。生成物を実施例（１）ｃに記載のように単離した。収量０．４０ｇ（７９％）。融点２２２〜２２４℃。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ４００ ＭＨｚ）： ５．１４８ （ｓ， ２Ｈ，ＯＣＨ_２Ｔｅｔ）， ５．６４９ （ｓ， ２Ｈ， ＯＣＨ_２Ｔｅｔ）， ５．９６８ （ｓ， １Ｈ， ＣＨ＝Ｃ）， ６．８１１ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．３ Ｈｚ）， ６．９６２ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．３ Ｈｚ）， ６．９９４−７．１８５ （ｍ， ５Ｈ， Ｐｈ）．
【０１７１】
実施例（６） ７，８，９，１０−テトラヒドロ−１，３−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−８−フェニル−６Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］ピラン−６−オンの製造
ａ） ７，８，９，１０−テトラヒドロ−１，３−ジヒドロキシ−８−フェニル−６Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］ピラン−６−オン
フロログルシノール（１．５６ｇ）および２−オキソ−５−フェニルシクロヘキサンカルボン酸エチル（２．５２ｇ）のエタノール（２５ｍｌ）溶液を、実施例（１）ａに記載のように無水ＨＣｌで処理した。沈殿をろ過し、水およびＥｔＯＨで洗浄した。収量１．０ｇ（３２％）。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ４００ ＭＨｚ）： １．７２−１．８２ （ｍ， １Ｈ）， ２．０１ （ｂ， １Ｈ）， ２．３１７−２．３８７ （ｍ， １Ｈ）， ２．７０７−２．７６３ （ｍ， １Ｈ）， ２．８３０ （ｂ， １Ｈ）， ３．０４１ （ｂ， １Ｈ）， ３．３５ および ３．４０ （ｂ， １Ｈ）， ６．１７４ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．３ Ｈｚ）， ６．２７７ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．３ Ｈｚ）， ７．２００−７．３５０ （ｍ， ５Ｈ， Ｐｈ）， １０．１３１ （ｓ， １Ｈ， ＯＨ）， １０．４０１ （ｓ， １Ｈ， ＯＨ）．
【０１７２】
ｂ） ７，８，９，１０−テトラヒドロ−１，３−ビス（シアノメトキシ）−８−フェニル−６Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］ピラン−６−オン
前実施例の生成物（１．０ｇ）を、実施例（１）ｂに記載のように、ＤＭＦ（５ｍｌ）中のクロロアセトニトリル（０．５７ｇ）および炭酸カリウム（１．０ｇ）で処理した。ＤＭＦを蒸発させ、残渣をＥｔＯＡｃに溶解した。酢酸エチルを１Ｍ ＮａＯＨで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させた。生成物をアセトン−イソプロパノール（１：３）から再結晶した。収量０．５０ｇ（４０％）。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ３００ ＭＨｚ）： １．７５−１．８８ （ｍ， １Ｈ）， ２．０５ （ｂ， １Ｈ）， ２．３８−２．４８ （ｍ， １Ｈ）， ２．７７−２．８５ （ｍ， １Ｈ）， ２．９０ （ｂ， １Ｈ）， ３．０７ （ｂ， １Ｈ）， ３．２２ および ３．２８ （ｂ， １Ｈ）， ５．３１６ （ｓ， ２Ｈ， ＯＣＨ_２ＣＮ）， ５．３３１ （ｓ， ２Ｈ， ＯＣＨ_２ＣＮ）， ６．８２９ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．５ Ｈｚ）， ６．９３９ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．５ Ｈｚ）， ７．２１０−７．３８０ （ｍ， ５Ｈ， Ｐｈ）．
【０１７３】
ｃ） ７，８，９，１０−テトラヒドロ−１，３−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−８−フェニル−６Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］ピラン−６−オン
前実施例の生成物（０．３０ｇ）をＤＭＦ（２ｍｌ）中のアジ化ナトリウム（０．１０ｇ）および塩化アンモニウム（０．０９ｇ）で、１００℃にて３．５時間処理した。生成物を実施例（１）ｃに記載のように単離した。収量０．３０ｇ（８２％）。融点２３５〜２４５℃。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ４００ ＭＨｚ）： １．７０−１．８０ （ｍ， １Ｈ）， １．９６ （ｂ， １Ｈ）， ２．３８−２．４４６ （ｍ， １Ｈ）， ２．８３６ （ｍ， ２Ｈ）， ３．０５２ （ｂ， １Ｈ）， ３．２５２ および ３．３０１ （ｂ， １Ｈ）， ５．６０４ （ｓ， ２Ｈ， ＯＣＨ_２ＣＮ）， ５．６３２ （ｓ， ２Ｈ， ＯＣＨ_２ＣＮ）， ６．８２７ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．５ Ｈｚ）， ６．８５８ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．５ Ｈｚ）， ７．２０９−７．３５１ （ｍ， ５Ｈ， Ｐｈ）．
【０１７４】
実施例（７） ５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−４−メチル−３−（２−フェニルエチル）−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オンの製造
ａ） ５，７−ジヒドロキシ−４−メチル−３−（２−フェニルエチル）−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
フロログルシノール（０．８７ｇ）および２−（２−フェニルエチル）アセト酢酸エチル（１．６２ｇ）のエタノール（３０ｍｌ）溶液を、実施例（１）ａに記載のように無水ＨＣｌで処理した。収量１．７７ｇ（８７％）。融点２４８〜２５２℃。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ３００ ＭＨｚ）： ２．４１３ （ｓ， ３Ｈ， ＣＨ_３）， ２．６５２−２．７８２ （ｍ，４Ｈ， ＣＨ_２ＣＨ_２）， ６．１５１ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．４ Ｈｚ）， ６．２５６ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．４ Ｈｚ）， ７．１８３−７．３０４ （ｍ， ５Ｈ， Ｐｈ）， １０．１３７ （ｓ， １Ｈ， ＯＨ）， １０．３６９ （ｓ， １Ｈ， ＯＨ）．
【０１７５】
ｂ） ５，７−ビス（シアノメトキシ）−４−メチル−３−（２−フェニルエチル）−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
前実施例の生成物（０．９０ｇ）を、ＤＭＦ（５ｍｌ）中のクロロアセトニトリル（０．４８ｇ）および炭酸カリウム（２．１ｇ）で、１００℃にて０．５時間処理した。生成物を実施例（１）ｂに記載のように単離した。収量１．００ｇ（８８％）。融点１７９〜１８３℃。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ３００ ＭＨｚ）： ２．３８４ （ｓ， ３Ｈ， ＣＨ_３）， ２．６９９−２．７５４ （ｍ， ２Ｈ， ＣＨ_２ＣＨ_２）， ２．８０５−２．８４１ （ｍ， ２Ｈ， ＣＨ_２ＣＨ_２）， ５．３０２（ｓ， ４Ｈ， ＯＣＨ_２ＣＮ）， ６，７９０ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．５ Ｈｚ）， ６．９０９ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．５ Ｈｚ）， ７．１９０−７．３０７ （ｍ， ５Ｈ， Ｐｈ）．
【０１７６】
ｃ） ５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−４−メチル−３−（２−フェニルエチル）−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
前実施例の生成物（０．４０ｇ）を、ＤＭＦ（２ｍｌ）中のアジ化ナトリウム（０．１５ｇ）および塩化アンモニウム（０．１２ｇ）で、１００℃にて２．５時間処理した。生成物を実施例（１）ｃに記載のように単離した。収量０．３８５ｇ（７８％）。融点２４８〜２５０℃。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ４００ ＭＨｚ）： ２．３６８ （ｓ， ３Ｈ， ＣＨ_３）， ２．６６８−２．７０７ （ｍ， ２Ｈ， ＣＨ_２ＣＨ_２）， ２．７８３−２．８２２ （ｍ， ２Ｈ， ＣＨ_２ＣＨ_２）， ５．５９３ （ｓ， ２Ｈ， ＯＣＨ_２Ｔｅｔ）， ５．６０４ （ｓ， ２Ｈ， ＯＣＨ_２Ｔｅｔ）， ６．８１９ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．３ Ｈｚ）， ６．８３４ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２，３ Ｈｚ）， ７．１６１−７．２９１ （ｍ， ５Ｈ， Ｐｈ）．
【０１７７】
実施例（８） ５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−メトキシ］−１，３−ジベンジル−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノンの製造
ａ） ２−ベンジル−３−オキソブタン酸３，５−ジメトキシアニリド
３，５−ジメトキシアニリン（５ｇ）を、窒素雰囲気下に予備加熱（１６０℃）された２−ベンジルアセト酢酸エチル（１５ｍｌ）に少しずつ添加し、その温度で６０分間維持した。冷却された溶液をヘプタン−エチルエーテルで希釈しろ過した。収量５．２ｇ（４９％）。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ３００ ＭＨｚ）： ２．１８３ （ｓ， ３Ｈ）， ３．０６９ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ＝７．２ Ｈｚ）， ３．９２３ （ｔ， １Ｈ， Ｊ＝７．２ Ｈｚ）， ６．６１６ （ｄｄ． １Ｈ， Ｊ＝２．３Ｈｚ）， ６．７６５ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ＝２．３ Ｈｚ）， ７．１３−７．３ （ｍ， ５Ｈ）， １０．１２３ （ｓ， １Ｈ）．
【０１７８】
ｂ） ３−ベンジル−５，７−ジメトキシ−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（１．２ｇ）を、予備加熱（８５℃）されたメタンスルホン酸（３．５ｍｌ）に添加し、その温度で１５分間維持した。溶液を冷却し、ついで氷水で処理した。生成物をろ過し、重炭酸ナトリウムおよび水で洗浄した。収量１．０８ｇ（９５％）。^１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ）： ２．４８６ （ｓ， ３Ｈ）， ３．７８５ （ｓ， ３Ｈ）， ３．８０８ （ｓ， ３Ｈ）， ３．９８５ （ｓ， ２Ｈ）， ６．３１５ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．４ Ｈｚ）， ６．４７２ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．４ Ｈｚ）， ７．１−７．３ （ｍ， ５ Ｈ）， １１．５２ （ｓ， １Ｈ）．
【０１７９】
ｃ） ３−ベンジル−５，７−ジヒドロキシ−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（１ｇ）を窒素雰囲気下にピリジン塩酸塩（５ｇ）中で２０分間還流した。反応混合物を水で処理し、生成物をろ過した。収量０．９ｇ（１００％）。融点３０７〜３１２℃。^１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ）： ２．５０３ （ｓ， ３Ｈ）， ３．９４２ （ｓ， ２Ｈ）， ６．１０２ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．３ Ｈｚ）， ６．１８７ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．３ Ｈｚ）， ７．１−７．２５ （ｍ， ５Ｈ）， ９．７２５ （ｓ， １Ｈ）， ９．９８４ （ｓ， １Ｈ）， １１．２８５ （ｓ， １Ｈ）．
【０１８０】
ｄ） １，３−ジベンジル−５，７−ジメトキシ−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン
実施例（８）ｂの生成物（１ｇ）、カリウムｔ−ブトキシド（０．６２ｇ）および臭化ベンジル（０．６８ｍｌ）を、ＤＭＳＯ（１０ｍｌ）中で６０℃にて４時間攪拌した。反応混合物を水で処理し、トルエンで抽出し蒸発させた。生成物をエチルエーテルで粉砕し、ろ過した。収量０．５ｇ（３９％）。^１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ）： ２．５３７ （ｓ， ３Ｈ）， ３．７０８ （ｓ， ３Ｈ）， ３．８２６ （ｓ， ３Ｈ）， ４．１２４ （ｓ， ２Ｈ）， ５．５６ （ｂ，２Ｈ）， ６．４１３−６．４３４ （ｍ， ２Ｈ）， ７．１５４−７．３３２ （ｍ， １０Ｈ）．
【０１８１】
ｅ） １，３−ジベンジル−５，７−ジヒドロキシ−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（２ｇ）を、実施例（８）ｃに記載のように、ピリジン塩酸塩（１０ｇ）で処理した。生成物を酢酸エチルで抽出し、蒸発させた。収量１．４ｇ（７５％）。^１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ）： ２．５７０ （ｓ， ３Ｈ）， ４．０７６ （ｓ， ２Ｈ）， ５．４５０ （ｂ， ２Ｈ）， ６．１３５ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．２ Ｈｚ）， ６．１９９ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．２ Ｈｚ）， ７．１２８−７．３３３ （ｍ，１０Ｈ）， ９．８３ （ｂ， １Ｈ）， １０．１６６ （ｓ， １Ｈ）．
【０１８２】
ｆ） ５，７−ビス（シアノメトキシ）−１，３−ジベンジル−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（１．４ｇ）を、実施例（１）ｂに記載のように、ＤＭＦ（２０ｍｌ）中のクロロアセトニトリル（０．７６ｇ）およびＫ_２ＣＯ_３（２．５ｇ）で処理した。収量１．５ｇ（８９％）。^１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ）： ２．５５５ （ｓ， ３Ｈ）， ４．１４６ （ｓ， ２Ｈ）， ５．２１４ （ｓ， ２Ｈ）， ５．２７５ （ｓ， ２Ｈ）， ５．５７８ （ｓ， ２Ｈ）， ６．７３５ （ｓ， ２Ｈ）， ７．１３−７．３３ （ｍ， １０Ｈ）．
【０１８３】
ｇ） ５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−１，３−ジベンジル−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（１．３ｇ）を、実施例（１）ｃに記載のように、アジ化ナトリウム（０．４１ｇ）および塩化アンモニウム（０．３４ｇ）で処理した。収量０．６９ｇ（４５％）。^１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ）： ２．４７１ （ｓ， ３Ｈ）， ４．１１３ （ｓ， ２Ｈ）， ５．４７７ （ｓ， ２Ｈ）， ５．５５ （ｂ， ２Ｈ）， ５．５７４ （ｓ， ２Ｈ）， ６．６７０ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．１ Ｈｚ）， ６．７７５ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．１ Ｈｚ）， ７．１３−７．３２ （ｍ， １０Ｈ）．
【０１８４】
実施例（９） ５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−３−ベンジル−１，４−ジメチル−２（１Ｈ）−キノリノンの製造
ａ） ３−ベンジル−５，７−ジメトキシ−１，４−ジメチル−２（１Ｈ）−キノリノン
実施例（８）ｂの生成物（０．５ｇ）、ｔ−ＢｕＯＫ（０．２ｇ）およびヨウ化メチル（０．４ｍｌ）をＤＭＳＯ（５ｍｌ）中で３５℃にて２日間攪拌した。反応混合物を水で処理し、トルエンで抽出した。生成物を、溶離液としてトルエン−酢酸エチル−酢酸（８：２：１）を用いてカラムクロマトグラフィーにより精製した。収量０．２４ｇ（４６％）。^１Ｈ−ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ）： ２．５１ （ｓ， ３Ｈ）， ３．６３２ （ｓ， ２Ｈ）， ３．８４６ （ｓ， ３Ｈ）， ３．８９６ （ｓ， ３Ｈ）， ４．０４７ （ｓ， ２Ｈ）， ６．４６８ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．３ Ｈｚ）， ６．５５８ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．３ Ｈｚ）， ７．１−７．２６ （ｍ， ５Ｈ）．
【０１８５】
ｂ） ３−ベンジル−５，７−ジヒドロキシ−１，４−ジメチル−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（０．２ｇ）を、実施例（８）ｃに記載のように、ピリジン塩酸塩（２ｇ）で処理し、生成物を酢酸エチルで抽出した。収量０．１６ｇ（８９％）。^１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ）： ２．５６７ （ｓ， ３Ｈ）， ３．５１５ （ｓ， ３Ｈ）， ４．００５ （ｓ， ２Ｈ）， ６．２４４ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．３ Ｈｚ）， ６．２６８ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．３ Ｈｚ）， ７．０８−７．２５ （ｍ， ５Ｈ）， ９．８７９ （ｓ， １Ｈ）， １０．１１３ （ｓ， １Ｈ）．
【０１８６】
ｃ） ５，７−ビス（シアノメトキシ）−３−ベンジル−１，４−ジメチル−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（０．１５ｇ）、クロロアセトニトリル（０．０８ｇ）およびＫ_２ＣＯ_３（０．２８ｇ）を、実施例（１）ｂに記載のように、ＤＭＦ（２ｍｌ）中で反応させた。収量０．１６ｇ（８４％）。^１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ）： ２．５２４ （ｓ， ３Ｈ）， ３．６５８ （ｓ， ３Ｈ）， ４．０７９ （ｓ， ２Ｈ）， ５．２９２ （ｓ， ２Ｈ）， ５．３７９ （ｓ， ２Ｈ）， ６．７６６ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．３ Ｈｚ）， ６．８５５ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．３ Ｈｚ）， ７．１３−７．２４ （ｍ ５Ｈ）．
【０１８７】
ｄ） ５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−３−ベンジル−１，４−ジメチル−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（０．１５ｇ）を、実施例（１）ｃに記載のように、ＤＭＦ（２ｍｌ）中のＮａＮ_３（５７ｍｇ）およびＮＨ_４Ｃｌ（４７ｍｇ）で処理した。収量０．１１５ｇ。融点２５０〜２５３℃。^１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ）： ２．４５１ （ｓ， ３Ｈ），３．６４９ （ｓ， ３Ｈ）， ４．０４２ （ｓ， ２Ｈ）， ６．７９２ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．２ Ｈｚ）， ６．８３３ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝Ｈｚ）， ７．１−７．２５ （ｍ， ５Ｈ）．
【０１８８】
実施例（１０） ３−ベンジル−５，７−ビス［（２−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オンおよびその３種類の異性体の製造
ヨウ化メチル０．０７ｍｌを、実施例（１）ｃの生成物０．２ｇおよびＫ_２ＣＯ_３０．３１ｇのＤＭＦ２ｍｌ溶液に添加し、混合物を室温で４時間攪拌した。反応混合物を氷水中に注ぎ、ろ過した。収量：４種類の位置異性体の混合物として０．２ｇ。融点７１〜７６℃。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ４００ＭＨｚ）： ２．４７ （ｓ， ＣＨ_３）， ２．４８ （ｓ， ＣＨ_３）， ３．９３ （ｓ， ＣＨ_２Ｐｈ）， ４．１１ （ｓ， ＮＣＨ_３）， ４．１２ （ｓ， ＮＣＨ_３）， ４．１５ （ｓ， ＮＣＨ_３）， ４．３８ （ｓ， ＮＣＨ_３）， ４．４０ （ｓ， ＮＣＨ_３）， ５．５１ （ｓ， ＯＣＨ_２）， ５．５２ （ｓ， ＯＣＨ_２）， ５．６２ （ｓ， ＯＣＨ_２）， ５．６７ （ｓ， ＯＣＨ_２）， ６．８４−６．９１ （ｍ， ２Ｈ）， ７．１６−７．２８ （ｍ， ５Ｈ， Ｐｈ）．
【０１８９】
実施例（１１） ３−ベンジル−５，７−ビス［１−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）エトキシ］−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン、立体異性体の混合物の製造
ａ） ３−ベンジル−５，７−ビス［（１−シアノ）エトキシ］−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
実施例（１）ａの生成物（１ｇ）、２−クロロプロピオニトリル（０．７ｇ）および炭酸カリウム（２ｇ）をＤＭＦ（１５ｍｌ）中で、窒素雰囲気下、１１０℃で６０分間加熱した。混合物を水で処理し、ろ過し、１Ｎ ＮａＯＨおよび水で洗浄した。収量１．２ｇ。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ３００ＭＨｚ）： １．７４−１．７８ （ｔ＋ｔ， ６ Ｈ，ＣＨ−ＣＨ _３）， ２．５３ （ｓ， ３ Ｈ）， ３．９７ （ｓ， ２Ｈ）， ５．５８−５．６６ （ｍ， ２Ｈ， ＣＨ−ＣＨ_３）， ６．８７ （ｍ， １Ｈ）， ６．９９ （ｄ， １Ｈ）， ７．１８−７．３１ （ｍ， ５Ｈ）．
【０１９０】
ｂ） ３−ベンジル−５，７−ビス［１−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）エトキシ］−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン、立体異性体の混合物
前実施例の生成物（０．５ｇ）、アジ化ナトリウム（０．１８ｇ）および塩化アンモニウム（０．１５ｇ）を、ＤＭＦ（７ｍｌ）中で、１００℃にて９０分間加熱した。生成物を水で処理し、酢酸エチルで抽出し、蒸発させた。収量０．５７ｇ。融点９１〜１０４℃。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ３００ＭＨｚ）： １．６９−１．７７ （ｍ， ６ Ｈ， ＣＨ−ＣＨ _３）， ２．５４ （ｓ， ３Ｈ）， ３．９４ （ｓ， ２Ｈ）， ６．１０−６．１７ （（ｍ， ２Ｈ， ＣＨ−ＣＨ_３）， ６．６５ （ｄｄ， １Ｈ）， ６．７４ （ｄｄ， １Ｈ）， ７．１３−７．３０ （ｍ， ５Ｈ）．
【０１９１】
実施例（１２） ５，７−ビス（カルボキシメトキシ）−１，３−ジベンジル−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノンの製造
【０１９２】
実施例（８）ｆの生成物（０．２ｇ）を、濃塩酸（３ｍｌ）および酢酸（２ｍｌ）からなる溶液中で１時間還流した。生成物を２５℃でろ過した。収量０．１４ｇ。^１Ｈ−ＮＭＲ （３００ Ｍｈｚ， ＤＭＳＯ−ｄ_６）： ２．６３ （ｓ， ＣＨ_３）， ４．１４ （ｓ， ２Ｈ， ＣＨ_２Ｐｈ）， ４．６６ （ｓ， ２ Ｈ， ＯＣＨ_２ＣＯＯＨ）， ４．７９ （ｓ， ２Ｈ， ＯＣＨ_２ＣＯＯＨ）， ５．５３ （ｓ， ２Ｈ， ＮＣＨ_２Ｐｈ）， ６．４１（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．２ Ｈｚ）， ６．４５ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．２ Ｈｚ）， ７．１３−７．３４ （ｍ， １０Ｈ， Ｐｈ）．
【０１９３】
実施例（１３） ３−ベンジル−５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−１−（４−フルオロベンジル）−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノンの製造
ａ） １−ベンジル−５，７−ジメトキシ−３−（４−フルオロベンジル）−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン
実施例（８）ｂの生成物（２ｇ）、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（０．８７ｇ）および４−フルオロベンジルクロライド（１．１２ｇ）を、実施例（８）ｄに記載のように、ＤＭＳＯ（２０ｍｌ）中で６０℃にて３時間加熱した。収量１．２８ ｇ。^１Ｈ−ＮＭＲ （４００ Ｍｈｚ， ＤＭＳＯ−ｄ_６）： ２．５３ （ｓ， ３Ｈ）， ３．７３ （ｓ， ３Ｈ）， ３．８３ （ｓ， ３Ｈ）， ５．５５ （ｓ， ２Ｈ）， ６．４３ （ｓ， ２Ｈ）， ７．１２−７．２ （ｍ， ５Ｈ）， ７．２６−７．２８ （ｍ， ４Ｈ）．
【０１９４】
ｂ） ３−ベンジル−５，７−ジヒドロキシ−１−（４−フルオロベンジル）−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（１．２５ｇ）を、ピリジン塩酸塩（１２．５ｇ）中で、約２２５℃にて９分間加熱した。収量１ｇ。^１Ｈ−ＮＭＲ （３００ Ｍｈｚ， ＤＭＳＯ−ｄ_６）： ２．５６ （ｓ， ３Ｈ）， ４．０７ （ｓ， ２Ｈ）， ５．４ （ｂ， ２Ｈ）， ６．１３ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．１ Ｈｚ）， ６．２０ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．１ Ｈｚ）， ７．１２−７．２８ （ｍ， ９Ｈ）， ９．８８ （ｓ， １Ｈ）， １０．２２ （ｓ， １Ｈ）．
【０１９５】
ｃ） ３−ベンジル−５，７−ビス（シアノメトキシ）−１−（４−フルオロベンジル）−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（１ｇ）、ＣｌＣＨ_２ＣＮ（０．４３ｇ）およびＫ_２ＣＯ_３（１．４２ｇ）を、ＤＭＦ（８ｍｌ）中で１２０℃にて１時間加熱した。収量０．９４ｇ。^１Ｈ−ＮＭＲ （３００ Ｍｈｚ， ＤＭＳＯ−ｄ_６）： ２．５５ （ｓ， ３Ｈ）， ４．１４ （ｓ， ２Ｈ）， ５．２５ （ｓ， ２Ｈ）， ５．２８ （ｓ， ２Ｈ）， ５．５７ （ｓ， ２Ｈ）， ６．７４ （ｓ， ２Ｈ， ＡｒＨ）， ７．１−７．３ （ｍ， ９Ｈ）．
【０１９６】
ｄ） ３−ベンジル−５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−１−（４−フルオロベンジル）−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（０．５ｇ）、アジ化ナトリウム（０．１４ｇ）および塩化アンモニウム（０．１２ｇ）を、ＤＭＦ（５ｍｌ）中で１２０℃にて９０分間加熱した。生成物をアセトニトリルで粉砕した。収量０．２８ｇ。融点１２６〜１３２℃。^１Ｈ−ＮＭＲ （３００ Ｍｈｚ， ＤＭＳＯ−ｄ_６）： ２．４８ （ｓ， ３Ｈ）， ４．１１ （ｓ， ２Ｈ）， ５．５１ （ｓ， ２Ｈ）， ５．５５ （ｓ， ２Ｈ）， ５．５８ （ｓ， ２Ｈ）， ６．６７ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．１ Ｈｚ）， ６．７８ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．１ Ｈｚ）．
【０１９７】
実施例（１４） ５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−３−（４−クロロベンジル）−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オンの製造
ａ） ３−（４−クロロベンジル）−５，７−ジヒドロキシ−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
フロログルシノール（１．５７ｇ）および２−（４−クロロベンジル）アセト酢酸エチル（３．１８ｇ）のエタノール（２５ｍｌ）溶液を、０℃にて無水ＨＣｌで１．５時間処理し、溶液をこの温度に一晩維持した。溶媒を蒸発させ、沈殿を水で粉砕した。収量３．８７ｇ（９８％）。融点２７０〜２７８℃。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ３００ ＭＨｚ）： ２．５２ （ｓ， ３Ｈ， ＣＨ_３）， ３．８７ （ｓ， ２Ｈ， ＣＨ_２）， ６．１７ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．４ Ｈｚ）， ６．２８ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．４ Ｈｚ）， ７．１８−７．３４ （ｍ， ４Ｈ， Ｐｈ）， １０．２１ （ｓ， １Ｈ， ＯＨ）， １０．４８ （ｓ， １Ｈ， ＯＨ）．
【０１９８】
ｂ） ５，７−ビス（シアノメトキシ）−３−（４−クロロベンジル）−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
前実施例の生成物（１．００ｇ）、クロロアセトニトリル（０．５０ｇ）および炭酸カリウム（２．１８ｇ）を、ＤＭＦ（５ｍｌ）中で１００℃にて３０分間加熱した。生成物を、実施例（１）ｂに記載のように単離した。収量０．９０ｇ（７２％）。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ３００ ＭＨｚ）： ２．５２ （ｓ， ３Ｈ， ＣＨ_３）， ３．９５ （ｓ， ２Ｈ， ＣＨ_２）， ５．３０８ （ｓ， ２Ｈ， ＯＣＨ_２ＣＮ）， ５．３１２ （ｓ， ２Ｈ， ＯＣＨ_２ＣＮ）， ６．８１ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．５ Ｈｚ）， ６．９４ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．５ Ｈｚ）， ７．２２−７．３３ （ｍ， ４Ｈ， Ｐｈ）．
【０１９９】
ｃ） ５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−３−（４−クロロベンジル）−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
前実施例の生成物（０．４０ｇ）、アジ化ナトリウム（０．１４ｇ）および塩化アンモニウム（０．１１ｇ）を、ＤＭＦ（２ｍｌ）中で１００℃にて２時間加熱した。生成物を、実施例（１）ｃに記載のように単離した。収量０．４０ｇ（８２％）。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ３００ ＭＨｚ）： ２．４６ （ｓ， ３Ｈ， ＣＨ_３）， ３．９２ （ｓ， ２Ｈ， ＣＨ_２）， ５．６０２ （ｓ， ２Ｈ， ＯＣＨ_２Ｔｅｔ）， ５．６０９ （ｓ， ２Ｈ， ＯＣＨ_２Ｔｅｔ）， ６．８３ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．５ Ｈｚ）， ６．８５ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．５ Ｈｚ）， ７．２０−７．３３ （ｍ， ４Ｈ， Ｐｈ）．
【０２００】
実施例（１５） ５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−３−（４−ニトロベンジル）−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オンの製造
ａ） ５，７−ジヒドロキシ−４−メチル−３−（４−ニトロベンジル）−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
フロログルシノール（０．４８ｇ）および２−（４−ニトロベンジル）アセト酢酸エチル（１．００ｇ）のエタノール（１５０ｍｌ）溶液を、０℃にて無水ＨＣｌで７．５時間処理し、溶液をこの温度に一晩維持した。溶媒を蒸発させ、沈殿を水で粉砕した。収量０．６３ｇ（５１％）。融点２８０〜２８５℃。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６， ３００ ＭＨｚ）： ２．５３ （ｓ， ３Ｈ， ＣＨ_３）， ４．０３ （ｓ， ２Ｈ， ＣＨ_２）， ６．１９ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．４ Ｈｚ）， ６．２９ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．４ Ｈｚ）， ７．４０−７．５１ および ８．１１−８．１７ （ｍ， ４Ｈ Ｐｈ）， １０．２５ （ｓ， １Ｈ， ＯＨ）， １０．５２ （ｓ， １Ｈ， ＯＨ）．
【０２０１】
ｂ） ５，７−ビス（シアノメトキシ）−３−（４−ニトロベンジル）−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
前実施例の生成物（０．５７ｇ）、クロロアセトニトリル（０．２７ｇ）および炭酸カリウム（１．２０ｇ）を、ＤＭＦ（２ｍｌ）中で１００℃にて５０分間加熱した。生成物を、実施例（１）ｂに記載のように単離した。収量０．４７ｇ（６７％）。融点１７８〜１８５℃。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ４００ ＭＨｚ）： ２．５３ （ｓ， ３Ｈ， ＣＨ_３）， ４．１１ （ｓ， ２Ｈ， ＣＨ_２）， ５．３１９ （ｓ， ２Ｈ， ＯＣＨ_２ＣＮ）， ５．３２３ （ｓ， ２Ｈ， ＯＣＨ_２ＣＮ），６．８３ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．４ Ｈｚ）， ６．９６ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．４ Ｈｚ）， ７．４８−７．５３ および ８．１２−８．１６ （ｍ， ４Ｈ， Ｐｈ）．
【０２０２】
ｃ） ５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−３−（４−ニトロベンジル）−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
前実施例の生成物（０．３８ｇ）、アジ化ナトリウム（０．１２ｇ）および塩化アンモニウム（０．１１ｇ）を、ＤＭＦ（３ｍｌ）中で１００℃にて２時間加熱した。生成物を、実施例（１）ｃに記載のように単離した。収量０．２５ｇ（５４％）。融点２４０〜２４４℃。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ４００ ＭＨｚ）： ２．４７ （ｓ， ３Ｈ， ＣＨ_３）， ４．０８ （ｓ， ２Ｈ， ＣＨ_２）， ５．６１１ （ｓ， ２Ｈ， ＯＣＨ_２Ｔｅｔ）， ５．６２３ （ｓ， ２Ｈ， ＯＣＨ_２Ｔｅｔ），６．８５ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．４ Ｈｚ）， ６．８７ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．４ Ｈｚ）， ７．４６−７．５０ および ８．１２−８．１６ （ｍ， ４Ｈ， Ｐｈ）．
【０２０３】
実施例（１６） ５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−３−シクロペンチル−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オンの製造ａ） ３−シクロペンチル−５，７−ジヒドロキシ−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
フロログルシノール（２．００ｇ）および２−シクロペンチルアセト酢酸エチル（３．１４ｇ）のエタノール（４０ｍｌ）溶液を、０℃にて無水ＨＣｌで２．５時間処理し、溶液をこの温度に一晩維持した。溶媒を蒸発させ、沈殿をトルエン−ＥｔＯＡｃ−ＡｃＯＨ（８：１：１）で溶離するフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。収量１．２２ｇ（２９％）。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ３００ ＭＨｚ）：１．５０−１．８８ （ｍ， ８Ｈ， −（ＣＨ_２）_４−）， ２．５７ （ｓ， ３Ｈ， ＣＨ_３）， ３．２５ （ｍ， １Ｈ， ＣＨ）， ６．１１ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．４ Ｈｚ）， ６．２５ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．４ Ｈｚ）， １０．２５ （ｂ， ２Ｈ， ＯＨ）．
【０２０４】
ｂ） ５，７−ビス（シアノメトキシ）−３−シクロペンチル−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
前実施例の生成物（０．５０ｇ）、クロロアセトニトリル（０．３１ｇ）および炭酸カリウム（０．６１ｇ）を、ＤＭＦ（２ｍｌ）中で８０℃にて４０分間加熱した。生成物を、実施例（１）ｂに記載のように単離した。収量０．５６ｇ（８６％）。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ３００ ＭＨｚ）： １．５５−１．９０ （ｍ， ８Ｈ， −（ＣＨ_２）_４−）， ２．５６（ｓ， ３Ｈ， ＣＨ_３）， ３．３７ （ｍ， １Ｈ， ＣＨ）， ５．２９ （ｓ， ２Ｈ， ＯＣＨ_２ＣＮ）， ５．３１ （ｓ， ２Ｈ， ＯＣＨ_２ＣＮ）， ６．７５ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．５ Ｈｚ）， ６．８８ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．５ Ｈｚ）．
【０２０５】
ｃ） ５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−３−シクロペンチル−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
前実施例の生成物（０．３０ｇ）、アジ化ナトリウム（０．１３ｇ）および塩化アンモニウム（０．１１ｇ）を、ＤＭＦ（１ｍｌ）中で１００℃にて１．５時間加熱した。生成物を、実施例（１）ｃに記載のように単離した。収量０．３０ｇ（８０％）。融点２４８〜２５２℃。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ４００ ＭＨｚ）： １．５３−１．８９（ｍ， ８Ｈ， −（ＣＨ_２）_４−）， ２．５１（ｓ， ３Ｈ， ＣＨ_３）， ３．３４ （ｍ， １Ｈ， ＣＨ）， ５．５９ （ｓ， ２Ｈ， ＯＣＨ_２Ｔｅｔ）， ５．６１ （ｓ， ２Ｈ， ＯＣＨ_２Ｔｅｔ）， ６．８０ （ｓ， ２Ｈ）．
【０２０６】
実施例（１７） ５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−４−メチル−３−（１−ナフチルメチル）−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オンの製造
ａ） ５，７−ジヒドロキシ−４−メチル−３−（１−ナフチルメチル）−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
フロログルシノール（０．４７ｇ）および２−（１−ナフチルメチル）アセト酢酸エチル（１．００ｇ）のエタノール（２０ｍｌ）溶液を、０℃にて無水ＨＣｌで３時間処理し、溶液をこの温度に一晩維持した。溶媒を蒸発させ、沈殿を水で粉砕し、イソプロパノール−水（１：１）から再結晶した。収量０．９６ｇ（７８％）。融点２７５〜２８０℃。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ４００ ＭＨｚ）： ２．４５ （ｓ， ３Ｈ， ＣＨ_３）， ４．３２ （ｓ， ２Ｈ， ＣＨ_２）， ６．２３ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．５ Ｈｚ）， ６．３２ （ｄ， １ Ｈ， Ｊ＝２．５ Ｈｚ）， ６．９７−８．２５ （ｍ， ７Ｈ， Ｎａｐｈ）， １０．２６ （ｓ， １Ｈ， ＯＨ）， １０．５３ （ｓ， １Ｈ， ＯＨ）．
【０２０７】
ｂ） ５，７−ビス（シアノメトキシ）−４−メチル−３−（１−ナフチルメチル）−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
前実施例の生成物（０．８０ｇ）、クロロアセトニトリル（０．３６ｇ）および炭酸カリウム（０．６６ｇ）を、ＤＭＦ（４ｍｌ）中で１００℃にて１時間加熱した。生成物を、実施例（１）ｂに記載のように単離した。収量０．３０ｇ（３０％）。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ３００ ＭＨｚ）： ２．４５ （ｓ， ３Ｈ， ＣＨ_３）， ４．４０ （ｓ， ２Ｈ， ＣＨ_２）， ５．３４ （ｓ， ２Ｈ， ＯＣＨ_２ＣＮ）， ５．３６ （ｓ， ２Ｈ， ＯＣＨ_２ＣＮ）， ６．８６ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．５ Ｈｚ）， ７．０１０ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．５ Ｈｚ）， ７．０１６−８．２７ （ｍ， ７Ｈ， Ｎａｐｈ）．
【０２０８】
ｃ） ５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−４−メチル−３−（１−ナフチルメチル）−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
前実施例の生成物（０．２５ｇ）、アジ化ナトリウム（０．０８０ｇ）および塩化アンモニウム（０．０７２ｇ）を、ＤＭＦ（２ｍｌ）中で１００℃にて２．５時間加熱した。生成物を、実施例（１）ｃに記載のように単離した。収量０．１１ｇ（３６％）。融点１６４〜１７４℃。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ３００ ＭＨｚ）： ２．４０ （ｓ， ３Ｈ， ＣＨ_３）， ４．３７ （ｓ， ２Ｈ， ＣＨ_２）， ５．６３ （ｓ， ２Ｈ， ＯＣＨ_２Ｔｅｔ）， ５．６５ （ｓ， ２Ｈ， ＯＣＨ_２Ｔｅｔ）， ６．８７ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．５ Ｈｚ）， ６．９２ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．５ Ｈｚ）， ６．９８−８．２６ （ｍ， ７Ｈ，Ｎａｐｈ）．
【０２０９】
実施例（１８） １−ベンジル−５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−メトキシ］−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノンの製造
ａ） ５，７−ジメトキシ−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン
アセト酢酸ｔｅｒｔ−ブチル（１．５８ｇ）を１２０℃に加熱し、キシレン（４ｍｌ）に溶解した３，５−ジメトキシアニリン（１．５３ｇ）を添加した。混合物を１２０〜１３０℃で２０分間加熱し、ついで室温まで冷却した。メタンスルホン酸（２ｍｌ）を添加し、混合物を周囲温度で１０分間攪拌した。水（４０ｍｌ）を添加し、沈殿をろ過し乾燥した。収量１．３１ｇ（６０％）。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ３００ ＭＨｚ）： ２．５０ （ｓ， ３Ｈ， ＣＨ_３）， ３．７９ （ｓ， ３Ｈ， ＯＣＨ_３）， ３．８３ （ｓ， ３Ｈ， ＯＣＨ_３）， ６．０３ （ｓ， １Ｈ， ＣＨ＝Ｃ）， ６．３１ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．３ Ｈｚ）， ６．４５ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．３ Ｈｚ）， １１．４ （ｂ， １Ｈ， ＮＨ）．
【０２１０】
ｂ） １−ベンジル−５，７−ジメトキシ−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（１．２０ｇ）をＤＭＳＯ（１５ｍｌ）中に懸濁しｔ−ＢｕＯＫ（０．６８ｇ）および臭化ベンジル（１．０３ｇ）を添加した。反応混合物を周囲温度で一晩攪拌した。水を添加し、生成物をＥｔＯＡｃ中に抽出した。ＥｔＯＡｃを乾燥し、蒸発乾燥させた。生成物をトルエンから再結晶した。収量０．８０ｇ（４７％）。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ３００ ＭＨｚ）： ２．５５ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ＝１．１ Ｈｚ， ＣＨ_３）， ３．７１ （ｓ， ３Ｈ， ＯＣＨ_３）， ３．８４ （ｓ， ３Ｈ， ＯＣＨ_３）， ５．４８ （ｂ， ２Ｈ， ＮＣＨ_２）， ６．２９ （ｄ，１Ｈ， Ｊ＝１．１ Ｈｚ， ＣＨ＝Ｃ）， ６．４ （ｓ， ２Ｈ）， ７．１８−７．３３ （ｍ， ５Ｈ， Ｐｈ）．
【０２１１】
ｃ） １−ベンジル−５，７−ジヒドロキシ−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（０．６９ｇ）をＣＨ_２Ｃｌ_２（１４ｍｌ）中に溶解し、反応混合物を−２０℃に冷却した。ＣＨ_２Ｃｌ_２中のＢＢｒ_３（２．４ｇ）（１Ｍ溶液）を添加し、混合物を一晩で周囲温度まで暖めた。沈殿をろ過し、ＣＨ_２Ｃｌ_２で洗浄し、ＥｔＯＡｃ中に溶解した。ＥｔＯＡｃを希ＨＣｌで洗浄し、乾燥し、蒸発乾燥した。収量０．３４ｇ（５４％）。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ３００ ＭＨｚ）： ２．５６ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ＝１．０ Ｈｚ， ＣＨ_３）， ５．３３ （ｂ， ２Ｈ， ＮＣＨ_２）， ６．１１ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．１ Ｈｚ）， ６．１３ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝１．０ Ｈｚ， ＣＨ＝Ｃ）， ６．１７ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．１ Ｈｚ）， ７．１２−７．３４ （ｍ， ５Ｈ， Ｐｈ）， ９．９０ （ｂ， １Ｈ， ＯＨ）， １０．２２ （ｓ， １Ｈ， ＯＨ）．
【０２１２】
ｄ） １−ベンジル−５，７−ビス（シアノメトキシ）−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（０．３４ｇ）、クロロアセトニトリル（０．１３ｇ）および炭酸カリウム（０．３４ｇ）を、ＤＭＦ（２ｍｌ）中で１００℃にて１．５時間加熱した。水を添加し、沈殿をろ過し乾燥した。生成物をイソプロパノールから再結晶した。収量０．２０ｇ（４６％）。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ４００ ＭＨｚ）： ２．５７ （ｓ， ３Ｈ， ＣＨ_３）， ５．２２ （ｓ， ２Ｈ， ＯＣＨ_２ＣＮ）， ５．３０ （ｓ， ２Ｈ， ＯＣＨ_２ＣＮ）， ５．５０ （ｂ， ２Ｈ， ＮＣＨ_２）， ６．４２ （ｓ， １Ｈ， ＣＨ＝Ｃ）， ６．７０ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．１ Ｈｚ）， ６．７３ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．１ Ｈｚ）， ７．２１−７．３２ （ｍ， ５Ｈ， Ｐｈ）．
【０２１３】
ｅ） １−ベンジル−５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（０．２０ｇ）、アジ化ナトリウム（０．０７２ｇ）および塩化アンモニウム（０．０６０ｇ）を、ＤＭＦ（２ｍｌ）中で１００℃にて３時間加熱した。生成物を、実施例（１）ｃに記載のように単離した。収量０．２１ｇ（８５％）。融点２４６〜２４９℃。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ４００ ＭＨｚ）： ２．５０ （ｓ， ３Ｈ， ＣＨ_３）， ５．４８ （ｂ， ４Ｈ， ＯＣＨ_２Ｔｅｔ， ＮＣＨ_２）， ５．６０ （ｓ， ２Ｈ， ＯＣＨ_２Ｔｅｔ）， ６．３４ （ｓ， １Ｈ， ＣＨ＝Ｃ）， ６．６４ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝１．９ Ｈｚ）， ６．７７ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝１．９ Ｈｚ）， ７．１８−７．３２ （ｍ， ５Ｈ， Ｐｈ）．
【０２１４】
実施例（１９） １−ベンジル−５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−３−（２−フルオロベンジル）−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノンの製造
ａ） ５，７−ジメトキシ−３−（２−フルオロベンジル）−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン
キシレン（１ｍｌ）中の２−（２−フルオロベンジル）アセト酢酸エチル（２．５ｇ）を１５０℃に加熱し、キシレン（４ｍｌ）中の３，５−ジメトキシアニリン（１．４６ｇ）を３０分間で少しずつ添加した。反応混合物を１６０℃で３時間加熱し、ついで室温まで冷却した。メタンスルホン酸（１．７ｍｌ）を添加し、混合物を周囲温度で３０分間攪拌した。水を添加し、沈殿をろ過し、乾燥した。生成物を温エタノールで粉砕した。収量０．６４ｇ（２１％）。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ３００ ＭＨｚ）： ２．４５ （ｓ， ３Ｈ）， ３，７９ （ｓ， ３Ｈ）， ３．８２ （ｓ， ３Ｈ）， ３．９７ （ｓ， ２Ｈ），６．３３ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．４ Ｈｚ）， ６．４８ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．４ Ｈｚ）， ６．９０−７．２５ （ｍ， ４Ｈ）， １１．６１ （ｓ， １Ｈ）．
【０２１５】
ｂ） １−ベンジル−５，７−ジメトキシ−３−（２−フルオロベンジル）−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（０．６２ｇ）をＤＭＳＯ（１２ｍｌ）中のｔ−ＢｕＯＫ（０．２３ｇ）および臭化ベンジル（０．３６ｇ）で６０℃にて２．５時間処理した。生成物を、実施例（１８）ｂに記載のように単離した。収量０．３９ｇ（４９％）。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ４００ ＭＨｚ）： ２．５１ （ｓ， ３Ｈ）， ３．７２ （ｓ， ３Ｈ）， ３．８４ （ｓ， ３Ｈ）， ４．１１ （ｓ， ２Ｈ）， ５．５５ （ｂ， ２Ｈ）， ６．４３３ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．１ Ｈｚ）， ６．４４３ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．１ Ｈｚ）， ６．９７−７．３３ （ｍ， ９Ｈ）．
【０２１６】
ｃ） １−ベンジル−５，７−ジヒドロキシ−３−（２−フルオロベンジル）−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（０．３４ｇ）を、実施例（１８）ｃに記載のように、ＣＨ_２Ｃｌ_２（７ｍｌ）中のＢＢｒ_３（８．４８ｇ）で処理した。収量０．３０ｇ（８２％）。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ４００ ＭＨｚ）： ２．５５ （ｓ， ３Ｈ）， ４．０６ （ｓ， ２Ｈ）， ５．４０ （ｂ， ２Ｈ）， ６．１３ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．１ Ｈｚ）， ６．２２ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．１ Ｈｚ）， ６．９７−７．３３ （ｍ， ９Ｈ）， １０．３ （ｂ， ２Ｈ）．
【０２１７】
ｄ） １−ベンジル−５，７−ビス（シアノメトキシ）−３−（２−フルオロベンジル）−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（０．２１ｇ）、クロロアセトニトリル（０．０８６ｇ）および炭酸カリウム（０．３７ｇ）を、ＤＭＦ（２ｍｌ）中で１００℃にて２時間加熱した。生成物を、実施例（１）ｂに記載のように単離した。収量０．１８ｇ（７１％）。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ４００ ＭＨｚ）： ２．５３ （ｓ， ３Ｈ）， ４．１３ （ｓ， ２Ｈ）， ５．２３ （ｓ， ２Ｈ）， ５．２９ （ｓ， ２Ｈ）， ５．５７ （ｂ， ２Ｈ）， ６．７４６ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．３ Ｈｚ）， ６．７５６ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２，３ Ｈｚ）， ７．００−７．３２ （ｍ， ９Ｈ）．
【０２１８】
ｅ） １−ベンジル−５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−３−（２−フルオロベンジル）−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（０．１７ｇ）、アジ化ナトリウム（０．０５１ｇ）および塩化アンモニウム（０．０４２ｇ）を、ＤＭＦ中で１００℃にて３時間加熱した。生成物を、実施例（１）ｃに記載のように単離した。収量０．１７ｇ（８５％）。融点１３５〜１４０℃。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ４００ ＭＨｚ）： ２．４６ （ｓ， ３Ｈ）， ４．１０ （ｓ， ２Ｈ）， ５．４８ （ｓ， ２Ｈ）， ５．５１（ｂ， ２Ｈ）， ５，５９ （ｓ， ２Ｈ）， ６．６８ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．２ Ｈｚ）， ６．７９ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．２ Ｈｚ）， ６．９９−７．３２ （ｍ， ９Ｈ）．
【０２１９】
実施例（２０） １−ベンジル−５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−メトキシ］−４−メチル−３−（２−フェニルエチル）−２（１Ｈ）−キノリノンの製造
ａ） ５，７−ジメトキシ−４−メチル−３−（２−フェニルエチル）−２（１Ｈ）−キノリノン
キシレン（５ｍｌ）中の２−（２−フェニルエチル）アセト酢酸エチル（２．７０ｇ）を、実施例（１９）ａに記載のように、１５０℃にて３，５−ジメトキシアニリン（１．６０ｇ）で処理した。メタンスルホン酸（４．０ｍｌ）を室温で添加し、混合物を８０℃で１時間加熱した。生成物を、実施例（１９）ａに記載のように単離した。収量１．３８ｇ（４１％）。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ４００ ＭＨｚ）：２．４５ （ｓ， ３Ｈ）， ２．６４−２．６８ （ｍ， ２Ｈ）， ２．８２−２．８６ （ｍ， ２Ｈ）， ３．７８ （ｓ， ３Ｈ）， ３．８１ （ｓ， ３Ｈ）， ６．３０ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．３ Ｈｚ）， ６．４５ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．３ Ｈｚ）， ７．１８−７．３０ （ｍ， ５Ｈ）， １１．４５ （ｓ， １Ｈ）．
【０２２０】
ｂ） １−ベンジル−５，７−ジメトキシ−４−メチル−３−（２−フェニルエチル）−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（０．６１ｇ）、ｔ−ＢｕＯＫ（０．２４ｇ）および臭化ベンジル（０．３６ｇ）を、ＤＭＳＯ（１２ｍｌ）中で６０℃にて２時間加熱した。生成物を、実施例（１８）ｂに記載のように単離した。収量０．３１ｇ（４０％）。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ４００ ＭＨｚ）： ２．５１ （ｓ， ３Ｈ）， ２．７３−２．７７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．９６−３．００ （ｍ， ２Ｈ）， ３．７０ （ｓ， ３Ｈ）， ３．８３ （ｓ， ３Ｈ）， ５．５５ （ｂ， ２Ｈ）， ６．４０ （ｓ， ２Ｈ）， ７．１７−７．３３ （ｍ， １０Ｈ）．
【０２２１】
ｃ） １−ベンジル−５，７−ジヒドロキシ−４−メチル−３−（２−フェニルエチル）−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（０．３１ｇ）を、実施例（１８）ｃに記載のように、ＣＨ_２Ｃｌ_２（５ｍｌ）中のＢＢｒ_３（０．７５ｇ）で処理した。収量０．２６ｇ（８９％）。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ３００ ＭＨｚ）： ２．５６ （ｓ， ３Ｈ）， ２．６９−２．７５ （ｍ， ２Ｈ）， ２．９０−２．９５ （ｍ， ２Ｈ）， ５．３９ （ｂ， ２Ｈ）， ６．０８ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．０ Ｈｚ）， ６．１９ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．０ Ｈｚ）， ７．１１−７．３３ （ｍ， １０Ｈ）， １０．２ （ｂ，２Ｈ）．
【０２２２】
ｄ） １−ベンジル−５，７−ビス（シアノメトキシ）−４−メチル−３−（２−フェニルエチル）−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例からの生成物（０．２２ｇ）、クロロアセトニトリル（０．０９１ｇ）および炭酸カリウム（０．３９ｇ）を、１００℃にて２時間加熱した。生成物を、実施例（１）ｂに記載のように単離した。収量０．２０ｇ（７６％）。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ４００ ＭＨｚ）： ２．５０ （ｓ， ３Ｈ）， ２．７３−２．７７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．９８−３．０２ （ｍ， ２Ｈ）， ５．２１ （ｓ， ２Ｈ）， ５．２９ （ｓ， ２Ｈ）， ５．５６ （ｂ， ２Ｈ）， ６．７０ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．１ Ｈｚ）， ６．７２ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．１ Ｈｚ）， ７．１８−７．３３ （ｍ， １０Ｈ）．
【０２２３】
ｅ） １−ベンジル−５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−４−メチル−３−（２−フェニルエチル）−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（０．１９ｇ）、アジ化ナトリウム（０．０５７ｇ）および塩化アンモニウム（０．０４７ｇ）を、ＤＭＦ中で１００℃にて３時間加熱した。生成物を、実施例（１）ｃに記載のように単離した。収量０．１８ｇ（７８％）。融点２１５〜２１８℃。^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６， ４００ ＭＨｚ）： ２．４６ （ｓ， ３Ｈ）， ２．７０−２．７４ （ｍ， ２Ｈ）， ２．９５−２．９９ （ｍ， ２Ｈ）， ５．４７ （ｓ， ２Ｈ）， ５．５４ （ｂ， ２Ｈ）， ５．５７ （ｓ， ２Ｈ）， ６．６４ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．０ Ｈｚ）， ６．７７ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．０ Ｈｚ）， ７．１６−７．３３ （ｍ， １０Ｈ）．
【０２２４】
実施例（２１） ５，７−ビス（アミノカルボニルメトキシ）−１，３−ジベンジル−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノンの製造
５，７−ジヒドロキシ−１，３−ジベンジル−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン（０．５ｇ）、炭酸カリウム（０．９ｇ）および２−クロロアセトアミド（０．２５ｇ）をＤＭＦ（６．５ｍｌ）中に含む混合物を、１００℃にて２時間反応させた。反応混合物を氷水で処理し、ろ過した。生成物を、熱エタノールで粉砕した。収量０．３２ｇ。融点２５２〜２５３℃。^１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ_６）： ２．６３ （ｓ， ３Ｈ， ＣＨ_３）， ４．１３ （ｓ， ２Ｈ， ＰｈＣＨ_２）， ４．３７ （ｓ， ２Ｈ， ＯＣＨ_２）， ４．５５ （ｓ， ２Ｈ， ＯＣＨ_２）， ５．５４ （ｓ， ２Ｈ， ＮＣＨ_２Ｐｈ）， ６．４０ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２ Ｈｚ， ＡｒＨ）， ６．５３ （ｄ， １Ｈ，Ｊ＝２ Ｈｚ， ＡｒＨ）， ７．１３−７．３３ （ｍ， １０Ｈ， Ｐｈ）， ７．４４ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ＝６５ Ｈｚ， ＣＯＮＨ_２）， ７．４７ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ＝６８ Ｈｚ， ＣＯＮＨ_２）．
【０２２５】
実施例（２２） ５，７−ビス（エトキシカルボニルメトキシ）−１，３−ジベンジル−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノンの製造
５，７−ジヒドロキシ−１，３−ジベンジル−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン（１ｇ）、２−ブロモ酢酸エチル（０．６３ｍｌ）および炭酸カリウム（１．４９ｇ）をＤＭＦ（５ｍｌ）中に含む混合物を、窒素雰囲気下に１１０℃にて３時間加熱し、氷水中に注ぎ、ろ過した。得られた固体物質を、エーテルで粉砕し、再びろ過した。収量１．０３ｇ。融点１１３〜１１６℃。^１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ_６）： １．１５ （ｔ， ３Ｈ， ＣＨ_３ＣＨ_２， Ｊ＝７．１ Ｈｚ）， １．２０ （ｔ， ３Ｈ， ＣＨ_３ＣＨ_２， Ｊ＝７．１ Ｈｚ）， ２．６３ （ｓ， ３Ｈ， ＣＨ_３）， ４．０３ （ｑ， ２Ｈ， ＣＨ_２ＣＨ_３， Ｊ＝７．１ Ｈｚ）， ４．１３ （ｓ， ２Ｈ， ＣＨ_２Ｐｈ）， ４．１７ （ｑ， ２Ｈ， ＣＨ_２ＣＨ_３， Ｊ＝７．１ Ｈｚ）， ４．７８ （ｓ， ２Ｈ， ＯＣＨ_２）， ４．９０ （ｓ， ２Ｈ， ＯＣＨ_２）， ６．４１ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．２ Ｈｚ）， ６．４４ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．２ Ｈｚ）， ７．１３−７．３３ （ｍ， １０Ｈ， Ｐｈ）．
【０２２６】
実施例（２３） ５，７−ビス（ヒドロキシアミノカルボニルメトキシ）−１，３−ジベンジル−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノンの製造
前実施例の生成物（０．３ｇ）、ヒドロキシルアミン塩酸塩（０．３２ｇ）および５Ｎ ＮａＯＨ（１．０５ｍｌ）を、エタノール（８ｍｌ）中で５０℃にて６時間反応させた。反応混合物を水で処理し、塩基性（ｐＨ１０）にし、ろ過した。ろ液をｐＨ２まで酸性化し、ろ過した。収量０．２ｇ。融点１２１〜１２７℃。^１Ｈ−ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ_６）： ヒドロキサム酸の互変異性型がＯＣＨ_２シグナルに見られた。２．６３ （ｓ，３Ｈ， ＣＨ_３）， ４．１３ （Ｓ， ２Ｈ， ＣＨ_２Ｐｈ）， ４．４１ （ｓ， ２Ｈ， ＯＣＨ_２），４．５４ （ｓ， ２Ｈ， ＯＣＨ_２）， ４．６４ （ｓ， ２Ｈ， ＨＯＮ＝Ｃ（ＯＨ）ＣＨ_２Ｏ）， ４．６５ （ｓ， ２Ｈ， ＨＯＮ＝Ｃ（ＯＨ）ＣＨ_２Ｏ）， ４．７７ （ｓ， ２Ｈ， ＨＯＮ＝Ｃ（ＯＨ）ＣＨ_２Ｏ）， ４．７８ （ｓ， ２Ｈ， ＨＯＮ＝Ｃ（ＯＨ）ＣＨ_２Ｏ）， ５．５４ （ｓ， ２Ｈ， ＮＣＨ_２Ｐｈ）， ６．３８−６．５４ （ｍ， ２Ｈ， ＡｒＨ）， ７．１４−７．３４ （ｍ， １０Ｈ， Ｐｈ）， ９．０５ （ｂ， ２Ｈ， ＮＯＨ）， １０．８４ （ｓ， １Ｈ， ＨＯＮＨＣＯ）， １０．８８ （ｓ， １Ｈ， ＨＯＮＨＣＯ）．
【０２２７】
実施例５ ＰＬＢ不活性化剤の設計
ホスホランバンに対して決定された三次元構造を、該タンパク質に結合する化合物を選択するためのターゲットとして用いることができる。ホスホランバンへの優れた親和性を得るために、リガンドは、ターゲットと立体的かつ静電的相補性を有すべきである。とくに、優れた静電的相互作用および／または水素結合相互作用が部位Ｓ１およびＳ２と形成されるべきであり、また優れた疎水的相互作用が部位Ｓ３およびＳ４と形成されるべきである。そのような目的に利用できる任意の種々のコンピュータプログラムおよびデータベースを用いて、これらの要求を満たす化合物を設計することができる。構造に基づく研究方法としては、デノボ設計、コンピュータに基づくターゲットに相補的なリガンドの選択、および優勢な分子のコンピュータ支援最適化があげられる。ＰＬＢ結合性化合物の検出は、以下の工程を用いて進めることができる。
【０２２８】
１．タンパク質のターゲット領域を選択する。効果的なホスホランバン不活性化剤ペプチドｃＰ２２６の結合モデルを用いて、ホスホランバン不活性化剤用のターゲットとして機能し得るホスホランバンの表面上の領域を定めることができる。とくに、これにより、設計すべき化合物と相互作用することができるホスホランバンの側鎖が決定される。
【０２２９】
２．結合部位に相補的な小さい分子を、たとえば、Ｌｕｄｉ、ＤＯＣＫまたはＬｅａｐＦｒｏｇのような入手可能なソフトウェアを用いることによりターゲットに結合させることができる。この結合に、小さな分子または分子フラグメントの三次元構造のコンピューターデータベースを用いることができる。このような研究方法により、ターゲット領域の種々の部分と優れた相互作用を有する分子またはフラグメントが与えられる。
【０２３０】
３．ターゲット領域に結合する種々の小さい分子またはフラグメントを結合し、または新しい側鎖および／または官能基をそれらに組み込み、単一のより大きな分子を得ることができる。得られる新規化合物は、より小さい分子よりも、ターゲットへの親和性が優れている可能性が高い。
【０２３１】
４．対話型分子グラフィックシステムを用いることにより、タンパク質の結合部位の近くの適当な足場または結合部を選択することができる。次に、足場に新しいフラグメントおよび官能基を加えて、新しい基が、ターゲットの表面と優れた相互作用を呈するようにさせることができる。
【０２３２】
５．環状ペプチドｃＰ２２６は、ホスホランバンのリガンド結合部位に結合する化合物の一例である。ｃＰ２２６の構造を、ホスホランバンに親和性を有する新規化合物を設計するためのモデルとして用いることができる。ペプチド模倣体、より一般的にはペプチドの模倣体（ｍｉｍｉｃｓ）を設計するための充分に洗練された任意の方法を用いて、そのような化合物を設計することができる。
【０２３３】
先に概説した方法により、限定された数の化合物を選択することができる。当業者は、コンピュータシステムに格納されたホスホランバンの三次元構造を用いることにより、そのような化合物を同定することができる。ついで実施例３に概説したアッセイと同様のアッセイにて、その化合物を合成し、ホスホランバンを不活性化する能力を試験することができる。
【０２３４】
【表４】

【０２３５】
【表５】

【０２３６】
【表６】

【０２３７】
【表７】

【０２３８】
【表８】

【０２３９】
【表９】

【０２４０】
略語
ＰＬＢ、ホスホランバン；ＰＬＢ［ａ．ａ．１−３６］、ヒトホスホランバンの３６ａ．ａ．Ｎ末端フラグメント；ＳＲ、筋小胞体；ＳＥＲＣＡ、筋／細胞質内小胞体Ｃａ^２＋−ＡＴＰａｓｅ；ＳＥＲＣＡ ２、筋／細胞質内小胞体Ｃａ^２＋−ＡＴＰａｓｅの心臓アイソフォーム；ＣＤ、円偏光２色性；ＣＯＳＹ、相関分光法；ＴＯＣＳＹ、全相関分光法；ＮＯＥＳＹ、核オーバーハウゼル・エンハンスメント分光法；ｄ_３−ＴＦＥ、過重水素化トリフルオロエタノール；ｄ_１０−ＤＴＴ、過重水素化ジチオスレイトール
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、さまざまな種（ヒト、ブタ、ウサギ、ラット、マウス、ニワトリ）由来のホスホランバンのアミノ酸配列を示す。
【図２】図２は、環状ペプチドｃＰ２２６のＮＭＲ構造の例図である。
【図３】図３は、ＰＬＢ（１〜３６）のＮＭＲ構造の例図である。
【図４】図４は、ＰＬＢ（１〜３６）と環状ペプチドｃＰ２２６との複合体のモデル構造の例図である。
【図５】図５は、二元複合体のモデルにおけるｃＰ２２６のＰＬＢ（１〜３６）との主たる相互作用の例図である。静電気的結合、Ｈ−結合または疎水性相互作用に必要な能力を有する重原子間距離を示す。
【図６】図６は、Ｓ１〜Ｓ４として示される４つの相互作用部位に分けられた、リガンドに対する結合部位を形成するＰＬＢアミノ酸側鎖を示す例図である。
【図７】図７は、ＰＬＢ（１〜３６）に関して観測された連続ＮＯＥおよび中位ＮＯＥの連続性（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｉｅｓ）の要約である。
【図８】図８は、ＰＬＢ構造上への実施例１ｃの化合物の重ね合わせの例図である。
【図９】図９は、ＮＯＥデータにより得られたＰＬＢ（１〜３６）の構造の質を示す。残基当たりのＲＭＳＤおよび残基当たりの制限（ｒｅｓｔｒａｉｎｔｓ）数を示す。
【図１０】図１０は、ｃＰ２２６に関して観測された連続ＮＯＥおよび中位ＮＯＥの連続性の要約である。
【図１１】図１１は、ＮＭＲデータから演繹されるｃＰ２２６の１２個の構造からなる群の例図である。
【図１２】図１２のＡおよびＢは、心臓（Ａ）および速骨格筋（Ｂ）のＳＲベジクル中へのＣａ^２＋取り込み率に対する実施例１ｃ（５０および１００μＭ）の化合物の効果を示す。
【図１３】図１３は、ＰＬＢ不活性化剤の三次元ファーマコフォア（Ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ）を説明する。
【図１４】図１４は、ＰＬＢ不活性化剤のファーマコフォアにおける実施例１２の化合物の適合を証明する。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to determining the three-dimensional structure of phospholamban (PLB) using NMR data of sufficiently high resolution for three-dimensional structure determination. The present invention also enables the design of compounds that inactivate phospholamban based on using three-dimensional structural data provided on a computer readable medium, as analyzed by a computer system with appropriate computer algorithms. To a method for logical drug design. The present invention also relates to phospholamban inactivating compounds having structural, physicochemical, and spatial properties that allow interaction with specific residues of phospholamban. This interaction is Ca²⁺-Blocks the inhibitory effect of phospholamban on ATPase, whereby compounds having this effect are reduced to Ca, such as congestive heart disease.²⁺-It will be effective in treating diseases in which the ATPase Ca pump activity may be reduced.
[0002]
[Prior art]
Phospholamban (PLB) is a low molecular weight protein (52 amino acids) present in slow and smooth muscle of the heart, cAMP-dependent phosphokinase and Ca²⁺/ Calmodulin-dependent phosphokinase. The amino acid sequences of phospholamban from various species are shown in FIG. Phosphorylation / dephosphorylation of phospholamban is induced by sarcoplasmic reticulum / ER in muscle cells.²⁺-Has been shown to regulate ATPase (SERCA_2). Phospholamban binds in a non-phosphorylated form to specific regions of a large loop in the cytoplasmic domain of SERCA_2,²⁺Have been shown to inhibit the SERCA_2 pump by decreasing the affinity of SERCA_2 for HER2 (while the phosphorylated form does not inhibit SERCA_2).
[0003]
Phospholamban and Ca²⁺It has been proposed that the region essential for functional binding to ATPase is in the cytoplasmic domain of phospholamban, while the transmembrane region anchors PLB to the sarcoplasmic membrane.
[0004]
In the last decade, by means of crosslinking experiments, or by reconstitution of SERCA_2 with point-mutated PLB, or finally, circular dichroism, laser light dispersion photometry-FTIR spectroscopy and NMR Efforts have been made to at least partially elucidate the secondary structure of PLB by obtaining direct structural information by spectroscopy. Molecular modeling has been used to hypothesize the quaternary structure of the transmembrane region in the PLB pentamer. The resulting structural information has been recently reviewed (Arkin, IT et al. (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 26, 157-179).
[0005]
PLB is i) an amphipathic oligopeptide, ii) contains three cysteines, and iii) tends to pentamerize in vitro, thus providing good conditions for studying its structure, Finding a suitable solvent system that suppresses specific aggregation is not trivial. Thus, to date, NMR studies have been performed on short PLB fragments or in organic solvents. In each case, no evidence of quaternary structure for the cytosolic domain of PLB has been found.
[0006]
Inhibition of CaATPase may play a causal role in heart disease with elevated myocyte calcium levels. This inhibition can be harmful in such diseases, as phospholamban inhibits SR CaATPase. For example, phospholamban-Ca²⁺-By preventing the ATPase interaction, the cardiac SR Ca²⁺-Compounds capable of reducing the inhibitory effect of phospholamban on ATPase would be potentially effective in the treatment of heart disease as described above. There are few examples in the literature of compounds that can prevent CaATPase inhibition by phospholamban. Such compounds include anti-phospholamban antibodies, some large polyanionic oligopeptides and tannins.
[0007]
Problems to be Solved by the Invention and Means for Solving the Problems
In the present invention, phospholamban can assume a well-characterized conformation in which the phospholamban is a common conformation that allows interaction with specific residues of phospholamban in a defined conformation. It has been found that it can bind to a wide range of low molecular weight compounds having structural, physicochemical, and spatial properties. This interaction inactivates phospholamban and prevents its inhibitory effect on CaATPase. Phospholamban inactivating compounds are potentially useful in the treatment of heart diseases where activation of SR CaATPase is beneficial. As used herein, a phospholamban inactivating compound is referred to as a phospholamban inactivating agent.
[0008]
The present invention is based on the complete elucidation of the three-dimensional structure of the whole cytosolic domain of phospholamban and its ligand binding site made by the present inventors.
[0009]
In one aspect, the invention provides a design of a phospholamban deactivator based on using three-dimensional structural data provided on a computer-readable medium, as analyzed by a computer system having appropriate computer algorithms. A method for enabling logical drug design. Compounds designed and identified according to the method of the present invention have the ability to produce cardiac SR Ca²⁺-The inhibitory effect of phospholamban on ATPase can be reduced, and thus such compounds act as phospholamban inactivators by direct binding to phospholamban proteins. Such compounds have common structural, physicochemical, and spatial properties that allow the compound to interact with particular residues at the ligand binding site of phospholamban.
[0010]
In another aspect, the invention provides a three-dimensional structure of a phospholamban cytosolic domain provided in a computer-readable medium.
[0011]
Still other aspects of the present invention will be apparent to those skilled in the art from the following detailed description and examples of the invention.
[0012]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Structure of Phospholamban (1-36)
The present invention is based on the complete elucidation of the three-dimensional structure of the whole cytosol domain of phospholamban (PLB) and the ligand binding site made by the present inventors. It is possible to determine the structure of the cytosolic domain of phospholamban using NMR spectroscopy methods in which the NMR data has sufficiently high resolution for three-dimensional structure determination. The method comprises the steps of 1 to 36a. Of phospholamban for NMR analysis in an aqueous solution containing 30% trifluoroethanol. a. Providing a fragment, which consists of the six amino acids of the cytosolic and transmembrane domains. The three-dimensional structure can then be determined from the NMR data by distance geometry followed by simulated annealing. The method is described in detail in Example 1.
[0013]
Phospholamban (1-36) fragments were found to adopt the conformational properties of the helix-turn-helix motif. The residues of the turn are Ile18, Glu19, Met20 and Pro21, which are adjacent to two phosphorylation sites Ser16 and Thr17. Proline is in the trans conformation. Both helices have preferentially charged polar residues on one side and the other side is lipophilic. The hydrophilic side of the N-terminal helix always faces the lipophilic side of the C-terminal helix, which defines a pocket that can be described as an amphipathic arm pit. This means that the PLB assumes a prolonged position (ie, the axes of the two helices should be nearly parallel) to interact with SERCA_2, but in a bent conformation, these charges Means that they were not exposed to ATPase but were eventually exposed to the surface charge of the phospholipid bilayer. Thus, the gentle relative positioning of the two helices around the movable central hinge domain is a functional feature of PLB. This flexibility may explain why PLB can take an extended structure in organic solvents.
[0014]
The structure also states that the pocket between the hydrophilic site of the N-terminal helix and the lipophilic site at the C-terminal (defined as an amphipathic armpit) stabilizes the bend conformation by PLB. It is an ideal target for low molecular weight amphipathic drug molecules designed with the purpose of inactivating. Such a molecule can be found in the cardiac SR Ca²⁺-Reduces the inhibitory effect of phospholamban on ATPase and will therefore act as a PLB inactivator by binding directly to the active site of PLB.
[0015]
Structure of cP226
A series of peptides were screened to find compounds that interact with PLB. The cyclic peptide of formula (pI) was found to be able to bind PLB and activate calcium uptake into liposomes containing both SERCA_2 and PLB. It was concluded that the cyclic peptide of formula (pI) binds to non-phosphorylated PLB and prevents PLB inhibition of SERCA_2 and acts as a PLB inactivator. Therefore, the cyclic peptides of formula (pI) are useful as lead compounds for logical drug design and in the treatment of diseases where PLB inactivation is desired. The cyclic dipeptide (pI) has the structure:
[0016]
Embedded image

[0017]
(X is preferably Tyr or Ala)
Having.
[0018]
The cyclic peptide of formula (pI) where X is Tyr was named cP226. The tertiary structure of cP226 was analyzed by NMR spectroscopy to determine the ligand binding site of PLB. The method used is described in detail in Example 2. The three-dimensional structure of cP226 shows a bend-coil-bend motif. The lipophilic side chains of Try-3, Leu-5, Trp-7 and Leu-8 cluster on one side of the cyclic peptide. The three-dimensional coordinates of cyclic peptide cP226 are provided in Table I attached herein.
[0019]
Structure of composite cP226 · PLB (1-36)
Based on the analyzed tertiary structure of PLB (1-36) and its ligand cP226, it was possible to prepare a model of the complex cP226.PLB (1-36) by molecular modeling. The three-dimensional model describes the interaction of PLB (1-36) with its ligand, which interaction is important in binding the ligand to the cytosolic domain of PLB.
[0020]
The structures of PLB (1-36) and cP226 analyzed by NMR were used as templates for complex construction. cP226 was docked interactively with the aid of molecular graphics and was guided by a possible interaction between the two peptides. The structure of cP226 indicates that the peptide has two negatively charged side chains (Glu-4 and Glu-6) on one side and hydrophobic on the other side (Trp-7, Leu-8 and Pro-9) (FIG. 2). In PLBs (1-36), three positively charged opposing surfaces are mainly by the hydrophobic surface of the C-terminal helix (eg, Leu-28, Leu-31, Phe-32, Phe-35). There are clusters of side chains (Arg-9, Arg-13, Arg-14) (FIG. 3). cP226 brings Glu-4 and Glu-6 into contact with Arg-9, Arg-13 and Arg-14, while Trp-7, Leu-8 and Pro-9 bind the hydrophobic surface of the PBL C-terminal helix. Manually docked on PLB (1-36) to be close. This provided a starting point for the energy refinement of the complex.
[0021]
The energy of the resulting composite was minimized by Insight II using a general charge field (gvff93). Rough minimization was performed by the steepest gradient method followed by the conjugate gradient method and the Newton method.
[0022]
FIG. 4 shows the structure of the energy minimizing complex cP226.PLB (1-36). The final total energy of the composite was 113 kcal / mol (non-bonded dispersion energy -1574 kcal / mol, Coulomb energy -690 kcal / mol).
[0023]
A schematic diagram of the mode of binding of cP226 to PLB is shown in FIG. The binding can be described by four binding sites (S1-S4) that bind Glu-4, Glu-6, Trp-7 and Pro-9, respectively (Table II, FIG. 6). Glu-4 has an electrostatic / H-binding interaction with Tyr-6, Arg-9 and Arg-13 (S1), Glu-6 binds to Arg-14 (S2), and Trp-7 has Buried mainly in the hydrophobic pocket (S3) formed by Met-20, Lys-27 and Leu-28, and Pro-9 mainly in the hydrophobic gap (S4) formed by Phe-32 and Phe-35. ). In addition, Leu-5 is backed by a hydrophobic portion of the side chain of Arg-13, and the NH of the indole of Try-7 can form an H-bond with the carbonyl of Arg-13. A positively charged N-terminal amino group (NH₃ ⁺) Is near the hydrophobic binding site S4.
[0024]
[Table 1]

[0025]
Thus, the term "binding site S1" refers to the amino acid residues Tyr-6, Arg-9 and / or Arg-13, in particular the -OH group of Tyr-6, the guanidinium group of Arg-9 and / or the guanidinium of Arg-13. It is defined as the space enclosed by the base.
[0026]
The term "binding site S2" is defined as the space surrounded by the amino acid residue Arg-14, particularly the guanidinium group of Arg-14.
[0027]
The term "binding site S3" is defined as the space surrounded by the amino acid residues Met-20, Lys-27 and / or Leu-28, especially their side chains.
[0028]
The term "binding site S4" is defined as the space surrounded by amino acid residues Phe-32 and / or Phe-35, especially their phenyl groups.
[0029]
The three-dimensional atomic coordinates of the phospholamban (1-36) in a conformation that permits the binding of the cyclic peptide cP226 are disclosed in Table III attached herein. The three-dimensional atomic coordinates of the complex between phospholamban (1-36) and the cyclic peptide cP226 are set forth in Table IV attached hereto. FIG. 8 is an explanatory diagram in which one compound designed by the method of the present invention is superimposed on a PLB structure.
[0030]
Logical drug design
Structure determination methods are also provided by the present invention for logical drug design of PLB ligands. Such drug design uses computer modeling programs that calculate the structure of various molecules that are expected to interact with the determined binding sites of PLB or other structural or functional domains. These molecules are then prepared and screened for PLB inactivating activity according to the methods of the present invention.
[0031]
The present invention represents a previously unknown ligand binding site of the PLB cytosolic domain and consists of a well defined three-dimensional array of atoms. The atomic coordinates of PLB (1-36) in a conformation that allows binding of the PLB inactivator to the PLB cytosolic domain are disclosed in Table III. This structure enables, for the first time, a structure-based design of a highly active PLB deactivator. The structure of the PLB cytosolic domain provided herein allows for the screening of known compounds and the design of novel molecules that bind to the ligand binding site of the PLB cytosolic domain using a computerized evaluation system. . For example, a computer-modeling system is used. In that system, the atomic coordinates of the PLB cytosolic domain and its ligand binding site, as provided in Table III, can be used as input data. Thus, in the method, the computer readable medium may be symbolized with data representing the coordinates of Table III.
[0032]
Accordingly, the present invention provides a method for identifying or designing a phospholamban inactivator, the method comprising:
(I) providing atomic coordinates defining a three-dimensional structure of a cytosolic domain of phospholamban or a ligand binding portion thereof;
(Ii) selecting candidate molecules that can adopt the three-dimensional structure to interact with the binding site of the three-dimensional structure or have good steric and electrostatic complementarity with the binding site of the three-dimensional structure; And
(Iii) identifying a selected candidate molecule as a potential phospholamban inactivator, then synthesizing the potential phospholamban inactivator and testing for its ability to function as a phospholamban inactivator Consists of
[0033]
In another aspect, the invention provides a method for identifying a phospholamban inactivator, comprising:
(I) providing a first computer readable dataset defining a three-dimensional structure of a phospholamban cytosolic domain or its ligand binding site;
(Ii) combining the first computer readable dataset with a second computer readable dataset defining the structure of the candidate molecule;
(Iii) assessing the ability of the candidate molecule to interact with at least three binding sites of the phospholamban cytosol domain or its ligand binding portion, wherein the binding site is the S1 binding site of the phospholamban cytosol domain, the S2 binding A site, an S3 binding site and an S4 binding site,
(Iv) selecting a candidate molecule that suitably interacts with at least three binding sites of the phospholamban cytosolic domain or a ligand binding portion thereof;
(V) identifying the candidate molecule as a potential phospholamban inactivator, then synthesizing the potential phospholamban inactivator and testing for its ability to function as a phospholamban inactivator.
[0034]
In another aspect, the present invention provides a method for selecting a compound capable of binding to a phospholamban cytosolic domain or a ligand binding portion thereof from a database of chemical structures, the method comprising:
(I) providing atomic coordinates defining a three-dimensional structure of a phospholamban cytosolic domain or a ligand binding portion thereof;
(Ii) assessing the compatibility of one or more functional group interactions at at least three binding sites of the phospholamban cytosolic domain or a ligand binding portion thereof;
(Iii) from the database of chemical structures each compound has one or more functional groups evaluated in the previous step that have favorable interactions with at least three binding sites of the phospholamban cytosolic domain or its ligand binding portion. Selecting a first set of one or more compounds; and
(Iv) selecting from the first set of compounds a second compound having a structure that has optimal compatibility of interaction with at least three binding sites of the three-dimensional structure of the phospholamban cytosol domain or its ligand binding portion. Consisting of
[0035]
Preferably, the atomic coordinates are provided by any computerized modeling system well known in the art.
[0036]
In general, the present invention also provides a method of designing a phospholamban inactivator, the method comprising:
(I) providing, with a computerized modeling system, atomic coordinates defining the three-dimensional structure of the phospholamban cytosolic domain or a ligand binding portion thereof;
(Ii) designing a phospholamban inactivator candidate molecule using the atomic coordinates.
[0037]
Also, the method is suitably performed using standard computer-aided molecular design techniques. The design process is preferably
(Ii) selecting a target region on the surface of the phospholamban cytosolic domain or a ligand binding portion thereof that functions as a region for binding of a phospholamban inactivator candidate molecule;
(Iib) selecting one or more molecules or fragments capable of associating with the target region;
(Iic) using a computer software program to fit the three-dimensional structure of the molecule or fragment to the target region;
(Id) using the results obtained from the computer software program to identify molecules or fragments thereof that have a favorable steric or electrostatic interaction with the target region.
[0038]
The method further comprises:
(Ie) synthesizing a molecule or a fragment thereof having a preferred steric and electrostatic interaction with the phospholamban cytosolic domain or a ligand binding portion thereof, and
(If) testing the molecule or fragment thereof for its ability to inactivate phospholamban.
[0039]
Further, the design step includes:
(Ie ') one or more small molecules or fragments thereof having favorable steric or electrostatic interactions with the target region of the phospholamban cytosolic domain or ligand binding portion thereof to form a single larger molecule. And (iif ′) testing the single larger molecule for its ability to inactivate phospholamban.
[0040]
The design process, or
(Iiaaa) using an interactive molecular graphics system to fit the molecular scaffold to the target region of the phospholamban cytosolic domain or its ligand binding portion; and
(Iibb) may comprise adding a functional group or fragment thereof to the molecular scaffold to create a single, larger molecule having favorable steric or electrostatic interactions with the target region.
[0041]
The three-dimensional structure used in the above method is the three-dimensional structure of the phospholamban cytosol domain formed in a complex with the phospholamban inactivator, particularly at the binding sites S1 to S4 and / or in the vicinity thereof. Is preferred.
[0042]
All of the above methods further synthesize a potential phospholamban inactivator and combine the synthesized potential phospholamban inactivator with the phospholamban inactivator as described in detail in Example 3, or in a variation thereof. Testing for CaATPase activation in the presence of
[0043]
The present invention also provides a computer-readable medium storing the atomic coordinates of the structure of a PLB cytosolic domain or a part thereof in a conformation that allows binding of a PLB inactivating agent to the PLB cytosolic domain.
[0044]
As used herein, "computer-readable medium" means any medium that can be read and accessed directly by a computer. Examples of such a medium include, but are not limited to, a magnetic storage medium such as a floppy disk, a hard disk storage medium, and a magnetic tape; an optical storage medium such as an optical disk or a CD-ROM; Electronic storage media; hybrids of these categories, such as magnetic / optical storage media. A skilled technician can readily evaluate how currently known computer readable media can be used to make a product comprising a computer readable medium that stores the atomic coordinates of the PLB structure. The choice of data storage structure is generally based on the means chosen to access the stored information. Various data processing programs and formats may be used to store the atomic coordinate data of the present invention on a computer readable medium.
[0045]
By providing a computer readable medium having stored therein the atomic coordinate data of the PLB structure, a skilled technician can routinely access the atomic coordinate data of the structure of the PLB cytosolic domain or a part thereof. Computer algorithms are publicly and commercially available that allow skilled technicians to access and analyze this data provided on computer readable media and to analyze it for structural determination and / or logical drug design. . See, for example, Biotechnology Software Directory, Mary Ann Liebert Publ. , New York (1995).
[0046]
The structural atomic coordinates of the PLBs (1-36) represented in Table III may be used for displays such as three-dimensional shapes, or for other uses such as computer-aided manipulation of the structural coordinates they define. It can be stored in a computer readable format on a readable storage medium. For example, data defining the three-dimensional structure of a PLB cytosolic domain or portion thereof is stored on a computer-readable storage medium, and typically can read data from the storage medium, and read from such data. Using a computer programmed with instructions to create the display, it can be displayed as a graphical three-dimensional representation of the protein structure. Thus, the present invention includes, together with any additional data and instructions for manipulating such data, data representing the structural coordinates of a PLB protein of the present invention, for example, coordinates as represented in Table III. And a machine such as a computer having a memory. Such data can be used for various purposes, such as logical drag design. The invention also encompasses the coordinates of Table III, as well as their translations or rotations, which maintain the internal coordinates, ie, maintain the intrinsic internal association. One of ordinary skill in the art will appreciate that the coordinates may undergo other transformations, including, for example, molecular mechanism calculations such as dynamic simulations, minimization, and the like.
[0047]
For example, a first computer readable dataset defining the three-dimensional structure of a PLB cytosolic domain or a portion thereof may include the ability of the candidate molecule to associate with a PLB cytosolic domain protein, and / or the location of such association and / or Combined with a second computer-readable data set that defines the structure of the candidate molecule using a computer programmed with instructions to evaluate orientation.
[0048]
The protein structure encoded by the data can be displayed in a graphical format that allows visual inspection of the structure as well as visual inspection of the structure association with the candidate molecule. Also, more quantitative calculations may be used. For example, one method of the invention for assessing the ability of a candidate molecule to associate with the PLB cytosolic domain comprises the steps of: i) employing a computational means to perform a fitting operation between the candidate molecule and the binding site of PLB. And ii) analyzing the results of the fitting procedure to quantify the association between the candidate molecule and the binding site of PLB.
[0049]
One method of the invention is provided for selecting a compound capable of binding to the PLB cytosolic domain from a database of chemical structures. The method begins with structural coordinates that define the three-dimensional structure of the PLB cytosolic domain or a portion thereof. The binding site of the three-dimensional structure is characterized with respect to the compatibility of the interaction with one or more functional groups. The database of chemical structures is then searched for candidate compounds containing functional groups that have been arranged for favorable interaction with PLB based on the previous characterization. In this way, compounds having a structure that best fits the point of favorable interaction with the three-dimensional structure are identified.
[0050]
Computer programs for viewing three-dimensional structures or for manipulating atomic coordinates are available and are well known to those skilled in the art.
[0051]
Phospholamban inactivating compound
The present invention provides compounds that can associate with at least three of the four binding sites S1, S2, S3 and S4 of the PLB cytosolic domain. It can be seen that such a compound has a phospholamban inactivating ability. In particular, the present invention provides a phospholamban inactivating compound comprising at least any three of the following:
(A) a first electronegative moiety capable of associating with an S1 binding site consisting of Try-6, Arg-9 and / or Arg-13 when the inactivator binds to the PLB cytosolic domain;
(B) a second electronegative moiety capable of associating with the S2 binding site consisting of Arg-14 when the inactivator binds to the PLB cytosolic domain;
(C) a first hydrophobic moiety capable of associating with an S3 binding site consisting of Met-20, Lys-27 and / or Leu-28 when the inactivator binds to the PLB cytosolic domain; and
(D) a second hydrophobic moiety capable of associating with the S4 binding site consisting of Phe-32 and / or Phe-35 when the inactivator binds to the PLB cytosolic domain.
[0052]
In particular, the present invention provides a phospholamban inactivating compound comprising at least any three of the following:
(A) When the inactivating agent binds to the PLB cytosolic domain, the PLB cytosolic domain undergoes a hydrogen bond with the -OH group of Tyr-6, a salt bridge with the guanidinium group of Arg-9 and / or Arg-. A first electronegative moiety capable of forming a salt bridge with the guanidinium group of 13,
(B) a second electronegative moiety capable of forming a salt bridge with the guanidinium group of Arg-14 of the PLB cytosol domain when the inactivating agent binds to the PLB cytosol domain;
(C) When the inactivator binds to the PLB cytosolic domain, it is capable of associating with the hydrophobic pocket created by Met-20, Lys-27 and / or Leu-28 of the PLB cytosolic domain. Sex part, and
(D) a second hydrophobic moiety capable of associating with the hydrophobic pocket created by Phe-32 and / or Phe-35 of the PLB cytosolic domain when the inactivating agent binds to the PLB cytosolic domain.
[0053]
In particular, the present invention
(A) When the inactivating agent binds to the PLB cytosolic domain, the PLB cytosolic domain undergoes a hydrogen bond with the —OH group of Try-6, a salt bridge with the guanidinium group of Arg-9 and / or Arg-. A first electronegative moiety capable of forming a salt bridge with 13 guanidinium groups;
(B) a second electronegative moiety capable of forming a salt bridge with the guanidinium group of Arg-14 of the PLB cytosolic domain when the inactivating agent binds to the PLB cytosolic domain; and
(C) When the inactivator binds to the PLB cytosolic domain, it is capable of associating with the hydrophobic pocket created by Met-20, Lys-27 and / or Leu-28 of the PLB cytosolic domain. Sex part
A phospholamban inactivator comprising:
[0054]
Thus, at least three of the four simultaneous interactions (a)-(d) as defined above can associate with the PLB cytosolic domain and can act as a PLB inactivator Seems to be necessary for
[0055]
Geometric dimensions and pharmacophore associated with the active site ( pharmacophore )
The distance between any of the active sites S1-S4 can be measured from the atomic coordinates provided herein. Similarly, the distance from a given binding moiety to the active site with which it is associated can be deduced from these atomic coordinates.
[0056]
At least three types of association occur.
[0057]
Salt bridges are formed when the charged groups of a ligand are attracted by the oppositely charged groups of the protein. The optimal distance between the oppositely charged atoms is about 2.8 °, but the distance between the centers of gravity of the oppositely charged groups can vary according to the size of the groups in question.
[0058]
Hydrogen bonds are formed when a hydrogen atom binds to an electronegative atom (hydrogen atom donor) and is attracted by another electronegative atom (hydrogen bond acceptor). The distance between two electronegative atoms in a hydrogen bond is between about 2.5 ° and about 3.3 °.
[0059]
Hydrophobic interactions are formed when two hydrophobic groups are attracted to each other by Van der Waals forces. The distance between the centers of gravity of the two hydrophobic groups can vary according to the size of the groups in question.
[0060]
Distance measurements from atomic coordinates show the following distance span for the interaction between the binding moiety and its active site. The distance for the hydrophobic interaction is defined below from the center of gravity of the hydrophobic moiety to the backbone atoms (carbonyl oxygen, amide nitrogen, α-carbon) of the PLB-protein, because the backbone atoms remain stationary in space. Because it is.
[0061]
1. First electronegative part
The first electronegative moiety, which is associated with the S1 binding site of PLB by forming a salt bridge, preferably associates as follows:
a) The distance from the center of gravity of the first electronegative part (negatively charged group) to the CZ atom of Arg-9 is between about 2.3 ° and about 6.3 °.
b) The distance from the center of gravity of the first electronegative part (negatively charged group) to the CZ atom of Arg-13 is between about 1.6 ° and about 5.6 °.
[0062]
The first electronegative moiety that is associated with the S1 binding site of PLB by forming a hydrogen bond preferably associates as follows:
c) The distance from the electronegative atom (hydrogen bond acceptor) of the first electronegative portion to the OH atom of Tyr-6 is between about 2.5 ° and about 3.3 °.
d) The distance from the electronegative atom (hydrogen bond acceptor) of the first electronegative moiety to any of the guanidinium nitrogens of Arg-9 is between about 2.5 ° and about 3.3 °.
e) The distance from the electronegative atom (hydrogen bond acceptor) of the first electronegative moiety to any of the guanidinium nitrogens of Arg-13 is between about 2.5 ° and about 3.3 °.
[0063]
2. Second electronegative part
The second electronegative moiety, which associates with the S2 binding site of PLB by forming a salt bridge, preferably associates as follows:
a) The distance from the center of gravity of the second electronegative part (negatively charged group) to the CZ atom of Arg-14 is between about 1.5 ° and about 5.5 °.
[0064]
The second electronegative moiety that associates with the S2 binding site of PLB by forming a hydrogen bond preferably associates as follows:
b) The distance from the electronegative atom (hydrogen bond acceptor) of the second electronegative moiety to any of the guanidinium nitrogens of Arg-14 is between about 2.5 ° and about 3.3 °.
[0065]
3. First hydrophobic part
The first hydrophobic moiety associated with the S3 binding site of PLB preferably associates as follows:
a) The distance from the center of gravity of the first hydrophobic moiety at the S3 binding site to the amide nitrogen of Met-20 is between about 6.0 ° and about 12.0 °.
b) The distance from the center of gravity of the first hydrophobic moiety at the S3 binding site to the carbonyl oxygen of Lys-27 is between about 4.4 ° and about 10.4 °.
c) The distance from the center of gravity of the first hydrophobic moiety at the S3 binding site to the α-carbon of Leu-28 is between about 2.9 ° and about 8.9 °.
[0066]
4. Second hydrophobic part
The second hydrophobic moiety associated with the S4 binding site of PLB preferably associates as follows:
a) The distance from the center of gravity of the second hydrophobic moiety at the S4 binding site to the carbonyl oxygen of Phe-32 is between about 3.6 ° and about 9.6 °.
b) The distance from the center of gravity of the second hydrophobic moiety at the S4 binding site to the amide nitrogen of Phe-35 is between about 5.6 ° and about 11.6 °.
[0067]
A three-dimensional definition of the pharmacophore, one class of PLB-deactivator, created from the atomic coordinates disclosed herein is shown in FIG. Each sphere represents the space in which the center of gravity of each connection should be located in the complex, with the center of the sphere being the optimal location. The optimal distance between the coupling parts is also given.
[0068]
FIG. 14 demonstrates how the compound of Example 12 is suitable for a pharmacophore. The location of these binding moieties that are complementary to S2-S4 may be quite good, while the location of the binding moieties that are complementary to S1 may appear less optimal. The distance of the center of gravity of each binding moiety to a selected backbone atom of the PLB-protein is given below.

[0069]
These values can be compared to the distance width definitions given above. Furthermore, the binding for S2 to S4 is within the defined range, while the binding for S1 is near the boundary of the defined range.
[0070]
Examples of phospholamban deactivators designed according to the present invention are those of formula (I) or (II):
[0071]
Embedded image

[0072]
(Where R₁Is hydrogen, alkyl, alkenyl, aryl, arylalkyl, hydroxyalkyl, halogenalkyl, alkoxy, COR₁₀, CONR₁₀R₁₁, OR₁₀, S (O)_mR₁₀, NR₁₀COR₁₁Or NR₁₀R₁₁, Where R₁₀Is hydrogen, alkyl, alkenyl, aryl, arylalkyl, hydroxyalkyl, halogenalkyl, alkoxy or hydroxy, and R₁₁Is hydrogen, alkyl, aryl, arylalkyl, alkoxy, aryloxy, hydroxy or acyl, or X is NR₁₁In the case of R₁Is carboxyalkyl,
R₆Is hydrogen, alkyl, alkenyl, aryl, arylalkyl,
R₂And R₇Is hydrogen, alkyl, aryl, arylalkyl, alkenyl, COR₁₀, CONR₁₀R₁₁, Halogen, trifluoromethyl, nitro or cyano, where R₁₀And R₁₁Is the same as above,
R₃Is hydrogen, alkyl, aryl or arylalkyl, A is alkyl or substituted alkyl, m is 0-2, and n is 1-3, Y is O, NR₁₁Or S, where R₁₁Is the same as above, X is O, NR₁₁Or S, where R₁₁Is the same as above, R₄, R₅, R₈And R₉Is independently the following groups:
[0073]
Embedded image

[0074]
Or X is NR₁₁In the case of R₄, R₅, R₈And R₉Is independently HOOC-, R₁₂OOC-, H₂NCO- or HOHNCO-, where R₁₂Is alkyl, arylalkyl or aryl, and each aryl residue defined herein as itself or as part of another group may be substituted), and pharmaceutically acceptable salts thereof. Includes, but is not limited to, the resulting salts and esters.
[0075]
Compounds of formula (I) or (II) share structural features that allow them to bind to the ligand binding site of the PLB cytoplasmic domain, thereby resulting in cardiac SR Ca²⁺-Reduce the inhibitory effect of PLB on ATPase.
[0076]
Compounds of formula (I) or (II) can be prepared from 1,3-dihydroxy-substituted heteroaromatic compounds by a suitable alkylating agent, such as chloroacetonitrile or bromoacetic ester, according to Scheme 1 below. Can be produced by In Scheme 1, R₁, R₂, R₃, X and Y are the same as described above, and R 'is a protecting group for a hydroxyl group such as methyl, benzyl or tetrahydropyranyl.
[0077]
Embedded image

[0078]
The cyano compound (IV) is described in J. Am. Med. Chem. It is used to prepare 1,2,4-oxadiazole and 1,2,4-thiadiazole derivatives using the method described in 1996, 39, 5228-5235.
[0079]
The synthesis is shown in Scheme 2. In Scheme 2, R₁, R₂, R₃, X and Y are the same as described above.
[0080]
Embedded image

[0081]
Substituent R₄, R₅, R₈And R₉Other heterocycles such as are described in Bioorg. Med. Chem. Lett. , 1994, 4, 45-50.
[0082]
Dihydroxyaromatic compounds (III) are prepared by using literature methods. Coumarins (XIV), (XVI) and (XX) are prepared by use of the Knoevenagel condensation or the von Pechmann reaction shown in Schemes 3 and 4. In schemes 3 and 4, R₁, R₂And R₃Is the same as above, Z is alkyl, aryl, arylalkyl or alkenyl, and R 'is a protecting group for a hydroxyl group such as methyl, benzyl or tetrahydropyranyl.
[0083]
Embedded image

[0084]
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[0085]
Quinolinone is produced by the Knorr reaction described in Scheme 5. In Scheme 5, R₁, R₁₁And R₃Is the same as above, and X is halogen.
[0086]
Embedded image

[0087]
Cyclic compound (II) can be prepared correspondingly from compound (XXXI) which can be prepared according to Scheme 6. In Scheme 6, R₂And R₆Is the same as above, and R 'is a protecting group for a hydroxyl group, for example, methyl, benzyl or tetrahydropyranyl.
[0088]
Embedded image

[0089]
The cyclic quinolinone compound (II) can be correspondingly prepared from (XXVI) using Scheme 5.
[0090]
Salts and esters of these compounds may, where appropriate, be prepared by known methods. Physiologically acceptable salts are useful as active pharmaceuticals, but salts with alkali metals or alkaline earth metals are preferred. Physiologically acceptable esters are also useful as active pharmaceuticals. Examples include esters with aliphatic or aromatic alcohols.
[0091]
As used herein, the term "alkyl" as used by itself or as part of another group refers to straight and branched chains having up to 18, preferably 1 to 8, and most preferably 1 to 4 carbon atoms. Includes both groups on the chain. As used herein, the term "lower alkyl" used by itself or as part of another group is a straight chain having 1 to 7 carbon atoms, preferably 1 to 4 carbon atoms, and most preferably 1 or 2 carbon atoms. And both branched and branched groups. Specific examples of alkyl and lower alkyl groups include methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, tert-butyl, pentyl, hexyl, octyl, decyl and dodecyl, and various branched chain isomers thereof.
[0092]
As used herein, the term "acyl" used by itself or as part of another group refers to an alkylcarbonyl or alkenylcarbonyl group, where the alkyl and alkenyl groups are defined above.
[0093]
The term “aryl” as used herein by itself or as part of another group refers to a monocyclic or bicyclic group containing 6 to 10 carbon atoms in the ring portion. Specific examples of the aryl group include phenyl and naphthyl. "Aroyl" means an aryl group attached to the oxygen atom in a corresponding manner.
[0094]
As used herein, the term “alkoxy” as used by itself or as part of another group includes the same alkyl groups described above, which are attached to an oxygen atom. "Aryloxy" means an aryl group linked to the oxygen in a corresponding manner.
[0095]
As used herein, the term `` substituted '' as used in connection with various groups refers to halogen substituents such as fluorine, chlorine, bromine, iodine or trifluoromethyl groups, amino, alkyl, alkoxy, aryl, alkylaryl, Halogen aryl, cycloalkyl, alkylcycloalkyl, hydroxy, alkylamino, alkanoylamino, arylcarbonylamino, nitro, cyano, thiol or alkylthio substituent.
[0096]
A “substituted” group may include from 1 to 3, preferably 1 or 2, most preferably 1, of said substituents.
[0097]
Compounds designed in accordance with the present invention are therapeutically effective, typically in the range of about 0.1 to 500 mg per day, depending on the age, weight, condition of the patient, route of administration and the phospholamban inactivator used. Can be administered to the patient in an appropriate amount. Compounds designed according to the present invention may be formulated into dosage forms using principles known in the art. It may be given to the patient in the form of tablets, dragees, capsules, suppositories, emulsions, suspensions or solutions, either neat or in combination with suitable pharmaceutical excipients. The selection of a suitable component of the composition is a matter of ordinary skill in the art. Obviously, suitable carriers, solutions, gelling agents, dispersing agents, antioxidants, coloring agents, sweeteners, wetting compounds and other ingredients commonly used in the art can also be used. While compositions containing the active ingredient can be administered enterally or parenterally, the oral route is the most preferred method. The content of active compound in the composition is from about 0.5 to 100%, preferably from about 0.5 to about 20%, by weight of the total composition.
[0098]
The following examples are set forth merely as illustrations of various aspects of the present invention, and are not intended to limit the present invention.
[0099]
【Example】
Example 1 Structure of the cytosolic domain of phospholamban
Synthesis, purification and characterization of phospholamban (1-36)
The cytosolic portion of the phospholamban peptide having the amino acid sequence MEKVQYLTRSAIRRASTIEMPQQARQKLQNLFINFC was synthesized using an automated peptide synthesizer (Perkin-Elmer, Applied Biosystems 431A) using the fluorenylmethoxycarbonyl method. The synthesis started from the hydrophobic C-terminus. The side chain protecting groups used during the synthesis were trityl (Trt) for Asn, Gln and Cys, tert-butoxy (OtBu) for Glu, and tert-butyl for Ser, Thr and Tyr. (TBu), tert-butoxycarbonyl (Boc) for Lys and 2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl (Pmc) for Arg.
[0100]
The amount of resin charged beforehand was 100 μmol, and the amount of amino acid in each step of the synthesis was 1 mmol. This was a 10-fold excess compared to the amount of pre-filled resin.
[0101]
Cleavage of the peptide from the resin support (usually pre-filled with Wang resin) contains 5% TFA, 0.2% β-mercaptoethanol, 0.2% thioanisole and 0.2% dimethyl sulfide Performed in methylene chloride. The side chain deprotection of the peptide was performed in a mixture of ethanedithiol: thioanisole: water: trifluoroacetic acid = 250 μl: 500 μl: 500 μl: 10 ml for 1.5 hours at room temperature. Thereafter, the peptide was precipitated, washed three times with diethyl ether and freeze-dried.
[0102]
The synthesized crude phospholamban (1-36) peptide was applied to an analytical reverse-phase (RP) column (C₈, 20 μm, 4.6 mm × 30 mm, Perkin-Elmer, Applied Biosystems Brownlee ™ column) and purified by high performance liquid chromatography (HPLC). A linear gradient of acetonitrile (0-100% in 30 minutes) in 0.1% TFA was used for elution.
[0103]
The repurified peptide was converted to C₁₈  It was further purified by HPLC RP-chromatography using a Kromasil, 5 μm (1.0 × 25 cm) column. Peptides were eluted with a step gradient of acetonitrile in 0.1% TFA, 0.075% TFA (3-30% in 10 minutes, 30-50% in 120 minutes). Purified phospholamban (1-36) peptides were characterized by SDS-PAGE followed by Coomassie brilliant blue staining. Western blot analysis was performed using a commercially available monoclonal anti-PLB antibody (Upstate Biotechnology). The peak of the purified RP-chromatography containing the peptide was further analyzed by mass spectrometry (MALDI-TOF) in a reflector mode using a BIFLEX® mass spectrometer using a 337 nm nitrogen laser. The sample was applied in a solution containing 30% acetonitrile / 0.1% TFA, along with droplets of the sinapinic acid matrix for mass spectrometry. The total amount of purified protein was estimated according to Bradford and further based on RP-chromatography using β-lactoglobulin as a standard. The purified peptide was lyophilized and the weight of the dried powder was determined before three-dimensional structural analysis.
[0104]
Acquisition of NMR spectrum of phospholamban (1-36)
¹1 H-NMR spectra were obtained on a Bruker ARX400 and VarianUNITY600 NMR analyzer at 400.13 MHz and 599.86 MHz, respectively. 6 mM d to prevent disulfide formation₁₀H containing DTT₂O: D₂O: d₃-36-a. Of PLB in a mixed solvent of TFE (63: 7: 30). a. 1D and 2D NMR spectra were obtained for a 3 mM solution of the fragment. The pH was adjusted to 3.00 ± 0.02 with a microliter volume of NaOD (inaccurate due to deuterium isotope effect). COSY, TOCSY (30-90 ms) and NOESY (40-400 ms) spectra were recorded at 2, 7, 17, and 27 ° C. by the States-TPPI method using a spectral width of 8.5 ppm. The 2D data was weighted and Fourier transformed into a 2k × 1k matrix of real points. Transmitters that saturated the residual solvent system (2.0 s) were converted by deconvolution. The spectra were referenced to the residual solvent signal (4.75 ppm at 27 ° C, -10 ppb / ° C). A series of 1D spectra were acquired at various temperatures (variable from 2 to 47 ° C.).
[0105]
Assignment of NMR spectrum of phospholamban (1-36)
Spin system assignments and continuous assignments were performed using Weythrich, K, et al., Using COSY, TOCSY and NOESY spectra obtained at 12, 17 and 27 ° C. (1986) "NMR of Proteins and Nucleic Acid", John Wiley & Sons, Inc. , New York. The difference in the temperature dependence of the chemical shift of the amide proton was sufficient to resolve the resonance overlap. The stereospecific assignment to unmodified methylene was determined by the coupling constant J determined from the COSY spectrum._{H α H β}And the intra-residue NOE cross-peak intensity.
[0106]
Generation and refinement of phospholamban (1-36) structures
A series of NOESY spectra were obtained at 17 ° C. with five mixing times (50, 80, 120, 160 and 200 ms). The integrated cross peak intensity (I) was used in NOESY-built-up-analysis. The distance constraint is defined by the initial condition I_{( τ m = 0)}= 0 was used to derive from the initial slope of a quadratic polynomial curve fitted to the volume of the cross peak integrated from the series of NOEs. Internal methylene NOE and continuous NOE served for calibration. Initially, the distance is short (1.8-2.5 °), medium (1.8-3.5 °) or long (3.0-6.0 °) for the occurrence of the first group of structures. Classified as follows. If the distance could not be calculated from the cumulative curve due to partial (> 20%) overlap and insufficient signal-to-noise ratio or interference, the distance was only reduced to less than 5.0 °. The upper limit was increased by 1.0 ° for each provisional atom. The restriction data was subject to distance restrictions based on strong, medium and weak NOE from a 150 ms NOE spectrum obtained at 12 ° C.
[0107]
The binding constant (J) was calculated from the fine structure of the COSY cross peak by the J-doubling method (McIntyre, L. et al. (1992) J Magn Reson 96, 425-431). Dihedral φ and χ characterized by intermediate J were unconstrained, but small and large J_{NH α}And J_{H α H β}Was associated with a twisted conformation (± 30 degrees) based on the Karplus function and the intra-residue NOE (Karplus, M. (1963) J. Am. Chem. Soc., 85, 2870). HH distance limits and dihedral angle limits were calculated, and the data was imported into software InsightII (Molecular Simulations, Inc.) to generate, evaluate and refine structures. The simulated NOESY spectrum was back calculated. Protein coordinate files were analyzed with the software PROMOTIF v2.0 (obtained from anonymous ftp in Hutchinson, G. (1995), v2.0 Ed., 128.40.46.11).
[0108]
The structure was generated by distance geometry (DGII) and then simulated annealing (force field AMBER) (Havel, T. et al. (1979) Biopolymers 18, 73). A set of structures was calculated. The NOE matrix was back-calculated using the structure with the fewest violations of restrictions. H of residue after segment characterized by typical NOE of α-helix_αIf the chemical shift deviated from the value of the corresponding random coil greater than -0.2 ppm, the corresponding dihedral Ψ was also limited (± 60 degrees). After that, a new set of structures was calculated. From this new group of structures, only those structures that did not exceed 0.2 mm were approved.
[0109]
Attribution result
Full spin and continuous assignments were obtained under the experimental conditions described. Assignment at 17 ° C., 54% H₂O / 6% D₂O / 30% d₃Table V (attached to this application) showing the H-chemical shifts of PLB (1-36) at -TFE, pH 3.05. In Table V, the twisted conformation is C in the anti-conformation._βThe chemical shift of H is indicated by underlining, and C_αGauche-type conformation to H (−60 degrees) is indicated by a dotted line.
[0110]
FIG. 7 shows that at 17 ° C., 54% H₂O / 6% D₂O / 30% d₃-Schematic of the observed continuous and moderate NOE connectivity to PLB (1-36) at TFE, pH 3.05, assignments were made from NOESY spectra obtained at 120, 160 and 200 ms mixing times. Continuous NOEs are indicated by shaded blocks. Middle NOEs are represented by arrows connecting the appropriate residues. Hollow circle is smaller than 7Hz³J_{NH α CH}Means the coupling constant. The secondary shift of αCH (Δδ) is defined as the difference between the observed chemical shift and the random coil chemical shift for each residue. Wishart et al. , Biochemistry (1992), 31, 1647-1661, a negative (upfield) Δδ value is associated with an α-helix secondary structure, and a positive (downfield) Δδ value is Associated with β-structure.
[0111]
A total of 723 NOEs were assigned. 34 possible internal NH-Cs_αAll H correlations were observed in the fingerprint area. Most of the corresponding NOEs are fairly powerful, NH_{i + 1}-C_αH_iComparable to NOE (FIG. 7). Many continuous NH_i-NH_{i + 1}And NH_i-NH_{i + 2}NOE was present. Huge C_αH_i-NH_{i + 3}And some C_αH_i-NH_{i + 4}The NOE was concentrated in the fingerprint region of the NOESY spectrum. In addition, many C_αH_i-C_βH_{i + 3}There were crossing peaks. NOE resulting from interactions longer than i> i + 4 was observed only for Met20 protons.
[0112]
NH and C_αThe J-coupling between H was small for most residues. It was not possible to measure exact values for all residues due to overlapping or weak intensities of resonances at the COSY cross-peaks, but coupling was not possible at the N- and C-terminal residues. Except for the group and the central residue of the PLB (1-36), it was below 7-8 Hz.
[0113]
The central region of PLB (1-36) did not show helix properties. That is, the δ of residues Glu19, Met20 and Pro21_{C α H}The values were not significantly smaller than their random coil values. Glu19 and Met20 mainly lack the typical NOE of the helix structure, and the Clu of Glu19_αBetween H and Met20 NH, and Met20 C_αH and C of Pro21_δThere was a clear strong continuous NOE between Hs. Further, even when partially obscured in crowded fingerprint areas, the Cle of Ile18_αThe NOE between H and NH of Glu19 was strong. All of these mean that the central region of PLB (1-36) adopts an extended conformation. The stretched segments are short despite the stretches. Thr17 and Gln22 exhibit NOE and binding constant properties of α-helix residues, with NOEs from the side chain protons of Glu19 and Met20 to the protons of the residues adjacent to the N- and C-terminal helices. We infer that the N-terminal and C-terminal α-helices are separated by turns at Ile18, Glu19, Met20 and Pro21. Proline exists in a trans conformation. Tight turns are not possible where the axes of the N- and C-terminal helices are parallel. There is an ambiguous NOE between the N-terminal helix and the C-terminal helix.
[0114]
Structure of PLB (1-36)
The structure of the PLB (1-36) is determined from the 599 distance limit and the 50 two-sided limit except those more precisely defined by the shared structure alone. These overlapping NOE induction limits were consistent with the co-imposed distance limits, suggesting that the distance calibration was valid. On average, there was a significant NOE-induced restriction of 16.6 per residue. Residues Lys3-Ile18 of the N-terminal helix are, on average, less restrictive per residue than residues Gln22-Cys36 in the C-terminal helix. This is at least partially due to the fact that on average there are more protons with non-denaturing shifts per residue in the C-terminal helix than in the N-terminal helix (Table V). . For turn-limiting residues Ile18-Pro21, there was as much per-residue restriction as in the N-terminal helix.
[0115]
Due to the structure generation, a group of structures showing all helix-turn-helix motifs was obtained. Root-mean-square deviations were calculated from a group of 20 structures with no distance violations or two-sided violations greater than 0.2 °. FIG. 9 shows the structural quality of PLB (1-36) obtained from the NOE data, showing the RMSD per residue and the number of restrictions per residue.
[0116]
Because the ambiguous distal NOE was found between the N- and C-terminal helices, the structures displayed the variance of the atomic coordinates at the far end of the N- and C-terminal helices. The helix's mutual direction was constrained only by short distance restrictions on the turn. Therefore, RMSD per residue was calculated separately for i) N-terminal helices and turns (aa 1-21) and ii) C-terminal helices and turns (18-36). The RMSD, as expected, showed a rough inverse correlation with the limiting number per residue. On average, the atoms in the N-terminal helix are accurate to 1.3 ° (skeleton only) and 2.3 ° (all atoms), and in the C-terminal helix are 0.8 ° (skeleton only) and 1.9 ° (all atoms). ). For the structure in which the segment from Glu19 Cα to Pro21 Cα is extended, the side chain of Met20 projects almost parallel to the C-terminal helix, and the side chain of Glu19 is oriented in almost the opposite direction, a minimal number of A distance violation (less than 0.2 mm) was observed. In these structures, the plane of the peptide bonds Ile18-Glu19 is approximately perpendicular to the plane of the elongated segment.
[0117]
Due to the structural mobility of the turns, the structures show variance in the relative positions of the N-terminal and C-terminal helices. Dispersion is still limited. When the various structures of the group are superimposed on the Cα of the residue of the C-terminal helix, the N-terminal axis is dispersed in a cone with an opening of about 90 degrees and a relative angle of about 80 degrees. Similar reciprocal directions for two consecutive helices, one transmembrane and the other amphiphilic, have been found or hypothesized for small membrane-bound proteins or peptides (Stopar, D. Et al. (1996) Biochemistry, 35 (48), 5467-5473).
[0118]
In some structures, the side chains εNH of Arg9, Arg13 and Arg14, whose chemical shifts are largely independent of T, form hydrogen bonds with the oxygens of the adjacent side chains of Ser10, Ser16 and Thr17. For Arg25, a large Δδ_NH(T) and no obvious hydrogen bond donor candidate was present. Glutamine and asparagine side chain NH₂Could form a hydrogen bonding network parallel to the helix axis.
[0119]
For PLB phosphorylation, we have found that it is important that the phosphorylation site Ser16 is readily available and exposed to the solvent. Thr17 on the N-terminal helix faces the C-terminal helix and appears to be less exposed to solvent than Ser16. Due to the pitch of the alpha helix, Arg13 and Arg14 have also been exposed with an orientation delayed by 60 degrees in phase with respect to Ser16 and Thr17 on the same side of the helix. In phosphokinase substrates (eg, topolonin I), the presence of positively charged residues near serine or threonine residues is often seen.
[0120]
We have found that one side of the N-terminal helix is mainly polar or hydrophilic. The same is true for the C-terminal helix, where the polar residues are localized in one plane away from the other plane occupied by the lipophilic side chains. It can be noted that, due to the relative orientation of the helices, the hydrophilic surface of the N-terminal helix always faces the lipophilic surface of the C-terminal helix. This defines a pocket called an amphipathic arm pit. In this pocket, the relative positions of the polar residues on the N-terminus and the lipophilic residues on the C-terminus are determined by using the two centroids calculated by averaging the coordinates of the selected side chains. It can be defined conveniently. The side chain coordinates of Arg13, Arg9 and Tyr6 were used to construct the centroid associated with the N-terminus, and the side chain coordinates of Phe32 and Phe35 were used to construct the centroid associated with the C-terminus. The distance between these two centroids was calculated for all structures in the group and was 18.5 ± 4.5 °. The sophisticated structure of the PLBs (1-36) is shown in FIG.
[0121]
Example 2 Structure of cyclic peptide cP226
Peptide synthesis, cyclization and purification
A linear peptide having the amino acid sequence CYWELEWLPCA was synthesized using an automated peptide synthesizer (Perkin-Elmer, Applied Biosystems 431A) using the fluorenylmethoxycarbonyl method. Synthesis started from the carboxy terminus. The side chain protecting groups used during the synthesis were trityl (Trt) for Cys, tert-butoxy (OtBu) for Glu and tert-butyl (tBu) for Tyr.
[0122]
The amount of resin charged beforehand was 100 μmol, and the amount of amino acid in each step of the synthesis was 1 mmol.
[0123]
Cleavage of the peptide from the resin support (usually pre-filled with Wang resin), as well as deprotection of the side chains, is performed using a mixture of ethanedithiol: thioanisole: water: trifluoroacetic acid = 250 μl: 500 μl: 500 μl: 10 ml For 1.5 hours at room temperature. Thereafter, the peptide was precipitated, washed three times with diethyl ether and freeze-dried.
[0124]
The amino acids and pre-filled resin used for peptide synthesis were obtained from Novabiochem. Trifluoroacetic acid (TFA) was from Perkin-Elmer and ethanedithiol (EDT) and thioanisole were from Fluka.
[0125]
The purified peptide was added at 0.5 mg / ml to 10 mM (NH₄)₂CO₃The cyclic peptide cP226 was reconstituted from the linear CYWELEWLPCA peptide by dissolution in Then, the solution was allowed to stand at room temperature for 1 to 2 days to oxidize the SH groups of two cysteine residues for forming intramolecular disulfide bridges. The reaction was followed by HPLC chromatography from linear and cyclic peptide peaks that changed as a function of time.
[0126]
Both linear and cyclic cP226 peptides were purified by reverse phase HPLC chromatography (C₈, Aqupore Octyl, 30 μm, 10 × 100 mm, Perkin-Elmer) using a 30 minute linear gradient from 0.1% TFA to 100% acetonitrile. The resulting peptide was characterized by mass spectroscopy.
[0127]
NMR spectrum of cP226
¹1 H-NMR spectra were obtained on a Bruker ARX400 and VarianUNITY600 NMR spectrometer at 400.13 MHz and 599.86 MHz, respectively. 1D and 2D NMR spectra were obtained for a 1 mM aqueous solution of the cyclic peptide. The pH was adjusted to 6.50 ± 0.02 with a microliter volume of NaOD (inaccurate due to deuterium isotope effect). COSY, TOCSY (30-90 ms) and NOESY (200-400 ms) spectra were recorded at 5, 10, 15, and 27 ° C. by the States-TPPI method using a 8.5 ppm spectral width. The 2D data was weighted and Fourier transformed into a 2k × 1k matrix of real points. Transmitters that saturated the residual solvent system (2.0 s) were converted by deconvolution. The spectra were referenced to the residual solvent signal (4.75 ppm at 27 ° C, -10 ppb / ° C).
[0128]
Assignment of NMR spectrum of cP226
Spin system assignments and continuous assignments were derived according to Weethrich as in Example 1 using COSY, TOCSY and NOESY spectra obtained at 5, 10 and 27 ° C. The difference in the temperature dependence of the chemical shift of the amide proton was sufficient to resolve the resonance overlap. The stereospecific assignment to unmodified methylene was determined by the coupling constant J determined from the COSY spectrum._{H α H β}And the intra-residue NOE cross-peak intensity.
[0129]
Generation and refinement of cP226 structure
A series of NOESY spectra were obtained at 10 ° C. with various mixing times (200, 300, 400 ms). The integrated cross-peak intensity (I) was used in the NOESY cumulative analysis. The distance limit is set in the initial condition I_{( τ m = 0)}= 0 was used to derive from the initial slope of a quadratic polynomial curve fitted to the volume of the cross peak integrated from the series of NOEs. Internal methylene NOE and continuous NOE served for calibration. Initially, the distance is short (1.8-2.5 °), medium (1.8-3.5 °) or long (3.0-6.0 °) for the occurrence of the first group of structures. Classified as follows. If the distance could not be calculated from the cumulative curve due to partial (> 20%) overlap and insufficient signal-to-noise ratio or interference, the distance was only reduced to less than 5.0 °. The upper limit was increased by 1.0 ° for each provisional atom. The restriction data was subject to distance restrictions based on strong, medium and weak NOE from 300 ms NOE spectra obtained at 10 ° C.
[0130]
The binding constant (J) was calculated from the fine structure of the COSY cross peak by the J-doubling method. Dihedral φ and χ characterized by intermediate J were unconstrained, but small and large J_{NH α}And J_{H α H β}Was associated with a twisted conformation (± 30 degrees) based on the Carplus function and the intra-residue NOE. The HH distance limit and the dihedral angle limit were calculated. Finally, the data was imported into the software InsightII (Molecular Simulations, Inc.) to generate, evaluate and refine the structure. The simulated NOESY spectrum was back calculated. Protein coordinate files were analyzed with the software PROMOTIF v2.0.
[0131]
The structure was generated by distance geometry (DGII) followed by simulated annealing (force field AMBER). A set of structures was calculated for 30 pieces. The NOE matrix was back-calculated using the structure with the fewest violations of restrictions. Based on a comparison of the back-calculated NOE spectrum with the experimental NOE nest spectrum, it was possible to clearly identify more NOEs and impose corresponding distance restrictions. Thereafter, a set of structures was calculated for the 30 new ones. From this new group, twelve structures with at most one violation, greater than 0.3 °, were selected for further study. The distance constraints corresponding to well-separated cross peaks were refined by a structure-based iterative relaxation matrix method (IRMA) without constraint violations (> 0.2 ＞,> 0 degrees). τ_cThe upper limit was maintained at 10% or more of the exact distance obtained by IRMA in order to take into account the uncertainty of. The refined set of restrictions was then used to refine the coordinates by simulated annealing.
[0132]
The final group of 12 structures obtained was visualized by graphic software MOLMOL (Koradi, R. et al. (1996) J Mol Graphics 14, 51-55).
[0133]
Attribution result
Full spin and continuous assignments were obtained under the experimental conditions described. To induce sufficient transfer and visualize cross-peaks, it was necessary to perform NOESY experiments at low temperatures (<10 ° C.) and at longer mixing times (> 300 ms). . The assignments are given in Table VI.
[0134]
The cP226 spectrum showed a chemical shift variance greater than 8.5 ppm. C_αThe H shift ranged from 3.9 to 4.7 ppm and most of the NH shift was constrained between 7.8 and 8.5 ppm, but for Tyr2 and Leu8, the NH resonances were listed at 6.9 ppm each on the listed side. And 7.3 ppm. There was no methyl group signal at very high fields (> 0 ppm).
[0135]
FIG. 10 shows 90% H at 10 ° C.₂O / 10% D₂FIG. 9 is a summary of the observed continuous and moderate NOE connectivity to cP226 at O, pH 6.50. Assignments were made from NOESY spectra obtained at 300 and 400 ms mixing times. Continuous NOEs are indicated by shaded blocks. Middle NOEs are represented by arrows connecting the appropriate residues. Hollow circle is greater than 8 Hz³J_{NH α CH}Means the coupling constant. The secondary shift of αCH (Δδ) is defined as the difference between the observed chemical shift and the random coil chemical shift for each residue. Wishart et al. , Biochemistry (1992), 31, 1647-1651, negative (upfield) and positive (downfield) Δδ values are associated with a secondary structure.
[0136]
A total of 120 NOEs were assigned. 9 possible internal NH-Cs_αAll H correlations were not observed in the fingerprint area. Most of the corresponding NOEs were fairly weak. Four consecutive NH_i-NH_{i + 1}And one NH_i-NH_{i + 2}Only NOE was present. Some NH_{i + n}-C_βH_iWas found in the NOE spectrum, facilitating continuous assignment. The secondary shift of αCH (Δδ), defined as the difference between the observed chemical shift and the random coil chemical shift for each residue, provided evidence of a folded structure (FIG. 10). NOEs derived from interactions longer than i> i + 4 (across the ring) were observed for Trp3 and Leu8 side chain protons and Tyr2 and Cys10 protons.
[0137]
NH and C_αThe J-coupling between H (calculated from the COSY cross-peak) was large for most residues. Coupling for all residues was above 8 Hz, suggesting that the φ angle had a value of mostly 120 ± 30 °. Proline was present in a trans conformation.
[0138]
Structure of cP226
The structure of cP226 is determined from 110 distance limits and 8 two-sided limits except those more precisely defined by the shared structure alone. These overlapping NOE induction limits were consistent with the co-imposed distance limits, suggesting that the distance calibration was valid. On average, there were 10 significant NOE induction limits per residue. Residues in the central portion of the peptide (Trp3 to Leu8) are more restrictive per residue than the average. This is due, at least in part, to the fact that there are, on average, more protons with non-denaturing shifts per residue in the region.
[0139]
A structural group showing all bend-coil-bend motifs was obtained by structural development (MOLMOL). Root-mean-square deviations were calculated from a group of 12 structures with no distance violations or two-sided violations greater than 0.3 °. Small distance limit violations occur mainly between the side chains, for example the side chains of tyrosine. This can be a result of the extreme mobility of these parts that can trigger non-simultaneous NOEs. The RMSD per residue was calculated and, as expected, showed an approximate inverse correlation with the number of restrictions per residue. On average, the atoms are defined to an accuracy of 0.96Å (skeleton only) and 2.02Å (all atoms), and when calculated only for the protons from Trp3 to Trp7, 0.72Å (skeleton only) and It was determined to an accuracy of 1.87 ° (all atoms) (Table VII).
[0140]
The lipophilic side chains of Trp3, Leu5, Trp7 and Leu8 were concentrated on one side of the cyclic peptide, leaving most of the polar carbonyl and amine groups of the backbone on the other side.
[0141]
The structure of cP226 shown in this report was combined with the structure of PLB (1-36) described above. Comparison of the two structures shows that two glutamic acid residues on cP226 are involved in binding by linking to Arg9 and Arg13 on PLB (1-36), and the lipophilic cluster of cP226 is on PLB (1-36). The hypothesis of exposure to the lipophilic outer part of the C-terminal helix is confirmed.
[0142]
FIG. 11 shows a group consisting of 12 structures of cP226 inferred from NMR data. The backbone, the heavy atoms of the Trp3 and Trp7 side chains, the heavy atoms of the Glu4 and Glu6 side chains, and the β carbons of Glu4 and Glu6 are shown. The distance between the beta carbons of the two glutamate residues (FIG. 11) was highly conserved (8.3 ± 0.9 °). This information may be useful in designing small molecules in which two acetate residues mimic the positions of Glu4 and Glu6 on cP226. Similarly, the distance of a lipophilic cluster from two glutamic acid residues is also useful in the drug design process.
[0143]
Example 3 Activity Assay
Experiment 1 Effect on calcium uptake in SR vesicles prepared from heart and fast bone muscle
The inhibitory effect of a given compound on phospholamban can be attributed to the effect of the compound on the uptake of calcium into SR vesicles prepared from heart tissue and the uptake of calcium into SR vesicles prepared from fast bone muscle (lumbar muscle). The effect was shown by measuring. Both types of SR vesicles contain Ca²⁺-Contains ATPase, but vesicles derived from fast bone do not contain phospholamban (Hoh JFY, "Muscle fiber types and function", Current Opinion in Rheumatology, 4: 801-808, 1992). Increased calcium uptake in SR vesicles prepared from heart tissue, but not SR vesicles prepared from fast bone muscle, indicates that the compound is SR Ca²⁺-Reduces the inhibitory effect of phospholamban on ATPase and thus acts as a phospholamban inactivator. Phospholamban is used in heart SR Ca²⁺Compounds that reduce these effects may be useful in the treatment of heart disease, as they suppress both the rate of relaxation and the rate of contraction in the mammalian heart through its inhibitory effect on ATPase.
[0144]
Method
Guinea pigs (10-12) were decapitated. The heart or psoas muscle was excised, washed in ice-cold 0.9% NaCl, and cut into fragments containing 20 mM Tris-maleate, 0.3 M sucrose in buffer (pH 7.0). . Thereafter, the tissue pieces were homogenized (10 strokes) using a Polytron and further using a Potter. The homogenate was centrifuged at 1000 g for 15 minutes at 4 ° C. The supernatant was collected and the pellet was resuspended in 5 ml of buffer (20 mM Tris-maleate, 0.3 M sucrose, pH 7.0) and centrifuged again at 4O <0> C at 1000 g for 10 minutes. The resulting supernatant was combined with the initially collected supernatant and centrifuged once again at 10,000 g for 20 minutes at 4 ° C. The final supernatant was filtered and placed in a bottle with a magnetic stirrer. KCl was added to the filtered supernatant to a final concentration of 0.6M (at 4 ° C). The resulting solution was centrifuged at 100,000 g for 60 minutes at 4 ° C. The pellet was suspended in 5 ml of a buffer (pH 7.0) containing 20 mM tris-maleate and 0.3 M sucrose, and centrifuged at 100,000 g for 60 minutes at 4 ° C. The resulting pellet was suspended in 5 ml of a buffer (pH 7.0) containing 20 mM Tris-maleate, 0.3 M sucrose, 0.1 M KCl and stored at -80 ° C until use. Protein concentration was also measured to standardize the separately prepared vesicle preparation.
[0145]
In a calcium uptake assay, SR Ca²⁺ATPase causes Ca from SR²⁺Was moved out of the vesicle using the fluorescent indicator fluo-3.²⁺A decrease in concentration was detected.
[0146]
The obtained SR vesicles (50 μg protein / ml) were combined with 40 mM imidazole, 95 mM KCl, 5 mM NaN.₃, 5 mM MgCl₂Preincubation for 5 min at 37 ° C. in assay buffer (pH 7.0) containing 0.5 mM EDTA, 5 mM potassium oxalate, 2 μl ruthenium red, 5 μM fluo-3 with or without test compound. did. Free calcium is replaced by CaCl₂Was adjusted to 0.1 μM or 0.04 μM. The reaction was started by adding ATP (5 mM). The final reaction volume was 1.5 ml. The fluorescence of the reaction mixture was measured for 3 minutes by using excitation and emission wavelengths of 510 nm and 530 nm, respectively.
[0147]
result
12A and 12B show Ca (A) and fast bone (B) Ca in SR vesicles.²⁺4 shows the effect of the compound of Example 1c (50 and 100 μM) on the uptake rate. It can be seen that the compounds of the invention accelerated calcium uptake in cardiac SR vesicles, but did not alter calcium uptake in SR vesicles prepared from fast bone muscle.
[0148]
Table VIII shows that Ca in the SR vesicles of heart (A) and fast bone muscle (B).²⁺4 shows the effect of various compounds of the invention on the uptake rate. Experiments were performed at free calcium concentrations of 0.1 μM and 0.04 μM, respectively.
[0149]
[Table 2]

[0150]
Experiment 2 Effect on left ventricular pressure induction
Method
Male and female 300-400 g guinea pigs were used in this study. After killing and decapitating a guinea pig by skull strike, the heart was quickly removed. The heart was then rinsed in cold oxygenated perfusion buffer. The cannula was inserted into the aorta and secured with a ligature. Retrograde perfusion began as soon as the heart was placed in the thermostatically controlled wet chamber of the Langendorff apparatus. Carbogen (O) with thermostat controlled oxygenator₂95% and CO₂5%) was used as perfusion buffer. The composition (mM) of the Tyrode solution is NaCl 135; MgCl₂× 6H₂O 1; KCl 5; CaCl₂× 2H₂O 2; NaHCO₂  15; Na₂HPO₄× 2H₂O1: glucose 10 and pH 7.3-7.4. The experiment was performed under a constant pressure condition (50 mmHg). After a brief (10 min) pre-stabilization, a latex balloon (size 4) was carefully placed into the left ventricle through the left pulmonary vein and left atrium. A latex balloon was attached to a stainless steel cannula connected to a pressure transducer. The chambers of the latex balloon, cannula and pressure transducer were filled with an ethylene glycol / water (1: 1) mixture, avoiding air bubbles. Equal volume left ventricular pressure was recorded through a pressure transducer. At the beginning of the experiment, the volume of the balloon was adjusted to obtain a diastolic pressure of about 5 mmHg. Prior to the start of the experiment, the heart was further stabilized with vehicle (0.1% DMSO) in perfusion buffer for 30-50 minutes.
[0151]
After a 15 minute baseline recording, various concentrations of the test compound were added to the perfusion buffer at 15 minute intervals. A concentration range of 0.3-30 μM was tested. Vehicle concentration (0.1% DMSO) was kept constant throughout the experiment.
[0152]
result
EC on left ventricular systolic pressure of various compounds of the invention₅₀Values and maximum effect (% change from baseline) are shown in Table IX.
[0153]
[Table 3]

[0154]
Example 4
The production of a PLB deactivator is illustrated by, but not limited to, the following examples.
[0155]
Example (1) Production of 3-benzyl-5,7-bis [(1H-tetrazol-5-yl) -methoxy] -4-methyl-2H-1-benzopyran-2-one
a) 3-benzyl-5,7-dihydroxy-4-methyl-2H-1-benzopyran-2-one
A solution of phloroglucinol dihydrate (20 g) and ethyl 2-benzylacetoacetate (27.5 ml) in ethanol (320 ml) was treated at 0 ° C. with anhydrous HCl for 5 hours and the solution was maintained at this temperature overnight. did. The yellow solution was concentrated, triturated with water, the solid was filtered, washed with water and dried. The resulting hydrate was evaporated to dryness three times from toluene, triturated with petroleum ether (boiling point 40-60 ° C) and filtered. Yield 33.4 g (96%). 258-260 ° C.¹H-NMR (DMSO-d₆, 400 MHz): 2.525 (s, 3H, CH)₃), 3.887 (s, 2 H, CH₂Ph), 6.171 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 6.274 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 7.167-7.279 (m, 5H, Ph), 10.2 (s, 1H, OH), 10.47 (s, 1H, OH).
[0156]
b) 3-benzyl-5,7-bis (cyanomethoxy) -4-methyl-2H-1-benzopyran-2-one
Chloroacetonitrile (6.86 g), potassium carbonate (23.9 g) and 12.2 g of the product of Example (1) a were stirred at 120 ° C. in 120 ml of DMF under nitrogen atmosphere for 2 hours. The reaction mixture was cooled and poured into ice water. The solid was filtered and washed with water. Yield 13.8 g (88%). 147-154 ° C.¹H-NMR (DMSO-d₆, 400 MHz): 2.525 (s, 3H, CH)₃), 3.969 (s, 2H, CH₂Ph), 5.307 (s, 2H, OCH₂CN), 5.314 (s, 2H, OCH₂CN), 6.814 (d, 1H, J = 2.5 Hz), 6.940 (d, 1H, J = 2.5 Hz), 7.18-7.292 (m, 5H, Ph) .
[0157]
c) 3-benzyl-5,7-bis [(1H-tetrazol-5-yl) methoxy] -4-methyl-2H-1-benzopyran-2-one
The product of Example (1) b (1 g), sodium azide (0.42 g) and ammonium chloride (0.34 g) were stirred in DMF (5 ml) at 100 ° C. under a nitrogen atmosphere for 5 hours. The reaction mixture was cooled and then poured into ice water. The pH of the solution was adjusted to 10-11, then the solution was extracted once with ethyl acetate or filtered through CELITE. The solution was acidified to pH 2 with hydrochloric acid, kept at 5 ° C and filtered. Yield 0.96 g (81%). Melting point 229-233 [deg.] C.¹H-NMR (DMSO-d₆, 400 MHz): 2.468 (s, 3H, CH)₃), 3.937 (s, 2H, CH₂Ph), 5.596 (s, 2H, OCH₂Tet), 5.602 (s, 2H, OCH₂Tet), 6.832 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 6.851 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 7.171-7.283 (m, 5H Ph).
[0158]
Example (2) 7,8,9,10-tetrahydro-1,3-bis [(1H-tetrazol-5-yl) methoxy] -7-phenyl-6H-dibenzo [b, d] pyran-6-one Manufacturing of
a) 7,8,9,10-Tetrahydro-1,3-dihydroxy-7-phenyl-6H-dibenzo [b, d] pyran-6-one
A solution of phloroglucinol (0.7 g) and 2-ethoxycarbonyl-3-phenylcyclohexanone (1.5 g) in ethanol was treated with anhydrous HCl as described in Example (1) a. The product was first recrystallized from ethanol-water (1: 1) and then triturated with ether. Yield 0.61 g.¹H-NMR (DMSO-d₆, 400 MHz): 1.38-1.52 (m, 1H), 1.57-1.66 (m, 1H), 1.69-1.78 (m, 1H), 1.86-1.96 (M, 1H), 2.9-3.02 (m, 1H), 3.3-3.4 (m, 1H), 4.050 (b, 1H), 6.157 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 6.297 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 7.076-7.265 (m, 5H), 10.153 (s, 1H), 10.456 (s , 1H).
[0159]
b) 7,8,9,10-Tetrahydro-1,3-bis (cyanomethoxy) -7-phenyl-6H-dibenzo [b, d] pyran-6-one
The product of Example (2) a (0.5 g) is treated with chloroacetonitrile (0.25 g) and potassium carbonate (1.12 g) in DMF (5 ml) as described in Example (1) b. Processed. Yield 0.6 g.¹H-NMR (DMSO-d₆, 400 MHz): 1.38-1.58 (m, 1H), 1.6-1.7 (m, 1H), 1.7-1.76 (m, 1H), 1.89-1.99 (M, 1H), 2.9-3.03 (m, 1H), 3.2-3.28 (m1H), 4.111 (b, 1H), 5.314 (s, 2H), 5 .349 (s, 2H), 6.840 (d, 1H, J = 2.5 Hz), 6.925 (d, 1H, J = 2.5 Hz), 7.108-7.274 (m, 5H).
[0160]
c) 7,8,9,10-tetrahydro-1,3-bis [(1H-tetrazol-5-yl) methoxy] -7-phenyl-6H-dibenzo [b, d] pyran-6-one
The product of Example (2) b (0.6 g) was combined with sodium azide (0.2 g) and ammonium chloride (0.17 g) in DMF (5 ml) as described in Example (1) c. Processed. The product was recrystallized from a mixture of DMF, ethanol and water (about 1: 2: 3). Yield 0.41 g. 153-154 ° C.¹H-NMR (DMSO-d₆, 400 MHz): 1.38-1.5 (m, 1H), 1.5-1.6 (m, 1H), 1.69-1.76 (m, 1H), 1.87-1.96 (M, 1H), 2.9-3.05 (m, 1H), 3.2-3.3 (m, 1H), 4.094 (b, 1H), 5.602 (s, 2H), 5.643 (s, 2H), 6.832 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 6.851 (d, 1H, J = 2.3.Hz), 7.089-7.212 ( m, 5H).
[0161]
Example (3) 3-benzyl-5,7-bis [(2,5-dihydro-5-oxo-4H-1,2,4-oxadiazol-3-yl) -methoxy] -4-methyl- Production of 2H-1-benzopyran-2-one
a) 3-benzyl-5,7-bis [(hydroxyamidino) methoxy] -4-methyl-2H-1-benzopyran-2-one
Triethylamine (1.94 ml) was added to a suspension of hydroxylamine hydrochloride (0.97 g) in DMSO (2 ml) and the resulting mixture was stirred at room temperature for 30 minutes. The crystals were filtered and washed with THF. The filtrate was concentrated and the product of Example (1) b (0.5 g) was added. This solution was maintained at 75 ° C. overnight. The reaction mixture was treated with ice water, the pH was adjusted to 11, the solid was filtered, washed with water and dried. Yield 0.5 g. 155-160 ° C.¹H-NMR (DMSO-d₆, 400 MHz): 2.56 (s, 3H, CH)₃), 3.938 (s, 2H), 4.466 (s, 2H), 4.486 (s, 2H), 5.565 (s, H, NH)₂), 5.709 (s, 2H, NH₂), 6.658 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 6.692 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 7.168-7.284 (m, 5H, Ph), 9 .346 (s, 1H, OH), 9.362 (s, 1H, OH).
[0162]
b) 3-benzyl-5,7-bis [(ethoxycarbonyloxyamidino) methoxy] -4-methyl-2H-1-benzopyran-2-one
Ethyl chloroformate (0.45 ml) was added at 0 ° C. to a solution of the product of Example (3) a (1 g) and pyridine (0.38 ml) in DMF (5 ml). The reaction mixture was maintained at this temperature for a further 30 minutes, then ice water was added. The solid was filtered and washed with water. Yield 1.63g. 87-92 ° C.¹H-NMR (DMSO-d₆, 400 MHz): 1.215-1.256 (m, 6H), 2.553 (s, 3H), 3.947 (s, 2H), 4.140-4.198 (m, 4H), 4. 566 (s, 2H), 4.599 (s, 2H), 6.688 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 6.718 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 6. 792 (b, 2H, NH₂), 6.818 (b, 2H, NH₂), 7.171-7.285 (m, 5H).
[0163]
c) 3-benzyl-5,7-bis [(2,5-dihydro-5-oxo-4H-1,2,4-oxadiazol-3-yl) -methoxy] -4-methyl-2H-1 -Benzopyran-2-one
The product of the previous example (1.5 g) and DBU (0.8 ml) in DMF (5 ml) were stirred at room temperature overnight. The reaction mixture was treated with ice water and acidified. The solid was filtered and washed with water. The resulting solid mass was mixed into a 0.1N sodium hydroxide solution, treated with activated carbon and finally acidified. Yield 0.64g. 130-136 ° C.¹H-NMR (DMSO-d₆, 400 MHz): 2.524 (s, 3H), 3.954 (s, 2H), 5.187 (s, 2H), 5.215 (s, 2H), 6.748 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 6.834 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 7.158-7.289 (m, 5H), 12.8 (b, 2H).
[0164]
Example (4) Production of 7,8,9,10-tetrahydro-bis [(1H-tetrazol-5-yl) methoxy] -1,3-dihydroxy-6H-dibenzo [b, d] pyran-6-one
[0165]
a) 7,8,9,10-Tetrahydro-1,3-dihydroxy-6H-dibenzo [b, d] pyran-6-one
Phloroglucinol (1 g) and ethyl 2-oxocyclohexanecarboxylate (1.32 g) were stirred in 75% sulfuric acid (10 ml) overnight, the mixture was poured into ice water and filtered. Yield 1.55 g.¹H-NMR (DMSO-d₆, 400 MHz): 1.65 (b, 4H), 2.345 (b, 2H), 3.037 (b, 2H), 6.138 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 6.245 (D, 1H, J = 2.4 Hz), 10.069 (b, 1H, OH), 10.322 (s, 1H, OH).
[0166]
b) 7,8,9,10-tetrahydro-bis (cyanomethoxy) -1,3-dihydroxy-6H-dibenzo [b, d] pyran-6-one
The product of the previous example (0.5 g), chloroacetonitrile (0.34 g) and potassium carbonate (1.5 g) were reacted in DMF (5 ml) as described in Example (1) b. . Yield 0.44g.¹H-NMR (DMSO-d₆, 400 MHz): 1.68 (b, 4H), 2.41 (b, 2H), 3.00 (b, 2H), 5.297 (s, 2H), 5.309 (s, 2H), 6 .797 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 6.899 (d, 1H, J = 2.4 Hz).
[0167]
c) 7,8,9,10-Tetrahydro-bis [(1H-tetrazol-5-yl) methoxy] -1,3-dihydroxy-6H-dibenzo [b, d] pyran-6-one
The product of the previous example (0.4 g) was prepared with sodium azide (0.18 g) and ammonium chloride (0.14 g) in DMF (2.5 ml) as described in Example (1) c. Processed. The product was recrystallized from ethanol-DMF (1: 1). Yield 0.17g. Melting point 283-286 [deg.] C.¹H-NMR (DMSO-d₆, 400 MHz): 1.626 (b, 4H), 2.393 (b, 2H), 2.971 (b, 2H), 5.583 (s, 2H), 5.599 (s, 2H), 6 .811 (s, 2H).
[0168]
Example (5) Production of 5,7-bis [(1H-tetrazol-5-yl) methoxy] -4-phenyl-2H-1-benzopyran-2-one
a) 5,7-dihydroxy-4-phenyl-2H-1-benzopyran-2-one
A solution of phloroglucinol (2.00 g) and ethyl benzoylacetate (3.05 g) in ethanol (30 ml) was treated with anhydrous HCl as described in Example (1) a. The product was recrystallized from ethanol-water (1: 1). Yield 3.0 g (75%).¹H-NMR (DMSO-d₆, 300 MHz): 5.739 (s, 1H, CH = C), 6.155 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 6.263 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 7.305-7.381 (m, 5H, Ph), 10.084 (s, 1H, OH), 10.368 (s, 1H, OH).
[0169]
b) 5,7-bis (cyanomethoxy) -4-phenyl-2H-1-benzopyran-2-one
The product of the previous example (1.00 g) was treated with chloroacetonitrile (0.62 g) and potassium carbonate (2.72 g) in DMF (5 ml) as described in Example (1) b. The reaction mixture was poured into ice water, and the mixture was extracted with ethyl acetate. The ethyl acetate was washed with 1M NaOH, dried over sodium sulfate and evaporated. The product was recrystallized from isopropanol. Yield 0.41 g (31%).¹H-NMR (DMSO-d₆, 300 MHz): 4.845 (s, 2H, OCH)₂CN), 5.344 (s, 2H, OCH₂CN), 6.086 (s, 1H, CH = C), 6.770 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 7.040 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 7. 320-7.443 (m, 5H, Ph).
[0170]
c) 5,7-bis [(1H-tetrazol-5-yl) methoxy] -4-phenyl-2H-1-benzopyran-2-one
The product of the previous example (0.40 g) was treated with sodium azide (0.16 g) and ammonium chloride (0.14 g) in DMF (2 ml) at 100 ° C. for 2 hours. The product was isolated as described in Example (1) c. Yield 0.40 g (79%). 222-224 ° C.¹H-NMR (DMSO-d₆, 400 MHz): 5.148 (s, 2H, OCH)₂Tet), 5.649 (s, 2H, OCH₂Tet), 5.968 (s, 1H, CH = C), 6.811 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 6.962 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 6. 994-7.185 (m, 5H, Ph).
[0171]
Example (6) 7,8,9,10-tetrahydro-1,3-bis [(1H-tetrazol-5-yl) methoxy] -8-phenyl-6H-dibenzo [b, d] pyran-6-one Manufacturing of
a) 7,8,9,10-Tetrahydro-1,3-dihydroxy-8-phenyl-6H-dibenzo [b, d] pyran-6-one
A solution of phloroglucinol (1.56 g) and ethyl 2-oxo-5-phenylcyclohexanecarboxylate (2.52 g) in ethanol (25 ml) was treated with anhydrous HCl as described in Example (1) a. The precipitate was filtered and washed with water and EtOH. Yield 1.0 g (32%).¹H-NMR (DMSO-d₆, 400 MHz): 1.72-1.82 (m, 1H), 2.01 (b, 1H), 2.317-2.387 (m, 1H), 2.707-2.763 (m, 1H) 1H), 2.830 (b, 1H), 3.041 (b, 1H), 3.35 and 3.40 (b, 1H), 6.174 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 6.277 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 7.200-7.350 (m, 5H, Ph), 10.131 (s, 1H, OH), 10.401 (s, 1H, OH).
[0172]
b) 7,8,9,10-tetrahydro-1,3-bis (cyanomethoxy) -8-phenyl-6H-dibenzo [b, d] pyran-6-one
The product of the previous example (1.0 g) was treated with chloroacetonitrile (0.57 g) and potassium carbonate (1.0 g) in DMF (5 ml) as described in Example (1) b. DMF was evaporated and the residue was dissolved in EtOAc. The ethyl acetate was washed with 1M NaOH, dried over sodium sulfate and evaporated. The product was recrystallized from acetone-isopropanol (1: 3). Yield 0.50 g (40%).¹H-NMR (DMSO-d₆, 300 MHz): 1.75-1.88 (m, 1H), 2.05 (b, 1H), 2.38-2.48 (m, 1H), 2.77-2.85 (m, 1H) 1H), 2.90 (b, 1H), 3.07 (b, 1H), 3.22 and 3.28 (b, 1H), 5.316 (s, 2H, OCH₂CN), 5.331 (s, 2H, OCH₂CN), 6.829 (d, 1H, J = 2.5 Hz), 6.939 (d, 1H, J = 2.5 Hz), 7.210-7.380 (m, 5H, Ph).
[0173]
c) 7,8,9,10-tetrahydro-1,3-bis [(1H-tetrazol-5-yl) methoxy] -8-phenyl-6H-dibenzo [b, d] pyran-6-one
The product of the previous example (0.30 g) was treated with sodium azide (0.10 g) and ammonium chloride (0.09 g) in DMF (2 ml) at 100 ° C. for 3.5 hours. The product was isolated as described in Example (1) c. Yield 0.30 g (82%). 235-245 ° C.¹H-NMR (DMSO-d₆, 400 MHz): 1.70-1.80 (m, 1H), 1.96 (b, 1H), 2.38-2.446 (m, 1H), 2.836 (m, 2H), 3 0.052 (b, 1H), 3.252 and 3.301 (b, 1H), 5.604 (s, 2H, OCH₂CN), 5.632 (s, 2H, OCH₂CN), 6.827 (d, 1H, J = 2.5 Hz), 6.858 (d, 1H, J = 2.5 Hz), 7.209-7.351 (m, 5H, Ph).
[0174]
Example (7) Production of 5,7-bis [(1H-tetrazol-5-yl) methoxy] -4-methyl-3- (2-phenylethyl) -2H-1-benzopyran-2-one
a) 5,7-dihydroxy-4-methyl-3- (2-phenylethyl) -2H-1-benzopyran-2-one
A solution of phloroglucinol (0.87 g) and ethyl 2- (2-phenylethyl) acetoacetate (1.62 g) in ethanol (30 ml) was treated with anhydrous HCl as described in Example (1) a. Yield 1.77 g (87%). 248-252 ° C.¹H-NMR (DMSO-d₆, 300 MHz): 2.413 (s, 3H, CH)₃), 2.652-2.782 (m, 4H, CH₂CH₂), 6.151 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 6.256 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 7.183-7.304 (m, 5H, Ph), 10 .137 (s, 1H, OH), 10.369 (s, 1H, OH).
[0175]
b) 5,7-bis (cyanomethoxy) -4-methyl-3- (2-phenylethyl) -2H-1-benzopyran-2-one
The product of the previous example (0.90 g) was treated with chloroacetonitrile (0.48 g) and potassium carbonate (2.1 g) in DMF (5 ml) at 100 ° C. for 0.5 hours. The product was isolated as described in Example (1) b. Yield 1.00 g (88%). Melting point 179-183 [deg.] C.¹H-NMR (DMSO-d₆, 300 MHz): 2.384 (s, 3H, CH)₃), 2.699-2.754 (m, 2H, CH₂CH₂), 2.805-2.841 (m, 2H, CH₂CH₂), 5.302 (s, 4H, OCH₂CN), 6,790 (d, 1H, J = 2.5 Hz), 6.909 (d, 1H, J = 2.5 Hz), 7.190-7.307 (m, 5H, Ph).
[0176]
c) 5,7-bis [(1H-tetrazol-5-yl) methoxy] -4-methyl-3- (2-phenylethyl) -2H-1-benzopyran-2-one
The product of the previous example (0.40 g) was treated with sodium azide (0.15 g) and ammonium chloride (0.12 g) in DMF (2 ml) at 100 ° C. for 2.5 hours. The product was isolated as described in Example (1) c. Yield 0.385 g (78%). 248-250 ° C.¹H-NMR (DMSO-d₆, 400 MHz): 2.368 (s, 3H, CH)₃), 2.668-2.707 (m, 2H, CH₂CH₂), 2.783-2.822 (m, 2H, CH₂CH₂), 5.593 (s, 2H, OCH₂Tet), 5.604 (s, 2H, OCH)₂Tet), 6.819 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 6.834 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 7.161-7.291 (m, 5H, Ph).
[0177]
Example (8) Production of 5,7-bis [(1H-tetrazol-5-yl) -methoxy] -1,3-dibenzyl-4-methyl-2 (1H) -quinolinone
a) 3,5-dimethoxyanilide 2-benzyl-3-oxobutanoate
3,5-Dimethoxyaniline (5 g) was added portionwise to preheated (160 ° C.) ethyl 2-benzylacetoacetate (15 ml) under a nitrogen atmosphere and maintained at that temperature for 60 minutes. The cooled solution was diluted with heptane-ethyl ether and filtered. Yield 5.2 g (49%).¹H-NMR (DMSO-d₆, 300 MHz): 2.183 (s, 3H), 3.069 (d, 2H, J = 7.2 Hz), 3.923 (t, 1H, J = 7.2 Hz), 6.616 ( dd. 1H, J = 2.3 Hz), 6.765 (d, 2H, J = 2.3 Hz), 7.13-7.3 (m, 5H), 10.123 (s, 1H).
[0178]
b) 3-benzyl-5,7-dimethoxy-4-methyl-2 (1H) -quinolinone
The product of the previous example (1.2 g) was added to preheated (85 ° C.) methanesulfonic acid (3.5 ml) and maintained at that temperature for 15 minutes. The solution was cooled and then treated with ice water. The product was filtered and washed with sodium bicarbonate and water. Yield 1.08 g (95%).¹H-NMR (300 MHz): 2.486 (s, 3H), 3.785 (s, 3H), 3.808 (s, 3H), 3.985 (s, 2H), 6.315 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 6.472 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 7.1-7.3 (m, 5H), 11.52 (s, 1H).
[0179]
c) 3-benzyl-5,7-dihydroxy-4-methyl-2 (1H) -quinolinone
The product of the previous example (1 g) was refluxed in pyridine hydrochloride (5 g) under a nitrogen atmosphere for 20 minutes. The reaction mixture was treated with water and the product was filtered. Yield 0.9 g (100%). Melting point 307-312 [deg.] C.¹H-NMR (300 MHz): 2.503 (s, 3H), 3.942 (s, 2H), 6.102 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 6.187 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 7.1-7.25 (m, 5H), 9.725 (s, 1H), 9.984 (s, 1H), 11.285 (s, 1H).
[0180]
d) 1,3-dibenzyl-5,7-dimethoxy-4-methyl-2 (1H) -quinolinone
The product of Example (8) b (1 g), potassium t-butoxide (0.62 g) and benzyl bromide (0.68 ml) were stirred in DMSO (10 ml) at 60 ° C. for 4 hours. The reaction mixture was treated with water, extracted with toluene and evaporated. The product was triturated with ethyl ether and filtered. Yield 0.5 g (39%).¹H-NMR (400 MHz): 2.537 (s, 3H), 3.708 (s, 3H), 3.826 (s, 3H), 4.124 (s, 2H), 5.56 (b, 2H), 6.413-6.434 (m, 2H), 7.154-7.332 (m, 10H).
[0181]
e) 1,3-dibenzyl-5,7-dihydroxy-4-methyl-2 (1H) -quinolinone
The product of the previous example (2 g) was treated with pyridine hydrochloride (10 g) as described in Example (8) c. The product was extracted with ethyl acetate and evaporated. Yield 1.4 g (75%).¹H-NMR (400 MHz): 2.570 (s, 3H), 4.076 (s, 2H), 5.450 (b, 2H), 6.135 (d, 1H, J = 2.2 Hz) , 6.199 (d, 1H, J = 2.2 Hz), 7.128-7.333 (m, 10H), 9.83 (b, 1H), 10.166 (s, 1H).
[0182]
f) 5,7-bis (cyanomethoxy) -1,3-dibenzyl-4-methyl-2 (1H) -quinolinone
The product of the previous example (1.4 g) was combined with chloroacetonitrile (0.76 g) and K in DMF (20 ml) as described in Example (1) b.₂CO₃(2.5 g). Yield 1.5 g (89%).¹H-NMR (400 MHz): 2.555 (s, 3H), 4.146 (s, 2H), 5.214 (s, 2H), 5.275 (s, 2H), 5.578 (s, 3H) 2H), 6.735 (s, 2H), 7.13-7.33 (m, 10H).
[0183]
g) 5,7-bis [(1H-tetrazol-5-yl) methoxy] -1,3-dibenzyl-4-methyl-2 (1H) -quinolinone
The product of the previous example (1.3 g) was treated with sodium azide (0.41 g) and ammonium chloride (0.34 g) as described in Example (1) c. Yield 0.69 g (45%).¹H-NMR (400 MHz): 2.471 (s, 3H), 4.113 (s, 2H), 5.577 (s, 2H), 5.55 (b, 2H), 5.574 (s, 3H) 2H), 6.670 (d, 1H, J = 2.1 Hz), 6.775 (d, 1H, J = 2.1 Hz), 7.13-7.32 (m, 10H).
[0184]
Example (9) Production of 5,7-bis [(1H-tetrazol-5-yl) methoxy] -3-benzyl-1,4-dimethyl-2 (1H) -quinolinone
a) 3-benzyl-5,7-dimethoxy-1,4-dimethyl-2 (1H) -quinolinone
The product of Example (8) b (0.5 g), t-BuOK (0.2 g) and methyl iodide (0.4 ml) were stirred in DMSO (5 ml) at 35 ° C. for 2 days. The reaction mixture was treated with water and extracted with toluene. The product was purified by column chromatography using toluene-ethyl acetate-acetic acid (8: 2: 1) as eluent. Yield 0.24 g (46%).¹H-NMR (300 MHz): 2.51 (s, 3H), 3.632 (s, 2H), 3.846 (s, 3H), 3.896 (s, 3H), 4.047 (s, 3H) 2H), 6.468 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 6.558 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 7.1-7.26 (m, 5H).
[0185]
b) 3-benzyl-5,7-dihydroxy-1,4-dimethyl-2 (1H) -quinolinone
The product of the previous example (0.2 g) was treated with pyridine hydrochloride (2 g) as described in Example (8) c and the product was extracted with ethyl acetate. Yield 0.16 g (89%).¹H-NMR (400 MHz): 2.567 (s, 3H), 3.515 (s, 3H), 4.005 (s, 2H), 6.244 (d, 1H, J = 2.3 Hz) , 6.268 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 7.08-7.25 (m, 5H), 9.879 (s, 1H), 10.113 (s, 1H).
[0186]
c) 5,7-bis (cyanomethoxy) -3-benzyl-1,4-dimethyl-2 (1H) -quinolinone
The product of the previous example (0.15 g), chloroacetonitrile (0.08 g) and K₂CO₃(0.28 g) was reacted in DMF (2 ml) as described in Example (1) b. Yield 0.16 g (84%).¹H-NMR (400 MHz): 2.524 (s, 3H), 3.658 (s, 3H), 4.079 (s, 2H), 5.292 (s, 2H), 5.379 (s, 3H) 2H), 6.766 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 6.855 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 7.13-7.24 (m5H).
[0187]
d) 5,7-bis [(1H-tetrazol-5-yl) methoxy] -3-benzyl-1,4-dimethyl-2 (1H) -quinolinone
The product of the previous example (0.15 g) was combined with NaN in DMF (2 ml) as described in Example (1) c.₃(57 mg) and NH₄Treated with Cl (47 mg). Yield 0.115 g. 250-253 ° C.¹H-NMR (400 MHz): 2.451 (s, 3H), 3.649 (s, 3H), 4.042 (s, 2H), 6.792 (d, 1H, J = 2.2 Hz) , 6.833 (d, 1H, J = Hz), 7.1-7.25 (m, 5H).
[0188]
Example (10) 3-benzyl-5,7-bis [(2-methyl-1H-tetrazol-5-yl) methoxy] -4-methyl-2H-1-benzopyran-2-one and its three isomers Manufacture of body
0.07 ml of methyl iodide was mixed with 0.2 g of the product of Example (1) c and K₂CO₃0.31 g was added to a solution of 2 ml of DMF and the mixture was stirred at room temperature for 4 hours. The reaction mixture was poured into ice water and filtered. Yield: 0.2 g as a mixture of four regioisomers. 71-76 ° C.¹H-NMR (DMSO-d₆, 400 MHz): 2.47 (s, CH₃), 2.48 (s, CH₃), 3.93 (s, CH₂Ph), 4.11 (s, NCH₃), 4.12 (s, NCH₃), 4.15 (s, NCH₃), 4.38 (s, NCH₃), 4.40 (s, NCH₃), 5.51 (s, OCH₂), 5.52 (s, OCH₂), 5.62 (s, OCH₂), 5.67 (s, OCH₂), 6.84-6.91 (m, 2H), 7.16-7.28 (m, 5H, Ph).
[0189]
Example (11) Production of 3-benzyl-5,7-bis [1- (1H-tetrazol-5-yl) ethoxy] -4-methyl-2H-1-benzopyran-2-one and a mixture of stereoisomers
a) 3-benzyl-5,7-bis [(1-cyano) ethoxy] -4-methyl-2H-1-benzopyran-2-one
The product of Example (1) a (1 g), 2-chloropropionitrile (0.7 g) and potassium carbonate (2 g) were heated in DMF (15 ml) under a nitrogen atmosphere at 110 ° C. for 60 minutes. The mixture was treated with water, filtered and washed with 1N NaOH and water. Yield 1.2 g.¹H-NMR (DMSO-d₆, 300 MHz): 1.74-1.78 (t + t, 6 H, CH-C)H ₃), 2.53 (s, 3H), 3.97 (s, 2H), 5.58-5.66 (m, 2H, CH-CH₃), 6.87 (m, 1H), 6.99 (d, 1H), 7.18-7.31 (m, 5H).
[0190]
b) 3-benzyl-5,7-bis [1- (1H-tetrazol-5-yl) ethoxy] -4-methyl-2H-1-benzopyran-2-one, a mixture of stereoisomers
The product of the previous example (0.5 g), sodium azide (0.18 g) and ammonium chloride (0.15 g) were heated in DMF (7 ml) at 100 ° C. for 90 minutes. The product was treated with water, extracted with ethyl acetate and evaporated. Yield 0.57 g. 91-104 ° C.¹H-NMR (DMSO-d₆, 300 MHz): 1.69-1.77 (m, 6 H, CH-C)H ₃), 2.54 (s, 3H), 3.94 (s, 2H), 6.10-6.17 ((m, 2H, CH-CH₃), 6.65 (dd, 1H), 6.74 (dd, 1H), 7.13-7.30 (m, 5H).
[0191]
Example (12) Production of 5,7-bis (carboxymethoxy) -1,3-dibenzyl-4-methyl-2 (1H) -quinolinone
[0192]
The product of Example (8) f (0.2 g) was refluxed for 1 hour in a solution consisting of concentrated hydrochloric acid (3 ml) and acetic acid (2 ml). The product was filtered at 25 ° C. Yield 0.14g.¹H-NMR (300 Mhz, DMSO-d₆): 2.63 (s, CH₃), 4.14 (s, 2H, CH₂Ph), 4.66 (s, 2 H, OCH₂COOH), 4.79 (s, 2H, OCH₂COOH), 5.53 (s, 2H, NCH₂Ph), 6.41 (d, 1H, J = 2.2 Hz), 6.45 (d, 1H, J = 2.2 Hz), 7.13-7.34 (m, 10H, Ph).
[0193]
Example (13) Production of 3-benzyl-5,7-bis [(1H-tetrazol-5-yl) methoxy] -1- (4-fluorobenzyl) -4-methyl-2 (1H) -quinolinone
a) 1-benzyl-5,7-dimethoxy-3- (4-fluorobenzyl) -4-methyl-2 (1H) -quinolinone
The product of Example (8) b (2 g), potassium tert-butoxide (0.87 g) and 4-fluorobenzyl chloride (1.12 g) were combined with DMSO (20 ml) as described in Example (8) d. ) At 60 ° C. for 3 hours. Yield 1.28 g.¹H-NMR (400 Mhz, DMSO-d₆): 2.53 (s, 3H), 3.73 (s, 3H), 3.83 (s, 3H), 5.55 (s, 2H), 6.43 (s, 2H), 7.12 -7.2 (m, 5H), 7.26-7.28 (m, 4H).
[0194]
b) 3-benzyl-5,7-dihydroxy-1- (4-fluorobenzyl) -4-methyl-2 (1H) -quinolinone
The product of the previous example (1.25 g) was heated in pyridine hydrochloride (12.5 g) at about 225 ° C. for 9 minutes. Yield 1 g.¹H-NMR (300 Mhz, DMSO-d₆): 2.56 (s, 3H), 4.07 (s, 2H), 5.4 (b, 2H), 6.13 (d, 1H, J = 2.1 Hz), 6.20 (d , 1H, J = 2.1 Hz), 7.12-7.28 (m, 9H), 9.88 (s, 1H), 10.22 (s, 1H).
[0195]
c) 3-benzyl-5,7-bis (cyanomethoxy) -1- (4-fluorobenzyl) -4-methyl-2 (1H) -quinolinone
Product from previous example (1 g), ClCH₂CN (0.43 g) and K₂CO₃(1.42 g) was heated in DMF (8 ml) at 120 ° C. for 1 hour. Yield 0.94g.¹H-NMR (300 Mhz, DMSO-d₆): 2.55 (s, 3H), 4.14 (s, 2H), 5.25 (s, 2H), 5.28 (s, 2H), 5.57 (s, 2H), 6.74 (S, 2H, ArH), 7.1-7.3 (m, 9H).
[0196]
d) 3-benzyl-5,7-bis [(1H-tetrazol-5-yl) methoxy] -1- (4-fluorobenzyl) -4-methyl-2 (1H) -quinolinone
The product of the previous example (0.5 g), sodium azide (0.14 g) and ammonium chloride (0.12 g) were heated in DMF (5 ml) at 120 ° C. for 90 minutes. The product was triturated with acetonitrile. Yield 0.28g. 126-132 ° C.¹H-NMR (300 Mhz, DMSO-d₆): 2.48 (s, 3H), 4.11 (s, 2H), 5.51 (s, 2H), 5.55 (s, 2H), 5.58 (s, 2H), 6.67. (D, 1H, J = 2.1 Hz), 6.78 (d, 1H, J = 2.1 Hz).
[0197]
Example (14) Production of 5,7-bis [(1H-tetrazol-5-yl) methoxy] -3- (4-chlorobenzyl) -4-methyl-2H-1-benzopyran-2-one
a) 3- (4-chlorobenzyl) -5,7-dihydroxy-4-methyl-2H-1-benzopyran-2-one
A solution of phloroglucinol (1.57 g) and ethyl 2- (4-chlorobenzyl) acetoacetate (3.18 g) in ethanol (25 ml) was treated with anhydrous HCl at 0 ° C. for 1.5 hours, and the solution was treated with water. Temperature was maintained overnight. The solvent was evaporated and the precipitate was triturated with water. Yield 3.87 g (98%). Mp 270-278 ° C.¹H-NMR (DMSO-d₆, 300 MHz): 2.52 (s, 3H, CH)₃), 3.87 (s, 2H, CH₂), 6.17 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 6.28 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 7.18-7.34 (m, 4H, Ph), 10 .21 (s, 1H, OH), 10.48 (s, 1H, OH).
[0198]
b) 5,7-bis (cyanomethoxy) -3- (4-chlorobenzyl) -4-methyl-2H-1-benzopyran-2-one
The product of the previous example (1.00 g), chloroacetonitrile (0.50 g) and potassium carbonate (2.18 g) were heated in DMF (5 ml) at 100 ° C. for 30 minutes. The product was isolated as described in Example (1) b. Yield 0.90 g (72%).¹H-NMR (DMSO-d₆, 300 MHz): 2.52 (s, 3H, CH)₃), 3.95 (s, 2H, CH₂), 5.308 (s, 2H, OCH)₂CN), 5.312 (s, 2H, OCH₂CN), 6.81 (d, 1H, J = 2.5 Hz), 6.94 (d, 1H, J = 2.5 Hz), 7.22-7.33 (m, 4H, Ph).
[0199]
c) 5,7-bis [(1H-tetrazol-5-yl) methoxy] -3- (4-chlorobenzyl) -4-methyl-2H-1-benzopyran-2-one
The product of the previous example (0.40 g), sodium azide (0.14 g) and ammonium chloride (0.11 g) were heated in DMF (2 ml) at 100 ° C. for 2 hours. The product was isolated as described in Example (1) c. Yield 0.40 g (82%).¹H-NMR (DMSO-d₆, 300 MHz): 2.46 (s, 3H, CH)₃), 3.92 (s, 2H, CH₂), 5.602 (s, 2H, OCH)₂Tet), 5.609 (s, 2H, OCH₂Tet), 6.83 (d, 1H, J = 2.5 Hz), 6.85 (d, 1H, J = 2.5 Hz), 7.20-7.33 (m, 4H, Ph).
[0200]
Example (15) Production of 5,7-bis [(1H-tetrazol-5-yl) methoxy] -3- (4-nitrobenzyl) -4-methyl-2H-1-benzopyran-2-one
a) 5,7-dihydroxy-4-methyl-3- (4-nitrobenzyl) -2H-1-benzopyran-2-one
A solution of phloroglucinol (0.48 g) and ethyl 2- (4-nitrobenzyl) acetoacetate (1.00 g) in ethanol (150 ml) was treated with anhydrous HCl at 0 ° C. for 7.5 hours and the solution was treated with Temperature was maintained overnight. The solvent was evaporated and the precipitate was triturated with water. Yield 0.63 g (51%). Melting point 280-285 [deg.] C.¹H-NMR (DMSO-d₆, 300 MHz): 2.53 (s, 3H, CH)₃), 4.03 (s, 2H, CH₂), 6.19 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 6.29 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 7.40-7.51 and 8.11-8.17 ( m, 4H Ph), 10.25 (s, 1H, OH), 10.52 (s, 1H, OH).
[0201]
b) 5,7-bis (cyanomethoxy) -3- (4-nitrobenzyl) -4-methyl-2H-1-benzopyran-2-one
The product of the previous example (0.57 g), chloroacetonitrile (0.27 g) and potassium carbonate (1.20 g) were heated in DMF (2 ml) at 100 ° C. for 50 minutes. The product was isolated as described in Example (1) b. Yield 0.47 g (67%). Melting point 178-185 [deg.] C.¹H-NMR (DMSO-d₆, 400 MHz): 2.53 (s, 3H, CH)₃), 4.11 (s, 2H, CH₂), 5.319 (s, 2H, OCH₂CN), 5.323 (s, 2H, OCH₂CN), 6.83 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 6.96 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 7.48-7.53 and 8.12-8.16. (M, 4H, Ph).
[0202]
c) 5,7-bis [(1H-tetrazol-5-yl) methoxy] -3- (4-nitrobenzyl) -4-methyl-2H-1-benzopyran-2-one
The product of the previous example (0.38 g), sodium azide (0.12 g) and ammonium chloride (0.11 g) were heated in DMF (3 ml) at 100 ° C. for 2 hours. The product was isolated as described in Example (1) c. Yield 0.25 g (54%). 240-244 ° C.¹H-NMR (DMSO-d₆, 400 MHz): 2.47 (s, 3H, CH)₃), 4.08 (s, 2H, CH₂), 5.611 (s, 2H, OCH)₂Tet), 5.623 (s, 2H, OCH₂Tet), 6.85 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 6.87 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 7.46-7.50, and 8.12-8.16. (M, 4H, Ph).
[0203]
Example (16) Preparation of 5,7-bis [(1H-tetrazol-5-yl) methoxy] -3-cyclopentyl-4-methyl-2H-1-benzopyran-2-one a) 3-cyclopentyl-5 7-dihydroxy-4-methyl-2H-1-benzopyran-2-one
A solution of phloroglucinol (2.00 g) and ethyl 2-cyclopentylacetoacetate (3.14 g) in ethanol (40 ml) was treated with anhydrous HCl at 0 ° C. for 2.5 hours and the solution was maintained at this temperature overnight. did. The solvent was evaporated and the precipitate was purified by flash chromatography, eluting with toluene-EtOAc-AcOH (8: 1: 1). Yield 1.22 g (29%).¹H-NMR (DMSO-d₆, 300 MHz): 1.50-1.88 (m, 8H,-(CH₂)₄−), 2.57 (s, 3H, CH₃), 3.25 (m, 1H, CH), 6.11 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 6.25 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 10.25 (b , 2H, OH).
[0204]
b) 5,7-bis (cyanomethoxy) -3-cyclopentyl-4-methyl-2H-1-benzopyran-2-one
The product of the previous example (0.50 g), chloroacetonitrile (0.31 g) and potassium carbonate (0.61 g) were heated in DMF (2 ml) at 80 ° C. for 40 minutes. The product was isolated as described in Example (1) b. Yield 0.56 g (86%).¹H-NMR (DMSO-d₆, 300 MHz): 1.55-1.90 (m, 8H,-(CH₂)₄−), 2.56 (s, 3H, CH₃), 3.37 (m, 1H, CH), 5.29 (s, 2H, OCH₂CN), 5.31 (s, 2H, OCH₂CN), 6.75 (d, 1H, J = 2.5 Hz), 6.88 (d, 1H, J = 2.5 Hz).
[0205]
c) 5,7-bis [(1H-tetrazol-5-yl) methoxy] -3-cyclopentyl-4-methyl-2H-1-benzopyran-2-one
The product of the previous example (0.30 g), sodium azide (0.13 g) and ammonium chloride (0.11 g) were heated in DMF (1 ml) at 100 ° C. for 1.5 hours. The product was isolated as described in Example (1) c. Yield 0.30 g (80%). 248-252 ° C.¹H-NMR (DMSO-d₆, 400 MHz): 1.53-1.89 (m, 8H,-(CH₂)₄−), 2.51 (s, 3H, CH₃), 3.34 (m, 1H, CH), 5.59 (s, 2H, OCH)₂Tet), 5.61 (s, 2H, OCH₂Tet), 6.80 (s, 2H).
[0206]
Example (17) Production of 5,7-bis [(1H-tetrazol-5-yl) methoxy] -4-methyl-3- (1-naphthylmethyl) -2H-1-benzopyran-2-one
a) 5,7-dihydroxy-4-methyl-3- (1-naphthylmethyl) -2H-1-benzopyran-2-one
A solution of phloroglucinol (0.47 g) and ethyl 2- (1-naphthylmethyl) acetoacetate (1.00 g) in ethanol (20 ml) was treated with anhydrous HCl at 0 ° C. for 3 hours and the solution was brought to this temperature. Maintained overnight. The solvent was evaporated, the precipitate was triturated with water and recrystallized from isopropanol-water (1: 1). Yield 0.96 g (78%). 275-280 ° C.¹H-NMR (DMSO-d₆, 400 MHz): 2.45 (s, 3H, CH)₃), 4.32 (s, 2H, CH₂), 6.23 (d, 1H, J = 2.5 Hz), 6.32 (d, 1H, J = 2.5 Hz), 6.97-8.25 (m, 7H, Naph), 10.26 (s, 1H, OH), 10.53 (s, 1H, OH).
[0207]
b) 5,7-bis (cyanomethoxy) -4-methyl-3- (1-naphthylmethyl) -2H-1-benzopyran-2-one
The product of the previous example (0.80 g), chloroacetonitrile (0.36 g) and potassium carbonate (0.66 g) were heated in DMF (4 ml) at 100 ° C. for 1 hour. The product was isolated as described in Example (1) b. Yield 0.30 g (30%).¹H-NMR (DMSO-d₆, 300 MHz): 2.45 (s, 3H, CH)₃), 4.40 (s, 2H, CH₂), 5.34 (s, 2H, OCH)₂CN), 5.36 (s, 2H, OCH₂CN), 6.86 (d, 1H, J = 2.5 Hz), 7.010 (d, 1H, J = 2.5 Hz), 7.016-8.27 (m, 7H, Naph).
[0208]
c) 5,7-bis [(1H-tetrazol-5-yl) methoxy] -4-methyl-3- (1-naphthylmethyl) -2H-1-benzopyran-2-one
The product of the previous example (0.25 g), sodium azide (0.080 g) and ammonium chloride (0.072 g) were heated in DMF (2 ml) at 100 ° C. for 2.5 hours. The product was isolated as described in Example (1) c. Yield 0.11 g (36%). Melting point 164-174 [deg.] C.¹H-NMR (DMSO-d₆, 300 MHz): 2.40 (s, 3H, CH)₃), 4.37 (s, 2H, CH₂), 5.63 (s, 2H, OCH₂Tet), 5.65 (s, 2H, OCH₂Tet), 6.87 (d, 1H, J = 2.5 Hz), 6.92 (d, 1H, J = 2.5 Hz), 6.98-8.26 (m, 7H, Naph).
[0209]
Example (18) Production of 1-benzyl-5,7-bis [(1H-tetrazol-5-yl) -methoxy] -4-methyl-2 (1H) -quinolinone
a) 5,7-Dimethoxy-4-methyl-2 (1H) -quinolinone
Heat tert-butyl acetoacetate (1.58 g) to 120 ° C. and add 3,5-dimethoxyaniline (1.53 g) dissolved in xylene (4 ml). The mixture was heated at 120-130 ° C for 20 minutes and then cooled to room temperature. Methanesulfonic acid (2 ml) was added and the mixture was stirred at ambient temperature for 10 minutes. Water (40 ml) was added and the precipitate was filtered and dried. Yield 1.31 g (60%).¹H-NMR (DMSO-d₆, 300 MHz): 2.50 (s, 3H, CH)₃), 3.79 (s, 3H, OCH₃), 3.83 (s, 3H, OCH₃), 6.03 (s, 1H, CH = C), 6.31 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 6.45 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 11.4. (B, 1H, NH).
[0210]
b) 1-benzyl-5,7-dimethoxy-4-methyl-2 (1H) -quinolinone
The product of the previous example (1.20 g) was suspended in DMSO (15 ml) and t-BuOK (0.68 g) and benzyl bromide (1.03 g) were added. The reaction mixture was stirred overnight at ambient temperature. Water was added and the product was extracted into EtOAc. The EtOAc was dried and evaporated to dryness. The product was recrystallized from toluene. Yield 0.80 g (47%).¹H-NMR (DMSO-d₆, 300 MHz): 2.55 (d, 3H, J = 1.1 Hz, CH₃), 3.71 (s, 3H, OCH₃), 3.84 (s, 3H, OCH₃), 5.48 (b, 2H, NCH₂), 6.29 (d, 1H, J = 1.1 Hz, CH = C), 6.4 (s, 2H), 7.18-7.33 (m, 5H, Ph).
[0211]
c) 1-benzyl-5,7-dihydroxy-4-methyl-2 (1H) -quinolinone
The product of the previous example (0.69 g) was converted to CH₂Cl₂(14 ml) and the reaction mixture was cooled to -20 <0> C. CH₂Cl₂BBr inside₃(2.4 g) (1 M solution) was added and the mixture was allowed to warm to ambient temperature overnight. The precipitate is filtered and CH₂Cl₂And dissolved in EtOAc. The EtOAc was washed with dilute HCl, dried and evaporated to dryness. Yield 0.34 g (54%).¹H-NMR (DMSO-d₆, 300 MHz): 2.56 (d, 3H, J = 1.0 Hz, CH₃), 5.33 (b, 2H, NCH₂), 6.11 (d, 1H, J = 2.1 Hz), 6.13 (d, 1H, J = 1.0 Hz, CH = C), 6.17 (d, 1H, J = 2.1 Hz). 1 Hz), 7.12-7.34 (m, 5H, Ph), 9.90 (b, 1H, OH), 10.22 (s, 1H, OH).
[0212]
d) 1-benzyl-5,7-bis (cyanomethoxy) -4-methyl-2 (1H) -quinolinone
The product of the previous example (0.34 g), chloroacetonitrile (0.13 g) and potassium carbonate (0.34 g) were heated in DMF (2 ml) at 100 ° C. for 1.5 hours. Water was added, the precipitate was filtered and dried. The product was recrystallized from isopropanol. Yield 0.20 g (46%).¹H-NMR (DMSO-d₆, 400 MHz): 2.57 (s, 3H, CH)₃), 5.22 (s, 2H, OCH)₂CN), 5.30 (s, 2H, OCH₂CN), 5.50 (b, 2H, NCH₂), 6.42 (s, 1H, CH = C), 6.70 (d, 1H, J = 2.1 Hz), 6.73 (d, 1H, J = 2.1 Hz), 7.21 -7.32 (m, 5H, Ph).
[0213]
e) 1-benzyl-5,7-bis [(1H-tetrazol-5-yl) methoxy] -4-methyl-2 (1H) -quinolinone
The product of the previous example (0.20 g), sodium azide (0.072 g) and ammonium chloride (0.060 g) were heated in DMF (2 ml) at 100 ° C. for 3 hours. The product was isolated as described in Example (1) c. Yield 0.21 g (85%). 246-249 ° C.¹H-NMR (DMSO-d₆, 400 MHz): 2.50 (s, 3H, CH)₃), 5.48 (b, 4H, OCH₂Tet, NCH₂), 5.60 (s, 2H, OCH₂Tet), 6.34 (s, 1H, CH = C), 6.64 (d, 1H, J = 1.9 Hz), 6.77 (d, 1H, J = 1.9 Hz), 7. 18-7.32 (m, 5H, Ph).
[0214]
Example (19) Production of 1-benzyl-5,7-bis [(1H-tetrazol-5-yl) methoxy] -3- (2-fluorobenzyl) -4-methyl-2 (1H) -quinolinone
a) 5,7-Dimethoxy-3- (2-fluorobenzyl) -4-methyl-2 (1H) -quinolinone
Ethyl 2- (2-fluorobenzyl) acetoacetate (2.5 g) in xylene (1 ml) was heated to 150 ° C. and 3,5-dimethoxyaniline (1.46 g) in xylene (4 ml) for 30 minutes. It was added in small portions. The reaction mixture was heated at 160 ° C. for 3 hours and then cooled to room temperature. Methanesulfonic acid (1.7 ml) was added and the mixture was stirred at ambient temperature for 30 minutes. Water was added, the precipitate was filtered and dried. The product was triturated with warm ethanol. Yield 0.64 g (21%).¹H-NMR (DMSO-d₆, 300 MHz): 2.45 (s, 3H), 3,79 (s, 3H), 3.82 (s, 3H), 3.97 (s, 2H), 6.33 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 6.48 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 6.90-7.25 (m, 4H), 11.61 (s, 1H).
[0215]
b) 1-benzyl-5,7-dimethoxy-3- (2-fluorobenzyl) -4-methyl-2 (1H) -quinolinone
The product of the previous example (0.62 g) was treated with t-BuOK (0.23 g) and benzyl bromide (0.36 g) in DMSO (12 ml) at 60 ° C. for 2.5 hours. The product was isolated as described in Example (18) b. Yield 0.39 g (49%).¹H-NMR (DMSO-d₆, 400 MHz): 2.51 (s, 3H), 3.72 (s, 3H), 3.84 (s, 3H), 4.11 (s, 2H), 5.55 (b, 2H), 6.433 (d, 1H, J = 2.1 Hz), 6.443 (d, 1H, J = 2.1 Hz), 6.97-7.33 (m, 9H).
[0216]
c) 1-benzyl-5,7-dihydroxy-3- (2-fluorobenzyl) -4-methyl-2 (1H) -quinolinone
The product of the previous example (0.34 g) was combined with CH 2 O as described in Example (18) c.₂Cl₂BBr in (7 ml)₃(8.48 g). Yield 0.30 g (82%).¹H-NMR (DMSO-d₆, 400 MHz): 2.55 (s, 3H), 4.06 (s, 2H), 5.40 (b, 2H), 6.13 (d, 1H, J = 2.1 Hz), 6. 22 (d, 1H, J = 2.1 Hz), 6.97-7.33 (m, 9H), 10.3 (b, 2H).
[0217]
d) 1-benzyl-5,7-bis (cyanomethoxy) -3- (2-fluorobenzyl) -4-methyl-2 (1H) -quinolinone
The product of the previous example (0.21 g), chloroacetonitrile (0.086 g) and potassium carbonate (0.37 g) were heated in DMF (2 ml) at 100 ° C. for 2 hours. The product was isolated as described in Example (1) b. Yield 0.18 g (71%).¹H-NMR (DMSO-d₆, 400 MHz): 2.53 (s, 3H), 4.13 (s, 2H), 5.23 (s, 2H), 5.29 (s, 2H), 5.57 (b, 2H), 6.746 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 6.756 (d, 1H, J = 2, 3 Hz), 7.00-7.32 (m, 9H).
[0218]
e) 1-benzyl-5,7-bis [(1H-tetrazol-5-yl) methoxy] -3- (2-fluorobenzyl) -4-methyl-2 (1H) -quinolinone
The product of the previous example (0.17 g), sodium azide (0.051 g) and ammonium chloride (0.042 g) were heated in DMF at 100 ° C. for 3 hours. The product was isolated as described in Example (1) c. Yield 0.17 g (85%). 135-140 ° C.¹H-NMR (DMSO-d₆, 400 MHz): 2.46 (s, 3H), 4.10 (s, 2H), 5.48 (s, 2H), 5.51 (b, 2H), 5,59 (s, 2H), 6.68 (d, 1H, J = 2.2 Hz), 6.79 (d, 1H, J = 2.2 Hz), 6.99-7.32 (m, 9H).
[0219]
Example (20) Production of 1-benzyl-5,7-bis [(1H-tetrazol-5-yl) -methoxy] -4-methyl-3- (2-phenylethyl) -2 (1H) -quinolinone
a) 5,7-Dimethoxy-4-methyl-3- (2-phenylethyl) -2 (1H) -quinolinone
Ethyl 2- (2-phenylethyl) acetoacetate (2.70 g) in xylene (5 ml) was treated with 3,5-dimethoxyaniline (1.60 g) at 150 ° C. as described in Example (19) a. ). Methanesulfonic acid (4.0 ml) was added at room temperature and the mixture was heated at 80 ° C. for 1 hour. The product was isolated as described in Example (19) a. Yield 1.38 g (41%).¹H-NMR (DMSO-d₆, 400 MHz): 2.45 (s, 3H), 2.64-2.68 (m, 2H), 2.82-2.86 (m, 2H), 3.78 (s, 3H), 3 .81 (s, 3H), 6.30 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 6.45 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 7.18-7.30 (m, 5H), 11.45 (s, 1H).
[0220]
b) 1-benzyl-5,7-dimethoxy-4-methyl-3- (2-phenylethyl) -2 (1H) -quinolinone
The product of the previous example (0.61 g), t-BuOK (0.24 g) and benzyl bromide (0.36 g) were heated in DMSO (12 ml) at 60 ° C. for 2 hours. The product was isolated as described in Example (18) b. Yield 0.31 g (40%).¹H-NMR (DMSO-d₆, 400 MHz): 2.51 (s, 3H), 2.73-2.77 (m, 2H), 2.96-3.00 (m, 2H), 3.70 (s, 3H), 3 .83 (s, 3H), 5.55 (b, 2H), 6.40 (s, 2H), 7.17-7.33 (m, 10H).
[0221]
c) 1-benzyl-5,7-dihydroxy-4-methyl-3- (2-phenylethyl) -2 (1H) -quinolinone
The product of the previous example (0.31 g) was combined with CH 2 O as described in Example (18) c.₂Cl₂BBr in (5 ml)₃(0.75 g). Yield 0.26 g (89%).¹H-NMR (DMSO-d₆, 300 MHz): 2.56 (s, 3H), 2.69-2.75 (m, 2H), 2.90-2.95 (m, 2H), 5.39 (b, 2H), 6 .08 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 6.19 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 7.11-7.33 (m, 10H), 10.2 (b, 2H).
[0222]
d) 1-benzyl-5,7-bis (cyanomethoxy) -4-methyl-3- (2-phenylethyl) -2 (1H) -quinolinone
The product from the previous example (0.22 g), chloroacetonitrile (0.091 g) and potassium carbonate (0.39 g) were heated at 100 ° C. for 2 hours. The product was isolated as described in Example (1) b. Yield 0.20 g (76%).¹H-NMR (DMSO-d₆, 400 MHz): 2.50 (s, 3H), 2.73-2.77 (m, 2H), 2.98-3.02 (m, 2H), 5.21 (s, 2H), 5 .29 (s, 2H), 5.56 (b, 2H), 6.70 (d, 1H, J = 2.1 Hz), 6.72 (d, 1H, J = 2.1 Hz), 7 .18-7.33 (m, 10H).
[0223]
e) 1-benzyl-5,7-bis [(1H-tetrazol-5-yl) methoxy] -4-methyl-3- (2-phenylethyl) -2 (1H) -quinolinone
The product of the previous example (0.19 g), sodium azide (0.057 g) and ammonium chloride (0.047 g) were heated in DMF at 100 ° C. for 3 hours. The product was isolated as described in Example (1) c. Yield 0.18 g (78%). Melting point 215-218 [deg.] C.¹H-NMR (DMSO-d₆, 400 MHz): 2.46 (s, 3H), 2.70-2.74 (m, 2H), 2.95-2.99 (m, 2H), 5.47 (s, 2H), 5 .54 (b, 2H), 5.57 (s, 2H), 6.64 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 6.77 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 7 .16-7.33 (m, 10H).
[0224]
Example (21) Production of 5,7-bis (aminocarbonylmethoxy) -1,3-dibenzyl-4-methyl-2 (1H) -quinolinone
5,7-Dihydroxy-1,3-dibenzyl-4-methyl-2 (1H) -quinolinone (0.5 g), potassium carbonate (0.9 g) and 2-chloroacetamide (0.25 g) were added to DMF (6. 5 ml) was reacted at 100 ° C. for 2 hours. The reaction mixture was treated with ice water and filtered. The product was triturated with hot ethanol. Yield 0.32g. Melting point 252-253 [deg.] C.¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆): 2.63 (s, 3H, CH₃), 4.13 (s, 2H, PhCH₂), 4.37 (s, 2H, OCH₂), 4.55 (s, 2H, OCH₂), 5.54 (s, 2H, NCH₂Ph), 6.40 (d, 1H, J = 2 Hz, ArH), 6.53 (d, 1H, J = 2 Hz, ArH), 7.13-7.33 (m, 10H, Ph), 7.44 (d, 2H, J = 65 Hz, CONH₂), 7.47 (d, 2H, J = 68 Hz, CONH₂).
[0225]
Example (22) Production of 5,7-bis (ethoxycarbonylmethoxy) -1,3-dibenzyl-4-methyl-2 (1H) -quinolinone
5,7-Dihydroxy-1,3-dibenzyl-4-methyl-2 (1H) -quinolinone (1 g), ethyl 2-bromoacetate (0.63 ml) and potassium carbonate (1.49 g) in DMF (5 ml). Was heated at 110 ° C. for 3 hours under a nitrogen atmosphere, poured into ice water, and filtered. The solid material obtained was triturated with ether and filtered again. Yield 1.03g. 113-116 ° C.¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆): 1.15 (t, 3H, CH₃CH₂, J = 7.1 Hz), 1.20 (t, 3H, CH)₃CH₂, J = 7.1 Hz), 2.63 (s, 3H, CH)₃), 4.03 (q, 2H, CH₂CH₃, J = 7.1 Hz), 4.13 (s, 2H, CH)₂Ph), 4.17 (q, 2H, CH₂CH₃, J = 7.1 Hz), 4.78 (s, 2H, OCH)₂), 4.90 (s, 2H, OCH₂), 6.41 (d, 1H, J = 2.2 Hz), 6.44 (d, 1H, J = 2.2 Hz), 7.13-7.33 (m, 10H, Ph).
[0226]
Example (23) Production of 5,7-bis (hydroxyaminocarbonylmethoxy) -1,3-dibenzyl-4-methyl-2 (1H) -quinolinone
The product of the previous example (0.3 g), hydroxylamine hydrochloride (0.32 g) and 5N NaOH (1.05 ml) were reacted in ethanol (8 ml) at 50 ° C. for 6 hours. The reaction mixture was treated with water, made basic (pH 10) and filtered. The filtrate was acidified to pH 2 and filtered. Yield 0.2 g. 121-127 ° C.¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆): The tautomeric form of hydroxamic acid is OCH₂It was seen in the signal. 2.63 (s, 3H, CH₃), 4.13 (S, 2H, CH₂Ph), 4.41 (s, 2H, OCH₂), 4.54 (s, 2H, OCH)₂), 4.64 (s, 2H, HON = C (OH) CH₂O), 4.65 (s, 2H, HON = C (OH) CH₂O), 4.77 (s, 2H, HON = C (OH) CH₂O), 4.78 (s, 2H, HON = C (OH) CH₂O), 5.54 (s, 2H, NCH₂Ph), 6.38-6.54 (m, 2H, ArH), 7.14-7.34 (m, 10H, Ph), 9.05 (b, 2H, NOH), 10.84 (s, 1H, HONHCO), 10.88 (s, 1H, HONHCO).
[0227]
Example 5 Design of PLB deactivator
The three-dimensional structure determined for phospholamban can be used as a target for selecting compounds that bind to the protein. To obtain good affinity for phospholamban, the ligand should have steric and electrostatic complementarity with the target. In particular, good electrostatic and / or hydrogen bonding interactions should be formed with sites S1 and S2, and good hydrophobic interactions should be formed with sites S3 and S4. Any of a variety of computer programs and databases available for such purposes can be used to design compounds that meet these requirements. Structure-based approaches include de novo design, computer-based selection of ligands complementary to targets, and computer-aided optimization of dominant molecules. The detection of a PLB binding compound can proceed using the following steps.
[0228]
1. Select the target region of the protein. The binding model of the effective phospholamban inactivator peptide cP226 can be used to define areas on the surface of phospholamban that can serve as targets for the phospholamban inactivator. In particular, this determines the side chain of the phospholamban that can interact with the compound to be designed.
[0229]
2. Small molecules complementary to the binding site can be bound to the target by using available software such as, for example, Ludi, DOCK, or LeapFrog. A computer database of the three-dimensional structure of small molecules or molecular fragments can be used for this binding. Such methods of study provide molecules or fragments that have excellent interactions with various portions of the target region.
[0230]
3. Various small molecules or fragments that bind to the target region can be attached, or new side chains and / or functional groups can be incorporated into them, resulting in a single, larger molecule. The resulting novel compounds are likely to have better affinity for the target than smaller molecules.
[0231]
4. By using an interactive molecular graphics system, an appropriate scaffold or junction near the binding site of the protein can be selected. Next, new fragments and functional groups can be added to the scaffold such that the new groups exhibit excellent interaction with the surface of the target.
[0232]
5. The cyclic peptide cP226 is an example of a compound that binds to the ligand binding site of phospholamban. The structure of cP226 can be used as a model for designing new compounds with affinity for phospholamban. Such compounds can be designed using any method that is sufficiently sophisticated to design peptidomimetics, more generally peptide mimics.
[0233]
A limited number of compounds can be selected by the methods outlined above. One skilled in the art can identify such compounds by using the three-dimensional structure of phospholamban stored in a computer system. The compound can then be synthesized and tested for its ability to inactivate phospholamban in an assay similar to the one outlined in Example 3.
[0234]
[Table 4]

[0235]
[Table 5]

[0236]
[Table 6]

[0237]
[Table 7]

[0238]
[Table 8]

[0239]
[Table 9]

[0240]
Abbreviation
PLB, phospholamban; PLB [a. a. 1-36], 36a. a. N-terminal fragment; SR, sarcoplasmic reticulum; SERCA, muscle / cytoplasmic endoplasmic reticulum Ca²⁺-ATPase; SERCA 2. Muscle / cytoplasmic endoplasmic reticulum Ca²⁺-Cardiac isoform of ATPase; CD, circular dichroism; COSY, correlation spectroscopy; TOCSY, total correlation spectroscopy; NOESY, nuclear Overhausel enhancement spectroscopy;₃-TFE, perdeuterated trifluoroethanol; d₁₀-DTT, deuterated dithiothreitol
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the amino acid sequences of phospholamban from various species (human, pig, rabbit, rat, mouse, chicken).
FIG. 2 is an example of the NMR structure of cyclic peptide cP226.
FIG. 3 is an example of an NMR structure of PLBs (1 to 36).
FIG. 4 is an example of a model structure of a complex of PLB (1-36) and cyclic peptide cP226.
FIG. 5 is an illustration of the main interaction of cP226 with PLBs (1-36) in a model of a binary complex. Shows the distance between heavy atoms that has the necessary capacity for electrostatic bonding, H-bonding or hydrophobic interactions.
FIG. 6 is an example diagram showing PLB amino acid side chains forming a binding site for a ligand, divided into four interaction sites designated as S1 to S4.
FIG. 7 is a summary of the continuity and mid-NOE connectivity observed for PLBs (1-36).
FIG. 8 is an example of superposition of the compound of Example 1c on a PLB structure.
FIG. 9 shows the quality of the structure of PLBs (1-36) obtained from NOE data. The RMSD per residue and the number of restrictions per residue are shown.
FIG. 10 is a summary of the continuity of continuous and moderate NOEs observed for cP226.
FIG. 11 is an example of a group consisting of 12 structures of cP226 deduced from NMR data.
FIGS. 12A and 12B show Ca into the heart (A) and fast skeletal muscle (B) SR vesicles.²⁺4 shows the effect of the compound of Example 1c (50 and 100 μM) on the uptake rate.
FIG. 13 illustrates a three-dimensional pharmacophore of a PLB deactivator.
FIG. 14 demonstrates the suitability of the compound of Example 12 in the pharmacophore of a PLB inactivator.

Claims (42)

A method for identifying or designing a phospholamban inactivator, comprising:
(I) providing atomic coordinates defining a three-dimensional structure of a cytosolic domain of phospholamban or a ligand binding portion thereof;
(Ii) selecting candidate molecules that can adopt the three-dimensional structure to interact with the binding site of the three-dimensional structure or have good steric and electrostatic complementarity with the binding site of the three-dimensional structure; And (iii) identifying the selected candidate molecule as a potential phospholamban inactivator, then synthesizing the potential phospholamban inactivator and testing for its ability to function as a phospholamban inactivator. A method consisting of: 2. The method of claim 1, further comprising synthesizing said potential phospholamban inactivator, and testing the synthesized potential phospholamban inactivator for activation of CaATPase in the presence of phospholamban. 2. The method of claim 1, wherein the phospholamban cytosolic domain or a ligand binding portion thereof is in a conformation that permits binding of a phospholamban inactivator. The method of claim 1, wherein the atomic coordinates are provided in a computerized modeling system. The method of claim 1, wherein said atomic coordinates are those of Table III. The method of claim 1, wherein the binding site is selected from the group consisting of an S1 binding site, an S2 binding site, an S3 binding site, and an S4 binding site. A method for identifying a phospholamban inactivator, comprising:
(I) providing a first computer readable dataset defining a three-dimensional structure of a phospholamban cytosolic domain or its ligand binding site;
(Ii) combining the first computer readable dataset with a second computer readable dataset defining the structure of the candidate molecule;
(Iii) assessing the ability of the candidate molecule to interact with at least three binding sites of the phospholamban cytosol domain or its ligand binding portion, wherein the binding site is the S1 binding site of the phospholamban cytosol domain, the S2 binding A site, an S3 binding site and an S4 binding site,
(Iv) selecting a candidate molecule that suitably interacts with at least three binding sites of the phospholamban cytosolic domain or a ligand binding portion thereof; and (v) identifying the candidate molecule as a potential phospholamban inactivator. And then synthesizing the potential phospholamban inactivator and testing for its ability to function as a phospholamban inactivator. 8. The method of claim 7, further comprising synthesizing the potential phospholamban inactivator and testing the synthesized potential phospholamban inactivator for CaATPase activation in the presence of the phospholamban. 8. The method of claim 7, wherein step (ii) comprises employing a computer programmed with instructions to evaluate the ability of the candidate molecule to associate with the binding site of the phospholamban cytosolic domain or a ligand binding portion thereof. Step (iii) comprises:
(Iiiia) performing a matching operation between the candidate molecule and the binding site of the phospholamban cytosol domain or its ligand binding portion, and (iiib) analyzing the results of the matching operation to obtain the candidate molecule and the phospholamban cytosol. 8. The method of claim 7, comprising quantifying the connection between the domain or the binding site of the ligand binding portion thereof. Step (iii) comprises:
(Iiiia ') displaying the protein structure encoded by the combination of the first computer readable data set and the second computer readable data set in a graphical format; and (iiib') displaying the protein structure in a graphic format The method according to claim 7, comprising evaluating the ability of the candidate molecule to interact with the binding site of the phospholamban cytosolic domain or its ligand binding portion by visually examining the candidate molecule. A method for selecting a compound capable of binding to a phospholamban cytosol domain or a ligand binding site thereof from a database of chemical structures,
(I) providing atomic coordinates defining a three-dimensional structure of a phospholamban cytosolic domain or a ligand binding portion thereof;
(Ii) assessing the compatibility of one or more functional group interactions at at least three binding sites of the phospholamban cytosolic domain or a ligand binding portion thereof;
(Iii) from the database of chemical structures each compound has one or more functional groups evaluated in the previous step that have favorable interactions with at least three binding sites of the phospholamban cytosolic domain or its ligand binding portion. Selecting a first set of one or more compounds and (iv) from the first set of compounds optimal interaction with at least three binding sites of the three-dimensional structure of the phospholamban cytosol domain or its ligand binding portion. Selecting a second compound having a structure with good compatibility. 13. The method of claim 12, wherein said binding site of the phospholamban cytosol domain or a ligand binding portion thereof is selected from the group consisting of S1, S2, S3 and S4 binding sites of the phospholamban cytosol domain. . The method of claim 12, wherein the atomic coordinates are provided by a computerized modeling system. A method of designing a phospholamban inactivator, comprising: (i) providing, in a computerized modeling system, atomic coordinates defining a three-dimensional structure of a phospholamban cytosolic domain or a ligand binding portion thereof; ii) a method comprising using the atomic coordinates to design a candidate molecule of a phospholamban inactivator. further,
(I) synthesizing a candidate phospholamban inactivator molecule and (ii) testing the candidate phospholamban inactivator molecule or an analog derived therefrom for CaATPase activation in the presence of phospholamban. How to be. 16. The method of claim 15, wherein the phospholamban inactivator candidate molecule is designed using computer-aided molecular design techniques. The method according to claim 15, wherein the three-dimensional structure of the phospholamban cytosol domain or the ligand-binding portion thereof comprises the three-dimensional structure of the phospholamban cytosol domain or the ligand-binding portion thereof formed in a complex with a phospholamban inactivator. . 18. The method of claim 17, wherein the computer aided technology used to design the phospholamban inactivator candidate molecule is a novel design technology. Claims wherein the computer-aided technique used to design a candidate molecule of a phospholamban inactivator comprises computer-based selection of molecules having steric and electrostatic complementarity with a phospholamban cytosolic domain or a ligand binding portion thereof. Item 18. The method according to Item 17. 18. The method of claim 17, wherein the computer-aided technique used to design a candidate phospholamban inactivator molecule is computer-aided optimization of a lead molecule. Step (ii) comprises:
(Ii) selecting a target region on the surface of the phospholamban cytosolic domain or a ligand binding portion thereof that functions as a region for binding of a phospholamban inactivator candidate molecule;
(Iib) selecting one or more molecules or fragments capable of associating with the target region;
(Iic) using a computer software program to fit the three-dimensional structure of the molecule or fragment to the target region, and (id) using the results obtained from the computer software program to establish favorable steric or electrostatic interactions with the target region. 16. The method of claim 15, comprising identifying the molecule or fragment thereof. further,
(Ii) synthesizing a molecule or fragment thereof that has a favorable steric and electrostatic interaction with the target region of the phospholamban cytosolic domain or a ligand binding portion thereof, and (iif) dissociating the molecule or fragment thereof with phospholamban. 23. The method of claim 22, comprising testing for the ability to activate. 23. The method of claim 22, wherein the phospholamban inactivator peptide cP226 is used to design a phospholamban inactivator. 23. The method of claim 22, wherein the phospholamban inactivator peptide cP226 is used to define a target region. further,
(Ie ') one or more small molecules or fragments thereof having favorable steric or electrostatic interactions with the target region of the phospholamban cytosolic domain or ligand binding portion thereof to form a single larger molecule. Made,
23. The method of claim 22, comprising (iif ') testing said single larger molecule for its ability to inactivate phospholamban. Step (ii) comprises:
(Iiaaa) using an interactive molecular graphics system to fit the molecular scaffold to the target region of the phospholamban cytosolic domain or its ligand binding portion, and (iibb) adding a functional group or fragment thereof to the molecular scaffold 16. The method of claim 15, comprising creating a single, larger molecule that has a favorable steric or electrostatic interaction with the target region. further,
28. The method of claim 27, comprising (iic) synthesizing a single larger molecule and (idd) testing said single larger molecule for the ability to inactivate phospholamban. Computer readable storage of atomic coordinates of the structure of the phospholamban cytosol domain or its ligand binding portion in a conformation that allows binding of the phospholamban inactivator to the phospholamban cytosol domain or its ligand binding portion. Medium. 30. The computer readable medium of claim 29, wherein the molecular coordinates are atomic coordinates in Table III. Construction:

(Where X is Tyr or Ala)
A cyclic peptide having the formula: 32. The peptide according to claim 31, wherein X is Tyr. 32. The peptide of claim 31, wherein the cyclic peptide is in contact with the aqueous solution. 32. The peptide according to claim 31 for use as a phospholamban inactivator. A method for identifying a phospholamban inactivator, comprising:
(I) Cyclic peptide

(Where X is Tyr or Ala)
And (ii) using said three-dimensional structure as a model for designing a phospholamban inactivator. Step (ii) comprises:
(Ii) creating a three-dimensional model of the complex of the cyclic peptide bound to phospholamban; and (iib) inactivating one or more phospholambans using distance measurements and electrostatic properties derived from the model. 36. The method of claim 35, comprising the step of identifying the agent. The method of claim 35, wherein step (ii) comprises performing one or more molecular modeling techniques. A method for identifying a region on the surface of a phospholamban that may function as a target region to which a phospholamban inactivator may bind, comprising:
(I) Cyclic peptide

(Where X is Tyr or Ala)
And (ii) defining said region on the surface of phospholamban that can function as said target region using one or more molecular modeling techniques. 39. Step (ii) comprises determining one or more amino side chains of phospholamban in said region that interacts with said cyclic peptide and with said phospholamban inactivator. The described method. A method for identifying, designing or selecting a phospholamban inactivator according to any of claims 1, 7, 12, 15, or 35, wherein the identified, designed or selected phospholamban inactivator is ,Less than:
(A) a first electronegative moiety capable of associating with an S1 binding site consisting of Tyr-6, Arg-9 and / or Arg-13 when the inactivator binds to the PLB cytosolic domain;
(B) a second electronegative moiety that can associate with the S2 binding site consisting of Arg-14 when the inactivator binds to the PLB cytosolic domain;
(C) a first hydrophobic moiety capable of associating with the S3 binding site consisting of Met-20, Lys-27 and / or Leu-28 when the inactivator binds to the PLB cytosolic domain; A method comprising any three of a second hydrophobic moiety capable of associating with an S4 binding site consisting of Phe-32 and / or Phe-35 when the activator binds to the PLB cytosolic domain. The identified, designed or selected phospholamban inactivator includes:
(A) When the inactivating agent binds to the PLB cytosolic domain, the PLB cytosolic domain undergoes a hydrogen bond with the -OH group of Tyr-6, a salt bridge with the guanidinium group of Arg-9 and / or Arg-. A first electronegative moiety capable of forming a salt bridge with 13 guanidinium groups;
(B) a second electronegative moiety capable of forming a salt bridge with the guanidinium group of Arg-14 of the PLB cytosolic domain when the inactivating agent binds to the PLB cytosolic domain;
(C) When the inactivator binds to the PLB cytosolic domain, it is capable of associating with the hydrophobic pocket created by Met-20, Lys-27 and / or Leu-28 of the PLB cytosolic domain. And (d) when the inactivating agent binds to the PLB cytosolic domain, it can associate with the hydrophobic pocket created by Phe-32 and / or Phe-35 of the PLB cytosolic domain. 41. The method of claim 40, comprising any three of the sexual moieties. The identified, designed or selected phospholamban inactivator includes:
(A) When the inactivating agent binds to the PLB cytosolic domain, the PLB cytosolic domain undergoes a hydrogen bond with the -OH group of Tyr-6, a salt bridge with the guanidinium group of Arg-9 and / or Arg-. A first electronegative moiety capable of forming a salt bridge with 13 guanidinium groups;
(B) a second electronegative moiety capable of forming a salt bridge with the guanidinium group of Arg-14 of the PLB cytosolic domain when the inactivator binds to the PLB cytosolic domain; and (c) inactive The agent comprising a first hydrophobic moiety capable of associating with a hydrophobic pocket created by Met-20, Lys-27 and / or Leu-28 of the PLB cytosolic domain when the agent binds to the PLB cytosolic domain. Item 40. The method according to Item 40.

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