JP2004219346A - Kit for detecting virus antigen of dog diarrheal disease - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は犬のウイルス性下痢症の診断に関するものであり、犬の下痢症の原因ウイルスであるイヌコロナウイルス（以下、「ＣＣＶ」と記載することがある）、又はＣＣＶ並びにイヌパルボウイルス（以下、「ＣＰＶ」と記載することがある）の両者を高感度かつ特異的に、しかも簡便かつ迅速に検出することの出来る犬下痢症ウイルス抗原検出用キットおよび該キットを用いた犬ウイルス性下痢症の診断法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
【非特許文献１】Ｔｕｃｈｉｙａら（１９９１） Ｖｅｔ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２６： ４１−５１
【非特許文献２】Ｒｉｍｍｅｌｚｗａａｎら（１９９１） Ｖｅｔ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２６： ２５−４０
【非特許文献３】Ｐｒａｔｅｌｌｉら （１９９９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ８０： １１−５
【非特許文献４】Ｐｒａｔｅｌｌｉら （２０００）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ８４： ９１−４
【非特許文献５】Ｎａｙｌｏｒら （２００１） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３９： １０３６−４１
【０００３】
従来、ＣＣＶの検出法には、エライザ法を応用した方法（非特許文献１、非特許文献２）とＰＣＲ法（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）を応用した方法が知られているのみである。しかし、これらの方法は、特殊な機器を必要とし、手技が繁雑で結果の判定に熟練を要するなどの問題があり、犬の下痢症の迅速診断を必要とする臨床の場面には適当なものではない。また、ＣＰＶのみを迅速に検出する方法はすでに知られているが、該方法により陰性の結果を得た場合に、臨床症状が酷似するＣＣＶ感染症であるか否かの検査結果は依然として得られず、原因が不明のまま治療にあたらなければならない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
犬の下痢症の診断においては、臨床症状が酷似しており、治療が遅れた場合に致死となる可能性のある２大ウイルス性下痢症である、ＣＣＶ感染症とＣＰＶ感染症の治療方針を立て、かつ予防措置を講じるために迅速かつ簡便な診断キットが必要とされている。本発明は、特殊な機器及び熟練した技術を必要とせず臨床の場面での簡便かつ迅速な診断に使用可能な犬下痢症ウイルス抗原検出用キットである、ＣＣＶ感染症の診断キット及びＣＣＶ感染症とＣＰＶ感染症の鑑別診断キットの提供を目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記目的を達成するためになされたものであって、各方面から検討の結果、免疫学的手法であるサンドイッチ法を多孔質キャリア上で実施することによって上述した技術課題を解決するのにはじめて成功したものである。
【０００６】
すなわち、本発明による課題解決の第一の手段は、ＣＣＶ抗原を検出するキットの提供である。
【０００７】
すなわち、
（１）多孔質キャリアに、検体滴下部位、標識抗体含有部位、抗原検出部位及び反応終了判定部位とを順次形成してなり、（２）標識抗体含有部位には湿潤状態において多孔質キャリア上を抗原検出部位から反応終了判定部位へと順次移動し得るＣＣＶ抗原特異的標識抗体（以下、「標識抗体Ｉ」と記載することがある）を含有せしめ、抗原検出部位にはＣＣＶ抗原特異的抗体（以下、「抗体ＩＩ」と記載することがある）を固相化し、反応終了判定部位には標識抗体として使用した動物種の免疫グロブリンタンパク質特異的抗体（以下、「抗体ＩＩＩ」と記載することがある）を固相化し、（３）もって、検体を検体滴下部位に滴下することにより、検体を多孔質キャリア内で移動せしめて、標識抗体Ｉを溶出させ、抗体ＩＩを固相化した抗原検出部位及び抗体ＩＩＩを固相化した反応終了判定部位を通過せしめることにより、検体中の該ＣＣＶ抗原を検出すること、を特徴とする犬下痢症ウイルス抗原検出用キットを提供することにより、ＣＣＶ抗原の簡便かつ迅速な検出を可能にすることである。以下、該検出用キットの要件を詳述する。
【０００８】
該検出用キットは、ＣＣＶ抗原に対するサンドイッチアッセイを多孔質キャリア上で行う方法（イムノクロマト法）を測定原理として利用するものである。該キットでは、ＣＣＶの全てのタンパク質が検出抗原となり得るが、好ましくは該ウイルスのヌクレオカプシドタンパク質（以下、ＣＣＶ−Ｎと記載することがある）を検出抗原として本キットを作製した場合に、該キットの検出感度を最大限に発揮させることができる。しかし、本発明の該検出用キットの検出抗原は、ＣＣＶ−Ｎに限られるものではなく、該ウイルスのＳタンパク質、Ｍタンパク質など該ウイルスにコードされるタンパク質であれば、本キットの検出抗原となりうる。
【０００９】
該キットにおける標識抗体Ｉを作製する抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもＣＣＶ抗原に特異的であれば使用できる。該抗体として該ウイルスヌクレオカプシドタンパク質に特異的な抗体を使用することにより、該キットの感度を最大限に発揮させることができる。また、該標識抗体Ｉがモノクローナル抗体を標識して作製されることにより、該キットの特異性を高めることができる。すなわち、標識抗体Ｉの最も好ましい実施態様は、ＣＣＶ−Ｎに特異的なモノクローナル抗体を使用することであるが、本発明は、これに限定されるものではない。該標識抗体は、例えば、着色ラテックス粒子、磁気ビーズ等の合成高分子、ゼラチン等の天然高分子、又は金コロイド等の金属高分子等で標識し、イムノクロマト法に使用することが可能である。反応を直接、可視的に検出する場合には金コロイドによる標識をその最も好適な例としてあげることができるが、これに限定されるものではない。
【００１０】
また、ＣＣＶ抗原を検出する該キットにおいて、抗原検出部位に固相化する抗体（抗体ＩＩ）においてもポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもＣＣＶ抗原に特異的であれば使用できる。該ウイルスヌクレオカプシドタンパク質を被検出抗原として該タンパク質に特異的な標識抗体Ｉを使用したキットを作製する場合、抗体ＩＩも該タンパク質に対して特異的な抗体分画を含むポリクローナル抗体を固相化することにより、該キットの検出感度を最大限に発揮させることができ、該抗体の使用をその最も好適な例としてあげることができるが、本発明は、これに限られるものではない。
【００１１】
反応終了判定部位には標識抗体Ｉとして使用した動物種の免疫グロブリンタンパク質に特異的な抗体（抗体ＩＩＩ）を固相化するが、該抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでも使用できる。
【００１２】
これらの抗体を多孔質キャリアに順次含有せしめて、犬下痢症ウイルス抗原検出用キットを構成する。多孔質キャリアの材質としては、市販の濾紙、ナイロン、ニトロセルロース、ポリビニリデンジフルオライドやガラスファイバー濾紙などを使用できる。上記のほか、ポリプロピレン、ポリエチレン、フッ化ポリビニリデン、エチレン酢酸ビニル、アクリルニトリル、ポリテトラフルオロエチレンのような合成高分子を多孔質化した多孔質プラスチックも使用することができる。
【００１３】
本キットの使用により、特殊な技術、装置及び施設を必要とせず、簡便かつ迅速にＣＣＶ感染症を診断することが可能となる。
【００１４】
さらに本発明による課題解決の第二の手段は、ＣＣＶ及びＣＰＶ抗原を同時に検出するキットの提供である。本キットの使用により、犬の主要なウイルス性下痢症の原因であるであるＣＣＶ及びＣＰＶの抗原検出を、一回の操作で行うことが出来、両感染症の鑑別診断が可能となり、より容易に、検査結果を得ることができる。本キットは、本発明の第一の手段で詳述した犬下痢症ウイルス抗原検出用キットを発展させたキットであり、同一検出用キット上で両ウイルス抗原を検出することが可能であることを見出し、本発明の第二の検出用キットを完成させるに至った。
【００１５】
すなわち、（１）多孔質キャリアに、検体滴下部位、標識抗体含有部位、抗原検出部位及び反応終了判定部位とを順次形成してなり、（２）標識抗体含有部位には湿潤状態において多孔質キャリア上を抗原検出部位から反応終了判定部位へと順次移動し得る、ＣＣＶ抗原特異的標識抗体（標識抗体Ｉ）及びＣＰＶ抗原特異的標識抗体（以下、「標識抗体ＩＶ」と記載することがある）を含有せしめ、抗原検出部位にはＣＣＶ抗原特異的抗体（抗体ＩＩ）及びＣＰＶ抗原特異的抗体（以下、「抗体Ｖ」と記載することがある）を固相化し、反応終了判定部位には、標識抗体として使用した動物種の免疫グロブリンタンパク質特異的抗体（抗体ＩＩＩ）を固相化し、（３）もって、検体を検体滴下部位に滴下することにより、検体を多孔質キャリア内で移動せしめて、標識抗体Ｉ及びＩＶを溶出させ、抗体ＩＩ及びＶを固相化した抗原検出部位及び抗体ＩＩＩを固相化した反応終了判定部位を通過せしめることにより、検体中の該ＣＣＶ抗原及び該ＣＰＶ抗原を検出すること、を特徴とする犬下痢症ウイルス抗原検出用キットを提供することにより、同一検体から両抗原を、迅速、簡便、かつ同時に検出することを可能にするものである。以下、該検出用キットの要件を詳述する。
【００１６】
該キットのＣＣＶ抗原検出のための要件については、イヌコロナウイルス抗原のみを検出するキットの項で詳述した事項が本キットにも当てはまる。
【００１７】
該キットのＣＰＶ抗原検出のための要件において、用いる標識抗体ＩＶは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもＣＰＶ抗原に特異的であれば使用できる。該ウイルス粒子表面タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を標識して使用することにより、該キットの特異性を最大限に発揮させることができ、該モノクローナル抗体の使用をその最も好適な例としてあげることができるが、これに限定されるものではない。該標識抗体ＩＶは、例えば、着色ラテックス粒子、磁気ビーズ等の合成高分子、ゼラチン等の天然高分子、又は金コロイドなどの金属高分子で標識し、イムノクロマト法に使用することが可能である。反応を直接、可視的に検出する場合には金コロイドによる標識をその最も好適な例としてあげることができるが、これに限定されるものではない。
【００１８】
また、抗原検出部位に固相化する抗体（抗体Ｖ）はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもＣＰＶ抗原に特異的であれば使用できる。該ウイルス粒子表面タンパク質を検出抗原とし、該抗原に対して特異的な抗体分画を含むポリクローナル抗体を固相化することにより、該キットの検出感度を最大限に発揮させることができ、該抗体の使用をその最も好適な例としてあげることができるが、これに限定されるものではない。
【００１９】
反応終了判定部位には標識抗体として使用した動物種の免疫グロブリンタンパク質に特異的な抗体（抗体ＩＩＩ）を固相化するが、該抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでも使用できる。
【００２０】
これらの抗体を多孔質キャリアに順次含有せしめて、犬下痢症ウイルス抗原検出用キットを構成する。該キットの多孔質キャリアの要件については、犬コロナウイルス抗原のみを検出するキットの項で詳述した事項が本キットにも当てはまる。
【００２１】
本キットの使用により、一回の操作でＣＣＶ感染症とＣＰＶ感染症を迅速に診断することが可能となる。なお、当業者にとって、同様の構成により検出用キットに新たに、イヌロタウイルス等の検出部位を加えていくことは容易なことである。
【００２２】
【発明の実施の形態】
請求項１に係る本発明は、「犬下痢症ウイルス抗原を検出するキットであり、（１）多孔質キャリアに、検体滴下部位、標識抗体含有部位、抗原検出部位及び反応終了判定部位とを順次形成してなり、（２）標識抗体含有部位には湿潤状態において多孔質キャリア上を抗原検出部位から反応終了判定部位へと順次移動し得る該ＣＣＶ抗原特異的標識抗体（標識抗体Ｉ）を含有せしめ、抗原検出部位には該ＣＣＶ抗原特異的抗体（抗体ＩＩ）を固相化し、反応終了判定部位には標識抗体として使用した動物種の免疫グロブリンタンパク質特異的抗体（抗体ＩＩＩ）を固相化し、（３）もって、検体を検体滴下部位に滴下することにより、検体を多孔質キャリア内で移動せしめて、標識抗体Ｉを溶出させ、抗体ＩＩを固相化した抗原検出部位及び抗体ＩＩＩを固相化した反応終了判定部位を通過せしめることにより、検体中の該ＣＣＶ抗原を検出すること、を特徴とする犬下痢症ウイルス抗原検出用キット」としたものであり、本キットの使用によりＣＣＶ感染症を、特殊な技術、装置及び施設を必要とせずしかも、簡便かつ迅速に診断できるという作用を有する。
【００２３】
本キットを作製するにあたって必要とされるＣＣＶポリクローナル抗体はＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ （１９８８， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ編）に記載される方法に従って精製ＣＣＶをウサギ、ヤギなどの各種動物に免疫することにより得ることができる。精製ＣＣＶはＭａｋｉｎｏらの方法（Ｍａｋｉｎｏら（１９８３）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２７：４４５−４５４、Ｍａｋｉｎｏら（１９８４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １３３：９−１７）により、例えばＣＣＶ１−７１株感染ＣＲＦＫ細胞の培養上清からショ糖密度勾配遠心法を用いて調製することができる。あるいは、ヌクレオカプシドタンパク質に対する抗体のみを得る目的で、同タンパク質をバキュロウイルスあるいは大腸菌などを用いた発現系で大量に発現させ、これを抗原としてポリクローナル抗体を得ることも可能である。
【００２４】
また、同ウイルスに対するモノクローナル抗体についても、精製ＣＣＶをマウスに免疫した後、同じくＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ （１９８８， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ編）に記載される方法に従い、ＣＣＶ抗原タンパク質に対する抗体を産生するハイブリドーマをクローニングすることにより得ることができる。得られたモノクローナル抗体の特異性については、エライザ法、ウェスタンブロッティング法や、ウイルスゲノムにコードされた各タンパク質の発現産物に対する反応性を調べることにより決定することができる。
【００２５】
得られた抗体の標識に使用する担体粒子は着色ラテックス粒子、磁気ビーズ等の合成高分子、ゼラチン等の天然高分子、又は金コロイド等の金属高分子を好適なものとして例示することができる。担体粒子は、肉眼での判定を行う場合には着色されていることが望ましく、この点で、金属高分子のコロイド粒子や着色ラテックス粒子は、色調を有するため有利である。抗体の標識法については、標識物である担体粒子を製造するメーカーがおのおの提供するマニュアルに沿って標識することができ、当業者にとっては自明の技術である。担体粒子により標識された抗体は、コロイド化学的安定性の向上、又は膜及び検体との非特異的な結合を防止する目的で、０．０５％から５％程度のＢＳＡ等を含有した緩衝液中に懸濁して保管することが望ましい。
【００２６】
これら抗体を、多孔質キャリア上に例えば図１に示すごとく配置して、本キットを作製する。すなわち、多孔質キャリアの標識抗体含有部位にはＣＣＶ抗原特異的標識抗体Ｉを含有せしめ、抗原検出部位にはＣＣＶ抗原特異的抗体（抗体ＩＩ）を固相化し、反応終了判定部位には標識抗体として使用した動物種の免疫グロブリンタンパク質特異的抗体（抗体ＩＩＩ）を固相化し、膜を短冊状（例えば、幅５〜２０ｍｍ、長さ約５０ｍｍ程度）に裁断し、裁断した膜を同一の大きさの支持体（例えば、プラスチック等）に固定する。裁断した短冊の反応終了判定部位側の片端に適当な大きさの吸収材を配置すると、検体の展開を容易にする機能を有しており、有利である。さらに検体滴下部位を配置して本キットを構成する。なお、本キットにおいては標識抗体含有部位と検体滴下部位は、同一であってもかまわない。支持体への各部材の固定には、接着剤、粘着テープ等を用いることができる。
【００２７】
多孔質キャリアの材質としては、市販の濾紙、ナイロン、ニトロセルロース、ポリビニリデンジフルオライドやガラスファイバー濾紙などの天然又は合成高分子のいずれも使用できる。また、ＣＣＶ抗原特異的抗体（抗体ＩＩ）の膜への固定方法としては、物理吸着法、化学結合（共有結合）法、その他いずれの方法も使用することができる。即ち、ＣＣＶ抗体が膜より脱離しなければどのような材質を用いることも可能である。抗体ＩＩ固定膜は、検体又は標識抗体Ｉとの非特異的な吸着を防止するために、０．０５から５％程度のＢＳＡ等でブロッキング処理を行い、乾燥条件下で保存することが望ましい。
【００２８】
使用にあたっては、被検動物である犬から採取した糞便を緩衝液に懸濁し、この適当量を、本キットの検体滴下部位に滴下する。滴下された検体は標識抗体Ｉを含有する部位に到達し、検体中にＣＣＶ抗原が存在する場合、これと標識抗体Ｉとの免疫複合体が形成される。該免疫複合体は毛細管現象により緩衝液とともに濾紙等の多孔質キャリア上に展開され、抗体ＩＩが固相化された抗原検出部位に到達し、該免疫複合体の大部分は該部位で抗体ＩＩに捕捉される。もし、検体中にＣＣＶ抗原が存在しない場合は、フリーの標識抗体Ｉとしてこの部位に捕捉されず通過する。一部の免疫複合体あるいはフリーの標識抗体Ｉは抗原検出部位を通り抜け、反応終了判定部位に到達し、免疫複合体の形成の有無にかかわらず、標識抗体Ｉが捕捉されて蓄積し、試験終了の反応が現れる。本キットにおいては検体滴下後、１０〜１５分間室温に静置することによりこの反応が現れる。この反応は、金コロイド標識抗体を用いた場合は、赤紫色の発色として出現する。反応終了判定部位に反応が現れた時点で、抗原検出部位に発色反応が現れた場合はＣＣＶ抗原陽性、現れない場合は陰性と判定し、ＣＣＶ抗原陽性の場合、被検動物（犬）はＣＣＶ感染症と診断される。
【００２９】
更に、該抗原検出用キットにおいて、図１に示したＣＣＶ抗原特異的標識抗体Ｉを含有せしめた標識抗体含有部位は、これを除いて本キットを構築することも可能である。このような形態のキットにおいては、標識抗体Ｉと緩衝液に懸濁した検体とをあらかじめ試験管内で混合した後に検体滴下部位に該混合液を滴下し、上記と同様に反応を待ち、抗原の有無を判定することができる。
【００３０】
本発明の請求項２に記載の発明は、「犬下痢症ウイルス抗原を検出するキットであり、（１）多孔質キャリアに、検体滴下部位、標識抗体含有部位、抗原検出部位及び反応終了判定部位とを順次形成してなり、（２）標識抗体含有部位には湿潤状態において多孔質キャリア上を抗原検出部位から反応終了判定部位へと順次移動し得る、ＣＣＶ抗原特異的標識抗体（標識抗体Ｉ）及びＣＰＶ抗原特異的標識抗体（標識抗体ＩＶ）を含有せしめ、抗原検出部位にはＣＣＶ抗原特異的抗体（抗体ＩＩ）及びＣＰＶ抗原特異的抗体（抗体Ｖ）を固相化し、反応終了判定部位には、標識抗体として使用した動物種の免疫グロブリンタンパク質特異的抗体（抗体ＩＩＩ）を固相化し、（３）もって、検体を検体滴下部位に滴下することにより、検体を多孔質キャリア内で移動せしめて、標識抗体Ｉ及びＩＶを溶出させ、抗体ＩＩ及びＶを固相化した抗原検出部位及び抗体ＩＩＩを固相化した反応終了判定部位を通過せしめることにより、検体中の該ＣＣＶ抗原及び該ＣＰＶ抗原を検出すること、を特徴とする犬下痢症ウイルス抗原検出用キット」としたものであり、本キットの使用によりＣＣＶ感染症及びＣＰＶ感染症を、特殊な機器及び熟練した技術を必要とせず、しかも簡便かつ迅速に診断できるという作用を有する。
【００３１】
本キットにおいて必要とされるＣＣＶ抗原検出のための抗体は、イヌコロナウイルス抗原のみを検出するキットを組み立てるために作製される抗体を使用することができる。
【００３２】
本キットを作製するにあたって、さらに必要とされるＣＰＶポリクローナル抗体はＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ （１９８８， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ編）に記載される方法に従って精製ＣＰＶをウサギ、ヤギなどの各種動物に免疫することにより得ることができる。精製ＣＰＶは例えば、ＣＰＶＣｐ−４９株感染ＣＲＦＫ細胞の培養上清から塩化セシウム密度勾配遠心法を用いて調製することができる。
【００３３】
また、同ウイルスに対するモノクローナル抗体についても、精製ＣＰＶをマウスに免疫した後、同じくＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ （１９８８， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ編）に記載される方法に従い、ＣＰＶ抗原タンパク質に対する抗体を産生するハイブリドーマをクローニングすることにより得ることができる。得られたモノクローナル抗体の特異性については、エライザ法やウェスタンブロッティング法、ウイルスゲノムにコードされた各タンパク質の発現産物に対する反応性、あるいはウイルス中和活性や赤血球凝集抑制活性により決定することができる。
【００３４】
抗体の標識については、ＣＣＶ抗原のみを検出するキットの作製法の項で詳述した方法を準用することができる。
【００３５】
これら抗体を、多孔質キャリア上に例えば図２に示すごとく配置して、本キットを作製する。すなわち、多孔質キャリアの標識抗体含有部位にはＣＣＶ抗原特異的標識抗体Ｉ及びＣＰＶ抗原特異的標識抗体ＩＶの両者を含有せしめ、抗原検出部位には、ＣＣＶ抗原特異的抗体（抗体ＩＩ）及びＣＰＶ抗原特異的抗体（抗体Ｖ）を固相化し、反応終了判定部位には標識抗体として使用した動物種の免疫グロブリンタンパク質特異的抗体（抗体ＩＩＩ）を固相化し、膜を短冊状（例えば、幅５〜２０ｍｍ、長さ約５０ｍｍ程度）に裁断し、裁断した膜を同一の大きさの支持体（例えば、プラスチック等）に固定する。裁断した短冊の反応終了判定部位側の片端に適当な大きさの吸収材を配置すると、検体の展開を容易にする機能を有しており、有利である。さらに検体滴下部位を配置して本キットを構成する。なお、本キットにおいては標識抗体含有部位と検体滴下部位は、同一であってもかまわない。支持体への各部材の固定には、接着剤、粘着テープ等を用いることができる。
【００３６】
本キットにおけるそれぞれの標識抗体は同一の物質、例えば金コロイドあるいは着色ラテックス粒子などで標識してもよく、両者を異なった標識物質、例えば一方を金コロイド、他方を着色ラテックス粒子で標識してもよい。抗原検出部位の２つの抗体（抗体ＩＩ及び抗体Ｖ）は、これらを該部位内で位置をずらして、あるいはさらに固相化の形状に違い（例えば、線状と点状）を持たせてそれぞれ固相化することにより、ＣＣＶ抗原検出部位とＣＰＶ抗原検出部位を区別させ抗原検出部位における発色等の反応の位置あるいは形状の違いから検体にはどちらの抗原を含んでいるか、あるいは両方の抗原を含んでいるか否かを容易に判定でき、有利である。ＣＣＶ抗原特異的標識抗体ＩとＣＰＶ抗原特異的標識抗体ＩＶとして使用した免疫グロブリンタンパク質の動物種が異なる場合は、いずれか一方の動物種の免疫グロブリンタンパク質特異的抗体（抗体ＩＩＩ）を反応終了判定部位に固相化することにより、該部位を形成することができるが、両動物種の免疫グロブリンタンパク質特異的抗体（抗体ＩＩＩ）を該部位に固相化してもよい。
【００３７】
多孔質キャリアの材質としては、市販の濾紙、ナイロン、ニトロセルロース、ポリビニリデンジフルオライドやガラスファイバー濾紙などの天然又は合成高分子のいずれも使用できる。また、ＣＣＶ抗体ＩＩの膜への固定方法としては、物理吸着法、化学結合（共有結合）法、その他いずれの方法も使用することができる。即ち、ＣＣＶ抗体が膜より脱離しなければどのような材質を用いることも可能である。ＣＣＶ抗体固定膜は、検体又は標識抗体Ｉとの非特異的な吸着を防止するために、０．０５から５％程度のＢＳＡ等でブロッキング処理を行い、乾燥条件下で保存することが望ましい。
【００３８】
抗原検出法は、ＣＣＶ抗原検出用キットの方法と同様であり、本キットの特徴はＣＣＶ抗原とＣＰＶ抗原検出を同一のキット上で行うところにある。本発明のキットを使用することにより、一回の操作で両抗原の存在の有無を判定することが可能となる。
【００３９】
使用にあたっては、検体を緩衝液に懸濁して本キットの検体滴下部位に滴下し、１０〜１５分間室温に静置することにより反応終了判定部位に反応が現れるのを待つ。この反応は、金コロイド標識抗体を用いた場合は、赤紫色の発色として出現する。反応終了判定部位に反応が現れた時点で、抗原検出部位のＣＣＶ抗原検出部位に同様の反応が現れた場合はＣＣＶ抗原陽性、ＣＰＶ抗原検出部位に同様の反応が現れた場合はＣＰＶ抗原陽性、両検出部位に同様の反応が現れた場合はＣＣＶ抗原およびＣＰＶ抗原陽性、両検出部位に反応が現れない場合はＣＣＶ抗原およびＣＰＶ抗原陰性と判定する。診断にあたっては、被検動物は抗原陽性であったウイルスの感染症と判定される。
【００４０】
更に、該抗原検出用キットにおいて、図２に示したＣＣＶ抗原特異的標識抗体Ｉ及びＣＰＶ抗原特異的標識抗体ＩＶを含有せしめた標識抗体含有部位は、これを除いて本キットを構築することも可能である。このような形態のキットにおいては、標識抗体Ｉ及びＩＶと緩衝液に懸濁した検体とをあらかじめ試験管内で混合した後に検体滴下部位に該混合液を滴下し、上記と同様に反応を待ち、抗原の有無を判定することができる。
【００４１】
【実施例】
以下、本発明の犬下痢症ウイルス抗原検出用キットが実際に非常に有用であることを下記の調製例及び実施例に沿ってさらに詳細に説明するが、本発明は、以下の調製例及び実施例によりなんら限定されるものではない。調製例では、本発明の抗原検出用キットを作製するために必要な各抗体の作製例を、そして実施例では、これら抗体を用いた抗原検出用キットの作製例ならびにその応用例を示す。
【００４２】
調製例１：抗ＣＣＶポリクローナル抗体の調製
免疫原であるＣＣＶは以下のように調製した。すなわち、ＣＣＶ １−７１株感染ＣＲＦＫ細胞の培養上清に２．２％の塩化ナトリウム及び６．５％のポリエチレングリコール＃６０００を添加した後遠心分離により析出物を回収することにより粗精製ＣＣＶを得、更にこれから不連続ショ糖密度勾配遠心法により３０％（Ｗ／Ｗ）ショ糖と６０％（Ｗ／Ｗ）ショ糖との間に集積する精製ＣＣＶ分画を調製した。ウサギ１羽あたり、１００μｇの精製ＣＣＶをＦｒｅｕｎｄの完全アジュバントとともに皮下に接種し、更に３週間隔で２回、Ｆｒｅｕｎｄの不完全アジュバントとともに皮下に追加接種した。その後３週間以上の間隔をあけてウサギ静脈内に精製ＣＣＶを接種し、接種後１０日以内にウサギ血清を抗ＣＣＶポリクローナル抗体として得た。得られた血清からプロテインＧカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー（アマシャムファルマシア社製）により抗ＣＣＶ抗体含有分画を精製した。
【００４３】
調製例２：抗ＣＣＶ−Ｎモノクローナル抗体の調製
マウス１匹あたり、調製例１において調製した１００μｇの精製ＣＣＶをＦｒｅｕｎｄの完全アジュバントとともに皮下に接種し、更に３週間隔で２回、Ｆｒｅｕｎｄの不完全アジュバントとともに皮下に追加接種した。その後３週間以上の間隔をあけてマウス腹腔内に精製ＣＣＶを接種し、３日後に脾臓を摘出した。その脾細胞をマウスミエローマ細胞と融合させ、スクリーニング及びクローニングにより抗ＣＣＶ−Ｎ抗体産生ハイブリドーマを得た。この抗ＣＣＶ−Ｎ抗体産生ハイブリドーマを、プリスタン（シグマ社製）投与後１０日目のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に移入し、約１０日後に腹水を採取した。得られた腹水からプロテインＧカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー（アマシャムファルマシア社製）により抗ＣＣＶ−Ｎモノクローナル抗体を精製した。
【００４４】
調製例３：抗マウスイムノグロブリンポリクローナル抗体の調製
ウサギ１羽あたり、１００μｇの市販のマウスイムノグロブリンＧ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社）をＦｒｅｕｎｄの完全アジュバントとともに皮下に接種し、更に３週間隔で２回、Ｆｒｅｕｎｄの不完全アジュバントとともに皮下に追加接種した。その後３週間以上の間隔をあけてウサギ静脈内にマウスイムノグロブリンＧを接種し、接種後１０日以内にウサギ血清を抗マウスイムノグロブリンポリクローナル抗体として得た。得られた血清からプロテインＧを用いたアフィニティークロマトグラフィー（アマシャムファルマシア社製）により抗マウスイムノグロブリン抗体含有分画を精製した。
【００４５】
調製例４：抗ＣＰＶポリクローナル抗体の調製
免疫原であるＣＰＶは以下のように調製した。すなわち、ＣＰＶ Ｃｐ−４９株感染ＣＲＦＫ細胞の培養上清に２．２％の塩化ナトリウム及び６．５％のポリエチレングリコール＃６０００を添加した後遠心分離により析出物を回収することにより粗精製ＣＰＶを得、更にこれから塩化セシウム密度勾配遠心法により精製ＣＰＶ分画を調製した。ウサギ１羽あたり、１００μｇの精製ＣＰＶをＦｒｅｕｎｄの完全アジュバントとともに皮下に接種し、更に３週間隔で２回、Ｆｒｅｕｎｄの不完全アジュバントとともに皮下に追加接種した。その後３週間以上の間隔をあけてウサギ静脈内に精製ＣＰＶを接種し、接種後１０日以内にウサギ血清を抗ＣＰＶポリクローナル抗体として得た。得られた血清からプロテインＧカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー（アマシャムファルマシア社製）により抗ＣＰＶ抗体含有分画を精製した。
【００４６】
調製例５：抗ＣＰＶモノクローナル抗体の調製
マウス１匹あたり、調製例４において調製した１００μｇの精製ＣＰＶをＦｒｅｕｎｄの完全アジュバントとともに皮下に接種し、更に３週間隔で２回、Ｆｒｅｕｎｄの不完全アジュバントとともに皮下に追加接種した。その後３週間以上の間隔をあけてマウス腹腔内に精製ＣＰＶを接種し、３日後に脾臓を摘出した。その脾細胞をマウスミエローマ細胞と融合させ、スクリーニング及びクローニングにより抗ＣＰＶ抗体産生ハイブリドーマを得た。この抗ＣＰＶ抗体産生ハイブリドーマを、プリスタン（シグマ社製）投与後１０日目のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に移入し、約１０日後に腹水を採取した。得られた腹水からプロテインＧカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー（アマシャムファルマシア社製）により抗ＣＰＶマウスモノクローナル抗体を精製した。
【００４７】
（実施例１）
本実施例はＣＣＶ抗原を検出するキットの作製及び該キットを用いたＣＣＶ抗原の検出を示す。
【００４８】
１）ＣＣＶ抗原検出用キットの作製
図１に示す抗原検出用キットを以下のように作製した。すなわち、図１の抗体ＩＩとして調製例１で調製した抗ＣＣＶ−Ｎウサギポリクローナル抗体を、抗体ＩＩＩとして調製例３で調製した抗マウスイムノグロブリンポリクローナル抗体を使用した。該抗体をＰＢＳ緩衝液により希釈し、抗体塗布キット（バイオドット社製）を用いて市販のニトロセルロースメンブレン（ミリポア社製）に図１に示すごとく線状に塗布した。十分に乾燥した後、非特異的な吸着を防止するため、１％のＢＳＡを添加したＰＢＳ緩衝液によりブロッキング処理を行い、十分に乾燥させて抗体固定膜を作製した。図１の標識抗体Ｉとして調製例２で調製した抗ＣＣＶ−Ｎモノクローナル抗体を以下のように標識し、使用した。すなわち、ｐＨ９．０に調製した精製ＣＣＶ−Ｎマウスモノクローナル抗体（０．１ｍｇ／ｍＬ）５０μｌを、粒子径４０ｎｍの金コロイド（ブリティッシュ・バイオセル社製）１ｍＬに添加し、常温で５分間撹拌し、次いでｐＨ９．０に調整した１０％ＢＳＡ及び１％ＰＥＧを含む水溶液を１００μｌ添加し、さらに常温で１０分間撹拌した。次いで、遠心分離（４℃、１０，０００ｇ、１５分間）により抗ＣＣＶ−Ｎマウスモノクローナル抗体蛋白質固定金コロイド粒子を集め、１００μｌの１％ＢＳＡ及び０．１％アジ化ナトリウムを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）に再懸濁し、ＣＣＶ−Ｎに特異的に結合する金コロイド粒子標識抗体懸濁液を得、ガラス繊維製の吸収膜（ミリポア社製）に固定した。前記抗体固定膜と金コロイド標識抗体Ｉを含むガラス繊維性吸収膜を、図１のごとく幅約５ｍｍ、長さ約５０ｍｍの短冊状に成型した。反応終了判定部位側の片端に、滴下した検体を容易に展開させる目的で、グラスファイバー製吸収材（ミリポア社製）を接着し、抗原検出用キットを完成させた。
【００４９】
２）被検試料
（１）試料番号１〜７：ＣＣＶ実験感染個体から経時的に採取した糞便
（２）試料番号８〜１１：下痢症を呈した個体から採取した糞便
（３）試料番号１２：検体希釈液
【００５０】
３）被検試料からのＲＴ−ＰＣＲ法によるＣＣＶゲノムＲＮＡの検出
被検糞便を１０（Ｗ／Ｖ）％になるようにＰＢＳ緩衝液に溶解し、遠心して得た上清からゲノムＲＮＡを抽出する。ＣＣＶゲノムＲＮＡは、糞便溶解液上清をプロテイナーゼＫ及びソジウムドデシル硫酸存在下で加温処理し、これをフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール溶液（２５：２４：１）により抽出し、取得することができる。
【００５１】
回収されたゲノムＲＮＡを鋳型とし、また、現在までに公知となっている塩基配列［ジャーナル・オブ・ジェネラル・ヴィロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、第７３巻、第２８４９ページ、１９９２年］を参考にして、２本の合成ＤＮＡプライマー５’−ＧＡＡＣＴＧＧＡＣＣＴＣＡＴＧＣＴＧＡＴ−３’（配列番号１）及び５’−ＣＡＴＴＣＴＴＡＧＧＴＧＴＡＧＴＡＴＣＴＣＴ−３’（配列番号２）を作製し、ＲＴ−ＰＣＲ法によりＣＣＶゲノムＲＮＡの検出を行った。
【００５２】
４）試験結果
この試験の結果は表１に示す通りである。表１から明らかな通り、ＣＣＶ実験感染個体から採取した糞便においては、接種後２日目から６日目までＲＴ−ＰＣＲ法によりＣＣＶゲノムが検出された。これら試料においては、本発明のＣＣＶ抗原を検出する犬下痢症ウイルス抗原検出用キットにより該抗原が検出された。下痢症を呈した個体から採取した糞便においては、ＲＴ−ＰＣＲ法によりＣＣＶゲノムＲＮＡが検出された試料番号８、９で本発明の抗原検出用キットにより該抗原が検出され、ＣＣＶゲノムが検出されない試料番号１０、１１ではＣＣＶ抗原も検出されなかった。
【００５３】
ＲＴ−ＰＣＲ法は感度の高いウイルス検出法とされているが、該方法によるＣＣＶゲノムの検出には検体の調製から結果がでるまでにほぼ１日を要するとともに、ＰＣＲ反応キットを必要とし、かつ熟練した技術が必要であることに比較し、本発明の犬下痢症ウイルス抗原検出用キットを用いた場合は、特殊な装置や熟練した技術を必要とせずに全工程をわずか２０分以内に完了した。以上の試験結果から、本発明のキットは、ＣＣＶ抗原を高感度に検出し、これによりＣＣＶ感染症を的確に診断することが可能となり、しかも簡便かつ迅速に結果を得ることが出来たことから、本発明の抗原検出用キットは、従来にない優れたＣＣＶ抗原検出用キットであることが判明した。
【００５４】
【表１】
（実施例２）
本実施例はＣＣＶ抗原及びＣＰＶ抗原を検出するキットの作製及び該キットを用いたＣＣＶ抗原並びにＣＰＶ抗原の検出を示す。
【００５６】
１）ＣＣＶ抗原及びＣＰＶ抗原検出用キットの作製
図２に示す抗原検出用キットを以下のように作製した。図２の標識抗体Ｉ、抗体ＩＩ、及び抗体ＩＩＩは実施例１で使用した標識抗体あるいは抗体を準用した。標識抗体ＩＶとしては調製例５で調製した抗ＣＰＶモノクローナル抗体を、抗体Ｖとしては調製例４で調製した抗ＣＰＶポリクローナル抗体を使用した。抗体ＩＩ、抗体ＩＩＩ、及び抗体Ｖを図２に示すごとく実施例１と同様の方法でニトロセルロースメンブレンに線状に塗布し、抗体固定膜を作製した。標識抗体ＩＶは、標識抗体Ｉと同様に作製し、同一ガラス繊維製の吸収膜に固定した。前記抗体固定膜と金コロイド標識抗体Ｉを含むガラス繊維性吸収膜を、図２のごとく幅約５ｍｍ、長さ約５０ｍｍの短冊状に成型した。反応終了判定部位側の片端に、滴下した検体を容易に展開させる目的で、グラスファイバー製吸収材（ミリポア社製）を接着し、抗原検出用キットを完成させた。
【００５７】
２）被検試料
（１）試料番号１〜７：ＣＣＶ実験感染個体から経時的に採取した糞便
（２）試料番号８〜１４：ＣＰＶ実験感染個体から経時的に採取した糞便
（３）試料番号１５〜１８：下痢症を呈した個体から採取した糞便
（４）試料番号１９： 検体希釈液
【００５８】
３）被検試料からのＲＴ−ＰＣＲ法によるＣＣＶゲノムＲＮＡの検出
実施例１と同様に行った。
【００５９】
４）被検試料からのＰＣＲ法によるＣＰＶゲノムＤＮＡの検出
被検糞便を１０（Ｗ／Ｖ）％になるようにＰＢＳ緩衝液に溶解し、遠心して得た上清からゲノムＤＮＡを抽出する。ＣＰＶゲノムＤＮＡは、糞便溶解液上清をプロテイナーゼＫ及びソジウムドデシル硫酸存在下で加温処理し、これをフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール溶液（２５：２４：１）により抽出し、取得することができる。
【００６０】
回収されたゲノムＤＮＡを鋳型とし、また、現在までに公知となっている塩基配列［ヴィロロジー・（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、第１４８巻、第１２１ページ、１９８６年］を参考にして、２本の合成ＤＮＡプライマー５’− ＴＧＣＣＡＴＴＴＡＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣ−３’（配列番号３）及び５’− ＣＡＴＴＴＧＡＧＴＴＡＣＡＣＣＡＣＧＴＣＴ −３’（配列番号４）を作製し、ＰＣＲ法によりＣＰＶゲノムＲＮＡの検出を行った。
【００６１】
５）試験結果
この試験の結果は表２に示す通りである。表２から明らかな通り、ＣＣＶ実験感染個体から採取した糞便においては、接種後２日目から６日目までＲＴ−ＰＣＲ法によりＣＣＶゲノムが検出された。これら試料においては、本発明のＣＣＶ及びＣＰＶ抗原を検出する犬下痢症ウイルス抗原検出用キットによりＣＣＶ抗原が検出され、ＣＰＶ抗原は陰性であった。下痢症を呈した個体から採取した糞便においては、ＲＴ−ＰＣＲ法によりＣＣＶゲノムＲＮＡが検出された試料番号１５、１６で本発明の抗原検出用キットによりＣＣＶ抗原が検出され、ＣＣＶゲノムが検出されない試料番号１７、１８ではＣＣＶ抗原も検出されなかった。また、ＣＰＶ実験感染個体から採取した糞便においては、接種後２日目から６日目までＰＣＲ法によりＣＰＶゲノムが検出された。これら試料においては、本発明のＣＣＶ及びＣＰＶ抗原検出用キットによりＣＰＶ抗原が検出され、ＣＣＶ抗原は陰性であった。下痢症を呈した個体から採取した糞便においては、ＰＣＲ法によりＣＰＶゲノムＤＮＡが検出された試料番号１７で本発明の抗原検出用キットによりＣＰＶ抗原が検出され、ＣＰＶゲノムが検出されない試料番号１５、１６、１８ではＣＰＶ抗原も検出されなかった。
【００６２】
ＲＴ−ＰＣＲ法及びＰＣＲ法は、感度の高いウイルス検出法とされているが、該方法によるウイルスゲノムの検出には検体の調製から結果がでるまでにほぼ１日を要するとともに、ＰＣＲ反応装置を必要とし、かつ熟練した技術が必要であることに比較し、本発明の抗原検出用キットを用いた場合は、特殊な装置や熟練した技術を必要とせずに全工程をわずか２０分以内に完了した。さらに、該キットの使用により、ＣＣＶとＣＰＶの鑑別も可能であった。以上の試験結果から、本発明のキットは、ＣＣＶ抗原及びＣＰＶ抗原を高感度に検出し、これによりＣＣＶ感染症及びＣＰＶ感染症を的確に診断することが可能となり、しかも簡便かつ迅速に結果を得ることが出来たことから、本発明の抗原検出用キットは、従来にない優れたＣＣＶ及びＣＰＶ検出用キットであることが判明した。
【００６３】
【表２】
【発明の効果】
以上詳記した通り、本発明は、新規な犬のウイルス性下痢症の診断キットに関するものであり、本発明によれば、次のような効果が奏される。
１）特殊な機器及び熟練した技術を必要とすることなく、検体（糞便）の採取現場において簡便かつ迅速にイヌコロナウイルス感染症を診断することが可能となる。
２）特殊な機器及び熟練した技術を必要とすることなく、検体（糞便）の採取現場において簡便、迅速、かつ同時にイヌコロナウイルス感染症とイヌパルボウイルス感染症を鑑別診断することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施の形態によるイヌコロナウイルス抗原を検出する犬下痢症ウイルス抗原検出用キットを示す平面図。
【図２】本発明の一実施の形態によるイヌコロナウイルス抗原及びイヌパルボウイルス抗原を検出する犬下痢症ウイルス抗原検出用キットを示す平面図。
【配列表】
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to the diagnosis of viral diarrhea in dogs. The present invention relates to canine coronavirus (hereinafter, sometimes referred to as “CCV”) which is a virus causing canine diarrhea, or CCV and canine parvovirus (hereinafter referred to as “CCV”). , And "CPV"), a kit for detecting canine diarrhea virus antigen which can detect both of them with high sensitivity and specificity, easily and quickly, and canine viral diarrhea using the kit. It relates to a diagnostic method.
[0002]
[Prior art]
[Non-Patent Document 1] Tuchiya et al. (1991) Vet. Microbiol. 26: 41-51
[Non-Patent Document 2] Rimmelzwaan et al. (1991) Vet. Microbiol. 26: 25-40
[Non-Patent Document 3] Pratellli et al. (1999) J. Virol. Methods 80: 11-5
[Non-Patent Document 4] Pratellli et al. (2000) J. Virol. Methods 84: 91-4
[Non-Patent Document 5] Naylor et al. (2001) J. Clin. Microbiol. 39: 1036-41
[0003]
Conventionally, methods for detecting the CCV include a method applying the ELISA method (Non-Patent Documents 1 and 2) and a method applying the PCR method (Non-Patent Documents 3, 4 and 5). Only known. However, these methods require special equipment, have problems such as complicated procedures and skill in judging the results, and are suitable for clinical situations requiring rapid diagnosis of diarrhea in dogs. is not. Although a method for rapidly detecting only CPV is already known, when a negative result is obtained by the method, a test result as to whether or not the disease is a CCV infection whose clinical symptoms are very similar can still be obtained. And the treatment must be performed with the cause unknown.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
In diagnosing diarrhea in dogs, the treatment strategy for CCV and CPV infections, which are the two major viral diarrhea that have similar clinical symptoms and can be fatal if treatment is delayed, is There is a need for a quick and easy diagnostic kit to stand up and take precautionary measures. The present invention provides a diagnostic kit for CCV infection, which is a kit for canine diarrhea virus antigen detection that can be used for simple and quick diagnosis in clinical settings without requiring special equipment and skilled techniques. And a differential diagnosis kit for CPV infection.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
The present invention has been made in order to achieve the above object, and as a result of studies from various aspects, solves the above-mentioned technical problem by performing a sandwich method, which is an immunological technique, on a porous carrier. It was the first successful one.
[0006]
That is, the first means for solving the problem according to the present invention is to provide a kit for detecting a CCV antigen.
[0007]
That is,
(1) A sample dropping site, a labeled antibody-containing site, an antigen detection site, and a reaction termination determination site are sequentially formed on a porous carrier, and (2) a labeled antibody-containing site is formed on the porous carrier in a wet state. A CCV antigen-specific labeled antibody (hereinafter sometimes referred to as “labeled antibody I”) that can sequentially move from the antigen detection site to the reaction termination determination site is contained, and the CCV antigen-specific antibody ( Hereinafter, the antibody may be referred to as “antibody II” and immobilized on the solid phase, and an immunoglobulin protein-specific antibody of the animal species used as the labeled antibody (hereinafter referred to as “antibody III”) may be used at the reaction termination determination site. ) Was immobilized and (3) the sample was dropped on the sample drop site, thereby moving the sample in the porous carrier, eluting the labeled antibody I, and immobilizing the antibody II. By allowing the CCV antigen in the sample to be detected by passing through the original detection site and the reaction termination determination site where the antibody III has been immobilized, by providing a kit for detecting dog diarrhea virus antigen, The purpose is to enable simple and rapid detection of CCV antigen. Hereinafter, the requirements of the detection kit will be described in detail.
[0008]
The detection kit utilizes a method of performing a sandwich assay for a CCV antigen on a porous carrier (immunochromatography) as a measurement principle. In this kit, all proteins of CCV can be used as a detection antigen. Preferably, when this kit is prepared using a nucleocapsid protein of the virus (hereinafter sometimes referred to as CCV-N) as a detection antigen, Can be maximized. However, the detection antigen of the detection kit of the present invention is not limited to CCV-N, and any protein encoded by the virus such as the S protein or M protein of the virus may serve as the detection antigen of the kit. sell.
[0009]
As the antibody for producing the labeled antibody I in the kit, any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody can be used as long as it is specific for the CCV antigen. By using an antibody specific to the viral nucleocapsid protein as the antibody, the sensitivity of the kit can be maximized. In addition, since the labeled antibody I is prepared by labeling a monoclonal antibody, the specificity of the kit can be improved. That is, the most preferred embodiment of the labeled antibody I is to use a monoclonal antibody specific to CCV-N, but the present invention is not limited to this. The labeled antibody can be labeled with, for example, a synthetic polymer such as colored latex particles or magnetic beads, a natural polymer such as gelatin, or a metal polymer such as colloidal gold, and used for immunochromatography. In the case where the reaction is directly and visually detected, labeling with colloidal gold is the most preferable example, but is not limited thereto.
[0010]
In the kit for detecting a CCV antigen, any of an antibody (antibody II) immobilized on an antigen detection site can be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody as long as it is specific to the CCV antigen. When preparing a kit using the virus nucleocapsid protein as an antigen to be detected and using a labeled antibody I specific to the protein, the antibody II is also immobilized with a polyclonal antibody containing an antibody fraction specific to the protein. Thereby, the detection sensitivity of the kit can be maximized, and the use of the antibody can be mentioned as the most preferable example, but the present invention is not limited to this.
[0011]
An antibody (antibody III) specific to the immunoglobulin protein of the animal species used as the labeled antibody I is immobilized on the reaction termination determination site, and any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody can be used.
[0012]
These antibodies are sequentially contained in a porous carrier to constitute a kit for detecting canine diarrhea virus antigen. As the material of the porous carrier, commercially available filter paper, nylon, nitrocellulose, polyvinylidene difluoride, glass fiber filter paper and the like can be used. In addition to the above, a porous plastic obtained by making a synthetic polymer porous such as polypropylene, polyethylene, polyvinylidene fluoride, ethylene vinyl acetate, acrylonitrile, and polytetrafluoroethylene can also be used.
[0013]
The use of this kit makes it possible to diagnose CCV infection simply and quickly without requiring special techniques, equipment and facilities.
[0014]
A second means for solving the problem according to the present invention is to provide a kit for simultaneously detecting CCV and CPV antigens. By using this kit, antigens of CCV and CPV, which are the main causes of viral diarrhea in dogs, can be detected in a single operation, and differential diagnosis of both infectious diseases is possible, making it easier. In addition, an inspection result can be obtained. This kit is a development of the kit for detecting canine diarrhea virus antigen described in detail in the first means of the present invention, and it is possible to detect both virus antigens on the same kit for detection. As a result, they have completed the second detection kit of the present invention.
[0015]
That is, (1) a sample dropping site, a labeled antibody-containing site, an antigen detection site, and a reaction termination determination site are sequentially formed on the porous carrier, and (2) the porous carrier is wetted in the labeled antibody-containing site. A CCV antigen-specific labeled antibody (labeled antibody I) and a CPV antigen-specific labeled antibody (hereinafter sometimes referred to as “labeled antibody IV”) that can sequentially move from the antigen detection site to the reaction termination determination site And immobilize a CCV antigen-specific antibody (antibody II) and a CPV antigen-specific antibody (hereinafter sometimes referred to as “antibody V”) on the antigen detection site, and The immunoglobulin protein-specific antibody (antibody III) of the animal species used as the labeled antibody is immobilized, and the sample is dropped onto the sample dropping site according to (3), whereby the sample is transferred to the porous carrier. To elute the labeled antibodies I and IV, and pass through the antigen detection site where the antibodies II and V are immobilized and the reaction termination judgment site where the antibody III is immobilized, whereby the CCV in the sample is removed. By providing a kit for detecting canine diarrhea virus antigens, characterized by detecting the antigen and the CPV antigen, it is possible to detect both antigens quickly, conveniently, and simultaneously from the same sample. is there. Hereinafter, the requirements of the detection kit will be described in detail.
[0016]
Regarding the requirement for detecting the CCV antigen of the kit, the details described in the section of the kit for detecting only the canine coronavirus antigen also apply to the present kit.
[0017]
In the requirement for detecting the CPV antigen of the kit, the labeled antibody IV to be used may be any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody as long as it is specific to the CPV antigen. By labeling and using a monoclonal antibody specific to the virus particle surface protein, the specificity of the kit can be maximized, and the use of the monoclonal antibody is the most preferred example. Yes, but not limited to. The labeled antibody IV can be labeled with a synthetic polymer such as colored latex particles or magnetic beads, a natural polymer such as gelatin, or a metal polymer such as colloidal gold, and used for immunochromatography. In the case where the reaction is directly and visually detected, labeling with colloidal gold is the most preferable example, but is not limited thereto.
[0018]
As the antibody (antibody V) immobilized on the antigen detection site, either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody can be used as long as it is specific to the CPV antigen. By using the virus particle surface protein as a detection antigen and immobilizing a polyclonal antibody containing an antibody fraction specific to the antigen, the detection sensitivity of the kit can be maximized, The most preferable example can be mentioned, but is not limited thereto.
[0019]
An antibody (antibody III) specific to the immunoglobulin protein of the animal species used as the labeled antibody is immobilized on the reaction termination determination site, and any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody can be used.
[0020]
These antibodies are sequentially contained in a porous carrier to constitute a kit for detecting canine diarrhea virus antigen. Regarding the requirement of the porous carrier of the kit, the details described in the section of the kit for detecting only the dog coronavirus antigen also apply to the present kit.
[0021]
By using this kit, it is possible to rapidly diagnose CCV infection and CPV infection with a single operation. In addition, it is easy for those skilled in the art to add a new detection site such as inurotavirus to the detection kit with the same configuration.
[0022]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The present invention according to claim 1 is a kit for detecting a canine diarrhea virus antigen, wherein (1) a porous carrier is provided with a sample dropping site, a labeled antibody-containing site, an antigen detection site, and a reaction termination determination site sequentially. (2) The labeled antibody-containing site contains the CCV antigen-specific labeled antibody (labeled antibody I) that can move sequentially from the antigen detection site to the reaction termination determination site on the porous carrier in a wet state. The CCV antigen-specific antibody (antibody II) was immobilized on the antigen detection site, and the immunoglobulin protein-specific antibody (antibody III) of the animal species used as the labeling antibody was immobilized on the reaction termination determination site. (3) the sample is dropped on the sample dropping site to move the sample in the porous carrier, elute the labeled antibody I, and immobilize the antibody II on the antigen detection site. By detecting the CCV antigen in the sample by passing the reaction completion determination site on which the body III has been immobilized, and a kit for detecting canine diarrhea virus antigen, It has the effect of being able to diagnose CCV infection simply and quickly without the need for special techniques, equipment and facilities.
[0023]
The CCV polyclonal antibody required for preparing this kit can be purified CCV immunized to various animals such as rabbits and goats according to the method described in Antibodies, A laboratory manual (1988, Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow and Lane). Can be obtained. Purified CCV was prepared according to the method of Makino et al. (Makino et al. (1983) Microbiol. Immunol. 27: 445-454, Makino et al. (1984). Virology 133: 9-17), for example, by using a sucrose density gradient centrifugation method from the culture supernatant of CCV1-71 strain-infected CRFK cells. Alternatively, in order to obtain only an antibody against the nucleocapsid protein, the protein can be expressed in a large amount in an expression system using baculovirus or Escherichia coli, and a polyclonal antibody can be obtained using the protein as an antigen.
[0024]
In addition, a monoclonal antibody against the virus is also immunized to a mouse with purified CCV, and then, following the method described in Antibodies, A laboratory manual (1988, Cold Spring Harbor Laboratory, edited by Harlow and Lane). Can be obtained by cloning a hybridoma that produces The specificity of the obtained monoclonal antibody can be determined by ELISA, Western blotting, or by examining the reactivity of each protein encoded in the viral genome with the expression product.
[0025]
Suitable carrier particles used for labeling the obtained antibody include colored latex particles, synthetic polymers such as magnetic beads, natural polymers such as gelatin, and metal polymers such as colloidal gold. It is desirable that the carrier particles are colored when the determination is made with the naked eye. In this regard, the colloidal particles of the metal polymer and the colored latex particles are advantageous because they have a color tone. Regarding the method of labeling an antibody, the label can be labeled according to the manual provided by the manufacturer of the carrier particle, which is a technique obvious to those skilled in the art. The antibody labeled with the carrier particles may be used as a buffer containing about 0.05% to 5% BSA or the like for the purpose of improving colloidal chemical stability or preventing non-specific binding to the membrane and the specimen. It is desirable to store it suspended in it.
[0026]
These antibodies are arranged on a porous carrier, for example, as shown in FIG. 1 to prepare the present kit. That is, the labeled antibody-containing site of the porous carrier contains the CCV antigen-specific labeled antibody I, the CCV antigen-specific antibody (antibody II) is immobilized on the antigen detection site, and the labeled antibody The antibody specific to the immunoglobulin protein (antibody III) of the animal species used as the solid phase is immobilized, and the membrane is cut into strips (for example, about 5 to 20 mm in width and about 50 mm in length). (For example, plastic). It is advantageous to dispose an absorber of an appropriate size at one end of the cut strip on the side of the reaction end determination site, which has a function of facilitating the development of the sample. Further, a sample dropping site is arranged to constitute the kit. In this kit, the labeled antibody-containing site and the sample dropping site may be the same. For fixing each member to the support, an adhesive, an adhesive tape, or the like can be used.
[0027]
As the material of the porous carrier, any of commercially available filter paper, natural or synthetic polymer such as nylon, nitrocellulose, polyvinylidene difluoride and glass fiber filter paper can be used. As a method for immobilizing a CCV antigen-specific antibody (antibody II) on a membrane, a physical adsorption method, a chemical bonding (covalent bonding) method, or any other method can be used. That is, any material can be used as long as the CCV antibody does not detach from the membrane. The antibody II-immobilized membrane is desirably subjected to a blocking treatment with about 0.05 to 5% of BSA or the like in order to prevent nonspecific adsorption with the specimen or the labeled antibody I, and stored under dry conditions.
[0028]
In use, feces collected from a dog as a test animal are suspended in a buffer solution, and an appropriate amount of the stool is dropped on a sample dropping site of the present kit. The dropped sample reaches the site containing the labeled antibody I, and when a CCV antigen is present in the sample, an immune complex is formed between the sample and the labeled antibody I. The immune complex is developed together with a buffer solution on a porous carrier such as filter paper by capillary action, and reaches the antigen detection site where the antibody II is immobilized, and most of the immune complex is bound by the antibody II at the site. Is captured by If the CCV antigen does not exist in the sample, it passes as a free labeled antibody I without being captured at this site. Part of the immune complex or free labeled antibody I passes through the antigen detection site, reaches the reaction termination determination site, and captures and accumulates the labeled antibody I regardless of the presence or absence of immune complex formation, and ends the test. Reaction appears. In this kit, this reaction appears by allowing the sample to stand at room temperature for 10 to 15 minutes after dropping the sample. This reaction appears as a purple-red color when a colloidal gold-labeled antibody is used. When a color reaction appears at the antigen detection site at the time when the reaction appears at the reaction termination judgment site, CCV antigen is determined to be positive; when not, the test animal (dog) is determined to be CCV antigen positive. Diagnosis of infection.
[0029]
Further, in the antigen detection kit, the kit may be constructed by excluding the labeled antibody-containing site containing the CCV antigen-specific labeled antibody I shown in FIG. 1. In the kit of such a form, the labeled antibody I and the sample suspended in the buffer solution are mixed in advance in a test tube, and then the mixed solution is dropped at the sample dropping site. The presence or absence can be determined.
[0030]
The invention according to claim 2 of the present invention provides a kit for detecting canine diarrhea virus antigen, wherein (1) a porous carrier is provided with a sample dropping site, a labeled antibody-containing site, an antigen detection site, and a reaction termination determination site. And (2) a labeled antibody containing a CCV antigen-specific labeled antibody (labeled antibody I) capable of sequentially moving from the antigen detection site to the reaction termination determination site on the porous carrier in a wet state at the site containing the labeled antibody. ) And a CPV antigen-specific labeled antibody (labeled antibody IV), and a CCV antigen-specific antibody (antibody II) and a CPV antigen-specific antibody (antibody V) are immobilized on the antigen detection site. First, an antibody specific to an immunoglobulin protein of the animal species used as the labeled antibody (antibody III) is immobilized, and (3) the sample is dropped at the sample drop site, thereby allowing the sample to be porous. By moving in the carrier, the labeled antibodies I and IV are eluted and passed through the antigen detection site where the antibodies II and V have been immobilized and the reaction termination judgment site where the antibody III has been immobilized, whereby the Detecting a CCV antigen and the CPV antigen, a kit for detecting canine diarrhea virus antigen characterized by the use of this kit. It has the effect that diagnosis can be performed easily and quickly without the need for technology.
[0031]
As the antibody required for the CCV antigen detection in the present kit, an antibody prepared for assembling a kit for detecting only a canine coronavirus antigen can be used.
[0032]
In preparing this kit, further required CPV polyclonal antibodies are purified CPV according to the method described in Antibodies, A laboratory manual (1988, Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow and Lane), various animals such as rabbits and goats. By immunizing it. Purified CPV can be prepared, for example, from a culture supernatant of CRFK cells infected with the CPVCp-49 strain using a cesium chloride density gradient centrifugation method.
[0033]
In addition, a monoclonal antibody against the same virus is also immunized to a mouse with purified CPV, and then the antibody against the CPV antigen protein is obtained according to the method described in Antibodies, A laboratory manual (1988, Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow and Lane). Can be obtained by cloning a hybridoma that produces The specificity of the obtained monoclonal antibody can be determined by the ELISA method, the Western blotting method, the reactivity to the expression product of each protein encoded in the virus genome, or the virus neutralizing activity or the hemagglutination inhibiting activity.
[0034]
For the labeling of the antibody, the method described in detail in the section of the method for preparing a kit for detecting only the CCV antigen can be applied mutatis mutandis.
[0035]
These antibodies are arranged on a porous carrier, for example, as shown in FIG. 2 to prepare the present kit. That is, both the CCV antigen-specific labeled antibody I and the CPV antigen-specific labeled antibody IV are contained in the labeled antibody-containing site of the porous carrier, and the CCV antigen-specific antibody (antibody II) and the CPV antigen-specific An antigen-specific antibody (antibody V) is immobilized, and an immunoglobulin protein-specific antibody (antibody III) of an animal species used as a labeled antibody is immobilized on the reaction termination determination site, and the membrane is strip-shaped (for example, width (5 to 20 mm, length about 50 mm), and the cut membrane is fixed to a support (for example, plastic or the like) of the same size. It is advantageous to dispose an absorber of an appropriate size at one end of the cut strip on the side of the reaction end determination site, which has a function of facilitating the development of the sample. Further, a sample dropping site is arranged to constitute the kit. In this kit, the labeled antibody-containing site and the sample dropping site may be the same. For fixing each member to the support, an adhesive, an adhesive tape, or the like can be used.
[0036]
Each labeled antibody in the kit may be labeled with the same substance, for example, colloidal gold or colored latex particles, or both may be labeled with different labeling substances, for example, one with gold colloid and the other with colored latex particles. Good. The two antibodies (antibody II and antibody V) at the antigen detection site may be displaced within the site or may be further provided with a difference in the shape of immobilization (for example, linear and dot). By immobilizing the solid phase, the CCV antigen detection site and the CPV antigen detection site can be distinguished from each other, and depending on the position or shape of the reaction such as coloring at the antigen detection site, which antigen is contained in the sample, or both antigens can be detected. This is advantageous because it can be easily determined whether or not it is included. When the animal species of the immunoglobulin protein used as the CCV antigen-specific labeled antibody I and the CPV antigen-specific labeled antibody IV is different, the end of the reaction is determined using an immunoglobulin protein-specific antibody (antibody III) of one of the animal species. The site can be formed by immobilization at the site, but immunoglobulin protein-specific antibodies (antibody III) of both animal species may be immobilized at the site.
[0037]
As the material of the porous carrier, any of commercially available filter paper, natural or synthetic polymer such as nylon, nitrocellulose, polyvinylidene difluoride and glass fiber filter paper can be used. In addition, as a method for fixing the CCV antibody II to the membrane, a physical adsorption method, a chemical bonding (covalent bonding) method, or any other method can be used. That is, any material can be used as long as the CCV antibody does not detach from the membrane. The CCV antibody-immobilized membrane is desirably subjected to a blocking treatment with about 0.05 to 5% of BSA or the like in order to prevent nonspecific adsorption with the specimen or the labeled antibody I, and stored under dry conditions.
[0038]
The antigen detection method is the same as that of the kit for detecting CCV antigen, and the feature of this kit resides in that CCV antigen and CPV antigen are detected on the same kit. By using the kit of the present invention, the presence or absence of both antigens can be determined by one operation.
[0039]
In use, the sample is suspended in a buffer solution, dropped into the sample dropping site of the kit, and allowed to stand at room temperature for 10 to 15 minutes to wait for the reaction to appear at the reaction termination determination site. This reaction appears as a purple-red color when a colloidal gold-labeled antibody is used. At the time when a reaction appears at the reaction termination determination site, if a similar reaction appears at the CCV antigen detection site of the antigen detection site, CCV antigen positive, if a similar reaction appears at the CPV antigen detection site, CPV antigen positive, When a similar reaction appears at both detection sites, it is determined that the reaction is positive for CCV antigen and CPV antigen, and when no reaction appears at both detection sites, it is determined that the reaction is negative for CCV antigen and CPV antigen. Upon diagnosis, the test animal is determined to be infected with the virus that was antigen-positive.
[0040]
Furthermore, in the kit for antigen detection, the kit may be constructed by removing the labeled antibody-containing site containing the CCV antigen-specific labeled antibody I and the CPV antigen-specific labeled antibody IV shown in FIG. It is possible. In the kit of such a form, after the labeled antibodies I and IV and the sample suspended in the buffer solution are mixed in advance in a test tube, the mixed solution is dropped at the sample drop site, and the reaction is waited for in the same manner as described above. The presence or absence of the antigen can be determined.
[0041]
【Example】
Hereinafter, the fact that the kit for detecting canine diarrhea virus antigen of the present invention is actually very useful will be described in more detail along the following Preparation Examples and Examples. It is not limited in any way by the examples. In Preparation Examples, examples of preparation of each antibody necessary for preparing the antigen detection kit of the present invention are shown, and in Examples, examples of preparation of antigen detection kits using these antibodies and application examples thereof are shown.
[0042]
Preparation Example 1: Preparation of anti-CCV polyclonal antibody
CCV, an immunogen, was prepared as follows. That is, 2.2% sodium chloride and 6.5% polyethylene glycol # 6000 were added to the culture supernatant of the CCV 1-71 strain-infected CRFK cells, and the precipitate was recovered by centrifugation to obtain a crude purified CCV. Then, a purified CCV fraction that accumulates between 30% (W / W) sucrose and 60% (W / W) sucrose was prepared by discontinuous sucrose density gradient centrifugation. Per rabbit, 100 μg of purified CCV was inoculated subcutaneously with Freund's complete adjuvant and boosted subcutaneously twice more at three week intervals with Freund's incomplete adjuvant. Thereafter, rabbits were inoculated with purified CCV at intervals of 3 weeks or more, and rabbit serum was obtained as an anti-CCV polyclonal antibody within 10 days after inoculation. From the obtained serum, an anti-CCV antibody-containing fraction was purified by affinity chromatography using a protein G column (manufactured by Amersham Pharmacia).
[0043]
Preparation Example 2: Preparation of anti-CCV-N monoclonal antibody
Per mouse, 100 μg of the purified CCV prepared in Preparation Example 1 was subcutaneously inoculated with Freund's complete adjuvant, and further subcutaneously inoculated twice at three-week intervals with Freund's incomplete adjuvant. Thereafter, at intervals of at least three weeks, purified CCV was inoculated into the abdominal cavity of the mouse, and the spleen was removed three days later. The spleen cells were fused with mouse myeloma cells, and an anti-CCV-N antibody-producing hybridoma was obtained by screening and cloning. This anti-CCV-N antibody-producing hybridoma was transferred into the abdominal cavity of a BALB / c mouse 10 days after administration of Pristane (Sigma), and ascites was collected about 10 days later. The anti-CCV-N monoclonal antibody was purified from the obtained ascites by affinity chromatography using a protein G column (manufactured by Amersham Pharmacia).
[0044]
Preparation Example 3: Preparation of anti-mouse immunoglobulin polyclonal antibody
Per rabbit, 100 μg of commercially available mouse immunoglobulin G (CALBIOCHEM) was inoculated subcutaneously with Freund's complete adjuvant, and further subcutaneously inoculated twice at three-week intervals with Freund's incomplete adjuvant. Thereafter, mouse immunoglobulin G was inoculated into rabbit veins at intervals of 3 weeks or more, and within 10 days after inoculation, rabbit serum was obtained as an anti-mouse immunoglobulin polyclonal antibody. The anti-mouse immunoglobulin antibody-containing fraction was purified from the obtained serum by affinity chromatography using Protein G (manufactured by Amersham Pharmacia).
[0045]
Preparation Example 4: Preparation of anti-CPV polyclonal antibody
The immunogen CPV was prepared as follows. That is, 2.2% of sodium chloride and 6.5% of polyethylene glycol # 6000 were added to the culture supernatant of CPV Cp-49 strain-infected CRFK cells, and then the precipitate was collected by centrifugation. A purified CPV fraction was prepared from the obtained CPV by cesium chloride density gradient centrifugation. Per rabbit, 100 μg of purified CPV was inoculated subcutaneously with Freund's complete adjuvant and boosted subcutaneously twice a week at three week intervals with Freund's incomplete adjuvant. The rabbits were inoculated with purified CPV at intervals of 3 weeks or more thereafter, and within 10 days after the inoculation, rabbit serum was obtained as an anti-CPV polyclonal antibody. From the obtained serum, an anti-CPV antibody-containing fraction was purified by affinity chromatography using a protein G column (manufactured by Amersham Pharmacia).
[0046]
Preparation Example 5: Preparation of anti-CPV monoclonal antibody
For each mouse, 100 μg of the purified CPV prepared in Preparation Example 4 was subcutaneously inoculated with Freund's complete adjuvant, and further subcutaneously inoculated twice at three-week intervals with Freund's incomplete adjuvant. Then, at intervals of 3 weeks or longer, purified CPV was inoculated into the abdominal cavity of the mouse, and the spleen was removed 3 days later. The spleen cells were fused with mouse myeloma cells, and an anti-CPV antibody-producing hybridoma was obtained by screening and cloning. The anti-CPV antibody-producing hybridoma was transferred into the abdominal cavity of a BALB / c mouse 10 days after administration of Pristane (Sigma), and ascites was collected about 10 days later. An anti-CPV mouse monoclonal antibody was purified from the obtained ascites by affinity chromatography using a protein G column (manufactured by Amersham Pharmacia).
[0047]
(Example 1)
This example shows the preparation of a kit for detecting CCV antigen and the detection of CCV antigen using the kit.
[0048]
1) Preparation of kit for detecting CCV antigen
The kit for antigen detection shown in FIG. 1 was prepared as follows. That is, the anti-CCV-N rabbit polyclonal antibody prepared in Preparation Example 1 was used as the antibody II in FIG. 1, and the anti-mouse immunoglobulin polyclonal antibody prepared in Preparation Example 3 was used as the antibody III. The antibody was diluted with a PBS buffer and applied linearly to a commercially available nitrocellulose membrane (manufactured by Millipore) using an antibody coating kit (manufactured by Biodot) as shown in FIG. After sufficient drying, in order to prevent non-specific adsorption, a blocking treatment was performed with a PBS buffer solution containing 1% BSA, followed by sufficient drying to prepare an antibody-immobilized membrane. As the labeled antibody I in FIG. 1, the anti-CCV-N monoclonal antibody prepared in Preparation Example 2 was labeled and used as follows. That is, 50 μl of the purified CCV-N mouse monoclonal antibody (0.1 mg / mL) adjusted to pH 9.0 was added to 1 mL of gold colloid (manufactured by British Biocell) having a particle diameter of 40 nm, and the mixture was stirred at room temperature for 5 minutes. Next, 100 μl of an aqueous solution containing 10% BSA and 1% PEG adjusted to pH 9.0 was added, and the mixture was further stirred at room temperature for 10 minutes. Subsequently, the anti-CCV-N mouse monoclonal antibody protein-immobilized gold colloid particles were collected by centrifugation (4 ° C., 10,000 g, 15 minutes), and Tris-HCl buffer containing 100 μl of 1% BSA and 0.1% sodium azide was collected. (PH 8.2) to obtain a suspension of an antibody labeled with colloidal gold particles that specifically binds to CCV-N, and fixed to a glass fiber absorption membrane (Millipore). The above-mentioned antibody-immobilized membrane and the glass fibrous absorption membrane containing the colloidal gold-labeled antibody I were formed into a strip having a width of about 5 mm and a length of about 50 mm as shown in FIG. An absorbent made of glass fiber (manufactured by Millipore) was adhered to one end on the side of the reaction termination judgment site to easily spread the dropped sample, thereby completing an antigen detection kit.
[0049]
2) Test sample
(1) Sample numbers 1 to 7: feces collected over time from individuals infected with CCV experiment
(2) Sample Nos. 8 to 11: Feces collected from an individual who had diarrhea
(3) Sample No. 12: Sample diluent
[0050]
3) Detection of CCV genomic RNA from test samples by RT-PCR
The stool to be tested is dissolved in a PBS buffer so as to have a concentration of 10 (W / V)%, and genomic RNA is extracted from the supernatant obtained by centrifugation. CCV genomic RNA can be obtained by heating the supernatant of fecal lysate in the presence of proteinase K and sodium dodecyl sulfate, extracting it with a phenol: chloroform: isoamyl alcohol solution (25: 24: 1). it can.
[0051]
Using the recovered genomic RNA as a template, and referring to a base sequence known to date [Journal of General Virology (Journal of General Virology), vol. 73, p. 2849, 1992] Thus, two synthetic DNA primers 5′-GAACTGGACCCTCATGCTGAT-3 ′ (SEQ ID NO: 1) and 5′-CATTCTGTAGTGTAGTATCTCT-3 ′ (SEQ ID NO: 2) were prepared, and CCV genomic RNA was detected by RT-PCR. .
[0052]
4) Test results
The results of this test are shown in Table 1. As is clear from Table 1, the CCV genome was detected by RT-PCR from day 2 to day 6 after inoculation in feces collected from individuals infected with the CCV experiment. In these samples, the CCV antigen of the present invention was detected by a kit for detecting canine diarrhea virus antigen which detects the antigen. In feces collected from an individual who had diarrhea, the antigen was detected by the antigen detection kit of the present invention in the sample Nos. 8 and 9 in which CCV genomic RNA was detected by the RT-PCR method, and the CCV genome was not detected. In sample numbers 10 and 11, no CCV antigen was detected.
[0053]
Although the RT-PCR method is considered to be a highly sensitive virus detection method, detection of the CCV genome by this method requires approximately one day from the preparation of a sample to the result, and requires a PCR reaction kit, and Compared to the need for skilled technology, using the kit for detecting canine diarrhea virus antigen of the present invention, the entire process can be completed within only 20 minutes without the need for special equipment or skilled technology. did. From the above test results, the kit of the present invention can detect CCV antigens with high sensitivity, thereby enabling accurate diagnosis of CCV infection, and furthermore, being able to obtain results simply and quickly. It has been found that the antigen detection kit of the present invention is an unprecedented excellent CCV antigen detection kit.
[0054]
[Table 1]
(Example 2)
This example shows the preparation of a kit for detecting CCV antigen and CPV antigen, and the detection of CCV antigen and CPV antigen using the kit.
[0056]
1) Preparation of kit for detecting CCV antigen and CPV antigen
The antigen detection kit shown in FIG. 2 was prepared as follows. As the labeled antibodies I, II and III in FIG. 2, the labeled antibodies or antibodies used in Example 1 were applied mutatis mutandis. The anti-CPV monoclonal antibody prepared in Preparation Example 5 was used as the labeled antibody IV, and the anti-CPV polyclonal antibody prepared in Preparation Example 4 was used as the antibody V. Antibody II, antibody III, and antibody V were linearly applied to a nitrocellulose membrane in the same manner as in Example 1 as shown in FIG. 2 to prepare an antibody-immobilized membrane. The labeled antibody IV was prepared in the same manner as the labeled antibody I, and fixed on the same glass fiber absorption membrane. The glass fiber-absorbing film containing the antibody immobilized film and the colloidal gold-labeled antibody I was formed into a strip having a width of about 5 mm and a length of about 50 mm as shown in FIG. An absorbent made of glass fiber (manufactured by Millipore) was adhered to one end on the side of the reaction termination judgment site to easily spread the dropped sample, thereby completing an antigen detection kit.
[0057]
2) Test sample
(1) Sample numbers 1 to 7: feces collected over time from individuals infected with CCV experiment
(2) Sample numbers 8 to 14: feces collected over time from individuals infected with the CPV experiment
(3) Sample Nos. 15 to 18: Feces collected from individuals presenting with diarrhea
(4) Sample No. 19: Sample diluent
[0058]
3) Detection of CCV genomic RNA from test samples by RT-PCR
Performed in the same manner as in Example 1.
[0059]
4) Detection of CPV genomic DNA from test samples by PCR
The test stool is dissolved in a PBS buffer so as to have a concentration of 10 (W / V)%, and genomic DNA is extracted from the supernatant obtained by centrifugation. The CPV genomic DNA can be obtained by heating the supernatant of the stool lysate in the presence of proteinase K and sodium dodecyl sulfate, extracting it with a phenol: chloroform: isoamyl alcohol solution (25: 24: 1). it can.
[0060]
Two synthetic DNA primers using the recovered genomic DNA as a template and referring to a base sequence known to date [Virology, 148, 121, 1986] 5′-TGCCATTACTCCAGCAGC-3 ′ (SEQ ID NO: 3) and 5′-CATTTGAGTTACACCACGTCT-3 ′ (SEQ ID NO: 4) were prepared, and CPV genomic RNA was detected by PCR.
[0061]
5) Test results
The results of this test are shown in Table 2. As is clear from Table 2, the CCV genome was detected by RT-PCR from day 2 to day 6 after inoculation in feces collected from the CCV experimental infected individual. In these samples, the CCV antigen was detected by the canine diarrhea virus antigen detection kit for detecting CCV and CPV antigens of the present invention, and the CPV antigen was negative. In feces collected from an individual exhibiting diarrhea, the CCV antigen is detected by the antigen detection kit of the present invention in Sample Nos. 15 and 16 in which CCV genomic RNA was detected by the RT-PCR method, and the CCV genome is not detected. In Sample Nos. 17 and 18, no CCV antigen was detected. In the feces collected from the individuals infected with the CPV experiment, the CPV genome was detected by PCR from the second day to the sixth day after the inoculation. In these samples, the CPV antigen was detected by the kit for detecting CCV and CPV antigen of the present invention, and the CCV antigen was negative. In feces collected from an individual exhibiting diarrhea, sample No. 17 in which CPV genomic DNA was detected by PCR, CPV antigen was detected by the kit for antigen detection of the present invention, and sample No. 15 in which no CPV genome was detected, No CPV antigen was detected in 16 or 18.
[0062]
The RT-PCR method and the PCR method are considered to be highly sensitive virus detection methods. However, detection of a virus genome by this method requires approximately one day from the preparation of a sample to the time when a result is obtained. Compared to the necessity and the need for skilled technology, when using the antigen detection kit of the present invention, the entire process can be completed within only 20 minutes without the need for special equipment or skilled technology. did. Furthermore, the use of the kit enabled the discrimination between CCV and CPV. From the above test results, the kit of the present invention can detect CCV antigens and CPV antigens with high sensitivity, and thereby can accurately diagnose CCV infection and CPV infection, and can easily and quickly obtain the results. From the fact that the kit was obtained, it was found that the kit for detecting an antigen of the present invention was an unprecedented excellent kit for detecting CCV and CPV.
[0063]
[Table 2]
【The invention's effect】
As described above in detail, the present invention relates to a novel diagnostic kit for viral diarrhea in dogs. According to the present invention, the following effects can be obtained.
1) A canine coronavirus infectious disease can be easily and quickly diagnosed at a sample (feces) collection site without requiring special equipment and skilled techniques.
2) It is possible to easily, quickly, and simultaneously differentially diagnose canine coronavirus infection and canine parvovirus infection at a sample (feces) collection site without requiring special equipment and skilled techniques. .
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a plan view showing a canine diarrhea virus antigen detection kit for detecting a canine coronavirus antigen according to one embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a plan view showing a kit for detecting canine diarrhea virus antigen for detecting canine coronavirus antigen and canine parvovirus antigen according to one embodiment of the present invention.
[Sequence list]
Claims (6)
（１）多孔質キャリアに、検体滴下部位、標識抗体含有部位、抗原検出部位及び反応終了判定部位とを順次形成してなり、
（２）標識抗体含有部位には湿潤状態において多孔質キャリア上を抗原検出部位から反応終了判定部位へと順次移動し得るイヌコロナウイルス抗原特異的標識抗体を含有せしめ、抗原検出部位にはイヌコロナウイルス抗原特異的抗体を固相化し、反応終了判定部位には標識抗体として使用した動物種の免疫グロブリンタンパク質特異的抗体を固相化し、
（３）もって、検体を検体滴下部位に滴下することにより、検体を多孔質キャリア内で移動せしめて、イヌコロナウイルス抗原特異的標識抗体を溶出させ、イヌコロナウイルス抗原特異的抗体を固相化した抗原検出部位及び免疫グロブリンタンパク質特異的抗体を固相化した反応終了判定部位を通過せしめることにより、検体中の該イヌコロナウイルス抗原を検出すること、
を特徴とする犬下痢症ウイルス抗原検出用キット。A canine diarrhea virus antigen detection kit for detecting canine coronavirus antigen,
(1) a sample in which a sample dropping site, a labeled antibody-containing site, an antigen detection site, and a reaction termination determination site are sequentially formed on a porous carrier;
(2) The labeled antibody-containing site contains a canine coronavirus antigen-specific labeled antibody that can move sequentially from the antigen detection site to the reaction termination determination site on the porous carrier in a wet state, and the antigen detection site contains Immobilize the virus antigen-specific antibody, and immobilize the immunoglobulin protein-specific antibody of the animal species used as the labeled antibody on the reaction termination determination site.
(3) By dropping the specimen at the specimen dropping site, the specimen is moved in the porous carrier to elute the canine coronavirus antigen-specific labeled antibody and immobilize the canine coronavirus antigen-specific antibody. Detecting the canine coronavirus antigen in the sample by allowing the antigen detection site and the immunoglobulin protein-specific antibody to pass through a reaction termination determination site immobilized thereon,
A kit for detecting canine diarrhea virus antigen, comprising:
（１）多孔質キャリアに、検体滴下部位、標識抗体含有部位、抗原検出部位及び反応終了判定部位とを順次形成してなり、
（２）標識抗体含有部位には湿潤状態において多孔質キャリア上を抗原検出部位から反応終了判定部位へと順次移動し得る、イヌコロナウイルス抗原特異的標識抗体及びイヌパルボウイルス抗原特異的標識抗体を含有せしめ、抗原検出部位にはイヌコロナウイルス抗原特異的抗体及びイヌパルボウイルス抗原特異的抗体を固相化し、反応終了判定部位には、標識抗体として使用した動物種の免疫グロブリンタンパク質特異的抗体を固相化し、
（３）もって、検体を検体滴下部位に滴下することにより、検体を多孔質キャリア内で移動せしめて、イヌコロナウイルス抗原特異的標識抗体及びイヌパルボウイルス抗原特異的標識抗体を溶出させ、イヌコロナウイルス抗原特異的抗体及びイヌパルボウイルス抗原特異的抗体を固相化した抗原検出部位及び免疫グロブリンタンパク質特異的抗体を固相化した反応終了判定部位を通過せしめることにより、検体中の該イヌコロナウイルス抗原及び該イヌパルボウイルス抗原を検出すること、
を特徴とする犬下痢症ウイルス抗原検出用キット。A dog diarrhea virus antigen detection kit for detecting canine coronavirus antigen and canine parvovirus antigen,
(1) a sample in which a sample dropping site, a labeled antibody-containing site, an antigen detection site, and a reaction termination determination site are sequentially formed on a porous carrier;
(2) In the labeled antibody-containing site, a canine coronavirus antigen-specific labeled antibody and a canine parvovirus antigen-specific labeled antibody capable of sequentially moving from the antigen detection site to the reaction termination determination site on the porous carrier in a wet state are used. The canine coronavirus antigen-specific antibody and canine parvovirus antigen-specific antibody were immobilized on the antigen detection site, and the immunoglobulin protein-specific antibody of the animal species used as the labeling antibody was used as the reaction end determination site. Immobilized,
(3) By dropping the sample at the sample drop site, the sample is moved in the porous carrier, and the canine coronavirus antigen-specific labeled antibody and the canine parvovirus antigen-specific labeled antibody are eluted. By passing the antigen detection site where the virus antigen-specific antibody and the canine parvovirus antigen-specific antibody are immobilized and the reaction termination determination site where the immunoglobulin protein-specific antibody is immobilized, the canine coronavirus Detecting the antigen and the canine parvovirus antigen;
A kit for detecting canine diarrhea virus antigen, comprising:
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| Country | Link |
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| JP (1) | JP2004219346A (en) |
Cited By (3)
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|---|---|---|---|---|
| JP2007057495A (en) * | 2005-08-26 | 2007-03-08 | Tottori Univ | Kit for detecting parvovirus antigen |
| JP7036979B1 (en) * | 2021-04-02 | 2022-03-15 | ライオン株式会社 | Inspection method |
| WO2022210307A1 (en) * | 2021-04-02 | 2022-10-06 | ライオン株式会社 | Test method |
-
2003
- 2003-01-17 JP JP2003009057A patent/JP2004219346A/en active Pending
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