JP2004219271A

JP2004219271A - Device for analysis, device for identifying snps, liquid supplying apparatus, inspecting device, and temperature treating apparatus

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Publication number: JP2004219271A
Application number: JP2003007487A
Authority: JP
Inventors: Minoru Sakata; 稔坂田; Akira Yabe; 明矢部; Mitsuru Fujii; 充藤井; Yuriko Endo; 百合子遠藤
Original assignee: DEVICE NANOTECH Research INST K; DEVICE NANOTECH Research INSTITUTE KK
Current assignee: DEVICE NANOTECH Research INST K; DEVICE NANOTECH Research INSTITUTE KK
Priority date: 2003-01-15
Filing date: 2003-01-15
Publication date: 2004-08-05

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a device for analysis capable of reducing costs and improving throughput in the typing of SNPs or the like, and to provide a liquid supplying apparatus, and the like. <P>SOLUTION: In an SNPs typing element 10, liquids, such as a DNA sample and a reagent, are thrown in. The SNPs typing element 10 is equipped integrally with a dropping mixing section 20 for mixing the liquids; a temperature treatment section 40 for providing a specific temperature cycle to the mixed liquids; a dilution section 50, and an inspection section 60. Then, at the dropping mixing section 20 and the temperature treatment section 40 in the SNPs typing element 10, a conveyance section 30 is continuously formed in zigzags to a plurality of throw-in section 21 and heater sections 41, 42, and 43. Additionally, at the dropping mixing section 20, the heater is used for expanding gas in a reserver, thus dropping a minute amount of liquid. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えばＳＮＰｓ（一塩基多型）の同定等に用いて好適な解析用デバイス、液体供給装置等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ＤＮＡ（ＤｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ）配列の解読が注目を浴びているのは周知の通りである。現状では、ヒトの一般的なＤＮＡ配列については９０％以上の解読が完了している。今後は、ポストゲノム等と称され、個人毎に特有なＤＮＡの配列の解読が望まれており、これが実現することで、個人毎のＤＮＡ配列に基づいた医療や投薬が可能になると言われている。
【０００３】
このような個人毎のＤＮＡ配列において、ＳＮＰｓ（ＳｉｎｇｌｅＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：一塩基多型）の同定（タイピング）が必要とされている。ＳＮＰｓは、個人間における１塩基の違い（置換、挿入、欠失）を意味し、特に疾患リスクの大小及び薬剤の効果や副作用の程度を決定する因子を含んでいる。医療の分野で待望されているテーラーメイド医療（個人の遺伝子のタイプに応じて最適な薬品を投与する治療法）実現のためには、まずＳＮＰｓタイピングにより、個々のＳＮＰｓと疾患へのかかりやすさ、薬剤の効果、副作用の程度等の関係を明確にする必要がある。
【０００４】
ＳＮＰｓタイピングの手法としてはハイブリダイゼーション法、蛍光共鳴エネルギー移動法、プライマ−伸長法等があるが現在では得られるデータの精度及び信頼性からハイブリダイゼーション法が主流となっている。
ハイブリダイゼーション法の一例としてＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．のＳＮＰｓ検出システムがある。これは、ＤＮＡチップを用い、既知の一つのＳＮＰｓに対し、このＳＮＰｓを含むオリゴヌクレオチドアレイ（ＤＮＡ）を準備し、これらにＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ：ポリメラーゼ連鎖反応）法で増幅したＤＮＡ断片が、ハイブリダイズするか否かによりＳＮＰｓを検出するものである。
ＤＮＡチップは、ＡｆｆｙｍａｘＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＮ．Ｖ．社の発明（特許文献１）やＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．の発明（特許文献２）に端を発したデバイスで、半導体膜やスライドグラス等の平板に、サンプルＤＮＡやＰＣＲ反応に用いられる試薬を含む緩衝溶液等を、１００００個以上アレイ状にスポットするものであり、ＳＮＰｓだけでなくＤＮＡ解析にも用いられるものである。
【０００５】
【特許文献１】
米国特許第５４４５９３４号明細書
【特許文献２】
米国特許第５７４４３０５号明細書
【０００６】
また、ハイブリダイゼーションの有無を、効率よく検出する手法として、オリンパス光学工業株式会社とＥＶＯＴＥＣＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社が共同開発した１分子蛍光検出法がある。この手法では共焦点光学系によりフェムトリットル領域中に存在する蛍光信号を高感度に検出することができる。その後、得られた蛍光分子（ハイブリダイズされたＤＮＡあるいはラベルプライマー）の熱揺らぎによる蛍光強度揺らぎを自己相関解析することにより、ハイブリダイズされたＤＮＡが存在するかどうかを精度良く判定することが可能となる。この手法によれば、１サンプルあたり数秒で増幅されたか否かを検出することができ、既に検出装置も市販されている。
【０００７】
図９は、上記したような手法の流れを示すもので、まず、平板上に、サンプルＤＮＡやＰＣＲ反応に用いられる試薬を含む緩衝溶液等を、アレイ状にスポットすることで、ＤＮＡアレイを作成する（ステップＳ１０１）。
続いて、ＤＮＡアレイ上のサンプルＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅（ハイブリダイゼーション）する（ステップＳ１０２）。ＰＣＲ法では、例えば９６℃→５０℃→７２℃という温度履歴をサンプルに与えることで、ＤＮＡの２本鎖を解き（メルティング）→１本鎖状のＤＮＡ上へプライマを配置し（アニール）→ＤＮＡポリメラーゼを用いた相補鎖ＤＮＡの合成（イクステンション）という反応を順次起こすことができる。この１サイクルの反応で、当初１本であったＤＮＡは２本に増幅される。このサイクルを必要なだけ繰り返すことで、サンプルＤＮＡを伸長させ、増幅するのである。
この後、増幅させたサンプルＤＮＡを、上記の１分子蛍光検出法により解析し、サンプルＤＮＡが増幅されたか否かを検出した後、その結果に基づいて塩基配列を解析するのである（ステップＳ１０３〜Ｓ１０４）。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記のような従来の手法では、さらなる高スループット化、低コスト化が望まれている。
ＤＮＡの解析を、個人毎の差までを含めて完全に行うには、現状の設備、手法でのスループットを毎年２倍ずつ向上させたとしても、数十年掛かると言われている。
【０００９】
また、ＳＮＰｓタイピングで疾患等とＤＮＡの関係を解析するにしても、一つの疾病とＳＮＰｓとの関係を明らかにするには、例えばその疾病の患者グループ５００人、健常者グループ５００人を対象として解析を行うわけであるが、一人あたり１０万と言われるＳＮＰｓサイトを解析するには、
（５００人＋５００人）×１０万ＳＮＰｓサイト＝１億回
のＳＮＰｓタイピングが必要となる。
現状、世界最大の施設においても、ＳＮＰｓタイピングのスループットは、１年あたり１億回と言われている。
コスト面でも、１タイピングあたり、現状では１００〜２００円となっており、一つの疾病について解析するには１００〜２００億円を要している。
このため、医療に有効に用いることができるよう、多くの疾病について解析を行うには、ＳＮＰｓタイピングにおいても遥かな高スループット化、低コスト化が必要となっている。
【００１０】
このような観点において、従来の手法を検討すると、一つには、上記のＤＮＡアレイを用いていることが、低コスト化の妨げになっている。ＤＮＡアレイでは、平板に、サンプルＤＮＡやＰＣＲ反応に用いられる試薬を含む緩衝溶液等をスポット（滴下）するわけであるが、現状の技術では、微小量の液体のハンドリングが困難なことから、１サンプルあたり、１〜１０μＬのオーダでスポットするのが限界である。
これに対し、ＳＮＰｓタイピングの際の１分子蛍光検出法では、１ｆＬのサンプルがあれば検出を行うことが可能となっており、残りのサンプルは、いわば余剰となっている。
このようなＳＮＰｓタイピングでは、特に試薬が高価であるため、上記のように多数回の解析を行うと、試薬のコストが飛躍的に高くなってしまうのである。
【００１１】
また、従来の手法では、ハイブリダイゼーションに、サーマルサイクラを用いていることが、高スループット化の大きな妨げとなっている。
サーマルサイクラでは、上記したように、例えば９６℃、５０℃、７２℃という３段階の温度環境のサイクルを所定回数繰り返すわけであるが、ハイブリダイゼーションを行うには、各段階の温度環境を高い精度で提供する必要がある。このため、サーマルサイクラでは、大型のヒートシンク等を設け、高い温度精度を保っている。その結果、ヒータで加熱あるいは冷却する対象の熱容量が非常に大きくなり、各段階間で温度を上昇あるいは下降させるのに、ほとんどの時間を費やしている。サーマルサイクラで、例えば４０サイクルを繰り返すには５時間程度を要し、１サンプルあたりに換算しても２０秒／１サンプル程度を要している。
これに対し、ＳＮＰｓタイピングの際の１分子蛍光検出法では、１サンプルあたり数秒で検出を行うことができており、ハイブリダイゼーション工程が、スループットの向上を妨げていると言える。
【００１２】
加えて、従来ＤＮＡアレイを作成する際、多数のサンプルＤＮＡをスポットした平板上に、一つの試薬を塗布している。これは、試薬により、サーマルサイクラで提供する各段階の温度環境が異なるからである。このため、ＳＮＰｓタイピングは、一つの試薬毎に行うしかなく、これも高スループット化の妨げとなっている。
【００１３】
本発明は、このような技術的課題に基づいてなされたもので、ＳＮＰｓのタイピング等を低コスト化、高スループット化することのできる解析用デバイス、液体供給装置等を提供することを目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
かかる目的のもと、本発明は、ＤＮＡの解析用デバイスであって、解析対象となるＤＮＡ等の試料、当該試料に混合する試薬等、試料を含む複数種の液体を滴下・混合する滴下混合部と、滴下混合部で滴下・混合された、ＤＮＡ等の試料を含む液体中に含まれる試料を増幅させる増幅処理部と、を備えることを特徴とする。
この解析用デバイスでは、被検体となるＤＮＡサンプル（試料）や試薬等を混合するだけでなく、増幅処理までを行うことができる。
【００１５】
滴下混合部としては、複数種の液体を滴下・混合できるのであればいかなる構成を採用してもよいが、例えば、一筆書き状に連続する搬送部を設け、この搬送部に対して臨むよう複数の液体滴下部を設けるのが好ましい。このような滴下混合部では、第一の液体滴下部から液体を滴下し、滴下されたこの液体を一筆書き状の搬送部に沿って搬送していく。そして、搬送部を搬送される前記の液体に対し、第二の液体滴下部から他の種類の液体を滴下させる（ぶつける）ことで、第一の液体滴下部から滴下された液体と、第二の液体滴下部から滴下された液体とを混合することができる。もちろん、三種類以上の液体を混合する場合には、これをさらに繰り返せば良い。
このとき、液体滴下部は、液体を気体とともに貯留するリザーバ部と、リザーバ部と搬送部を連結する連結部と、リザーバ部内の気体を膨張させる気体膨脹部と、を備える構成とすることができる。このような構成では、リザーバ部に貯留された気体をヒータ等の気体膨張部で膨張させると、リザーバ部に貯留された液体が連結部を介して搬送部に押し出される。このとき気体膨張部で気体の膨張量を制御することで、液体を搬送部に対して微少量で滴下させることが可能となる。
この他に、液体の滴下方法としては、インクジェットやバブルジェットと同様の技術を用いることもできる。
【００１６】
そして、このようにして滴下・混合された、ＤＮＡサンプル（試料）や試薬等を滴下・混合した後、これを増幅処理部で増幅するのである。
このような解析用デバイスにおいて、増幅処理部は、滴下混合部で滴下・混合された液体が複数のヒータに臨む位置を順次通過するパスを、搬送部が一以上有する構成を採用することができる。
これにより、液体がヒータに臨む位置を順次通過することになるので、ヒータの温度を変動させることなく、液体に対し温度サイクル（履歴）を与えることができる。特に、搬送部に、液体が複数のヒータに臨む位置を順次通過するパスを複数設ければ、複数回の温度サイクルを液体に与えることができる。
増幅処理部では、ＤＮＡ等の試料を含む液体を増幅できるのであれば、上記のような温度処理以外の処理手法を採用することもできる。
また、このような解析用デバイスには、増幅処理部の後段側に、増幅処理部を経た液体に希釈液を供給する希釈部をさらに備えることもできる。
このような解析用デバイスは、ＳＮＰｓの同定（タイピング）用として好適に用いることができる。
【００１７】
本発明を、ＳＮＰｓの同定用デバイスと捉えれば、これは、解析対象となるＤＮＡ試料を含む複数種の液体を滴下・混合する滴下混合部と、滴下混合部で滴下・混合された液体に対し所定の温度処理を施す温度処理部と、を備えることを特徴とすることができる。
【００１８】
微少量の液体のハンドリングを向上させると言う観点からすれば、上記のようなＤＮＡ解析、ＳＮＰｓタイピングだけでなく、例えば複数種の化学物質どうしの化学反応を見るためのマイクロリアクタ等にも本発明を適用することが考えられる。
このような液体供給装置としての本発明は、液体を気体とともに貯留するリザーバ部と、リザーバ部の下端に連続して形成され、リザーバ部に貯留された液体が通過する通過部と、リザーバ部内を加熱するヒータと、ヒータの作動を制御するヒータ制御部と、を備えることを特徴とする。
このような液体供給装置では、リザーバ部内で、液体が下方に貯留して液層を形成し、気体がその上方に貯留して気層を形成する。そして、ヒータ制御部でヒータを作動させてリザーバ部内を加熱することで、リザーバ部内の気層の気体を膨張させると、その膨張量に応じ、液層の液体をリザーバ部から通過部に滴下させることができる。
このような構成により、液体を微少量で滴下させることが可能となる。このとき、リザーバ部は、通過部から上方に向けてその内径が漸次拡大するテーパ部を有する構成とするのが好ましい。このようなテーパ部では、通過部側の内径が小さくなるので、液体の滴下量の微小化に貢献する。
このような液体供給装置は、ＤＮＡ解析やＳＮＰｓタイピングだけでなく、化学物質を混合して反応させるためのマイクロリアクタ等、さまざまな用途に適用することができる。
【００１９】
また、リザーバ部、通過部、ヒータを複数組設け、各組の通過部を、連続する搬送部に臨むように設けると、この搬送部に対し、各組のリザーバ部から通過部を介して液体を滴下できる。
このときに、搬送部で搬送される液滴の位置を位置検出部で検出し、この液滴の位置に基づいて、各組のヒータの作動をヒータ制御部で制御するようにして滴下のタイミングをコントロールすれば、搬送部内で、複数組のリザーバ部から滴下した液体を混合することができる。これにより、リザーバ部に貯留する液体の種類を組毎に異ならせれば、多種多様の組み合わせで液体を混合できる。
このような搬送部は、一直線状として、各組の通過部をこれに沿って配列するようにしてもよいが、各組の通過部をマトリックス状に配列し、搬送部を、これらマトリックス状に配列された各組の通過部に臨むよう、一筆書き状に形成するのが、スペースの有効利用の面で好ましい。
【００２０】
ところで、気体の膨張力を利用して液体を滴下させるには、リザーバ部を密閉空間とするのが好ましい。ただし、リザーバ部に液体を補給する必要があることから、リザーバ部は上方に開口した開口部を有するのが通常である。その場合、リザーバ部内の下部に液体が貯留され、かつ液体の上部に気体が貯留された状態で、開口部を封止する封止部材を装着できるようにして、リザーバ部を密閉可能とするのが好ましい。
封止部材としては、蓋や粘着テープ等がある。蓋の場合は、リザーバ部の開口部に着脱可能、あるいは開閉可能に備えるのが好ましい。また、各組のリザーバ部の間隔を小さくする場合、蓋を設けたり、蓋を着脱するのは困難となるため、粘着テープ等を開口部に貼り付けるのが好ましい。
【００２１】
本発明は、複数種の液体を組み合わせて検査を行うための検査デバイスとして捉えることもできる。この検査デバイスは、基端から終端まで連続する搬送部に対し、複数の液体滴下部が間隔を隔てて配置される。そして、液体滴下部から液体が搬送部に対して滴下されて液滴となると、搬送部で搬送される液滴の位置は、位置検出部で検出され、その位置に基づいて、他の液体滴下部における液体の滴下を制御部で制御する。これにより、液滴を搬送部内で間隔を隔てて搬送したり、あるいは一つの液体滴下部から滴下されて搬送部内を搬送される液滴に対し、他の液体滴下部から滴下した液滴をぶつけ、複数種の液体を混合することができる。
このような液体滴下部は、所定列×所定行を有したマトリックス状に配置することができ、その場合、搬送部は、マトリックス状に配置された液体滴下部に対し、ミアンダ（ｍｅａｎｄｅｒ）状に形成するのが好ましい。
このような検査デバイスでは、複数種の液体を組み合わせて混合し、検査に供することができる。この場合、液体は、ＤＮＡサンプル等に限らず、様々な液体を対象とすることができる。
また、液体滴下部では、上述したような、ヒータでリザーバ部内の気体を膨張させる構成が好適であるが、これに限らず、他の様々な滴下手段を採用してもよい。例えば、リザーバ部に対し、搬送部側から負圧を与えて液体を滴下させることもできる。これには、搬送部側に負圧の流体を流しても良いし、また、搬送部側で冷却することで、負圧を発生させるようにすることも可能である。
【００２２】
このようにして搬送部で搬送される液滴に対しては、所定の温度処理を施す温度処理部をさらに備えることができる。その場合、制御部は、位置検出部で検出される搬送部での液滴の位置に基づいて、温度処理部で施す温度処理の条件を制御する。これにより、混合した液体の種類に応じ、与える温度処理条件を変更することができる。
【００２３】
また、液体滴下部は搬送部の注入された溶媒中に液体を滴下することも可能である。この場合、溶媒としては、液体と混合しない特性を有したものであれば良く、例えば非水溶媒を用いることができる。このように液体が滴下された溶媒を搬送部で搬送するには、例えば、搬送部の壁面に発生させる静電力を用いたり、搬送部を加圧したり負圧とすることで発生させた圧力差を用いることが可能である。
【００２４】
さて、本発明は、一方向に連続して設けられた温度処理ヒータと、温度処理ヒータを複数回通過するように連続して形成された搬送部と、搬送部で搬送される液滴の位置を検出する位置検出部と、位置検出部で検出される搬送部での液滴の位置に基づいて、温度処理ヒータで液滴に対して施す温度処理の条件を制御する温度処理制御部と、を備えることを特徴とする温度処理装置として捉えることもできる。
この場合、搬送部は、温度処理ヒータを複数回通過するように連続して形成される。つまり、温度処理ヒータが一方向に連続する棒状である場合、搬送部は、温度処理ヒータが連続する方向とは交差する方向にミアンダ状に連続することになる。
これにより、搬送部を搬送される液滴は、温度処理ヒータを複数回通過することで、複数回の温度サイクルを受けることになる。
なお、温度処理ヒータは、複数を並列して設けても良い。また、温度処理ヒータは、それが連続する方向に複数を直列に設けることもできる。その場合、温度処理制御部は、位置検出部で検出される搬送部での液滴の位置に基づいて、液滴に対して温度処理を施す温度処理ヒータを切り替えることもできる。
これとは別に、温度処理制御部は、位置検出部で検出される搬送部での液滴の位置に基づいて、温度処理ヒータの温度を制御することも可能である。その場合、温度処理ヒータの温度変更による時間のロスを抑えるため、温度処理制御部における温度処理ヒータの温度変更が最小限で済むよう、搬送部に投入する液滴の順序を設定するのが好ましい。
【００２５】
【発明の実施の形態】
以下、添付図面に示す実施の形態に基づいてこの発明を詳細に説明する。
図１は、本実施の形態におけるＳＮＰｓタイピング素子（解析用デバイス、ＳＮＰｓの同定用デバイス、検査デバイス）１０の構成を説明するための図である。
この図１に示すように、ＳＮＰｓタイピング素子１０は、滴下混合部２０、搬送部３０、温度処理部（増幅処理部）４０、希釈部５０、検査部６０、排出部７０を有している。
このようなＳＮＰｓタイピング素子１０は、例えば３枚の基板１１、１２、１３を積層して組み合せることで形成される。
【００２６】
滴下混合部２０としては、基板１１の上面に突起した投入部（液体滴下部）２１が縦横所定間隔毎にマトリックス状に設けられている。
図２、図３に示すように、各投入部２１は、その外径が上方から下方にいくにしたがい拡大する形状とされている。そして、各投入部２１には、ＤＮＡサンプル（試料）や試薬、緩衝液を投入するためのリザーバ孔（リザーバ部）２２が、投入部２１の上面に開口して形成されている。このリザーバ孔２２は、例えば平面視円形で、投入部２１の上面側から所定寸法の範囲は内径が一定のストレート部２２ａとされ、このストレート部２２ａの下方は、基板１１の下面に向けてその内径がテーパ状（スリ鉢状）に漸次縮小とするテーパ部２２ｂとなっている。
そして、図３に示したように、テーパ部２２ｂ（あるいはストレート部２２ａでもよい）の壁面（あるいはその近傍）には、ヒータ（気体膨張部）２３が設けられている。このヒータ２３は、リング状の環状体、あるいは環状体が複数に分割された扇状で、図示しないコントローラ（ヒータ制御部、制御部）によってそのオン・オフが制御されるようになっている。
基板１２には、リザーバ孔２２に連続して、テーパ部２２ｂの下端と同径のストレート状の滴下孔（連結部、通過部）２４が形成されている。
【００２７】
図４は、ＳＮＰｓタイピング素子１０の各部における作用、つまり液体１００の滴下・混合、温度処理、希釈等の工程を示すための図である。これらの工程を示すため、便宜上、滴下混合部２０、温度処理部４０、希釈部５０、検査部６０を、後述する搬送部３０に沿った適宜断面で断面視した図であり、必ずしも実際の図１等に正確に対応した断面図ではない。
図４（ａ）に示すように、このような滴下混合部２０では、各投入部２１のリザーバ孔２２に、ＤＮＡサンプルや試薬、緩衝液等の液体１００を投入する。すると液体１００は、液体１００自体の表面張力、後述する搬送部３０の内圧等によって、リザーバ孔２２のテーパ部２２ｂの下部に溜まった状態で保持される。
図４（ｂ）に示すように、投入部２１の上面の開口部を、別途取り付けられる蓋体あるいは粘着テープ２５等の封止部材で封止し、リザーバ孔２２内を液体１００と気体（大気あるいは置換ガス）１０１を密閉した後、ヒータ２３をコントローラでオンにすると、リザーバ孔２２内で液体１００の上方に位置する気体１０１がヒータ２３の熱により膨張する。この気体１０１の膨張により、液体１００がテーパ部２２ｂの下端から押し出され、下方の滴下孔２４に滴下されるようになっている。
【００２８】
このとき、リザーバ孔２２から滴下される液体１００の量を微小な所定量とするため、ヒータ２３をオンにする時間（の長さ）を、予め設定した所定時間とするのが好ましい。ヒータ２３をオンにする時間自体は、リザーバ孔２２や滴下孔２４の内径等に応じ、適宜設定すればよい。また、雰囲気温度による滴下量の精度が低下するのを防ぐため、単にヒータ２３をオン・オフするのではなく、ヒータ２３を予め所定の一定温度にしておき、液体１００を滴下するときに、ヒータ２３を所定時間だけ加熱させるようにするのが好ましい。
このような構成を採用することで、滴下混合部２０では、液体１００を、ｐＬ（ピコリットル）のオーダで滴下することが可能となる。
【００２９】
搬送部３０は、滴下混合部２０の各投入部２１で滴下された液体１００（以下、滴下された液体１００を液滴１０２と称する）を、滴下混合部２０内で各投入部２１間を循環して搬送するとともに、後工程の温度処理部４０、希釈部５０、検査部６０、排出部７０に搬送するものである。
図１、図５に示すように、この搬送部３０は、基板１２の下面にチャンネル（溝）３１が形成されることで構成されている。
このチャンネル３１は、滴下混合部２０に対応した部分において、全ての投入部２１の滴下孔２４がチャンネル３１の底面（上面）に開口するよう、一筆書き状に連続して形成されている。図５の例では、チャンネル３１は、滴下混合部２０に対応した部分において、その基端部３１ａから、温度処理部４０側の端部３１ｂまで、滴下混合部２０の両側の端部２０ａ、２０ｂで折り返されることでジグザグ状（ミアンダ状）に形成されている。
また、このチャンネル３１は、温度処理部４０、希釈部５０においても、同様に、一筆書き状に連続するよう、例えば温度処理部４０、希釈部５０の両側の端部４０ａ、４０ｂ、５０ａ、５０ｂで折り返されることで、それぞれの領域で、全体としてジグザグ状に形成されている。
図１に示したように、このようなチャンネル３１が下面に形成された基板１２には、基板１３の上面が対向して取り付けられ、これによってチャンネル３１と基板１３とに囲まれた空間が搬送部３０として機能するのである。
【００３０】
このような搬送部３０には、チャンネル３１の上底面に開口した各投入部２１の滴下孔２４から液滴１０２が滴下される。この搬送部３０には、滴下された液滴１０２を搬送部３０が連続する方向に搬送するための搬送機構が備えられている。
この搬送機構としては、一つには親水性を用いたものがある。これには、図６（ａ）に示すように、搬送部３０の相対向する面、例えばチャンネル３１の上底面と基板１３の上面に、搬送部３０が連続する方向において所定間隔毎に、対となる電極３２Ａ、３２Ｂを設ける。そして、それぞれの電極３２Ａ、３２Ｂは、絶縁膜３３Ａ、３３Ｂで被覆する。一方の電極３２Ａは図示しないコントローラの制御により、電圧の印加がオン・オフされるようにし、他方の電極３２Ｂは、接地（ＧＮＤ）させる。また、電圧が印加される電極３２Ａの絶縁膜３３Ａは、それ自体、あるいはさらにその外表面に形成された被覆膜が、シリコン、テフロン（四フッ化エチレン）等、電圧によって親水性が変化する物質によって形成されている。
このような親水性を用いた搬送機構では、一方の電極３２Ａに印加する電圧を変動（オン・オフ）させることで、絶縁膜３３Ａあるいはその被覆膜の親水性を変化させる。
液滴１０２は、その表面張力により親水性が高い方向に引き寄せられるので、下流側の電極３２Ａに電圧を印加することで、液滴１０２の前後方向の親水性のバランスを崩し、親水性の高い下流側の電極３２Ａの側に液滴１０２を引き寄せることができる。これを利用し、コントローラで、電圧を印加する電極３２Ａの位置を所定時間毎に搬送部３０の下流側に向けて順次移行させることで、液滴１０２を搬送部３０に沿って下流側に搬送するのである。
【００３１】
また、他の搬送機構として、静電力を利用したものもある。これは、図６（ｂ）に示すように、搬送部３０の相対向する面、例えばチャンネル３１の上面と基板１３の上底面に、搬送部３０が連続する方向において所定間隔毎に、対となる電極３４Ａ、３４Ｂを設ける。そして、それぞれの電極３４Ａ、３４Ｂは、絶縁膜３５Ａ、３５Ｂで被覆する。一方の電極３４Ａは図示しないコントローラの制御により、電圧の印加がオン・オフされるようにし、他方の電極３４Ｂは、接地（ＧＮＤ）させる。
このような搬送機構では、一方の電極３４Ａに電圧を印加した状態では、液滴１０２にプラスのチャージ（図６（ｂ）中、“＋”で表記）が励起される。そして、この電極３４Ａに対する電圧の印加を停止すると、プラスのチャージはイオンに復帰するわけであるが、イオンに復帰するには時間（この時間はチャージ緩和時間：誘電率ε／導電率σと称され、例えば水の場合はμｓｅｃオーダの時間）がかかる。このチャージ緩和時間の間、つまりプラスのチャージが消滅するまでの間に、隣接する下流側の電極３４Ａに電圧を印加することで、静電力を発生させ、これによって液滴１０２を下流側の電極３４Ａに引き寄せることができる。
これを利用し、コントローラで、電圧を印加する電極３４Ａの位置を所定時間毎に搬送部３０の下流側に向けて順次移行させることで、液滴１０２を搬送部３０に沿って下流側に搬送するのである。
【００３２】
この他にも、搬送機構としては、搬送部３０（チャンネル３１）の基端部と終端部に、負圧ポンプや加圧ポンプ、コンプレッサ等の圧力付与手段で圧力差を生じさせ、これによって液滴１０２を搬送する構成が採用できる。
【００３３】
ところで、上記したような各種の搬送機構により、複数の投入部２１の滴下孔２４から滴下した複数の液滴１０２は、混合することなく搬送部３０内で間隔を隔てて搬送することができるわけであるが、図６（ｃ）に示すように、互いに前後する液滴１０２間に、非水溶媒（水溶液と混ざらない溶媒）からなる流体１０３を介在させることも可能である（もちろん、介在させなくても良い）。
このような流体１０３は、搬送部３０（チャンネル３１）の基端部側から、シリンジポンプ等で注入すればよい。これにより、液滴１０２は、注入された流体１０３中に滴下されることになる。
この流体１０３を、液滴１０２間に介在させる（満たす）ことで、この流体１０３を液滴１０２の搬送液として機能させることができるのである。
【００３４】
また、異なるＤＮＡサンプル、あるいは異なる試薬を搬送部３０で搬送するとき等には、ＤＮＡサンプル等が搬送部３０の内壁面に付着する可能性がある。このため、搬送部３０で搬送するＤＮＡサンプルや試薬の種類が変わるときには、搬送部３０内を洗浄する洗浄液を搬送部３０に流すようにしても良い（もちろん、流さなくても良い）。
これには、ＤＮＡサンプル等と同様、所定の投入部２１に洗浄液を投入し、これを投入孔から液滴１０２として滴下することができる。また、上記したように、非水溶媒からなる流体１０３として、この洗浄液を互いに前後する液滴１０２間に流すことも好ましい。
【００３５】
上記のような搬送機構により、搬送部３０では各投入部２１から滴下された液滴１０２を搬送する。
このとき、図４（ｃ）に示すように、滴下混合部２０において、任意の一つの投入部２１から滴下され、搬送部３０により搬送される液滴１０２に対し、任意の他の投入部２１から他の液体１００の液滴１０２を滴下させ（ぶつける）、双方を混合させることもできる。これにより、例えばＤＮＡサンプルに、試薬を混合させる等が可能となるのである。
【００３６】
これを実現するため、搬送部３０においては、搬送する液滴１０２の位置を検出する必要がある。この位置検出機構（位置検出部）としては、搬送部３０（チャンネル３１）の側面に、間隔を隔てて複数対の電極（図示無し）等のセンサを設け、対となる電極（センサ）間で静電容量等をモニタすることで、液滴１０２の位置を検出する構成がある。もちろん、液滴１０２の位置を検出できるのであれば、上記以外の方式のセンサを設けても良い。
また、上記したような、図６（ａ）、（ｂ）に示した、親水性や静電力を利用した搬送機構を採用する場合には、電圧を印加する電極３２Ａ、３４Ａの位置をコントローラは認識することができるので、その位置に基づき、液滴１０２の位置を検出することもできる。
このようにして、コントローラ（図示無し）で、各投入部２１から投入されて搬送部３０を下流に向けて搬送される液滴１０２の位置を検出しつつ、この液滴１０２に対し、他の投入部２１から液滴１０２を滴下してぶつけ、混合させることができる（以下、混合後の液滴１０２を液滴１０２’と適宜称する）。これにより、複数の投入部２１から投入した複数種（２つとは限らず、３つ以上でも良い）の液滴１０２を搬送部３０内で混合し、さらにこれを下流側に搬送することができるのである。
【００３７】
さて、温度処理部４０は、例えば３個のヒータ部４１、４２、４３を備えている。図７に示すように、これらヒータ部４１、４２、４３は、基板１３において、搬送部３０に露出あるいは近接して設けられている。ヒータ部４１、４２、４３のそれぞれは、温度処理ヒータ４４と、センサ４５を備えて構成されている。そして、ヒータ部４１の温度処理ヒータ４４は例えば９６℃に設定され、ヒータ部４２の温度処理ヒータ４４は例えば７２℃に設定され、ヒータ部４３の温度処理ヒータ４４は例えば５０℃に設定される。
また、ヒータ部４１、４２、４３のそれぞれに設けられたセンサ４５は、液滴１０２の位置（有無）を検出するためのものである。このセンサ４５は、その長さ方向に周期的に分断されており、後述する各パス３０ｐ毎に独立して液滴１０２の位置検出を行うことができる。
【００３８】
図５に示したように、このような温度処理部４０に対し、前記搬送部３０は、その両側の端部４０ａ、４０ｂで折り返させてジグザグ状に形成されることで、混合後の液滴１０２’がヒータ部４１、４２、４３をここに記載した通りの順序で通過するパス３０ｐが複数設けられた構成となっている。つまり、ヒータ部４１、４２、４３は、搬送部３０の各パス３０ｐに対し、略直交するように設けられている。
図４（ｄ）に示すように、このような温度処理部４０において、搬送部３０で液滴１０２が搬送されることで、各パス３０ｐにおいて、液滴１０２’がヒータ部４１、４２、４３によって提供される温度環境に晒される。液滴１０２’が複数のパス３０ｐを順次通ることで、ヒータ部４１、４２、４３によって順次提供される温度サイクルが繰り返され、これによってＰＣＲ増幅が行われる。したがって、液滴１０２’が所定回数の温度サイクルを経るようにするため、搬送部３０には、ヒータ部４１、４２、４３の順で通過するパス３０ｐを所定本数設ける必要がある。
【００３９】
また、図７に示したように、互いに隣接するヒータ部４１、４２、４３間での熱伝導を避けるため、基板１３の下面に、エッチング等により、キャビティ４７を形成するようにしても良い。
【００４０】
ところで、液滴１０２に投入された試薬の種類等に応じ、温度処理部４０で与える温度が異なることがある。
これに対応するため、図８に示すように、３個一組のヒータ部４１、４２、４３を、それぞれが連続する方向において複数（例えば３つ、もちろんこれ以外でも良い）に分割したような形態のヒータ部４１Ａ〜４１Ｃ、４２Ａ〜４２Ｃ、４３Ａ〜４３Ｃとしてこれらを直列に配置することもできる。そして、ヒータ部４１Ａ〜４１Ｃ、４２Ａ〜４２Ｃ、４３Ａ〜４３Ｃのそれぞれを、温度処理制御部として機能する図示しないコントローラで独立に温度制御するようにしても良い。
このような構成では、ヒータ部４１Ａ〜４１Ｃ、４２Ａ〜４２Ｃ、４３Ａ〜４３Ｃのうち、液滴１０２’に投入された試薬の種類に対応した温度サイクルを提供する部分において、試薬が反応してＰＣＲ増幅が行われる。
さらには、ヒータ部４１、４２、４３を、搬送部３０のパス３０ｐ毎に分割し、それぞれを独立して温度制御するようにしても良い。
【００４１】
また、液滴１０２’に投入された試薬の種類等に応じ、温度処理部４０で与える温度を異ならせるための構成として、液滴１０２’の位置を検出しつつ、温度処理制御部として機能する図示しないコントローラで、ヒータ部４１、４２、４３の温度処理ヒータ４４の温度を調整する方法もある。
この場合、滴下混合部２０の段階から前記の位置検出機構で液滴１０２’の位置を検出し、その位置に基づき、ヒータ部４１、４２、４３のそれぞれの温度処理ヒータ４４の温度を、コントローラでその液滴１０２’に対応した温度に調整する。このとき、ヒータ部４１、４２、４３のセンサ４５により、液滴１０２’の通過が検出できるので、この液滴１０２’の通過を検出した後、ヒータ部４１、４２、４３の温度処理ヒータ４４を、次の液滴１０２に応じた温度に変更する。
このような方法を採用する場合、ヒータ部４１、４２、４３の温度処理ヒータ４４において温度の上下が煩雑となると、温度処理ヒータ４４の反応時間によって温度処理時間全体が長くなってしまう可能性がある。このため、液滴１０２’を流す順序（投入部２１から投入する順序）を、温度処理部４０での処理温度が近くなる、つまりヒータ部４１、４２、４３の温度処理ヒータ４４の温度変動が小さくなるように設定するのが好ましい。
【００４２】
図４（ｅ）に示したように、希釈部５０は、構造的には図３に示した滴下混合部２０と全く同様であり、複数の投入部２１が設けられ、各投入部２１は、ヒータ２３を備えたリザーバ孔２２と、これに連続する滴下孔２４とを備えている。そして、搬送部３０（のチャンネル３１）が、各投入部２１の滴下孔２４を連続するように形成されている。
このような希釈部５０では、投入部２１に液体１００として希釈液１１０が投入され、搬送部３０によって搬送されてくる温度処理後の液滴１０２’に対し、この希釈液１１０が滴下混合部２０と全く同様のメカニズムで所定量滴下されることで、液滴１０２’が希釈液１１０によって希釈される（希釈後の液滴１０２’を、液滴１０２”と示す）。
【００４３】
図１に示したように、検査部６０は、希釈部５０を経て希釈された液滴１０２”を、１分子蛍光検出装置で検査するための領域であり、例えば、基板１３の上面に、搬送部３０の終端部に連続して凹部６１が形成された構成となっている。図４（ｆ）に示すように、搬送部３０にて搬送された液滴１０２”が、この凹部６１に流れ込み、これを１分子蛍光検出装置の光学系の検出光路上に位置させることで、液滴１０２”における蛍光の有無、あるいはその状態が１分子蛍光検出法により検査されるのである。
【００４４】
また排出部７０は、検査部６０にて検査を行った液滴１０２”を、外部に排出するものである。検査後の液滴１０２を検査部６０から排出部７０に移動させるに際しても、上記の搬送部３０と同様の搬送機構が採用できる。
【００４５】
上述した、ＳＮＰｓタイピング素子１０では、ＤＮＡサンプルや試薬等の液体１００を投入し、これらを混合する滴下混合部２０と、混合された液体１００（液滴１０２）に対し所定の温度サイクルを提供する温度処理部４０とが一体に備えられた構成となっている。そして、コントローラで制御することで、滴下混合部２０でＤＮＡサンプルや、このＤＮＡサンプルに混合する試薬等の滴下・混合を行い、これにより得られた液滴１０２に応じて温度処理部４０で所定の温度サイクルを与えた後、希釈部５０で希釈を行うことができる。
これにより、図９に示したような複数の個別の装置で行われるＤＮＡサンプルの作成工程やハイブリダイゼーション工程を経ることなく、ＳＮＰｓタイピング素子１０上にＤＮＡサンプルや試薬等を投入しさえすれば、その後は図示しないコントローラによる制御で、ハイブリダイゼーション、さらに希釈までを、ＳＮＰｓタイピング素子１０という一つのデバイスで完結して行うことができる。これにより、ＳＮＰｓタイピングを効率良く行うことができる。
【００４６】
さらに詳細に見れば、滴下混合部２０においては、ヒータ２３を用い、リザーバ孔２２内の気体１０１を膨張させることで、液体１００を、ピコリットルという、従来にないオーダの微小量で滴下することができる。これにより、ＤＮＡサンプルや、特に高価な試薬等の使用量を大幅に削減することができ、その結果、ＳＮＰｓタイピングに要するコストの大幅な低減が可能となる。また、液滴１０２の量を微少量とすることで、温度処理部４０における熱の拡散速度も高まり、温度処理も高速化できる。
また、温度処理部４０では、ヒータ部４１、４２、４３に対し、搬送部３０がジグザグ状に設けられることで、所定の順序での温度サイクルを経るパス３０ｐが複数設けられた構成となっている。これにより、ヒータ部４１、４２、４３で提供する温度を変えることなく、一つの液滴１０２に所定回数の温度サイクルを与えることができるので、１サイクル毎にヒータを温度変動させなければならない従来のサーマルサイクラを用いる場合に比較すれば、ＳＮＰｓタイピングのスループットを遥かに向上させることが可能となる。
【００４７】
また、ＳＮＰｓタイピング素子１０の滴下混合部２０では、複数の投入部２１に対し、搬送部３０が連続して形成され、さらに各投入部２１で投入した液滴１０２の位置をコントローラで検出することで、この液滴１０２に対し、他の投入部２１から他の液体１００の液滴１０２を滴下させ、混合させることができる。しかも、温度処理部４０においても、試薬の種類等に応じ、提供する温度環境を変更できる構成とすることが可能である。これにより、複数のＤＮＡサンプルと複数の試薬を自由に組み合わせることが可能となる。つまり、従来のように、一つの試薬毎にＤＮＡアレイを作成する必要もなくなるため、ＳＮＰｓタイピング全体のスループットを向上することができる。
【００４８】
なお、上記実施の形態では、ＳＮＰｓタイピング素子１０を、例えば３枚の基板１１、１２、１３を積層する構成としたが、本発明による構成を実現でき、また加工や組立を行うことが可能であれば、他のいかなる構成を採用しても良い。また、温度処理部４０は、ハイブリダイゼーションに必要な温度サイクルに応じ、ヒータ部４１、４２、４３の数や、提供する温度環境等を適宜変更できる。さらには、液滴１０２をハイブリダイゼーションすることができるのであれば、ＰＣＲ法以外を採用することも可能であり、この場合、温度処理部４０に変えて、他のハイブリダイゼーションのための領域を形成することができる。
もちろん、検査部６０での検査に希釈が不要であれば、希釈部５０を省略することができる。
加えて、検査部６０においても、１分子蛍光検出法以外の検査方法を実施しても何ら支障はない。
【００４９】
ところで、上記したようなＳＮＰｓタイピング素子１０の滴下混合部２０や温度処理部４０は、独立したデバイスとすることもできる。これにより、滴下混合部２０は、微小量の液体１００を滴下する液体供給装置や、複数種の液体１００を自在に混合できる検査デバイスとして構成することができる。また、温度処理部４０は、液滴１０２の種類に応じてヒータ部４１、４２、４３で提供する温度環境を変動させたり、図８に示したようなヒータ部４１Ａ〜４１Ｃ、４２Ａ〜４２Ｃ、４３Ａ〜４３Ｃを備えることで、液滴１０２に応じて提供する温度環境を制御する温度処理装置として構成することができる。
これ以外にも、本発明の主旨を逸脱しない限り、上記実施の形態で挙げた構成を取捨選択したり、他の構成に適宜変更することが可能である。
【００５０】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、ＤＮＡサンプルや試薬等の複数種の液体を投入しさえすれば、その後は、液体どうしの混合、増幅処理までを、一つのデバイスで完結して行うことができる。これにより、ＳＮＰｓタイピング等の解析を効率良く行うことが可能となる。
さらに、温度処理部において、温度処理ヒータを搬送部が複数回通るように設けることで、一つの液滴に所定回数の温度サイクルを与えることができるので、ＳＮＰｓタイピング等の温度処理のスループットを遥かに向上させることが可能となる。
また、本発明によれば、液体を、従来にないオーダの微小量で滴下することができるので、ＤＮＡサンプルや、特に高価な試薬等の使用量を大幅に削減することができ、その結果、コストの大幅な低減が可能となる。
加えて、連続して形成された搬送部に対し、複数の液体滴下部が設けられているので、複数の液体滴下部から滴下した液滴を搬送部で混合させることができる。これにより、複数のＤＮＡサンプルと複数の試薬、あるいは複数の化学物質どうし等を自由に組み合わせることが可能となり、スループットを向上することができる。
このようにして、ＳＮＰｓタイピング等を従来より遥かに高効率で、しかも低コストで行うことが可能となるのである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本実施の形態におけるＳＮＰｓタイピング素子の構成を示す斜視展開図である。
【図２】滴下混合部の構成を示す斜視断面図である。
【図３】滴下混合部の断面図であり、（ａ）は搬送部が連続する方向に沿った断面での図、（ｂ）は（ａ）に直交する断面での図である。
【図４】ＳＮＰｓタイピング素子の各部における作用を示すための図である。
【図５】搬送部の形状を示すための図である。
【図６】搬送部における液滴の搬送機構の複数の例を示す図である。
【図７】温度処理部を示す断面図である。
【図８】温度処理部の他の例を示す図である。
【図９】従来のＳＮＰｓタイピングの流れを示す図である。
【符号の説明】
１０…ＳＮＰｓタイピング素子（解析用デバイス、ＳＮＰｓの同定用デバイス、検査デバイス）、１１、１２、１３…基板、２０…滴下混合部、２１…投入部（液体滴下部）、２２…リザーバ孔（リザーバ部）、２２ｂ…テーパ部、２３…ヒータ（気体膨張部）、２４…滴下孔（連結部、通過部）、２５…粘着テープ（封止部材）、３０…搬送部、３０ｐ…パス、３１…チャンネル、４０…温度処理部（増幅処理部）、４１、４２、４３…ヒータ部、４４…温度処理ヒータ、５０…希釈部、６０…検査部、１００…液体、１０１…気体、１０２、１０２’、１０２”…液滴、１１０…希釈液[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to an analysis device, a liquid supply device, and the like suitable for use in, for example, identification of SNPs (single nucleotide polymorphisms).
[0002]
[Prior art]
It is well known that the decoding of DNA (Deoxyribonucleic Acid) sequences has recently attracted attention. At present, decoding of 90% or more of general human DNA sequences has been completed. In the future, it is called post-genome etc., and it is desired to decode the sequence of DNA unique to each individual, and it is said that by realizing this, medical treatment and medication based on the DNA sequence of each individual will be possible. I have.
[0003]
In such a DNA sequence for each individual, identification (typing) of SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) is required. The SNPs mean a single base difference (substitution, insertion, deletion) between individuals, and particularly include factors that determine the magnitude of disease risk and the degree of drug effects and side effects. In order to realize tailor-made medicine (a treatment method that administers an optimal drug according to the type of an individual's gene), which is expected in the medical field, first, individual SNPs and susceptibility to disease are determined by SNPs typing. It is necessary to clarify the relationship between the effect of the drug and the degree of side effects.
[0004]
The SNPs typing method includes a hybridization method, a fluorescence resonance energy transfer method, a primer-extension method, and the like. At present, however, the hybridization method is mainly used due to the accuracy and reliability of the obtained data.
As an example of the hybridization method, Affymetrix, Inc. SNPs detection system. In this method, for a known single SNP using a DNA chip, an oligonucleotide array (DNA) containing this SNP is prepared, and a DNA fragment amplified by a PCR (Polymerase Chain Reaction) method is added thereto. It detects SNPs depending on whether or not they hybridize.
The DNA chip is manufactured by Affymax Technologies N.D. V. (Patent Document 1) and Affymetrix, Inc. Device (patent document 2) in which 10,000 or more buffer solutions containing sample DNA and reagents used for PCR reaction are spotted on a flat plate such as a semiconductor film or a slide glass in an array form. Which is used not only for SNPs but also for DNA analysis.
[0005]
[Patent Document 1]
U.S. Pat. No. 5,445,934
[Patent Document 2]
U.S. Pat. No. 5,744,305
[0006]
As a technique for efficiently detecting the presence or absence of hybridization, there is a single-molecule fluorescence detection method jointly developed by Olympus Optical Industries, Ltd. and EVOTEC Technologies. In this method, a fluorescent signal existing in the femtoliter region can be detected with high sensitivity by the confocal optical system. Thereafter, it is possible to accurately determine whether or not the hybridized DNA exists by performing autocorrelation analysis on the fluorescence intensity fluctuation due to the thermal fluctuation of the obtained fluorescent molecule (hybridized DNA or label primer). It becomes. According to this method, it is possible to detect whether or not amplification is performed within a few seconds per sample, and a detection device is already commercially available.
[0007]
FIG. 9 shows the flow of the above-described method. First, a DNA array is prepared by spotting a sample DNA or a buffer solution containing reagents used in a PCR reaction in an array on a plate. (Step S101).
Subsequently, the sample DNA on the DNA array is amplified (hybridized) by the PCR method (step S102). In the PCR method, by giving a sample a temperature history of, for example, 96 ° C. → 50 ° C. → 72 ° C., the double strand of DNA is melted (melting) → primers are arranged on single-stranded DNA (annealing). → A reaction called synthesis (extension) of complementary strand DNA using DNA polymerase can be sequentially caused. In this one-cycle reaction, one DNA is initially amplified to two DNAs. By repeating this cycle as necessary, the sample DNA is extended and amplified.
Thereafter, the amplified sample DNA is analyzed by the above-described single-molecule fluorescence detection method to detect whether or not the sample DNA has been amplified, and then to analyze the base sequence based on the result (steps S103 to S103). S104).
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
However, in the conventional methods as described above, further higher throughput and lower cost are desired.
It is said that it will take several decades to completely analyze DNA, including the differences between individuals, even if the throughput with the current facilities and methods is doubled every year.
[0009]
Even if the relationship between a disease or the like and DNA is analyzed by SNPs typing, in order to clarify the relationship between one disease and SNPs, for example, a group of 500 patients with the disease and a group of 500 healthy subjects are targeted. In order to analyze SNPs site which is said to be 100,000 per person,
(500 people + 500 people) x 100,000 SNPs site = 100 million times
SNPs typing is required.
At present, even in the largest facility in the world, the throughput of SNPs typing is said to be 100 million times per year.
The cost is currently 100 to 200 yen per typing, and it takes 10 to 20 billion yen to analyze one disease.
For this reason, in order to analyze many diseases so that they can be used effectively in medical treatment, much higher throughput and lower cost are required for SNPs typing.
[0010]
From this point of view, when examining the conventional methods, the use of the above-mentioned DNA array has hindered the cost reduction. In a DNA array, a buffer solution or the like containing a sample DNA or a reagent used for a PCR reaction is spotted (dropped) on a flat plate. However, with the current technology, it is difficult to handle a very small amount of liquid. The limit is spotting on the order of 1 to 10 μL per sample.
On the other hand, in the single-molecule fluorescence detection method at the time of SNPs typing, detection can be performed if there is a sample of 1 fL, and the remaining samples are, as it were, surplus.
In such SNPs typing, since the reagent is particularly expensive, if the analysis is performed a large number of times as described above, the cost of the reagent will increase dramatically.
[0011]
Further, in the conventional method, the use of a thermal cycler for hybridization is a major hindrance to high throughput.
In the thermal cycler, as described above, a cycle of a three-stage temperature environment of, for example, 96 ° C., 50 ° C., and 72 ° C. is repeated a predetermined number of times. Need to be provided by For this reason, in the thermal cycler, a large heat sink or the like is provided to maintain high temperature accuracy. As a result, the heat capacity of the object to be heated or cooled by the heater becomes very large, and most of the time is spent raising or lowering the temperature between each step. In a thermal cycler, it takes about 5 hours to repeat, for example, 40 cycles, and it takes about 20 seconds / 1 sample in terms of one sample.
On the other hand, in the single-molecule fluorescence detection method at the time of SNPs typing, detection can be performed in a few seconds per sample, and it can be said that the hybridization step hinders improvement in throughput.
[0012]
In addition, when a conventional DNA array is prepared, one reagent is applied on a plate on which many sample DNAs are spotted. This is because the temperature environment of each stage provided by the thermal cycler differs depending on the reagent. For this reason, SNPs typing must be performed for each reagent, which also hinders an increase in throughput.
[0013]
The present invention has been made based on such a technical problem, and an object of the present invention is to provide an analysis device, a liquid supply device, and the like that can reduce the cost and the throughput of SNPs typing and the like. .
[0014]
[Means for Solving the Problems]
With this object in mind, the present invention provides a device for analyzing DNA, in which a plurality of liquids including a sample, such as a sample of DNA or the like to be analyzed and a reagent mixed with the sample, are dropped and mixed. And an amplification processing unit that amplifies the sample contained in the liquid containing the sample such as DNA dropped and mixed in the drop mixing unit.
This analysis device can perform not only mixing of a DNA sample (sample) or a reagent to be an analyte, but also amplification processing.
[0015]
As the dripping / mixing unit, any configuration may be adopted as long as a plurality of types of liquids can be dropped / mixed. Is preferably provided. In such a drop mixing section, the liquid is dropped from the first liquid drop section, and the dropped liquid is transported along a one-stroke transport section. Then, by causing another type of liquid to drip (bump) from the second liquid dropping portion to the liquid conveyed through the transfer portion, the liquid dropped from the first liquid dropping portion is subjected to the second liquid dropping portion. Can be mixed with the liquid dropped from the liquid dropping section. Of course, when mixing three or more types of liquids, this may be further repeated.
At this time, the liquid dropping unit may be configured to include a reservoir unit that stores the liquid together with the gas, a connection unit that connects the reservoir unit and the transport unit, and a gas expansion unit that expands the gas in the reservoir unit. . In such a configuration, when the gas stored in the reservoir section is expanded by the gas expansion section such as a heater, the liquid stored in the reservoir section is pushed out to the transport section via the connection section. At this time, by controlling the amount of gas expansion in the gas expansion section, it becomes possible to drop the liquid in a very small amount onto the transport section.
In addition, as a method of dropping a liquid, a technique similar to that of an ink jet or a bubble jet can be used.
[0016]
Then, the DNA sample (sample), the reagent, and the like thus dropped and mixed are dropped and mixed, and then amplified by the amplification processing unit.
In such an analysis device, the amplification processing unit may adopt a configuration in which the transport unit has one or more paths through which the liquid dropped and mixed in the drop mixing unit sequentially passes through the positions facing the plurality of heaters. .
As a result, the liquid sequentially passes through the position facing the heater, so that a temperature cycle (history) can be given to the liquid without changing the temperature of the heater. In particular, if a plurality of paths are sequentially provided in the transport unit so that the liquid sequentially passes through the positions facing the plurality of heaters, a plurality of temperature cycles can be given to the liquid.
In the amplification processing unit, any processing method other than the above-described temperature processing can be adopted as long as the liquid including a sample such as DNA can be amplified.
Further, such an analysis device may further include a diluting unit that supplies a diluting liquid to the liquid that has passed through the amplifying unit, at a stage subsequent to the amplifying unit.
Such a device for analysis can be suitably used for identification (typing) of SNPs.
[0017]
If the present invention is regarded as a device for identification of SNPs, it is used for a dripping / mixing unit for dripping / mixing a plurality of types of liquids including a DNA sample to be analyzed, and for a liquid dropped / mixed in a dripping / mixing unit. A temperature processing unit for performing a predetermined temperature processing.
[0018]
From the viewpoint of improving the handling of a very small amount of liquid, the present invention can be applied not only to DNA analysis and SNPs typing as described above, but also to a microreactor for observing a chemical reaction among a plurality of chemical substances. It is conceivable to apply.
The present invention as such a liquid supply device includes a reservoir portion that stores the liquid together with the gas, a passage portion that is formed continuously at a lower end of the reservoir portion, and through which the liquid stored in the reservoir portion passes, and the inside of the reservoir portion. It is characterized by including a heater for heating and a heater control unit for controlling the operation of the heater.
In such a liquid supply device, in the reservoir, the liquid is stored below to form a liquid layer, and the gas is stored above the liquid to form a gas layer. When the gas in the gas layer in the reservoir is expanded by operating the heater in the heater control unit to heat the inside of the reservoir, the liquid in the liquid layer is dropped from the reservoir to the passage according to the amount of expansion. be able to.
With such a configuration, the liquid can be dripped in a very small amount. At this time, it is preferable that the reservoir section has a tapered section whose inner diameter gradually increases upward from the passage section. In such a tapered portion, the inner diameter on the passage portion side is reduced, which contributes to miniaturization of the amount of liquid dropped.
Such a liquid supply device can be applied not only to DNA analysis and SNPs typing but also to various uses such as a microreactor for mixing and reacting chemical substances.
[0019]
In addition, when a plurality of sets of the reservoir, the passing section, and the heater are provided, and the passing section of each set is provided so as to face a continuous transport section, the liquid is supplied to the transport section from the reservoir section of each set via the passing section. Can be dropped.
At this time, the position of the droplet transported by the transport unit is detected by the position detection unit, and based on the position of the droplet, the operation of each set of heaters is controlled by the heater control unit so that the drop timing is adjusted. Is controlled, liquids dropped from a plurality of sets of reservoirs can be mixed in the transport unit. Thus, if the type of liquid stored in the reservoir section is different for each set, the liquids can be mixed in various combinations.
Such a transporting section may be arranged in a straight line, and the passing sections of each set may be arranged along the same.However, the passing sections of each set are arranged in a matrix, and the transporting sections are arranged in a matrix. It is preferable to form in a one-stroke form so as to face the passage portions of each set arranged in terms of effective use of space.
[0020]
By the way, in order to drop the liquid by utilizing the expansion force of the gas, it is preferable that the reservoir portion is a closed space. However, since it is necessary to supply the liquid to the reservoir, the reservoir usually has an opening that opens upward. In that case, in a state where the liquid is stored in the lower part in the reservoir part and the gas is stored in the upper part of the liquid, a sealing member for sealing the opening part can be attached, so that the reservoir part can be sealed. Is preferred.
Examples of the sealing member include a lid and an adhesive tape. In the case of a lid, it is preferable that the lid be detachably provided in the opening of the reservoir portion or that the lid can be opened and closed. In addition, in the case where the interval between the reservoir portions of each set is reduced, it is difficult to provide a lid or attach / detach the lid. Therefore, it is preferable to attach an adhesive tape or the like to the opening.
[0021]
The present invention can also be regarded as an inspection device for performing an inspection by combining a plurality of types of liquids. In this inspection device, a plurality of liquid dropping units are arranged at intervals with respect to a transport unit that is continuous from a base end to a terminal end. Then, when the liquid is dropped from the liquid dropping unit onto the transport unit to form droplets, the position of the droplet transported by the transport unit is detected by the position detection unit, and based on the position, another liquid droplet is dropped. The dripping of the liquid in the section is controlled by the control section. This allows droplets to be transported at intervals in the transport unit, or the droplets dropped from one liquid dropper and conveyed through the transporter to hit droplets dropped from another liquid dropper A plurality of types of liquids can be mixed.
Such liquid dropping portions can be arranged in a matrix having predetermined columns × predetermined rows, and in this case, the transport portion is arranged in a meander shape with respect to the liquid dropping portions arranged in a matrix. Preferably, it is formed.
In such an inspection device, a plurality of types of liquids can be combined and mixed and provided for inspection. In this case, the liquid is not limited to a DNA sample or the like, and various liquids can be used.
Further, in the liquid dropping section, a configuration in which the gas in the reservoir section is expanded by the heater as described above is preferable, but the invention is not limited thereto, and various other dropping means may be employed. For example, it is also possible to apply a negative pressure to the reservoir section from the transport section side to drop the liquid. For this purpose, a negative pressure fluid may be supplied to the transport unit, or a negative pressure may be generated by cooling the transport unit.
[0022]
A temperature processing unit that performs a predetermined temperature process on the liquid droplet transported by the transport unit in this manner can be further provided. In that case, the control unit controls the condition of the temperature processing performed by the temperature processing unit based on the position of the droplet in the transport unit detected by the position detection unit. Thereby, the temperature treatment conditions to be applied can be changed according to the type of the mixed liquid.
[0023]
Further, the liquid dropping section can drop a liquid into the solvent injected into the transport section. In this case, the solvent only needs to have characteristics that do not mix with the liquid, and for example, a non-aqueous solvent can be used. In order to transport the solvent in which the liquid is dropped in the transport unit, for example, an electrostatic force generated on the wall of the transport unit is used, or a pressure difference generated by pressurizing the transport unit or applying a negative pressure. Can be used.
[0024]
The present invention relates to a temperature processing heater provided continuously in one direction, a transport unit continuously formed so as to pass through the temperature processing heater a plurality of times, and a position of a droplet transported by the transport unit. And a temperature processing control unit that controls conditions of temperature processing to be performed on the droplets by the temperature processing heater based on the position of the droplet in the transport unit detected by the position detection unit. It can also be considered as a temperature processing device characterized by comprising.
In this case, the transport section is formed continuously so as to pass through the temperature processing heater a plurality of times. That is, when the temperature processing heaters are rod-shaped continuous in one direction, the transport unit is continuous in a meandering manner in a direction crossing the direction in which the temperature processing heaters are continuous.
As a result, the droplet transported through the transport unit passes through the temperature processing heater a plurality of times, and thus undergoes a plurality of temperature cycles.
Note that a plurality of temperature processing heaters may be provided in parallel. Also, a plurality of temperature processing heaters can be provided in series in a direction in which the heaters are continuous. In that case, the temperature processing control unit can also switch the temperature processing heater that performs temperature processing on the droplet based on the position of the droplet in the transport unit detected by the position detection unit.
Apart from this, the temperature processing control section can also control the temperature of the temperature processing heater based on the position of the droplet in the transport section detected by the position detection section. In this case, it is preferable to set the order of the droplets to be supplied to the transport unit so that the temperature change of the temperature processing heater in the temperature processing control unit is minimized in order to suppress a time loss due to the temperature change of the temperature processing heater. .
[0025]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail based on embodiments shown in the accompanying drawings.
FIG. 1 is a diagram for explaining the configuration of a SNPs typing element (analysis device, SNPs identification device, inspection device) 10 in the present embodiment.
As shown in FIG. 1, the SNPs typing element 10 includes a drop mixing unit 20, a transport unit 30, a temperature processing unit (amplification processing unit) 40, a dilution unit 50, an inspection unit 60, and a discharge unit 70.
Such an SNPs typing element 10 is formed by, for example, stacking and combining three substrates 11, 12, and 13.
[0026]
As the drop mixing section 20, input sections (liquid drop sections) 21 projecting from the upper surface of the substrate 11 are provided in a matrix at predetermined vertical and horizontal intervals.
As shown in FIGS. 2 and 3, each charging section 21 has a shape that expands as its outer diameter goes downward from above. A reservoir hole (reservoir section) 22 for introducing a DNA sample (sample), a reagent, or a buffer solution is formed in each of the input sections 21 so as to open to the upper surface of the input section 21. The reservoir hole 22 is, for example, a circular shape in a plan view, and a straight portion 22 a having a constant inner diameter in a predetermined size range from the upper surface side of the input portion 21. The lower portion of the straight portion 22 a faces the lower surface of the substrate 11. The inner diameter is a tapered portion 22b that is gradually reduced in a tapered shape (a mortar shape).
Then, as shown in FIG. 3, a heater (gas expansion portion) 23 is provided on the wall surface (or in the vicinity thereof) of the tapered portion 22b (or the straight portion 22a). The heater 23 is a ring-shaped annular body or a fan-shape in which the annular body is divided into a plurality of parts, and its on / off is controlled by a controller (a heater control unit, a control unit) not shown.
The substrate 12 is formed with a straight drip hole (connecting portion, passing portion) 24 having the same diameter as the lower end of the tapered portion 22b, continuous with the reservoir hole 22.
[0027]
FIG. 4 is a diagram for illustrating an operation in each part of the SNPs typing element 10, that is, steps such as dropping and mixing of the liquid 100, temperature processing, and dilution. In order to show these steps, for the sake of convenience, the drop mixing section 20, the temperature processing section 40, the diluting section 50, and the inspection section 60 are cross-sectional views taken along appropriate sections along the transport section 30, which will be described later. It is not a sectional view exactly corresponding to 1 etc.
As shown in FIG. 4 (a), in such a drop mixing section 20, a liquid 100 such as a DNA sample, a reagent, or a buffer is injected into a reservoir hole 22 of each input section 21. Then, the liquid 100 is held in a state where the liquid 100 accumulates below the tapered portion 22 b of the reservoir hole 22 due to the surface tension of the liquid 100 itself, the internal pressure of the transport unit 30 described below, and the like.
As shown in FIG. 4B, the opening on the upper surface of the charging unit 21 is sealed with a sealing member such as a lid or an adhesive tape 25 separately attached, and the inside of the reservoir hole 22 is filled with a liquid 100 and a gas (atmosphere). Alternatively, when the heater 23 is turned on by the controller after sealing the replacement gas 101, the gas 101 located above the liquid 100 in the reservoir hole 22 expands due to the heat of the heater 23. Due to the expansion of the gas 101, the liquid 100 is pushed out from the lower end of the tapered portion 22b, and is dropped into the dropping hole 24 below.
[0028]
At this time, in order to make the amount of the liquid 100 dropped from the reservoir hole 22 a minute predetermined amount, it is preferable that the time (length) of turning on the heater 23 be a predetermined time set in advance. The time for turning on the heater 23 may be appropriately set according to the inner diameter of the reservoir hole 22 or the drip hole 24 or the like. Further, in order to prevent the accuracy of the dropping amount due to the ambient temperature from being lowered, the heater 23 is set to a predetermined constant temperature in advance instead of simply turning the heater 23 on and off. Preferably, 23 is heated for a predetermined time.
By adopting such a configuration, the liquid 100 can be dropped in the drop mixing section 20 on the order of pL (picoliter).
[0029]
The transport section 30 circulates the liquid 100 dropped at each of the input sections 21 of the drop mixing section 20 (hereinafter, the dropped liquid 100 is referred to as a droplet 102) between the input sections 21 within the drop mixing section 20. And transport to the temperature processing unit 40, the dilution unit 50, the inspection unit 60, and the discharge unit 70 in the post-process.
As shown in FIGS. 1 and 5, the transport unit 30 is configured by forming a channel (groove) 31 on the lower surface of the substrate 12.
The channel 31 is continuously formed in a one-stroke shape so that the dropping holes 24 of all the charging portions 21 are opened at the bottom surface (upper surface) of the channel 31 at a portion corresponding to the drop mixing portion 20. In the example of FIG. 5, the channel 31 has two ends 20 a, 20 b on both sides of the drop mixing section 20 in a portion corresponding to the drop mixing section 20, from a base end 31 a to an end 31 b on the temperature processing section 40 side. Is formed in a zigzag shape (meander shape).
In the temperature processing section 40 and the diluting section 50, the channels 31 are similarly connected in a single-stroke form, for example, the end sections 40 a, 40 b, 50 a, 50 b on both sides of the temperature processing section 40 and the diluting section 50. By folding back in each region, each region is formed in a zigzag shape as a whole.
As shown in FIG. 1, the upper surface of the substrate 13 is attached to the substrate 12 having such a channel 31 formed on the lower surface so that the space surrounded by the channel 31 and the substrate 13 is conveyed. It functions as the unit 30.
[0030]
Droplets 102 are dropped onto such a transport unit 30 from dropping holes 24 of each input unit 21 opened on the upper bottom surface of the channel 31. The transport unit 30 is provided with a transport mechanism for transporting the dropped droplets 102 in a direction in which the transport unit 30 continues.
As one of the transport mechanisms, there is one using hydrophilicity. As shown in FIG. 6 (a), the opposite sides of the transport unit 30, for example, the upper bottom surface of the channel 31 and the upper surface of the substrate 13, are arranged at predetermined intervals in the direction in which the transport unit 30 is continuous. Electrodes 32A and 32B are provided. Then, the respective electrodes 32A and 32B are covered with insulating films 33A and 33B. One electrode 32A is turned on / off under the control of a controller (not shown), and the other electrode 32B is grounded (GND). The insulating film 33A of the electrode 32A to which a voltage is applied has its own or a coating film formed on the outer surface thereof, whose hydrophilicity changes depending on the voltage, such as silicon or Teflon (tetrafluoroethylene). It is formed by substances.
In such a transport mechanism using hydrophilicity, the hydrophilicity of the insulating film 33A or its coating film is changed by changing (on / off) the voltage applied to the one electrode 32A.
Since the droplet 102 is attracted in the direction of high hydrophilicity due to its surface tension, by applying a voltage to the electrode 32A on the downstream side, the balance of the hydrophilicity of the droplet 102 in the front-back direction is lost, and the droplet 102 has high hydrophilicity. The droplet 102 can be drawn to the electrode 32A on the downstream side. By utilizing this, the controller sequentially shifts the position of the electrode 32A to which the voltage is applied toward the downstream side of the transport unit 30 every predetermined time, thereby transporting the droplet 102 to the downstream side along the transport unit 30. You do it.
[0031]
Further, as another transfer mechanism, there is a transfer mechanism using electrostatic force. As shown in FIG. 6 (b), the pair is formed on the opposing surfaces of the transport unit 30, for example, the upper surface of the channel 31 and the upper bottom surface of the substrate 13 at predetermined intervals in a direction in which the transport unit 30 is continuous. Electrodes 34A and 34B are provided. Then, the respective electrodes 34A and 34B are covered with insulating films 35A and 35B. One electrode 34A is turned on / off by the control of a controller (not shown), and the other electrode 34B is grounded (GND).
In such a transport mechanism, a positive charge (indicated by “+” in FIG. 6B) is excited in the droplet 102 when a voltage is applied to one electrode 34A. Then, when the application of the voltage to the electrode 34A is stopped, the positive charge returns to ions, but it takes time to return to ions (this time is called charge relaxation time: dielectric constant ε / conductivity σ). For example, in the case of water, it takes time on the order of μsec). During this charge relaxation time, that is, before the positive charge disappears, an electrostatic force is generated by applying a voltage to the adjacent downstream electrode 34A, thereby causing the droplet 102 to move to the downstream electrode 34A. 34A.
By utilizing this, the controller sequentially shifts the position of the electrode 34A to which the voltage is applied toward the downstream side of the transport unit 30 at predetermined time intervals, thereby transporting the droplet 102 to the downstream side along the transport unit 30. You do it.
[0032]
In addition, as a transport mechanism, a pressure difference is generated between the base end and the end of the transport unit 30 (channel 31) by a pressure applying means such as a negative pressure pump, a pressure pump, or a compressor. A configuration for transporting the droplet 102 can be employed.
[0033]
By the way, by the various transport mechanisms as described above, the plurality of droplets 102 dropped from the dropping holes 24 of the plurality of input units 21 can be transported at intervals in the transport unit 30 without mixing. However, as shown in FIG. 6C, it is also possible to interpose a fluid 103 made of a non-aqueous solvent (a solvent that does not mix with an aqueous solution) between the droplets 102 before and after each other. You don't have to.)
Such a fluid 103 may be injected with a syringe pump or the like from the base end side of the transport unit 30 (channel 31). Thus, the droplet 102 is dropped into the injected fluid 103.
By interposing (filling) the fluid 103 between the droplets 102, the fluid 103 can function as a carrier liquid for the droplet 102.
[0034]
Further, when a different DNA sample or a different reagent is transported by the transport unit 30, the DNA sample or the like may adhere to the inner wall surface of the transport unit 30. For this reason, when the type of the DNA sample or the reagent to be transported by the transport unit 30 changes, a cleaning liquid for cleaning the inside of the transport unit 30 may be flowed to the transport unit 30 (of course, it is not necessary to flow).
For this purpose, as in the case of a DNA sample or the like, a cleaning liquid can be charged into a predetermined charging section 21 and dropped as a droplet 102 from a charging hole. In addition, as described above, it is also preferable to flow the cleaning liquid as the fluid 103 made of a non-aqueous solvent between the droplets 102 that are adjacent to each other.
[0035]
With the above-described transport mechanism, the transport unit 30 transports the droplets 102 dropped from each of the input units 21.
At this time, as shown in FIG. 4C, in the drop mixing section 20, any other dropping section 21 is dropped from one dropping section 21 and transported by the transport section 30 to the drop 102. , A droplet 102 of another liquid 100 may be dropped (bumped), and both may be mixed. This makes it possible, for example, to mix the reagent with the DNA sample.
[0036]
In order to realize this, the transport unit 30 needs to detect the position of the droplet 102 to be transported. As the position detection mechanism (position detection unit), a plurality of pairs of electrodes (not shown) and other sensors are provided on the side surface of the transport unit 30 (channel 31) at intervals, and between the pair of electrodes (sensors). There is a configuration in which the position of the droplet 102 is detected by monitoring the capacitance or the like. Of course, any other type of sensor may be provided as long as the position of the droplet 102 can be detected.
When the transport mechanism using hydrophilicity or electrostatic force as shown in FIGS. 6A and 6B is employed, the controller determines the positions of the electrodes 32A and 34A to which a voltage is applied. Since it can be recognized, the position of the droplet 102 can also be detected based on the position.
In this way, the controller (not shown) detects the position of the droplet 102 that is thrown in from each of the throwing units 21 and is transported downstream of the transport unit 30, and the other droplets 102 Droplets 102 can be dropped and crushed from the input unit 21 and mixed (hereinafter, the mixed droplets 102 are appropriately referred to as droplets 102 '). Accordingly, a plurality of types (not limited to two, but three or more) of the droplets 102 injected from the plurality of input units 21 can be mixed in the transport unit 30 and further transported downstream. It is.
[0037]
The temperature processing unit 40 includes, for example, three heater units 41, 42, and 43. As shown in FIG. 7, these heater units 41, 42, and 43 are provided on the substrate 13 so as to be exposed to or close to the transport unit 30. Each of the heater units 41, 42, and 43 includes a temperature processing heater 44 and a sensor 45. The temperature processing heater 44 of the heater section 41 is set to, for example, 96 ° C., the temperature processing heater 44 of the heater section 42 is set to, for example, 72 ° C., and the temperature processing heater 44 of the heater section 43 is set to, for example, 50 ° C. .
The sensors 45 provided in each of the heater units 41, 42, and 43 are for detecting the position (presence or absence) of the droplet 102. The sensor 45 is divided periodically in its length direction, and can independently detect the position of the droplet 102 for each pass 30p described later.
[0038]
As shown in FIG. 5, with respect to such a temperature processing unit 40, the transport unit 30 is folded back at both ends 40a and 40b to form a zigzag shape, so that the mixed droplets are formed. 102 'has a configuration in which a plurality of paths 30p are provided that pass through the heater sections 41, 42, and 43 in the order described here. That is, the heater units 41, 42, and 43 are provided so as to be substantially orthogonal to each path 30p of the transport unit 30.
As shown in FIG. 4D, in such a temperature processing unit 40, the droplet 102 ′ is transported by the transport unit 30, so that the droplet 102 ′ is heated by the heater units 41, 42, 43 in each pass 30 p. Exposed to the temperature environment provided by As the droplet 102 'sequentially passes through the plurality of paths 30p, the temperature cycle sequentially provided by the heater units 41, 42, and 43 is repeated, thereby performing PCR amplification. Therefore, in order for the droplet 102 ′ to undergo a predetermined number of temperature cycles, it is necessary to provide the transport unit 30 with a predetermined number of paths 30 p passing through the heater units 41, 42, 43 in this order.
[0039]
Further, as shown in FIG. 7, a cavity 47 may be formed on the lower surface of the substrate 13 by etching or the like in order to avoid heat conduction between the heater units 41, 42, and 43 adjacent to each other.
[0040]
Incidentally, the temperature given by the temperature processing unit 40 may be different depending on the type of the reagent put into the droplet 102 and the like.
In order to cope with this, as shown in FIG. 8, a set of three heater units 41, 42, 43 is divided into a plurality (for example, three, of course, other than this) in a continuous direction. These may be arranged in series as heaters 41A to 41C, 42A to 42C, and 43A to 43C in the form. The temperature of each of the heaters 41A to 41C, 42A to 42C, and 43A to 43C may be independently controlled by a controller (not shown) functioning as a temperature processing controller.
With such a configuration, the reagent reacts and reacts in a part of the heater units 41A to 41C, 42A to 42C, and 43A to 43C that provides a temperature cycle corresponding to the type of the reagent put in the droplet 102 '. Amplification is performed.
Furthermore, the heater units 41, 42, and 43 may be divided for each path 30p of the transport unit 30, and the temperature of each may be controlled independently.
[0041]
Further, as a configuration for making the temperature given by the temperature processing unit 40 different depending on the type of the reagent put into the droplet 102 ′, it functions as a temperature processing control unit while detecting the position of the droplet 102 ′. There is also a method of adjusting the temperature of the temperature processing heater 44 of the heater units 41, 42, 43 by a controller (not shown).
In this case, the position of the droplet 102 'is detected by the position detection mechanism from the stage of the drop mixing unit 20, and based on the position, the temperature of each temperature processing heater 44 of the heater units 41, 42, and 43 is controlled by the controller. Is adjusted to a temperature corresponding to the droplet 102 '. At this time, since the passage of the droplet 102 ′ can be detected by the sensor 45 of the heater units 41, 42, 43, the temperature processing heater 44 of the heater units 41, 42, 43 after detecting the passage of the droplet 102 ′. Is changed to a temperature corresponding to the next droplet 102.
When such a method is adopted, if the temperature of the temperature processing heaters 44 of the heater units 41, 42, and 43 becomes more and more complicated, the reaction time of the temperature processing heater 44 may increase the entire temperature processing time. is there. For this reason, the order in which the droplets 102 ′ flow (the order in which the droplets are injected from the input unit 21) is set so that the processing temperature in the temperature processing unit 40 becomes close, that is, the temperature fluctuation of the temperature processing heater 44 of the heater units 41, 42, and 43. It is preferable to set so as to be small.
[0042]
As shown in FIG. 4E, the diluting section 50 is structurally exactly the same as the drop mixing section 20 shown in FIG. 3, and is provided with a plurality of input sections 21. A reservoir hole 22 provided with a heater 23 and a drip hole 24 connected to the reservoir hole 22 are provided. Further, (the channel 31 of) the transport section 30 is formed so as to be continuous with the dropping holes 24 of the respective input sections 21.
In the diluting section 50, the diluting liquid 110 is supplied as the liquid 100 to the input section 21, and the diluting liquid 110 is dropped onto the temperature-treated droplets 102 ′ conveyed by the conveying section 30. By dropping a predetermined amount by exactly the same mechanism as described above, the droplet 102 'is diluted with the diluent 110 (the diluted droplet 102' is shown as a droplet 102 ").
[0043]
As shown in FIG. 1, the inspection unit 60 is a region for inspecting the droplet 102 ″ diluted through the dilution unit 50 with a single-molecule fluorescence detection device. The concave portion 61 is formed continuously at the end of the portion 30. As shown in Fig. 4F, the droplet 102 "transported by the transport portion 30 flows into the concave portion 61. By locating this on the detection optical path of the optical system of the single-molecule fluorescence detection device, the presence or absence of the fluorescence in the droplet 102 "or the state thereof is inspected by the single-molecule fluorescence detection method.
[0044]
Further, the discharge unit 70 discharges the droplet 102 ″ inspected by the inspection unit 60 to the outside. When the inspected droplet 102 is moved from the inspection unit 60 to the discharge unit 70, The same transport mechanism as the transport unit 30 can be adopted.
[0045]
In the above-described SNPs typing element 10, a liquid 100 such as a DNA sample or a reagent is supplied, and a drop mixing unit 20 that mixes them and a predetermined temperature cycle is provided for the mixed liquid 100 (droplet 102). The temperature processing unit 40 is integrally provided. Then, under the control of the controller, the dropping / mixing section 20 drops and mixes the DNA sample and the reagent mixed with the DNA sample. After the temperature cycle described above, dilution can be performed in the dilution section 50.
As a result, the DNA sample, the reagent, and the like can be put on the SNPs typing element 10 without going through a DNA sample preparation step and a hybridization step performed by a plurality of individual devices as shown in FIG. Thereafter, under the control of a controller (not shown), the steps from hybridization to further dilution can be performed completely by one device called the SNPs typing element 10. Thereby, SNPs typing can be performed efficiently.
[0046]
More specifically, in the dripping / mixing unit 20, the liquid 100 is dripped in a picoliter, an unprecedented small amount, by expanding the gas 101 in the reservoir hole 22 using the heater 23. Can be. As a result, the amount of the DNA sample and particularly the amount of the expensive reagent used can be significantly reduced, and as a result, the cost required for SNPs typing can be significantly reduced. In addition, by making the amount of the droplet 102 very small, the heat diffusion speed in the temperature processing unit 40 is increased, and the temperature processing can be performed at a high speed.
In the temperature processing unit 40, the transport unit 30 is provided in a zigzag manner with respect to the heater units 41, 42, and 43, so that a plurality of paths 30p that pass through a temperature cycle in a predetermined order are provided. I have. As a result, a predetermined number of temperature cycles can be given to one droplet 102 without changing the temperature provided by the heater units 41, 42, and 43, so that the temperature of the heater must be changed every cycle. As compared with the case where the thermal cycler is used, the throughput of SNPs typing can be greatly improved.
[0047]
Also, in the drop mixing section 20 of the SNPs typing element 10, the transport section 30 is formed continuously with respect to the plurality of input sections 21, and the position of the liquid drop 102 input in each input section 21 is detected by the controller. Then, the droplet 102 of another liquid 100 can be dropped on the droplet 102 from another input unit 21 and mixed. Moreover, the temperature processing unit 40 can also be configured so that the provided temperature environment can be changed according to the type of the reagent and the like. This makes it possible to freely combine a plurality of DNA samples and a plurality of reagents. That is, unlike the related art, there is no need to prepare a DNA array for each reagent, so that the overall throughput of SNPs typing can be improved.
[0048]
In the above-described embodiment, the SNPs typing element 10 has a configuration in which, for example, three substrates 11, 12, and 13 are stacked. However, the configuration according to the present invention can be realized, and processing and assembly can be performed. If so, any other configuration may be adopted. In addition, the temperature processing unit 40 can appropriately change the number of heater units 41, 42, and 43, the temperature environment to be provided, and the like according to the temperature cycle required for hybridization. Furthermore, as long as the droplet 102 can be hybridized, a method other than the PCR method can be adopted. In this case, instead of the temperature processing unit 40, another region for hybridization is formed. can do.
Of course, if dilution is not required for inspection by the inspection unit 60, the dilution unit 50 can be omitted.
In addition, even in the inspection unit 60, there is no problem even if an inspection method other than the single-molecule fluorescence detection method is performed.
[0049]
By the way, the drop mixing unit 20 and the temperature processing unit 40 of the SNPs typing element 10 described above may be independent devices. Thus, the drop mixing unit 20 can be configured as a liquid supply device that drops a minute amount of the liquid 100 or an inspection device that can freely mix a plurality of types of liquids 100. Further, the temperature processing unit 40 changes the temperature environment provided by the heater units 41, 42, and 43 according to the type of the droplet 102, or changes the temperature environment provided by the heater units 41A to 41C, 42A to 42C, By including 43A to 43C, it is possible to configure as a temperature processing device that controls a temperature environment provided according to the droplet 102.
In addition, the configuration described in the above embodiment can be selected or changed to another configuration as appropriate without departing from the gist of the present invention.
[0050]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, as long as a plurality of types of liquids such as DNA samples and reagents are supplied, the mixing and amplification of the liquids is completed by a single device. be able to. This makes it possible to efficiently perform analysis such as SNPs typing.
Further, in the temperature processing unit, by providing the temperature processing heater so that the transport unit passes a plurality of times, a predetermined number of temperature cycles can be given to one droplet, so that the throughput of temperature processing such as SNPs typing can be greatly reduced. Can be improved.
Further, according to the present invention, since the liquid can be dripped in a very small amount on the order of the prior art, it is possible to greatly reduce the amount of the DNA sample and particularly the amount of expensive reagents and the like used. The cost can be significantly reduced.
In addition, since a plurality of liquid dropping portions are provided for a continuously formed transporting portion, droplets dropped from the plurality of liquid dropping portions can be mixed in the transporting portion. This makes it possible to freely combine a plurality of DNA samples with a plurality of reagents, a plurality of chemical substances, and the like, thereby improving the throughput.
In this way, SNPs typing and the like can be performed with much higher efficiency and at lower cost than before.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an exploded perspective view showing a configuration of a SNPs typing element according to the present embodiment.
FIG. 2 is a perspective sectional view showing a configuration of a drop mixing section.
FIGS. 3A and 3B are cross-sectional views of a drop mixing section, in which FIG. 3A is a cross-sectional view along a direction in which a conveying section is continuous, and FIG. 3B is a cross-sectional view orthogonal to FIG.
FIG. 4 is a diagram showing an operation of each part of the SNPs typing element.
FIG. 5 is a diagram illustrating a shape of a transport unit.
FIG. 6 is a diagram illustrating a plurality of examples of a droplet transport mechanism in a transport unit.
FIG. 7 is a cross-sectional view illustrating a temperature processing unit.
FIG. 8 is a diagram illustrating another example of the temperature processing unit.
FIG. 9 is a diagram showing a flow of conventional SNPs typing.
[Explanation of symbols]
Reference Signs List 10: SNPs typing element (analysis device, SNPs identification device, inspection device), 11, 12, 13: substrate, 20: drop mixing section, 21: input section (liquid drop section), 22: reservoir hole (reservoir) , 22b ... taper part, 23 ... heater (gas inflating part), 24 ... dropping hole (connecting part, passing part), 25 ... adhesive tape (sealing member), 30 ... transport part, 30p ... path, 31 ... Channel, 40: temperature processing unit (amplification processing unit), 41, 42, 43: heater unit, 44: temperature processing heater, 50: dilution unit, 60: inspection unit, 100: liquid, 101: gas, 102, 102 ' , 102 ″: droplet, 110: diluent

Claims

A device for analyzing DNA, comprising:
A sample such as a DNA to be analyzed, a reagent mixed with the sample, a drop mixing unit that drops and mixes a plurality of liquids including the sample,
An amplification processing unit that amplifies the sample contained in the liquid dropped and mixed in the drop mixing unit,
An analysis device, comprising:

The drop mixing section,
A transport unit that is continuous in a one-stroke form,
A plurality of liquid dropping units provided to face the transport unit,
The analysis device according to claim 1, further comprising:

The liquid dropping section,
A reservoir for storing the liquid together with the gas,
A connecting unit that connects the reservoir unit and the transport unit;
A gas inflation unit for inflating gas in the reservoir unit,
The analysis device according to claim 2, comprising:

The amplification processing unit has a plurality of temperature processing heaters,
4. The analytical device according to claim 2, wherein the transport unit has one or more paths through which the liquid dropped and mixed in the dropping / mixing unit sequentially passes through positions facing the plurality of temperature processing heaters. 5. device.

The analysis device according to claim 1, further comprising a diluting unit that supplies a diluting liquid to the liquid that has passed through the amplifying unit, at a stage subsequent to the amplifying unit.

The analysis device according to any one of claims 1 to 5, which is for identification of SNPs (Single Nucleotide Polymorphism: single nucleotide polymorphism).

A device for identifying SNPs,
A DNA sample to be analyzed, a reagent to be mixed with the sample, a drop mixing unit that drops and mixes plural types of liquids including the sample,
A temperature processing unit that performs a predetermined temperature process on the liquid dropped and mixed in the drop mixing unit,
A device for identifying SNPs, comprising:

A liquid supply device for supplying a liquid,
A reservoir for storing the liquid together with the gas,
A passage portion formed continuously with the lower end of the reservoir portion and through which the liquid stored in the reservoir portion passes;
A heater for heating the inside of the reservoir,
A heater control unit that controls the operation of the heater;
A liquid supply device comprising:

The heater control section operates the heater to heat the inside of the reservoir section, thereby expanding the gas in the reservoir section and dropping the liquid from the reservoir section to the passage section. 9. The liquid supply device according to 8.

The liquid supply device according to claim 8, wherein the reservoir portion has a tapered portion whose inner diameter gradually increases upward from the passage portion.

A plurality of sets of the reservoir section, the passing section, and the heater are provided, and a continuous transport section is further provided,
The liquid supply device according to any one of claims 8 to 10, wherein the passage sections of each set are provided so as to face the transport section.

The apparatus further includes a position detection unit that detects a position of the droplet transported by the transport unit,
The liquid supply according to claim 11, wherein the heater control unit controls the operation of each set of the heaters based on a position of the droplet in the transport unit detected by the position detection unit. apparatus.

The reservoir has an opening that opens upward, the liquid is stored in a lower part of the reservoir, and the gas is stored in an upper part of the liquid, and the opening is sealed to seal the opening. The liquid supply device according to any one of claims 8 to 12, wherein the member is mountable.

An inspection device for performing an inspection by combining a plurality of types of liquids,
A transport unit that is continuous from the base end to the end,
A plurality of liquid dropping units that are arranged at an interval with respect to the transport unit and drop liquid to the transport unit,
A position detecting unit that detects a position of a droplet that is dropped from the liquid dropping unit and is transported by the transport unit,
A control unit that controls dropping of the liquid in the liquid dropping unit based on a position of the droplet in the transport unit detected by the position detection unit,
An inspection device comprising:

The droplet further transported by the transport unit, further comprising a temperature processing unit that performs a predetermined temperature processing,
The method according to claim 14, wherein the control unit controls a condition of temperature processing performed by the temperature processing unit based on a position of the droplet in the transport unit detected by the position detection unit. Inspection device.

The liquid dropping portions are arranged in a matrix having a predetermined column × a predetermined row,
The inspection device according to claim 14, wherein the transport unit is formed in a meandering shape with respect to the liquid dropping units arranged in a matrix.

The inspection device according to claim 14, wherein a solvent is injected into the transport unit, and the liquid dropping unit drops the liquid into the solvent of the transport unit.

A temperature processing heater provided continuously in one direction;
A transport unit that is formed continuously so as to pass through the temperature processing heater a plurality of times, and transports droplets,
A position detection unit that detects the position of the droplet transported by the transport unit,
A temperature processing control unit that controls a temperature processing condition to be applied to the droplet by the temperature processing heater based on a position of the droplet in the transport unit detected by the position detection unit;
A temperature processing device comprising:

A plurality of the temperature processing heaters are provided in series,
The temperature processing control unit switches the temperature processing heater that performs temperature processing on the droplet based on a position of the droplet in the transport unit detected by the position detection unit. 19. The temperature processing device according to 18.

19. The temperature processing device according to claim 18, wherein the temperature processing control unit controls the temperature of the temperature processing heater based on a position of the droplet in the transport unit detected by the position detection unit. apparatus.