JP2004219109A

JP2004219109A - Method and apparatus for detecting activity potential of physiological cell tissue

Info

Publication number: JP2004219109A
Application number: JP2003003556A
Authority: JP
Inventors: Toshihiko Yoku; 俊彦浴; Saburo Tanaka; 三郎田中; Sachiko Yoshida; 祥子吉田
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2003-01-09
Filing date: 2003-01-09
Publication date: 2004-08-05

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for detecting the activity potential of a physiological cell tissue capable of treating a large number of samples and not causing the trouble due to the coloring matter taken in cells, and an apparatus therefor. <P>SOLUTION: This apparatus for detecting the activity potential of the physiological cell tissue is constituted so as to measure a magnetic change caused accompanied by a change in the activity potential of the physiological cell tissue yielded by the maturity of the tissue to evaluate a degree of the maturity of the tissue or the function of the tissue and equipped with a SQUID magnetism sensor as a magnetism detector for detecting the magnetic change. The magnetism sensor 3 is arranged under a physiological cell lump sample 4 so that the distance between the physiological cell lump sample 4 and the magnetism sensor 3 becomes short. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体細胞組織の微弱な活動電位変化の検出における新しい原理に基づく検出装置に関するものである。この装置は、心臓・骨格筋などの、動きと膜電位変化を伴う組織の培養生体組織を利用する再生工学の分野、あるいは臓器のような機能細胞の培養組織を利用する薬効評価の分野において、検査の効率化と精密化をもたらすものである。
【０００２】
【従来の技術】
心臓や神経、筋肉などでは、イオンの流れによる膜電位変化により活動電位変化を生じることで、それぞれ組織の機能を発揮することが知られている。このような組織の機能を評価するためには、数十倍の顕微鏡で拡大し、一つ一つの細胞をマイクロメートルサイズの検出針（マイクロプローブ）で測定することが多かったが、これは工業化された再生工学、スクリーニングテストに用いられる組織の評価などには適さない。特に、再生工学では、細胞培養技術を利用して幹細胞や胎児組織から活動電位変化を伴う組織（心臓など）を再構成するため、構成された組織を無侵襲で組織全体について評価する検査方法が必要である。さらに薬効や外部刺激のスクリーニングテストに用いられる培養組織の評価でも、非侵襲で効率的な活動電位変化検出法が求められていた。
【０００３】
そこで、これまで微小な培養組織の活動電位変化を非侵襲で効率的に検出する方法として、微小多点電極を利用する方法（〔非特許文献１〕、〔非特許文献２〕参照）と膜電位感応色素による色素プローブ法を利用する方法（〔非特許文献３〕、〔非特許文献４〕参照）が用いられてきた。
【０００４】
【非特許文献１】
ＨｏｎｍａＳ．，ＳｈｉｒａｋａｗａＴ．，ＮａｋａｍｕｒａＷ．＆ＨｏｎｍａＫ．２０００ＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅＬｅｔｔｅｒｓ２９４，１１３−１１６
【非特許文献２】
Ｃｌａｖｅｒｏｌ−ＴｉｎｔｕｒｅＥ．＆ＰｉｎｅＪ．２００２Ｊ．ＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅＭｅｔｈｏｄｓ１１７，１３−２１
【非特許文献３】
ＤｅｖｏｒＡ．＆ＹａｒｏｍＹ．２００１Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ８７，３０５９−３０６９
【非特許文献４】
ＪｉｎＷ．，ＺｈａｎｇＲ．＆ＷｕＪ．２００２Ｊ．ＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅＭｅｔｈｏｄｓ１１５，１３−２７
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、微小多点電極を利用する方法は、培養組織に電極を直接接触させないと測定できないため、電極面上で細胞を培養する必要がある。さらに、検査後の組織を電極から分離することが困難になるため、再生工学における検出装置として利用することは不可能である。また、電極上の培養であるため、技術的に安定した結果を得るためには高い習熟度が要求され、多数のサンプルを処理することが必要となるが、それは大変困難であるため、薬効や外部刺激のスクリーニングテストの検出装置として用いるのも難しい。
【０００６】
また、膜電位感応色素による色素プローブ法は、比較的簡便な方法であるが、細胞に色素を取り込ませるため再生工学試料には利用できない。
【０００７】
さらに、細胞に取り込まれた色素によって細胞内でラジカルが発生し、測定対象の細胞に傷害を与えることから、長期間の観察が必要な培養組織の成熟度のモニターなどには使用できないという問題点を抱えている。
【０００８】
本発明は、上記状況に鑑みて、多数のサンプルを処理することができ、細胞に取り込まれた色素による弊害がない生体細胞組織の活動電位検出方法および装置を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記目的を達成するために、
〔１〕生体細胞組織の活動電位検出方法において、生体細胞組織の成熟により生じるこの組織の活動電位変化に伴って発生する磁気変化を計測することによって、前記組織の成熟度あるいは組織機能を評価することを特徴とする。
【００１０】
〔２〕生体細胞組織の活動電位検出方法において、生体細胞組織に薬液を加えて生じるこの組織の活動電位変化に伴って発生する磁気変化を計測することによって、前記薬液の薬効を評価することを特徴とする。
【００１１】
〔３〕生体細胞組織の活動電位検出方法において、光照射、電磁波などの外界からの刺激を生体細胞組織に与えて生じるこの組織の活動電位変化に伴って発生する磁気変化を計測することにより、前記組織の機能を評価することを特徴とする。
【００１２】
〔４〕上記〔１〕、〔２〕又は〔３〕記載の生体細胞組織の活動電位検出方法において、ＳＱＵＩＤ磁気センサを磁気検出器として用いることを特徴とする。
【００１３】
〔５〕生体細胞組織の活動電位検出装置において、生体細胞組織の成熟により生じるこの組織の活動電位変化に伴って発生する磁気変化を計測する手段と、この磁気変化を計測する手段によって、前記組織の成熟度あるいは組織機能を評価する手段とを具備することを特徴とする。
【００１４】
〔６〕生体細胞組織の活動電位検出装置において、生体細胞組織に薬液を加えて生じるこの組織の活動電位変化に伴って発生する磁気変化を計測する手段と、この磁気変化を計測する手段によって、前記薬液の薬効を評価する手段とを具備することを特徴とする。
【００１５】
〔７〕生体細胞組織の活動電位検出装置において、光照射、電磁波などの外界からの刺激を生体細胞組織に与えて生じるこの組織の活動電位変化に伴って発生する磁気変化を計測する手段と、この磁気変化を計測する手段によって、前記組織の機能を評価する手段とを具備することを特徴とする。
【００１６】
〔８〕生体細胞組織評価装置において、生体細胞組織の成熟により生じるこの組織の活動電位変化に伴って発生する磁気変化を計測することによって、前記組織の成熟度あるいは組織機能を評価する装置であって、前記磁気変化を検出する磁気検出器としてＳＱＵＩＤ磁気センサを具備し、前記磁気センサが生体細胞塊試料の近傍に配置され、前記生体細胞塊試料対磁気センサ間距離が小さくなる配置構成としたことを特徴とする。
【００１７】
〔９〕生体細胞組織評価装置において、生体細胞組織に薬液を加えて生じるこの組織の活動電位変化に伴って発生する磁気変化を計測することによって、前記薬液の薬効を評価する装置であって、前記磁気変化を検出する磁気検出器としてＳＱＵＩＤ磁気センサを具備し、前記磁気センサが生体細胞塊試料の近傍に配置され、前記生体細胞塊試料対磁気センサ間距離が小さくなる配置構成としたことを特徴とする。
【００１８】
〔１０〕上記〔８〕又は〔９〕記載の生体細胞組織評価装置において、前記前記磁気センサが生体細胞塊試料の下方に配置されることを特徴とする。
【００１９】
〔１１〕上記〔８〕又は〔９〕記載の生体細胞組織評価装置において、前記生体細胞塊試料を培養するための培養ディッシュとして、また評価時には支持体として用いるプレートあるいはフィルムの厚さが３ｍｍ以下であることを特徴とする。
【００２０】
〔１２〕上記〔８〕又は〔９〕記載の生体細胞組織評価装置において、前記ＳＱＵＩＤ磁気センサが、高温超伝導ＳＱＵＩＤあるいは高温超伝導差分型グラジオメータであることを特徴とする。
【００２１】
〔１３〕上記〔８〕又は〔９〕記載の生体細胞組織評価装置において、前記生体細胞塊試料を順次計測できるよう、試料移動機構を具備することを特徴とする。
【００２２】
上記したように、無侵襲・非接触・非ラジカルが、生体組織工学の検出装置に必要な条件であり、本発明ではこれを満たすような測定装置を開発した。
【００２３】
すなわち、本発明では、（１）培養組織が自発的に発生する磁界を検出するため無侵襲である、（２）培養組織から３ｍｍ以内で、非侵襲で測定するため、適切な条件で組織を大量培養し各種の検査に合致したものを、本発明の装置で検査することができ効率的である、（３）化学物質を色素として用いる必要がないため、検査を終えた組織を再生工学、あるいは薬効や外部刺激のスクリーニングに用いる上で問題を生じない。
【００２４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００２５】
図１は本発明の第１実施例を示す生体細胞組織評価装置のブロック図、図２はその生体細胞組織評価装置の構成図である。
【００２６】
この実施例では、培養心筋細胞塊の活動電位変化の検出について説明する。
【００２７】
ラット胎児の培養心筋細胞の活動電位変化を、本発明により検出した実施例を示す。
【００２８】
図１において、１は磁気シールドルーム、２はクライオスタット、３はＳＱＵＩＤ（超伝導量子干渉計：ＳｕｐｅｒｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇＱｕａｎｔｕｍＩｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅＤｅｖｉｃｅ）磁気センサ、４は被測定物（サンプル）であり、ここでは、ラット胎児の培養心筋細胞塊（２ｍｌの培地を含む、直径３３ｍｍのプラスチック製培養ディッシュに植えたもの）をサンプルとした。
光学顕微鏡下で周期的な収縮を繰り返していることから、正常に成熟した細胞塊であることを確認したサンプルを使用した。
【００２９】
また、１０は電磁シールドルーム、１１はＳＱＵＩＤ制御装置、１２はスペクトルアナライザ、１３はオシロスコープ、１４は６０Ｈｚノッチフィルター、１５はパーソナルコンピュータ（ＰＣ：データ収録ノートパソコン）、１６はペンレコーダーである。
【００３０】
なお、被測定物４である前記生体細胞塊試料を培養するための培養ディッシュとして用いるプレートあるいはフィルムは、評価時には支持体として用いるため、その厚さは３ｍｍ以下であり、好適には１００ミクロン、さらに好適には数１０ミクロンである。
【００３１】
また、ＳＱＵＩＤ磁気センサ３は、高温超伝導ＳＱＵＩＤあるいは高温超伝導差分型グラジオメータを用いる。
【００３２】
図２において、２１は培養ディッシュ、２２は細胞塊試料、２３はＳＱＵＩＤ磁気センサ、２４は伝熱ロッド、２５は真空容器、２６は液体窒素タンク、２７は真空隔壁窓、２８は試料移動機構、２９はＳＱＵＩＤ駆動装置、３０は制御用パーソナルコンピュータ（ＰＣ）、３１は記録計、３２はフィルターである。
【００３３】
図２に示すように、真空容器２５内の伝熱ロッド２４上に配置されたＳＱＵＩＤ磁気センサ２３によって、培養ディッシュ２１に配置される細胞塊試料２２の組織の活動電位変化に伴って発生する磁気変化を計測する。なお、細胞塊試料２２は試料移動機構２８によって所望の位置に設定することができる。
【００３４】
なお、上記実施例では、ＳＱＵＩＤ磁気センサ２３を培養ディッシュ２１の下方に配置するようにしているが、ＳＱＵＩＤ磁気センサ２３を培養ディッシュ２１の上方に配置するようにしてもよい。ただし、その場合は、培養ディッシュ内の培養液面を１ｍｍ程度に低くする必要がある。また、この形態では培養液が乾燥しやすいので、望ましくは、図２に示したように、ＳＱＵＩＤ磁気センサ２３を培養ディッシュ２１の下方に配置するのが望ましい。
【００３５】
以下、実験方法について説明する。
【００３６】
図１に示すように、パーソナルコンピュータ（ＰＣ；データ集録ノートパソコン）１５とペンレコーダー１６の間に６０Ｈｚのノイズを除去するノッチフィルター１４を挿入し、ＳＱＵＩＤ磁気センサ３と被測定物４の距離を２ｍｍ程度に近づけた。また、磁気シールドルーム１内のクライオスタット２上に配置されたＳＱＵＩＤ磁気センサ３の上部に被測定物４を置き、機器（図示なし）でデータを取得した。実験は、被測定物４の存在する場合と存在しない場合（コントロール）で測定した。コントロールとして培養細胞サンプルを含まない、２ｍｌの培地のみを含む同型のプラスチック製培養ディッシュを使用した。
【００３７】
培養心筋細胞塊のない培地のみのコントロールにおける磁束変化を図３に、また、前記細胞塊を含むサンプルでの代表的な磁束変化を図４に示す。
【００３８】
図３においては信号が見られないが、図４においては心筋細胞の拍動に起因する、断続した信号が検出された。
【００３９】
ＳＱＵＩＤ磁気センサ３による計測結果から、心筋細胞の拍動時間と休止時間を求めた結果、心筋細胞が動いている時間は約５秒から２０秒であり、止まっている時間が約９秒から１３秒であることが分かった。一方、顕微鏡下で心筋細胞を観察しながらカウントした結果、心筋細胞の拍動時間は、約８秒から１８秒で、休止時間が約９秒から１５秒であり、磁束の信号変化は心筋細胞塊の拍動変化と一致することが確認できた。なお、ここでの値は、多数回実験を行った結果を示している。
【００４０】
電圧−磁束Φ_０への換算は、０．４〔Ｖ／Φ_０〕で電圧を除することによって可能である。測定結果より、最大で０．０１Φ_０〔ｐｅａｋｔｏｐｅａｋ〕の信号であることが分かる。また、１Φ_０は１８．２〔ｎＴ〕に相当するので換算すると、０．１８２〔ｎＴ〕の磁界が発生していることが分かった。
【００４１】
次に、本発明の第２実施例である測定装置を用いた薬効評価について説明する。
【００４２】
上記した第１実施例の実験系を利用した、心臓組織に作用する薬剤の評価を行った例を示す。
【００４３】
被測定物（サンプル）は、第１実施例と同様のものを用いた。
【００４４】
用いた装置、実験条件なども第１実施例と同様である。
【００４５】
以下、この第２実施例の実験方法について図４〜図８を用いて説明する。
【００４６】
ラット胎児由来の培養心筋細胞塊を含む培養液に、▲１▼生理食塩水（コントロール）、▲２▼ＫＣｌ（終濃度２０ｍＭ）、▲３▼ｎｏｒａｄｒｅｎａｌｉｎ（ノルアドレナリン）（終濃度１０μＭ）、▲４▼ｃａｆｆｅｉｎｅ（カフェイン）（終濃度１００μＭ）を各々添加した場合の磁束変化を第１実施例と同様にして、測定時間を４０秒程度に延長して測定を行った。あわせて光学顕微鏡による培養組織の拍動の変化を第１実施例と同様の方法でモニターした。
【００４７】
以下、その実験結果について述べる。
【００４８】
１４日間培養したラット心筋細胞の拍動を確認した上で、各処理を行った場合における典型的な磁束変化の様子を、各々図５（コントロール処理）、図６（ＫＣｌ処理）、図７（ノルアドレナリン処理）、図８（カフェイン処理）に示した。図中の矢印の時点でそれぞれ薬液を投与した。
【００４９】
被測定物（サンプル）を第１の実施例と同様にして測定した際、コントロールとして生理食塩水を添加した場合の典型的な活動電位変化を図５に示した。
【００５０】
ラット心筋細胞の拍動を確認した上で、細胞外液を２０ｍＭＫＣｌを含む培地に置換し、細胞を脱分極させたところ、一過性の電位上昇と活動電位の停止を観察した（図６）。顕微鏡下で、同じ処理で組織塊の一過性の拍動の上昇とそれに続く停止を確認した。
【００５１】
ラット心筋細胞の拍動を確認した上で、伝達物質のノルアドレナリンを終濃度で１０μＭ投与したところ、心臓細胞塊の活動電位変化が消失してしまった（図７）。顕微鏡により、同じ処理で組織塊の拍動が停止することを確認した。
【００５２】
ラット心筋細胞の拍動を確認した上で、終濃度１００μＭのカフェインを投与したところ、組織の活動電位変化のピッチ（拍動間隔）が小さくなった（図８）。同じ処理で組織塊の拍動が速くなることを顕微鏡下で確認した。
【００５３】
いずれも生体内で心臓に対する薬物の反応に近似した反応を観察することができた。
【００５４】
図９は本発明の第３実施例を示す外界の刺激としての赤外線（光）照射による磁束変化を示す図である。
【００５５】
ラット心筋細胞の拍動の確認および、赤外線がＳＱＵＩＤ磁気センサになんら影響を及ぼさないことを確認した上で、図９に示すように、外部より赤外線をラット心筋細胞に照射したところ、電位上昇が観察された。
【００５６】
本発明によれば、無侵襲、非接触、非化学反応的に培養組織が自発的に発生する磁界を検出することができ、測定後の組織を再生工学、薬効や外部刺激の評価に再利用することもできる。
【００５７】
つまり、細胞の分化・機能発生に伴って生じる拍動・収縮などの活動電位変化を、ＳＱＵＩＤ磁気センサにより非接触的に捕らえることができ、細胞の分化・発生の研究も再生医療での利用が期待される。
【００５８】
なお、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨に基づいて種々の変形が可能であり、これらを本発明の範囲から排除するものではない。
【００５９】
【発明の効果】
以上、詳細に説明したように、本発明によれば、電極を接触させたり、化学物質を色素として利用する従来の方法と異なり、細胞組織塊に対して全くの非侵襲で活動電位変化に対応した磁気信号を得ることができた。
【００６０】
さらに従来方法に比べ、操作が容易であることから、十倍以上のサンプル数を処理できる利点がある。
【００６１】
これによって、様々な活動電位変化を伴う培養組織の機能評価、成熟度評価、あるいは当該培養組織を利用した薬効や外部刺激の評価が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１実施例を示す生体細胞組織評価装置のブロック図である。
【図２】本発明の第１実施例を示す生体細胞組織評価装置の構成図である。
【図３】培養心筋細胞塊を含まないコントロールサンプルでの磁束変化を示す図である。
【図４】培養心筋細胞塊を含むサンプルでの磁束変化を示す図である。
【図５】本発明の実施例におけるコントロール処理による磁束変化を示す図である。
【図６】ＫＣｌ投与による磁束変化を示す図である。
【図７】ノルアドレナリン投与による磁束変化を示す図である。
【図８】カフェイン投与による磁束変化を示す図である。
【図９】本発明の第３実施例を示す外界の刺激としての赤外線（光）照射による磁束変化を示す図である。
【符号の説明】
１磁気シールドルーム
２クライオスタット
３，２３ＳＱＵＩＤ磁気センサ
４，２２被測定物（サンプル）
１０電磁シールドルーム
１１ＳＱＵＩＤ制御装置
１２スペクトルアナライザ
１３オシロスコープ
１４６０Ｈｚノッチフィルター
１５，３０パーソナルコンピュータ（ＰＣ）
１６ペンレコーダー
２１培養ディッシュ
２４伝熱ロッド
２５真空容器
２６液体窒素タンク
２７真空隔壁窓
２８試料移動機構
２９ＳＱＵＩＤ駆動装置
３１記録計
３２フィルター[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a detection device based on a new principle in detecting a slight change in action potential of a living cell tissue. This device is used in the field of regenerative engineering that uses cultured biological tissues of tissues with movement and membrane potential changes, such as heart and skeletal muscle, or in the field of drug efficacy evaluation that uses cultured tissues of functional cells such as organs. This will increase the efficiency and precision of the inspection.
[0002]
[Prior art]
In the heart, nerves, muscles, and the like, it is known that a tissue potential is exhibited by generating an action potential change due to a membrane potential change due to the flow of ions. In order to evaluate the function of such a tissue, it was common to magnify it with a microscope of several tens of times and measure each cell with a micrometer-sized detection needle (microprobe). It is not suitable for regenerative engineering, evaluation of tissues used for screening tests, etc. In particular, in regenerative engineering, cell culture technology is used to reconstitute tissues (such as the heart) with action potential changes from stem cells and fetal tissues. is necessary. Furthermore, a non-invasive and efficient detection method of action potential change was also required for evaluation of cultured tissues used for screening tests for drug efficacy and external stimuli.
[0003]
Therefore, as a method for non-invasively and efficiently detecting a change in action potential of a minute cultured tissue, a method using a micro multipoint electrode (see [Non-Patent Document 1] and [Non-Patent Document 2]) and a membrane have been proposed. A method using a dye probe method using a voltage-sensitive dye (see [Non-patent Document 3] and [Non-patent Document 4]) has been used.
[0004]
[Non-patent document 1]
Honma S.A. , Shiragawa T .; , Nakamura W. et al. & Honma K. 2000 Neuroscience Letters 294, 113-116
[Non-patent document 2]
Claverol-Tinture & Pine J. 2002 J.C. Neuroscience Methods 117, 13-21
[Non-Patent Document 3]
Devor A. & Yarom Y. 2001 J.M. Neurophysiology 87, 3059-3069
[Non-patent document 4]
Jin W. , Zhang R .; & Wu J. 2002 J.C. Neuroscience Methods 115, 13-27
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
However, in the method using a micro multi-point electrode, measurement cannot be performed unless the electrode is brought into direct contact with the cultured tissue, and therefore, it is necessary to culture cells on the electrode surface. Further, it becomes difficult to separate the tissue after the examination from the electrodes, so that it cannot be used as a detection device in regenerative engineering. In addition, since the culture is performed on an electrode, a high level of proficiency is required to obtain a technically stable result, and it is necessary to process a large number of samples. It is also difficult to use as a detection device for a screening test for external stimuli.
[0006]
The dye probe method using a membrane potential-sensitive dye is a relatively simple method, but cannot be used for a regenerative engineering sample because the dye is incorporated into cells.
[0007]
In addition, the dye incorporated into the cells generates radicals in the cells, damaging the cells to be measured, and cannot be used for monitoring the maturity of cultured tissues, which require long-term observation. I have
[0008]
The present invention has been made in view of the above circumstances, and has as its object to provide a method and an apparatus for detecting an action potential of a living cell tissue, which can process a large number of samples and have no adverse effect due to a dye taken into cells.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
The present invention, in order to achieve the above object,
[1] In the action potential detection method for living cell tissue, the degree of maturity or tissue function of the tissue is evaluated by measuring a magnetic change caused by an action potential change of the tissue caused by maturation of the living cell tissue. It is characterized by the following.
[0010]
[2] In the action potential detecting method for living cell tissue, the medicinal effect of the drug solution is evaluated by measuring a magnetic change generated with an action potential change of the tissue caused by adding a drug solution to the living cell tissue. Features.
[0011]
[3] In the action potential detection method for living cell tissue, by measuring the magnetic change generated due to the action potential change of this tissue caused by applying an external stimulus such as light irradiation and electromagnetic waves to the living cell tissue, The function of the organization is evaluated.
[0012]
[4] The method for detecting an action potential of a living cell tissue according to the above [1], [2] or [3], wherein a SQUID magnetic sensor is used as a magnetic detector.
[0013]
[5] In the action potential detecting device for living cell tissue, a means for measuring a magnetic change caused by a change in action potential of the tissue caused by maturation of the living cell tissue, and a means for measuring the magnetic change, Means for assessing the maturity or organizational function of the organization.
[0014]
[6] In an action potential detecting device for living cell tissue, a means for measuring a magnetic change generated due to a change in action potential of the tissue caused by adding a drug solution to the living cell tissue, and a means for measuring the magnetic change, Means for evaluating the efficacy of the drug solution.
[0015]
[7] In an action potential detecting device for living cell tissue, means for measuring a magnetic change generated with an action potential change of the tissue caused by applying an external stimulus such as light irradiation or electromagnetic waves to the living cell tissue, Means for evaluating the function of the tissue by means for measuring the magnetic change.
[0016]
[8] A biological cell tissue evaluation device that evaluates the maturity or tissue function of the tissue by measuring a magnetic change generated with a change in action potential of the tissue caused by maturation of the biological cell tissue. An SQUID magnetic sensor is provided as a magnetic detector for detecting the magnetic change, and the magnetic sensor is disposed near the living cell mass sample, and the distance between the living cell mass sample and the magnetic sensor is reduced. It is characterized by the following.
[0017]
[9] In a biological cell tissue evaluation device, a device for evaluating the medicinal effect of the medical solution by measuring a magnetic change generated with an action potential change of the tissue caused by adding a medical solution to the biological cell tissue, It is provided with a SQUID magnetic sensor as a magnetic detector for detecting the magnetic change, the magnetic sensor is arranged in the vicinity of the living cell mass sample, and the arrangement is such that the distance between the living cell mass sample and the magnetic sensor is reduced. Features.
[0018]
[10] The apparatus for evaluating a living cell tissue according to the above [8] or [9], wherein the magnetic sensor is disposed below the living cell mass sample.
[0019]
[11] In the biological cell tissue evaluation apparatus according to [8] or [9], the thickness of a plate or film used as a culture dish for culturing the biological cell mass sample and as a support at the time of evaluation is 3 mm or less. It is characterized by being.
[0020]
[12] The biological cell tissue evaluation apparatus according to [8] or [9], wherein the SQUID magnetic sensor is a high-temperature superconducting SQUID or a high-temperature superconducting differential gradiometer.
[0021]
[13] The biological cell tissue evaluating apparatus according to [8] or [9], further including a sample moving mechanism so that the biological cell mass sample can be sequentially measured.
[0022]
As described above, non-invasive, non-contact, and non-radical are necessary conditions for a biological tissue engineering detection device, and the present invention has developed a measurement device that satisfies this condition.
[0023]
That is, according to the present invention, (1) the cultured tissue is non-invasive to detect a spontaneously generated magnetic field, and (2) the tissue is measured under non-invasive conditions within 3 mm from the cultured tissue. Efficient mass cultures and those that match various tests can be tested using the apparatus of the present invention. (3) Since there is no need to use chemical substances as dyes, tissues that have been tested can be regenerated and engineered. Alternatively, there is no problem when used for screening for medicinal effects and external stimuli.
[0024]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail.
[0025]
FIG. 1 is a block diagram of a biological cell tissue evaluating apparatus according to a first embodiment of the present invention, and FIG. 2 is a configuration diagram of the biological cell tissue evaluating apparatus.
[0026]
In this example, detection of a change in action potential of a cultured cardiomyocyte cluster will be described.
[0027]
An example in which a change in action potential of cultured cardiomyocytes of a rat fetus was detected by the present invention is shown.
[0028]
In FIG. 1, 1 is a magnetic shield room, 2 is a cryostat, 3 is a SQUID (Superconducting Quantum Interference Device) magnetic sensor, 4 is an object to be measured (sample), and here is a rat embryo culture. Cardiomyocyte clumps (planted in a 33 mm diameter plastic culture dish containing 2 ml of medium) were used as samples.
A sample that was confirmed to be a normally matured cell mass because of repeated cyclic contraction under an optical microscope was used.
[0029]
Reference numeral 10 denotes an electromagnetic shield room, 11 denotes a SQUID controller, 12 denotes a spectrum analyzer, 13 denotes an oscilloscope, 14 denotes a 60 Hz notch filter, 15 denotes a personal computer (PC: data recording notebook personal computer), and 16 denotes a pen recorder.
[0030]
The plate or film used as a culture dish for culturing the living cell mass sample, which is the object to be measured 4, is used as a support at the time of evaluation. More preferably, it is several tens of microns.
[0031]
The SQUID magnetic sensor 3 uses a high-temperature superconducting SQUID or a high-temperature superconducting differential gradiometer.
[0032]
In FIG. 2, 21 is a culture dish, 22 is a cell mass sample, 23 is a SQUID magnetic sensor, 24 is a heat transfer rod, 25 is a vacuum vessel, 26 is a liquid nitrogen tank, 27 is a vacuum partition window, 28 is a sample moving mechanism, 29 is a SQUID driving device, 30 is a control personal computer (PC), 31 is a recorder, and 32 is a filter.
[0033]
As shown in FIG. 2, the magnetic field generated by the SQUID magnetic sensor 23 disposed on the heat transfer rod 24 in the vacuum vessel 25 with the change in the action potential of the tissue of the cell mass sample 22 disposed on the culture dish 21. Measure the change. The cell mass sample 22 can be set at a desired position by the sample moving mechanism 28.
[0034]
In the above embodiment, the SQUID magnetic sensor 23 is disposed below the culture dish 21. However, the SQUID magnetic sensor 23 may be disposed above the culture dish 21. However, in that case, it is necessary to lower the level of the culture solution in the culture dish to about 1 mm. Further, in this embodiment, since the culture solution is easily dried, it is desirable to arrange the SQUID magnetic sensor 23 below the culture dish 21 as shown in FIG.
[0035]
Hereinafter, the experimental method will be described.
[0036]
As shown in FIG. 1, a notch filter 14 for removing noise of 60 Hz is inserted between a personal computer (PC; data acquisition notebook personal computer) 15 and a pen recorder 16, and the distance between the SQUID magnetic sensor 3 and the device under test 4 is increased. It was close to about 2 mm. In addition, the device under test 4 was placed above the SQUID magnetic sensor 3 placed on the cryostat 2 in the magnetic shield room 1 and data was acquired by a device (not shown). In the experiment, the measurement was performed with and without the DUT 4 (control). As a control, a plastic culture dish of the same type containing only 2 ml of a medium without a cultured cell sample was used.
[0037]
FIG. 3 shows the change in magnetic flux in the control using only the medium without the cultured cardiomyocyte mass, and FIG. 4 shows the typical change in magnetic flux in the sample containing the cell mass.
[0038]
In FIG. 3, no signal is seen, but in FIG. 4, an intermittent signal due to the pulsation of the cardiomyocytes was detected.
[0039]
From the measurement results by the SQUID magnetic sensor 3, the pulsation time and rest time of the cardiomyocytes were obtained. As a result, the time during which the cardiomyocytes were moving was about 5 to 20 seconds, and the time during which the cardiomyocytes were stopped was about 9 to 13 seconds. Seconds. On the other hand, as a result of counting while observing the myocardial cells under a microscope, the beating time of the myocardial cells was about 8 to 18 seconds, the pause time was about 9 to 15 seconds, and the change in the magnetic flux signal was It was confirmed that it coincided with the pulsation change of the mass. In addition, the value here shows the result of having performed many experiments.
[0040]
Conversion to voltage-magnetic flux Φ ₀ is possible by dividing the voltage by 0.4 [V / Φ ₀ ]. From the measurement results, it can be seen that the signal is at most 0.01Φ ₀ [peak to peak]. Further, when 1.phi ₀ is converted so corresponds to 18.2 [nT], it was found that the magnetic field of 0.182 [nT] is generated.
[0041]
Next, a description will be given of a drug efficacy evaluation using a measuring device according to a second embodiment of the present invention.
[0042]
An example in which a drug acting on heart tissue is evaluated using the experimental system of the first embodiment described above will be described.
[0043]
An object to be measured (sample) was the same as that in the first example.
[0044]
The used apparatus and experimental conditions are the same as in the first embodiment.
[0045]
Hereinafter, the experimental method of the second embodiment will be described with reference to FIGS.
[0046]
In a culture solution containing cultured cardiomyocyte clusters derived from rat fetuses, (1) physiological saline (control), (2) KCl (final concentration 20 mM), (3) noradrenalin (noradrenaline) (final concentration 10 μM), (4) The measurement was carried out by changing the magnetic flux change when caffeine (caffeine) (final concentration: 100 μM) was added, respectively, in the same manner as in the first example, and extending the measurement time to about 40 seconds. At the same time, the change in pulsation of the cultured tissue was monitored by an optical microscope in the same manner as in the first example.
[0047]
Hereinafter, the experimental results will be described.
[0048]
After confirming the pulsation of rat cardiomyocytes cultured for 14 days, typical changes in magnetic flux when each treatment was performed are shown in FIGS. 5 (control processing), FIG. 6 (KCl treatment), and FIG. Noradrenaline treatment) and FIG. 8 (caffeine treatment). Each drug solution was administered at the time of the arrow in the figure.
[0049]
FIG. 5 shows a typical action potential change when a physiological saline was added as a control when a measurement was performed on an object (sample) in the same manner as in the first example.
[0050]
After confirming the pulsation of the rat cardiomyocytes, the extracellular fluid was replaced with a medium containing 20 mM KCl, and the cells were depolarized. As a result, a transient increase in potential and cessation of action potential were observed (FIG. 6). ). Under the microscope, the same treatment confirmed a transient increase in the pulsatility of the tissue mass followed by cessation.
[0051]
After confirming the pulsation of rat cardiomyocytes, administration of the transmitter, noradrenaline, at a final concentration of 10 μM, abrogated the action potential change of the cardiac cell mass (FIG. 7). Microscopy confirmed that the same treatment stopped pulsing the tissue mass.
[0052]
After confirming the pulsation of rat cardiomyocytes, administration of caffeine at a final concentration of 100 μM reduced the pitch of action potential change (pulsation interval) of the tissue (FIG. 8). It was confirmed under a microscope that the same treatment accelerated the pulsation of the tissue mass.
[0053]
In each case, a response close to the response of the drug to the heart could be observed in vivo.
[0054]
FIG. 9 is a diagram showing a change in magnetic flux due to infrared (light) irradiation as an external stimulus according to the third embodiment of the present invention.
[0055]
After confirming the pulsation of the rat cardiomyocytes and confirming that the infrared rays had no effect on the SQUID magnetic sensor, as shown in FIG. Was observed.
[0056]
According to the present invention, a magnetic field generated spontaneously by a cultured tissue in a non-invasive, non-contact, non-chemical reaction manner can be detected, and the measured tissue can be reused for regeneration engineering, evaluation of medicinal effects and external stimuli. You can also.
[0057]
In other words, action potential changes such as pulsation and contraction caused by cell differentiation and functional development can be captured in a non-contact manner by the SQUID magnetic sensor, and research on cell differentiation and development can be used in regenerative medicine. Be expected.
[0058]
It should be noted that the present invention is not limited to the above embodiment, and various modifications are possible based on the spirit of the present invention, and these are not excluded from the scope of the present invention.
[0059]
【The invention's effect】
As described in detail above, according to the present invention, unlike the conventional method of contacting electrodes or using a chemical substance as a dye, it responds to action potential changes in a completely non-invasive manner against a cell tissue mass. The obtained magnetic signal was obtained.
[0060]
Furthermore, since the operation is easier than the conventional method, there is an advantage that the number of samples can be processed ten times or more.
[0061]
As a result, it becomes possible to evaluate the function and maturity of the cultured tissue with various action potential changes, or to evaluate the medicinal effect and external stimulus using the cultured tissue.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a block diagram of a living cell tissue evaluation apparatus according to a first embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a configuration diagram of a biological cell tissue evaluation apparatus according to a first embodiment of the present invention.
FIG. 3 is a diagram showing a change in magnetic flux in a control sample containing no cultured cardiomyocyte mass.
FIG. 4 is a diagram showing a change in magnetic flux in a sample containing a cultured cardiomyocyte mass.
FIG. 5 is a diagram illustrating a change in magnetic flux due to a control process according to the embodiment of the present invention.
FIG. 6 is a diagram showing a change in magnetic flux due to administration of KCl.
FIG. 7 is a diagram showing a change in magnetic flux due to noradrenaline administration.
FIG. 8 is a diagram showing a change in magnetic flux due to caffeine administration.
FIG. 9 is a diagram showing a change in magnetic flux due to infrared (light) irradiation as an external stimulus according to the third embodiment of the present invention.
[Explanation of symbols]
1 magnetic shield room 2 cryostat 3,23 SQUID magnetic sensor 4,22 DUT (sample)
Reference Signs List 10 Electromagnetic shield room 11 SQUID controller 12 Spectrum analyzer 13 Oscilloscope 14 60Hz notch filter 15, 30 Personal computer (PC)
16 Pen Recorder 21 Culture Dish 24 Heat Transfer Rod 25 Vacuum Container 26 Liquid Nitrogen Tank 27 Vacuum Partition Wall Window 28 Sample Movement Mechanism 29 SQUID Drive 31 Recorder 32 Filter

Claims

A method for detecting an action potential of a living cell tissue, comprising: measuring a magnetic change caused by a change in the action potential of the tissue caused by maturation of the living cell tissue, thereby evaluating the maturity or the tissue function of the tissue. .

A method for detecting the action potential of a living cell tissue, comprising: evaluating a drug effect of the drug solution by measuring a magnetic change caused by an action potential change of the tissue caused by adding a drug solution to the living cell tissue.

The function of the tissue is evaluated by measuring a magnetic change generated with an action potential change of the tissue caused by applying an external stimulus such as light irradiation and electromagnetic waves to the living cell tissue, thereby evaluating the function of the tissue. A method for detecting action potential of cell tissue.

4. The method for detecting an action potential of a living cell tissue according to claim 1, wherein the SQUID magnetic sensor is used as a magnetic detector.

(A) means for measuring a magnetic change that occurs with a change in action potential of a living cell tissue caused by maturation of the tissue;
(B) a device for evaluating the maturity or tissue function of the tissue by means for measuring the magnetic change;

(A) means for measuring a magnetic change generated with a change in action potential of a living cell tissue caused by adding a drug solution;
(B) an action potential detecting device for a living cell tissue, comprising: means for evaluating the drug effect of the drug solution by means for measuring the magnetic change.

(A) light irradiation, means for measuring a magnetic change generated with an action potential change of the living cell tissue caused by giving an external stimulus such as an electromagnetic wave to the living cell tissue,
(B) a device for evaluating the function of the tissue by means for measuring the magnetic change.

An apparatus for evaluating a degree of maturity or tissue function of the tissue by measuring a magnetic change caused by a change in action potential of the tissue caused by maturation of a living cell tissue, wherein the magnetic detection detects the magnetic change. A biological cell tissue evaluation device, comprising: a SQUID magnetic sensor as a detector, wherein the magnetic sensor is disposed near a biological cell mass sample, and the distance between the biological cell mass sample and the magnetic sensor is reduced. .

A device that evaluates the medicinal effect of the drug solution by measuring a magnetic change generated with an action potential change of the tissue caused by adding a drug solution to a living cell tissue, and as a magnetic detector that detects the magnetic change A biological cell tissue evaluation device comprising a SQUID magnetic sensor, wherein the magnetic sensor is arranged near a biological cell mass sample, and the distance between the biological cell mass sample and the magnetic sensor is reduced.

The biological cell tissue evaluation device according to claim 8, wherein the magnetic sensor is disposed below a biological cell mass sample.

The biological cell tissue evaluation apparatus according to claim 8 or 9, wherein a plate or a film used as a culture dish for culturing the biological cell mass sample and as a support at the time of evaluation is 3 mm or less. Biological tissue evaluation device.

10. The living cell tissue evaluating apparatus according to claim 8, wherein the SQUID magnetic sensor is a high-temperature superconducting SQUID or a high-temperature superconducting differential gradiometer.

10. The biological cell tissue evaluating apparatus according to claim 8, further comprising a sample moving mechanism so that the biological cell mass sample can be sequentially measured.