JP2004217588A

JP2004217588A - Angiotensin-converting enzyme inhibitor

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Publication number: JP2004217588A
Application number: JP2003008131A
Authority: JP
Inventors: Kazunori Katayama; 員典片山; Hidetaka Fuchu; 英孝府中; Yoshiro Kodama; 芳郎小玉; Takeo Nakayama; 建男中山; Yukio Kawamura; 幸雄河村; Michio Rokushiya; 三治男六車
Original assignee: Marudai Food Co Ltd
Current assignee: Marudai Food Co Ltd
Priority date: 2003-01-16
Filing date: 2003-01-16
Publication date: 2004-08-05
Anticipated expiration: 2023-01-16
Also published as: JP4221571B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a new angiotensin-converting enzyme (ACE)-inhibiting peptide derived from a muscle protein largely contained in meat and exhibiting a hypertension-preventing effect. <P>SOLUTION: The angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibiting peptide has a specific amino acid sequence obtained by hydrolyzing crudely purified troponin (having about 14-31 kDa molecular weight and including a myosin light chain) with pepsin. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アンギオテンシン変換酵素阻害剤又は高血圧予防用食品の有効成分として有用なポリペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）は主にヒトの血管の内皮細胞、肺、腎臓及び脳に存在する。この酵素は、アンギオテンシンＩに作用して、Ｃ末端から２つのアミノ酸（Ｈｉｓ−Ｌｅｕ）を切断することにより、強力な血圧上昇作用を有するアンギオテンシンＩＩに変換する。また、この酵素は、降圧作用のあるブラジキニンの分解にも関与している。
【０００３】
従って、アンギオテンシン変換酵素の活性を阻害すれば、血圧が低下し、高血圧の予防乃至治療に効果を奏すると考えられる。
【０００４】
これまでにも、種々のアンギオテンシン変換酵素阻害活性を有する物質が見出されている。
【０００５】
例えば、牛乳等に含まれるカゼインやアサリ肉のタンパク質の分解物などが検討されている（例えば、特許文献１及び特許文献２参照）。しかし、これらは豚肉や牛肉などの畜肉に多く含まれる筋タンパク質を利用したものではない。
【０００６】
また、畜肉由来のタンパク質の分解物も報告されている（非特許文献１参照）。しかし、十分なＡＣＥ阻害作用を有するためには、ペプチドの付加等の修飾工程が必要であり、修飾工程等を伴わない天然由来のタンパク質で、満足のいく活性を有するものは未だ見出されていなかった。
【０００７】
【特許文献１】
特開２００１−１０６７００
【０００８】
【特許文献２】
特開平７−１０１９８５号公報
【０００９】
【非特許文献１】
有原ら、「ミートサイエンス（ｍｅａｔｓｃｉｅｎｃｅ）」，５７，３１９−３２４，（２００１）
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、顕著なアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性を有し、天然物から得られ、毒性が低く安全性の高い物質を提供することを主な課題とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、新規なアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性を有する物質を見出すことを目的として鋭意検討を重ねた。その結果、粗精製トロポニン（分子量範囲約１４〜３１ｋＤａ、ミオシン軽鎖を含む）の酵素分解物に、顕著なアンギオテンシン変換酵素阻害活性を有する物質が存在することを見出し、更に検討を重ねて本発明を完成するに至った。
【００１２】
即ち、本発明は次の事項に係る。
【００１３】
本発明の第１項は、７〜１０個のアミノ酸残基からなり、以下の３つのうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有する、アンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するポリペプチドに係る。
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ；
Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ；
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ。
【００１４】
好ましくは、
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏからなる８個のアミノ酸、
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−ＰｒｏのＮ末端又はＣ末端に２個のアミノ酸残基が付加した１０個のアミノ酸、
Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ又はＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅからなる７個のアミノ酸、或いは、Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ又はＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−ＩｌｅのＮ末端又はＣ末端に２個のアミノ酸残基が付加した９個のアミノ酸からなり、アンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するポリペプチドに係る。
【００１５】
より好ましくは、８〜１０個のアミノ酸残基からなり、Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏのアミノ酸配列を有する、ミオシン由来のアンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するポリペプチド、
又は、７〜９個のアミノ酸残基からなり、Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ又はＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅのいずれかのアミノ酸配列を有する、トロポニンＴ由来のアンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するポリペプチドに係る。
【００１６】
更に具体的には、Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏからなる８個のアミノ酸、又は、Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−ＰｒｏのＮ末端又はＣ末端に２個のアミノ酸残基が付加した１０個のアミノ酸からなり、ミオシン由来のアンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するポリペプチド、
或いは、Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ又はＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅからなる７個のアミノ酸、
或いは、Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ又はＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−ＩｌｅのＮ末端又はＣ末端に２個のアミノ酸残基が付加した９個のアミノ酸からなる、トロポニンＴ由来のアンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するポリペプチドに係る。
【００１７】
本発明の第２項は、５〜１０個のアミノ酸残基からなり、以下の５つのうちいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドを１種又は２種以上有効成分として含有するアンギオテンシン変換酵素阻害剤に係る。
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ；
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ；
Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ；
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ；
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ。
【００１８】
好ましくは、以下の５つのポリペプチド；
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏからなるポリペプチド、
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｎからなるポリペプチド、
Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎからなるポリペプチド、
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅからなるポリペプチド、又は、
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒからなるポリペプチド
の１種又は２種以上を有効成分として含有するアンギオテンシン変換酵素阻害剤に係る。
【００１９】
より好ましくは、以下のポリペプチド；
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏからなるミオシン由来のポリペプチド、
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｎからなるミオシン由来のポリペプチド、
Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−ＧｌｎからなるトロポニンＴ由来のポリペプチド、
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−ＩｌｅからなるトロポニンＴ由来のポリペプチド、又は、
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−ＴｙｒからなるトロポニンＴ由来のポリペプチド
の１種又は２種以上を有効成分として含有するアンギオテンシン変換酵素阻害剤に係る。
【００２０】
本発明の第３項は、粗精製トロポニン（分子量範囲約１４〜３１ｋＤａ、ミオシン軽鎖を含む）を、タンパク質分解酵素を用いて、７〜１０個のアミノ酸残基からなり、以下の３つのうちの少なくとも１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドに加水分解する工程を含むアンギオテンシン変換酵素阻害剤の製造方法に係る。
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ；
Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ；
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ。
【００２１】
好ましくは、粗精製トロポニン（分子量範囲約１４〜３１ｋＤａ、ミオシン軽鎖を含む）におけるミオシンを、タンパク質分解酵素を用いて、Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏからなる８個のアミノ酸、又は、Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−ＰｒｏのＮ末端又はＣ末端に２個のアミノ酸残基が付加した１０個のアミノ酸からなるポリペプチドに加水分解する工程を含むアンギオテンシン変換酵素阻害剤の製造方法に係る。
【００２２】
または、粗精製トロポニン（分子量範囲約１４〜３１ｋＤａ、ミオシン軽鎖を含む）におけるトロポニンＴを、タンパク質分解酵素を用いて、Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ又はＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅからなる７個のアミノ酸、或いは、Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ又はＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−ＩｌｅのＮ末端又はＣ末端に２個のアミノ酸残基が付加した９個のアミノ酸からなるポリペプチドに加水分解する工程を含むアンギオテンシン変換酵素阻害剤の製造方法に係る。
【００２３】
好ましくは、粗精製トロポニン（分子量範囲約１４〜３１ｋＤａ、ミオシン軽鎖を含む）を、ペプシン、トリプシン又はキモトリプシンを用いて、７〜１０個のアミノ酸残基からなり、以下の３つのうちの少なくとも１つのアミノ酸配列：
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ；
Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ；
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ
を有するポリペプチドに加水分解する工程を含むアンギオテンシン変換酵素阻害剤の製造方法に係る。
【００２４】
本発明の第４項は、アンギオテンシン変換酵素阻害剤が、５〜１０個のアミノ酸残基からなり、以下の５つのうちいずれか１つのアミノ酸配列：
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ；
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ；
Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ；
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ；
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ
を有するポリペプチドの１種又は２種以上を有効成分として含有している、項３に記載の製造法に係る。
【００２５】
好ましくは、粗精製トロポニン（分子量範囲約１４〜３１ｋＤａ、ミオシン軽鎖を含む）を、ペプシン、トリプシン又はキモトリプシンを用いて、７〜１０個のアミノ酸残基からなり、以下の３つのうちの少なくとも１つのアミノ酸配列：
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ；
Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ；
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ
を有するポリペプチドに加水分解する工程を含む、
５〜１０個のアミノ酸残基からなり、以下の５つのうちいずれか１つのアミノ酸配列：
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ；
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ；
Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ；
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ；
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ
を有するポリペプチドの１種又は２種以上を有効成分として含有しているアンギオテンシン変換酵素阻害剤の製造方法に係る。
【００２６】
本発明の第５項は、項１に記載のポリペプチド又は項２に記載のアンギオテンシン変換酵素阻害剤を有効成分として含有する高血圧予防用食品に係る。
【００２７】
好ましくは、Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏからなる８個のアミノ酸、又は、Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−ＰｒｏのＮ末端又はＣ末端に２個のアミノ酸残基が付加した１０個のアミノ酸からなる、ミオシン由来のアンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するポリペプチドを有効成分として含有する高血圧予防用食品に係る。
【００２８】
または、Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ又はＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅからなる７個のアミノ酸、或いは、Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ又はＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−ＩｌｅのＮ末端又はＣ末端に２個のアミノ酸残基が付加した９個のアミノ酸からなる、トロポニンＴ由来のアンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するポリペプチドを有効成分として含有する高血圧予防用食品に係る。
【００２９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００３０】
ポリペプチド
本発明におけるポリペプチドは、７〜１０個からなるアミノ酸残基からなり、以下の３つのうちいずれか１つの骨格を有し、アンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するポリペプチドである。
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ；
Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ；
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ。
【００３１】
本発明のポリペプチドは、具体的には、
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏからなる８個のアミノ酸、
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−ＰｒｏのＮ末端又はＣ末端に２個のアミノ酸残基が付加した１０個のアミノ酸、
Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ又はＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅからなる７個のアミノ酸、或いは、Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ又はＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−ＩｌｅのＮ末端又はＣ末端に２個のアミノ酸残基が付加した９個のアミノ酸からなり、アンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するポリペプチドである。
【００３２】
上記骨格を有するポリペプチドが、優れたアンギオテンシン変換酵素阻害活性を有することが今回明らかとなった。
【００３３】
ここで、Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ（ＶＫＫＶＬＧＮＰ）は、ミオシン軽鎖（Ｄａｖｏｌｉｅｔａｌ．ＡｎｉｍａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１７９−１８５，１９９７）４７位から５４位由来のペプチドである。ミオシン由来のペプチドの中で、該ペプチドのように優れたアンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するものはこれまで知られていなかった。
【００３４】
また、Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ（ＥＫＥＲＥＲＱ）及びＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ（ＫＲＱＫＹＤＩ）は、トロポニンＴ（Ｍｏｉｒｅｔａｌ．ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ，１６１：３７１−３８２，１９７７）由来のペプチドと考えられる。
【００３５】
トロポニンＴ由来のペプチドでアンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するものはこれまで知られていなかった。
【００３６】
上記本発明のポリペプチドは、粗精製トロポニン（分子量範囲約１４〜３１ｋＤａ、ミオシン軽鎖を含む）をタンパク質分解酵素で加水分解することによって得られる。粗精製トロポニンとしては、ウサギ、ウシ、ブタ等に由来するタンパク質から抽出したものを用いることができる。
【００３７】
粗精製トロポニンは、具体的には、以下のような精製を行うことにより得られる。低塩濃度水溶液で洗浄したひき肉をアセトンパウダーにし、そこから高塩濃度バッファーで抽出する。抽出液に塩酸を加えｐＨを４．６とした後、遠心して得られた上清のｐＨをさらに水酸化カリウムで７．０に調整する。次いで、硫酸アンモニウムを加え、硫酸アンモニウム濃度４０％から６０％の間で沈殿してくる画分を集める。この沈殿を、バッファーを用いて透析することで、粗精製トロポニンを得る。
【００３８】
タンパク質分解酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン等が挙げられる。
【００３９】
タンパク質分解酵素による加水分解の条件は、適宜設定し得るが、トリプシン、キモトリプシンはｐＨ７．０〜８．５、ペプシンはｐＨ１〜３、また温度はいずれも２５〜３７℃とすることが一般的である。
【００４０】
本発明のポリペプチドは、粗精製トロポニン（分子量範囲約１４〜３１ｋＤａ、ミオシン軽鎖を含む）をタンパク質加水分解酵素で加水分解した後、生成物を、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣなどを適宜組み合わせて精製することにより得られる。
【００４１】
また本発明のポリペプチドは、Ｆｍｏｃ固相合成などの公知の方法で合成してもよい。
【００４２】
アンギオテンシン変換酵素阻害剤
本発明のアンギオテンシン変換酵素阻害剤は、上記アンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するポリペプチドを１種または２種以上有効成分として含有することにより得られる。具体的には、７〜１０個のアミノ酸残基からなり、以下の３つのうちいずれか１つの骨格を有するポリペプチドを１種又は２種以上有効成分として含有するアンギオテンシン変換酵素阻害剤である。
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ；
Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ；
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ。
【００４３】
本発明のアンギオテンシン変換酵素阻害剤においては、
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ；
Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ；又は
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅのいずれかの骨格に適当なアミノ酸残基が付加したものやアミノ酸残基が欠如したものであって、アンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するペプチドを有効成分として用いる。
【００４４】
例えば、本発明には、５〜１０個のアミノ酸残基からなり、以下の５つのうちいずれか１つの骨格を有するポリペプチドの１種又は２種以上を有効成分として含有するアンギオテンシン変換酵素阻害剤が含まれる。
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ；
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ；
Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ；
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ；
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ。
【００４５】
ここで、Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ（ＶＫＫＶＬＧＮＰＳＮ）は、ＶＫＫＶＬＧＮＰに２個のアミノ残基が付加したものであり、ミオシン軽鎖の４７位から５６位に相当する。
【００４６】
また、Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ（ＫＲＱＫＹ）は、ＫＲＱＫＹＤＩから２個のアミノ酸残基が欠如したものである。
【００４７】
アンギオテンシン変換酵素阻害剤は、上記に例示したポリペプチドをそのまま又は適当な担体と共に適宜製剤化することによって得ることができる。
【００４８】
担体としては、製剤分野において常用され、かつ本発明のポリペプチドと反応しない物質を用いることができる。
【００４９】
具体的には、例えば乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、テンプン、庶糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン界面活性剤、プロピレングリコール、水等が挙げられる。剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、坐剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。尚、液体製剤にあっては、用時、水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、ポリペプチドを水、生理食塩水あるいはブドウ糖溶液等に溶解させてもよい。また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。
【００５０】
本発明のアンギオテンシン変換酵素阻害剤における、上記ポリペプチドの含有量は所望に応じて適宜設定し得るが、０．０００１〜１００％程度、好ましくは０．０１〜１０％程度の割合で含有する。
【００５１】
本発明のアンギオテンシン変換酵素阻害剤には、降圧作用を有する他の成分や各種の添加剤を含有させてもよい。
【００５２】
本発明のアンギオテンシン変換酵素阻害剤は、血圧降下作用、ブラジキニン不活化抑制作用を奏し得ることから、本態性高血圧、腎性高血圧、副腎性高血圧などの高血圧症の予防乃至治療剤、狭心病発作の閾値上昇、心筋梗塞の減少、うっ血性心不全における病態の改善剤等として用いることができる。
【００５３】
高血圧予防用食品
本発明の高血圧予防用食品は、上記本発明のポリペプチド又はアンギオテンシン変換酵素阻害剤を適当な食材に含有させることにより得ることができる。
【００５４】
食材としては、例えば、豚肉、牛肉、家兎肉（ウサギ）、羊肉、山羊肉、馬肉、鶏肉、七面鳥肉、ウズラ肉、鯨肉、サメ肉、タラやサケといった魚肉類等が挙げられる。
【００５５】
食品の形態としては、ソーセージ、ハム、ハンバーグ、ミートボールなどの畜肉加工品、カレー、コロッケ、鶏肉唐揚げ、春巻き、ロールキャベツなどの惣菜類、スープ類、栄養ドリンク類、ゼリー、アイスクリームなどのデザート類、スナック・菓子類、錠剤タイプの栄養機能食品類、唐揚げ粉などの混合調味料類、粉末調味料類等が挙げられる。
【００５６】
本発明の食品においては、上記ポリペプチド又はアンギオテンシン変換酵素阻害剤は、いずれかのアミノ酸骨格を有するものを、１種単独で、又は２種以上を併用して用いることができる。
【００５７】
本発明の食品におけるポリペプチド又はアンギオテンシン変換酵素阻害剤の含有量は、所望に応じて適宜設定し得るが、ポリペプチドとして０．０００１〜９９％程度、好ましくは０．０１〜１０％程度である。
【００５８】
本発明の食品には、降圧作用を有する他の成分や食品に一般に用いられる添加剤、例えばソルビン酸などの保存料、リン酸塩などの結着補強剤、カラギーナンなどの増粘剤、ビタミンＣなどの強化剤、亜硝酸ナトリウムなどの発色剤、安定剤、酸化防止剤、固結防止剤等を適宜含有していてもよい。
【００５９】
本発明の食品は、上記ポリペプチド及び該ポリペプチドを含有するアンギオテンシン変換酵素阻害剤を含んでいることから、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性を有し、強力な血圧上昇作用を有するアンギオテンシンＩＩの変換阻害作用や降圧作用のあるブラジキニンの分解阻害作用に基づく血圧降下作用を奏する。
【００６０】
このような性質から、本発明は、本態性高血圧、腎性高血圧、副腎性高血圧などの高血圧症の予防用食品として、好適に用いることができる。
【００６１】
【実施例】
以下、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６２】
実施例１
国産の豚ロース肉から抽出した粗精製トロポニン（分子量範囲約１４〜３１ｋＤａ）をペプシンで加水分解した。粗精製トロポニンは、以下のような精製を行うことにより得た。低塩濃度水溶液（１％トライトンＸ−１００，５０ｍＭ塩化カリウム，５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン，ｐＨ８．０）で洗浄したひき肉をアセトンパウダーにし、そこから高塩濃度バッファー（１Ｍ塩化カリウム，２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン，０．１ｍＭ塩化カルシウム，０．１ｍＭジチオトレイトール，１ｍＭアジ化ナトリウム，ｐＨ８．０）の溶液で抽出した。抽出液に塩酸を加えｐＨを４．６とした後、遠心して得られた上清のｐＨをさらに水酸化カリウムで７．０に調整して硫酸アンモニウムを加え、硫酸アンモニウム濃度４０％から６０％の間で沈殿してくる画分を集めた。この沈殿をバッファー（２ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン，０．５ｍＭジチオトレイトール，２ｍＭアジ化ナトリウム，ｐＨ７．５）に透析することで、粗精製トロポニンを得た。
【００６３】
なお、この粗精製トロポニンにはミオシン軽鎖（分子量約１５〜２６ｋＤａ）が含まれていることが、ポリアクリルアミド電気泳動により確認された。この粗精製トロポニンのペプシン加水分解物のウシ肺由来のＡＣＥに対する５０％阻害活性（ＩＣ_５０）は２２５ｍｇ／ｍｌであった。未加水分解トロポニンにはＡＣＥ阻害活性が認められなかったことから、活性の発現はペプシン分解で生じたペプチドに由来することが推定された。
【００６４】
以下、実施例１において、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）に対する５０％阻害活性（ＩＣ_５０）は、ウシ肺由来ＡＣＥを用いて、Ｃｕｓｈｍａｎ− Ｃｈｅｕｎｇの方法（ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２０：１６３７−１６４８，１９７１）で測定した。
【００６５】
該加水分解物をまず、ＤＥ５３カラム（ＷｈａｔｍａｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＬｔｄ．，Ｋｅｎｔ，ＵＫ）（１６ｘ１５０ｍｍ）を用いる陰イオン交換クロマトグラフィーに供した。すなわち、２０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（酢酸でｐＨ７．５に調整したもの）で該加水分解物をアプライし、同バッファーを含むＮａＣｌ水溶液によるグラジェント（０−３００ｍＭ）溶出を行った。流速は１．１３ｍｌ／分とし、７分毎（７．９１ｍｌ）に分画したのち、２１５ｎｍと２８０ｎｍの吸光度を測定した（図１）。得られた画分をＳＥＰ−ＰＡＫＰｌｕｓＣ_１８カートリッジ（ＷａｔｅｒｓＣｏ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて脱塩し、吸着画分を５０％アセトニトリルで溶出させて得られた画分を濃縮して、その活性を測定した。特に強い活性が認められたのは、初期に溶出した画分（ＩＣ_５０＝２０１ｍｇ／ｍｌ）であった。この活性画分をコスモシール５Ｃ_１８ＡＲ−ＩＩ（４．５ｘ１５０ｍｍ）（ＮａｃａｌａｉＴｅｓｑｕｅＩｎｃ．，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を用いる逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣに供し、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含むアセトニトリルの１−８０％のグラジェント溶出（流速０．５ｍｌ／分）で分画し、２１５ｎｍの吸光度をモニターした（図２）。以降の精製過程でも２１５ｎｍの吸光度を測定した。
【００６６】
次に、図２のフラクション５（ＩＣ_５０＝１３８ｍｇ／ｍｌ）をコスモシール５Ｃ_１８ＡＲ−ＩＩ（４．５ｘ１５０ｍｍ）（ＮａｃａｌａｉＴｅｓｑｕｅ）を用いるＲＰ−ＨＰＬＣに供し、０．１％ＴＦＡを含む１２％ＣＨ_３ＣＮでイソクラティック溶出（流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ）した（図３）。ここで得られた活性画分ＡおよびＢをＴＳＫ−ｇｅｌＧ２０００ＳＷ_ＸＬ（７．８ｘ３００ｍｍ）（ＴｏｓｏｈＣｏ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いるゲルろ過ＨＰＬＣにそれぞれ供して、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）でイソクラティック溶出（流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ）した（図４）。ここで得られた活性の強い画分（Ａ由来：ＩＣ_５０＝１１９ｍｇ／ｍｌ，Ｂ由来：ＩＣ_５０＝２７ｍｇ／ｍｌ）をコスモシール５ＰＥ−ＭＳ（４．６ｘ２５０ｍｍ）（ＮａｃａｌａｉＴｅｓｑｕｅ）を用いるＲＰ−ＨＰＬＣに供し、０．１％ＴＦＡを含む１２％ＣＨ_３ＣＮでイソクラティック溶出（流速１ｍｌ／ｍｉｎ）した。同カラムでさらに二回繰り返し精製（１２％および１４％ＣＨ_３ＣＮ）することで単一と認められるピークをそれぞれ得た（図５）。
【００６７】
さらに、図２のフラクション７（ＩＣ_５０＝１１４ｍｇ／ｍｌ）をコスモシール５Ｃ_１８ＡＲ−ＩＩ（４．５ｘ１５０ｍｍ）（ＮａｃａｌａｉＴｅｓｑｕｅ）を用いるＲＰ−ＨＰＬＣに供し、０．１％ＴＦＡを含む１６％ＣＨ_３ＣＮでイソクラティック溶出（流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ）した（図６）。ここで得られた活性画分ＬをＴＳＫ−ｇｅｌＧ２０００ＳＷ_ＸＬ（７．８ｘ３００ｍｍ）（Ｔｏｓｏｈ）を用いるゲルろ過ＨＰＬＣに供して、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）でイソクラティック溶出（流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ）した（図７）。ここで得られた活性の強い画分（Ｌ由来：ＩＣ_５０＝５７ｍｇ／ｍｌ）をコスモシール５ＰＥ−ＭＳ（４．６ｘ２５０ｍｍ）（ＮａｃａｌａｉＴｅｓｑｕｅ）を用いるＲＰ−ＨＰＬＣに供し、０．１％ＴＦＡを含む１５％ＣＨ_３ＣＮでイソクラティック溶出（流速１ｍｌ／ｍｉｎ）した。同カラムでさらに二回繰り返し精製（１２％ＣＨ_３ＣＮを二回）することで単一と認められるピークを得た（図８）。
【００６８】
精製で得られた画分のアミノ酸配列を、プロテインシーケンサーＰｒｏｃｉｓｅ４９２（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）でシーケンス解析した。その結果、画分Ａから得られたペプチドはＶＫＫＶＬＧＮＰ、画分Ｂから得られたペプチドはＥＫＥＲＥＲＱ、画分Ｌから得られたペプチドはＫＲＱＫＹＤＩであると認められた。これらのペプチドはこれまでに報告のない、新規なＡＣＥ阻害ペプチドであった。
これらのアミノ酸配列をデータベースＳｗｉｓｓＰｒｏｔ（ＥＭＢＬＯｕｔｓｔａｔｉｏｎ− ＥｕｒｏｐｅａｎＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＷｅｌｌｃｏｍｅＴｒｕｓｔＧｅｎｏｍｅＣａｍｐｕｓ，Ｈｉｎｘｔｏｎ，ＣａｍｂｒｉｄｇｅＣＢ１０１ＳＤ，ＵＫ）で検索した結果、ＶＫＫＶＬＧＮＰは豚のミオシン軽鎖の４７位から５４位に一致し、材料として使用した粗精製トロポニンに含まれていたミオシン軽鎖（分子量約１５〜２６ｋＤａ）由来と認められた。ＥＫＥＲＥＲＱおよびＫＲＱＫＹＤＩは、ウサギ、ウシ、ラット、ヒト、マウスの骨格筋トロポニンＴに含まれるペプチドと一致した。
【００６９】
本発明で利用した粗精製トロポニン（分子量範囲約１４〜３１ｋＤａ、ミオシン軽鎖を含む）は豚骨格筋由来のものであるが、豚トロポニンの配列はトロポニンＣ、トロポニンＩ、トロポニンＴとも、未だ確定していない。データベースには豚トロポニンＣのアミノ酸配列が一応登録されてはいるものの、トロポニンＩおよびトロポニンＴのアミノ酸配列は登録されておらず、本発明のペプチドと完全に一致する配列は見出せなかった。しかし、豚以外の動物のトロポニンのアミノ酸配列がデータベースに登録されているため、本研究で得られたペプチドがこれらのトロポニン中に存在するかどうかを検索した。その結果、ＥＫＥＲＥＲＱは、ウサギ（１２０〜１２６残基目）、ウシ（１２０〜１２６残基目）、ラット（１０２〜１０８残基目）、ヒト（１１２〜１１８残基目）、マウス（１０４〜１１０残基目）のトロポニンＴに存在していた。また、ＫＲＱＫＹＤＩはウサギ（２３０〜２３６残基目）、ウシ（２３０〜２３６残基目）、ラット（２１２〜２１８残基目）、ヒト（２２２〜２２８残基目）、マウス（２１４〜２２０残基目）のトロポニンＴに存在していた。これらのことから豚のトロポニンＴにも同じ配列のペプチドが存在している可能性が認められ、本研究で見出したペプチドは豚肉を材料として得られたものであるため、トロポニンＴ由来であると推定された。
【００７０】
実施例２
実施例１で同定したＡＣＥ阻害ペプチド３種類と、その関連ペプチドであるＶＫＫＶＬＧＮＰＳＮ（豚ミオシン軽鎖の４７位から５６位に相当）とＫＲＱＫＹ（ウサギトロポニンＴの２３０位から２３４位に相当）をＦｍｏｃ固相合成法で合成した。
【００７１】
ＡＣＥ阻害活性の評価
実施例２で作成したペプチドのＩＣ_５０、分子量、及びＲＰ−ＨＰＬＣ（（ＴＳＫｇｅｌＯＤＳ−８０ＴＳ、４．５ｘ２５０ｍｍ、Ｔｏｓｏｈ）で０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルの５−５５％（２０分）のグラジェント溶出（流速１ｍｌ／ｍｉｎ））の保持時間（ＲＴ）を表１に示す。
【００７２】
実施例２において、ＡＣＥに対する５０％阻害活性（ＩＣ_５０）は、ウサギ肺由来のＡＣＥを用いて、Ｃｕｓｈｍａｎ− Ｃｈｅｕｎｇの方法（ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２０：１６３７−１６４８，１９７１）で測定した。
【００７３】
【表１】

【００７４】
【発明の効果】
本発明は、豚肉や牛肉に多く含まれる筋タンパク質であるトロポニンやミオシンから得られる、新規なアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性を有するポリペプチドを提供するものである。
【００７５】
本発明のポリペプチド乃至アンギオテンシン変換酵素阻害剤は、顕著なアンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するだけでなく、天然の食肉由来のタンパク質を生体内にも存在する消化酵素を用いて分解して得られることから、安全性が高く、毒性も低い。
【００７６】
このような特性により、本発明のポリペプチド乃至アンギオテンシン変換酵素阻害剤は、医薬用の薬理成分として有用であるばかりでなく、血圧降下作用等を有する高血圧予防用食品等の付加価値の高い機能性食品を作る素材としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、粗精製トロポニンのペプシン加水分解物を試料とする陰イオン交換クロマトグラフィーを行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図２】図２は、図１に示される活性画分をコスモシール（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ）５Ｃ_１８ＡＲ−ＩＩを用いる逆相高速液体クロマトグラフィーに供した際のクロマトグラムを示す図である。
【図３】図３は、図２に示される活性画分５を再度コスモシール５Ｃ_１８ＡＲ−ＩＩを用いる逆相高速液体クロマトグラフィーに供した際のクロマトグラムを示す図である。
【図４】図４は、図３に示される活性画分ＡおよびＢをそれぞれＴＳＫ−ｇｅｌＧ２０００ＳＷ_ＸＬを用いるゲル濾過高速液体クロマトグラフィーに供した際のクロマトグラムを示す図である。
【図５】図５は、図４に示されるふたつの活性画分（画分ＡおよびＢ由来）をそれぞれコスモシール５ＰＥ−ＭＳを用いる逆相高速液体クロマトグラフィーに供した際のクロマトグラムを示す図である。
【図６】図６は、図２に示される活性画分７を再度コスモシール５Ｃ_１８ＡＲ−ＩＩを用いる逆相高速液体クロマトグラフィーに供した際のクロマトグラムを示す図である。
【図７】図７は、図６に示される活性画分ＬをＴＳＫ−ｇｅｌＧ２０００ＳＷ_ＸＬを用いるゲル濾過高速液体クロマトグラフィーに供した際のクロマトグラムを示す図である。
【図８】図８は、図７に示される活性画分（画分Ｌ由来）をコスモシール５ＰＥ−ＭＳを用いる逆相高速液体クロマトグラフィーに供した際のクロマトグラムを示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a polypeptide useful as an angiotensin converting enzyme inhibitor or an active ingredient of a food for preventing hypertension.
[0002]
[Prior art]
Angiotensin converting enzyme (ACE) is present mainly in human vascular endothelial cells, lung, kidney and brain. This enzyme acts on angiotensin I to cleave two amino acids (His-Leu) from the C-terminus, thereby converting it into angiotensin II having a strong blood pressure increasing effect. This enzyme is also involved in the degradation of antihypertensive bradykinin.
[0003]
Therefore, if the activity of the angiotensin converting enzyme is inhibited, it is considered that the blood pressure is reduced, which is effective in preventing or treating hypertension.
[0004]
Until now, various substances having angiotensin converting enzyme inhibitory activity have been found.
[0005]
For example, casein and clam meat protein degradation products contained in milk and the like have been studied (for example, see Patent Documents 1 and 2). However, these do not utilize muscle proteins that are often contained in animal meat such as pork and beef.
[0006]
In addition, a degradation product of a protein derived from livestock meat has been reported (see Non-Patent Document 1). However, in order to have a sufficient ACE inhibitory action, a modification step such as addition of a peptide is required, and a naturally occurring protein having no modification step and the like having a satisfactory activity has been found. Did not.
[0007]
[Patent Document 1]
JP 2001-106700A
[0008]
[Patent Document 2]
JP-A-7-101985
[0009]
[Non-patent document 1]
Arihara et al., "Meat Science", 57, 319-324, (2001).
[0010]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a substance which has remarkable angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory activity, is obtained from natural products, has low toxicity and high safety.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies for the purpose of finding a substance having a novel angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory activity. As a result, it was found that a substance having remarkable angiotensin converting enzyme inhibitory activity was present in the enzymatically degraded product of partially purified troponin (molecular weight range: about 14 to 31 kDa, including myosin light chain). Was completed.
[0012]
That is, the present invention relates to the following matters.
[0013]
The first item of the present invention relates to a polypeptide having an angiotensin converting enzyme inhibitory activity, comprising 7 to 10 amino acid residues and having any one of the following three amino acid sequences.
Val-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Asn-Pro;
Glu-Lys-Glu-Arg-Glu-Arg-Gln;
Lys-Arg-Gln-Lys-Tyr-Asp-Ile.
[0014]
Preferably,
8 amino acids consisting of Val-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Asn-Pro,
10 amino acids obtained by adding two amino acid residues to the N-terminal or C-terminal of Val-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Asn-Pro;
7 amino acids consisting of Glu-Lys-Glu-Arg-Glu-Arg-Gln or Lys-Arg-Gln-Lys-Tyr-Asp-Ile, or Glu-Lys-Glu-Arg-Glu-Arg-Gln or The present invention relates to a polypeptide comprising nine amino acids with two amino acid residues added to the N-terminal or C-terminal of Lys-Arg-Gln-Lys-Tyr-Asp-Ile and having angiotensin converting enzyme inhibitory activity.
[0015]
More preferably, a polypeptide consisting of 8 to 10 amino acid residues, having an amino acid sequence of Val-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Asn-Pro, having a myosin-derived angiotensin converting enzyme inhibitory activity,
Or, a troponin consisting of 7 to 9 amino acid residues and having any amino acid sequence of Glu-Lys-Glu-Arg-Glu-Arg-Gln or Lys-Arg-Gln-Lys-Tyr-Asp-Ile. The present invention relates to a T-derived polypeptide having an angiotensin converting enzyme inhibitory activity.
[0016]
More specifically, eight amino acids consisting of Val-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Asn-Pro, or N-terminal or C-terminal of Val-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Asn-Pro A polypeptide consisting of 10 amino acids with two amino acid residues added to the terminus and having angiotensin converting enzyme inhibitory activity derived from myosin;
Alternatively, 7 amino acids consisting of Glu-Lys-Glu-Arg-Glu-Arg-Gln or Lys-Arg-Gln-Lys-Tyr-Asp-Ile,
Alternatively, Glu-Lys-Glu-Arg-Glu-Arg-Gln or Lys-Arg-Gln-Lys-Tyr-Asp-Ile has 9 amino acids with two amino acid residues added to the N-terminus or C-terminus. The present invention relates to a polypeptide having troponin T-derived angiotensin converting enzyme inhibitory activity.
[0017]
Item 2 of the present invention is an angiotensin converting enzyme inhibitor comprising 5 to 10 amino acid residues and containing one or more active ingredients of a polypeptide having any one of the following five amino acid sequences: Pertaining to the agent.
Val-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Asn-Pro;
Val-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Asn-Pro-Ser-Asn;
Glu-Lys-Glu-Arg-Glu-Arg-Gln;
Lys-Arg-Gln-Lys-Tyr-Asp-Ile;
Lys-Arg-Gln-Lys-Tyr.
[0018]
Preferably, the following five polypeptides;
A polypeptide consisting of Val-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Asn-Pro,
A polypeptide consisting of Val-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Asn-Pro-Ser-Asn;
A polypeptide consisting of Glu-Lys-Glu-Arg-Glu-Arg-Gln;
A polypeptide consisting of Lys-Arg-Gln-Lys-Tyr-Asp-Ile, or
Polypeptide consisting of Lys-Arg-Gln-Lys-Tyr
The present invention relates to an angiotensin converting enzyme inhibitor comprising one or more of the following as an active ingredient.
[0019]
More preferably, the following polypeptides;
A myosin-derived polypeptide consisting of Val-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Asn-Pro;
A myosin-derived polypeptide consisting of Val-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Asn-Pro-Ser-Asn;
A troponin T-derived polypeptide consisting of Glu-Lys-Glu-Arg-Glu-Arg-Gln;
A troponin T-derived polypeptide consisting of Lys-Arg-Gln-Lys-Tyr-Asp-Ile, or
Troponin T-derived polypeptide consisting of Lys-Arg-Gln-Lys-Tyr
The present invention relates to an angiotensin converting enzyme inhibitor comprising one or more of the following as an active ingredient.
[0020]
The third item of the present invention is that crude troponin (molecular weight range of about 14 to 31 kDa, including myosin light chain) is composed of 7 to 10 amino acid residues using a proteolytic enzyme. The present invention relates to a method for producing an angiotensin converting enzyme inhibitor, which comprises a step of hydrolyzing to a polypeptide having at least one amino acid sequence of
Val-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Asn-Pro;
Glu-Lys-Glu-Arg-Glu-Arg-Gln;
Lys-Arg-Gln-Lys-Tyr-Asp-Ile.
[0021]
Preferably, myosin in the crudely purified troponin (molecular weight range: about 14 to 31 kDa, including myosin light chain) is converted into eight varieties of Val-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Asn-Pro using a protease. Or a step of hydrolyzing to a polypeptide consisting of 10 amino acids with two amino acid residues added to the N-terminus or C-terminus of Val-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Asn-Pro. And a method for producing an angiotensin converting enzyme inhibitor.
[0022]
Alternatively, troponin T in crude troponin (molecular weight range of about 14 to 31 kDa, including myosin light chain) can be converted to Glu-Lys-Glu-Arg-Glu-Arg-Gln or Lys-Arg-Gln using a protease. 7 amino acids consisting of -Lys-Tyr-Asp-Ile, or N-terminal or C-terminal of Glu-Lys-Glu-Arg-Glu-Arg-Gln or Lys-Arg-Gln-Lys-Tyr-Asp-Ile The present invention relates to a method for producing an angiotensin converting enzyme inhibitor, which comprises a step of hydrolyzing to a polypeptide consisting of 9 amino acids obtained by adding two amino acid residues to a polypeptide.
[0023]
Preferably, crude troponin (molecular weight range of about 14-31 kDa, including myosin light chain) is composed of 7-10 amino acid residues using pepsin, trypsin or chymotrypsin and comprises at least one of the following three: Two amino acid sequences:
Val-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Asn-Pro;
Glu-Lys-Glu-Arg-Glu-Arg-Gln;
Lys-Arg-Gln-Lys-Tyr-Asp-Ile
The present invention relates to a method for producing an angiotensin converting enzyme inhibitor, which comprises a step of hydrolyzing to a polypeptide having
[0024]
Item 4 of the present invention is that the angiotensin converting enzyme inhibitor comprises 5 to 10 amino acid residues, and has one of the following five amino acid sequences:
Val-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Asn-Pro;
Val-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Asn-Pro-Ser-Asn;
Glu-Lys-Glu-Arg-Glu-Arg-Gln;
Lys-Arg-Gln-Lys-Tyr-Asp-Ile;
Lys-Arg-Gln-Lys-Tyr
Item 4 relates to the production method according to Item 3, which comprises one or more of the polypeptides having the following as an active ingredient:
[0025]
Preferably, the crude troponin (molecular weight range of about 14-31 kDa, including myosin light chain) is composed of 7-10 amino acid residues using pepsin, trypsin or chymotrypsin and comprises at least one of the following three: Two amino acid sequences:
Val-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Asn-Pro;
Glu-Lys-Glu-Arg-Glu-Arg-Gln;
Lys-Arg-Gln-Lys-Tyr-Asp-Ile
Comprising a step of hydrolyzing to a polypeptide having
Consists of 5 to 10 amino acid residues and is an amino acid sequence of any one of the following 5:
Val-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Asn-Pro;
Val-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Asn-Pro-Ser-Asn;
Glu-Lys-Glu-Arg-Glu-Arg-Gln;
Lys-Arg-Gln-Lys-Tyr-Asp-Ile;
Lys-Arg-Gln-Lys-Tyr
The present invention relates to a method for producing an angiotensin-converting enzyme inhibitor, which comprises one or more of polypeptides having the following as an active ingredient.
[0026]
Item 5 of the present invention relates to a food for preventing hypertension, comprising the polypeptide of Item 1 or the angiotensin converting enzyme inhibitor of Item 2 as an active ingredient.
[0027]
Preferably, eight amino acids consisting of Val-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Asn-Pro, or 2 amino acids at the N-terminus or C-terminus of Val-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Asn-Pro The present invention relates to a food for preventing hypertension comprising, as an active ingredient, a polypeptide having myosin-derived angiotensin-converting enzyme inhibitory activity, comprising 10 amino acids to which 10 amino acid residues have been added.
[0028]
Alternatively, seven amino acids consisting of Glu-Lys-Glu-Arg-Glu-Arg-Gln or Lys-Arg-Gln-Lys-Tyr-Asp-Ile, or Glu-Lys-Glu-Arg-Glu-Arg- Glon or Lys-Arg-Gln-Lys-Tyr-Asp-Ile having 9 amino acids in which two amino acid residues are added to the N-terminal or C-terminal of the troponin T-derived angiotensin converting enzyme-inhibiting enzyme The present invention relates to a food for preventing hypertension containing a peptide as an active ingredient.
[0029]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0030]
Polypeptide
The polypeptide in the present invention is a polypeptide consisting of 7 to 10 amino acid residues, having any one of the following three skeletons, and having angiotensin converting enzyme inhibitory activity.
Val-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Asn-Pro;
Glu-Lys-Glu-Arg-Glu-Arg-Gln;
Lys-Arg-Gln-Lys-Tyr-Asp-Ile.
[0031]
The polypeptide of the present invention is, specifically,
8 amino acids consisting of Val-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Asn-Pro,
10 amino acids obtained by adding two amino acid residues to the N-terminal or C-terminal of Val-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Asn-Pro;
Seven amino acids consisting of Glu-Lys-Glu-Arg-Glu-Arg-Gln or Lys-Arg-Gln-Lys-Tyr-Asp-Ile, or Glu-Lys-Glu-Arg-Glu-Arg-Gln or A polypeptide comprising nine amino acids with two amino acid residues added to the N-terminal or C-terminal of Lys-Arg-Gln-Lys-Tyr-Asp-Ile and having angiotensin converting enzyme inhibitory activity.
[0032]
It has now been found that polypeptides having the above skeleton have excellent angiotensin converting enzyme inhibitory activity.
[0033]
Here, Val-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Asn-Pro (VKKVLGNP) is a peptide derived from position 47 to position 54 from the myosin light chain (Davoli et al. Animal Biotechnology, 8: 179-185, 1997). It is. Among myosin-derived peptides, those having excellent angiotensin converting enzyme inhibitory activity such as the peptide have not been known so far.
[0034]
Glu-Lys-Glu-Arg-Glu-Arg-Gln (EKERERQ) and Lys-Arg-Gln-Lys-Tyr-Asp-Ile (KRQKYDI) are troponin T (Moir et al., Biochemical, January 16, 2017). -382, 1977).
[0035]
No troponin T-derived peptide having angiotensin converting enzyme inhibitory activity has been known so far.
[0036]
The polypeptide of the present invention can be obtained by hydrolyzing crude troponin (molecular weight range: about 14 to 31 kDa, including myosin light chain) with a proteolytic enzyme. As the partially purified troponin, those extracted from proteins derived from rabbits, cows, pigs and the like can be used.
[0037]
The crudely purified troponin is specifically obtained by performing the following purification. The ground meat washed with the low salt aqueous solution is made into acetone powder, from which it is extracted with a high salt buffer. Hydrochloric acid is added to the extract to adjust the pH to 4.6, and then the supernatant obtained by centrifugation is further adjusted to pH 7.0 with potassium hydroxide. Then, ammonium sulfate is added, and the fraction that precipitates at an ammonium sulfate concentration of 40% to 60% is collected. The precipitate is dialyzed using a buffer to obtain a crudely purified troponin.
[0038]
Examples of proteolytic enzymes include trypsin, chymotrypsin, pepsin and the like.
[0039]
The conditions for hydrolysis by the protease can be set as appropriate, but generally trypsin and chymotrypsin have a pH of 7.0 to 8.5, pepsin has a pH of 1 to 3, and the temperature is generally 25 to 37 ° C. is there.
[0040]
The polypeptide of the present invention is obtained by hydrolyzing crude troponin (molecular weight range: about 14 to 31 kDa, including myosin light chain) with a protein hydrolase, and then subjecting the product to ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, reverse It is obtained by purifying by appropriately combining phase HPLC and the like.
[0041]
The polypeptide of the present invention may be synthesized by a known method such as Fmoc solid phase synthesis.
[0042]
Angiotensin converting enzyme inhibitor
The angiotensin converting enzyme inhibitor of the present invention is obtained by containing one or more of the above-mentioned polypeptides having angiotensin converting enzyme inhibitory activity as active ingredients. Specifically, it is an angiotensin converting enzyme inhibitor comprising one or two or more polypeptides consisting of 7 to 10 amino acid residues and having any one of the following three skeletons.
Val-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Asn-Pro;
Glu-Lys-Glu-Arg-Glu-Arg-Gln;
Lys-Arg-Gln-Lys-Tyr-Asp-Ile.
[0043]
In the angiotensin converting enzyme inhibitor of the present invention,
Val-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Asn-Pro;
Glu-Lys-Glu-Arg-Glu-Arg-Gln; or
A peptide having an angiotensin-converting enzyme inhibitory activity, which is obtained by adding an appropriate amino acid residue to the skeleton of Lys-Arg-Gln-Lys-Tyr-Asp-Ile or lacking an amino acid residue, is effective. Used as a component.
[0044]
For example, the present invention provides an angiotensin converting enzyme inhibitor comprising, as an active ingredient, one or more polypeptides having 5 to 10 amino acid residues and having any one of the following five backbones: Is included.
Val-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Asn-Pro;
Val-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Asn-Pro-Ser-Asn;
Glu-Lys-Glu-Arg-Glu-Arg-Gln;
Lys-Arg-Gln-Lys-Tyr-Asp-Ile;
Lys-Arg-Gln-Lys-Tyr.
[0045]
Here, Val-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Asn-Pro-Ser-Asn (VKKVLGNPSN) is one in which two amino residues are added to VKKVLGNNP, and 56 to 47 from the 47th position of the myosin light chain. Correspond to the rank.
[0046]
Further, Lys-Arg-Gln-Lys-Tyr (KRQKY) is obtained by deleting two amino acid residues from KRQKYDI.
[0047]
An angiotensin converting enzyme inhibitor can be obtained by appropriately formulating the polypeptide exemplified above as it is or together with a suitable carrier.
[0048]
As the carrier, a substance that is commonly used in the field of pharmaceuticals and that does not react with the polypeptide of the present invention can be used.
[0049]
Specifically, for example, lactose, glucose, mannitol, dextrin, cyclodextrin, starch, sucrose, magnesium metasilicate aluminate, synthetic aluminum silicate, sodium carboxymethylcellulose, hydroxypropyl starch, carboxymethylcellulose calcium, ion exchange resin, methylcellulose , Gelatin, gum arabic, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, light anhydrous silicic acid, magnesium stearate, talc, tragacanth, bentonite, veegum, titanium oxide, sorbitan fatty acid ester, sodium lauryl sulfate, glycerin, Fatty acid glycerin ester, purified lanolin, glycerogelatin, polysorbate, macro Lumpur, vegetable oils, waxes, liquid paraffin, white petrolatum, fluorocarbons, nonionic surfactants, propylene glycol, water and the like. Dosage forms include tablets, capsules, granules, powders, syrups, suspensions, suppositories, ointments, creams, gels, patches, inhalants, injections, and the like. In the case of a liquid preparation, it may be in the form of being dissolved or suspended in water or another appropriate medium at the time of use. Tablets and granules may be coated by a known method. In the case of an injection, the polypeptide may be dissolved in water, physiological saline, a glucose solution, or the like. Further, a buffer and a preservative may be added.
[0050]
The content of the polypeptide in the angiotensin converting enzyme inhibitor of the present invention can be appropriately set as desired, but is contained at a rate of about 0.0001 to 100%, preferably about 0.01 to 10%.
[0051]
The angiotensin converting enzyme inhibitor of the present invention may contain other components having a hypotensive effect and various additives.
[0052]
The angiotensin-converting enzyme inhibitor of the present invention can exert an antihypertensive action and an inhibitory action on bradykinin inactivation, so that essential hypertension, renal hypertension, a preventive or therapeutic agent for hypertension such as adrenal hypertension, an agent for angina attack, It can be used as an agent for improving a pathological condition in an increase in threshold value, a decrease in myocardial infarction, and congestive heart failure.
[0053]
Foods for preventing hypertension
The food for preventing hypertension of the present invention can be obtained by incorporating the polypeptide of the present invention or the angiotensin converting enzyme inhibitor into a suitable foodstuff.
[0054]
Examples of the food materials include pork, beef, rabbit (rabbit), lamb, goat, horse, chicken, turkey, quail, whale, shark, fish such as cod and salmon.
[0055]
Food forms include processed meat products such as sausages, hams, hamburgers, meatballs, curry, croquettes, fried chicken, spring rolls, rolled cabbage, and other prepared foods, soups, energy drinks, jelly, ice cream, etc. Desserts, snacks / confectionery, tablet-type nutritionally functional foods, mixed seasonings such as fried powder, powder seasonings, and the like.
[0056]
In the food of the present invention, the above-mentioned polypeptide or angiotensin converting enzyme inhibitor having any amino acid skeleton can be used alone or in combination of two or more.
[0057]
The content of the polypeptide or the angiotensin converting enzyme inhibitor in the food of the present invention can be appropriately set as desired, but is about 0.0001 to 99%, preferably about 0.01 to 10% as the polypeptide. .
[0058]
In the food of the present invention, other components having an antihypertensive action and additives generally used in foods, for example, preservatives such as sorbic acid, binding reinforcing agents such as phosphates, thickeners such as carrageenan, vitamin C And a coloring agent such as sodium nitrite, a stabilizer, an antioxidant, an anti-caking agent, and the like.
[0059]
Since the food of the present invention contains the above-mentioned polypeptide and an angiotensin converting enzyme inhibitor containing the polypeptide, it has angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory activity and angiotensin II having a strong blood pressure increasing action. It exerts a blood pressure lowering effect based on the effect of inhibiting the degradation of bradykinin, which has a conversion inhibiting effect and a blood pressure lowering effect.
[0060]
Due to such properties, the present invention can be suitably used as a food for preventing hypertension such as essential hypertension, renal hypertension, and adrenal hypertension.
[0061]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
[0062]
Example 1
Crude troponin (molecular weight range: about 14 to 31 kDa) extracted from domestic pork loin was hydrolyzed with pepsin. The partially purified troponin was obtained by performing the following purification. The ground meat washed with a low salt aqueous solution (1% Triton X-100, 50 mM potassium chloride, 5 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane, pH 8.0) was converted into acetone powder, and a high salt buffer (1 M) was added thereto. It was extracted with a solution of potassium chloride, 25 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane, 0.1 mM calcium chloride, 0.1 mM dithiothreitol, 1 mM sodium azide, pH 8.0). Hydrochloric acid was added to the extract to adjust the pH to 4.6, then the supernatant obtained by centrifugation was further adjusted to pH 7.0 with potassium hydroxide, and ammonium sulfate was added. Fractions that precipitated in were collected. The precipitate was dialyzed against a buffer (2 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane, 0.5 mM dithiothreitol, 2 mM sodium azide, pH 7.5) to obtain a crude purified troponin.
[0063]
In addition, it was confirmed by polyacrylamide electrophoresis that the partially purified troponin contained a myosin light chain (molecular weight: about 15 to 26 kDa). 50% inhibitory activity of this crude troponin pepsin hydrolyzate on ACE from bovine lung (IC₅₀) Was 225 mg / ml. Since no ACE inhibitory activity was observed for unhydrolyzed troponin, it was presumed that the expression of the activity was derived from the peptide generated by pepsin degradation.
[0064]
Hereinafter, in Example 1, 50% inhibitory activity against angiotensin converting enzyme (ACE) (IC₅₀) Was measured by the method of Cushman-Cheng (Biochemical Pharmacology, 20: 1637-1648, 1971) using ACE derived from bovine lung.
[0065]
The hydrolyzate was first subjected to anion exchange chromatography using a DE53 column (Whatman International Ltd., Kent, UK) (16 × 150 mm). That is, the hydrolyzate was applied with 20 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane (adjusted to pH 7.5 with acetic acid), and a gradient (0-300 mM) elution was performed with an aqueous NaCl solution containing the same buffer. . The flow rate was 1.13 ml / min. After fractionation every 7 minutes (7.91 ml), the absorbance at 215 nm and 280 nm was measured (FIG. 1). The obtained fraction was subjected to SEP-PAK PlusC₁₈The salt was desalted using a cartridge (Waters Co., Milford, Mass., USA), the adsorbed fraction was eluted with 50% acetonitrile, the obtained fraction was concentrated, and the activity was measured. Particularly strong activity was observed in the fraction (IC₅₀  = 201 mg / ml). This active fraction is used for Cosmoseal 5C₁₈  AR-II (4.5 × 150 mm) (Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan) subjected to reverse phase (RP) -HPLC and 1-80 of acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid (TFA). % Elution (flow rate 0.5 ml / min) and the absorbance at 215 nm was monitored (FIG. 2). The absorbance at 215 nm was also measured in the subsequent purification steps.
[0066]
Next, the fraction 5 (IC₅₀  = 138 mg / ml) with Cosmoseal 5C₁₈  RP-HPLC using AR-II (4.5 × 150 mm) (Nacalai Tesque), 12% CH containing 0.1% TFA₃Isocratic elution was performed with CN (flow rate: 0.5 ml / min) (FIG. 3). The active fractions A and B obtained here were combined with TSK-gel G2000SW._XL  (7.8 x 300 mm) Each was subjected to gel filtration HPLC using (Tosoh Co., Tokyo, Japan) and isocratic elution with 20 mM sodium phosphate (pH 7.0) (flow rate 0.5 ml / min) (FIG. 4). The highly active fraction obtained here (derived from A: IC₅₀  = 119 mg / ml, from B: IC₅₀  = 27 mg / ml) was subjected to RP-HPLC using Cosmoseal 5PE-MS (4.6 x 250 mm) (Nacalai Tesque) and 12% CH containing 0.1% TFA.₃Isocratic elution was carried out with CN (flow rate 1 ml / min). Purify twice more with the same column (12% and 14% CH₃CN) yielded a single peak (FIG. 5).
[0067]
Further, the fraction 7 (IC₅₀  = 114 mg / ml) with Cosmoseal 5C₁₈  RP-HPLC using AR-II (4.5 × 150 mm) (Nacalai Tesque), 16% CH containing 0.1% TFA₃Isocratic elution was performed with CN (flow rate: 0.5 ml / min) (FIG. 6). The active fraction L obtained here was used for TSK-gel G2000SW._XL  The gel was subjected to gel filtration HPLC using (7.8 × 300 mm) (Tosoh), and subjected to isocratic elution (flow rate: 0.5 ml / min) with 20 mM sodium phosphate (pH 7.0) (FIG. 7). . The highly active fraction obtained here (derived from L: IC₅₀  = 57 mg / ml) was subjected to RP-HPLC using Cosmoseal 5PE-MS (4.6 x 250 mm) (Nacalai Tesque) and 15% CH containing 0.1% TFA.₃Isocratic elution was carried out with CN (flow rate 1 ml / min). Purification was repeated twice more with the same column (12% CH₃By performing CN twice), a single peak was obtained (FIG. 8).
[0068]
The amino acid sequence of the fraction obtained by the purification was subjected to sequence analysis using a protein sequencer Procise 492 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). As a result, it was confirmed that the peptide obtained from Fraction A was VKKVLGNP, the peptide obtained from Fraction B was EKERERQ, and the peptide obtained from Fraction L was KRQKYDI. These peptides were novel ACE inhibitory peptides that had not been reported before.
These amino acid sequences were searched for in the database SwissProt (EMBL Outstation-European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge, UK), and the K position at the 47th position of the pigs in the K-position was the K-position from the K-line to the K-position in the 47th position, and the K-position was the same as the K-position in the K-line. The protein was found to be derived from myosin light chain (molecular weight: about 15 to 26 kDa) contained in the crude troponin used as the material. EKERERQ and KRQKYDI were consistent with peptides contained in rabbit, bovine, rat, human and mouse skeletal muscle troponin T.
[0069]
The crude troponin (molecular weight range: about 14 to 31 kDa, including myosin light chain) used in the present invention is derived from porcine skeletal muscle. I haven't. Although the amino acid sequence of porcine troponin C has been registered in the database, the amino acid sequences of troponin I and troponin T have not been registered, and a sequence completely matching the peptide of the present invention could not be found. However, since the amino acid sequence of troponin in animals other than pigs was registered in the database, it was searched whether the peptide obtained in this study was present in these troponins. As a result, EKERERRQ was found to be rabbit (residues 120 to 126), bovine (residues 120 to 126), rat (residues 102 to 108), human (residues 112 to 118), and mouse (residues 112 to 118). (Residue 110) was present in troponin T. KRQKYDI is rabbit (residues 230 to 236), bovine (residues 230 to 236), rat (residues 212 to 218), human (residues 222 to 228), and mouse (residues 214 to 220). Troponin T). From these facts, it was recognized that a peptide having the same sequence was also present in porcine troponin T. Since the peptide found in this study was obtained using pork as a material, it was considered that it was derived from troponin T. Estimated.
[0070]
Example 2
The three ACE-inhibiting peptides identified in Example 1 and their related peptides, VKKVLGNPSN (corresponding to positions 47 to 56 of pig myosin light chain) and KRQKY (corresponding to positions 230 to 234 of rabbit troponin T), were Fmoc. It was synthesized by solid phase synthesis.
[0071]
ACE Evaluation of inhibitory activity
IC of peptide prepared in Example 2₅₀, Molecular weight, and 5-55% (20 min) gradient elution of acetonitrile containing 0.1% TFA by RP-HPLC ((TSKgel ODS-80TS, 4.5 × 250 mm, Tosoh) (flow rate 1 ml / min)) are shown in Table 1.
[0072]
In Example 2, 50% inhibitory activity against ACE (IC₅₀) Was measured by the method of Cushman-Cheung (Biochemical Pharmacology, 20: 1636-1648, 1971) using ACE derived from rabbit lung.
[0073]
[Table 1]

[0074]
【The invention's effect】
The present invention provides a polypeptide having a novel angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory activity, which is obtained from troponin and myosin, which are muscle proteins abundantly contained in pork and beef.
[0075]
The polypeptide or the angiotensin converting enzyme inhibitor of the present invention not only has remarkable angiotensin converting enzyme inhibitory activity, but also can be obtained by decomposing a protein derived from natural meat using a digestive enzyme which is also present in a living body. Therefore, its safety is high and its toxicity is low.
[0076]
Due to such properties, the polypeptide or angiotensin converting enzyme inhibitor of the present invention is not only useful as a pharmacological component for medicine, but also has a high value-added functionality such as a food for preventing hypertension having a hypotensive action and the like. It is also useful as a material for making food.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a chromatogram obtained when anion exchange chromatography is performed using a pepsin hydrolyzate of a partially purified troponin as a sample.
FIG. 2 shows the active fraction shown in FIG. 1 in Cosmosil 5C₁₈  It is a figure which shows the chromatogram at the time of being provided to the reverse phase high performance liquid chromatography using AR-II.
FIG. 3 shows the active fraction 5 shown in FIG.₁₈  It is a figure which shows the chromatogram at the time of being provided to the reverse phase high performance liquid chromatography using AR-II.
FIG. 4 shows that the active fractions A and B shown in FIG. 3 were separately treated with TSK-gel G2000SW._XLFIG. 6 is a view showing a chromatogram when subjected to gel filtration high-performance liquid chromatography using a.
FIG. 5 shows chromatograms obtained when the two active fractions (derived from fractions A and B) shown in FIG. 4 were subjected to reversed-phase high-performance liquid chromatography using Cosmoseal 5PE-MS. FIG.
FIG. 6 shows that the active fraction 7 shown in FIG.₁₈  It is a figure which shows the chromatogram at the time of being provided to the reverse phase high performance liquid chromatography using AR-II.
FIG. 7 shows that the active fraction L shown in FIG. 6 was transferred to TSK-gel G2000SW._XLFIG. 6 is a view showing a chromatogram when subjected to gel filtration high-performance liquid chromatography using a.
FIG. 8 is a view showing a chromatogram obtained when the active fraction (derived from fraction L) shown in FIG. 7 was subjected to reversed-phase high-performance liquid chromatography using Cosmoseal 5PE-MS.

Claims

A polypeptide comprising 7 to 10 amino acid residues and having any one of the following three amino acid sequences and having angiotensin converting enzyme inhibitory activity:
Val-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Asn-Pro;
Glu-Lys-Glu-Arg-Glu-Arg-Gln;
Lys-Arg-Gln-Lys-Tyr-Asp-Ile.

An angiotensin converting enzyme inhibitor comprising a polypeptide consisting of 5 to 10 amino acid residues and having any one of the following five amino acid sequences as one or more active ingredients.
Val-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Asn-Pro;
Val-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Asn-Pro-Ser-Asn;
Glu-Lys-Glu-Arg-Glu-Arg-Gln;
Lys-Arg-Gln-Lys-Tyr-Asp-Ile;
Lys-Arg-Gln-Lys-Tyr.

Crude troponin (molecular weight range of about 14 to 31 kDa, including myosin light chain) is composed of 7 to 10 amino acid residues using a protease, and has at least one of the following three amino acid sequences: A method for producing an angiotensin converting enzyme inhibitor, comprising a step of hydrolyzing to a polypeptide.
Val-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Asn-Pro;
Glu-Lys-Glu-Arg-Glu-Arg-Gln;
Lys-Arg-Gln-Lys-Tyr-Asp-Ile.

4. The angiotensin converting enzyme inhibitor comprises 5 to 10 amino acid residues, and contains one or more polypeptides having any one of the following five amino acid sequences as an active ingredient. Production method described in 1.
Val-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Asn-Pro;
Val-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Asn-Pro-Ser-Asn;
Glu-Lys-Glu-Arg-Glu-Arg-Gln;
Lys-Arg-Gln-Lys-Tyr-Asp-Ile;
Lys-Arg-Gln-Lys-Tyr.

A food for preventing hypertension, comprising the polypeptide according to claim 1 or the angiotensin converting enzyme inhibitor according to claim 2 as an active ingredient.