JP2004217577A - 新規リゾホスファチジン酸受容体 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、ＬＰＡの新規な受容体を提供するものであり、それを用いたＬＰＡ受容体拮抗剤などの医薬品のスクリーニング方法を提供する。
【解決手段】本発明は、Ｇタンパク質共役型タンパク質ｐ２ｙ９からなるリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）受容体としての用途に関する。より詳細には、Ｇタンパク質共役型タンパク質ｐ２ｙ９のリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）受容体としての使用に関する。また、本発明は、前記した本発明のＬＰＡ受容体を用いて、当該受容体に対する作動物質又は拮抗物質をスクリーニングする方法に関する。
【選択図】 なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なリゾホスファチジン酸（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ：ＬＰＡ）の受容体に関する。より詳細には、本発明は、Ｇタンパク質共役型タンパク質ｐ２ｙ９からなるリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）受容体、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）受容体としての使用、及びそれを用いて当該受容体に対する作動物質又は拮抗物質をスクリーニングする方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
リゾホスファチジン酸（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ：ＬＰＡ）は、グリセロリン脂質の１種であり、グリセリン骨格のひとつの水酸基に脂質が結合した物質である。ＬＰＡは、グリセロリン脂質がホスホリパーゼなどの作用により、グリセロリン脂質の２個の脂質部分のうちの１個の脂質部分が加水分解されて生ずる物質であり、１−アシルグリセロール−３−リン酸、２−アシルグリセロール−３−リン酸、１−アルケニル−グリセロール−３−リン酸などがＬＰＡの代表例として知られている。
ＬＰＡは、生体内においては極微量しか存在せず、グリセロリン脂質の生合成の中間体や分解物である程度の認識しかされていなかったけれども、近年になってＬＰＡが様々な生理活性を有し、特に血清中に存在する脂質性の増殖因子の主要な成分であることが明らかにされて（非特許文献１参照）からは、生理活性脂質の１種として注目を集めてきた。
ＬＰＡは、細胞増殖促進作用を有し、障害を受けた組織の修復に必要な物質であることが見出され、また、ＬＰＡには、神経細胞の成熟化に必要な神経突起を退縮させる作用や、ある種の癌細胞の浸潤を誘導する作用がことも報告されている。さらに、ＬＰＡは、平滑筋収縮作用、血小板凝集作用、細胞死の抑制、細胞の走化性の亢進作用など、様々な組織において様々な作用を有していることが知られてきた。さらに、血漿中のＬＰＡを検出して卵巣がんを検出する方法（特許文献１参照）や、試料中のＬＰＡなどのリゾリン酸を測定する方法（特許文献２参照）や、ＬＰＡを特異的に加水分解するリゾホスファチジン酸ホスファターゼの製造方法（特許文献３参照）や、ヒトリゾホスファチジン酸ホスファターゼのクローニング（特許文献４参照）などに関する特許出願も行われてきている。
このようにＬＰＡは、単に中間物や分解物ではなく、様々な生理活性を有するメディエーターの１種であることがわかってきた。したがって、ＬＰＡは、血小板活性化因子（ＰＡＦ）やスフィンゴシン１リン酸（Ｓ１Ｐ）などと共に「リゾリン脂質メディエーター」の１種であると考えられるようになってきた。
【０００３】
ＬＰＡは、細胞膜表面に存在するＧタンパク質共役型の受容体（Ｇ‐ｐｒｏｔｅｉｎ‐ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＧＰＣＲ）に結合してその生理作用を発現すると考えられてきた。即ち、ＬＰＡの受容体は７回膜貫通型のＧＰＣＲであると考えられていたが、その実体は長らく不明であった。それは、ＬＰＡがリゾリン脂質の１種であり、脂溶性の物質であることから、膜との結合実験が非常に難しいことや、よいアンタゴニストが存在しないことなどから、受容体の存在そのものも疑問視されていたからである。
しかし、１９９６年に、ＬＰＡの受容体としてｖｚｇ‐１（非特許文献２参照）、及びＰＳＰ２４（非特許文献３参照）と命名されたＬＰＡの受容体遺伝子がクローニングされた。ｖｚｇ‐１は、マウス脳の発生過程の脳質層において細胞周期に伴って神経芽細砲のエレベーター運動が観察され、この細胞に特異的な７回膜貫通型のＧＰＣＲであることから、ｖｚｇ‐１（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｚｏｎｅ ｇｅｎｅ‐１）と命名された。ｖｚｇ‐１は、それまでに単離されていたヒツジ由来のオーファン受容体であるｅｄｇ−２遺伝子のマウスホモログであることがわかり、現在ではｅｄｇ−２遺伝子として知られている。
そして、ＥＳＴデータベース上では、ｅｄｇ‐２（ｖｚｇ‐１）の他に、ｅｄｇ‐１、ｅｄｇ−３、ｅｄｇ−４遺伝子などの多くの相同性を示す配列が登録されており、これらが一群のＥＤＧ（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ）ファミリーを形成することが明らかになった。このＥＤＧファミリーは、その相同性から２つのグループに細分され、その１つはｅｄｇ−２及びｅｄｇ−４などのＬＰＡのレセプターとして機能するグループであり、他のひとつはｅｄｇ−１及びｅｄｇ−３などのＳ１Ｐ（スフィンゴシン１リン酸）の受容体として機能するものである。
また、ＰＳＰ２４遺伝子は、前述してきたｅｄｇ−２遺伝子とはアミノ酸配列上、相同性がほとんど無いが、マウス神経系やヒト胎児脳においても相同遺伝子が発現しており、この遺伝子産物もＬＰＡに対する反応性を有することから独立のグループを形成すると考えられている。また、アフリカツメガエル卵母細胞のＰＳＰ２４遺伝子の塩基配列に基づいて、ヒト成人の脳組織のｃＤＮＡライブラリーからヒト型のＰＳＰＳ２４遺伝子も見出されている（特許文献５参照）。
【０００４】
ＥＤＧファミリーやＰＳＰ２４は、ＧＰＣＲの１種であり、図１に現在までに知られているＧＰＣＲを示す。図１はこれらのタンパク質のアミノ酸配列の相同性に基づいて相同性の大きいものを近くに配置し、相同性の小さいものを遠くに配置した系統樹である。図１中の数字は各タンパク質間の相同性の低さを示す尺度となる相対値である。また、図１中の黒丸印は、脂質の受容体として知られているものを示し、灰色は脂質以外の受容体として知られているものを示し、それらの外側にリガンドとなる物質の総称が記載されている。ＥＤＧファミリーは図１中では右下側に表示されている。また、ＰＳＰ２４はほぼ中央の下側に示されている。図１中の白丸印はそのリガンドが未だ知られていないオーファン受容体であることを示している。
本発明のＧＰＣＲであるｐ２ｙ９は、図１中では左側の下方に表示されており、従来のＥＤＧファミリーやＰＳＰ２４とはアミノ酸配列の相同性が全く異なるものであることが図１からもわかる。
ＧＰＣＲについては現在でも新規なものが見出されており、例えば、特開２００２−３５５０４５号（特許文献６）、特開２００２−１７３７８号（特許文献７）などの特許出願（特許文献８〜１８参照）として公開されている。また、ＧＰＣＲの機能を改変させる方法（特許文献１９参照）や、Ｇ２Ａ受容体の転写の調節方法（特許文献２０参照）や、ＧＰＣＲ活性のスクリーニング方法（特許文献２１参照）についても特許出願がされてきている。
【０００５】
【特許文献１】
特開２００２−３２８１３２号
【特許文献２】
特開２００２−０１７３９８号
【特許文献３】
特開２０００−１５２７８２号
【特許文献４】
再表 ＷＯ００／０３１２７５号
【特許文献５】
再表 ＷＯ９９／０２４５６９号
【特許文献６】
特開２００２−３５５０４５号
【特許文献７】
特開２００２−１７３７８号
【特許文献８】
特開２００１−２４５６７４号
【特許文献９】
特開２００１−２４５６７３号
【特許文献１０】
特開２００１−２４５６７２号
【特許文献１１】
特開２００１−２１１８８９号
【特許文献１２】
特開２００１−１９０２８１号
【特許文献１３】
特開２００１−１８６８８８号
【特許文献１４】
特開２００１−１６９７８６号
【特許文献１５】
特開２００１−１６１３８５号
【特許文献１６】
特開２００１−１６１３８３号
【特許文献１７】
特開２００１−１６１３８２号
【特許文献１８】
特表２００２−５０１０８３号
【特許文献１９】
特表２００２−５２３０９１号
【特許文献２０】
特表２００１−５２３４５６号
【特許文献２１】
特表平１１−５０５７１８号
【非特許文献１】
フォン コルベン イーら、セル、５９巻、４５−５４頁、１９８９年（ｖａｎ Ｃｏｒｖｅｎ Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ５９， ４５−５４ （１９８９））
【非特許文献２】
ヘチャト ジェー エイチら、ジャーナル セル バイオロジー、１３５巻、１０７１−１０８３頁（１９９６年）（Ｈｅｃｈｔ，Ｊ．Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １３５， １０７１‐１０８３ （１９９６））
【非特許文献３】
グオ ゼットら、プロシーディング ナショナル アカデミック サイエンスユーエスエー、９３巻、１４３６７‐１４３７２頁、１９９６年（Ｇｕｏ，Ｚ．， ｅｔａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９３， １４３６７‐１４３７２ （１９９６））
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
ＬＰＡは生体内において様々な生理活性を有するリゾリン脂質メディエーターの１種であるが、その受容体については未だ十分に解明されておらず、ＬＰＡの受容体を解明することは、ＬＰＡが関与する様々な生理活性作用や各種の疾患の治療や予防に重要なことである。したがって、ＬＰＡの新規な受容体を得ることができれば、新しいタイプのＬＰＡ受容体拮抗剤などの医薬品のスクリーニングや評価など幅広く医薬品の開発に利用することができる。
本発明は、ＬＰＡの新規な受容体を提供するものであり、それを用いたＬＰＡ受容体拮抗剤などの医薬品のスクリーニング方法を提供するものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、図１に示される種々のＧタンパク質共役型受容体のアミノ酸配列の相同性をもとに構築した系統樹における、血小板活性化因子受容体（ＰＡＦＲ）に相同性があるオーファン受容体（図１の左側に示される。）について検討しきた。その結果、意外なことに血小板活性化因子受容体（ＰＡＦＲ）に相同性があるオーファン受容体のひとつであるｐ２ｙ９が、血小板活性化因子（ＰＡＦ）よりもＬＰＡに対して強く反応することを見出した。即ち、本発明者らは、従来知られているＬＰＡ受容体とは全くタイプの異なる新たなＬＰＡ受容体を見出し、本発明を完成した。
【０００８】
本発明は、Ｇタンパク質共役型タンパク質ｐ２ｙ９からなるリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）受容体としての用途に関する。より詳細には、Ｇタンパク質共役型タンパク質ｐ２ｙ９のリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）受容体としての使用に関する。さらに詳細には、Ｇタンパク質共役型タンパク質ｐ２ｙ９が配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するものであるｐ２ｙ９のリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）受容体としての使用に関する。
また、本発明は、前記した本発明のＬＰＡ受容体を用いて、当該受容体に対する作動物質又は拮抗物質をスクリーニングする方法に関する。
本発明は、Ｇタンパク質共役型タンパク質ｐ２ｙ９がリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）の受容体として機能するものであることを明らかにするものである。即ち、ＬＰＡがＧタンパク質共役型タンパク質ｐ２ｙ９のリガンドとして機能することを明らかにするものである。
【０００９】
本発明者らは、血小板活性化因子受容体（ＰＡＦＲ）に相同性があるオーファン受容体のうちＧＰＲ３４、ｐ２ｙ５、ｐ２ｙ９（別名ＧＰＲ２３）、及びｐ２ｙ１０に注目し、これらのリガンドを検討してきた。これらの受容体は、いずれも血小板活性化因子受容体（ＰＡＦＲ）とアミノ酸配列において相同性を有していることから、血小板活性化因子（ＰＡＦ）又はその関連物質をリガンドとしていることが予想されていたが、ｐ２ｙ９（別名ＧＰＲ２３）は、血小板活性化因子（ＰＡＦ）又はその関連物質とは反応性を示さず、意外にもＬＰＡと大きな反応性を示し、ＬＰＡをリガンドとする受容体であることを見出した。ｐ２ｙ９のアミノ酸配列は、ＬＰＡ受容体として従来から知られているＥＤＧ−２、ＥＤＧ−４、ＥＤＧ−７、及びＰＳＰＳ２４とはほとんど相同性を有しておらず、このことは図１の系統樹からも理解されるとおりであり、従来から知られているＬＰＡ受容体とは全く異なる新しいタイプのＬＰＡ受容体を見出したことになる。
【００１０】
本発明者らは、ＧＰＲ３４、ｐ２ｙ５、ｐ２ｙ９（別名ＧＰＲ２３）、及びｐ２ｙ１０のそれぞれのアミノ酸配列のＮ末端にＨＡタグと呼ばれる９アミノ酸残基からなる外来のペプチドを付加したアミノ酸配列をコードするＤＮＡを、それぞれｐＣＸＮ２．１ベクターに組み込み、ＣＨＯ細胞にトランスフェクションし、細胞表面上のＨＡタグの発現レベルが高いクローンを選択して、これらを安定的に発現するクローンを得た。
図２に、ＨＡタグの付いたｐ２ｙ９をコードするＤＮＡをｐＣＸＮ２．１ベクターのＫｐｎＩとＮｈｅＩの間に組み込んだ発現ベクターを示す。他の受容体についても、それぞれ同様にベクターを構築した。実験に使用したｐ２ｙ９は３７０個のアミノ酸からなるタンパク質であり、このアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。
また、これらの実験で使用したＬＰＡとしては、次の式、
【００１１】
【化１】

【００１２】
で示される、１−オレオイル−ＬＰＡを用いた。
各受容体のＣＨＯクローンを用いて、２００種以上の脂質（バイオモル社脂質ライブラリー由来）やヌクレオチドについて、ＣＨＯ細胞のカルシウム濃度の変化についてのスクリーニングを行った。このスクリーニングに際しては、ポジティブコントロールとして１μＭのＡＴＰ、１０μＭのＡＴＰ、及び１００μＭのＡＴＰを使用した。これは、ＣＨＯ細胞はもともとＡＴＰ受容体を発現しているので、ＡＴＰの添加によりカルシウム濃度が大きく変化する。この実験では、このポジティブコントロール、即ち、ＡＴＰの添加によりいずれの濃度の場合にも、測定機器の針が振り切れる程大きな細胞内カルシウム濃度の変化が認められた。このことは、この実験自体がうまくいっていることの証明になっている。
一方、トランスフェクションにより、発現している受容体に特異的な細胞内のカルシウム濃度の上昇は、ｐ２ｙ９を発現したクローンがＬＰＡと反応したときに認められた。このスクリーニングにより、ｐ２ｙ９をコードするＤＮＡをトランスフェクションしたＣＨＯ細胞に大きなカルシウム濃度の変化が見られることがわかった。
さらに、各受容体のＣＨＯ細胞のクローンを用いて、１０μＭのＬＰＡによる各細胞のカルシウム濃度の変化を詳細に検討した結果を図３に示す。図３の縦軸はカルシウム濃度（ＲＦＵ）を示し、横軸は時間（秒）を示す。図３中の黒丸印（●）はＧＰＲ３４の場合を示し、白四角印（□）はｐ２ｙ５の場合を示し、白三角印（△）はｐ２ｙ９の場合を示し、バツ印（×）はｐ２ｙ１０の場合をそれぞれ示している。
この結果からも明らかなように、１０μＭのＬＰＡによりｐ２ｙ９のみが特異的にカルシウム濃度の増加を示すこと、即ち、ＬＰＡがｐ２ｙ９のリガンドになっていることがわかった。
【００１３】
次に、これらの４種の受容体を各々安定的に発現しているＣＨＯクローンの細胞を用いて、細胞内のサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の濃度変化について検討した。バイオモル社の脂質ライブラリーの中からの５９種類の脂質、及び１７種類のヌクレオチド類を用いて、それぞれ室温で３０分間反応させた。
結果を図４〜図１０に示す。使用した脂質類及びヌクレオチド類は各図に記載のとおりである。図４〜図１０の縦軸はｃＡＭＰの濃度を示し、横軸は使用した各脂質類又はヌクレオチド類を示している。図１０の右端はコントロールである。図４〜図１０に各添加物における４本の棒グラフは左から、ＧＰＲ３４、ｐ２ｙ５、ｐ２ｙ９、及びｐ２ｙ１０をそれぞれ示している。
この結果、図８の左から５番目に示されるように、ＬＰＡに対するｐ２ｙ９の場合は、有意にｃＡＭＰの濃度の上昇がみられることがわかった。
【００１４】
次に、ＣＨＯ細胞のクローンについて検討した。ｐ２ｙ９を安定的に発現している４つのＣＨＯ細胞のクローン、＃０１、＃０９、＃１５、及び＃２０の各々について、細胞内にカルシウムを取り込ませる実験を行った。種々の濃度のＬＰＡを加えたときの細胞内カルシウム濃度の変化を測定した。陰性対照サンプルとして、ｐＣＸＮ２．１ベクターのみをトランスフェクションしてネオマイシン耐性を獲得したＣＨＯ細胞を用いた。
結果を図１１の（Ａ）〜（Ｄ）に示す。各グラフの横軸はＬＰＡの濃度（ｎＭ）を示し、縦軸はカルシウムの増加量（ｎＭ）を示す。図１１の（Ａ）は＃０１のクローンの場合であり、図１１の（Ｂ）は＃０９のクローンの場合であり、図１１の（Ｃ）は＃１５のクローンの場合であり、図１１の（Ｄ）は＃２０のクローンの場合である。各（Ａ）〜（Ｄ）の黒菱形印（◆）は各クローンの場合を示し、灰色の四角印（■）は陰性対照の場合を示す。
ＣＨＯ細胞は、元々ＬＰＡ受容体を持っている細胞であるから、ベクターのみを導入した細胞であってもＬＰＡに対して反応する。しかし、ｐ２ｙ９が導入されたいずれのクローンにおいても、ＬＰＡの濃度依存的にｐ２ｙ９が導入されたクローンのほうが顕著に細胞内のカルシウム濃度が増加することがわかった。
【００１５】
同様に、細胞内のカルシウム濃度の変化をトロンビン（０．１ＮＩＨ単位／ｍｌ）、ＰＡＦ（１μＭ）、及びＡＴＰ（１０μＭ）について検討した結果を図１２に示す。図１２の縦軸はカルシウムの増加量（ｎＭ）を示し、横軸は各添加物を示す。各棒グラフは、左から陰性対照のベクターのみを導入したＣＨＯ細胞、ｐ２ｙ９のクローン＃０１、クローン＃０９、クローン＃１５、クローン＃２０をそれぞれ示している。
この結果、トロンビン、ＰＡＦ、及びＡＴＰについては、ｐ２ｙ９を導入した細胞も陰性対照の細胞と変わりが無いことがわかった。
【００１６】
次に、ｐ２ｙ９またはｐ２ｙ５を安定的に発現しているＣＨＯ細胞のクローンを用いて、百日咳毒素（ＰＴＸ）の存在下又は非存在下で、種々の濃度のＬＰＡを加えて室温で３０分間処理したときの細胞内ｃＡＭＰ濃度を測定した。陰性対照サンプルとして、ｐＣＸＮ２．１ベクターのみをトランスフェクションしてネオマイシン耐性を獲得したＣＨＯ細胞を用いた。
結果を図１３の（Ａ）、（Ｂ）に示す。図１３の（Ａ）はｃＡＭＰを上昇させる作用を有するフォルスコリン（５μＭ）で処理しなかった場合であり、図１３の（Ｂ）はフォルスコリン（５μＭ）で処理した場合である。各図の横軸はＬＰＡの濃度（μＭ）を示し、縦軸はｃＡＭＰの濃度の変化の比を示す。各図の黒四角印（■）はｐ２ｙ９のクローンの場合であり、灰色四角印（□）（注：原図では赤色で示されている。）はｐ２ｙ５のクローンの場合を示す。黒菱形印（◆）（注：原図では青色で示されている。）は陰性対照のベクターのみのクローンの場合を示す。各図の実線は、百日咳毒素（ＰＴＸ）の非存在下の場合であり、破線は百日咳毒素（ＰＴＸ）の存在下の場合である。
この結果、ｐ２ｙ９はＬＰＡに反応してｃＡＭＰの濃度を上昇させるが、ｐ２ｙ５及び陰性対照ではＬＰＡに対してｃＡＭＰの濃度の上昇はみられかった。Ｇタンパク質Ｇｉ／Ｇｏの阻害剤である百日咳毒素（ＰＴＸ）の存在により（各図の破線で示される場合。）、ｃＡＭＰの濃度の上昇レベルは増強した。これは、ＣＨＯ細胞が元々持っているＬＰＡ受容体が百日咳毒素（ＰＴＸ）に感受性を持っており、かつｃＡＭＰの濃度を下降させる作用があるためと考えられる。また、フォルスコリンの存在下（図１３の（Ｂ））では、ｐ２ｙ９のＬＰＡに対するｃＡＭＰの濃度の上昇が増強されている。
【００１７】
ｐ２ｙ５は、３４４個のアミノ酸からなるタンパク質であり、ｐ２ｙ９とは５６．２％の相同性がある。両者のアミノ酸の比較を図１４に示す。図１４の上の段はｐ２ｙ９であり、下の段はｐ２ｙ５である。アミノ酸が同じ位置に有る場合には両者の間にアスタリスク（＊）が付されている。両者は比較的相同性が高いにもかかわらず、ＬＰＡに対する反応性を全く異にしており、血小板活性化因子受容体（ＰＡＦＲ）に相同性があるタンパク質（図１の系統樹において左側に示されている。）の中でも、本発明のｐ２ｙ９のみがＬＰＡに対して特異的に作用するものであることがわかる。
【００１８】
ＣＨＯ細胞は元々ＬＰＡ受容体を持っている細胞であるが、次に元々はＬＰＡ受容体を持っていない細胞についてｐ２ｙ９を導入して、その反応性を検討した。ＬＰＡ受容体を持っていない細胞として、ＲＨ７７７７細胞及びＢ１０３細胞を使用した。
ｐＣＸＮ２．１ベクターに挿入されたＨＡタグ付きのｐ２ｙ９またはｐ２ｙ５をコードするＤＮＡを、ＲＨ７７７７細胞またはＢ１０３細胞へトランスフェクションし、一過性に受容体を発現する細胞由来の膜画分を得た。陰性対照サンプルでは、受容体をコードするＤＮＡの代わりにｐＣＸＮ２．１ベクターをトランスフェクションしたものを使用した。この膜画分を、それぞれの濃度における総結合量を求めるために、１ｎＭ、３ｎＭ、又は１０ｎＭのトリチウムラベルされたＬＰＡと混ぜ合わせ、４℃で６０分間反応させた。これと平行して、それぞれの濃度における非特異的結合量を求めるために、５００倍濃度のトリチウムラベルされていないＬＰＡを含んだ反応液でも、膜画分とトリチウムラベルされたＬＰＡを同様に反応させた。反応液をＧＦ／Ｃガラスフィルターで濾過し、ガラスフィルターに吸着している放射能を、受容体と結合しているトリチウムラベルされたＬＰＡの量とした。特異的結合量は総結合量から非特異的結合量を引いて求めた。
結果を図１５及び図１６に示す。図１５はＲＨ７７７７細胞を用いた場合であり、図１６はＢ１０３細胞を用いた場合である。図１５及び図１６のそれぞれの、（Ａ）は陰性対照の場合を示し、（Ｂ）はｐ２ｙ５の場合を示し、（Ｃ）はｐ２ｙ９の場合を示す。各グラフの横軸はトリチウムラベルされたＬＰＡの添加量（ｎＭ）であり、縦軸は測定された放射能の量（ｄｐｍ）を示す。各グラフの黒色の棒は総結合量であり、その右側の灰色の棒は非特異的結合量である。灰色三角印（▲）（注：原図では赤色で示されている。）は、総結合量から非特異的結合量を引いて求めた特異的結合量を示している。
この結果、ｐ２ｙ９はいずれの細胞においてもＬＰＡと特異的に結合するものであることがわかった。
【００１９】
このトランスフェクションしたＲＨ７７７７細胞から得られた一過性に受容体を発現する細胞由来の膜画分を用いて、ｐ２ｙ９の他の脂質との反応性を検討した。
前記した方法で得られた膜画分を、５ｎＭのトリチウムラベルされたＬＰＡと混ぜ合わせ、４℃で６０分間反応させた。この値を、ＬＰＡだけの総結合量として対照とした（得られた値は、図１７のグラフ内では“Ｂｕｆｆｅｒ”と記載している。）。これと平行して、１μＭのトリチウムラベルされていない種々の脂質（ＬＰＣ：リゾフォスファチジルコリン、ＬＰＥ：リゾフォスファチジルエタノールアミン、ＬＰＳ：リゾフォスファチジルセリン、ＬＰＧ：リゾフォスファチジルグリセロール、ＰＡ：フォスファチジン酸、ＰＡＦ：血小板活性化因子、Ｓ１Ｐ：スフィンゴシン１−リン酸、ＳＰＣ：シフィンゴシルフォスフォリルコリン）をそれぞれ含む、５ｎＭのトリチウムラベルされたＬＰＡを同様に反応させた。
反応後、反応液をＧＦ／Ｃガラスフィルターで濾過し、ガラスフィルターに吸着している放射能を、受容体と結合しているトリチウムラベルされたＬＰＡの量とした。
結果を図１７に示す。図１７の縦軸は測定された放射能の量（ｄｐｍ）を示し、横軸は添加した各脂質を示す。
ＬＰＡと一緒に添加されたこれらの脂質が、ＬＰＡと同様にｐ２ｙ９と親和性を有するものであるならば、多量に添加されたこれらの脂質が競争的にｐ２ｙ９に結合し、結果的にラベルされたＬＰＡのｐ２ｙ９への結合が阻害され、ラベルされたＬＰＡの結合量が減少することになる。しかし、図１７に示されるように、ｐ２ｙ９とラベルされたＬＰＡの結合量は、ＬＰＡ以外の他の脂質により減少しておらず、調べた脂質は全てｐ２ｙ９への親和性がＬＰＡほど高くないことが示された。即ち、ｐ２ｙ９は、これらの脂質よりもＬＰＡと特異的に結合するものであることが示された。
【００２０】
次に、前記で使用してきたＲＨ７７７７細胞から得られた一過性に受容体を発現する細胞由来の膜画分を用いて、ｐ２ｙ９に対するＬＰＡの結合の動力学的検討を行った。
ＲＨ７７７７細胞由来の膜画分を、種々の濃度のトリチウムラベルされたＬＰＡと混ぜ合わせ、４℃で６０分間反応させて、総結合量を求めた。これと平行して、１０μＭのトリチウムラベルされていないＬＰＡを含んだ反応液でも、膜画分とトリチウムラベルされたＬＰＡを同様に反応させて、非特異的結合量を求めた。反応液をＧＦ／Ｃガラスフィルターで濾過し、ガラスフィルターに吸着している放射能を、受容体と結合しているトリチウムラベルされたＬＰＡの量とした。特異的結合量は総結合量から非特異的結合量を引いて求めた。陰性対照サンプルでは、受容体をコードするＤＮＡの代わりにｐＣＸＮ２．１ベクターをトランスフェクションしたものを用いた。
結果を図１８に示す。図１８の（Ａ）はｐ２ｙ９が導入された細胞の膜を用いた場合であり、図１８の（Ｂ）は陰性対照の場合である。図１８の各グラフの横軸はトリチウムラベルされたＬＰＡの濃度（ｎＭ）であり、縦軸は測定された放射能の量（ｄｐｍ）である。各グラフの黒四角印（■）は総結合量を示し、黒菱形印（◆）は非特異的結合量を示す。白丸印（○）は、総結合量から非特異的結合量を引いて求めた特異的結合量を示す。
これらの結果から得られた動力学パラメーターを求めるためのグラフを図１９に示す。トリチウムラベルされたＬＰＡの比活性は２１０９ＧＢｑ／ｍｍｏｌ（５７Ｃｉ／ｍｍｏｌ）であった。図１９の横軸は結合（ｆｍｏｌ／ｍｇ）を示し、縦軸は結合と解離の比（ｆｍｏｌ／ｍｇ／ｎＭ）を示す。この結果得られた直線の式は、
ｙ ＝ −０．０２２３ｘ ＋ ８３１．１９
であった。
この結果、ｐ２ｙ９とＬＰＡとのＫｄ値は、４４．８ｎＭであり、Ｂｍａｘは３７．３ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質であった。また、
【００２１】
さらに、ＰＣ１２細胞を用いてｐ２ｙ９の作用を検討した。
ＰＣ１２細胞に、以下の（１）〜（３）の３種のＤＮＡを同時にトランスフェクションした。
（１）ｐＣＸＮ２．１ベクターに挿入されたＨＡタグ付きのｐ２ｙ９をコードするＤＮＡ。
（２）ラットのｚｉｆプロモーターに発現が制御されたホタルのルシフェラーゼＤＮＡ。ｚｉｆプロモーターは細胞外からの刺激に応じて活性化する。
（３）単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターに発現が制御されたウミシイタケのルシフェラーゼＤＮＡ。チミジンキナーゼプロモーターは外来の刺激に関係なく、常に一定の活性を持つ。
得られたトランスフェクタントに、種々の濃度のＬＰＡで細胞を６時間刺激したときのホタルルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼの活性を求め、これらの値をもとにウミシイタケルシフェラーゼに対するホタルのルシフェラーゼ活性値の比を算出した。陰性対照サンプルでは、ｐ２ｙ９をコードするＤＮＡの代わりにｐＣＸＮ２．１ベクターをトランスフェクションしたものを用いた。
結果を図２０に示す。図２０の横軸はＬＰＡの濃度（ｎＭ〜μＭ）を示し、縦軸は比を示す。黒四角印（■）はｐ２ｙ９を導入したＰＣ１２細胞の場合を示し、黒菱形印（◆）は陰性対照の場合を示す。
ｚｉｆプロモーターやチミジンキナーゼプロモーターは、細胞内のｃＡＭＰの濃度の上昇やカルシウムの濃度の上昇により作動するプロモーターであり、この結果、ｐ２ｙ９は、ＰＣ１２細胞においてもＬＰＡに対して濃度依存的に反応していることがわかった。また、この結果からすれば、ＰＣ１２細胞はＬＰＡ受容体を元々は持っていないか、持っているとしてもかなり感受性の低い受容体であることも示された。
【００２２】
以上のことから、ｐ２ｙ９はＬＰＡの受容体であることが明確になった。ｐ２ｙ９は図１のＧＰＣＲの系統樹からも明らかなように、従来ＬＰＡの受容体として知られていたＥＤＧファミリーやＰＳＰ２４とは相同性のないものであり、本発明は全く新しいタイプのＬＰＡの受容体を提供するものである。また、従来ＰＡＦ受容体と相同性があるｐ２ｙ９が、ＰＡＦとは相違しているＬＰＡの受容体として機能しているという本発明の知見は、ＧＰＣＲの系統樹に対する新たな知見を提供するものでもある。
【００２３】
本発明は、ｐ２ｙ９がＬＰＡの受容体であるという、ｐ２ｙ９の新たな機能及び用途を提供するものである。
本発明のｐ２ｙ９としては、ヒト型のもの、マウス型のものなどｐ２ｙ９として機能するものであればよく、好ましいｐ２ｙ９としては配列表の配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するものが挙げられる。このアミノ酸配列は、この全配列に限定されるものではなく、その一部のアミノ酸が欠失し、また一部のアミノ酸が他のアミノ酸で置換され、また他のアミノ酸が付加され、又はこれらが同時に組み合わされたアミノ酸配列を有するものであってもｐ２ｙ９としての機能を有するものであればよい。
本発明のＬＰＡとしては、前記の実験で使用されてきた１−オレオイル−ＬＰＡに限定されるものではなく、グリセリンの３位の水酸基にリン酸基が結合し、１位又は２位のいずれかの水酸基にアシル基、アルケニル基、アルキル基などが結合したものであればよく、これらの誘導体であってもよく、ｐ２ｙ９に対する反応性を有するＬＰＡであればよい。
本発明においては、グリセリンの１位にアシル基が結合したＬＰＡを１−アシル−ＬＰＡと称し、グリセリンの２位にアシル基が結合したＬＰＡを２−アシル−ＬＰＡと称する。同様に、アルケニル基の場合には１−アルケニル−ＬＰＡ、２−アルケニル−ＬＰＡと称し、アルキル基の場合には、１−アルキル−ＬＰＡ、２−アルキル−ＬＰＡと称する。グリセリンに結合するアシル基としては、例えば、飽和又は不飽和の脂肪酸から誘導されるアシル基が好ましく、具体的にはパルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、オレイン酸、アラキドン酸などから誘導されるアシル基が挙げられる。アルケニル基としては、例えば、炭素数１０〜３０、好ましくは炭素数１４〜２２の直鎖状又は分枝状、好ましくは直鎖状のアルケニル基が挙げられ、当該アルケニル基は１個以上、好ましくは１個の不飽和結合を有するものが挙げられる。アルケニル基の例としては、１−ヘキサデセニル基、１−オクタデセニル基などが挙げられる。アルキル基としては、例えば炭素数１０〜３０、好ましくは炭素数１４〜２２の直鎖状又は分枝状、好ましくは直鎖状のアルキル基が挙げられる。アルキル基の例としては、ヘキサデシル基、オクタデシル基などが挙げられる。
【００２４】
本発明は、ｐ２ｙ９がＬＰＡの受容体であることから、ＬＰＡによって亢進又は抑制される各種の生理活性を、本発明のｐ２ｙ９を用いてスクリーニングすることができる。本発明のスクリーニング方法は、ｐ２ｙ９を細胞に発現させて行ってもよいし、既にｐ２ｙ９を有する細胞を用いてもよいし、またｐ２ｙ９を有する膜を使用してもよい。本発明のスクリーニング方法は、前記で例示したいずれの方法に限定されるものではないが、いずれの方法においても、ｐ２ｙ９をＬＰＡの受容体として、ＬＰＡに対する活性物質をスクリーニングする方法を包含するものである。
【００２５】
【実施例】
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２６】
実施例１ （ＣＨＯ細胞への受容体の導入）
Ｎ末端に９アミノ酸残基からなるＨＡタグを付加したＧＰＲ３４、ｐ２ｙ５、ｐ２ｙ９、及びｐ２ｙ１０の４種のオーファン受容体をコードするＤＮＡをそれぞれｐＣＸＮ２．１ベクター（図２参照）に組み込み、インビトロジェン社のリポフェクトアミンプラスでＣＨＯ細胞にトランスフェクションした。培養は１０％ウシ胎児血清を含むＨａｍＦ−１２培地を用いた。２ｇ／Ｌのネオマイシン存在下で１個のＣＨＯ細胞由来の細胞群（クローン）を増殖させた後、細胞表面上のＨＡタグの発現レベルが高いクローンをフローサイトメトリー解析で複数選択し、それぞれの受容体の安定的発現クローンを得た。
【００２７】
実施例２ （種々の脂質に対する各クローンのカルシウム濃度の変化の測定）
ＧＰＲ３４、ｐ２ｙ５、ｐ２ｙ９、及びｐ２ｙ１０の４種の各受容体のＣＨＯクローン１つずつについて、１ウェル当たり４ｘ１０^４個の細胞を９６穴プレート３枚に播いた。翌日、４μＭのフルオ３（カルシウムインジケーター）と３７℃で１時間保温し、細胞内にフルオ３を取り込ませた。その後、約２００種類の脂質分子から構成されているバイオモル社の脂質ライブラリーの各脂質（１〜１０μＭ）やＡＴＰ等の１７種類のヌクレオチド類（１〜１００μＭ）と反応させ、モレキュラーデバイス社のフレックスステーションを用いて細胞内カルシウム濃度の時間変化を追った。
ＣＨＯ細胞はもともとＡＴＰ受容体を発現しているので、ＡＴＰを添加したクローンでは振り切れる程大きな細胞内カルシウム濃度の変化が認められた。これにより、この実験の正当性を確認することができた。
一方、ＡＴＰのような全てのクローンにおいてではなく、発現している受容体特異的な細胞内カルシウム上昇は、ｐ２ｙ９を発現したクローンがＬＰＡと反応したときに認められた。
【００２８】
実施例３ （ＬＰＡに対する各クローンのカルシウム濃度の変化の測定）
ＧＰＲ３４、ｐ２ｙ５、ｐ２ｙ９、及びｐ２ｙ１０の４種の受容体各々を安定的に発現しているＣＨＯクローンの細胞を用いて、実施例２に記載の方法と同様にして、各細胞内のカルシウムの濃度の変化を測定した。
結果を図３に示す。
【００２９】
実施例４ （各クローンによるｃＡＭＰの濃度の変化の測定）
ＧＰＲ３４、ｐ２ｙ５、ｐ２ｙ９、及びｐ２ｙ１０の４種の受容体各々を安定的に発現しているＣＨＯクローンの細胞を、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ ７．４）、０．１％ ＢＳＡ、５００μＭ ＩＢＭＸ（ｃＡＭＰ分解酵素阻害剤）を含むＨＢＳＳに懸濁した。１ｘ１０^５個ずつの細胞を３８４穴プレートに播き、５０μＭフォルスコリン（受容体非依存的にｃＡＭＰ合成酵素を活性化する薬剤）の共存下で、上記バイオモル社の脂質ライブラリーの中からの５９種類または１７種類のヌクレオチド類と室温で３０分間反応させた。その後、細胞内サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）濃度をパッカード社のアルファースクリーンｃＡＭＰアッセイキットを使って測定した。
結果を図４〜図１０に示す。
ｐ２ｙ９を発現しているＣＨＯ細胞がＬＰＡに反応したときに、大きなｃＡＭＰ濃度の上昇が認められた（図８参照）。
【００３０】
実施例５ （ｐ２ｙ９のクローンの比較）
ｐ２ｙ９を安定的に発現しているＣＨＯクローン、＃０１、＃０９、＃１５、及び＃２０の４種について、１０％ウシ胎児血清を含むＨａｍＦ−１２から０．１％ＢＳＡを含むＨａｍＦ−１２に培地を切り替え２４時間培養した。その後３μＭフラ２（カルシウムインジケーター）と０．０１％クレモフォアＥＬを含むＨＥＰＥＳ−タイロード緩衝液（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、１２ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、５．６ｍＭ Ｄ−グルコース、０．４９ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．３７ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ ７．４））で細胞を懸濁した。これを３７℃で１時間保温し、細胞内にフラ２を取り込ませた。１ｘ１０^６個／ｍｌの濃度になるよう再びＨＥＰＥＳ−タイロード緩衝液に細胞を懸濁し、種々の濃度のＬＰＡを加えたときの細胞内カルシウム濃度の変化を、日本光電社製のＣＡＦ−１００を用いて測定した。陰性対照サンプルとして、ｐＣＸＮ２．１ベクターのみをトランスフェクションしてネオマイシン耐性を獲得したＣＨＯ細胞を用いた。
結果を図１１に示す。
【００３１】
実施例６ （ｐ２ｙ９の各クローンによるトロンビン等に対する反応性）
ｐ２ｙ９を安定的に発現しているＣＨＯクローン、＃０１、＃０９、＃１５、及び＃２０の４種を用いて、ＬＰＡに代えて、トロンビン０．１ＮＩＨ単位／ｍｌ、ＰＡＦ１μＭ、ＡＴＰ１０μＭをそれぞれ添加して、実施例５と同様にして各クローンの細胞内のカルシウム濃度の増加を測定した。
結果を図１２に示す。トロンビン、ＰＡＦ、及びＡＴＰのいずれの場合も、陰性対照と比べて大きな相違は見られなかった。
【００３２】
実施例７ （ｐ２ｙ９のクローンとｐ２ｙ５のクローンの比較）
１０％ウシ胎児血清の代わりに、０．１％ＢＳＡを含むＨａｍＦ−１２培地で２４時間培養したｐ２ｙ９またはｐ２ｙ５を安定的に発現しているＣＨＯクローン１つずつを、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ ７．４）、０．１％ＢＳＡ、５００μＭ ＩＢＭＸを含むＨＢＳＳに懸濁した。５μＭフォルスコリンで処理する場合は、１ｘ１０^５個ずつ、処理しない場合は１ｘ１０^６個ずつを３８４穴プレートに播いた。その後、種々の濃度のＬＰＡを加えて室温で３０分間処理したときの細胞内ｃＡＭＰ濃度を、パッカード社のアルファースクリーンｃＡＭＰアッセイキットを使って測定した。陰性対照サンプルとして、ｐＣＸＮ２．１ベクターのみをトランスフェクションしてネオマイシン耐性を獲得したＣＨＯ細胞を用いた。
結果を図１３に示す。
【００３３】
実施例８ （ＲＨ７７７７細胞またはＢ１０３細胞によるｐ２ｙ９及びｐ２ｙ５の発現と、ＬＰＡに対する反応性）
ｐＣＸＮ２．１ベクターに挿入されたＨＡタグ付きのｐ２ｙ９またはｐ２ｙ５をコードするＤＮＡをインビトロジェン社のリポフェクトアミン２０００によって、ＲＨ７７７７細胞またはＢ１０３細胞へトランスフェクションした。２４時間後に１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭから、０．１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭに培地を切り替え、さらに２４時間培養した。細胞を剥がし取り、結合バッファー（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ ７．４）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．２５Ｍシュークロース）に懸濁した状態で、金属プローブを用いた超音波処理によって細胞を破砕し、８００ｘｇで遠心分離し、上清をさらに１００，０００ｘｇの超遠心分離にかけて、沈殿を得た。この沈殿を再び結合バッファーに懸濁し、一過性に受容体を発現する細胞由来の膜画分とした。
５０μｇのタンパク質を含む膜画分を、０．２５％ＢＳＡを含む結合バッファー中で、各濃度でのＬＰＡの総結合量を求めるために、１ｎＭ、３ｎＭ、及び１０ｎＭのトリチウムラベルされたＬＰＡと混ぜ合わせ（計２００μｌ）、４℃で６０分間反応させた。これと平行して、各濃度でのＬＰＡの非特異的結合量を求めるために、５００倍濃度のトリチウムラベルされていないＬＰＡを含んだ反応液で、膜画分とトリチウムラベルされたＬＰＡを同様に反応させた。
反応液をパッカード社のＧＦ／Ｃガラスフィルターで濾過し、さらにこれを０．２５％ＢＳＡを含む結合バッファーで洗浄した。洗浄後にも依然としてガラスフィルターに吸着している放射能を、受容体と結合しているトリチウムラベルされたＬＰＡの量とした。特異的結合量は総結合量から非特異的結合量を引いて求めた。陰性対照サンプルでは、受容体をコードするＤＮＡの代わりにｐＣＸＮ２．１ベクターをトランスフェクションした。
ＲＨ７７７７細胞についての結果を図１５に示し、Ｂ１０３細胞についての結果を図１６に示す。
【００３４】
実施例９
ｐＣＸＮ２．１ベクターに挿入されたＨＡタグ付きのｐ２ｙ９またはｐ２ｙ５をコードするＤＮＡをインビトロジェン社のリポフェクトアミン２０００によって、ＲＨ７７７７細胞へトランスフェクションした。２４時間後に１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭから、０．１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭに培地を切り替え、さらに２４時間培養した。細胞を剥がし取り、結合バッファー（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ ７．４）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２５Ｍ シュークロース）に懸濁した状態で、金属プローブを用いた超音波処理によって細胞を破砕し、８００ｘｇで遠心分離し、上清をさらに１００，０００ｘｇの超遠心分離にかけて、沈殿を得た。この沈殿を再び結合バッファーに懸濁し、一過性に受容体を発現する細胞由来の膜画分とした。
２０μｇのタンパク質を含む膜画分を、０．２５％ＢＳＡを含む結合バッファー中で、ＬＰＡの総結合量を求めるために、５ｎＭのトリチウムラベルされたＬＰＡと混ぜ合わせ（計２００μｌ）、４℃で６０分間反応させた（この結果を、図１７中では“Ｂｕｆｆｅｒ”と記載している。）。これと平行して、５ｎＭのトリチウムラベルされたＬＰＡと、１μＭのトリチウムラベルされていない種々の脂質（ＬＰＣ：リゾフォスファチジルコリン、ＬＰＥ：リゾフォスファチジルエタノールアミン、ＬＰＳ：リゾフォスファチジルセリン、ＬＰＧ：リゾフォスファチジルグリセロール、ＰＡ：フォスファチジン酸、ＰＡＦ：血小板活性化因子、Ｓ１Ｐ：スフィンゴシン１−リン酸、ＳＰＣ：シフィンゴシルフォスフォリルコリン）を含む反応液で、膜画分とトリチウムラベルされたＬＰＡを同様に反応させた。
各反応液をパッカード社のＧＦ／Ｃガラスフィルターで濾過し、さらにこれを０．２５％ＢＳＡを含む結合バッファーで洗浄した。洗浄後にも依然としてガラスフィルターに吸着している放射能を、受容体と結合しているトリチウムラベルされたＬＰＡの量とした。
結果を図１７に示す。添加した脂質がｐ２ｙ９に親和性を有していれば、ｐ２ｙ９にＬＰＡと競争的に結合し、その結果ＬＰＡのｐ２ｙ９への結合が阻害され、トリチウムラベルされたＬＰＡの結合量が減少することになるが、実験の結果は図１７に示されるように、ＬＰＡ以外の調べた脂質は全てｐ２ｙ９への親和性がＬＰＡほど高くないことが示された。
【００３５】
実施例１０ （ｐ２ｙ９に対するＬＰＡの結合の動力学的考察）
ｐＣＸＮ２．１ベクターに挿入されたＨＡタグ付きのｐ２ｙ９をコードするＤＮＡをインビトロジェン社のリポフェクトアミン２０００によって、ＲＨ７７７７細胞へトランスフェクションした。２４時間後に１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭから、０．１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭに培地を切り替え、さらに２４時間培養した。細胞を剥がし取り、結合バッファー（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ ７．４）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．２５Ｍ シュークロース）に懸濁した状態で、金属プローブを用いた超音波処理によって細胞を破砕し、８００ｘｇで遠心分離し、上清をさらに１００，０００ｘｇの超遠心分離にかけて、沈殿を得た。この沈殿を再び結合バッファーに懸濁し、一過性に受容体を発現する細胞由来の膜画分とした。
４０μｇのタンパク質を含む膜画分を、種々の濃度でのＬＰＡの総結合量を求めるために、０．２５％ＢＳＡを含む結合バッファー中で種々の濃度のトリチウムラベルされたＬＰＡと混ぜ合わせ（計２００μｌ）、４℃で６０分間反応させた。これと平行して、種々の濃度でのＬＰＡの非特異的結合量を求めるために、１０μＭのトリチウムラベルされていないＬＰＡを含んだ反応液で、膜画分とトリチウムラベルされたＬＰＡを同様に反応させた。
反応液をパッカード社のＧＦ／Ｃガラスフィルターで濾過し、さらにこれを０．２５％ＢＳＡを含む結合バッファーで洗浄した。洗浄後にも依然としてガラスフィルターに吸着している放射能を、受容体と結合しているトリチウムラベルされたＬＰＡの量とした。特異的結合量は総結合量から非特異的結合量を引いて求めた。陰性対照サンプルでは、受容体をコードするＤＮＡの代わりにｐＣＸＮ２．１ベクターをトランスフェクションした。
結果を図１８に示す。さらに、ｐ２ｙ９に対するＬＰＡの結合をまとめたグラフを図１９に示す。トリチウムラベルされたＬＰＡの比活性は２１０９ＧＢｑ／ｍｍｏｌ（５７Ｃｉ／ｍｍｏｌ）であった。この図に示されるように、結果はほぼ直線上に乗り、当該直線の式は、ｙ＝−０．０２２３ｘ＋８３１．１９であった。
この結果、ｐ２ｙ９とＬＰＡとのＫｄ値は、４４．８ｎＭであり、Ｂｍａｘは３７．３ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質であった。また、
【００３６】
実施例１１ （ＰＣ１２細胞によるルシフェラーゼ分析）
１０％ウマ血清と５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地から、０．５％ウマ血清と０．２５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地に交換したＰＣ１２細胞に対し、以下の３種のＤＮＡを同時にトランスフェクションした。
（１）ｐＣＸＮ２．１ベクターに挿入されたＨＡタグ付きのｐ２ｙ９をコードするＤＮＡ。
（２）ラットのｚｉｆプロモーターに発現が制御されたホタルのルシフェラーゼＤＮＡ。
（３）単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターに発現が制御されたウミシイタケのルシフェラーゼＤＮＡ。
トランスフェクションの試薬はキアゲン社のスーパーフェクトを用いた。２ｘ１０^５個ずつの細胞を２４穴プレートに播き、４８時間培養した。その後、培地を０．１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ培地に交換し、さらに１２時間培養した。
種々の濃度のＬＰＡで細胞を６時間刺激したときのホタルルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼの活性を、東洋インキ社のピッカジーンデュアルシーパンジーキットとベルトールド社のルミノメーターＬＢ９５０６によって求め、これらの値をもとにウミシイタケに対するホタルのルシフェラーゼ活性値の比を算出した。陰性対照サンプルでは、ｐ２ｙ９をコードするＤＮＡの代わりにｐＣＸＮ２．１ベクターをトランスフェクションした。
結果を図２０に示す。
【００３７】
【発明の効果】
リゾホスファチジン酸（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ：ＬＰＡ）は、血小板活性化因子（ＰＡＦ）やスフィンゴシン１リン酸（Ｓ１Ｐ）などと共に「リゾリン脂質メディエーター」の１種であると考えられており、細胞増殖促進作用、神経細胞の成熟化に必要な神経突起を退縮させる作用、癌細胞の浸潤を誘導する作用、平滑筋収縮作用、血小板凝集作用、細胞死の抑制、細胞の走化性の亢進作用など、様々な組織において様々な作用を有していることが知られてきている。しかし、その作用機構や受容体については、十分な解明がされていなかった。ＬＰＡの生体内での作用機構を解明することは、ＬＰＡが関与している様々な生理作用についての障害を治癒するために必要であり、ＬＰＡの作用機構の解明が求められていた。
本発明は、ＬＰＡの新しいタイプの受容体を明らかにするするものであり、ＬＰＡの受容体を解明したことにより、ＬＰＡの関与する様々な生理作用についての新しい医薬品や診断薬の開発に有効なスクリーニング手法を提供するものである。また、本発明により明らかにされたＬＰＡ受容体であるｐ２ｙ９は、ＬＰＡの受容体として従来から知られていたＥＤＧファミリーやＰＳＰ２４とはアミノ酸配列の相同性がほとんど無いものであり、ＬＰＡの幅広い生理作用の解明に新たな分野を提供するものである。
【００３８】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＧＰＣＲの系統樹である。図１中の任意の２つの受容体を結ぶ線の長さの総和が小さい程、お互いが近縁であることを示す。
【図２】図２は、本発明のｐ２ｙ９を細胞に導入するためのベクターの例を示す。図２の例は、ＨＡタグの付いたｐ２ｙ９をコードするＤＮＡをｐＣＸＮ２．１ベクターのＫｐｎＩとＮｈｅＩの間に組み込んだ発現ベクターを示す。
【図３】図３は、各受容体のＣＨＯ細胞のクローンを用いて、１０μＭのＬＰＡによる各細胞のカルシウム濃度の変化を詳細に検討した結果を示す。図３の縦軸はカルシウム濃度（ＲＦＵ）を示し、横軸は時間（秒）を示す。図３中の黒丸印（●）はＧＰＲ３４の場合を示し、白四角印（□）はｐ２ｙ５の場合を示し、白三角印（△）はｐ２ｙ９の場合を示し、バツ印（×）はｐ２ｙ１０の場合をそれぞれ示している。
【図４】図４は、ＧＰＲ３４、ｐ２ｙ５、ｐ２ｙ９、及びｐ２ｙ１０の４種の受容体を各々安定的に発現しているＣＨＯクローンの細胞を用いて、各種の脂質又はヌクレオチドの添加による細胞内のサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の濃度変化の結果を示すものである。使用した脂質類及びヌクレオチド類は図に記載のとおりである。図４の縦軸はｃＡＭＰの濃度を示し、横軸は使用した各脂質類又はヌクレオチド類を示している。図４の各添加物における４本の棒グラフは左から、ＧＰＲ３４、ｐ２ｙ５、ｐ２ｙ９、及びｐ２ｙ１０をそれぞれ示している。
【図５】図５は、ＧＰＲ３４、ｐ２ｙ５、ｐ２ｙ９、及びｐ２ｙ１０の４種の受容体を各々安定的に発現しているＣＨＯクローンの細胞を用いて、各種の脂質又はヌクレオチドの添加による細胞内のサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の濃度変化の結果を示すものである。使用した脂質類及びヌクレオチド類は図に記載のとおりである。図５の縦軸はｃＡＭＰの濃度を示し、横軸は使用した各脂質類又はヌクレオチド類を示している。図５の各添加物における４本の棒グラフは左から、ＧＰＲ３４、ｐ２ｙ５、ｐ２ｙ９、及びｐ２ｙ１０をそれぞれ示している。
【図６】図６は、ＧＰＲ３４、ｐ２ｙ５、ｐ２ｙ９、及びｐ２ｙ１０の４種の受容体を各々安定的に発現しているＣＨＯクローンの細胞を用いて、各種の脂質又はヌクレオチドの添加による細胞内のサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の濃度変化の結果を示すものである。使用した脂質類及びヌクレオチド類は図に記載のとおりである。図６の縦軸はｃＡＭＰの濃度を示し、横軸は使用した各脂質類又はヌクレオチド類を示している。図６の各添加物における４本の棒グラフは左から、ＧＰＲ３４、ｐ２ｙ５、ｐ２ｙ９、及びｐ２ｙ１０をそれぞれ示している。
【図７】図７は、ＧＰＲ３４、ｐ２ｙ５、ｐ２ｙ９、及びｐ２ｙ１０の４種の受容体を各々安定的に発現しているＣＨＯクローンの細胞を用いて、各種の脂質又はヌクレオチドの添加による細胞内のサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の濃度変化の結果を示すものである。使用した脂質類及びヌクレオチド類は図に記載のとおりである。図７の縦軸はｃＡＭＰの濃度を示し、横軸は使用した各脂質類又はヌクレオチド類を示している。図７の各添加物における４本の棒グラフは左から、ＧＰＲ３４、ｐ２ｙ５、ｐ２ｙ９、及びｐ２ｙ１０をそれぞれ示している。
【図８】図８は、ＧＰＲ３４、ｐ２ｙ５、ｐ２ｙ９、及びｐ２ｙ１０の４種の受容体を各々安定的に発現しているＣＨＯクローンの細胞を用いて、各種の脂質又はヌクレオチドの添加による細胞内のサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の濃度変化の結果を示すものである。使用した脂質類及びヌクレオチド類は図に記載のとおりである。図８の縦軸はｃＡＭＰの濃度を示し、横軸は使用した各脂質類又はヌクレオチド類を示している。図８の各添加物における４本の棒グラフは左から、ＧＰＲ３４、ｐ２ｙ５、ｐ２ｙ９、及びｐ２ｙ１０をそれぞれ示している。図８の左から５番目がＬＰＡの場合である。
【図９】図９は、ＧＰＲ３４、ｐ２ｙ５、ｐ２ｙ９、及びｐ２ｙ１０の４種の受容体を各々安定的に発現しているＣＨＯクローンの細胞を用いて、各種の脂質又はヌクレオチドの添加による細胞内のサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の濃度変化の結果を示すものである。使用した脂質類及びヌクレオチド類は図に記載のとおりである。図９の縦軸はｃＡＭＰの濃度を示し、横軸は使用した各脂質類又はヌクレオチド類を示している。図９の各添加物における４本の棒グラフは左から、ＧＰＲ３４、ｐ２ｙ５、ｐ２ｙ９、及びｐ２ｙ１０をそれぞれ示している。
【図１０】図１０は、ＧＰＲ３４、ｐ２ｙ５、ｐ２ｙ９、及びｐ２ｙ１０の４種の受容体を各々安定的に発現しているＣＨＯクローンの細胞を用いて、各種の脂質又はヌクレオチドの添加による細胞内のサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の濃度変化の結果を示すものである。使用した脂質類及びヌクレオチド類は図に記載のとおりである。図１０の縦軸はｃＡＭＰの濃度を示し、横軸は使用した各脂質類又はヌクレオチド類を示している。図１０の各添加物における４本の棒グラフは左から、ＧＰＲ３４、ｐ２ｙ５、ｐ２ｙ９、及びｐ２ｙ１０をそれぞれ示している。図１０の右端はコントロールである。
【図１１】図１１は、ｐ２ｙ９を安定的に発現している４つのＣＨＯ細胞のクローン、＃０１、＃０９、＃１５、及び＃２０の各々について、種々の濃度のＬＰＡを加えたときの細胞内カルシウム濃度の変化を測定した結果を示す。各グラフの横軸はＬＰＡの濃度（ｎＭ）を示し、縦軸はカルシウムの増加量（ｎＭ）を示す。図１１の（Ａ）は＃０１のクローンの場合であり、図１１の（Ｂ）は＃０９のクローンの場合であり、図１１の（Ｃ）は＃１５のクローンの場合であり、図１１の（Ｄ）は＃２０のクローンの場合である。各（Ａ）〜（Ｄ）の黒菱形印（◆）は各クローンの場合を示し、灰色の四角印（■）は陰性対照の場合を示す。
【図１２】図１２は、ＣＨＯ細胞のクローン、＃０１、＃０９、＃１５、及び＃２０の各々について、細胞内のカルシウム濃度の変化をトロンビン（０．１ＮＩＨ単位／ｍｌ）、ＰＡＦ（１μＭ）、及びＡＴＰ（１０μＭ）について検討した結果を示す。図１２の縦軸はカルシウムの増加量（ｎＭ）を示し、横軸は各添加物を示す。各棒グラフは、左から陰性対照のベクターのみを導入したＣＨＯ細胞、ｐ２ｙ９のクローン＃０１、クローン＃０９、クローン＃１５、クローン＃２０をそれぞれ示している。
【図１３】図１３は、ｐ２ｙ９またはｐ２ｙ５を安定的に発現しているＣＨＯ細胞のクローンを用いて、百日咳毒素（ＰＴＸ）の存在下又は非存在下で、種々の濃度のＬＰＡを加えたときの細胞内ｃＡＭＰ濃度を測定した結果を示す。図１３の（Ａ）はフォルスコリン（５μＭ）で処理しなかった場合であり、図１３の（Ｂ）はフォルスコリン（５μＭ）で処理した場合である。各図の横軸はＬＰＡの濃度（μＭ）を示し、縦軸はｃＡＭＰの濃度の変化の比を示す。各図の黒四角印（■）はｐ２ｙ９のクローンの場合であり、灰色四角印（□）はｐ２ｙ５のクローンの場合を示す。黒菱形印（◆）は陰性対照のベクターのみのクローンの場合を示す。各図の実線は、百日咳毒素（ＰＴＸ）の非存在下の場合であり、破線は百日咳毒素（ＰＴＸ）の存在下の場合である。
【図１４】図１４は、本発明のｐ２ｙ９とｐ２ｙ５とのアミノ酸配列の相同性を示す。図１４の上の段はｐ２ｙ９であり、下の段はｐ２ｙ５である。アミノ酸が同じ位置に有る場合には両者の間にアスタリスク（＊）が付されている。
【図１５】図１５は、ｐ２ｙ５又は本発明のｐ２ｙ９が導入されたＲＨ７７７７細胞を用いて、ＬＰＡとの結合を測定した結果を示す。図１５の（Ａ）は陰性対照の場合を示し、（Ｂ）はｐ２ｙ５の場合を示し、（Ｃ）はｐ２ｙ９の場合を示す。グラフの横軸はトリチウムラベルされたＬＰＡの添加量（ｎＭ）であり、縦軸は測定された放射能の量（ｄｐｍ）を示す。各グラフの黒色の棒は総結合量であり、その右側の灰色の棒は非特異的結合量である。灰色三角印（▲）は、特異的結合量を示している。
【図１６】図１６は、ｐ２ｙ５又は本発明のｐ２ｙ９が導入されたＢ１０３細胞を用いて、ＬＰＡとの結合を測定した結果を示す。図１６の（Ａ）は陰性対照の場合を示し、（Ｂ）はｐ２ｙ５の場合を示し、（Ｃ）はｐ２ｙ９の場合を示す。グラフの横軸はトリチウムラベルされたＬＰＡの添加量（ｎＭ）であり、縦軸は測定された放射能の量（ｄｐｍ）を示す。各グラフの黒色の棒は総結合量であり、その右側の灰色の棒は非特異的結合量である。灰色三角印（▲）は、特異的結合量を示している。
【図１７】図１７は、ＲＨ７７７７細胞から得られた一過性にｐ２ｙ９受容体を発現する細胞由来の膜画分を用いて、ＬＰＡ以外の脂質との反応性を測定した結果を示すものである。図１７中のＢｕｆｆｅｒはトリチウムラベルされたＬＰＡだけを用いた総結合量を示す対照である。図１７の縦軸は測定された放射能の量（ｄｐｍ）を示し、横軸は添加した各脂質を示す。
【図１８】図１８は、本発明のｐ２ｙ９を導入したＲＨ７７７７細胞から得られた一過性にｐ２ｙ９受容体を発現する細胞由来の膜画分を用いて、ｐ２ｙ９に対するＬＰＡの結合の動力学的検討を行った結果を示すものである。図１８の（Ａ）はｐ２ｙ９が導入された細胞の膜を用いた場合であり、図１８の（Ｂ）は陰性対照の場合である。図１８の各グラフの横軸はトリチウムラベルされたＬＰＡの濃度（ｎＭ）であり、縦軸は測定された放射能の量（ｄｐｍ）である。各グラフでは、総結合量を黒四角印（■）で示し、非特異的結合量を黒菱形印（◆）で示し、特異的結合量は白丸印（○）で示されている。
【図１９】図１９は、図１８の結果から得られた動力学パラメーターを求めるためのグラフを示す。図１９の横軸は結合（ｆｍｏｌ／ｍｇ）を示し、縦軸は結合と解離の比（ｆｍｏｌ／ｍｇ／ｎＭ）を示す。
【図２０】図２０は、ＰＣ１２細胞を用いてｐ２ｙ９の作用をルシフェラーゼアッセイにより検討した結果を示すものである。図２０の横軸はＬＰＡの濃度（ｎＭ〜μＭ）を示し、縦軸は比を示す。黒四角印（■）はｐ２ｙ９を導入したＰＣ１２細胞の場合を示し、黒菱形印（◆）は陰性対照の場合を示す。

Claims (8)

1. Ｇタンパク質共役型タンパク質ｐ２ｙ９からなるリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）受容体。
2. ＬＰＡが、１−アシル−ＬＰＡである請求項１に記載のＬＰＡ受容体。
3. ｐ２ｙ９が、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するものである請求項１又は２に記載のＬＰＡ受容体。
4. Ｇタンパク質共役型タンパク質ｐ２ｙ９の、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）受容体としての使用。
5. ＬＰＡが、１−アシル−ＬＰＡである請求項４に記載の使用。
6. ｐ２ｙ９が、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するものである請求項４又は５に記載の使用。
7. 請求項１〜３のいずれかに記載のＬＰＡ受容体を用いて、当該受容体に対する作動物質又は拮抗物質をスクリーニングする方法。
8. 癌細胞の浸潤に対する拮抗物質をスクリーニングする方法である請求項７に記載の方法。

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