【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物から抽出した天然のポルフィリン誘導体からなる生体用光増感剤及び腫瘍細胞殺傷剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
腫瘍の治療法の１つに光力学療法という方法がある（非特許文献１参照）。この方法は、腫瘍細胞に対する選択性を有する光感受性物質を腫瘍細胞に取り込ませ、光を照射して光による化学反応（光反応）を腫瘍細胞内に起こさせることにより、酸素を活性化し、その結果生じる一重項酸素やスーパーオキシドラジカルにより腫瘍細胞を死滅させるものである。類似する放射線治療法に比べて、骨髄等に対する重篤な副作用がほとんどなく、外科的方法のように組織の大部分を取り去るということもないので、腫瘍以外の組織・臓器の機能を保全することも容易になる。従来、光を照射しやすい皮膚ガンや眼底病変の治療にもっぱら用いられてきたが、最近、光源としてのレーザーや導波管（光ファイバー）等ハードウェア面での著しい進歩があいまって、肺ガンや大腸ガン等の臓器ガンにも積極的に応用されている。特に中心性早期肺ガンについては、米国ＮＣＩのプロトコールで治療の第１選択肢となっており、我が国でも本法のみにより８５％以上の治癒率があげられている（非特許文献２参照）。ところで、このような光力学療法にとって重要な要素は、腫瘍細胞に対する選択性を有し、かつ光によって酸素を活性化する仲立ちとなる化合物（光増感剤）である。
【０００３】
この光増感剤として従来用いられてきたものにはヘマトポルフィリン（非特許文献３参照）やピロフェオホーバイドエステル（非特許文献４、５参照）など天然のポルフィリン誘導体やそれをモデルとしたフタロシアニン系色素 （非特許文献６参照）などがあるが、これらの中ではヘマトポルフィリンの加工品であるフォトフリンのみが我が国では治療薬として認可されている。また、これらは、癌細胞に対する親和性を利用して診断剤として使用する試みもなされている。
しかし、癌の光力学療法に用いられている従来の光増感剤、とくにフォトフリンは光の吸収極大が６２５ｎｍと比較的短波長側にあるため、組織浸透性の良い７００ｎｍに近いもしくはそれよりも長い長波長の光による細胞殺傷効果が弱いという問題があった。また、第２世代の光増感剤と期待されているクロリンｅ６誘導体（特許文献１参照）は吸収波長の問題をクリアしているが、ガン細胞への取り込みが必ずしも良いとは言えない（非特許文献７参照）。また、フタロシアニンやローダミンのような合成色素（特許文献２参照）の場合は非選択的毒性と副作用も強いという問題があり、この点からは天然ポルフィリンが優れていると考えられ、またガン細胞への取り込み効率からも、天然のポルフィリン誘導体に新たな期待が高まっている。
【０００４】
【非特許文献１】
奥仲、加藤、日本外科学会雑誌、第１０３巻、第２号、２５８−２６２頁（２００２年）
【非特許文献２】
古川、加藤、 日本臨床、第６０巻、増刊５、４１４−４１８頁、（２００２年）
【非特許文献３】
Ｐａｓｓ， ＨＩ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， ８５（６）， ４４３ −４５６ （１９９３））
【非特許文献４】
Ｍａｔｒｏｕｌｅ Ｊ．Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ２０， ４０７０ −４０８４ （２００１）
【非特許文献５】
Ｈａｊｒｉ Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ， ７５（２）， １４０ −１４８（２００２）
【非特許文献６】
Ｌａｍ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２７６ （５０）， ４７３７９ −４７３８６ （２００１）
【非特許文献７】
Ｓｐｉｋｅｓ Ｊ．Ｄ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｂ： ６， ２５９ −２７４ （１９９０）
【特許文献１】
特開昭２００１−２３３８７７号公報
【特許文献１】
再表９８／１４４５３号公報
【特許文献２】
特表平１０−５０５３４９号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は、腫瘍細胞への取り込み効率が高く、安全な天然のポルフィリン化合物であって、吸収極大が７００ ｎｍの長波長側へシフトし、かつ、光照射により、従来のものよりさらに強力な腫瘍細胞傷害性を発揮する化合物を見いだし、これにより、新規かつ有用な生体用光増感剤ないしは腫瘍細胞傷害剤を開発することを課題とするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するため、鋭意研究の結果、本発明者等は、クロロフィルの代謝産物として各種のポルフィリン誘導体を含有する植物において、光増感作用を有し、光の照射により腫瘍細胞を殺傷する成分を検索した結果、植物抽出物中に含まれる、以下の式Ｉ及びＩＩの構造式で表されるポルフィリン誘導体が上記課題の解決に有用であることを見いだし、本発明を完成するに至ったものである。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１２）からなるものである。
（１） 下記構造式Ｉ又は式ＩＩで表される化合物を含有することを特徴とする生体用光増感剤。
【化１】
【化２】
（２） 上記構造式Ｉ及び／又は式ＩＩで表される化合物を含む植物の抽出物からなる生体用光増感剤。
（３） 植物がイネ科植物である（２）に記載の生体用光増感剤。
（４） イネ科植物が、Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ属に属する植物である（３）の生体用光増感剤。
（５） 上記構造式Ｉ又はＩＩで表される化合物を含有することを特徴とする腫瘍細胞殺傷剤。
（６） 上記構造式Ｉ及び／又は式ＩＩで表される化合物を含む植物の抽出物からなる腫瘍細胞殺傷剤。
（７） 植物がイネ科植物である（６）に記載の腫瘍細胞殺傷剤。
（８） イネ科植物がＰｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ属に属する植物である（７）に記載の腫瘍細胞殺傷剤。
（９） 上記構造式Ｉで表される化合物。
（１０）上記構造式Ｉ又はＩＩで表される化合物を含有する植物から溶媒を用いて抽出することを特徴とする上記構造式Ｉ又はＩＩで表される化合物の製造方法。
（１１）植物がイネ科植物である（１０）に記載の製造方法。
（１２）イネ科植物が、Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ属に属する植物である（１１）に記載の方法。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明において使用する上記構造式Ｉ及びＩＩの化合物（以下、前者を化合物１といい、後者を化合物２という。）は、植物から抽出される。抽出原料となる植物としては、例えば、モウソウチク、マダケ等Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ属の植物の他、クマザサ等Ｓａｓａ属、イネ等Ｏｒｙｚａ属、トウモロコシ等Ｚｅａ属等のイネ科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ科）の植物が挙げられるが、 特に、モウソウチク、マダケ等Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ属に属する植物が好適である。しかし、本発明の化合物１及び／又は化合物２を含んでいれば他科の植物であっても、もちろん良い。これら植物の植物体のうち、化合物１及び／又は化合物２ を多く含む部位はクロロフィル多く含む部位であり、主として葉、茎等である。これら植物体は本化合物含量が最高の時期に収穫する。すなわち、本化合物が多く含まれる部位、時期等は植物によって異なるが、一般的には、本発明の化合物１及び／又は化合物２の母体であるクロロフィルの代謝が盛んな部位、時期が望ましく、緑葉を収穫することになる。
本発明においては、このように収穫した植物体を水または有機溶媒で抽出する。有機溶媒としてはメタノール、エタノール、酢酸エチル、クロロホルム等が用いられる。このような粗抽出物は有毒成分を含まない限りそのまま適宜濃縮、希釈して用いることができるが、活性物質である化合物１または化合物２を精製して用いる方が良い場合には、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、分取薄層クロマトグラフィー等、公知の手段で精製することができる。
【０００９】
上記方法により精製した化合物１及び２は、水、エタノール等の溶媒に溶解するか、もしくは適当なリン脂質等の界面活性剤を含む水に懸濁して、生体に適用する光増感剤として用いる。
すなわち、本発明の化合物１及び２は、そのＵＶスペクトルにおいて、Ｑバンドの吸収極大がともに６６８ｎｍにあり、従来、光力学療法用の光増感剤として使用されていたフォトフリン（６２５ｎｍ）よりもはるかに長波長域側であり、また、従来、最も長波長域側に吸収極大があるとされるクロリンｅ６（６５４ｎｍ）よりもさらに長波長域側に吸収極大がある。したがって、本発明の化合物１及び２は、これら従来の光力学療法に使用する光増感剤に比べ、より、組織浸透性の高い波長域の光に対しても光増感性を示し、これらの長波長域の光照射により、より深い部位にある癌組織あるいは癌細胞を有効に殺傷できる。特に、本発明の化合物のうち、化合物１は文献未記載の新規化合物であり、光力学療法用光増感剤として極めて顕著な腫瘍細胞殺傷性を有する。
【００１０】
次に、本発明の化合物の使用形態について説明するが、基本的には従来の光力学療法における光増感剤の使用形態と同様である。
本発明の化合物１及び２は、上記溶媒に溶解して静注により生体内に投与され、これら化合物の腫瘍細胞に対する選択的親和性により、これら化合物は腫瘍組織、細胞に集積する。
次いで、腫瘍組織あるいは細胞に対し光照射を行うが、光照射は、腫瘍組織、細胞に対して、光を直接あるいは導波管（光ファイバー）を介して照射する。
使用する光源としては、例えば、白色蛍光灯、半導体レーザ（６７０ｎｍ）、ＹＡＧ−ＯＰＯレーザ（６２０−６７０ｎｍの可変波長）、Ｎｄ／ＹＡＧレーザ、ハロゲンランプ、ダイオードアレイ（ｄｉｏｄｅ ａｒｒａｙ）及びキセノンアークラプ（Ｘｅｎｏｎ ａｒｃ ｌａｍｐ）等が挙げられる。
腫瘍に集積した本発明の化合物１、２は、この光照射により励起されて光化学反応を惹起し、これにより、腫瘍組織内において活性酸素が産生される。活性酸素は、腫瘍細胞に対しネクローシスを生じさせ、また、ミトコンドリアからのシトクロムｃの放出を介してカスパーゼ３を活性化させアポトーシスを誘導して、腫瘍を壊死させる。本発明の化合物１及び２を用いた癌細胞の殺傷試験においては、光照射により、癌細胞におけるカスパーゼ活性が増大し、アポトーシスを起こすことが確認されている。
【００１１】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【実施例１】竹の葉抽出物の調製
１０月に採取したモウソウチクの葉を２０日間陰干しし、５００ｇの乾燥葉を得た。これを約１０リットルのメタノールに浸漬、ホモジェナイザーで処理し１０日間暗所に放置した。葉を濾過で除いた抽出液をロータリーエバポレーターで濃縮し、１０５ｇの油状残渣を得た。この１０４ｇを１０分の１づつ２００ｍｌの酢酸エチルと混合し３０分攪拌した。静置し、上清をデカンテーションで得た。全部の上清を合わせ、ロータリーエバポレーターで濃縮し、油状残渣２８ｇを得た。
【００１２】
【実施例２】化合物１のクロマトグラフィーによる精製
実施例１で得た酢酸エチル抽出物（油状残渣）のうち５ ｇを取り少量のヘキサンと酢酸エチルの混合液に溶かし、ヘキサンで充填したシリカゲルカラム（１２０ ｃｍ３）の頂部に流し込み吸着させた。ヘキサンと酢酸エチルを５：１、３：１、２：１、１：１で混合した溶液６００ ｍｌづつを流し、溶出液を６０ ｍｌづつ分画した。ヘキサン：酢酸エチル＝３：１の混合液で溶出したフラクションを合わせ、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この操作を４本のカラムについて繰返し、合計６ｇの濃縮残渣を得た。
上記の濃縮残渣６ｇのうち２ｇをベンゼンで充填したシリカゲルカラム（６０ｃｍ３）の頂部に吸着させ、ベンゼンと酢酸エチルを２０：１、１０：１、８：１、６：１、３：１、１：１で混合した溶液２４０ ｍｌづつを流し、溶出液を３０ ｍｌづつ分画した。１０：１から６：１のベンゼン／酢酸エチル混合液で溶出したフラクションを合わせ、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この操作を３本のカラムについて繰返し、合計０．８ｇの濃縮残渣を得た。
【００１３】
濃縮残渣０．８ｇのうち０．２ｇをベンゼンで充填したシリカゲルカラム（３０ ｃｍ３）の頂部に吸着させ、ベンゼンと酢酸エチルを１００：１、５０：１、３０：１、２０：１、１０：１、８：１、５：１、１：１で混合した溶液１２０ ｍｌづつを流し、溶出液を２０ ｍｌづつ分画した。３０：１から１０：１のベンゼン／酢酸エチル混合液で溶出したフラクションを合わせ、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この操作を４回繰返して合計２００ｍｇの濃縮残渣を得た。
濃縮残渣２００ｍｇのうち４０ｍｇを少量のアセトニトリルに溶かし、水とアセトニトリル（２：１）の混液で充填したワコーゲルＬＰ−６０Ｃ１８のカラム（１５ ｃｍ３）の頂部に流し込み、次いで水とアセトニトリルを２：１、１：１、１：２、１：２．５、１：３、１：４、１：５、１：６、１：８、１：２０、１：４０、１：８０、及び０：１００の割合で混合した溶液を３０ ｍｌづつ流し、溶出液を８ ｍｌづつ分画した。１：３から１：５の水／アセトニトリル混合液で溶出したフラクションを合わせ、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この操作を５回繰返して２０ｍｇの残渣を得た。
【００１４】
この濃縮残渣の半分をヘキサンで充填したシリカゲルカラム（１２ ｃｍ３）の頂部に吸着させ、ヘキサンと酢酸エチルを４：１、３．５：１、３：１、２．５：１、２：１、１．５：１、及び１：１の割合で混合した溶液２０ ｍｌづつを流し、溶出液を４ ｍｌづつ分画した。２．５：１から１．５：１の混合液で溶出したフラクションを合わせ、ロータリーエバポレーターで濃縮した。残り半分の残渣についても同様に処理し、合わせた濃縮残渣を真空ポンプで乾燥し、４．０ｍｇの化合物１を灰緑色のガム状物として得た。このようにして得られた化合物１はＴＬＣ（シリカゲル６０ Ｆ２５４、０．２５ ｍｍ、ヘキサン／酢酸エチル＝１：１で展開）においてＲｆ ０．３０の単一スポットを示したことから単一化合物と判断された。
本化合物はＦＡＢ−ＭＳにおいてｍ／ｚ ６５３とｍ／ｚ ６７５に顕著なピークを示し、それぞれ［Ｍ＋１］＋、［Ｍ＋Ｎａ］＋ピークと判断された。またＥＳＩ−ＭＳにおいてもｍ／ｚ ６５３．４に［Ｍ＋１］＋と判断されるピークを示した。ＵＶスペクトルは酢酸エチル中で、３９８、４９６、５２７、６１１、及び６６８ｎｍに吸収極大を示した。モル吸光係数はこの順に１．２５ ｘ １０５、１．１１ ｘ １０４、７．９１ ｘ １０３、５．５４ ｘ １０３、４．５１ ｘ １０４であった。このＵＶスペクトルのデータから、本化合物はクロロフィルの関連物と推定されたので、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定し、既知のクロロフィル関連化合物の文献データと比較した。この比較を表１及び表２に示す。
【００１５】
【表１】
表１ １Ｈ−ＮＭＲ（４００／５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）のデータの比較（数字はケミカルシフト、ｐｐｍ）
【００１６】
【表２】
表２ １３Ｃ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）のデータの比較
（数字はケミカルシフト、ｐｐｍ）
文献値はＴａｋａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， （Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．， １９９５， １０１５−１０１６）による。
＊検出されず。
【００１７】
上表からわかるように、本化合物のＮＭＲスペクトルはＭａら（Ｍａ Ｌ． ａｎｄ Ｄｏｌｐｈｉｎ Ｄ．， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， ６１， ２５０１−２５１０ （１９９６））及びＴａｋａｓｈｉｍａら（Ｔａｋａｓｈｉｍａ Ｈ．， Ｊｉｎ Ｓ．， Ｙｏｓｈｉｄａ Ｍ．， Ａｂｅ Ｊ．， ａｎｄ Ｍｕｒａｉ Ａ．， Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．， １０１５ −１０１６， １９９５）に記載のある１８−ｃａｒｂｏｘｙ−２０−（１，１−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｏｘｙ−２−ｏｘｏｅｔｈｙｌ）−８−ｅｔｈｅｎｙｌ−１３−ｅｔｈｙｌ−２，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−３，７，１２，１７−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−２２Ｈ，２４Ｈ−ｐｏｒｐｈｉｎｅ−２−ｐｒｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄ δ−ｌａｃｔｏｎｅ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒのスペクトルによく一致し、ただｄｉｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒでなくｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒである点が異なると結論された。これにより、本化合物の分子式はＣ３７Ｈ４０Ｎ４Ｏ７となるが、この式量（６５２．７３６）は前述のマススペクトルのデータによく一致する。さらに１Ｈ−ＮＭＲを詳細に解析したところ、２位のプロトンのシグナルが４．０９５ ｐｐｍと４．９９ ｐｐｍに分かれて出現していることを認めた（積分曲線比６．１５：１．０１）。このことはＭａらによって既に指摘されているが、２０１位のヒドロキシル基がセミケタール構造のためにエピメリ化し、２０１−（Ｓ）体（主成分）と２０１−（Ｒ）体（副成分）のジアステレオマー混合物となるためである。従って、本発明の化合物１は上記δ−ｌａｃｔｏｎｅ ｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒの２０１−（Ｓ）体と２０１−（Ｒ）体が６：１で混ざった混合物と結論される。本化合物１は文献未載の新規化合物である上、上記のＭａらやＴａｋａｓｈｉｍａらのｄｉｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒとｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒを含めて、光増感作用による細胞殺傷効果が初めて明らかにされた２０１−ｈｙｄｒｏｘｙｐｕｒｐｕｒｉｎ−７ δ−ｌａｃｔｏｎｅ型ポルフィリン誘導体である。
【００１８】
【実施例３】化合物２のクロマトグラフィーによる精製
実施例１で得られた酢酸エチル抽出物（油状残渣）のうち２ｇを取り少量のヘキサンと酢酸エチルの混合液に溶かし、ヘキサンで充填したシリカゲルカラム（６５ ｃｍ３）の頂部に流し込み吸着させた。ヘキサンと酢酸エチルを８０：１、６０：１、４０：１、２０：１、１０：１、８：１、６：１、４：１、２：１、１：１、１：２、
１：５、１：６、１：５０、及び０：１で混合した溶液１５０ ｍｌづつを流し、溶出液を２０ ｍｌづつ分画した。ヘキサン：酢酸エチル４：１から１：５０の混合液で溶出したフラクションを合わせ、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この操作を４本のカラムについて行ない、合計３ｇの濃縮残渣を得た。
上記の濃縮残渣３ｇのうち０．５ｇを再度ヘキサンで充填したシリカゲルカラム（３０ ｃｍ３）の頂部に吸着させ、ヘキサンと酢酸エチルを３：１、２．５：１、２：１、１．５：１、１：１、１：１．５で混合した溶液１２０ ｍｌづつを流し、溶出液を１５ ｍｌづつ分画した。２．５：１から１．５：１のヘキサン／酢酸エチル混合液で溶出したフラクションを合わせ、ロータリーエバポレーターで濃縮した。以上の操作を６回繰返して合計５００ｍｇの濃縮残渣を得た。
【００１９】
この濃縮残渣を分取用ＴＬＣ（シリカゲル、厚さ１ｍｍ、２０ ｘ ２０ ｃｍ）にアプライし、ヘキサン／酢酸エチル３：１の混液で２回、３：２の混液で３回、１：１の混液で１回、合計６回多重展開した。最終的にＲｆ ０．６の緑色ゾーンのシリカゲルを掻き取り、酢酸エチルで抽出した。
この抽出物を濃縮して得た８ｍｇの油状残渣をヘキサンで充填したシリカゲルカラム（１０ ｃｍ３）の頂部に流し込み吸着させた。ヘキサンと酢酸エチルを３：１、３：１．５、３：２、及び０：１で混合した溶液３０ ｍｌづつを流し、溶出液を５ ｍｌづつ分画した。ヘキサン：酢酸エチル３：１．５の混合液で溶出したフラクションを合わせ、ロータリーエバポレーターで濃縮、真空ポンプで乾燥し、２．０ｍｇの化合物２を灰緑色ガムとして得た。本化合物はＴＬＣ（シリカゲル６０ Ｆ２５４、０．２５ ｍｍ、ヘキサン／酢酸エチル＝３：２で展開）においてＲｆ ０．５３の単一スポットを示したことから単一化合物と判断された。
【００２０】
本化合物はＦＡＢ−ＭＳにおいてｍ／ｚ ９０３とｍ／ｚ ９２５に顕著なピークを示し、それぞれ［Ｍ＋１］＋、［Ｍ＋Ｎａ］＋ピークと判断された。ＵＶスペクトルは酢酸エチル中で前述の化合物１とほぼ同様に、３９８、４９６、５２７、６１１、及び６６８ｎｍに吸収極大を示した。モル吸光係数はこの順に１．１９ ｘ １０５、１．２１ ｘ １０４、７．２７ ｘ １０３、５．０５ ｘ １０３、４．２９ ｘ １０４であった。このＵＶスペクトルのデータから、本化合物もクロロフィルの関連物と推定されたので、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定し、既知のクロロフィル関連化合物の文献データ及び前述の化合物１のスペクトルと比較した。この比較を前記表１、及び下記表３に示す。
【００２１】
【表３】
表３ １３Ｃ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ａｃｅｔｏｎ−ｄ６）のデータの比較
（数字はケミカルシフト、ｐｐｍ）
１８２−（Ｒ）−Ｃｈｌ ａのデータはＨｙｖａｅｒｉｎｅｎら（Ｍａｇ．Ｒｅｓ．Ｃｈｅｍ．，
３３，６４６−６５６（１９９５））による。ただし、表のｎｕｍｂｅｒｉｎｇは
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔの体系による。
＊検出されず。
【００２２】
これによれば、化合物２は化合物１のエチルエステルがフィチルエステルに置換された構造であることが判明した。これにより、本化合物の分子式はＣ５５Ｈ７４Ｎ４Ｏ７となるが、その式量（９０２．５５５７）は前述のマススペクトルのデータによく一致する。さらに１Ｈ−ＮＭＲを詳細に解析したところ、２位のプロトンのシグナルが４．０６ｐｐｍと４．９６ ｐｐｍに分かれて出現していることを認めた（積分曲線比８．７：１．４）。従って、本発明の化合物２は１８−ｃａｒｂｏｘｙ−２０−（１，１−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｏｘｙ−２−ｏｘｏｅｔｈｙｌ）−８−ｅｔｈｅｎｙｌ−１３−ｅｔｈｙｌ−２，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−３，７，１２，１７−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−２２Ｈ，２４Ｈ−ｐｏｒｐｈｉｎｅ−２−ｐｒｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄδ−ｌａｃｔｏｎｅ ｐｈｙｔｙｌ ｅｓｔｅｒの２０１−（Ｓ）体と２０１−（Ｒ）体が６：１で混合しているジアステレオマー混合物と結論される。なお、Ｇａｎｄｕｌ−Ｒｏｊａｓら（Ｇａｎｄｕｌ−Ｒｏｊａｓ Ｂ．， Ｇａｌｌａｒｄｏ−Ｇｕｅｒｒｅｒｏ Ｌ．， Ｍｉｎｇｕｅｚ−Ｍｏｓｑｕｅｒａ Ｍ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， ６２（１０）， １１７２ −１１７７ （１９９９））はオリーブから同じ構造の化合物が得られたと記載しているが、ＵＶとＭＳスペクトルにのみ基づいて判断している。１Ｈ−ＮＭＲと１３Ｃ−ＮＭＲを測定し、構造を厳密に確認した上での報告としては本明細書が初めてである。
【００２３】
【実施例４】
ヒト白血病細胞株Ｕ−９３７を１０％の子牛胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地に１ｘ１０６個／ｍｌの割合で懸濁し、１２−ｗｅｌｌの細胞培養プレート２枚のウェルに０．８ｍｌづつ入れた。サンプルは２０％アセトンを含むエタノールに溶解し、適宜希釈した上で、８μｌづつ上記０．８ｍｌの細胞培養液に添加した。この際、２枚のプレートの両方に同じように添加した。１枚のプレートはサンプル添加後アルミフォイルでくるみ、炭酸ガスインキュベーターに入れた。もう１枚のプレートは５時間インキュベート後、蛍光灯（ＮＥＣ製昼白色、２０型１８Ｗ、ＦＬ２０ＳＳＮ／１８）の１０ｃｍ直下（約２０００ｌｕｘ、０．２４ ｍＷ／ｃｍ２）に１０分置いた後、インキュベータに戻し培養を継続した。６時間後に位相差顕微鏡で細胞を観察し、ネクロシスが見られる場合はトリパンブルー染色で確認した。
【００２４】
結果を図１と図２に示す。図１においてＡはコントロール、ＢとＣには化合物１を１μＭ濃度で添加し、ＤとＥには標準の光増感剤であるＰＰＢＭｅ（ピロフェオフォーバイドメチルエステル， Ｆｒｏｎｔｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．社（ユタ州、Ｕ．Ｓ．Ａ．）製）を１μＭ濃度で添加した。サンプル添加後、ＢとＤは上述のように光を照射し、ＣとＥは光を断って培養した。図１ではＢが位相差顕微鏡下にネクロシスの像を示したので、Ａ〜Ｅの各ウェルをトリパンブルーで染色した。Ｂ（化合物１添加、光照射）のみ、全細胞が青に染まり、ネクロシスを起こしていることがわかる。一方、ＰＰＢＭｅでは光照射しても、ほとんどネクロシスはおきていない（図１のＤ）。図２は位相差顕微鏡写真であり、本図においてＡはコントロール、ＢとＣには化合物１を０．３μＭ濃度で添加し、ＤとＥにはＰＰＢＭｅを０．３μＭ濃度で添加した。サンプル添加後、ＢとＤは上述のように光を照射し、ＣとＥは光を断って培養した。図２Ｂ（０．３μＭの化合物１添加、光照射）では、大部分の細胞が断片化し、アポトーシスが起きていることがわかる。一方、図２Ｄ（０．３μＭ ＰＰＢＭｅ、光照射）では断片化した細胞はわずかである。いずれも、光照射なし（図１ＣとＥ、図２ＣとＥ）ではアポトーシスは起きず、ネクロシスもほとんど起きていない。このように、本発明の化合物１は１μＭ程度の濃度では光照射によりネクロシスを、また０．３μＭ程度の濃度では光照射によりアポトーシスを誘起し、いずれにおいても標準のＰＰＢＭｅより強い活性を示している。
【００２５】
【実施例５】
Ｕ−９３７細胞を１ｘ１０６個／ｍｌの割合で上記培地に懸濁し、１２−ｗｅｌｌの細胞培養プレートの各ウェルに０．８ ｍｌづつ入れた。次いで、本発明の化合物１、化合物２、もしくは標準の光増感剤であるＰＰＢＭｅを１， ０．１，０．０３または０．０１ ｍＭの濃度で溶かした２０％アセトン／エタノール溶液の８μｌづつを入れ、プレートをゆすってよく混合した。コントロールとしてはサンプルを含まない上記溶媒を８μｌ添加した。各サンプルについてプレートを２枚づつ準備し、１枚は光照射なしでインキュベートし、他の１枚は実施例１の場合と同様に５時間前培養後１０分間蛍光灯直下に置き、光照射後インキュベータに戻し、培養を継続した。７時間後、細胞を遠心分離で集め、氷冷したＰＢＳ（リン酸緩衝化塩溶液）で洗浄した。次いで、公知の方法（Ｙａｍａｚａｋｉ Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．， ２５９， ６４ −７８ （２０００））でアポトーシスの指標となるカスパーゼ−３の活性を測定した。結果を図３に示すが、化合物１は光を当てた場合にのみカスパーゼを活性化しアポトーシスを誘導すること、そしてその活性は同濃度のＰＰＢＭｅと比べて顕著に強く、特に低濃度（０．１μＭ）では４０倍以上強いことがわかる（光照射なしのバックグラウンドを差し引いて比較）。また、化合物２も、化合物１に比べると弱いが、やはり光を当てられるとカスパーゼを活性化することがわかる。（図３のデータは３回の平均値と標準偏差で示されている。）
【００２６】
【実施例６】
ヒト大腸がん細胞株Ｃｏｌｏ３２０ＤＭを１０％ＦＢＳ入りＲＰＭＩ−１６４０培地で培養し、３ ｘ１０５個／ｍｌの割合で同培地に懸濁した。これを０．１ｍｌづつ９６−ｗｅｌｌプレートの各ウェルに入れ、３日間培養しウェルの底に張りつかせた。次に、実施例４と同様にして、化合物１を１μＭ（Ｂ、Ｆ）、同０．１μＭ（Ｃ、Ｇ）、ＰＰＢＭｅ１μＭ（Ｄ、Ｈ）、溶媒のみ（Ａ、Ｅ）を添加した。この際、２枚のプレートを用意し、一方のプレートに対してサンプル（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）を添加し、他方のプレートにサンプル（Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）を添加した。この後、それぞれ６時間前培養後、一方のプレート（サンプルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）に対し１５分間光照射処理し（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）、他方のプレート（サンプルＥ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）に対しては光照射せずに、さらに２４時間培養した。次いで、培地をピペットで吸引除去し、４％のホルマリン液（１０％液をＰＢＳで希釈）０．１ｍｌづつを入れ、氷上に１５分放置した。ホルマリン液を除き、氷冷ＰＢＳで１回洗浄後、０．５％のＴｗｅｅｎ２０と０．２％の牛血清アルブミンを含むＰＢＳ０．１ｍｌづつを入れ、室温に１０分放置した。処理液を捨て、ＳＳＣ（Ｘ２）液で洗浄後、ＰＢＳで３回洗浄した。Ｐｒｏｍｅｇａ社のｉｎ ｓｉｔｕアポトーシス検出キットを用い、ＤＮＡの断片化をＴＵＮＥＬ法で検出した。すなわち、ＤＮＡ断端にＴｄＴ酵素でビオチン結合ヌクレオチドを導入し、そのビオチンにホース・ラディッシュ・ペロキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合したアビジンを結合させ、最後に過酸化水素と色素前駆体をＨＲＰに作用させ発色反応を行い、アポトーシスでＤＮＡが断片化した核を褐色に染色した。結果を図４に示すが、１μＭの化合物１を作用させ、光処理した細胞（Ｂ）はほぼすべてアポトーシスしていることがわかる。同条件下で１μＭのＰＰＢＭｅはＤＮＡの断片化を完全には進行させていない（Ｄ）。さらに、化合物１は０．１μＭの濃度でも光照射でアポトーシスを誘導していた（Ｃ）。以上すべての場合について、光照射がなければ褐色の細胞はほとんど検出されなかった（Ｆ、Ｇ、Ｈ）。このように、化合物１はＣｏｌｏ３２０ＤＭ細胞のアポトーシスを光照射下でＰＰＢＭｅより強く誘導する。
【００２７】
【実施例７】
Ｃｏｌｏ３２０ＤＭ細胞の懸濁液（３ ｘ １０５個／ｍｌ）を０．８ ｍｌづつ１２−ｗｅｌｌプレートのウェルに入れ、３日間培養した。次いで、化合物２を１０及び０．１μＭの濃度で、ＰＰＢＭｅを０．１μＭの濃度で、実施例５と同様に上記各ウエルの細胞懸濁液に添加し、前培養、光照射処理し、さらに１８時間培養後、ウェルごとに細胞をスクレーパーで剥がして集めた。氷冷ＰＢＳで洗浄後、前述のようにカスパーゼ−３の活性を測定した。結果を図５に示すが、１０μＭの化合物２は０．１μＭのＰＰＢＭｅより強くカスパーゼを活性化する。（データは２回の平均値と標準偏差で示されている。）
【００２８】
【実施例８】
ヒト大腸がん細胞株ＨＴ−２９を１０％のＦＢＳを含むＭｃＣｏｙ’５Ａ培地で培養し、実施例７と同様にして、１２−ｗｅｌｌプレートに植え込み、化合物１を１μＭおよび０．１μＭの濃度でそれぞれ添加、前培養、光照射を行った。 この際、化合物１を添加しないものをコントロールとして、同様に前培養、光照射した。２４時間後細胞をスクレーパーで集め、ＰＢＳで洗浄後、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００含有０．１Ｍリン酸緩衝液で細胞を破壊しＤＮＡを抽出した。抽出液をＲＮａｓｅとプロティナーゼＫで処理し、寒天ゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイドでＤＮＡを検出した。結果を図６に示す。
図６中、レーン１は分子量マーカー、レーン２はコントロール、レーン３は化合物１を１μＭ濃度で添加したもの、レーン４は化合物１を０．１μＭ濃度で添加したものをそれぞれ示す。
これによれば、化合物１を加え光照射した細胞では小サイズのＤＮＡ断片が増加し、アポトーシスが進行していることが確認された。
【００２９】
【実施例９】
ヒト肉腫細胞株ＨＴ−１０８０を１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地で培養し、２ ｘ １０５個／ｍｌの懸濁液とし、０．１ｍｌづつ９６−ｗｅｌｌプレートに撒き込んだ。実施例４と同様に化合物１を１μＭ濃度で添加、前培養、光照射を行い、１６時間培養後、４％ホルマリンで固定し、Ｓｙｔｏｘ（１０μＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）で細胞核を染色し、蛍光顕微鏡で観察した。結果を図７に示す。なお、図中Ａは、コントロール（化合物１無添加）。Ｂは化合物１（１μＭ）を添加し、光照射した場合、Ｃは化合物１（１μＭ）を添加し、遮光して培養した場合をそれぞれ示す。Ｂに示されるように、化合物１を添加して光照射した場合にのみ核が凝集、断片化しており、アポトーシスが誘導されたことが確認された。
【００３０】
【実施例１０】
ＨＴ−１０８０細胞を１ ｘ １０６個づつ１ｍｌの培地と共に１２−ｗｅｌｌプレートに植え込み、実施例１で得た竹の葉のメタノール抽出物（粗抽出物）を１、０．１及び０．０１μｇ／ｍｌの濃度で添加し、光照射処理、１８時間培養後、実施例７と同様に細胞を集め、カスパーゼ−３の活性を測定した。図８に示すように、粗抽出物も光照射でＨＴ−１０８０細胞のカスパーゼを活性化した。（データは３回の平均値と標準偏差で示されている。）
【００３１】
【発明の効果】
本発明のポルフィリン誘導体のＵＶスペクトルは、Ｑバンドの吸収極大が６６８ｎｍにあり、従来用いられてきたポルフィリン系光増感剤のフォトフリン（６２５ ｎｍ）やクロリンｅ６ （６５４ ｎｍ）などより長波長側にシフトしている。また、実際の腫瘍細胞傷害性試験においても、ヒト白血病細胞や大腸ガン細胞について同一の条件で薬剤処理、光照射を行なった場合、本発明の化合物１は従来用いられてきたピロフェオホーバイドより強力な細胞傷害性を示した。すなわち、本発明は、従来の光力学療法用光増感性ポルフィリン誘導体よりも強力なガン細胞傷害性を示す新しい天然由来ポルフィリン誘導体を提供するものである。
【００３２】
【図面の簡単な説明】
【図１】化合物１（Ｂ， Ｃ）又はＰＰＢＭｅ （Ｄ， Ｅ）を１μＭの濃度で添加したＵ−９３７細胞をＦＬ２０ＳＳＮ／１８蛍光灯で１０分間光照射し（Ｂ、Ｄ）または照射せずに（Ｃ， Ｅ）６時間インキュベート後、トリパンブルーで染色した顕微鏡写真である。
【図２】化合物１（Ｂ， Ｃ）又はＰＰＢＭｅ （Ｄ， Ｅ）を０．３μＭの濃度で添加したＵ−９３７細胞を図１と同様に光照射し（Ｂ、Ｄ）または照射せずに（Ｃ， Ｅ）インキュベート後、位相差顕微鏡で観察した写真である。
【図３】化合物１と化合物２及びＰＰＢＭｅを１０， １， ０．３ 又は０．１μＭ濃度でＵ−９３７細胞に添加し、光照射せずに（黒いバー）またはＦＬ２０ＳＳＮ／１８蛍光灯で光照射し（斜線のバー）、７時間インキュベート後のカスパーゼ−３の活性を示すグラフである。
【図４】化合物１［１μＭ（Ｂ、Ｆ）及び０．１μＭ（Ｃ、Ｇ）］、ＰＰＢＭｅ ［１μＭ（Ｄ、Ｈ）］、またはこれらを含まない溶媒のみ（Ａ、Ｅ）をＣｏｌｏ３２０ＤＭ細胞に添加し、蛍光灯で光照射し（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）または照射せずに（Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）インキュベート後、ＤＮＡの断端をＴＵＮＥＬ法でラベルし、ＨＲＰ反応（褐色に呈色）で検出した顕微鏡写真である。
【図５】化合物２を１０及び１μＭ、ＰＰＢＭｅを０．１μＭの濃度でＣｏｌｏ３２０ＤＭ細胞に添加し、６時間前培養後蛍光灯で光照射し、さらに１８時間インキュベート後のカスパーゼ−３の活性を示すグラフである。
【図６】化合物１添加下に光照射されたＨＴ−２９細胞のＤＮＡの電気泳動写真である。
【図７】ＨＴ−１０８０細胞に化合物１を添加し、光照射することによりアポトーシスの特徴である細胞核の凝縮と断片化が起きることを示す蛍光顕微鏡写真である。
【図８】竹の葉粗抽出物と光照射によるＨＴ−１０８０細胞のカスパーゼ−３活性化を示すグラフである。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a biological photosensitizer comprising a natural porphyrin derivative extracted from a plant and a tumor cell killing agent.
[0002]
[Prior art]
One of the methods for treating tumors is a method called photodynamic therapy (see Non-Patent Document 1). In this method, a photosensitizer having selectivity for a tumor cell is incorporated into the tumor cell, and a light-induced chemical reaction (photoreaction) is caused in the tumor cell to activate oxygen. It kills tumor cells with the resulting singlet oxygen and superoxide radicals. Preserving the function of tissues and organs other than tumors, as there are almost no serious side effects on bone marrow and the like compared to similar radiotherapy, and there is no need to remove most of the tissue unlike surgical methods Will also be easier. Conventionally, it has been used exclusively for the treatment of skin cancers and fundus lesions that are easily irradiated with light, but recently, remarkable advances in hardware such as lasers and waveguides (optical fibers) as light sources have led to It is also actively applied to organ cancers such as colon cancer. In particular, central early lung cancer is the first treatment option in the protocol of the United States NCI, and in Japan, a cure rate of 85% or more is achieved by this method alone (see Non-Patent Document 2). By the way, an important factor for such photodynamic therapy is a compound (photosensitizer) which has selectivity for tumor cells and which mediates activation of oxygen by light.
[0003]
Conventionally used photosensitizers include natural porphyrin derivatives such as hematoporphyrin (see Non-Patent Document 3) and pyropheophorbide esters (see Non-Patent Documents 4 and 5) and phthalocyanines modeled on them. Among them, there is a dye (see Non-Patent Document 6). Among them, only photofrin, which is a processed product of hematoporphyrin, is approved as a therapeutic drug in Japan. Attempts have also been made to use these as diagnostic agents utilizing their affinity for cancer cells.
However, conventional photosensitizers used in cancer photodynamic therapy, especially photofrin, have a light absorption maximum on the relatively short wavelength side of 625 nm, so that tissue permeability is close to 700 nm or better. However, there is also a problem that the cell killing effect by long long wavelength light is weak. Further, the chlorin e6 derivative (see Patent Document 1), which is expected to be a second-generation photosensitizer, clears the problem of the absorption wavelength, but it cannot be said that the uptake into cancer cells is always good. See Patent Document 7). In addition, in the case of synthetic dyes such as phthalocyanine and rhodamine (see Patent Document 2), there is a problem that non-selective toxicity and side effects are strong. In this respect, natural porphyrin is considered to be superior, and it is considered that natural porphyrin is excellent. From the viewpoint of the efficiency of incorporation of porphyrin, new expectations have been raised for natural porphyrin derivatives.
[0004]
[Non-patent document 1]
Okunaka and Kato, Journal of the Japanese Surgical Society, Vol. 103, No. 2, 258-262 (2002)
[Non-patent document 2]
Furukawa, Kato, Nippon Clinic, Vol. 60, extra number 5, pp. 414-418, (2002)
[Non-Patent Document 3]
Pass, HI, Journal of the National Cancer Institute, 85 (6), 443-456 (1993))
[Non-patent document 4]
Matrole J .; Y. et al. , Oncogene, 20, 4070-4084 (2001).
[Non-Patent Document 5]
Hajri A. et al. , Photochemistry and Photobiology, 75 (2), 140-148 (2002).
[Non-Patent Document 6]
Lam M. et al. , The Journal of Biological Chemistry, 276 (50), 47379-47386 (2001).
[Non-Patent Document 7]
Spikes J. et al. D. , Journal of Photochemistry and Photobiology B: 6, 259-274 (1990).
[Patent Document 1]
JP-A-2001-233877
[Patent Document 1]
JP-A-98 / 14453
[Patent Document 2]
Japanese Patent Publication No. 10-505349
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, the present invention provides a safe porphyrin compound having a high efficiency of incorporation into tumor cells and having a maximum absorption shifted to a longer wavelength side of 700 nm, and further enhanced by light irradiation. It is an object of the present invention to find a compound exhibiting a novel tumor cytotoxicity, and thereby to develop a novel and useful biological photosensitizer or tumor cytotoxic agent.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above problems, as a result of intensive studies, the present inventors have found that plants containing various porphyrin derivatives as metabolites of chlorophyll have a photosensitizing effect and kill tumor cells by irradiation with light. As a result of searching the components, the porphyrin derivatives represented by the following structural formulas I and II contained in the plant extract were found to be useful for solving the above-mentioned problems, and the present invention was completed. Things.
[0007]
That is, the present invention includes the following (1) to (12).
(1) A biological photosensitizer containing a compound represented by the following structural formula I or II.
Embedded image
Embedded image
(2) A biological photosensitizer comprising a plant extract containing the compound represented by the above structural formula I and / or formula II.
(3) The biological photosensitizer according to (2), wherein the plant is a gramineous plant.
(4) The biological photosensitizer according to (3), wherein the gramineous plant is a plant belonging to the genus Phyllostachys.
(5) A tumor cell killing agent comprising a compound represented by the above structural formula I or II.
(6) A tumor cell killing agent comprising a plant extract containing a compound represented by the above structural formula I and / or formula II.
(7) The tumor cell killing agent according to (6), wherein the plant is a gramineous plant.
(8) The tumor cell killing agent according to (7), wherein the gramineous plant is a plant belonging to the genus Phyllostachys.
(9) The compound represented by the above structural formula I.
(10) A method for producing a compound represented by the above structural formula I or II, comprising extracting from a plant containing the compound represented by the above structural formula I or II with a solvent.
(11) The method according to (10), wherein the plant is a gramineous plant.
(12) The method according to (11), wherein the gramineous plant is a plant belonging to the genus Phyllostachys.
[0008]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The compounds of the above structural formulas I and II used in the present invention (hereinafter, the former is referred to as Compound 1 and the latter is referred to as Compound 2) are extracted from plants. Examples of plants to be used as extraction raw materials include plants of the genus Gramineae, such as plants of the genus Phyllostachys such as Moso bamboo and Madake, Sasa genus such as Kumazasa, Oryza genus such as rice, and Zea genus such as corn. In particular, plants belonging to the genus Phyllostachys, such as Moso bamboo and Madake, are suitable. However, as long as it contains the compound 1 and / or the compound 2 of the present invention, it may be a plant of another family. Among the plant bodies of these plants, a portion containing a large amount of compound 1 and / or compound 2 is a portion containing a large amount of chlorophyll, and is mainly a leaf, a stem or the like. These plants are harvested at the time when the compound content is highest. That is, although the site and timing of a large amount of the present compound vary depending on the plant, in general, the site and timing where metabolism of chlorophyll, which is the parent of compound 1 and / or compound 2 of the present invention, is active is desirable. Will be harvested.
In the present invention, the plant thus harvested is extracted with water or an organic solvent. As the organic solvent, methanol, ethanol, ethyl acetate, chloroform or the like is used. Such a crude extract can be appropriately concentrated and diluted as it is as long as it does not contain a toxic component. However, when it is better to purify and use the active substance, Compound 1 or Compound 2, it is preferable to use silica gel column chromatography. It can be purified by known means such as chromatography, reverse phase column chromatography, preparative thin layer chromatography and the like.
[0009]
Compounds 1 and 2 purified by the above method are dissolved in a solvent such as water or ethanol, or suspended in water containing a surfactant such as an appropriate phospholipid and used as a photosensitizer applied to a living body. .
That is, Compounds 1 and 2 of the present invention both have an absorption maximum of the Q band at 668 nm in the UV spectrum, which is higher than that of photofrin (625 nm) which has been conventionally used as a photosensitizer for photodynamic therapy. It is much longer in the wavelength region, and has an absorption maximum in the longer wavelength region than chlorin e6 (654 nm), which is conventionally considered to have the absorption maximum in the longest wavelength region. Therefore, Compounds 1 and 2 of the present invention show photosensitization to light in a wavelength region with higher tissue permeability than those of photosensitizers used in these conventional photodynamic therapies. By irradiation with light in a long wavelength region, cancer tissue or cancer cells at a deeper site can be effectively killed. In particular, among the compounds of the present invention, compound 1 is a novel compound not described in the literature, and has extremely remarkable tumor cell killing properties as a photosensitizer for photodynamic therapy.
[0010]
Next, the usage of the compound of the present invention will be described, but it is basically the same as the usage of the photosensitizer in the conventional photodynamic therapy.
The compounds 1 and 2 of the present invention are dissolved in the above-mentioned solvent and administered to a living body by intravenous injection, and these compounds accumulate in tumor tissues and cells due to their selective affinity for tumor cells.
Next, light irradiation is performed on the tumor tissue or cell. In the light irradiation, light is irradiated on the tumor tissue or cell directly or through a waveguide (optical fiber).
As a light source to be used, for example, a white fluorescent lamp, a semiconductor laser (670 nm), a YAG-OPO laser (a variable wavelength of 620 to 670 nm), a Nd / YAG laser, a halogen lamp, a diode array, and a xenon arc lamp ( Xenon arc lamp).
The compounds 1 and 2 of the present invention accumulated in the tumor are excited by this light irradiation to cause a photochemical reaction, whereby active oxygen is produced in the tumor tissue. Reactive oxygen causes necrosis in tumor cells, activates caspase 3 through the release of cytochrome c from mitochondria, induces apoptosis, and causes tumor necrosis. In a killing test of cancer cells using Compounds 1 and 2 of the present invention, it has been confirmed that light irradiation increases caspase activity in cancer cells and causes apoptosis.
[0011]
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.
【Example】
Example 1 Preparation of bamboo leaf extract
Moso bamboo leaves collected in October were shaded for 20 days to obtain 500 g of dried leaves. This was immersed in about 10 liters of methanol, treated with a homogenizer, and left in a dark place for 10 days. The extract from which the leaves were removed by filtration was concentrated with a rotary evaporator to obtain 105 g of an oily residue. This 104 g was mixed with 200 ml of ethyl acetate in one-tenth portions and stirred for 30 minutes. After standing, the supernatant was obtained by decantation. All supernatants were combined and concentrated on a rotary evaporator to give 28 g of an oily residue.
[0012]
Example 2 Purification of Compound 1 by Chromatography
5 g of the ethyl acetate extract (oil residue) obtained in Example 1 was dissolved in a small amount of a mixture of hexane and ethyl acetate, and the mixture was dissolved in a small amount of a mixture of hexane and ethyl acetate. 3 ) And adsorbed. A mixture of hexane and ethyl acetate in a ratio of 5: 1, 3: 1, 2: 1, 1: 1 was passed through each 600 ml, and the eluate was fractionated by 60 ml. The fractions eluted with a mixture of hexane: ethyl acetate = 3: 1 were combined, and concentrated by a rotary evaporator. This operation was repeated for four columns to obtain a total of 6 g of concentrated residue.
A silica gel column (60 cm) in which 2 g of the above concentrated residue (6 g) was packed with benzene. 3 ) Is adsorbed on the top, and 240 ml of a solution obtained by mixing benzene and ethyl acetate at a ratio of 20: 1, 10: 1, 8: 1, 6: 1, 3: 1, and 1: 1 is passed, and the eluate is 30 ml. Fractionated one by one. Fractions eluted with a 10: 1 to 6: 1 benzene / ethyl acetate mixture were combined and concentrated on a rotary evaporator. This operation was repeated for three columns to obtain a total of 0.8 g of concentrated residue.
[0013]
A silica gel column (30 cm) in which 0.2 g of the concentrated residue 0.8 g was filled with benzene. 3 ) And adsorbed on the top of the mixture, and mixed with benzene and ethyl acetate at a ratio of 100: 1, 50: 1, 30: 1, 20: 1, 10: 1, 8: 1, 5: 1, 1: 1 in 120 ml portions. And the eluate was fractionated in 20 ml portions. Fractions eluted with a 30: 1 to 10: 1 benzene / ethyl acetate mixture were combined and concentrated on a rotary evaporator. This operation was repeated four times to obtain a total of 200 mg of concentrated residue.
A column of Wakogel LP-60C18 (15 cm) was prepared by dissolving 40 mg of the concentrated residue (200 mg) in a small amount of acetonitrile and packing with a mixture of water and acetonitrile (2: 1). 3 ), Then water and acetonitrile are 2: 1, 1: 1, 1: 2, 1: 2.5, 1: 3, 1: 4, 1: 5, 1: 6, 1: 8, 1 : 20, 1:40, 1:80, and 0: 100 were mixed in 30 ml portions, and the eluate was fractionated in 8 ml portions. Fractions eluted with a 1: 3 to 1: 5 water / acetonitrile mixture were combined and concentrated on a rotary evaporator. This operation was repeated five times to obtain 20 mg of a residue.
[0014]
A silica gel column (12 cm) in which half of the concentrated residue was packed with hexane 3 ) And hexane and ethyl acetate in a ratio of 4: 1, 3.5: 1, 3: 1, 2.5: 1, 2: 1, 1.5: 1, and 1: 1 The eluate was fractionated by 4 ml each by flowing 20 ml of the solution thus obtained. The fractions eluted with the 2.5: 1 to 1.5: 1 mixture were combined and concentrated on a rotary evaporator. The other half of the residue was treated in the same manner, and the combined concentrated residue was dried with a vacuum pump to obtain 4.0 mg of compound 1 as a gray-green gum. Compound 1 thus obtained was prepared by TLC (silica gel 60 F). 254 , 0.25 mm, developed with hexane / ethyl acetate = 1: 1). f A single compound of 0.30 was determined, indicating that the compound was a single compound.
This compound showed prominent peaks at m / z 653 and m / z 675 in FAB-MS, and [M + 1] respectively. + , [M + Na] + The peak was determined. Also, in ESI-MS, [M + 1] was found at m / z 653.4. + The peak determined to be The UV spectrum showed absorption maxima at 398, 496, 527, 611, and 668 nm in ethyl acetate. The molar extinction coefficient is 1.25 × 10 in this order. 5 , 1.11 x 10 4 , 7.91 x 10 3 5.54 x 10 3 4.51 x 10 4 Met. Based on this UV spectrum data, the compound was estimated to be related to chlorophyll. 1 H-NMR and Thirteen C-NMR spectra were measured and compared with literature data for known chlorophyll-related compounds. This comparison is shown in Tables 1 and 2.
[0015]
[Table 1]
Table 1 1 H-NMR (400/500 MHz, CDCl 3 ) Comparison of data (number is chemical shift, ppm)
[0016]
[Table 2]
Table 2 Thirteen C-NMR (400 MHz, CDCl 3 ) Data comparison
(The figures are chemical shifts, ppm)
Literature values are given by Takashima et al. , (Chem. Lett., 1995, 1015-1016).
* Not detected.
[0017]
As can be seen from the above table, the NMR spectrum of this compound is shown by Ma et al. (Ma L. and Dolphin D., J. Org. , Yoshida M., Abe J., and Murai A., Chem. Lett., 1015-1016, 1995), 18-carboxy-20- (1,1-dihydroxy-2-methoxy-2-oxoxy). ) -8-Ethenyl-13-ethyl-2,3-dihydro-3,7,12,17-tetramethyl-22H, 24H-porfine-2-propanoic acid δ-lactone methyl ester It was well agreed with the spectrum, and it was concluded that the difference was that it was an ethyl methyl ester rather than a dimethylester. Thus, the molecular formula of this compound is C 37 H 40 N 4 O 7 However, this formula quantity (652.736) agrees well with the above-mentioned mass spectrum data. further 1 When the H-NMR was analyzed in detail, it was found that the signal of the 2-position proton appeared separately at 4.095 ppm and 4.99 ppm (integration curve ratio 6.15: 1.01). This has already been pointed out by Ma et al. 1 The hydroxyl group at the position is epimerized due to the semiketal structure, 1 -(S) body (main component) and 20 1 This is because a diastereomer mixture of-(R) -form (subcomponent) is obtained. Therefore, the compound 1 of the present invention has a δ-lactone ethyl methyl ester of 20 1 -(S) body and 20 1 It is concluded that the mixture of (R) -forms is 6: 1. The present compound 1 is a novel compound not described in the literature, and the cell killing effect by photosensitization was first clarified, including the above-mentioned Ma et al. And Takashima et al.'S dimethyl ester and monomethyl ester20. 1 -Hydroxypurpurin-7 δ-lactone porphyrin derivative.
[0018]
Example 3 Purification of Compound 2 by Chromatography
2 g of the ethyl acetate extract (oil residue) obtained in Example 1 was dissolved in a small amount of a mixed solution of hexane and ethyl acetate, and a silica gel column (65 cm) filled with hexane was used. 3 ) And adsorbed. Hexane and ethyl acetate were combined at 80: 1, 60: 1, 40: 1, 20: 1, 10: 1, 8: 1, 6: 1, 4: 1, 2: 1, 1: 1, 1: 2,
150 ml of a solution mixed at 1: 5, 1: 6, 1:50 and 0: 1 was applied, and the eluate was fractionated in 20 ml. The fractions eluted with a mixture of hexane: ethyl acetate 4: 1 to 1:50 were combined and concentrated on a rotary evaporator. This operation was performed for four columns to obtain a total of 3 g of concentrated residue.
A silica gel column (30 cm) in which 0.5 g of the above concentrated residue (3 g) was filled again with hexane. 3 ), And hexane and ethyl acetate in a mixture of 3: 1, 2.5: 1, 2: 1, 1.5: 1, 1: 1, and 1: 1.5 in a mixture of 120 ml each. The eluate was fractionated in 15 ml portions. Fractions eluted with a 2.5: 1 to 1.5: 1 hexane / ethyl acetate mixture were combined and concentrated on a rotary evaporator. The above operation was repeated six times to obtain a total of 500 mg of a concentrated residue.
[0019]
The concentrated residue was applied to preparative TLC (silica gel, 1 mm thick, 20 × 20 cm), and mixed with hexane / ethyl acetate 3: 1 twice, 3: 2 3 times, and 1: 1. The mixed solution was developed once and a total of six times. Finally R f The silica gel in the 0.6 green zone was scraped off and extracted with ethyl acetate.
8 mg of an oily residue obtained by concentrating the extract was packed in a silica gel column (10 cm 3 ) And adsorbed. 30 ml of a solution of hexane and ethyl acetate mixed at 3: 1, 3: 1.5, 3: 2, and 0: 1 was flowed, and the eluate was fractionated by 5 ml. The fractions eluted with a mixture of hexane: ethyl acetate 3: 1.5 were combined, concentrated on a rotary evaporator and dried on a vacuum pump to give 2.0 mg of compound 2 as a gray-green gum. This compound is obtained by TLC (silica gel 60 F) 254 , 0.25 mm, developed with hexane / ethyl acetate = 3: 2). f A single compound was determined from the single spot of 0.53.
[0020]
This compound shows prominent peaks at m / z 903 and m / z 925 in FAB-MS, and each peak is [M + 1]. + , [M + Na] + The peak was determined. The UV spectrum showed absorption maxima at 398, 496, 527, 611, and 668 nm in ethyl acetate, much like compound 1 described above. The molar extinction coefficient was 1.19 × 10 in this order. 5 , 1.21 x 10 4 , 7.27 x 10 3 5.05 x 10 3 , 4.29 x 10 4 Met. From this UV spectrum data, the present compound was also estimated to be related to chlorophyll. 1 H-NMR and Thirteen C-NMR spectra were measured and compared with literature data of known chlorophyll-related compounds and the spectra of compound 1 described above. This comparison is shown in Table 1 above and Table 3 below.
[0021]
[Table 3]
Table 3 Thirteen C-NMR (270 MHz, acetone-d 6 ) Data comparison
(The figures are chemical shifts, ppm)
18 2 -(R) -Chla data was obtained from Hyvaerinen et al. (Mag. Res. Chem.,
33, 646-656 (1995)). However, the numbering of the table is
According to the Chemical Abstract system.
* Not detected.
[0022]
According to this, it was found that Compound 2 had a structure in which the ethyl ester of Compound 1 was substituted with phytyl ester. Thus, the molecular formula of this compound is C 55 H 74 N 4 O 7 Where the formula quantity (902.5557) matches well with the mass spectrum data described above. further 1 When the H-NMR was analyzed in detail, it was recognized that the signal of the 2-position proton appeared separately at 4.06 ppm and 4.96 ppm (integration curve ratio: 8.7: 1.4). Therefore, compound 2 of the present invention is 18-carboxy-20- (1,1-dihydroxy-2-methoxy-2-oxoethyl) -8-ethynyl-13-ethyl-2,3-dihydro-3,7,12, 20 of 17-tetramethyl-22H, 24H-porphine-2-propanoic acid δ-lactone phytyl ester 1 -(S) body and 20 1 It is concluded that the (R) form is a 6: 1 mixture of diastereomers. In addition, Gandul-Rojas et al. (Gandul-Rojas B., Gallardo-Guerrero L., Minguez-Mosquera M., Journal of Food Protection, Compounds 62 (10) and 1172-1177 of Olives from 1921 to 1177) are the same as Olive (1919). Although it is described as having been obtained, it is determined based only on the UV and MS spectra. 1 H-NMR and Thirteen This is the first report in which a C-NMR is measured and the structure is strictly confirmed.
[0023]
Embodiment 4
Human leukemia cell line U-937 was cultured in RPMI-1640 medium containing 10% fetal calf serum at 1 × 10 6 6 The cells were suspended at a ratio of cells / ml and placed in two wells of a 12-well cell culture plate in an amount of 0.8 ml. The sample was dissolved in ethanol containing 20% acetone, diluted appropriately, and added to the above 0.8 ml cell culture solution in 8 μl portions. At this time, it was similarly added to both of the two plates. One plate was wrapped with aluminum foil after addition of the sample, and placed in a carbon dioxide gas incubator. The other plate was incubated for 5 hours, and then immediately under 10 cm (about 2000 lux, 0.24 mW / cm) of a fluorescent lamp (neutral white made by NEC, 20 type, 18 W, FL20SSN / 18). 2 ) For 10 minutes, and then returned to the incubator to continue the culture. Six hours later, the cells were observed with a phase-contrast microscope, and if necrosis was observed, it was confirmed by trypan blue staining.
[0024]
The results are shown in FIGS. In FIG. 1, A is a control, B and C are compounds 1 at a concentration of 1 μM, and D and E are a standard photosensitizer, PPBMe (pyropheophorbide methyl ester, Frontier Scientific Inc. (Utah). (U.S.A., USA) was added at a concentration of 1 μM. After the sample addition, B and D were irradiated with light as described above, and C and E were cultured without light. In FIG. 1, B shows an image of necrosis under a phase contrast microscope, and thus each of the wells A to E was stained with trypan blue. Only B (compound 1 added, light irradiation) shows that all the cells are stained blue and necrosis is occurring. On the other hand, PPBMe hardly causes necrosis even when irradiated with light (D in FIG. 1). FIG. 2 is a phase contrast micrograph. In this figure, A is a control, B and C were added with Compound 1 at a concentration of 0.3 μM, and D and E were added with PPBMe at a concentration of 0.3 μM. After the sample addition, B and D were irradiated with light as described above, and C and E were cultured without light. In FIG. 2B (addition of 0.3 μM compound 1, light irradiation), it can be seen that most of the cells are fragmented and apoptosis has occurred. On the other hand, in FIG. 2D (0.3 μM PPBMe, light irradiation), the number of fragmented cells is small. In all cases, apoptosis did not occur and necrosis hardly occurred without light irradiation (FIGS. 1C and E and FIGS. 2C and E). As described above, Compound 1 of the present invention induces necrosis by light irradiation at a concentration of about 1 μM, and induces apoptosis by light irradiation at a concentration of about 0.3 μM, and shows a stronger activity than the standard PPBMe in any case. .
[0025]
Embodiment 5
1 x 10 U-937 cells 6 The cells were suspended in the above medium at a ratio of cells / ml, and 0.8 ml was added to each well of a 12-well cell culture plate. Then, 8 μl of a 20% acetone / ethanol solution in which Compound 1, Compound 2 of the present invention, or PPBMe as a standard photosensitizer was dissolved at a concentration of 1, 0.1, 0.03 or 0.01 mM was added. And shaken the plate to mix well. As a control, 8 μl of the solvent containing no sample was added. Prepare two plates for each sample, incubate one without light irradiation, and place the other one under fluorescent light for 10 minutes after 5 hours of pre-incubation as in Example 1, and after light irradiation Return to the incubator and continue the culture. After 7 hours, cells were collected by centrifugation and washed with ice-cold PBS (phosphate buffered salt solution). Next, the activity of caspase-3, which is an indicator of apoptosis, was measured by a known method (Yamazaki Y. et al., Exp. Cell Res., 259, 64-78 (2000)). The results are shown in FIG. 3, where compound 1 activates caspase and induces apoptosis only when exposed to light, and its activity is remarkably stronger compared to the same concentration of PPBMe, especially at low concentrations (0.1 μM ) Indicates that it is more than 40 times stronger (compare by subtracting the background without light irradiation). Compound 2 is also weaker than compound 1, but also activates caspase when exposed to light. (The data in FIG. 3 is shown as the average value and standard deviation of three times.)
[0026]
Embodiment 6
The human colon cancer cell line Colo320DM was cultured in RPMI-1640 medium containing 10% FBS, and 3 × 10 5 The cells were suspended in the same medium at a ratio of cells / ml. Each 0.1 ml of the solution was placed in each well of a 96-well plate, cultured for 3 days, and adhered to the bottom of the well. Next, 1 μM (B, F), 0.1 μM (C, G), 1 μM of PPBMe (D, H), and only the solvent (A, E) were added in the same manner as in Example 4. At this time, two plates were prepared, samples (A, B, C, D) were added to one plate, and samples (E, F, G, H) were added to the other plate. Thereafter, after pre-incubation for 6 hours, one plate (samples A, B, C, and D) was irradiated with light for 15 minutes (A, B, C, and D), and the other plate (samples E, F, and D) was irradiated. G, H) were cultured for another 24 hours without light irradiation. Next, the medium was removed by suction with a pipette, and 0.1 ml each of a 4% formalin solution (10% solution was diluted with PBS) was added, and the mixture was left on ice for 15 minutes. After removing the formalin solution and washing once with ice-cold PBS, 0.1 ml of PBS containing 0.5% Tween 20 and 0.2% bovine serum albumin was added and left at room temperature for 10 minutes. The treatment solution was discarded, washed with SSC (X2) solution, and then washed three times with PBS. DNA fragmentation was detected by the TUNEL method using an in situ apoptosis detection kit from Promega. That is, a biotin-linked nucleotide is introduced into a DNA stump with a TdT enzyme, avidin bound with horseradish peroxidase (HRP) is bound to the biotin, and finally hydrogen peroxide and a dye precursor are caused to act on the HRP. A chromogenic reaction was performed, and the nuclei from which DNA had fragmented due to apoptosis were stained brown. The results are shown in FIG. 4, and it can be seen that almost all of the cells (B) treated with 1 μM of compound 1 and subjected to light treatment undergo apoptosis. Under the same conditions, 1 μM PPBMe did not completely advance DNA fragmentation (D). Furthermore, Compound 1 induced apoptosis by light irradiation even at a concentration of 0.1 μM (C). In all cases, brown cells were hardly detected without light irradiation (F, G, H). Thus, Compound 1 induces apoptosis of Colo320DM cells more strongly than PPBMe under light irradiation.
[0027]
Embodiment 7
Colo320DM cell suspension (3 x 10 5 Per ml) was placed in a well of a 12-well plate in an amount of 0.8 ml and cultured for 3 days. Next, compound 2 was added at a concentration of 10 and 0.1 μM, and PPBMe was added at a concentration of 0.1 μM to the cell suspension in each well in the same manner as in Example 5; After culturing for 18 hours, cells were scraped off with a scraper for each well and collected. After washing with ice-cold PBS, the activity of caspase-3 was measured as described above. The results are shown in FIG. 5, where 10 μM of Compound 2 activates caspase more strongly than 0.1 μM of PPBMe. (Data are shown as the mean and standard deviation of two experiments.)
[0028]
Embodiment 8
The human colon cancer cell line HT-29 was cultured in McCoy'5A medium containing 10% FBS, inoculated on a 12-well plate in the same manner as in Example 7, and compound 1 was added at a concentration of 1 μM and 0.1 μM. Addition, preculture and light irradiation were performed respectively. At this time, preculture and light irradiation were similarly performed using the compound without addition of compound 1 as a control. After 24 hours, the cells were collected with a scraper, washed with PBS, and then disrupted with a 0.1 M phosphate buffer containing 0.5% Triton X100 to extract DNA. The extract was treated with RNase and proteinase K, agar gel electrophoresis was performed, and DNA was detected with ethidium bromide. FIG. 6 shows the results.
In FIG. 6, lane 1 shows a molecular weight marker, lane 2 shows a control, lane 3 shows a result of adding compound 1 at a concentration of 1 μM, and lane 4 shows a result of adding compound 1 at a concentration of 0.1 μM.
According to this, it was confirmed that in cells irradiated with light after adding compound 1, small-sized DNA fragments increased and apoptosis was progressing.
[0029]
Embodiment 9
The human sarcoma cell line HT-1080 was cultured in DMEM medium containing 10% FBS, and 2 × 10 5 Each of the suspensions was dispersed in a 96-well plate at 0.1 ml / ml. As in Example 4, Compound 1 was added at a concentration of 1 μM, precultured, and irradiated with light. After culturing for 16 hours, the cells were fixed with 4% formalin, the cell nucleus was stained with Sytox (10 μM, Molecular Probes), and a fluorescence microscope was used. Was observed. FIG. 7 shows the results. In addition, A in the figure is a control (no compound 1 added). B shows the case where compound 1 (1 μM) was added and irradiated with light, and C shows the case where compound 1 (1 μM) was added and the cells were cultured in the light-shielded state. As shown in B, the nuclei aggregated and fragmented only when compound 1 was added and irradiated with light, confirming that apoptosis was induced.
[0030]
Embodiment 10
HT-1080 cells at 1 × 10 6 Each was inoculated in a 12-well plate together with 1 ml of the medium, and the methanol extract (crude extract) of the bamboo leaves obtained in Example 1 was added at a concentration of 1, 0.1 and 0.01 μg / ml. After irradiation treatment and culturing for 18 hours, the cells were collected in the same manner as in Example 7, and the activity of caspase-3 was measured. As shown in FIG. 8, the crude extract also activated caspases of HT-1080 cells by light irradiation. (Data are shown as the mean and standard deviation of three experiments.)
[0031]
【The invention's effect】
The UV spectrum of the porphyrin derivative of the present invention has an absorption maximum of the Q band at 668 nm, which is longer than that of the conventionally used porphyrin photosensitizers such as photofrin (625 nm) and chlorin e6 (654 nm). Has shifted to Further, in an actual tumor cytotoxicity test, when human leukemia cells and colorectal cancer cells were subjected to drug treatment and light irradiation under the same conditions, Compound 1 of the present invention was obtained from pyropheophorbide which had been conventionally used. It showed strong cytotoxicity. That is, the present invention provides a new naturally-derived porphyrin derivative which exhibits stronger cancer cytotoxicity than conventional photosensitizing porphyrin derivatives for photodynamic therapy.
[0032]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1. U-937 cells to which compound 1 (B, C) or PPBMe (D, E) is added at a concentration of 1 μM are irradiated with light using a FL20SSN / 18 fluorescent lamp for 10 minutes (B, D) or not. (C, E) is a micrograph stained with trypan blue after incubation for 6 hours.
[FIG. 2] U-937 cells to which compound 1 (B, C) or PPBMe (D, E) is added at a concentration of 0.3 μM are irradiated with light (B, D) or not as in FIG. (C, E) Photographs observed with a phase contrast microscope after incubation.
FIG. 3: Compound 1, Compound 2 and PPBMe were added to U-937 cells at a concentration of 10, 1, 0.3 or 0.1 μM, and were irradiated without light (black bars) or with a FL20SSN / 18 fluorescent lamp. It is a graph which shows the activity of caspase-3 after irradiation (hatched bar) and incubation for 7 hours.
FIG. 4: Compound 1 [1 μM (B, F) and 0.1 μM (C, G)], PPBMe [1 μM (D, H)], or a solvent without these (A, E) alone was added to Colo320DM cells. After adding, irradiating with a fluorescent lamp (A, B, C, D) or without irradiating (E, F, G, H), the DNA stump is labeled by the TUNEL method, and the HRP reaction (brown) is performed. FIG. 9 is a micrograph detected by the following method.
FIG. 5 shows the activity of caspase-3 after adding compound 2 to Colo320DM cells at a concentration of 10 and 1 μM and PPBMe at a concentration of 0.1 μM, pre-cultivating for 6 hours, irradiating with fluorescent light, and further incubating for 18 hours. It is a graph.
FIG. 6 is an electrophoretic photograph of DNA of HT-29 cells irradiated with light while adding compound 1.
FIG. 7 is a fluorescence micrograph showing that addition of compound 1 to HT-1080 cells and irradiation with light cause condensation and fragmentation of cell nuclei, which are characteristic of apoptosis.
FIG. 8 is a graph showing activation of caspase-3 in HT-1080 cells by bamboo leaf crude extract and light irradiation.
