JP2004217535A

JP2004217535A - Crystallization of protein trimestatin, determination of structural coordinate, use of structural coordinate

Info

Publication number: JP2004217535A
Application number: JP2003004289A
Authority: JP
Inventors: Nagafumi Kawai; 永文河合; Hiroshi Mizuno; 洋水野; Takashi Morita; 隆司森田
Original assignee: National Institute of Agrobiological Sciences; NEC Solution Innovators Ltd
Current assignee: National Institute of Agrobiological Sciences; NEC Solution Innovators Ltd
Priority date: 2003-01-10
Filing date: 2003-01-10
Publication date: 2004-08-05

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To design, evaluate, search or identify a trimestatin mutant or compound subjected to the insertion, deletion, modification or chemical modification of one or more amino acids and having integrin-inhibiting activity, high structure stability and bond specificity, or search or identify a receptor for the mutant or compound. <P>SOLUTION: Trimestatin crystal, and a trimestatin three-dimensional structure coordinate determined by an X-ray crystal structure analysis using the trimestatin crystal. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、結晶化されたトリメスタチン（ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎ）蛋白質、そのアミノ酸配列の３次元構造座標及びその用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
虚血性心疾患などの動脈硬化性疾患は死亡の原因となり得る病気であり、心筋梗塞における動脈硬化は血小板の凝集が原因となっている。血小板は、止血や血栓症において重要な役割をしており、血管内皮の損傷などでさまざまな生理学的物質によって活性化された結果、血小板糖蛋白質ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ（αＩＩｂβ３とも呼ばれる）の活性化によってフィブリノーゲンなどに網状に結合し凝集体を形成する（Ｋｌｅｉｍａｎ，Ｔ．Ａ．等，ＷｉｌｅｙＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｄｉｃｉｎｅＶｏｌｕｍｅ３，Ｊｏｈｎ＆ＷｉｌｅｙＳｏｎｓ，１７８４−１７９８（２００２）：非特許文献１）。
【０００３】
動脈硬化の治療法として、現在行われているのが風船型のカテーテルを閉塞部で膨らませる経皮的冠動脈介入術（ＰＣＩ）やバイパス手術などである。しかし、ＰＣＩの治療後に風船などでつけられた傷によって急性の血栓症や再狭窄が起こるなど問題点があり、現在まで血栓症を防ぐためにアスピリン（抗血小板剤）、ヘパリン（抗凝固剤）が使われてきたが、アスピリンは血小板凝集を弱く阻害するだけであった。それ以外の治療法に、抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体であるｃ７Ｅ３（ａｂｃｉｘｉｍａｂ）があり、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに結合し凝集を阻害する。臨床検査では従来のアスピリン、ヘパリンに比べて、より優れた成績を上げている。しかし、ａｂｃｉｘｉｍａｂはＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａとフィブリノーゲンの結合部位であるＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）には結合せず、立体阻害、コンフォメーションの効果によりレセプターへの分子の接近を阻害している（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｃ．，ＤｒｕｇｓＦｕｔ．，２０，４５７−６３（１９９５）：非特許文献２；Ｇｅｎａｔｔａ，Ｔ．Ｂ．等，Ａｎｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，３０，２５１−７（１９９６）：非特許文献３；米国特許第５４４００２０号明細書：特許文献１）。
【０００４】
ＲＧＤ配列を含むペプチドがＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに結合することにより効果的に、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの接着機能を阻害する。血小板の凝集を阻害する物質としてｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎがあり、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）やＬｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＫＧＤ）配列を蛇毒由来のｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎの多くは含んでいる（Ｐｌｏｗ，Ｅ．Ｆ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２，８０５７−８０６１（１９８５）：非特許文献４；Ｎｉｅｗｉａｒｏｗｓｋｉ，Ｓ．等，Ｓｅｍｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，３１，２８９−３００（１９９４）：非特許文献５）。Ｓｉｓｔｒｕｒｕｓｍｉｌａｒｕｓｂａｒｂｏｕｒｉの蛇毒（Ｂａｒｂｏｕｒｉｎ）は、ＫＧＤ配列をもつ７３残基のアミノ酸からなるｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎで、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに特異的で、環状にすると活性が高くなる。このＢａｒｂｏｕｒｉｎに基づいてデザインされたＥｐｔｉｆｉｂａｔｉｄｅ（製品名：Ｉｎｔｅｇｒｉｌｉｎ）が現在市販されている（Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈ，Ｒ．Ｍ．等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，１０６６−７３（１９９３）：非特許文献６；Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈ，Ｒ．Ｍ．，ＤｒｕｇｓＦｕｔ．，２３，５８５−５９０（１９９８）：非特許文献７；米国特許第５９６８９０２号明細書：特許文献２）。
【０００５】
インテグリンとｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎの構造的な結合様式を明らかにすることによって、結合特異性及び、高い阻害活性を有する変異体、及び化合物を設計することが可能となる。現在、インテグリンαＶβ３とＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐとの複合体の立体構造が結晶化によるＸ線結晶解析で明らかにされており、ＡｒｇとＡｓｐが異なった方向に結合サイトがあることがわかっている（Ｘｉｏｎｇ，Ｊ．Ｐ．等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９６，１５１−１５５（２００２）：非特許文献８）。
【０００６】
また、米国特許第５５８７３６０号公報にはコラーゲンに結合することで血小板凝固を阻害する物質について開示されており、また、米国特許第５４９３０２０には、ペプチドではないαＩＩｂβ３の阻害物質について開示されている。
【０００７】
【特許文献１】
米国特許第５４４００２０号明細書
【特許文献２】
米国特許第５９６８９０２号明細書
【特許文献３】
米国特許第５５８７３６０号明細書
【特許文献４】
米国特許第５４９３０２０号明細書
【特許文献５】
特開平６−３０９３８５号公報
【０００８】
【非特許文献１】
Ｋｌｅｉｍａｎ，Ｔ．Ａ．等，ＷｉｌｅｙＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｄｉｃｉｎｅＶｏｌｕｍｅ３，Ｊｏｈｎ＆ＷｉｌｅｙＳｏｎｓ，１７８４−１７９８（２００２）
【非特許文献２】
Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｃ．，ＤｒｕｇｓＦｕｔ．，２０，４５７−６３（１９９５）
【非特許文献３】
Ｇｅｎａｔｔａ，Ｔ．Ｂ．等，Ａｎｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，３０，２５１−７（１９９６）
【非特許文献４】
Ｐｌｏｗ，Ｅ．Ｆ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２，８０５７−８０６１（１９８５）
【非特許文献５】
Ｎｉｅｗｉａｒｏｗｓｋｉ，Ｓ．等，Ｓｅｍｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，３１，２８９−３００（１９９４）
【非特許文献６】
Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈ，Ｒ．Ｍ．等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，１０６６−７３（１９９３）
【非特許文献７】
Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈ，Ｒ．Ｍ．，ＤｒｕｇｓＦｕｔ．，２３，５８５−５９０（１９９８）
【非特許文献８】
Ｘｉｏｎｇ，Ｊ．Ｐ．等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９６，１５１−１５５（２００２）
【非特許文献９】
Ｒａｈｍａｎ，Ｓ．等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３３５，２４７−２５７（１９９８）
【非特許文献１０】
Ｐｆａｆｆ，Ｍ．等，ＣｅｌｌＡｄｈｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２，４９１−５０１（１９９４）
【非特許文献１１】
Ｍａｒｃｉｎｋｉｅｗｉｃｚ，Ｃ．等，Ｂｌｏｏｄ，９０，１５６５−１５７５（１９９７）
【非特許文献１２】
Ｏｋｕｄａ，Ｄ．等，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３０，４０７−４１５（２００１）
【非特許文献１３】
Ｗｙｃｋｏｆｆ，Ｈ．Ｗ．等，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１１４，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ（１９８５）
【非特許文献１４】
Ｗｙｃｋｏｆｆ，Ｈ．Ｗ．等，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１１５，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ（１９８５）
【非特許文献１５】
Ｙａｍａｄａ，Ｍ．等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２４３，３１０−３２６（１９９６）
【非特許文献１６】
Ｇａｂｂ，Ｈ．Ａ．等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７２，１０６−１２０（１９９７）
【非特許文献１７】
Ｌａｔｔｍａｎ，Ｅ．，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１１５，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，５５−７６（１９８５）
【非特許文献１８】
竹中章郎、勝部幸輝、笹田義夫訳、Ｊ．ドレント著、蛋白質のＸ線結晶解析法、シュプリンガー・フェアラーク東京、２０４−２２４（１９９８）
【非特許文献１９】
ＣＣＰ４（ＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌＰｒｏｊｅｃｔ，Ｎｕｍｂｅｒ４），ＡｃｔａＣｒｙｓｔ．，Ｄ５０，７６０−７６３（１９９４）
【非特許文献２０】
Ｎａｖａｚａ，Ｊ．，ＡｃｔａＣｒｙｓｔ．，Ａ５０，１５７−１６３（１９９４）
なお、非特許文献９〜２０については後述する。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、Ｘ線結晶構造解析により解明されたｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ側の配列はＲＧＤを含む５残基のみであり、これだけでは結合特異性が説明できず、ＲＧＤの前後の配列及びＮ末端配列が、結合特異性や活性に関与していることが生化学的に証明されている（Ｒａｈｍａｎ，Ｓ．等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３３５，２４７−２５７（１９９８）：非特許文献９；Ｐｆａｆｆ，Ｍ．等，ＣｅｌｌＡｄｈｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２，４９１−５０１（１９９４）：非特許文献１０；Ｍａｒｃｉｎｋｉｅｗｉｃｚ，Ｃ．等，Ｂｌｏｏｄ，９０，１５６５−１５７５（１９９７）：非特許文献１１）。
【００１０】
そのため、ｄｉｓｉｎｔｅｇｉｒｎの機能を解明するためにはＲＧＤの前後の配列の構造様式を明らかにする必要がある。また、新たに設計した化合物が、副作用を引き起こしたり、異なる効果を示す可能性があるため、この化合物に結合するかどうかＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ以外の受容体との親和性をも調べる必要がある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記のような問題点を解決するためにトリメレスラス・フラボビリディス（Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓｆｌａｖｏｖｉｒｉｄｉｓ）由来の蛇毒中に含まれるディスインテグリン（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ）であるトリメスタチン（ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎ）を結晶化し、Ｘ線を用いた構造解析によりＲＧＤ配列の前後を含む配列の３次元構造座標を初めて決定したことにある。この３次元構造座標を用いることにより、動脈硬化等における血栓形成を防ぐための薬剤として有効であるインテグリン阻害剤を設計するにあたり、ＲＧＤ配列以外の部分の情報を用い、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの結合特異性を有し、阻害活性、及び構造安定性の高いｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの変異体を同定、検索、評価または設計すること、ならびにその受容体を探索または同定することを可能にした。
【００１２】
更に、本発明はｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの結晶を要旨とする。更に、本発明はｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの変異体、インテグリン阻害活性を有する化合物を探索、設計、同定または評価、あるいはその受容体を探索または同定するために使用する表１に示した３次元構造座標を要旨とする。更に、本発明はｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの変異体またはインテグリン阻害活性を有する化合物を探索、設計、同定または評価、あるいはその受容体を探索または同定するために使用する３次元構造座標の全部または、一部を格納しているコンピュータ用記憶媒体と、その使用を要旨とする。
【００１３】
更に、本発明は上記にあるアミノ酸配列、上記に記載の３次元構造座標の全部または一部の配列、上記にあるコンピュータ記憶媒体を使用することを特徴とするインテグリン阻害活性、高い構造安定性及び結合特異性を有する蛋白質または化合物を同定、探索、評価または設計、あるいはその受容体を探索、同定する方法を要旨とする。
【００１４】
すなわち、本発明には以下の各態様が含まれる。
（１）トリメスタチン（ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎ）の結晶。
（２）トリメスタチンが配列番号：１のアミノ酸配列を有する上記項目（１）に記載の結晶。
（３）結晶が単斜晶系で空間群Ｃ２を有する上記項目（１）または（２）に記載の結晶。
（４）結晶の単位格子がａ＝４７．５Å、ｂ＝４８．１Å、ｃ＝３７．７Å、β＝１２６．８°である上記項目（３）に記載の結晶。
（５）トリメスタチン（ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎ）の変異体、又はインテグリン阻害活性を有する化合物を、探索、設計、同定または評価するための、あるいは、その受容体を探索または同定するための表１に示したトリメスタチン３次元構造座標。
（６）上記項目（５）記載の３次元構造座標を示すモデルを初期モデルとして、分子設計手段により、エネルギー的な安定性が向上した構造を有するトリメスタチン変異体を得ることを特徴とするトリメスタチン変異体の構造決定方法。
（７）上記項目（５）記載の３次元構造座標を示すモデルを初期モデルとして、分子設計手段により、エネルギー的な安定性が向上した構造を有するインテグリン阻害活性を有する化合物を得ることを特徴とするインテグリン阻害活性を有する化合物の構造決定方法。
（８）（Ａ）トリメスタチン（ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎ）の変異体またはインテグリン阻害活性を有する化合物を探索、設計、同定または評価するための、あるいは、その受容体を探索または同定するための上記項目（５）に記載された３次元構造座標；
（Ｂ）上記項目（５）に記載された３次元構造座標をモデルとして、分子置換法によって決定されたトリメスタチンの主要部分の主鎖及び、Ｃα炭素の位置との平均二乗偏差が２Å以下である３次元構造座標；及び
（Ｃ）上記項目（５）に記載の３次元構造座標を示すモデルを初期モデルとして、分子設計手段により得られた、可能な限りエネルギー的に安定な構造を与える蛋白質または化合物の３次元構造座標；
から選択された全部または一部を格納しているコンピュータ用記憶媒体。
（９）（ａ）上記項目（５）に記載の３次元構造座標；（ｂ）上記項目（５）に記載の３次元構造座標をモデルとして、分子置換法によって決定されたトリメスタチン（ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎ）の主要部分の主鎖及び、Ｃα炭素の位置との平均二乗偏差が２Å以下である３次元構造座標；（ｃ）上記項目（５）に記載の３次元構造座標であるモデルを初期モデルとして、分子設計手段により、エネルギー的な安定性が向上した構造を有する蛋白質または化合物の３次元構造座標；から選択された全部または一部の配列、あるいは上記項目（８）に記載のコンピュータ記憶媒体から得られた情報に基づいて、アミノ酸を１個以上挿入、欠失、改変または、化学的に修飾することにより、インテグリン阻害活性を有し、高い結合特異性を有する構造を設計する工程を有することを特徴とするｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの変異体またはインテグリン阻害活性を有する化合物を同定、探索、評価または設計、あるいはその受容体を探索または同定する方法。
（１０）分子置換法を用いた蛋白質結晶構造解析における、上記項目（５）〜（９）のいずれかに記載の３次元構造座標の全部又は、一部の使用、及び上記項目（９）に記載のコンピュータ記憶媒体の使用。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明書において、アミノ酸、ペプチド及び蛋白質の表記には下記に示すＩＵＰＡＣとＩＵＢの生化学命名委員会（ＣＢＮ）で採用されている略語を用いている。また、蛋白質のアミノ酸は左から右の方向でＮ末端からＣ末端方向を表している。
ＡまたはＡｌａ：アラニン
ＶまたはＶａｌ：バリン
ＬまたはＬｅｕ：ロイシン
ＩまたはＩｌｅ：イソロイシン
ＰまたはＰｒｏ：プロリン
ＦまたはＰｈｅ：フェニルアラニン
ＷまたはＴｒｐ：トリプトファン
ＭまたはＭｅｔ：メチオニン
ＧまたはＧｌｙ：グリシン
ＳまたはＳｅｒ：セリン
ＴまたはＴｈｒ：トレオニン
ＣまたはＣｙｓ：システイン
ＱまたはＧｌｎ：グルタミン
ＮまたはＡｓｎ：アスパラギン
ＹまたはＴｙｒ：チロシン
ＫまたはＬｙｓ：リシン
ＲまたはＡｒｇ：アルギニン
ＨまたはＨｉｓ：ヒスチジン
ＤまたはＡｓｐ：アスパラギン酸
ＥまたはＧｌｕ：グルタミン酸。
【００１６】
１．Ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの結晶化
本発明に用いるｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎは、Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓｆｌａｖｏｖｉｒｉｄｉｓ由来の蛇毒中に含まれるｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎである（Ｏｋｕｄａ，Ｄ．等，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３０，４０７−４１５（２００１）：非特許文献１２）。
【００１７】
蛋白質の３次元構造を解析するために用いられる手法としてＸ線結晶構造解析が多く用いられている。Ｘ線結晶構造解析とは、蛋白質を結晶化し、Ｘ線を当て散乱したＸ線の回折像から蛋白質の３次元構造を解析する方法である。結晶化とは、イオン強度、塩濃度、温度、沈殿剤、ｐＨなど溶解度に関係する物理化学的因子を組み合わせることにより、蛋白質を結晶として析出させる方法である。また、蛋白質の結晶化法として静止バッチ法、自由界面拡散法、微量透析法、蒸気拡散法などがある。結晶化の際には、さまざまな結晶化条件を試してみて、最良な結晶化条件を決定する必要がある（Ｗｙｃｋｏｆｆ，Ｈ．Ｗ．等，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１１４，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ（１９８５）：非特許文献１３；Ｗｙｃｋｏｆｆ，Ｈ．Ｗ．等，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１１５，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ（１９８５）：非特許文献１４）。
【００１８】
本発明で用いるｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの結晶は以下にあるような方法で調整される。まず始めに、ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎを高純度に精製する必要があるが、これはカラムクロマトグラフィーなどの方法を単独または、異なる方法を組み合わせることにより行われる。次にｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎを結晶化する方法であるが、これにはバッチ法、蒸気拡散法、微量透析法などを用いることができる。これらの方法を用いて更に、最適な結晶化条件を探す必要がある。ただし、他の方法で同じ結晶が得られることは一般的な事実であるので、同一の結晶学的定数をもつｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの結晶が得られたとしても、それは本発明の範囲内となる。
【００１９】
２．Ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの３次元構造の座標
このようにして得られた配列番号：１に示すｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの結晶をＸ線による結晶構造解析を行い３次元構造座標を明らかにした。Ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの結晶は単斜晶系で空間群Ｃ２に属し、ａ＝４７．５Å，ｂ＝４８．１Å，Ｃ＝３７．７Å， β＝１２６．８°の格子定数を持つ。結晶の単位格子の形を図３に示す。この結晶をＸ線結晶構造解析により３次元構造座標を初めて明らかにした。得られた構造座標をＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋフォーマットで表１（表１−１〜１−１７）に示す。ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの７０残基のうちＣ末端のＡｓｐ６９とＬｅｕ７０は電子密度地図では見ることができなかった。表１において、左から順に、１列目はこの行が原子座標を示していることを表している。２列目は、その原子の順番を、３列目は原子名を、４列目はアミノ酸名を、５列目は分子鎖の識別記号を、６列目はアミノ酸残基の順番を、７から９列目はÅ単位でＸ、Ｙ、Ｚ軸の原子座標を表しており、１０列目は原子の占有率を、１１列目は温度因子を表している。
【００２０】
【表１】

【００２１】
【表２】

【００２２】
【表３】

【００２３】
【表４】

【００２４】
【表５】

【００２５】
【表６】

【００２６】
【表７】

【００２７】
【表８】

【００２８】
【表９】

【００２９】
【表１０】

【００３０】
【表１１】

【００３１】
【表１２】

【００３２】
【表１３】

【００３３】
【表１４】

【００３４】
【表１５】

【００３５】
【表１６】

【００３６】
【表１７】

表１の３次元構造座標より得られるｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの３次元構造座標のコンピュータグラフィックスによる詳細図を図１に示し、図２に概略図を示す。ペプチド鎖は、６個のジスルフィド結合によって細長く、厳密な形に折りたたまれており、２次構造はおおまかに一連のターンと２個の短い逆平行βシートの部分からなっている。ＲＧＤ配列のＡｒｇ４９とＡｓｐ５１の側鎖は反対の方向を指している。５個のプロリンのうちＰｒｏ９，Ｐｒｏ１２，Ｐｒｏ２３はターン構造の２番目の位置にある。インテグリン型受容体によって認識されるＲＧＤ配列はＴｈｒ４３からＣｙｓ５７までの長く不規則な１５残基のヘアピンループの先端にある。逆平行β鎖は一方の鎖のＡｓｐ５５ともう一方の鎖のＣｙｓ４５−Ａｒｇ４６にあるβ隆起のためややねじれている。両鎖は６個の水素結合によって結合されており、その内４個が主鎖間で、１個が主鎖と側鎖間で、１個が側鎖間の水素結合である。ヘアピンループの付け根部分では、２個のジスルフィドブリッジ、Ｃｙｓ３２−Ｃｙｓ５７，Ｃｙｓ４５−Ｃｙｓ６４が存在する。後者のブリッジによってＣ末端領域が折り返しＲＧＤループに接近する。これによってＴｒｐ６７のインドール環がＰｒｏ５３に疎水的に接触する。もう一つのβシートは分子の中央に位置し、シート内に水素結合を持ち、Ｃｙｓ３２−Ｌｙｓ３９の間にヘアピンループがある。ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎに厳密に保存されているＰｈｅ３８のフェニル環は、Ｇｌｎ２６のメチレン側鎖とＧｌｎ６０−Ｓｅｒ６１の主鎖の間に挿入されている。Ｐｈｅ３８はＮ末とＣ末サブドメインの間の相対的な動きを減少させるために分子の中心で支柱の役割をしていると解せられる。
【００３７】
ここで、ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの変異体の結晶の構造であっても本発明による結晶構造と実質的に一致するものは本発明の範囲である。また、配列番号：１の配列に対して１つまたは数個のアミノ酸の欠失、置換または付加により得られるｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎと同様のインテグリン阻害活性を有する変異体も本発明の範囲にある。更に、各配列の開始位置及び終了位置も本発明にとって厳密なものでなく、Ｎ末端及びＣ末端に別の蛋白質が付加しているもの、Ｎ末端及びＣ末端に１個以上のアミノ酸残基が付加したものなど、ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの分子について実質的な変化をもたらさないものについては本発明に含まれる。また、糖鎖が結合したもの、糖鎖が切断されたものなどについても、ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの分子について実質的な変化をもたらさないものについては、本発明の範囲である。実質的に一致するものとは、構造の主要部分の対応する部分の主鎖又はＣα炭素の部分の位置の平均二乗偏差がおよそ２Å以下である構造のことである。なお、表１に示した本発明の３次元構造座標をコンピュータによる計算に用いる場合などで、各原子の相対的な配置を変化させず、３次元空間内で並進、回転、対称などの移動操作の結果として得られる新たな３次元構造座標も本発明の範囲である。
【００３８】
表１の構造座標はｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの構造を表しており、表１の構造からｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎのインテグリンへの結合様式、及び結合特異性を解明でき、ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの変異体、及びｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎのように機能する、すなわちディスインテグリンとしての活性を有する化合物を同定、検索、評価または設計、あるいはその受容体を探索または同定することができる。
【００３９】
３．ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの３次元構造座標を利用した分子設計のためのコンピュータの使用
ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの結晶から得られる３次元構造座標を、分子の３次元構造座標を表現することができるコンピュータプログラムが動作するコンピュータまたはそのコンピュータの記憶媒体に入力することで、ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの立体構造を表現することが可能になる。
【００４０】
コンピュータの記憶媒体としては、ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎから得られた構造座標をプログラムに導くことができるものであれば特に限定されない。例えば、メモリ、プロッピーディスク、ハードディスク、光ディスク、光磁気ディスク、磁気テープなどである。
【００４１】
本発明におけるｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの３次元構造座標を、分子の３次元構造座標を表示することができるコンピュータプログラムが起動するコンピュータに入力し、視覚的及びエネルギー的安定性を検討することで、インテグリン阻害活性を有し、基質特異性、又は構造安定性の高い変異体、及び化合物を設計することが可能になる。
【００４２】
蛋白質分子の３次元構造座標を表示することができる市販のコンピュータプログラムは、好ましくは、分子の３次元構造座標を入力するための入力部、入力された３次元構造座標を用いてコンピュータの画面（ディスプレイ）で蛋白質の立体構造を表現するための表現部、表現された分子内における各原子間の距離や結合角などを測定するための測定部、３次元構造座標を追加または修正するための追加修正部などの各種の部分から構成することができる。更に、分子の座標を元に、分子の構造エネルギーを計算するための分子構造エネルギー計算部、水分子などの溶媒分子を考慮して自由エネルギーを計算するための自由エネルギー計算部などを追加的に有するものであってもよい。なお、分子の３次元構造座標はコンピュータ内の記憶装置に保持し、これを画面表示するようにプログラムを設定してもよい。
【００４３】
例えば、アクセルリス社から販売されているコンピュータプログラムであるＩｎｓｉｇｈｔＩＩやＱＵＡＮＴＡは、このために用いるプログラムの例であるが、これらのプログラムに限定されない。また、プログラムは、シリコングラフィクス社やサンマイクロシステムズ社などから販売されているワークステーションと呼ばれているコンピュータに導入されて使用されるが、これらに限定されない。
【００４４】
Ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの変異体の設計方法の一つにコンピュータ又はその記憶媒体に本発明にかかるｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの３次元構造座標を記憶させ、それに基づいてｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの立体構造を表示させ、視覚的検討によって行う方法がある。まず、コンピュータにｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの３次元構造座標を入力し、それに基づいて蛋白質の立体構造を画面に表示させる。そして、この立体構造上で１個以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入やアミノ酸の化学的修飾などを行い、その結果からできた化合物の空間的なコンフォメーションをコンピュータ上で表示させ、インテグリン阻害剤としてより適切な構造を探索していく。３次元構造を表記する方法としてクリスタルアイ、立体視、ステレオ対があるが、必ずしも３次元を表記する方法としてこれらに限定されない。
【００４５】
Ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの変異体の設計方法は、例えば、
（１）ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの３次元構造座標に基づいてコンピュータの画面にｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの立体構造を表示させる工程と、
（２）画面に表示されたｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの立体構造上で１個以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入、あるいは化学的に親水基、疎水基、ペプチド構造類似化合物による置き換えなどのアミノ酸の化学修飾を行う構造変更工程と、
（３）前記構造変更にともなう空間的なコンフォメーションを画面に表示させる工程と、
（４）前記コンフォメーションを用いてインテグリン阻害剤として機能する構造を検索し、決定する工程と、
を有して構成することができる。
【００４６】
このような処理を行う装置としては、例えば、必要に応じて記憶装置が付加されている演算装置とデータやプログラムに応じて各種の画像を表示し得るディスプレイとを有するコンピュータシステムを主体とし、
（Ａ）ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの３次元構造座標に基づいてコンピュータの画面にｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの立体構造を表示させる手段と、
（Ｂ）画面に表示されたｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの立体構造上で１個以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入、あるいはアミノ酸の化学修飾を行う構造変更のための手段と、
（Ｃ）前記構造変更にともなう空間的なコンフォメーションを画面に表示させる手段と、
（Ｄ）前記コンフォメーションを用いてインテグリン阻害剤として機能する構造を検索し、決定する手段と、
を少なくとも有するものを挙げることができる。
【００４７】
更に、視覚的な探索をした化合物の構造のエネルギーを計算することでエネルギー的な安定性を求めることができる。エネルギー的な安定性は、結合エネルギー、自由エネルギーで評価できる。エネルギー計算は、分子力場計算を行うコンピュータープログラムを用いることによって行うことができる。例えばＩｎｓｉｇｈｔＩＩのＤＩＳＣＯＶＥＲモジュールなどがあるが、これらに限定されない。また、分子軌道計算によっても、化合物のエネルギー的安定性を求めることができる。分子軌道計算を行うプログラムに、例えば、ＧＡＵＳＩＡＡＮ社のＧＡＵＳＩＡＡＮ９８，Ｑ−ｃｈｅｍ，Ｉｎｃ．のＱ−ｃｈｅｍ、アクセルリス社のＩｎｓｉｇｈｔＩＩのＤＭｏＬモジュール，ＮＥＣ社のＡＭＯＳＳなどがあるが、これらに限定されない。これらの視覚的、計算化学的手法で変異体を探索していくことで、構造安定性が高い変異体を求めることができる。また、受容体とｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの３次元構造座標を用いて、立体構造をコンピュータ上に表示して重ね合わせることによって、視覚的、エネルギー的に安定に受容体と結合とするようにｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎ部分を変異させることで、インテグリン阻害活性及び結合特異性を有する変異体を設計することができる。このときに使用するコンピュータ、コンピュータプログラム、記憶媒体に特に制限はない。
【００４８】
上記の方法（視覚的手法、計算化学的手法、受容体との結合モデルなどの分子設計方法または手段）を組み合わせるか、繰り返し行うことによってもインテグリン阻害活性、高い結合特異性、構造安定性を有するｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの変異体を設計することができる。また、データベースに登録されている蛋白質の３次元立体構造座標を用いて、網羅的にコンピュータでドッキングシミュレーションを行い、上記で設計したｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの変異体に安定的に結合する受容体を探索することができる。ドッキングシミュレーションを行うプログラムとしてＡＤＡＭ（Ｙａｍａｄａ，Ｍ．等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２４３，３１０−３２６（１９９６）：非特許文献１５）やＤＯＣＫ、ＦＴＤＯＣＫ（Ｇａｂｂ，Ｈ．Ａ．等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７２，１０６−１２０（１９９７）：非特許文献１６）、ＮＥＣ社のＡＭＯＳＳなどがあるが、これらに限定されない。
【００４９】
また、受容体を探索する方法には、リガンドと受容体の３次元構造をコンピュータ上に表示し重ね合わせることにより視覚的に最適な受容体を探索する方法がある。その他にも、エネルギー的に安定に結合する受容体を分子力場計算、あるいは分子軌道計算を用いることによって探索することができる。
【００５０】
また、これらの手法を組み合わせることでも受容体を探索できる。このときに使用するコンピュータ又は、記憶媒体には特に制限はない。
【００５１】
４．インテグリン阻害活性を有する化合物を設計するためのｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの３次元構造座標の使用
本発明による表１に示したｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの３次元構造座標の全部、又は一部をコンピュータに入力してコンピュータプログラムを用いることにより、特開平６−３０９３８５号公報（特許文献５）に示されたような方法によって、リガンド分子の３次元構造座標から生理活性を有するリガンドの分子構造を決定することができる。リガンド分子の３次元構造座標を用いることによって、活性を有する化合物を設計する方法であれば特にこの方法に制限されない。
【００５２】
また、データベースに登録されている蛋白質の３次元立体構造座標を用いて、網羅的にコンピュータでドッキングシミュレーションを行い、上記で設計した化合物に安定的に結合する受容体を探索することができる。ドッキングシミュレーションを行うプログラムとしてＡＤＡＭやＤＯＣＫ、ＦＴＤＯＣＫ、ＡＭＯＳＳなどがあるが、これらに限定されない。また、受容体を探索する方法には、リガンドと受容体の３次元構造をコンピュータ上に表示し重ね合わせることにより視覚的に最適な受容体を探索する方法がある。その他にも、エネルギー的に安定に結合する受容体を分子力場計算、あるいは分子軌道計算を用いることによって探索することができる。また、これらの手法を組み合わせることでも受容体を探索できる。このときに使用するコンピュータ又は、記憶媒体には特に制限はない。
【００５３】
５．分子置換法によるＸ線結晶解析を行うためのｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの構造座標の使用
本発明による表１に示したｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの３次元構造座標のすべて又はその一部を使用することで、ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの全部又は一部を含んでいる結晶、又はｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎと有意な相同性を持つアミノ酸配列を持つ蛋白質の結晶などのＸ線結晶解析の方法の一つとして用いられている分子置換法（Ｌａｔｔｍａｎ，Ｅ．，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１１５，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，５５−７６（１９８５）非特許文献１７；竹中章郎、勝部幸輝、笹田義夫訳、Ｊ．ドレント著、蛋白質のＸ線結晶解析法、シュプリンガー・フェアラーク東京、２０４−２２４（１９９８）非特許文献１８）で、構造座標決定の際に重原子同型置換法を用いず、構造座標が未知の蛋白質の結晶のＸ線回折像から得られる構造因子からその構造座標を決定することが可能である。分子置換法を行う時には、分子置換法に用いるプログラムを起動することができるコンピュータを用いる。プログラムは、例えばＡＭｏＲｅ（ＣＣＰ４（ＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌＰｒｏｊｅｃｔ，Ｎｕｍｂｅｒ４），ＡｃｔａＣｒｙｓｔ．，Ｄ５０，７６０−７６３（１９９４）：非特許文献１９；Ｎａｖａｚａ，Ｊ．，ＡｃｔａＣｒｙｓｔ．，Ａ５０，１５７−１６３（１９９４）：非特許文献２０）プログラムパッケージに含まれるプログラムなどがあるが、使用するプログラムとしてこのプログラムに限定されない。本発明のｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの３次元構造座標を使用して分子置換法を適用することができる結晶としては、ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの全部又は一部を含んでいる結晶、ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎと有意な相同性を持つアミノ酸配列を持つ他の蛋白質から得られた結晶、ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎと結合する化合物とｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの複合体、ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎとアミノ酸残基において有意な相同性を持つ蛋白質を含むもの、ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの変異体及びそれを含むものなどから得られた結晶、また更にそれらの複合体から得られた結晶に適応することができる。有意な相同性とは、一般に、挿入配列を許すアミノ酸配列で２０％以上、好ましくは３０％以上一致している場合のことである。実際に結晶のＸ線回折像から得られた以外の未知物質の結晶において、本発明による表１に示したｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの３次元構造座標の全部又は一部を用いて分子置換法により構造解析することは、有意な解が得られた場合には本発明の範囲である。
【００５４】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【００５５】
実施例１Ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの精製方法
Ｔｒｉｍｅｒｅｓｒｕｓｆｌａｖｏｖｉｒｉｄｉｓの凍結乾燥した毒は（財）日本蛇族学術研究所（群馬県）から購入した。その粗毒は５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）に溶解し、溶解しなかったものは遠心分離により取り除いた。上清はＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇを用いた分子ふるいクロマトグラフィーで分画した。分画はヒト血小板のＡＤＰ誘導凝固の阻害活性で分析した。活性のあった分画を集め、ＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅと逆相ＨＰＬＣの２種類のカラムにかけた。Ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの収量は粗毒１ｇあたり４．２ｍｇであった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでのｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの分子量は、還元下、非還元下で８ｋＤａだった。純度はＣｏｏｍａｓｓｉｅＢｒｉｌｌｉａｎｔＢｌｕｅ染色による１６％ポリアクリルアミド電気泳動から推測した。
【００５６】
実施例２ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの結晶化方法
凍結乾燥したｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの蛋白質サンプルは濃度が３０．０ｍｇ／ｍｌになるように調製した。結晶化条件はＣｒｙｓｔａｌＳｃｒｅｅｎｋｉｔｓ１と２（ＨａｍｐｔｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ社）を用いたマイクロバッチ法によって探索した。一般的に、０．４ μｌの蛋白質溶液と１．２ μｌのスクリーニング溶媒と混合した。条件は多くの実験によって探索され、単結晶（一片がそれぞれ０．３ｍｍ）が０．５ μｌの蛋白質溶液を３０％ポリエチレングリコール０．６ μｌと０．１Ｍ硫酸アンモニウム０．６ μｌとを混合して２９３Ｋで放置する条件下で得られた。
【００５７】
実施例３ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの回折実験法
結晶は凍結防止剤（同じ結晶化条件で与えられた２０％エチレングリコール）で浸漬処理後、１００Ｋの液体窒素気流中で急速冷凍した。完全な１．７ Åデータセットは、ＰｈｏｔｏｎＦａｃｔｏｒｙ（高エネルギー加速器研究機構），ｂｅａｍｌｉｎｅＢＬ６Ａ（λ ＝１．００Å）で得られた。すべてのデータセットはＤＰＳ／Ｍｏｓｆｌｍを使って処理した。データ収集と精密化における統計は以下の数値である。分解能の範囲（Å）：３０．０−１．７（１．７６−１．７０）、精密化における反射数：７，５３８（７３７）、完全性（％）：９９．８（１００．０）、Ｒ因子（％）：１８．９（２２．９）、Ｒｆｒｅｅ因子：２２．９（２７．８）、但し括弧内は最外角の分解能を示す。
【００５８】
蛋白質中での水素原子以外の原子数：５０７、水分子数：１４７、標準値からの平均２乗偏差値は結合長で０．００４Å、結合角で１．２°、平均の温度因子は２３．２Å^２である。
【００５９】
実施例４ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの構造決定と最精密化法
ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの結晶は単斜晶系で空間群Ｃ２に属し、ａ＝４７．５Å，ｂ＝４８．１Å，ｃ＝３７．７Å， β＝１２６．８°の格子定数を持っていた。その構造は、ｆｌａｖｏｒｉｄｉｎのＮＭＲ構造（ＰＤＢｃｏｄｅ１ｆｖｌ）を使用してＡＭｏＲｅでの分子置換法によって解かれた。最初の試みでは、サーチモデルとして１ｆｖｌの各々の１８分子を使ったものは、多くの探索パラメータを使用したが顕著な解は得られなかった。次に１ｆｖｌ全体（１８分子を平均したもの）を探索モデルとして試した。そのため、一定のＢ因子（２０Å^２）を持つ以下の３種の全体モデルが準備された。Ａｌｌ−ａｔｏｍｍｏｄｅｌ（全原子からなるサーチモデル）、ｐｏｌｙ−ＡＧｍｏｄｅｌ（グリシン以外のアミノ酸残基をアラニンに置き換えたサーチモデル）、ｐｏｌｙ−ＳＡＧｍｏｄｅｌ（グリシン、アラニン以外のアミノ酸残基をセリンに置き換えたサーチモデル）。１５．０と３．５Å分解能の間のデータを用いてＡＭｏＲｅｐａｃｋａｇｅによる分子置換を行った。回転関数は明確な解を出すことはできなかった。並進関数はすべての回転関数ピーク値を使って計算され、ａｌｌ−ａｔｏｍｍｏｄｅｌまたはｐｏｌｙ−ＳＡＧｍｏｄｅｌ（ｐｏｌｙ−ＡＧｍｏｄｅｌは全く明確な解が得られなかった）を用いそれぞれ１個の顕著な解が得られた。
【００６０】
この解は結晶内パッキングによって評価された。Ａｌｌ−ａｔｏｍｍｏｄｅｌを使った分子置換の解は、ＣＮＳプログラムを使ったねじれ分子動力学精密化にかけられ、１５．０と１．７Å分解能の間のデータを用いてＲ因子は４４．６％、Ｒｆｒｅｅ因子は４５．７％までそれぞれ向上した。このモデルは自動モデル化プログラムＡＲＰ／ｗＡＲＰの開始モデルとして使われ、２００回の自動モデル化サイクル後、Ｒ因子は１９．２％まで向上した。さらにモデル構築はプログラムＯで行われた。モデルは１．７Åのネイティブデータを用いてＣＮＳで精密化された（統計は実施例４の下部）。ＰＲＯＣＨＥＫによれば精密化モデルの各残基はＲａｍａｃｈａｎｄｒａｎプロットの許容範囲内であった。
【００６１】
実施例５インテグリン阻害剤の設計方法
インテグリン阻害剤の設計は図４の流れ図に従って設計できる。この流れ図では、ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの３次元構造をコンピュータに入力し、視覚的、エネルギー的に受容体との結合能を評価していき、分子置換や化学的修飾を繰り返し行うことにより、最適なインテグリン阻害剤を設計する。
【００６２】
実施例６副作用を防ぐためにインテグリンαＶβ３とｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの相互作用を減少させる方法
ＴｒｉｍｅｓｔａｔｉｎとαＶβ３（ＰＤＢｃｏｄｅＩＬ５Ｇ）の間のドッキングシミュレーションはＦＴＤＯＣＫと分子シミュレーションパッケージＩｎｓｉｇｈｔＩＩ２０００（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社）を使用して行った。Ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎは移動する分子とし、一方でＭＩＤＡＳ部位を含むαＶ（残基：Ａ１−Ａ４３８）とβ３（残基：Ｂ１１１−Ｂ３５１）のパートナードメインは静止する分子として使用した。計算では、１方向に２１４グリッド単位（グリッド点間隔：０．７０ Å）をとった空間中で並進、回転走査するために使用し、ｓｕｒｆａｃｅｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙとｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｆｉｌｔｅｒで制限した。経験的スコアリングは残基−残基間ポテンシャルを使用して行った。適切な複合体モデルを選択するために、ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎのＡｒｇ４９とαＶドメインのＡｓｐ１５０の間を４．５ Åに距離を制限すると、最良のスコアを持つ良い候補モデルが得られた。モデルのエネルギー最小値化は最大の各原子間に働く力が１０^−４ｋｃａｌ／ｍｏｌ・Åに至るまでＩｎｓｉｇｈｔＩＩのＤＩＳＣＯＶＥＲモジュール内のＣＶＦＦ力場を使用して行った。計算は１．０の誘電率を使用して真空中で行った。主鎖原子の座標は固定し、側鎖原子は構造の変形を避けるために最初のモデルに拘束した。省略したｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎのＣ末端残基Ａｓｐ６９、Ｉｌｅ７０は最後に付け加えた。
【００６３】
αＶβ３とｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎとの間で相互作用しているアミノ酸残基のコンピュータグラフィックスによる詳細図を図５に示し、図６に模式図を表している。ＲＧＤ配列にあるＡｒｇ４９のグアニジン基とＡｓｐ５１のカルボキシル基の位置は、αＶβ３に結合した環状ペンタペプチドリガンドのそれらの位置と良く一致している。従って、Ａｒｇ４９はプロペラドメインのＡｓｐ１５０、Ａｓｐ２１８との間に塩橋を、Ｔｈｒ２１２との間に水素結合を形成しており、Ａｓｐ５１はβＡドメインのＭＩＤＡＳ（ｍｅｔａｌｉｏｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔａｄｈｅｓｉｏｎｓｉｔｅ）でＭｎ^２＋に直接結合している。中央の残基のＧｌｙ５０はαＶβ３と相互作用していない。しかし、環状ペンタペプチドＧｌｙ残基はαＶといくつか疎水相互作用をしている。この違いは明らかに主鎖のコンフォメーションの違いからきている。環状ペンタペプチドの残りの２個の残基はαＶβ３に面していなく、相互作用していない。しかしながら、天然のｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎリガンドの場合には、他の結合サイトがこのモデルで見つけられた。１）ＲＧＤ配列の隣のＰｈｅ５２はプロペラドメインのＴｙｒ１７８とβ３ドメインのＴｙｒ１６６と疎水作用をしている。環状ペンタペプチドはこの位置にＰｈｅを含んでいる。しかし環状化によるコンフォメーションの制約のためとＤ−アミノ酸（Ｄ−Ｐｈｅ）のため、側鎖は違った方向を指している。２）Ｐｒｏ５３はβ３ドメインのＡｓｐ１７９とＡｓｐ２１４と相互作用している。３）Ａｒｇ６６のグアニジニウム基はプロペラドメインのＡｓｐ１４８へ塩橋を形成し、さらにＡｓｐ１５０へも塩橋を形成している。４）Ｔｒｐ６７はプロペラドメインのＡｓｐ１４８、β３ドメインのＴｙｒ１６６、Ａｓｐ１７９と相互作用している。５）Ａｓｎ６８の側鎖はプロペラドメインのＴｈｒ１１６、Ｌｙｓ１１９、Ｇｌｕ１２１、Ａｓｐ１４８と水素結合している。６）Ａｓｐ６９の主鎖はプロペラドメインのＬｙｓ１１９と水素結合している。
【００６４】
上記の相互作用している残基を図７の流れ図のように視覚的、エネルギー的に安定的に結合しないように（しかし、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａとの結合は保つ）分子置換、及び化学的修飾を行うことで、副作用を防ぐためにαＶβ３との結合を弱め、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａと強く結合するようにｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの変異体を設計することができる。
【００６５】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの立体構造を主鎖リボン図により表した立体構造図である。Ｃ末端の２個の残基は省略した。ＲＧＤ配列にはラベルがあり、側鎖はボールアンドスティック図で示してある。６個のジスルフィド結合はボールアンドスティック図で示してある。図はＭＯＬＳＣＲＩＰＴ（Ｋｒａｕｌｉｓ，Ｊ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，２４，９４６−９５０（１９９３））とＲＡＳＴＥＲ３Ｄ（ＭｅｒｉｔｔＥ．Ａ．等，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，２７７，５０５−５２４（１９９７））を使用して作成した。
【図２】ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの構造の概略図である。
【図３】ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの結晶の単位格子を表した図である。
【図４】インテグリン阻害剤の設計方法のフローチャートである。
【図５】相互作用部位の拡大した立体図。相互作用している残基はラベルを付けたボールアンドスティック図で示してある。図はＭＯＬＳＣＲＩＰＴを使用して作成した。
【図６】ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎとαＶβＩＩＩの間のアミノ酸残基の相互作用を結線で示した図である。
【図７】副作用を防ぐためにαＶβ３にｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎが結合しないようにする方法のフローチャートである。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a crystallized trimestatin protein, its three-dimensional structural coordinates of its amino acid sequence, and its use.
[0002]
[Prior art]
Arteriosclerotic diseases such as ischemic heart disease are diseases that can cause death, and arteriosclerosis in myocardial infarction is caused by platelet aggregation. Platelets play an important role in hemostasis and thrombosis. Fibrinogen is activated by platelet glycoprotein GPIIb / IIIa (also called αIIbβ3) as a result of being activated by various physiological substances such as damage to vascular endothelium. (Kleiman, TA, et al., Wiley Encyclopedia of Molecular Medicine Volume 3, John & Wiley Sons, 1784-1798 (2002): Non-Patent Document 1).
[0003]
As a treatment method of arteriosclerosis, percutaneous coronary intervention (PCI) or bypass surgery in which a balloon-shaped catheter is inflated at an occluded portion is currently performed. However, there are problems such as acute thrombosis and restenosis caused by balloon and other injuries after PCI treatment. To date, aspirin (antiplatelet agent) and heparin (anticoagulant) have been used to prevent thrombosis. Although used, aspirin only weakly inhibits platelet aggregation. Another treatment is the anti-GPIIb / IIIa antibody, c7E3 (abciximab), which binds to GPIIb / IIIa and inhibits aggregation. In clinical tests, it has performed better than conventional aspirin and heparin. However, abciximab does not bind to Arg-Gly-Asp (RGD), which is a binding site between GPIIb / IIIa and fibrinogen, and inhibits access of the molecule to the receptor by steric inhibition and conformational effects (Robinson, C., Drugs Fut., 20, 457-63 (1995): Non-Patent Document 2; Genatta, TB, et al., Ann. Pharmacol., 30, 251-7 (1996): Non-Patent Document 3; No. 544020 specification: Patent Document 1).
[0004]
The binding function of GPIIb / IIIa is effectively inhibited by binding of the peptide containing the RGD sequence to GPIIb / IIIa. Disintegrin is a substance that inhibits platelet aggregation, and most of disintegrin derived from snake venom contain the Arg-Gly-Asp (RGD) or Lys-Gly-Asp (KGD) sequence (Plow, EF, etc.). Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 82, 8057-8061 (1985): Non-Patent Document 4; Niewirowski, S. et al., Semin. Hematol., 31, 289-300 (1994): Non-Patent Document 4. Patent Document 5). Sistrulus milarus barbourian snake venom (Barbourin) is a disintegrin consisting of 73 amino acids having a KGD sequence, which is specific to GPIIb / IIIa and becomes more active when cyclized. Eptifibatide (product name: Integrilin) designed based on this Barbourin is currently commercially available (Scarborough, RM et al., J. Biol. Chem., 268, 1066-73 (1993): Non-Patent Document 6). Scarborough, RM, Drugs Fut., 23, 585-590 (1998): Non-Patent Document 7; U.S. Patent No. 5,968,902: Patent Document 2).
[0005]
By elucidating the structural binding mode between integrin and disintegrin, it becomes possible to design mutants and compounds having binding specificity and high inhibitory activity. At present, the three-dimensional structure of the complex of integrin αVβ3 and Arg-Gly-Asp has been revealed by X-ray crystallography by crystallization, and it is known that Arg and Asp have binding sites in different directions ( Xiong, JP, et al., Science, 296, 151-155 (2002): Non-Patent Document 8).
[0006]
Also, US Pat. No. 5,587,360 discloses a substance that inhibits platelet coagulation by binding to collagen, and US Pat. No. 5,493,020 discloses an inhibitor of αIIbβ3, which is not a peptide.
[0007]
[Patent Document 1]
U.S. Pat. No. 5,440,020
[Patent Document 2]
U.S. Pat. No. 5,968,902
[Patent Document 3]
U.S. Pat. No. 5,587,360
[Patent Document 4]
U.S. Pat. No. 5,493,020
[Patent Document 5]
JP-A-6-309385
[0008]
[Non-patent document 1]
Kleiman, T .; A. Et al., Wiley Encyclopedia of Molecular Medicine Volume 3, John & Wiley Sons, 1784-1798 (2002).
[Non-patent document 2]
Robinson, C .; , Drugs Fut. , 20, 457-63 (1995).
[Non-Patent Document 3]
Genatta, T .; B. Et al., Ann. Pharmacol. , 30, 251-7 (1996)
[Non-patent document 4]
Plow, E.A. F. Et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 82, 8057-8061 (1985).
[Non-Patent Document 5]
Niewirowski, S .; Et al., Semin. Hematol. , 31, 289-300 (1994).
[Non-Patent Document 6]
Scarborough, R .; M. J. et al. Biol. Chem. , 268, 1066-73 (1993).
[Non-Patent Document 7]
Scarborough, R .; M. , Drugs Fut. , 23, 585-590 (1998).
[Non-Patent Document 8]
Xiong, J .; P. Et al., Science, 296, 151-155 (2002).
[Non-Patent Document 9]
Rahman, S.M. Et al., Biochem. J. , 335, 247-257 (1998).
[Non-Patent Document 10]
Pfaff, M .; Et al., Cell Adhes. Commun. , 2, 491-501 (1994).
[Non-Patent Document 11]
Markinkiewicz, C.I. Et al., Blood, 90, 1565-1575 (1997).
[Non-Patent Document 12]
Okuda, D.A. J. et al. Biochem. , 130, 407-415 (2001).
[Non-patent document 13]
Wyckoff, H .; W. Et al., Methods in Enzymology 114, Academic Press (1985).
[Non-patent document 14]
Wyckoff, H .; W. Et al., Methods in Enzymology 115, Academic Press (1985).
[Non-Patent Document 15]
Yamada, M .; J. et al. Mol. Biol. , 243, 310-326 (1996).
[Non-Patent Document 16]
Gabb, H .; A. J. et al. Mol. Biol. , 272, 106-120 (1997).
[Non-Patent Document 17]
Latman, E .; , Methods in Enzymology 115, Academic Press, 55-76 (1985).
[Non-Patent Document 18]
Translated by Akio Takenaka, Kouki Katsube, Yoshio Sasada, Drent, X-ray crystallography of proteins, Springer Verlag Tokyo, 204-224 (1998)
[Non-Patent Document 19]
CCP4 (Collaborative Computational Project, Number 4), Acta Cryst. , D50, 760-763 (1994).
[Non-Patent Document 20]
Navaza, J .; , Acta Cryst. , A50, 157-163 (1994).
Non-patent documents 9 to 20 will be described later.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
However, the sequence on the disintegrin side elucidated by X-ray crystal structure analysis is only 5 residues including RGD, and this alone cannot explain the binding specificity, and the sequence before and after RGD and the N-terminal sequence are And bioactivity have been demonstrated to be involved in the activity (Rahman, S., et al., Biochem. J., 335, 247-257 (1998): Non-Patent Document 9; Pfaff, M., et al., Cell. Commun., 2, 491-501 (1994): Non-Patent Document 10; Marcinkiewicz, C. et al., Blood, 90, 1565-1575 (1997): Non-Patent Document 11).
[0010]
Therefore, in order to elucidate the function of disintegirn, it is necessary to clarify the structure of the sequence before and after RGD. In addition, since the newly designed compound may cause side effects or show different effects, it is necessary to examine the affinity with a receptor other than GPIIb / IIIa to bind to the compound.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have solved the above-mentioned problems by crystallizing trimestatin, which is a disintegrin contained in snake venom derived from Trimeresus flavoviridis, and forming X. That is, the three-dimensional structural coordinates of an array including before and after the RGD array are determined for the first time by a structural analysis using a line. By using these three-dimensional structural coordinates, in designing an integrin inhibitor that is effective as a drug for preventing thrombus formation in arteriosclerosis or the like, binding specificity to GPIIb / IIIa can be determined using information of a part other than the RGD sequence. It has become possible to identify, search, evaluate or design a mutant of trimestatin which has high inhibitory activity and structural stability, and to search or identify its receptor.
[0012]
Further, the present invention provides a crystal of trimestatin. In addition, the present invention provides a summary of the three-dimensional structural coordinates shown in Table 1 used for searching, designing, identifying or evaluating a mutant of trimestatin, a compound having an integrin inhibitory activity, or for searching or identifying a receptor thereof. I do. Further, the present invention stores all or a part of three-dimensional structural coordinates used for searching, designing, identifying or evaluating a mutant of trimestatin or a compound having an integrin inhibitory activity, or for searching or identifying a receptor thereof. The gist of the present invention is a storage medium for a computer and its use.
[0013]
Further, the present invention provides the amino acid sequence described above, the sequence of all or a part of the three-dimensional structural coordinates described above, the integrin inhibitory activity characterized by using the computer storage medium described above, high structural stability and The gist is a method of identifying, searching, evaluating or designing a protein or compound having binding specificity, or searching and identifying a receptor thereof.
[0014]
That is, the present invention includes the following embodiments.
(1) Crystals of trimestatin.
(2) The crystal according to the above item (1), wherein trimestatin has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
(3) The crystal according to the above item (1) or (2), wherein the crystal is monoclinic and has a space group C2.
(4) The crystal according to the above item (3), wherein the unit cell of the crystal is a = 47.5 °, b = 48.1 °, c = 37.7 °, and β = 126.8 °.
(5) Trimestat shown in Table 1 for searching, designing, identifying or evaluating a mutant of trimestatin or a compound having an integrin inhibitory activity, or for searching or identifying a receptor thereof. Statin 3D structural coordinates.
(6) Using a model showing the three-dimensional structural coordinates described in the item (5) as an initial model, a trimestatin mutant having a structure with improved energy stability is obtained by molecular designing means. A method for determining the structure of a statin mutant.
(7) A compound having an integrin inhibitory activity having a structure with improved energy stability is obtained by molecular designing means using a model showing the three-dimensional structural coordinates described in the above item (5) as an initial model. Of determining the structure of a compound having an integrin inhibitory activity.
(8) (A) The above item (5) for searching, designing, identifying or evaluating a mutant of trimestatin or a compound having an integrin inhibitory activity, or for searching or identifying a receptor thereof. Three-dimensional structural coordinates described in
(B) Using the three-dimensional structural coordinates described in the above item (5) as a model, the mean square deviation between the position of the main chain and the Cα carbon of the main part of trimestatin determined by the molecular replacement method is 2 ° or less. Certain three-dimensional structural coordinates; and
(C) Three-dimensional structural coordinates of a protein or compound that gives a structure that is as energetically stable as possible obtained by molecular design means, using the model representing the three-dimensional structural coordinates described in the above item (5) as an initial model. ;
A storage medium for a computer that stores all or a part selected from.
(9) (a) three-dimensional structural coordinates according to item (5); (b) trimestatin determined by a molecular replacement method using the three-dimensional structural coordinates according to item (5) as a model Three-dimensional structural coordinates in which the mean square deviation from the main chain of the main part and the position of the Cα carbon is 2 ° or less; (c) a model that is the three-dimensional structural coordinates described in the above item (5) as an initial model; A three-dimensional structural coordinate of a protein or compound having a structure with improved energy stability by molecular designing means; or all or part of sequences selected from the three-dimensional structural coordinates, or the computer storage medium described in item (8) above. Insertion, deletion, modification or chemical modification of one or more amino acids based on the information provided, has integrin inhibitory activity and has high binding specificity Identifying a compound having a mutant or integrin inhibitory activity trimestatin characterized by having a step of designing the concrete, search, evaluation, or design, or a method of searching or identifying its receptor.
(10) Use of all or part of the three-dimensional structural coordinates according to any of the above items (5) to (9) in protein crystal structure analysis using a molecular replacement method, and the use of the above item (9). Use of the described computer storage medium.
[0015]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
In the present specification, amino acids, peptides and proteins are represented by the following abbreviations adopted by the IUPAC and IUB Biochemical Nomenclature Committee (CBN). Further, the amino acids of the protein represent the N-terminal to C-terminal directions from left to right.
A or Ala: alanine
V or Val: Valine
L or Leu: Leucine
I or Ile: Isoleucine
P or Pro: Proline
F or Phe: phenylalanine
W or Trp: tryptophan
M or Met: methionine
G or Gly: glycine
S or Ser: Serine
T or Thr: threonine
C or Cys: cysteine
Q or Gln: glutamine
N or Asn: Asparagine
Y or Tyr: tyrosine
K or Lys: lysine
R or Arg: Arginine
H or His: histidine
D or Asp: aspartic acid
E or Glu: glutamic acid.
[0016]
1. Crystallization of Tristatatin
Tristatatin used in the present invention is disintegrin contained in snake venom derived from Trimeresurus flavoviridis (Okuda, D. et al., J. Biochem., 130, 407-415 (2001): Non-Patent Document 12).
[0017]
X-ray crystal structure analysis is often used as a technique used to analyze the three-dimensional structure of a protein. X-ray crystal structure analysis is a method of crystallizing a protein and analyzing the three-dimensional structure of the protein from a diffraction image of the X-ray scattered by X-ray irradiation. Crystallization is a method in which proteins are precipitated as crystals by combining physicochemical factors related to solubility such as ionic strength, salt concentration, temperature, precipitant, and pH. The protein crystallization method includes a stationary batch method, a free interface diffusion method, a microdialysis method, and a vapor diffusion method. In crystallization, it is necessary to try various crystallization conditions and determine the best crystallization conditions (Wyckoff, HW, etc., Methods in Enzymology 114, Academic Press (1985): Non-Patent Document). Reference 13; Wyckoff, HW, et al., Methods in Enzymology 115, Academic Press (1985): Non-patent Reference 14).
[0018]
The crystal of trimestatin used in the present invention is prepared by the following method. First, it is necessary to purify trimstatin to high purity, which is performed by a method such as column chromatography alone or by combining different methods. Next, there is a method of crystallizing trimstatin, which can be performed by a batch method, a vapor diffusion method, a microdialysis method, or the like. Using these methods, it is further necessary to find optimal crystallization conditions. However, since it is a general fact that the same crystal can be obtained by other methods, even if a crystal of trimestatin having the same crystallographic constant is obtained, it is within the scope of the present invention.
[0019]
2. The coordinates of the three-dimensional structure of the Tristatin
The crystal of trimestatin shown in SEQ ID NO: 1 thus obtained was subjected to X-ray crystal structure analysis to clarify the three-dimensional structural coordinates. Tristatatin crystals are monoclinic and belong to the space group C2, and have lattice constants of a = 47.5 °, b = 48.1 °, C = 37.7 °, and β = 126.8 °. FIG. 3 shows the shape of the unit cell of the crystal. The three-dimensional structural coordinates of this crystal were first clarified by X-ray crystal structure analysis. The obtained structural coordinates are shown in Table 1 (Tables 1-1 to 1-17) in the Protein Data Bank format. Asp69 and Leu70 at the C-terminal among the 70 residues of trimestatin could not be seen on the electron density map. In Table 1, in order from the left, the first column indicates that this row indicates the atomic coordinates. The second column indicates the order of the atoms, the third column indicates the atomic name, the fourth column indicates the amino acid name, the fifth column indicates the identification code of the molecular chain, the sixth column indicates the order of the amino acid residues, and the seventh column indicates the order of the amino acid residues. , The ninth column represents the atomic coordinates of the X, Y, and Z axes in units of Å, the tenth column represents the occupancy of atoms, and the eleventh column represents the temperature factor.
[0020]
[Table 1]

[0021]
[Table 2]

[0022]
[Table 3]

[0023]
[Table 4]

[0024]
[Table 5]

[0025]
[Table 6]

[0026]
[Table 7]

[0027]
[Table 8]

[0028]
[Table 9]

[0029]
[Table 10]

[0030]
[Table 11]

[0031]
[Table 12]

[0032]
[Table 13]

[0033]
[Table 14]

[0034]
[Table 15]

[0035]
[Table 16]

[0036]
[Table 17]

FIG. 1 shows a detailed view of the three-dimensional structure coordinates of trimstatin obtained from the three-dimensional structure coordinates in Table 1 by computer graphics, and FIG. 2 shows a schematic diagram thereof. The peptide chain is elongated and tightly folded by six disulfide bonds, and the secondary structure is roughly composed of a series of turns and two short antiparallel β-sheets. The side chains of Arg49 and Asp51 in the RGD sequence point in opposite directions. Pro9, Pro12 and Pro23 of the five prolines are at the second position of the turn structure. The RGD sequence recognized by the integrin-type receptor is at the tip of a long, irregular 15 residue hairpin loop from Thr43 to Cys57. The antiparallel β-strand is slightly twisted due to the β-ridges at Asp55 on one strand and Cys45-Arg46 on the other strand. Both chains are linked by six hydrogen bonds, four of which are between the main chains, one is between the main chain and the side chains, and one is a hydrogen bond between the side chains. At the base of the hairpin loop, there are two disulfide bridges, Cys32-Cys57, Cys45-Cys64. The latter bridge turns the C-terminal region back to the RGD loop. This brings the indole ring of Trp67 into hydrophobic contact with Pro53. Another β-sheet is located in the center of the molecule, has a hydrogen bond in the sheet, and has a hairpin loop between Cys32-Lys39. The phenyl ring of Phe38, which is strictly conserved in disintegrin, is inserted between the methylene side chain of Gln26 and the main chain of Gln60-Ser61. Phe38 is thought to play a role as a pillar at the center of the molecule to reduce the relative movement between the N-terminal and C-terminal subdomains.
[0037]
Here, even if the crystal structure of the mutant of trimestatin substantially matches the crystal structure according to the present invention, it is within the scope of the present invention. Further, a mutant having the same integrin inhibitory activity as trimestatin obtained by deleting, substituting or adding one or several amino acids to the sequence of SEQ ID NO: 1 is also within the scope of the present invention. Furthermore, the starting position and the ending position of each sequence are not strict for the present invention, and those in which another protein is added to the N-terminus and C-terminus, and that one or more amino acid residues are present Those that do not cause a substantial change in the molecule of trimestatin, such as those added, are included in the present invention. In addition, those having a sugar chain bonded, a sugar chain being cleaved, and the like that do not substantially change the molecule of trimestatin are within the scope of the present invention. Substantially identical is a structure in which the mean square deviation of the position of the main chain or Cα carbon portion of the corresponding portion of the main portion of the structure is less than about 2 °. In the case where the three-dimensional structure coordinates of the present invention shown in Table 1 are used for calculation by a computer, for example, translation operations such as translation, rotation, and symmetry in a three-dimensional space without changing the relative arrangement of each atom. The new three-dimensional structure coordinates obtained as a result are also within the scope of the present invention.
[0038]
The structural coordinates in Table 1 represent the structure of trimestatin, and from the structure in Table 1, the binding mode of trimestatin to the integrin and the binding specificity can be elucidated, and it functions like a mutant of trimestatin, and functions like trimstatin, ie, Compounds having integrin activity can be identified, searched, evaluated or designed, or their receptors can be searched or identified.
[0039]
3. Use of computer for molecular design using three-dimensional structural coordinates of trimestatin
Representing the three-dimensional structure of trimstatin by inputting the three-dimensional structural coordinates obtained from the crystal of trimestatin into a computer running a computer program capable of expressing the three-dimensional structural coordinates of a molecule or a storage medium of the computer Becomes possible.
[0040]
The storage medium of the computer is not particularly limited as long as the structure coordinates obtained from the trimesterin can be led to a program. For example, a memory, a proppy disk, a hard disk, an optical disk, a magneto-optical disk, a magnetic tape, and the like.
[0041]
The three-dimensional structural coordinates of trimestatin in the present invention are input to a computer that is activated by a computer program capable of displaying the three-dimensional structural coordinates of a molecule, and the integrin inhibitory activity is determined by examining the visual and energy stability. It is possible to design mutants and compounds having high substrate specificity or structural stability.
[0042]
A commercially available computer program capable of displaying the three-dimensional structural coordinates of a protein molecule is preferably an input unit for inputting the three-dimensional structural coordinates of the molecule, and a computer screen using the input three-dimensional structural coordinates ( Display) to represent the three-dimensional structure of the protein, to measure the distance and bond angle between atoms in the represented molecule, and to add or modify 3D structural coordinates It can be composed of various parts such as a correction unit. Furthermore, based on the coordinates of the molecule, a molecular structure energy calculator for calculating the structural energy of the molecule and a free energy calculator for calculating the free energy in consideration of solvent molecules such as water molecules are additionally provided. May be provided. Note that the three-dimensional structural coordinates of the molecule may be stored in a storage device in the computer, and a program may be set so as to display this on a screen.
[0043]
For example, InsightII and QUANTA, which are computer programs sold by Accelrys, are examples of programs used for this purpose, but are not limited to these programs. The program is installed in a computer called a workstation sold by Silicon Graphics, Sun Microsystems, or the like, and is used, but is not limited thereto.
[0044]
One of the design methods of the mutants of Tristatin is a method of storing the three-dimensional structural coordinates of trimestatin according to the present invention in a computer or its storage medium, displaying the three-dimensional structure of trimestatin based on the coordinates, and performing a visual examination. . First, the three-dimensional structure coordinates of trimstatin are input to a computer, and the three-dimensional structure of the protein is displayed on the screen based on the coordinates. Then, one or more amino acid substitutions, deletions, insertions, and chemical modifications of the amino acids are performed on the three-dimensional structure, and the spatial conformation of the resulting compound is displayed on a computer to inhibit integrin inhibition. We will search for a more suitable structure as an agent. Although there are crystal eye, stereoscopic view, and stereo pair as a method of expressing a three-dimensional structure, the method of expressing a three-dimensional structure is not necessarily limited to these.
[0045]
Methods for designing mutants of Tristatin include, for example,
(1) displaying the three-dimensional structure of trimstatin on a computer screen based on the three-dimensional structural coordinates of trimstatin;
(2) Chemical modification of amino acids, such as substitution, deletion or insertion of one or more amino acids, or chemical substitution with a hydrophilic group, a hydrophobic group, or a peptide structure analogous compound on the three-dimensional structure of trimestatin displayed on the screen. A structural change process to be performed;
(3) displaying a spatial conformation accompanying the structural change on a screen;
(4) using the conformation to search for and determine a structure that functions as an integrin inhibitor;
Can be configured.
[0046]
As an apparatus for performing such processing, for example, a computer system having an arithmetic unit to which a storage device is added as necessary and a display capable of displaying various images in accordance with data and programs, is mainly used.
(A) means for displaying a three-dimensional structure of trimstatin on a computer screen based on three-dimensional structure coordinates of trimstatin;
(B) means for structural change by substitution, deletion or insertion of one or more amino acids, or chemical modification of amino acids on the three-dimensional structure of trimstatin displayed on the screen;
(C) means for displaying a spatial conformation accompanying the structural change on a screen;
(D) means for searching for and determining a structure that functions as an integrin inhibitor using the conformation;
Can be mentioned.
[0047]
Further, the energy stability can be obtained by calculating the energy of the structure of the visually searched compound. Energy stability can be evaluated based on binding energy and free energy. The energy calculation can be performed by using a computer program that performs a molecular force field calculation. Examples include, but are not limited to, the InsightII DISCOVER module. The energy stability of the compound can also be determined by molecular orbital calculation. Examples of programs for calculating molecular orbitals include, for example, GAUSIAAN 98, Q-chem, Inc. of GAUSIAAN. Q-chem, Accelrys's InsightII DMoL module, NEC's AMOSS, etc., but are not limited thereto. By searching for mutants using these visual and computational chemistry techniques, mutants with high structural stability can be obtained. In addition, by using the three-dimensional structural coordinates of the receptor and trimstatin to display and superimpose the three-dimensional structure on a computer, the trimstatin portion is mutated so as to stably and visually bind to the receptor. Thereby, a mutant having integrin inhibitory activity and binding specificity can be designed. There are no particular restrictions on the computer, computer program, and storage medium used at this time.
[0048]
Combination or repetition of the above methods (visual techniques, computational chemistry techniques, molecular design methods or means such as receptor binding models, etc.), also has integrin inhibitory activity, high binding specificity, and structural stability Mutants of trimestatin can be designed. In addition, it is possible to comprehensively perform a docking simulation using a computer using the three-dimensional three-dimensional structure coordinates of the proteins registered in the database to search for a receptor that stably binds to the mutant of trimestatin designed above. it can. As a program for performing docking simulation, ADAM (Yamada, M., et al., J. Mol. Biol., 243, 310-326 (1996): Non-Patent Document 15), DOCK, FTDOCK (Gabb, HA, et al., J. Mol. Mol. Biol., 272, 106-120 (1997): Non-Patent Document 16), NEC Corporation's AMOSS, and the like, but are not limited thereto.
[0049]
As a method of searching for a receptor, there is a method of displaying a three-dimensional structure of a ligand and a receptor on a computer and superimposing the three-dimensional structure on the computer to search for a visually optimal receptor. In addition, a receptor that stably binds energetically can be searched for by using molecular force field calculation or molecular orbital calculation.
[0050]
Receptors can also be searched for by combining these methods. There is no particular limitation on the computer or storage medium used at this time.
[0051]
4. Use of three-dimensional structural coordinates of trimestatin to design compounds with integrin inhibitory activity
By inputting all or a part of the three-dimensional structure coordinates of trimstatin shown in Table 1 according to the present invention to a computer and using a computer program, the results are as disclosed in JP-A-6-309385 (Patent Document 5). By such a method, the molecular structure of a ligand having biological activity can be determined from the three-dimensional structural coordinates of the ligand molecule. The method is not particularly limited as long as it is a method of designing a compound having activity by using the three-dimensional structural coordinates of the ligand molecule.
[0052]
Further, docking simulation can be comprehensively performed by a computer using the three-dimensional three-dimensional structure coordinates of the protein registered in the database, and a receptor that stably binds to the compound designed above can be searched. Examples of the program for performing the docking simulation include ADAM, DOCK, FTDOCK, and AMOS, but are not limited thereto. As a method of searching for a receptor, there is a method of displaying a three-dimensional structure of a ligand and a receptor on a computer and superimposing the three-dimensional structure on the computer to search for a visually optimal receptor. In addition, a receptor that stably binds energetically can be searched for by using molecular force field calculation or molecular orbital calculation. Receptors can also be searched for by combining these methods. There is no particular limitation on the computer or storage medium used at this time.
[0053]
5. Use of structural coordinates of trimestatin for X-ray crystallographic analysis by molecular replacement method
By using all or a part of the three-dimensional structure coordinates of trimestatin shown in Table 1 according to the present invention, a crystal containing all or a part of trimestatin or an amino acid sequence having significant homology with trimestatin can be obtained. Molecular replacement method (Lattman, E., Methods in Enzymology 115, Academic Press, 55-76 (1985)), which is used as one of the methods of X-ray crystallography such as crystal of protein having. Translated by Katsube Yukiki and Sasada Yoshio, J. Dorrent, Protein X-ray Crystallography, Springer Verlag Tokyo, 204-224 (1998) Non-patent Document 18) X-ray diffraction of protein crystal with unknown structure coordinates It is possible to determine the structural coordinates from structure factors derived from the image. When performing the molecular replacement method, a computer capable of starting a program used for the molecular replacement method is used. The program is, for example, AMoRe (CCP4 (Collaborative Computational Project, Number 4)), Acta Cryst., D50, 760-763 (1994): Non-Patent Document 19; Navaza, J., Acta Crystal. ): Non-Patent Document 20) There is a program included in a program package, but the program to be used is not limited to this program. Crystals to which the molecular replacement method can be applied using the three-dimensional structural coordinates of trimestatin according to the present invention include crystals containing all or part of trimestatin and having an amino acid sequence having significant homology with trimestatin. Crystals obtained from other proteins, complexes of trimestatin and compounds that bind trimestatin, those containing proteins with significant homology at amino acid residues to trimestatin, mutants of trimestatin and those containing it Crystals, or even crystals obtained from their composites. Significant homology generally refers to 20% or more, preferably 30% or more identity in the amino acid sequence allowing the inserted sequence. In a crystal of an unknown substance other than actually obtained from an X-ray diffraction image of the crystal, a structural analysis is performed by a molecular replacement method using all or a part of the three-dimensional structural coordinates of trimestatin shown in Table 1 according to the present invention. Is within the scope of the present invention when a significant solution is obtained.
[0054]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
[0055]
Example 1 Purification method of Tristatatin
The freeze-dried poison of Trimeresrus flavoviridis was purchased from Japan Snake Tribe Research Institute (Gunma Prefecture). The crude poison was dissolved in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), and the undissolved one was removed by centrifugation. The supernatant was fractionated by molecular sieving chromatography using Superdex 75 pg. Fractions were analyzed for the inhibitory activity of human platelets on ADP-induced coagulation. Active fractions were collected and applied to two types of columns, SP-Sepharose High Performance and reverse phase HPLC. The yield of Tristatatin was 4.2 mg / g of crude venom. The molecular weight of trimstatin on SDS-PAGE was 8 kDa under reduced and non-reduced conditions. Purity was estimated from 16% polyacrylamide electrophoresis by Coomassie Brilliant Blue staining.
[0056]
Example 2 Method of crystallizing trimstatin
The freeze-dried trimestatin protein sample was prepared to a concentration of 30.0 mg / ml. The crystallization conditions were searched by a micro-batch method using Crystal Screen kits 1 and 2 (Hampton Research). Generally, 0.4 μl of protein solution and 1.2 μl of screening solvent were mixed. The conditions were explored by a number of experiments and a single crystal (each 0.3 mm) of 0.5 μl protein solution was mixed with 0.6 μl of 30% polyethylene glycol and 0.6 μl of 0.1 M ammonium sulfate. At 293 K.
[0057]
Example 3 Tristatatin Diffraction Experimental Method
The crystals were immersed in a cryoprotectant (20% ethylene glycol provided under the same crystallization conditions) and then rapidly frozen in a 100 K liquid nitrogen stream. The complete 1.7 ° data set was obtained on a Photon Factory (High Energy Accelerator Research Organization), beamline BL6A (λ = 1.00 °). All data sets were processed using DPS / Mosflm. The statistics for data collection and refinement are as follows. Resolution range (Å): 30.0-1.7 (1.76-1.70), number of reflections in refinement: 7,538 (737), completeness (%): 99.8 (100.0) ), R factor (%): 18.9 (22.9), Rfree factor: 22.9 (27.8), where the value in parentheses indicates the resolution of the outermost angle.
[0058]
The number of atoms other than hydrogen atoms in the protein: 507, the number of water molecules: 147, the mean square deviation from the standard value is a bond length of 0.004 °, a bond angle of 1.2 °, and an average temperature factor of 23. .2Å ² It is.
[0059]
Example 4 Structure determination of trimestatin and the most precise method
The crystal of trimestatin was monoclinic and belonged to the space group C2, and had lattice constants of a = 47.5 °, b = 48.1 °, c = 37.7 °, and β = 126.8 °. The structure was solved by molecular replacement with AMoRe using the flavoridin NMR structure (PDB code 1fvl). In the first attempt, using 18 molecules of each of 1fvl as search models, many search parameters were used, but no significant solution was obtained. Next, the entire 1fvl (average of 18 molecules) was tried as a search model. Therefore, a certain B factor (20Å ² ) Were prepared for the following three models. All-atom model (search model consisting of all atoms), poly-AG model (search model in which amino acid residues other than glycine are replaced with alanine), poly-SAG model (amino acid residues other than glycine and alanine are replaced with serine) Search model). Molecular replacement by AMoRe package was performed using data between 15.0 and 3.5 ° resolution. The rotation function could not give a clear solution. The translation function was calculated using all the rotation function peak values, and one remarkable solution was obtained using all-atom model or poly-SAG model (poly-AG model did not give any clear solution). Obtained.
[0060]
This solution was evaluated by intracrystalline packing. The solution of molecular replacement using the All-atom model was subjected to torsional molecular dynamics refinement using the CNS program, using data between 15.0 and 1.7 ° resolution to find an R factor of 44.6%, The Rfree factor improved to 45.7%, respectively. This model was used as a starting model for the automatic modeling program ARP / wARP, and after 200 automatic modeling cycles, the R-factor had increased to 19.2%. Further, the model construction was performed by the program O. The model was refined in the CNS using 1.7 ° native data (statistics below in Example 4). According to PROCHEK, each residue in the refined model was within the acceptable range of the Ramachandran plot.
[0061]
Example 5 Method for Designing Integrin Inhibitor
The design of the integrin inhibitor can be designed according to the flowchart of FIG. In this flowchart, the optimal integrin inhibitor is obtained by inputting the three-dimensional structure of trimestatin into a computer, visually and energetically assessing the ability to bind to the receptor, and repeatedly performing molecular substitution and chemical modification. Design.
[0062]
Example 6 Method for reducing the interaction of integrin αVβ3 with trimestatin to prevent side effects
The docking simulation between Tristatatin and αVβ3 (PDB code IL5G) was performed using FTDOCK and a molecular simulation package Insight II 2000 (Accelrys). Tristatatin was used as a migrating molecule, while the partner domains of αV (residues: A1-A438) and β3 (residues: B111-B351) containing MIDAS sites were used as resting molecules. In the calculation, translation and rotation scanning were performed in a space having 214 grid units (grid point interval: 0.70 °) in one direction, and were limited by a surface completion elementary and an electrostatic filter. Empirical scoring was performed using residue-residue potentials. Restricting the distance between Tristatatin's Arg49 and Asp150 of the αV domain to 4.5 ° to select an appropriate complex model yielded a good candidate model with the best score. The energy minimization of the model means that the maximum force between each atom is 10 ^-4 Using the CVFF force field in the DISCOVER module of Insight II down to kcal / mol · Å. Calculations were performed in vacuum using a dielectric constant of 1.0. The coordinates of the main chain atoms were fixed, and the side chain atoms were constrained in the original model to avoid structural deformation. The omitted C-terminal residues Asp69 and Ile70 of trimestatin were added at the end.
[0063]
FIG. 5 shows a detailed view of the amino acid residues interacting between αVβ3 and trimstatin by computer graphics, and FIG. 6 shows a schematic diagram thereof. The positions of the guanidine group of Arg49 and the carboxyl group of Asp51 in the RGD sequence are in good agreement with those positions of the cyclic pentapeptide ligand bound to αVβ3. Therefore, Arg49 forms a salt bridge with Asp150 and Asp218 of the propeller domain and a hydrogen bond with Thr212, and Asp51 forms Mn by MIDAS (metal ion dependent adhesion site) of the βA domain. ²⁺ Directly bound to. The central residue, Gly50, does not interact with αVβ3. However, the cyclic pentapeptide Gly residue has some hydrophobic interactions with αV. This difference clearly comes from the difference in the main-chain conformation. The remaining two residues of the cyclic pentapeptide are not facing αVβ3 and do not interact. However, in the case of the native trimestatin ligand, other binding sites were found in this model. 1) Phe52 adjacent to the RGD sequence has a hydrophobic action with Tyr178 of the propeller domain and Tyr166 of the β3 domain. The cyclic pentapeptide contains Phe at this position. However, the side chains point in different directions due to conformational constraints due to cyclization and D-amino acids (D-Phe). 2) Pro53 interacts with Asp179 and Asp214 in the β3 domain. 3) The guanidinium group of Arg66 forms a salt bridge to Asp148 of the propeller domain, and also forms a salt bridge to Asp150. 4) Trp67 interacts with Asp148 of the propeller domain and Tyr166 and Asp179 of the β3 domain. 5) The side chain of Asn68 is hydrogen-bonded to Thr116, Lys119, Glu121, and Asp148 of the propeller domain. 6) The main chain of Asp69 is hydrogen-bonded with Lys119 of the propeller domain.
[0064]
The above-described interacting residues are not visually and energetically stably bound as shown in the flow chart of FIG. 7 (but keep the binding to GPIIb / IIIa), and the chemical modification is performed. By doing so, a mutant of trimestatin can be designed to weaken the binding to αVβ3 to prevent side effects and to strongly bind to GPIIb / IIIa.
[0065]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a three-dimensional structure diagram showing the three-dimensional structure of trimestatin by a main chain ribbon diagram. The two C-terminal residues have been omitted. The RGD sequence is labeled and the side chains are shown in a ball and stick diagram. The six disulfide bonds are shown in a ball and stick diagram. The figure uses MOLSCRIPT (Kraulis, J., J. Appl. Crystallogr., 24, 946-950 (1993)) and RASTER3D (Meritt EA, et al., Methods Enzymol., 277, 505-524 (1997)). Created.
FIG. 2 is a schematic diagram of the structure of trimstatin.
FIG. 3 is a diagram illustrating a unit cell of a crystal of trimestatin.
FIG. 4 is a flowchart of a method for designing an integrin inhibitor.
FIG. 5 is an enlarged three-dimensional view of an interaction site. The interacting residues are shown in the labeled ball and stick diagram. The figure was created using MOLSCRIPT.
FIG. 6 is a diagram showing the interaction of amino acid residues between trimestatin and αVβIII by connecting lines.
FIG. 7 is a flowchart of a method for preventing trimstatin from binding to αVβ3 to prevent side effects.

Claims

Crystals of trimestatin.

The crystal of claim 1, wherein trimestatin has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

The crystal according to claim 1 or 2, wherein the crystal is monoclinic and has a space group C2.

The crystal according to claim 3, wherein the unit cell of the crystal has a = 47.5 °, b = 48.1 °, c = 37.7 °, and β = 126.8 °.

Trimestatin 3D shown in Table 1 for searching, designing, identifying or evaluating a mutant of trimestatin or a compound having an integrin inhibitory activity, or for searching or identifying a receptor thereof. Structure coordinates.

A structure of a trimestatin mutant, characterized in that a trimestatin mutant having a structure with improved energy stability is obtained by molecular designing means using the model showing the three-dimensional structural coordinates according to claim 5 as an initial model. Decision method.

The integrin inhibitory activity characterized by obtaining a compound having an integrin inhibitory activity having a structure with improved energy stability by molecular design means, using the model showing the three-dimensional structural coordinates according to claim 5 as an initial model. Method for determining the structure of a compound having

(1) The method according to claim 5 for searching, designing, identifying, or evaluating a mutant of trimestatin or a compound having an integrin inhibitory activity, or for searching or identifying a receptor thereof. Dimensional structure coordinates;
(2) Using the three-dimensional structural coordinates described in claim 5 as a model, the mean square deviation between the main chain of the main part of trimestatin and the position of the Cα carbon determined by the molecular replacement method is 2 ° or less. And (3) a protein or compound obtained by molecular design means and giving a structure that is as energy-stable as possible, using the model showing the three-dimensional structure coordinates according to claim 5 as an initial model. Dimensional structure coordinates;
A storage medium for a computer that stores all or a part selected from.

(1) three-dimensional structural coordinates according to claim 5; (2) a main chain of a main part of trimestatin determined by a molecular replacement method using the three-dimensional structural coordinates according to claim 5 as a model; , Three-dimensional structural coordinates whose mean square deviation from the position of the Cα carbon is 2Å or less; (3) energetically stable by the molecular design means using the model that is the three-dimensional structural coordinates according to claim 5 as an initial model. A three-dimensional structural coordinate of a protein or a compound having a structure with improved affinity; one or more amino acids based on all or part of sequences selected from the information obtained from the computer storage medium according to claim 8; Having a step of designing a structure having integrin inhibitory activity and high binding specificity by inserting, deleting, modifying or chemically modifying the above. Identifying a compound having a mutant or integrin inhibitory activity trimestatin, wherein, search, evaluation, or design, or a method of searching or identifying its receptor.

Use of all or a part of the three-dimensional structure coordinates according to any one of claims 5 to 9 and use of the computer storage medium according to claim 8 in protein crystal structure analysis using a molecular replacement method.