【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、有効量のＰＩＩＩヘビ毒Ｚｎ−メタロプロテイナーゼ（ＳＶＭＰ）あるいはそれらのフラグメント、ペプチド、誘導体、同族体、又はミメティック、あるいはこれらの化合物の任意の１種類をコードする核酸を投与することを含む、線維芽細胞におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）発現を誘導する方法に関する。特に、本発明は、線維症又は硬化症の治療又は予防が必要な患者の治療又は予防のために上記化合物を使用することに関する。さらに、本発明は、生理学的有効量のＰＩＩＩ ＳＶＭＰ、好ましくはハララギン（ｊａｒａｒｈａｇｉｎ）、あるいは機能的に同等のそれらの誘導体を治療を必要とする患者に投与することを含む、患者の皮膚再建又は創傷治療方法に関する。さらに、本発明は、ＭＭＰの活性又は発現を調節する化合物のセルベースの同定及び単離方法、ならびに創傷治療を補助する抗癌薬及び抗癌剤の製造方法におけるその使用を含む。本発明は、以上のような方法の実施に有用なキット、及びＰＩＩＩＳＶＭＰ又は機能的に同等のそれらの誘導体を含む人工結合組織にも関する。
【０００２】
本明細書においていくつかの文献が引用される。ここで引用される各文献（製造元の仕様書、使用説明書を含む）を本明細書に援用するが、本発明に関してすべての引用文献が従来技術であるわけではない。
【０００３】
【従来の技術】
線維症、即ち線維組織又は瘢痕組織の過剰な形成は医学における大きな問題である。瘢痕組織は、動脈を遮断し、関節を動かなくし、内臓を損傷し、生体機能を維持する生体の能力を大きく混乱させる。
線維化は、手術後に癒着、ケロイド腫瘍、又は肥大性（非常に重篤な）瘢痕化の形態で発生しうる。線維化は、激しい衝突、創傷、又は整形外科的外傷の後で拘縮及び関節脱臼を引き起こし、あらゆる器官で発生する可能性があり、肝炎（肝硬変）、高血圧（心不全）、結核（肺線維症）、強皮症（線維性皮膚及び内臓）、糖尿病（腎症）、及びアテローム性動脈硬化症（線維状血管）などの多くの疾病状態を伴う。
皮肉なことに、身体を修復するために計画された過程自体が非常に危険な問題の原因となりうる。エポキシ樹脂のように、瘢痕組織は単に構造的な役割を果たしているだけである。これは間隙を充填するが、この組織が出現する器官の機能に寄与することはできない。例えば、高血圧で損傷した心筋が線維状の瘢痕組織で置き換えられると、心臓の弾性が低下し始め、そのため機能が低下する。同様に、肺線維症は肺を硬化させ、萎縮させ、生命を脅かしうる症状となる。また、線維の成長は広がり、元の外傷が治癒した後でさえも、それを取り囲む健康な組織に侵入する。このように瘢痕組織が多すぎるとこれらが生理学的な障害物となり、変形、肢体不自由、又は死亡の原因となる。
ほとんどの場合、線維化は反応性プロセスであり、いくつかの異なる要因が、組織を線維化へと導く経路を調節できることが明らかとなっている。このような要因としては、早期炎症反応、線維芽細胞集団の局所的増加、線維芽細胞の合成機能の変化、ならびにコラーゲンの生合成及び分解の制御の変化が挙げられる。
したがって、治療方法の一つは、早期炎症反応を対象としている。外用副腎皮質ホルモン剤を使用する治療は、早期の線維化に使用する場合に限って成功していた。しかしながら、ステロイド治療は、瘢痕組織がすでに形成されてからではほとんど又は全く効果がなかった。さらに、肺線維症などにおいてヒドロコルチゾンの投与が長期間に及ぶと、症状が悪化する場合がある。
第２の方法は、コラーゲン合成の増加に関与する細胞の増殖を鈍化させることである。一般にこれは、平滑筋細胞がコラーゲンの沈着を行う脈管構造を除けば線維芽細胞が関与する。
多数の治療法が、線維芽細胞又は平滑筋細胞の合成機能の調節に基づいて考案されてきた。ほとんどの細胞と同様に、線維芽細胞及び平滑筋細胞はサイトカイン（標的細胞の機能を修飾する影響に反応して分泌される因子）によって調節される。γインターフェロンは、線維芽細胞増殖及びコラーゲン合成を抑制することが知られているリンホカイン（リンパ球が産生するサイトカイン）である。同様に、モノカイン（マクロファージが産生するサイトカイン）のβ−インターフェロンも同じ機能を果たす。例えば、米国特許第５，３１２，６２１号は、これらのサイトカインの線維化の治療への使用を教示している。有望ではあるのだが、これらの物質及び組成物の多くは重大な副作用があることが知られており、そのため有効性が制限される。
さらに別の治療方針は、コラーゲン及び線維組織の他の成分の代謝に直接影響を与えることを含んでいる。例えば、コラーゲンの生合成、蓄積、及び異化を妨害する薬物が、線維化の治療に使用されてきた。多くの薬物がコラーゲン合成の阻害に使用されており、例えば、ピリドン、アルカジエン、ベンゾキノン、ピリジン、オキサリルアミノ酸、及びプロリン類似体の誘導体が挙げられる。しかしながら、これらの薬物のすべては、線維化中に生じる有害な合成を阻害するとともに、正常時の必要なコラーゲン合成も阻害するという欠点がある。別の方法として考えられるのは、線維組織及び／又は線維芽細胞に、ヒトメタロプロテアーゼ又はコラゲナーゼ、ヒトＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２などの治療遺伝子を送達することであって、これらは、沈着した過剰のコラーゲンタンパク質を分解し、及び／又はコラーゲンタンパク質の過剰な合成を抑制する。
【０００４】
線維芽細胞の天然Ｉ型コラーゲンへの付着は、α１β１及びα２β１インテグリン受容体によって調節される（１，２）。近年、Ｋｎｉｇｈｔら（３）は、三重らせんコラーゲンＩ型及びＩＶ型の配列ＧＦＯＧＥＲ（Ｏ，ヒドロキシプロリン）がα１β１及びα２β１の両方のインテグリンに認識されることを示した。いくつかの研究で、α鎖インテグリンサブユニットのＩ−ドメインのコラーゲン結合部位が特定されている。Ｉ−ドメインは約２００個のアミノ酸で構成され、フォンビルブラント因子Ａドメインと相同性を有する（４〜６）。
ヒト皮膚線維芽細胞が線維コラーゲンＩ型と接触するようになると、一連の事象が引き起こる。線維芽細胞に表現型組織様特性を獲得し、これはプラスチック上又はモノマーコラーゲンＩ型状上の単層培養で成長した線維芽細胞には見られない（７，８）。これらのコラーゲンフィブリルのゆるい網目構造に線維芽細胞が播種された場合、Ｉ型コラーゲンの発現が抑制され（９）、ＭＭＰ−１合成が誘導され（１０）、プロＭＭＰ−２が活性化される（１１）。さらに、α２β１インテグリンに結合したコラーゲンは、コラーゲンマトリックスの再構成及び収縮に寄与し（１２，１３）、ＭＭＰ−１合成を誘導する原因となる（１４，１５）ことが線維芽細胞に観察された。この系におけるＩ型コラーゲン合成の抑制は、コラーゲンがα１β１インテグリンと結合することが原因であった（１４）。最近、本発明者らは、ＭＭＰ−１以外に、ＭＴ１−ＭＭＰも、α２β１インテグリン受容体が線維コラーゲンと連結することによってｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルの両方で誘導されることを発見した（１６）。コラーゲン格子構造において、α２β１インテグリンの合成が増加される一方で、α１β１やα３β１などの別のコラーゲンインテグリン受容体の発現は影響を受けないことが分かった（１３）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、線維症の治療に極めて有用と考えられる、マトリックスメタロプロテイナーゼの発現を調節する有効物質が望まれており、また線維症ならびに癌、特にメラノーマなどの異常なコラーゲンの代謝回転を伴う他の疾患の治療に使用される物質の同定方法も望まれている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
実施態様の一つでは、本発明は、有効量のＰＩＩＩヘビ毒Ｚｎ−メタロプロテイナーゼ（ＳＶＭＰ）又はそのフラグメント、ペプチド、誘導体、同族体、若しくはミメティック（ｍｉｍｅｔｉｃ）、あるいはこららの化合物のいずれか一つをコードする核酸を投与することを含む、線維芽細胞におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の発現を誘導するための方法及び組成物を提供する。好ましい実施態様では、前記ＭＭＰは、ＭＭＰ−１又は膜型ＭＴ１−ＭＭＰ（ＭＭＰ−１４）である。ＭＭＰの発現を誘導する好ましい化合物は、ヘビ毒メタロプロテイナーゼハララギン、又はそのフラグメント、ペプチド、誘導体、同族体、若しくはミメティック化合物である。これらの物質は、医薬用担体又は賦形剤とともにｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで投与することができる。本発明の物質の好ましい実施態様は、治療の必要な患者に局所的に投与することができ、例えば、皮膚、特に肥厚性瘢痕及びケロイド（局所的皮内注射によって）、肺（例えば薬剤の吸入によって）、又は肝臓（肝灌流によって）に投与することができる。
【０００７】
好ましい実施態様では、本発明は、肝臓、肺、腎臓、及び心臓の線維化、アテローム性動脈硬化症、肝硬変、局所的及び系統的強皮症、ケロイド、肥厚性瘢痕、並びに増殖性硝子体網膜症などの線維症又は硬化症の治療方法又は予防方法を提供する。また、これらの方法に使用される組成物を提供する。好ましくは本発明の方法は、ＭＭＰの発現の誘導に十分な量のＰＩＩＩ ＳＶＭＰ、又はそのフラグメント、ペプチド、誘導体、同族体、若しくはミメティック、あるいはこれらの化合物のいずれか一つをコードする核酸を、治療又は予防を必要とする患者に投与することを含む。従って、本発明の組成物では、ＭＭＰの発現の誘導に十分な量の前記化合物又は核酸を含むことが好ましい。さらに別の実施態様では、本発明は、患者の皮膚再建方法又は創傷治療方法のためのこれらの化合物の使用に関する。
【０００８】
別の局面では、本発明は、ＰＩＩＩ ＳＶＭＰ、又はそのフラグメント、ペプチド、誘導体、同族体、若しくはミメティック、あるいは前述の規定の核酸の存在下で、候補となる化合物又は化合物の混合物の、ＭＭＰ活性又は発現を促進又は抑制する能力を調べる（評価する）ことを含む、ＭＭＰの活性及び発現を調節する化合物のセルベースの同定及び単離方法に関する。
さらに本発明は、線維症の進行を防止する化合物を同定するためのゲル収縮アッセイを提供する。概して、このアッセイは、試験化合物及びゲルの収縮を刺激する既知物質と細胞とを接触させ、試験化合物が存在しない場合と比べて、試験化合物が存在することでゲルの収縮が阻害されるかどうかを調べることを含む。この方法で単離される化合物は、ＰＩＩＩ ＳＶＭＰの媒介するＭＭＰ発現の誘導を増強又は抑制する化合物であり得、したがってそれらはそれぞれアゴニスト又はアンタゴニスト／阻害剤とされる。本発明のセルベースアッセイは線維芽細胞で行われることが好ましく、最も好ましくは皮膚線維芽細胞で行われる。
化合物がＭＭＰ活性を低下させるか、あるいは活性ＭＭＰ量を減少させることが分かれば、前記化合物は抗癌薬（好ましくはメラノーマの治療用）の製造に有利に使用される。別の実施態様では、この化合物は創傷治療を補助する薬剤の製造に使用することができる。
さらに本発明は、上述の方法及びアッセイの実施に有用なキットを提供する。さらに、本発明は、上記ＰＩＩＩ ＳＶＭＰ及び関連化合物の少なくとも１種類を含む人工組織を提供する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明は、血小板において観察さる現象とは対象的に、ハララギン（ｊａｒａｒｈａｇｉｎ）、ＰＩＩＩヘビ毒メタロプロテイナーゼ（ＳＶＭＰ）の一つの要素、及びいわゆるＡＤＡＭ（哺乳類タンパク質のディスインテグリン様及びメタロプロテイナーゼファミリー）に含まれる分子の同族体が、線維芽細胞のインテグリン受容体α２β１と結合して、ＭＭＰ１及びＭＴ１−ＭＭＰのアップレギュレーションなどのコラーゲン様細胞シグナル伝達を行うという知見に少なくとも一部が基づいている。したがって、このような毒メタロプロテイナーゼならびにそれらの活性フラグメント及び誘導体を、線維芽細胞におけるＭＭＰ発現の誘導に使用することができ、したがって線維症（一例として肥厚性瘢痕）などの異常なコラーゲン沈着と関連する疾患の治療に使用することができる。本発明は、線維芽細胞が線維状Ｉ型コラーゲンを主成分とする３次元マトリックスに組み込まれる細胞ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルの使用、並びにハララギンが他の種類の細胞と比較する場合のヒト皮膚線維芽細胞のコラーゲンに誘導される細胞活性の分子機序を研究するための有用なツールとなるという知見にも基づく。
したがって本発明の実施態様の一つは、有効量のＰＩＩＩヘビ毒Ｚｎ−メタロプロテイナーゼ（ＳＶＭＰ）又はそのフラグメント、ペプチド、誘導体、同族体、若しくはミメティック、あるいはこれらの化合物のいずれか一つをコードする核酸を含む、線維芽細胞でマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の発現を誘導する方法に関する。好ましくは前記線維芽細胞は皮膚線維芽細胞である。
【００１０】
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、亜鉛依存性細胞外エンドプロテイナーゼのファミリーである。これらは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）及び基底膜のすべての成分を分解させることができる。新しいタンパク質分解機能は、ミエリン塩基性タンパク質などの非マトリックス高分子の分解、α抗トリプシンの不活性化、ＥＣＭからの増殖因子の放出、及び細胞表面からの生体活性分子の開裂などで規定される。これらは、腫瘍浸潤及び転移、リウマチ及び変形性関節症、脈管形成、ならびに創傷治癒などの多数の病原過程と関与しており、例えばＳｋｉｌｅｓら、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８（２００１），４２５−４７４、Ｗｏｅｓｓｎｅｒ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２（２００２），３３−４９、Ｏｖｅｒａｌｌ ａｎｄ Ｌｏｐｅｚ−Ｏｔｉｎ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ ２（２００２），６５７−６７２を参照することができる。
【００１１】
ＭＭＰは、正常な発生、形態形成、ホメオスタシス、及び組織再形成において主要な役割を果たしている。したがって、ＭＭＰの発現又は活性を調節する化合物は、上記病原過程の治療に使用され得るし、及び／又は組織再形成を補助する物質として使用され得る。
【００１２】
ヘビ毒メタロプロテイナーゼ（ＳＶＭＰ）は、メタロプロテイナーゼのＲｅｐｒｏｌｙｓｉｎファミリー（Ｍ１３）に含まれる。タンパク質のＡＤＡＭ（ディスインテグリン様及びメタロプロテイナーゼ）／ＭＤＣ（メタロプロテイナーゼ、ディスインテグリン、システインリッチ）グループもＲｅｐｒｏｌｙｓｉｎファミリーに含まれる（１７）。ＳＶＭＰのＰＩＩＩクラス及びＡＤＡＭは、相同メタロプロテイナーゼ、ディスインテグリン、及びシステインリッチドメインを共有している（１８）。これらの類似性のため、ＳＶＭＰは、ＡＤＡＭ機能の早期モデルとして機能してきた。ＰＩＩＩ ＳＶＭＰは、細胞外マトリックスのタンパク分解、及び血小板のα２β１へのコラーゲンの結合を遮断することによる血小板凝集の阻害が可能であることが示されている（１７）。
Ｂｏｔｈｒｏｐｓ ｊａｒａｒａｃａの出血性メタロプロテイナーゼであるハララギンは、毒を受けた人に観察される局所性及び全身性出血の原因となる主要毒成分の一つである（１９）。ハララギンは、微小血管系の基底膜の成分及び止血に重要な一部の血漿タンパク質を分解することが示されている（２０，２１）。さらに、コラーゲンに誘導される血小板凝集を阻害することによって出血を促進する（２２）。この毒に関して、ハララギンのメタロプロテイナーゼドメインは、タンパク分解過程によって、ハララギンのディスインテグリン及びシステインリッチドメインのフラグメントであるハララギン−Ｃを生成する。α２β１インテグリンは、ハララギン−Ｃとも相互作用可能であるが、この相互作用はハララギンとの相互作用より弱いと思われ（２３）、これはさらなるＮ−末端構造のハララギン−α２β１結合との関与を示唆している。興味深いことに、ハララギンのメタロプロテイナーゼドメインの配列に基づいた合成ペプチドは、組換えα２インテグリン鎖のＩ−ドメインと結合し、それによってα２−ＩドメインのコラーゲンＩ及びＩＶへの結合、ならびにラミニン−１への結合が防止されることが示されている（２４）。
本発明によると、線維コラーゲンの線維芽細胞との相互作用を模倣して、インテグリンα２β１、ならびにマトリックスメタロプロテイナーゼＭＭＰ−１及びＭＴ１−ＭＭＰの発現を調節するハララギンの能力を詳細に調べた。血小板に対して行われた従来の研究とは対照的に、線維芽細胞と結合するハララギンによって、α２β１インテグリンを介して結合した線維状Ｉ型コラーゲンによって誘導される細胞活性と同様の細胞活性が得られた。これらの結果によると、他のディスインテグリン様／システインリッチドメインを含有するするタンパク質（例えばＡＤＡＭ）は、従来示されているようにインテグリンと結合できるだけではなく、遺伝子及びタンパク質の発現などの細胞の活動を変化させる信号をインテグリンを介して発生し、ハララギンと同一ではないかもしれないが同様の生物活性を示すと予想される。
【００１３】
前述したように、ハララギンは、ＭＭＰ−１及びＭＴ１−ＭＭＰ発現を調節することが示された。したがって、ＰＩＩＩ ＳＶＭＰ又はそれから誘導される化合物は、ＭＭＰ−１及び／又は膜型ＭＴ１−ＭＭＰ（ＭＭＰ−１４とも呼ばれる）の発現を調節可能であることが好ましい。本発明は、ＰＩＩＩ ＳＶＭＰ（好ましくはハララギン）から誘導されるフラグメント、ペプチド、又は誘導体、同族体、類似体、若しくはミメティックの使用にも関する。ハララギンのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は当業者には公知であり、前述の文献及び参考文献の項を参照されたい。これらの配列はＧｅｎＢａｎｋよりＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． Ｘ６８２５１ Ｓ４９３８５（Ｖｅｒｓｉｏｎ Ｘ６８２５１．１ ＧＩ：６２４６７）で入手可能であり、Ｐａｉｎｅら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（１９９２），２２８６９−２２８７６）によって公開されている。同様に、血小板のコラーゲンへの付着を阻害するＣｒｏｔａｌｕｓ ａｔｒｏｘ（ニシダイヤガラガラヘビ）のヘビ毒タンパク質であるカトロコラスタチン（ｃａｔｒｏｃｏｌｌａｓｔａｔｉｎ）のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列も、ＧｅｎＢａｎｋよりＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． Ｕ２１００３（Ｖｅｒｓｉｏｎ Ｕ２１００３．１ ＧＩ：７１０３５３）で入手可能であり、Ｚｈｏｕら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０７（１９９５），４１１−４１７）によって公開されている。
【００１４】
好ましくは、これらの誘導体の任意の一つは、ハララギンのアミノ酸配列と少なくとも４０％類似、より好ましくは６０％、さらにより好ましくは８０％類似した、あるいは同一のアミノ酸配列を有し、その誘導体は実施例に記載されるようにＭＭＰ発現を調節することができる。前記ＰＩＩＩ ＳＶＭＰ及びフラグメントに加えて、又は代替的に、そのペプチド、誘導体、同族体、又はミメティックも、α２β１インテグリン受容体の結合に関して未変性ハララギンと競合可能である。ハララギンに関する発見によると、前記結合がα２β１インテグリンの可溶性外部ドメインで行われることが好ましい。ハララギンと十分に結合することができる化合物を検出するための競合アッセイを実施例に従って設計することができる。比較ウィンドウをアライメントするための最適な配列のアライメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２（１９８１），４８２の局所的相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８（１９７０），４４３の相同性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．ＳＡ．）８５（１９８８），２４４４の同様の方法の研究、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０によるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、あるいは選択した種々の方法で得られる検定及び最適なアライメント（すなわち、比較ウィンドウにわたって相同性の比率が最大となる）によって実施することができる。好ましくは、同一ではない残基の位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。保存的アミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基と交換可能であることを意味する。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループは、セリン及びトレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、アスパラギン及びグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループは、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループは、リジン、アルギニン、及びヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、システイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換のグループは、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンである。好ましくは、前記フラグメント、誘導体、同族体、類似体、又はミメティックは、それら自体がペプチド化合物である。
【００１５】
用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」は本明細書では互いに交換可能に使用される。しかしながら好ましくはペプチドは、約２アミノ酸残基〜約５０アミノ酸残基を含むタンパク質性分子を含む。ハララギンのインテグリン結合モチーフはこれまでのところ知られていない。しかしながら、α２β１と結合可能な約８アミノ酸のペプチドが報告されている。このペプチドは、Ｉｖａｓｋａらにより記載されているようにハララギンのメタロプロテイナーゼドメイン中に存在する配列モチーフＲＫＫＨを有する（２４）。
好ましくは、本発明におけるペプチドは約３アミノ酸残基〜約４０アミノ酸残基を有する。さらにより好ましくは、本発明におけるペプチドは約４アミノ酸残基〜約３０アミノ酸残基を有する。特に好ましい本発明の実施態様は、約４アミノ酸残基〜約２０アミノ酸残基（例えば４〜１５アミノ酸残基及び６〜８アミノ酸残基）を有するペプチドを含む。前記ペプチドのアミノ酸配列はヘビ毒から誘導されるかこれに基づくものであるが、ヘビ毒の全長に必ずしも対応するわけではなく、むしろその一部分である。
前記ペプチドは、グリコシル化又は非グリコシル化される場合があるし、及び／又は縮合、架橋、結合、又はペプチドと関連するその他の方法である範囲の他の分子を含むこともあり、例えば、アミノ酸、脂質、炭水化物、又は他のペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質を含みうる。本明細書において「ペプチド」を使用する場合は、あるアミノ酸配列を有するペプチド、ならびにアミノ酸、脂質、炭化水素、又は他のペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質などの他の分子と関連するペプチドを含む。本発明の説明では、少なくとも約５０個のアミノ酸配列を有する分子をペプチドと見なす。
本発明のペプチドについては、化学合成技術によって生成することができ、あるいは後に詳述する組換えＤＮＡ技術によって生成することもできる。本発明のペプチドは、ヘビ毒由来のより大きな分子のフラグメントであってもよい。フラグメントは天然のフラグメントの場合もあるし、あるいはプロテアーゼ、ペプチダーゼ、アミダーゼ、溶解素、又は他の酵素の作用、ならびに超音波破壊、熱、化学的破壊、及び／又は剪断によって得られる場合もある。
ＰＩＩＩ ＳＶＭＰのペプチドのアミノ酸配列は、ヘビ毒トキシン、より具体的にはハララギンから誘導されるかこれに基づくものと考えられている。しかしながら、これは、好ましいペプチドが天然のヘビ毒トキシの誘導体であることを必ずしも意味するわけではなく、本発明によると特に有用なペプチドは、より大きなヘビ毒トキシンのアミノ酸配列に基づいて化学合成される。好ましいヘビとしては、Ｂｏｔｈｒｏｐｓ属及びＣｒｏｔａｌｕｓ属などのＶｉｐｅｒｉｄａｅ科及びＣｒｏｔａｌｉｄａｅ科のヘビが挙げられる。特に好ましいヘビは、Ｂｏｔｈｒｏｐｓ ｊａｒａｒａｃａ及びＣｒｏｔａｌｕｓ ａｔｒｏｘである。
【００１６】
前述したように、血小板でみられるのとは対照的に、線維芽細胞中でインテグリン受容体α２β１と結合したハララギンが、ＭＭＰ−１及びＭＴ１−ＭＭＰのアップレグレーションなどのコラーゲン様細胞のシグナル伝達を引き起こすことが示されている。メタロプロテイナーゼドメインを不活性化しても、ハララギンのこのような性質には影響しなかった。したがって線維芽細胞では、ヘビ毒メタロプロテイナーゼハララギンは、インテグリンと結合しこれを活性化させるコラーゲン−模倣的（ミメティック）基質として機能する。メタロプロテイナーゼ、ハララギンディスインテグリン様及びシステインリッチドメイン、及びＡＤＡＭ（ディスインテグリン様及びメタロプロテイナーゼ）タンパク質ファミリー内の分子間に相同性があると仮定すると、本発明は、これらのタンパク質の生物学的機能と関連する応答を誘導する細胞シグナル伝達物質としてのＡＤＡＭ中のディスインテグリン様／システインリッチドメインの能力を示す。毒タンパク質のＰ−ＩＩＩクラスに関して記載したドメイン構造以外に、ＡＤＡＭは上皮増殖因子様ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインを有する。これらのドメインは本発明による使用に必ずしも必要であるわけではなく、そのため使用されなくてもよいし、他の機能ドメインで置き換えられてもよい。毒メタロプロテイナーゼ構造、ならびに毒タンパク質、及びタンパク質のＡＤＡＭファミリーの間の類似性及び相違に関する説明は、例えば、Ｊｉａら，Ｔｏｘｉｃｏｎ ３４（１９９６），１２６９−１２７６に記載されている。ＡＤＡＭタンパク質とそれらのＰＩＩＩ ＳＶＭＰとの関係は当業者には周知であり、例えば、Ｃａｌｖｅｔｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９（２０００），１３６５−１３７３に記載されている。ＡＤＡＭのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列はｗｗｗ（ｗｏｒｌｄ ｗｉｄｅ ｗｅｂ）及びＧｅｎＢａｎｋから容易に入手可能である。例えば、公知のＡＤＡＭのＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．及び配列のアラインメントにアクセスでき、頻繁に更新される３つのウェブサイトが、Ｈｏｗａｒｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３４８（２０００），２１−２７の導入部分に記載されており、この記載内容を本明細書に援用する。この発見は、最近発表されたＢｒｉｄｇｅｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（２００２），３７８４−３７９２によってさらに支持されており、この文献はＡＤＡＭファミリーの一員とインテグリンα４β１の相互作用を報告している。したがって、本発明において使用可能なＰＩＩＩ ＳＶＭＰの前記同族体は、ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）に属するものであってもよい。ＡＤＡＭタンパク質の同族体、誘導体、突然変異タンパク質、又は同等物の調製方法も当業者には公知であり、例えば、ＷＯ９７／４００７２号（この記載内容を本明細書に援用する）を参照されたい。ＷＯ９７／４００７２号に記載のベクター及び宿主細胞も、前述のタンパク質の発現に使用することができる。
【００１７】
実施例で示すように、ＰＩＩＩ ＳＶＭＰハララギンは、メタロプロテイナーゼ活性非存在下に観察される生物学的活性に影響を与える。したがって、あるＰＩＩＩ ＳＶＭＰのこの特定の活性は停止され得る。あるいは、プロテイナーゼドメインの一部又は全体を削除又は置換することができる。ここにおいて、ＰＩＩＩ ＳＶＭＰのディスインテグリン様／システインリッチドメインは、α２β１インテグリンとの結合に関与し、そのため、マトリックスメタロプロテイナーゼ発現の誘導及びコラーゲン格子の収縮の遅延に最も影響するであろうということが示されている。したがって本発明の方法では、少なくともＰＩＩＩ ＳＶＭＰのディスインテグリン様／システインリッチドメインを使用すれば十分であると考えられる。したがって、ＰＩＩＩ ＳＶＭＰの前記のフラグメント、ペプチド、誘導体、同族体、類似体、又はミメティックは、これらのドメインを有するか、これらのドメインの少なくとも一部を有するか、これらのドメインから誘導されるか、あるいはこれらの構造に基づいて設計されることが好ましい。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「誘導体」は、対象となるＰＩＩＩ ＳＶＭＰ（特にハララギン）の一部、フラグメント、及び部分を含む。また、誘導体は、一つ又は複数のアミノ酸置換、欠失及び／又は付加を含んでいてもよい。同族体（ホモローグ）は、同じ種のヘビ又は同じ属又は科のヘビの毒と、機能的、構造的、又は立体化学的に類似の（ポリ）ペプチドを含む。あるいは、元のＰＩＩＩ ＳＶＭＰポリペプチドの一部のアミノ酸は、類似の電荷、空間配置、コンフォメーション、又はペプチドコンフォメーションへの影響性、を有するアミノ酸で置換されていてもよい。これらのすべての同族体が本発明で考慮されるものである。類似体及びミメティックとしては、非天然アミノ酸を含有する分子、又はアミノ酸を含有しないが実施例に記載のアッセイでＰＩＩＩ ＳＶＭＰと同じ機能を示す分子を有する分子が挙げられる。天然物スクリーニングは類似体及びミメティックを同定するための有用な方法の一つである。しかし、本発明で考慮の対象となるＰＩＩＩ ＳＶＭＰの類似体では、側鎖の修飾、（ポリ）ペプチド合成中の非天然アミノ酸及び／又はそれらの誘導体の導入、及び架橋剤の使用、（ポリ）ペプチド分子又はそれらの類似体の立体配座を制約する他の方法の使用も考慮される。
本発明で考慮される側鎖修飾の例としては、アミノ基の修飾が挙げられ、例えば、アルデヒドと反応させた後でＮａＢＨＬ４と反応させることによる還元的アルキル化、メチルアセトイミデートによるアミジン基転移、無水酢酸によるアシル化、シアネートによるアミノ基のカルバミル化、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミノ基のトリクロロベンジル化、無水コハク酸及び無水テトラヒドロフタル酸によるアミノ酸のアシル化、及びピリドキサル−５−リン酸と反応させた後ＮａＢＨ４と反応させるリジンのピリドキシル化が挙げられる。可能なさらに別の修飾、ならびにペプチド及びペプチド類似体の好適な生成方法は、例えば、Ｇｏｏｄｍａｎら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ４７（１９９８），１２７−１４２、ＷＯ９９／２４０５５号、及びＷＯ９９／５０２８１号に記載されており、これらの記載内容は本明細書に援用される。
さらに本発明では、ＭＭＰのアンタゴニスト又はアゴニストとして作用しうる、対象ＰＩＩＩ ＳＶＭＰの化学的類似体を用いることもできる。化学的類似体は必ずしも前記ペプチド自体から誘導される必要はないが、コンフォメーション的にある程度の類似性を有する場合がある。例えば、本発明における類似体は、ハララギンの結合部位のエピトープの内部構造を表す抗体又は抗イディオタイプ抗体によって表される。このような抗体又はこれらに対応する結合部位は特に重要である。なぜなら、実施例１及び２に示されるように、公知のα２及びβ１抗体はハララギンの受容体との結合を完全には阻害せず、ハララギンの結合が２価の陽イオンの存在に依存しないように思われる観察と合わせて考えると、ハララギン、及び受容体分子上のコラーゲンに対する結合部位が異なる可能性を示唆しているからである。したがって、ハララギンのα２β１インテグリンへの結合を模倣する抗体又は対応する結合分子は、本発明の方法に特に有用であると予想される。抗体及び抗イディオタイプ抗体の調製方法は当業者には公知であり、例えばＶｏｇｅｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９（２００２），７２９−７３５を参照されたい。あるいは、ＰＩＩＩ ＳＶＭＰの特定の生理学的性質を模倣するように化学的類似体を特異的に設計することもできる。化学的類似体は、化学合成することもできるし、あるいは天然物スクリーニングなどで検出することもできる。
【００１９】
本明細書では実施態様のほとんどは、ＰＩＩＩ ＳＶＭＰ、特にハララギン、及びそれらの誘導体を例として説明される。しかしながら、これらの説明は、前述のフラグメント、ペプチド、同族体、類似体、及びミメティック化合物、ならびにこれらの化合物のいずれか一つをコードする核酸にも適用される。
【００２０】
さらに別の局面では、本発明は、患者の線維症又は硬化症を治療又は予防する方法に関し、ＰＩＩＩ ＳＶＭＰ、又はそのフラグメント、ペプチド、誘導体、同族体、若しくはミメティック、あるいは前述の核酸の、患者の線維症又は硬化症の治療又は予防に有効な量を、患者に投与することを含む。また、本発明は、患者の線維症又は硬化症の治療又は予防に使用される組成物に関し、当該組成物はＰＩＩＩ ＳＶＭＰ、又はそのフラグメント、ペプチド、誘導体、同族体、若しくはミメティック、あるいは前述の核酸を、患者の線維症又は硬化症の治療又は予防に有効な量だけ含有する。
【００２１】
実施態様の一つでは、ＰＩＩＩ ＳＶＭＰ又はその誘導体が最初にｉｎ ｖｉｔｒｏで生成され、次に細胞又は必要とする患者に投与される。別の実施態様では、ＰＩＩＩ ＳＶＭＰをコードする核酸、又は前記核酸を発現する細胞、又は誘導体が、細胞又は必要とする患者に投与される。
典型的には、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＰＩＩＩ ＳＶＭＰ タンパク質の発現に使用される発現ベクターは少なくとも一つの転写制御配列の制御下に結合させたＰＩＩＩ ＳＶＭＰ又はその誘導体をコードする核酸を含む。制御配列は、その技術分野では公知であり、所望の方式（時間及び場所）で対象のタンパク質を直接発現するように選択される。転写制御配列は例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。外来タンパク質の発現に好適なベクターとしては、ｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミド、及びｐＵＣ由来プラスミドなどを例示でき、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞での発現に使用される。
好ましい哺乳動物発現ベクターは、細菌中でのベクターの増殖を促進するために原核細胞の配列を有し、真核細胞で発現する一つ以上の真核生物の転写ユニットも有する。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏ、及びｐＨｙｇに由来するベクターが、真核細胞のトランスフェクションに好適な哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターの一部は、原核細胞と真核細胞の両方において複製と薬剤耐性選択を促進するために、ｐＢＲ３２２などの細菌プラスミドの配列によって修飾される。あるいは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）、又はエプスタイイン・バール ウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来、及びｐ２０５）などのウイルスの誘導体も、真核細胞のタンパク質の一過性の発現に使用することができる。プラスミドの調製及び宿主生物の形質転換に使用される種々の方法が当技術分野では公知である。原核細胞と真核細胞の両方に対して好適な他の発現系、ならびに一般的な組換え方法については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＣｌｏｎｉｎｇＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ．，ｅｄ．、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ、及びＭａｎｉａｔｉｓ編著（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：１９８９）Ｃｈａｐｔｅｒｓ １６及び１７を参照されたい。
好ましい実施態様では、プロモーターは構成性プロモーターであり、例えば強いウイルス性プロモーターであり、例えばＣＭＶプロモーターである。プロモーターは、所定の細胞（例えば、専門的には抗原提示細胞）のみでＤＮＡの実質的な転写が起こる細胞特異的又は組織特異的であってもよく、例えば、線維芽細胞又は平滑筋細胞、網膜細胞又はＲＰＥ細胞に特異的なプロモーターであってもよい。線維芽細胞に対して比較的特異的なプロモーターはα２（Ｉ）コラーゲンプロモーター（骨細胞中にも存在する）であると考えられる（Ｚｈｅｎｇら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６０（２００２），１６０９−１６１７、Ａｎｔｏｎｉｖ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１），２１７５４−２１７６４を参照されたい）。平滑筋に特異的なプロモーターは、例えば、平滑筋細胞マーカーのＳＭ２２ａｌｐｈａのプロモーターである（Ａｋｙｕｒａら，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６（２０００），９８３）。網膜色素上皮細胞に特異的なプロモーターは、例えば、Ｒｐｅ６５遺伝子のプロモーターである（Ｂｏｕｌａｎｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（２０００），３１２７４）。プロモーターは誘導性プロモーターであってもよく、例えばメタロチオネインプロモーターであってもよい。他の誘導性プロモーターとしては、転写因子の誘導性結合又は活性化によって制御されるプロモーターが挙げられ、例えば、Ｃｒａｂｔｒｅｅらの米国特許第５，８６９，３３７号及び第５，８３０，４６２号（小分子誘導性遺伝子発現（遺伝子スイッチ）が記載されている）、国際特許出願ＷＯ９４／１８３１７号、ＷＯ９６／０６１１１号、ＷＯ９６／４１８６５号などに記載されており、またＢｕｊａｒｄらによる報告のテトラサイクリン系制御などの他の異種転写系も挙げられ、これはアロステリック「オフスイッチ」と一般に呼ばれており、Ｇｏｓｓｅｎ ａｎｄ Ｂｕｊａｒｄ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９（１９９２），５５４７）及びＢｕｊａｒｄらの米国特許第５，４６４，７５８号、第５，６５０，２９８号、及び第５，５８９，３６２号に記載されている。その他の誘導性転写系としては、ステロイド又は他のホルモン系の制御が挙げられる。
核酸を、別の物質をコードする別のＤＮＡ配列（前記核酸と同一又は異なるＤＮＡ分子であってよい）とともに発現するように細胞中に導入することもできる。具体的な物質は後に詳述する。実施態様の一つでは、ＤＮＡは、そのＤＮＡの転写のポリメラーゼをコードし、ポリメラーゼの認識部位を含むことができ、注射製剤は初期量のポリメラーゼを含むことができる。
場合によっては、ポリペプチドの送達が一過的となるように制限された時間で核酸が翻訳されることが好ましい。これは、例えば、誘導性プロモーターを使用することで実現可能である。
本発明で使用される核酸は、化学合成によってその一部又は全体を作製することもでき、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔｓ．２２（１９８１），１８５９−１８６２に記載のホスホラミダイト法、又はＭａｔｔｅｕｃｃｉら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ，Ｓｏｃ．１０３（１９８１），３１８５に記載の方法によるトリエステル法によって生成することができ、市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置で実施することもできる。二本鎖フラグメントは、化学合成による１本鎖生成物から得ることができ、相補鎖を合成し適切な条件下で互いの鎖をアニールするか、あるいは適切なプライマー配列を有するＤＮＡポリメラーゼを使用して相補鎖を合成することによって得ることができる。
すべての必要な転写及び翻訳制御要素と作動可能なように結合した核酸は、裸のＤＮＡとして患者に注射することができる。好ましい実施態様では、核酸及び必要な制御要素は、プラスミド又はベクター中に存在した状態で使用される。したがって、本発明の核酸は、非複製性のＤＮＡであってもよいが、レプリケーターをさらに含みうるプラスミドに挿入される。ＤＮＡは、宿主細胞ゲノムに組み込まれないように設計された配列であってもよい。
本発明により使用される好ましいベクターは、発現ベクターであり、すなわち、細胞中での核酸の発現を可能にするベクターである。好ましい発現ベクターは、細菌中でのベクターの増殖を促進するための原核生物の配列と、真核細胞中で発現する真核生物の一つ以上の転写ユニットとの両方を含む発現ベクターであり、前述を参照されたい。哺乳動物（ヒト又は非ヒト）に核酸を導入のための任意の手段を、本発明の実施において、種々のベクターを目的のレシピエント内に運搬することに利用できる。本発明の実施態様の一つでは、トランスフェクションによって、すなわち「裸の」ＤＮＡ又はコロイド分散系との複合体のデリバリによってベクターが細胞に導入される。コロイド系としては、高分子錯体、ナノカプセル、ミクロスフィア、ビーズ、ならびに水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームなどの脂質系が挙げられる。このような送達システムは、ＰＩＩＩ ＳＶＭＰタンパク質、そのペプチド、及び誘導体に使用することもできる。本発明の好ましいコロイド系は、脂質複合ＤＮＡ又はリポソームが配合されたＤＮＡである。前者の方法では、ＤＮＡの形成の前に、例えば、所望のＤＮＡコンストラクトを有する導入遺伝子を含有するプラスミドに脂質を加えたものを、まず発現に対して実験的に最適化させる（例えば、５’非翻訳領域にイントロンを導入し、不要な配列を除去する（Ｆｅｌｇｎｅｒら，Ａｎｎ．ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９５）１２６−１３９））。次にＤＮＡの構築（例えば種々の脂質又はリポソーム材料との配合）を公知の方法及び材料によって実施し、宿主哺乳動物に導入することができ、例えば、Ｃａｎｏｎｉｃｏら，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０（１９９４）２４−２９、Ｔｓａｎら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６８、Ａｌｔｏｎら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．５（１９９３），１３５−１４２、及びＣａｒｓｏｎらのコロイド分散系（米国特許第５，６７９，６４７号）を参照されたい。
本発明の好ましい方法では、ウイルスベクターが使用される。導入遺伝子は、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、及び単純ヘルペスウイルス−１、あるいは組換え細菌又は真核生物プラスミドなどの遺伝子治療に有用な種々のウイルスベクターに組込まれて使用される。種々のウイルスベクターを本発明の実施に使用できるが、ＡＡＶ及びアデノウイルスを利用した方法が特に重要である。このようなベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏ、特にヒトへの外因性遺伝子の移入に好適な組換え遺伝子導入（送達）システムであると一般に理解されている。ウイルスベクターの選択及び使用に関する以下のさらなる手引きは本発明の実施に有用である。後に詳述するように、対象となる発現コンストラクトのこのような実施態様は、種々のｉｎ ｖｉｖｏ及びｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療プロトコルで特に使用され得る。
例えば肝硬変、及び全身性線維化（例えば腎線維症、肺線維症、肥厚性瘢痕、及び皮膚のケロイド）、及び／又はそれに罹患する可能性のある他の目標臓器の治療に有用な治療タンパク質をコードする外因性遺伝子の発現に使用することができるベクターが、例えばＷＯ０１／２１７６１号に記載されている。
【００２２】
組換えベクターの好ましい使用方法は、静脈内投与による方法であり、これは治療的有効量が線維症の患者に好都合な単位投与計画で投与される。この投与計画は、疾患の程度によって調節され得る。一般にウイルスベクターの場合、患者当たり約１０１０個のウイルス粒子が単位用量で使用される。組換えベクターを含む医薬化合物の調製は、従来の医薬上許容される担体と組み合わせて当業者には周知の標準的な技術を使用して行うことができ、従来の医薬上許容される担体としては、デンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゲル、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、グリセリルモノステアレート粉末、ＮａＣｌ、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール、及びこれらに類似したものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの化合物は、溶液、懸濁液、丸剤、錠剤、カプセル、散剤、徐放性処方などの薬剤形態を取りうる。
【００２３】
患者の線維症又は硬化症の治療又は予防のための本発明による別の方法は細胞治療プロトコルを含む。例えば、これらの化合物を長期持続的に全身に送達するために、ＰＩＩＩ ＳＶＭＰ又はその誘導体を発現するように遺伝子操作された皮膚線維芽細胞を使用することができる。治療抗体のｉｎ ｖｉｖｏ産生及び全身への送達のための対応する方法は、例えば、Ｎｏｅｌら，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１５（２０００）７４０−７４５に記載されている。同様に、この方法は、後にさらに詳述する本発明の方法により同定及び単離されたＭＭＰ拮抗化合物の送達に使用することができる。
【００２４】
タンパク質又はペプチド材料を使用する場合、好適なプロモーター及び他の適切な転写制御要素を有する発現ベクターへの分子クローニングを行うことで、本明細書に記載のＰＩＩＩ ＳＶＭＰ又はその誘導体をコードするクローン化核酸をリコンビナント発現させ、原核生物又は真核生物宿主細胞に移行させ、これによって組換えタンパク質を産生させることができる。このような操作方法は、前述のＳａｍｂｒｏｏｋらの文献に詳述されており、当技術分野では公知である。発現ベクターは本明細書に記載されており、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌、ラン藻類、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞などの真菌細胞、及び動物細胞などの種々の宿主での真核生物遺伝子の発現に使用することができる。発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、プロトプラスト融合、リポフェクション、及びエレクトロポレーションから任意に選択される方法で宿主細胞に導入可能であるが、これらの方法に限定されるものではない。発現ベクターを含有する細胞は、クローニングで増殖させることができ、それぞれについてＰＩＩＩ ＳＶＭＰタンパク質又はその誘導体を産生するかどうかを分析することができる。これらの宿主細胞クローンの同定は、抗ＰＩＩＩ ＳＶＭＰ抗体に対する免疫学的活性、及び／又は宿主細胞関連ＰＩＩＩ ＳＶＭＰ活性の存在など、いくつかの手段によって行うことができるが、これらの手段に限定されるものではない。
ＰＩＩＩ ＳＶＭＰのＤＮＡの発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成される合成ｍＲＮＡを使用して行うこともできる。合成ｍＲＮＡ、又はＰＩＩＩ ＳＶＭＰ産生細胞から単離されたｍＲＮＡは、限定するものではないが小麦胚芽抽出物及び赤血球抽出物などの種々の細胞非使用の系で効率的に翻訳することができ、また限定するものではないがカエル卵母細胞へのマイクロインジェクションなどのセルベース系で効率的に翻訳することもでき、カエル卵母細胞へのマイクロインジェクションが一般には好ましい。したがって、ＰＩＩＩ ＳＶＭＰ又はその誘導体は、本発明の宿主を核酸が発現する条件で培養するか、核酸のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳を行い、産生されるタンパク質を回収することによって得ることができる。
形質転換した宿主は、発酵槽で成長させ、当技術分野で公知の技術により培養して、細胞増殖を最適にすることができる。次に、タンパク質を、増殖培地、細胞溶解物、又は細胞膜画分から単離することができる。発現されたタンパク質は、硫安分画、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などの当技術分野の標準的方法によって精製することができ、例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）を参照されたい。医薬用途では、少なくとも約９０〜９５％の均質性の実質的に純粋なタンパク質が好ましく、９８〜９９％又はそれを超える均質性が最も好ましい。必要に応じて部分的又は全体的に精製した後、タンパク質は治療に使用したり（体外を含む）、あるいは分析方法の開発及び実施に使用したりすることができる。
【００２５】
本発明を構成する化合物のサイズは、細胞の親油性細胞膜を通過できるように「バイオアベイラビリティの壁」である５００〜６００Ｄａを下回ることが好ましい。一方、タンパク質治療の場合、ＨＩＶウイルスのタンパク質の一部と融合する酵素は、細胞膜を通過することができ、マウスによるｉｎ ｖｉｖｏの酵素活性が維持されることが最近示された（Ｓｃｈｗａｒｚｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５（１９９９），１５６９−１５７２）。ＨＩＶウイルスのトランス転写活性促進タンパク質（ＴＡＴタンパク質）は、受容体又はトランスポーターを使用したりＡＴＰを必要としたりせずに細胞膜を通過するという特異な能力を有することがほぼ１０年前から知られている（Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｌｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ，Ｃｅｌｌ ５５（１９８８），１１７９−１１８８）。その正確な機構は未知であるが、ＴＡＴのタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）が細胞膜の脂質二重層に「穴」を開け、共有結合的に結合してその穴から中に入り込み、再び穴を閉じることが知られている。これは特殊な方法であり、他の方法では細胞を損傷しない。したがって、本発明のポリペプチド、本発明の抗体又はその他の化合物は、リンカーによってＰＴＤと結合させて、細胞膜を通過させることができ、ＤＤＴ ４（１９９９），５３７も参照されたい。
【００２６】
一般に、本発明は、ＭＭＰ発現、細胞移動、細胞増殖、収縮、及び／又は 細胞外マトリックス合成又は分泌などの線維芽細胞におけるα２β１インテグリン介在性細胞応答を正常化する方法を提供する。好ましい実施態様では、本発明は、線維症又は疾患の治療又は予防方法を提供する。このような疾病又は疾患は一般に、創傷治療部位などの特定の部位で新しい細胞及び細胞外マトリックスが過剰になったりし無秩序に沈着したりするために起こる。この余分な物質は、正常組織の機能を妨害することによって疾患又は障害の原因となりうる。余分な物質は障害となることもある。新しく沈着した細胞及び細胞外マトリックスは一般に瘢痕組織と呼ばれる。大部分の線維症では、瘢痕組織の収縮が起こり、そのためさらに別の望ましくないことが起こりうる。代表的な線維症としては、肺線維症（肺の線維症）、糸球体腎炎（腎臓の線維症）、肝硬変（肝臓の線維症）、上皮又は皮膚の創傷治療、アテローム性動脈硬化症、及び増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）が挙げられる。線維症としては、腱の障害の修復、衝突傷害の治癒、中枢神経系（ＣＮＳ）の外傷の治癒、ＣＮＳに瘢痕組織が形成される症状、脳卒中による瘢痕組織の形成、外傷又は手術などによる組織の接着も挙げられる。したがって、本発明の方法は、瘢痕を減少させて創傷又は線維症を治療することを可能とする。
組織損傷後の創傷治癒は、炎症、増殖、及び瘢痕の調節の３つのフェーズに分割可能な過程である。第１フェーズは、外傷直後の血液眼球関門の破壊、及び初期炎症反応によって引き起こされる。この段階で血小板が損傷部位に移動し、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β、及びＥＧＦなどの増殖因子を放出すると考えられている。次にこれらの因子は創傷後数時間で多核白血球を引き寄せ、この多角白血球は循環する血中単球を引き寄せる別の因子を放出し、血中単球はマクロファージになる場合があり、この細胞は線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）などのさらに別の増殖因子を放出する。創傷治癒過程の第２段階では、マクロファージが結合性組織細胞の増殖及び蓄積を刺激し、組織の肉芽化が起こる。創傷治癒過程の第３フェーズは、細胞及び細胞外マトリックスの再編成からなり、即ち先に形成された組織の変調からなる。次に線維芽細胞は収縮し、肉芽化によって成熟瘢痕となる（Ｐａｓｔｏｒ Ｊ．Ｃ．Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ４３（１９９８），３）。
実施態様の一つでは、本発明の方法は、コラーゲンとの望ましくない収縮が起こる線維芽細胞に導入遺伝子が送達されるように、前述の核酸を有するベクターを創傷治癒又は線維化の部位と接触させることを含む。導入遺伝子の発現によって、ＰＩＩＩ ＳＶＭＰ又はその誘導体が発現され、それによって、実施例に示されるようにコラーゲン格子の収縮の減少又は阻害が起こる。実施例に示されるように、コラーゲンが組織中に存在する場合でも多量のＰＩＩＩ ＳＶＭＰを使用する必要がある訳ではない。当然ながら、導入遺伝子を含有するベクターを外傷部位に接触させる代わりに、タンパク質又はペプチドが細胞に取り込まれるような方法で、ＰＩＩＩ ＳＶＭＰ又は誘導体タンパク質を直接細胞に送達することも可能であり、例えば、ＰＩＩＩ ＳＶＭＰ又はその誘導体をＴＡＴトランスダクションドメインと融合した融合タンパク質を使用する方法によって可能となる（上記参照）。所望の細胞へ到達させるために、所望の細胞を特異的に目標とするベクター又は運搬体を使用することができる。あるいは、又はベクターが外傷部位に送達される場合にはこのようなベクター又は運搬体と併用して、組織又は細胞特異的プロモーターを使用して、所望の細胞で特異的に導入遺伝子を直接発現させることができる。
本発明の方法により治療可能な線維症は、好ましくは肝臓、肺、腎臓、及び心臓の線維症、アテローム性動脈硬化症、肝硬変、局所性及び全身性強皮症、ケロイド、肥厚性瘢痕、及び増殖性硝子体網膜症からなる群より選択される線維症又は硬化症である。好ましくは、前記線維症は皮膚線維症である。
【００２７】
さらに他の局面では、本発明は、生理学的有効量のＰＩＩＩ ＳＶＭＰ、あるいはそのフラグメント、ペプチド、誘導体、同族体、又はミメティック、あるいは前述の定義の若しくは後に更に特定される核酸を、それを必要とする患者に投与することを含む患者の皮膚再建又は創傷治療方法に関する。
前述したように、本発明によると、ＰＩＩＩ ＳＶＭＰ化合物は、望ましくない組織の増殖（例えば、 線維症）を特徴とする症状を治療するために患者に投与され得る。あるいは、任意にＰＩＩＩ ＳＶＭＰが媒介するＭＭＰ発現又は活性を阻害する化合物を同定して、望ましくない組織の破壊（例えば、治癒しない創傷、慢性潰瘍、化学線（日光）性弾力線維症、及び加齢関連の皮膚の萎縮、腫瘍細胞の浸潤）を特徴とする症状を治療するために患者に投与することができる。ＭＭＰ活性の阻害は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の破壊を防止することによって腫瘍細胞の他の部位への移動（すなわち転移）を防止できるため、腫瘍を有する患者の治療にも有用となりうる。プロテアーゼがタンパク質の性質をいかに変化させることができるかに関する顕著な例はＢｌｏｂｅｌ，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １２（２０００），６０６−６１２に記載されており、これはマトリックスメタロプロテイナーゼ２（ＭＭＰ−２）又は膜型マトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＴ１−ＭＭＰ）で処理されるラミニン５の場合である。無傷のラミニン５は細胞接着を支援するが、ＭＭＰ−２及びＭＴ１−ＭＭＰによって切断されたラミニン５は細胞移動を促進する。興味深いことに、切断されたラミニン５フラグメントは、ｉｎ ｖｉｖｏで再構成される組織で検出され、例えば皮膚癌、及び妊娠中のラットの乳腺組織で検出されるが、正常組織や未成熟のメスの乳腺組織からは検出されない。ＭＴ１−ＭＭＰは骨及び細胞外結合組織の発育にも重要である。ＭＴ１−ＭＭＰ欠損マウスは、頭蓋異形成症、関節炎、オステオペニア、小人症、及び軟組織線維症などの重篤な骨格性及び骨外性異常を有する。ＭＴ１−ＭＭＰは、別の酵素ＭＭＰ２／ゼラチナーゼＡの活性化に必要であると提言されている。実際、ＭＭＰ２の活性化は、ＭＴ１−ＭＭＰを欠失したマウスの組織抽出物中では低下した。ＰＩＩＩ ＳＶＭＰはマトリックスメタロプロテイナーゼの発現、特にＭＴ１−ＭＭＰの発現を促進可能なことを本発明により示されるため、上記のことは本発明のさらに重要な用途を提供する。したがって、前述のＰＩＩＩ ＳＶＭＰ及びその誘導体、ならびにそれらの化合物をコードする核酸は、マトリックスメタロプロテイナーゼ発現又は活性、特にＭＴ１−ＭＭＰの以上と関連する障害の治療に使用することができる。一方、マトリックスメタロプロテイナーゼ発現又は活性、特にＭＴ１−ＭＭＰの発現又は活性に対して拮抗する化合物は、ＭＭＰの望ましくない切断活性と関連する皮膚癌などの疾患の治療に使用することができる。したがって、ＭＭＰ、特にＭＭＰ−１及び／又はＭＴ１−ＭＭＰの活性又は発現を調節する化合物の同定及び単離のための化合物及び方法を提供することも本発明の目的の一つであり、これは前述及び後述のような治療用途に有用となりうる。
【００２８】
したがって、本発明は、ＭＭＰの活性又は発現を調節する化合物の同定及び単離のためのセルベースの方法を含み、これは好ましくは前述の定義のＰＩＩＩ ＳＶＭＰ、あるいはそのフラグメント、ペプチド、誘導体、同族体、又はミメティック、あるいは核酸の存在下で、候補化合物又は化合物の混合物のＭＭＰ活性又は発現を促進又は抑制する能力を調べることを含む。
本発明は、線維症の治療に使用することができる化合物、好ましくは小さな分子の化合物を同定するためのアッセイをさらに提供する。このアッセイは一般に、細胞培養皿中に実質的に単層で存在する線維芽細胞集団の収縮に関して、試験化合物の影響を調べることを含む。さらにより好ましい実施態様では、前記細胞はコラーゲンゲルなどのゲル中で培養される。好ましいコラーゲンゲルはコラーゲンＩ型ゲルである。前記細胞はゲル上で培養されても、あるいはゲル内部で培養されてもよい。好ましい収縮アッセイは実施例に記載される。簡潔に言えば、細胞はゲル（例えばコラーゲンゲル）中に分散され、培養皿に播種され、そして培地が培養皿に加えられる。続いてゲルの直径を測定する（コントロールの直径）。試験物質を加えて細胞を適当な時間インキュベートし、再び直径を測定して収縮が生じたかどうかを調べる。コラーゲンなどのある物質による収縮の刺激に対する試験物質の影響を調べようとする場合には、試験物質とコラーゲンＩ型などの物質を加えて細胞をインキュベートし、コラーゲンに誘導される収縮に対する物質の影響を調べる。線維化の治療ための治療薬の同定をしようとする実施態様では、例えば、コラーゲンと試験物質を細胞に加えてインキュベートして、コラーゲンと試験物質を加えてインキュベートした細胞の収縮と、試験物質を加えなかった場合の細胞の収縮とを比較する。したがって、試験物質の存在下でコラーゲンに誘導される収縮が、試験物質を使用しない場合と比べて減少すると、その試験物質は細胞の収縮を防止していることを示しており、そのため試験物質は、過剰な瘢痕化などの細胞収縮が少なくとも原因の一部である疾患又は障害の治療に有効である。好ましい実施態様では、コラーゲンはＰＩＩＩ ＳＶＭＰ又はその誘導体で部分的又は完全に置き換えられる。
したがって、一般的には、本発明は、患者の線維症の治療に有効な物質の同定方法を提供し、その方法は、刺激物質の存在下では細胞が収縮する条件下で、前記物質を線維芽細胞及び刺激物質と接触させることを含み、前記物質の存在下での細胞の収縮が、前記物質の非存在下での収縮よりも軽減されると、前記物質が患者の線維症の治療に有効であることが示される。線維芽細胞は、規定サイズのコラーゲンマトリックス中に分散させてもよく、本発明の方法は、前記物質の存在下におけるコラーゲンマトリックスのサイズを前記物質の非存在下でのサイズと比較することを含む。
このアッセイに使用される細胞は初代培養のものであってもよいが、確立された細胞株のものが好ましい。実際、新しい細胞を単離し、新しい細胞培養を確立するよりも細胞株を使用する方がより便利である。ＳＶ４０の感染などの当技術分野で公知の方法によって、細胞株を初代培養から確立することもできる。さらにより好ましい細胞は線維芽細胞である。これらの細胞は、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ヒツジ、ウシ、又はニワトリの細胞などの哺乳動物の細胞であってもよい。好ましい実施態様では、細胞は（不死化）皮膚線維芽細胞である。
ある種のゲル収縮アッセイは当技術分野で公知であり、例えばＢｅｌｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ Ａ．７６（１９７９），１２７４−１２７８を参照することができるが、血小板細胞培養とは異なり、線維化と関連する疾患の治療における物質の効果を予測するゲル収縮アッセイに線維芽細胞を使用できることが発見された（実施例で説明する）。新しい細胞を単離する必要がなくいつでもアッセイを実施できるので、細胞株を使用することがはるかに有利である。異なる患者又は動物から得られた新しい細胞を使用するのではなく、アッセイが同じ細胞に基づくため再現性もより優れている。
本発明の好ましいアッセイは、細胞が３次元ゲル内部にあるという点で記載のコラーゲン収縮アッセイとはさらに異なる。ゲル収縮アッセイは数百万の化合物を同時に試験する高処理能力アッセイの形態で容易に実施可能である。
本発明の収縮アッセイは、細胞及び／又はマトリックスの収縮を伴う線維症などの種々の疾患を治療するための化合物を同定するために使用することができる。いずれの線維症であるかを同定するための化合物を同定する場合、アッセイに使用される細胞は、特定の線維症及び細胞収縮を引き起こす疾患における特定の刺激で収縮する細胞と類似するように選択され得る。したがって、例えば、皮膚創傷治療における過剰な瘢痕を防止する化合物を同定する場合は、皮膚線維芽細胞をアッセイに使用することができ、刺激物質はコラーゲンであってよく、より好ましくはＰＩＩＩ ＳＶＭＰ又はその誘導体である。好ましい実施態様では、細胞は規定サイズのコラーゲン様マトリックス中に分散され、本発明の方法はコラーゲン様マトリックスのサイズを化合物の存在下と非存在下で比較することを含む。本発明の方法は好ましくは、同定した化合物の単離も含む。
【００２９】
出発材料として、通常は多様な約１０５もの様々な分子を含む化合物コレクション等の化合物の混合物が使用され、本発明の方法は一つ以上のサブコレクションを単離するステップを含むことができる。本発明の方法（すなわち「スクリーニングアッセイ」）を実施することによって、当業者であれば、モジュレーター、すなわちα２β１インテグリンと結合する、及び／又はＭＭＰ発現又はＭＭＰ活性などに対して刺激又は抑制作用を有する候補又は試験化合物又は薬剤（例えば、ペプチド、ペプチドミメティック、小分子、又はその他の薬物）を同定可能である。好ましくは、前記ＭＭＰはＭＭＰ−１及び／又はＭＭＰ−１４である。例えば、ＭＭＰ活性又は発現を調節する候補化合物又は試験化合物のスクリーニングが可能である。試験化合物は、コンビナトリアルライブラリ法の分野で公知の種々のライブラリの任意のものを使用して得ることができ、例えば、生物学的ライブラリ、空間的にアドレス可能な並列固相又は溶液相ライブラリ、デコンボリューションの必要な合成ライブラリ法、「１ビーズ１化合物」ライブラリ法、及びアフィニティークロマトグラフィーによる選別を使用する合成ライブラリ法を使用することができる。生物学的ライブラリ法はペプチドライブラリに制限されるが、他の４つの方法はペプチド、非ペプチドオリゴマー、又は小分子の化合物ライブラリに適用できる（Ｌａｍ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１２（１９９７），１４５）。分子ライブラリの合成方法の例は当技術分野で公知であって、例えばＤｅＷｉｔｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（１９９３），６９０９、Ｅｒｂら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１（１９９４），１１４２２、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７（１９９４），２６７８；Ｃｈｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１（１９９３），１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３（１９９４），２０５９、Ｃａｒｅｌｌら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３ ８（１９９４），２０６１、及びＧａｌｌｏｐら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７（１９９４），１２３３を参照できる。化合物のライブラリは、溶液（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３（１９９２），４１２−４２１）、又はビーズ上（Ｌａｍ，Ｎａｔｕｒｅ ３５４（１９９１），８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３６４（１９９３），５５５−５５６）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（米国特許第５，５７１，６９８号、第５，４０３，４８４号、及び第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９（１９９２），１８６５−１８６９）、又はファージ上（Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９（１９９０），３８６−３９０、Ｄｅｖｌｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９（１９９０），４０４−４０６、Ｃｗｉｒｌａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７（１９９０），６３７８−６３８２、及びＦｅｌｉｃｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２（１９９１），３０１−３１０）で存在しうる。
【００３０】
好ましい実施態様では、本発明は、前述のステップのいずれか一つを含む抗癌薬の製造方法に関し、ＭＭＰ活性量の減少又は活性ＭＭＰ量の減少が抗癌薬に対する指標となる。最近、Ｋｕｒｓｃｈａｔら，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９７（２００２），１７９−１８７で、マトリックスメタロプロテイナーゼによるタンパク分解の増加は、腫瘍細胞と近接する間質に主に局在化されることが示された。特に、腫瘍−間質相互作用部位でＭＰ１−ＭＭＰ及びＭＭＰ−２の強い発現を示すことができる。したがって、マトリックスメタロプロテイナーゼ活性を阻害又はこれと拮抗するとして本発明により同定され単離された化合物は、悪性メラノーマの治療に特に有用である。
【００３１】
別の好ましい実施態様では、本発明は、創傷治療を支援する薬剤の製造方法に関し、この方法は前述の本発明のスクリーニング及び単離方法のステップのいずれか一つを含み、ＭＭＰ活性量の減少又は活性ＭＭＰ量の減少が前記薬剤に対する指標となる。
【００３２】
したがって、さらに本発明は、医薬組成物の製造方法に関し、特に癌、好ましくはメラノーマ、又は前述のような線維症、創傷治療、さらにはある美容上の価値を有しうる組織再構成などの一般的な用途のための医薬組成物の製造方法に関する。本発明の方法は、前述のＰＩＩＩ ＳＶＭＰ又はその誘導体のいずれか一つの使用、又は前述のＭＭＰのモジュレーターを同定して得るための本発明の方法のステップのいずれか一つを実施することを含み、さらに（ａ）（ｉ）カルボキシル基のエステル化、又は（ｉｉ）ヒドロキシル基とカルボン酸のエステル化、又は（ｉｉｉ）ヒドロキシル基と、例えばホスフェート、ピロホスフェート、又はサルフェート又はヘミサルフェートとのエステル化、又は（ｉｖ）医薬上許容される塩の形成、又は（ｖ）医薬上許容される錯体の形成、又は（ｖｉ）薬理学的に活性のポリマーの合成、又は（ｖｉｉ）親水性部分の導入、又は（ｖｉｉｉ）芳香族部分又は側鎖の置換基の導入又は交換、置換パターンの変更、又は（ｉｘ）等配電子部分又は生物学的等価部分の導入による改質、又は（ｘ）同族化合物の合成、又は（ｘｉ）分岐側鎖の導入、又は（ｘｉｉ）アルキル置換基の環状類似体への転化、又は（ｘｉｉｉ）ヒドロキシル基のケタール、アセタールへの誘導体化、又は（ｘｉｖ）アミド、フェニルカルバメートへのＮ−アセチル化、又は（ｘｖ）Ｍａｎｎｉｃｈ塩基、イミンの合成、又は（ｘｖｉ）ケトン又はアルデヒドの、Ｓｃｈｉｆｆ塩基、オキシム、アセタール、ケタール、エノールエステル、オキサゾリジン、チオゾリジン、又はそれらの組合せへの変換によって、ＰＩＩＩ ＳＶＭＰ又はその誘導体、あるいはリード化合物として単離された化合物を修飾して、（ｉ）作用、活性スペクトル、又は器官特異性の修飾部位、及び／又は（ｉｉ）効力の向上、及び／又は（ｉｉｉ）毒性の減少（治療指数の増加）、及び／又は（ｉｖ）副作用の減少、及び／又は（ｖ）治療効果の開始、効果持続時間の変更、及び／又は（ｖｉ）薬物動力的パラメータ（吸収、分布、代謝、及び排泄）の修正、及び／又は（ｖｉｉ）物理化学的パラメータ（溶解性、吸湿性、色、食味、におい、安定性、状態）の修正、及び／又は（ｖｉｉｉ）全体的な特異性、器官／組織特異性の向上、及び／又は（ｉｘ）使用形態及び経路の最適化を行うステップ、ならびに（ｂ）前記修飾した化合物と医薬上許容される担体から生成物を得るステップとを含む。
上記の種々の工程は一般に当技術分野で公知である。例えば、これらの技術を実施するためのコンピュータプログラムが利用可能であり、例えば、Ｒｅｉｎ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｌｉｇａｎｄ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ（Ａｌａｎ Ｌｉｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９）が利用可能である。化学的誘導体及び類似体の調製方法は当業者には公知であり、例えば、Ｂｅｉｌｓｔｅｉｎ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ｅｄｉｔｉｏｎＮｅｗ Ｙｏｒｋ Ｉｎｃ．，１７５ Ｆｉｆｔｈ Ａｖｅｎｕｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１００１０ Ｕ．Ｓ．Ａ．、及びＯｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡに記載されている。さらに、前述の方法などによって、ペプチドミメティック及び／又は適切な誘導体及び類似体のコンピュータ支援デザインを使用することができる。薬物発見のリード化合物創出法も、タンパク質と質量分析の使用（Ｃｈｅｎｇら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７（１９９５），８８５９−８８６０）、及び核磁気共鳴（ＮＭＲ）法（Ｆｅｊｚｏら，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．６（１９９９），７５５−７６９、Ｌｉｎら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２（１９９７），８９３０−８９３１）の使用を含む。これらは、定量的な構造−作用関係（ＱＳＡＲ）分析（Ｋｕｂｉｎｙｉ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４１（１９９３），２５５３−２５６４，Ｋｕｂｉｎｙｉ，Ｐｈａｒｍ．Ｕｎｓｅｒｅｒ Ｚｅｉｔ ２３（１９９４），２８１−２９０）コンビナトリアル生化学、古典的化学、及びその他を含んだりそれらを基礎としている場合もある（例えば、Ｈｏｌｚｇｒａｂｅ ａｎｄ Ｂｅｃｈｔｏｌｄ，Ｐｈａｒｍ．Ａｃｔａ Ｈｅｌｖ．７４（２０００），１４９−１５５参照）。さらに、担体及び製剤方法の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓを参照することができる。上述した本発明の方法のいずれか一つにより薬剤を選択すると、その薬剤又はそのプロドラッグを治療的有効量となるように合成することができる。本明細書で使用される場合、「治療的有効量」とは、患者に有意義な利益をもたらす、すなわちアポトーシスと関連する症状の治療、治癒、予防、又は回復、あるいはそのような症状の治療、治癒、予防、又は回復の速度の増加を示すために十分な薬剤又はプロドラッグの全量を意味する。加えて又は代替的に、特に薬物の前臨床試験に関する場合、「治療的有効量」とは、非ヒト動物試験で生理学的反応を誘発するのに十分な薬物又はプロドラッグの全量を意味する。
【００３３】
さらに、ｉｎ ｖｉｖｏ投与後の薬物又はプロドラッグは、排泄あるいは１種類以上の活性又は不活性代謝物質に代謝することによって除去するために代謝される（Ｍｅｙｅｒ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．２４（１９９６），４４９−４５９）。したがって、本発明の方法による同定され得られた実際の化合物又は薬物を使用するよりも、患者体内で活性形態に変化するプロドラッグとして作用する製剤を使用することができる。プロドラッグ及び薬物の使用に対して行うことができる予備的測定は文献に記載されており、レビューのＯｚａｍａ，Ｊ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｓｃｉ．２１（１９９６），３２３−３２９を参照することができる。
さらに、本発明は、前述のＰＩＩＩ ＳＶＭＰ又は前述の関連化合物、又はそれらの化学的誘導体、あるいは核酸、あるいはそのいずれかを含むベクター又は細胞を含む組成物の使用に関する。本発明の組成物は、医薬上許容される担体をさらに含むことができる。用語「化学的誘導体」は、通常は基本分子の一部としては存在しない別の化学的部分を含有する分子を意味する。このような部分は、基本分子の溶解性、半減期、吸収などを向上させ得る。あるいは、これらの部分は、基本分子の望ましくない副作用を軽減したり、基本分子の毒性を低下させたりすることもある。このような部分の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓなどの種々の文献に記載されている。好適な医薬用担体の例は当業者には公知であり、リン酸緩衝液、水、油／水エマルションなどのエマルション、種々の湿潤剤、無菌溶液などが挙げられる。このような担体を含む組成物は、公知の従来方法によって製剤することができる。これらの医薬組成物は、適当な投与量で患者に投与することができる。好適な組成物の投与は、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉投与、局所投与、又は皮内投与などの種々の方法で行うことができる。鼻内噴霧製剤などのエアロゾル製剤においては、活性物質に保存剤及び等張剤が加えられた精製水溶液又は他の溶液を含む。このような製剤は、ｐＨ及び等張状態が鼻粘膜と適合するように調整されることが好ましい。直腸投与又は経膣投与用の製剤は、適当な担体を使用した座剤として提供することができる。
投与計画は、主治医及び臨床的要因によって決定される。医療分野では公知であるが、患者の投与量は、患者の体型、体表面積、年齢、投与される具体的な化合物、性別、投与時間及び経路、身体全体の健康状態、及び同時に投与される他の薬剤などの多くの要因に依存する。典型的な投与量は、例えば０．００１μｇ〜１０ｍｇの範囲内（発現又は発現の阻害のための核酸もこの範囲内）とすることができ、特に上記要因を考慮して、この範囲より少ない、又は多い投与量を設定してもよい。一般に、医薬組成物の規則的投与としての投与計画では、１日当たり０．０１μｇ〜１０ｍｇ単位の範囲とされる。投与計画が連続的輸液である場合は、体重１ｋｇ、１分間当たり０．０１μｇ〜１０ｍｇ単位の範囲とされる。定期的な診断によって経過を観察することができる。場合によって異なるが、静脈内投与によるＤＮＡの好ましい投与量は約１０６〜１０１２コピーのＤＮＡ分子である。
【００３４】
本発明の組成物は、局所的又は全身的に投与することができる。一般に投与は非経口的に行われ、例えば静脈内投与であり、ＤＮＡを使用する場合には、目標部位に直接投与することもでき、例えば、内部又は外部目標部位への微粒子銃送達（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）、又は動脈内の部位へカテーテルなどによって投与することができる。非経口投与用の製剤としては、滅菌した水性又は非水性溶液、懸濁液、及びエマルションが挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体としては、水、アルコール性／水性溶液、エマルション又は懸濁液が挙げられ、例えば食塩水及び緩衝媒体が挙げられる。非経口媒体としては、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液、又は不揮発性油が挙げられる。静脈用媒体としては、流動性栄養補充液、電解質補充液（リンガーデキストロースを主成分とするものなど）などが挙げられる。保存剤及び他の添加剤も使用することができ、例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート化剤、不活性ガスなどを使用できる。さらに、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の用途に応じて、インターロイキンやインターフェロンなどの薬剤も含むことができる。
【００３５】
本発明の治療又は診断用組成物は、ＭＭＰ活性の調節が見られる異常を治療又は診断するのに十分な有効投与量で患者に投与される。有効量は、患者の状態、体重、性別、及び年齢などの要因によって変動しうる。他の要因としては投与形態が挙げられる。本発明の医薬組成物は、冠内、腹腔内、皮下、静脈内、経皮、滑膜内、筋肉内、又は経口経路などの種々の経路で患者に投与される。さらに、他の薬剤の同時投与又は逐次投与が望ましい場合もある。
治療的有効投与量は、症状及び状態を改善する、前述の本発明ＰＩＩＩ ＳＶＭＰ及び関連化合物、ポリヌクレオチド、及びベクターの投与量を意味する。このような化合物の治療的有効性及び毒性は、細胞培養又は実験動物を利用した標準的な医薬的手順によって決定することができ、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％で治療的に有効な投与量）及びＬＤ５０（集団の５０％が死亡する投与量）によって決定される。治療効果と毒性作用との投与量比は治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０で表現することができる。
【００３６】
本発明は、上述の方法を実施するためのキットも提供し、当該キットは、前述の定義のＰＩＩＩ ＳＶＭＰ、あるいはそのフラグメント、ペプチド、誘導体、同族体、又はミメティック、あるいは核酸を含み、さらに細胞、アガロースゲル、コラーゲン、抗体、細胞増殖培地、核酸プローブの中の一つ又は複数を含んでいてもよい。一態様では、所定量の上記成分を収容する容器を含む。本発明のキットは、他の組成物や、及びそれを含有する化合物を細胞又は組織に投与するために有用な装置（例えば、シリンジ）を含んでいてもよい。また、使用説明書を含んでいてもよい。本発明のキットは、箱、ブリスターパック、又は液体の収容に使用される同様の包装材料などの包装材料に封入することができる。包装材料は、輸送及び貯蔵中の内容物の無菌性を維持しやすくするために不浸透性カバーでコーティングすることができる。容器はガラスびんが好ましいが、液体のロス又は内容物の汚染のない状態で液体の輸送及び貯蔵が可能な、びん又は袋の形態の剛性又は可撓性プラスチックなどの任意の不活性材料で作製することができる。本発明のキットの他の形態としては、本明細書に記載のゲル収縮アッセイの構成成分を含む。例えば、本発明のキットは、アッセイに使用される細胞（例えば、細胞株、好ましくは線維芽細胞）、ゲル（例えば、コラーゲンＩ型）、細胞増殖培地、刺激物質（例えば、ＰＩＩＩ ＳＶＭＰ）、及び標準試薬を含んでもよい。
【００３７】
さらに別の態様では、本発明は、前述のＰＩＩＩ ＳＶＭＰ、又はフラグメント、ペプチド、誘導体、同族体、又はミメティックを含む人工結合組織等に関する。
【００３８】
有効な創傷修復を促進するために、人工移植材料への医療的な要求は大きい。
慢性的又は欠損の大きな創傷の例としては、床ずれ（褥瘡性潰瘍）、糖尿病性皮膚潰瘍、静脈鬱血性潰瘍、火傷、及び腫瘍切除後に現れる異常が挙げられる。大規模の全層性熱創傷の治療は、中間層皮膚移植及び自家網状植皮などの外科的皮膚移植法の発達によってかなり向上している。しかしながら再生した皮膚の品質は正常な無傷の組織と比較すると不十分である。そのため、創傷収縮及び瘢痕形成が起こって、関節が外傷と近接している場合には大きな機能障害となりうる。実験及び臨床データに基づく予備的な結果は、代用真皮を使用することによって、創傷収縮を抑制し皮膚構築を改善することが可能なことを示している。より有効な治療計画では、機能障害及び不快感が少なくなり、瘢痕修正の形成外科手術の必要性及びコストが押さえられる。このような治療によって、重要な社会経済的影響が生じ、すなわち入院が少なくなり、生活の質が向上し、医療費が軽減される。
【００３９】
したがって、本発明は代用真皮を提供し、それは通常は、線維芽細胞（場合によってはさらに内皮細胞）の浸透、接着、増殖、及び新しいマトリックスの形成産生を補助可能な支持構造と、真皮成分及び表皮成分の両方を支持可能な代用真皮及び代用表皮の組合せの代用皮膚とからなる。この人工組織で使用される材料の潜在的有効性は、内部に成長する細胞を支持する能力、接着に好適な基材の提供、細胞増殖及び細胞外マトリックス産生の促進、及び制御された方法による創傷部位の再吸収などのいくつかの要因に依存する。
最小限の毒性、低免疫原性、及び無傷の組織と同様の引張特性等もさらに要求される。多数の材料が修復の実験モデルとして評価されてきており、そのような材料としては、コラーゲン（多くはウシ又はブタ由来）、フィブリン、フィブロネクチン、キチン／キトサン、コンドロイチン−６−硫酸、基底膜タンパク質、ヒアルロン酸、ポリ乳酸、及びポリグリコール酸が挙げられる。任意の組織工学製品の細胞成分は、自己細胞、同種細胞、異種組織、又は線維芽細胞を組込んだコラーゲンスポンジであってよい。
【００４０】
本発明では、培養組織又は代用真皮／表皮、及び代表皮膚はそれぞれ、前述のＰＩＩＩ ＳＶＭＰ又はその誘導体のいずれか１種類を、追加成分又はコラーゲンＩの代用として含む。さらに、前述のＰＩＩＩ ＳＶＭＰ又はその誘導体、あるいは本発明の方法により得られた化合物を含む人工結合組織は、骨新生を促進する歯周治療などで代用骨移植材料として使用することができる。この実施態様では、無機質ウシ骨基質への細胞の付着を促進し、骨の再生を促進するためにＰＩＩＩ ＳＶＭＰは、コラーゲンＩ型の代替物として使用される。この点に関しては例えば、Ｌａｌｌｉｅｒら，Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．８０（２００１），１７４８−１７５２を参照されたい。
【００４１】
これら及びその他の実施態様は、本発明の説明及び実施例によって開示され、また説明される。本発明により使用されるＰＩＩＩ ＳＶＭＰ、方法、使用法、及び化合物のいずれかに関するさらに詳細な文献は、電子機器などを使用して公共図書館及びデータベースから入手することができる。例えば、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ 及び／又は ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ ａｔ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆ Ｈｅａｌｔｈが提供する公開データベース「Ｍｅｄｌｉｎｅ」を利用することができる。ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （ＥＭＢＬ）の一部であるｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）などのさらに別のデータベース及びウェブアドレスは当業者には公知であり、インターネットの検索エンジンを使用して調べることができる。バイオテクノロジーの特許情報の概要、及び遡及調査及び現状把握調査に有用な特許情報の関連情報の概説が、Ｂｅｒｋｓ，ＴＩＢＴＥＣＨ １２（１９９４），３５２−３６４に記載されている。
【００４２】
上記開示は本発明を概略的に説明している。以下の具体的実施例を参照することによってより十分に理解することができ、これらの実施例は単に説明の目的で提供さるものであり、本発明の範囲の限定を意図するものではない。すべての引用文献（本出願全体に記載の参考文献、発行特許、公開特許出願など）の記載内容を特に本明細書に援用する。
他に明記しない限り、本発明の実施には、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子組み換え生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の従来技術が使用され、これらは当業者には公知である。これらの技術は公知文献で十分説明されており、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：１９８９）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．，１９８５）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ ｅｄ．，１９８４）、Ｍｕｌｌｉｓらの米国特許第４，６８３，１９５号、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．１９８４）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．１９８４）、Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）、Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、論文のＭｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４ ａｎｄ １５５（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ＯｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）を参照されたい。
【００４３】
【実施例】
［材料及び方法］
（抗体及び試薬）
以下の抗体を使用した。β１（４Ｂ４；コールター・コーポレーション（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））、α２（Ｐ１Ｅ６；バイオモル（Ｂｉｏｍｏｌ））、及びα３（バイオモル）インテグリン鎖に対する機能阻止マウスｍＡｂ。ＭＴ１−ＭＭＰに対する単一特異性マウス抗体は、ヒトＭＴ１−ＭＭＰの残基１６０〜１７３に対応するペプチドに対して作製された（１１４−１Ｆ２；フジ・ケミカルズ（Ｆｕｊｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ））。ヒトＭＭＰ−１に対するウサギポリクローナル抗体はＤｒ．Ｐ Ａｎｇｅｌ（ＤＫＦＺ，ハイデルベルグ）の好意により提供された。ヒトＭＭＰ−１に対する市販のモノクローナル抗体は、フジ・ケミカル（Ｆｕｊｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）（富山、日本）より販売されている。イムノブロッティングに使用したヒトα１インテグリン鎖に対する機能阻止マウス抗体、ヒトＨＬＡ−ＡＢＣに対するマウス抗体、及びβ１インテグリンサブユニット抗体に対する抗体はケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）製である。ハララギンに対するウサギポリクローナル抗体はＤｒ．Ａ．Ｓ．Ｋａｍｉｇｕｔｉより提供され、参考文献１９に記載されている。
【００４４】
既報の方法（１９）ようにＢ．ｊａｒａｒａｃａの毒液よりハララギンを精製した。５ｍＭの１，１０−フェナントロリンで３７℃において５分間処理することによってタンパク分解活性を不活性化した（２５）。
【００４５】
（細胞培養及び免疫染色）
１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２ｍＭのグルタミン、及びそれぞれ１００Ｕ／ｍｌのペニシリンとストレプトマイシンを加えたＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）で外植片の増殖より得たヒト真皮線維芽細胞を培養した。継代数１〜９の線維芽細胞を使用した。３次元コラーゲンゲルを既報の方法で調製した（９）。簡潔に述べると、Ｉ型コラーゲン（３ｍｇ／ｍｌ、ビトロゲン（Ｖｉｔｒｏｇｅｎ））と１０×ＤＭＥＭを１０：１の比で混合し、０．１ＭのＮａＯＨを加えて中和した。線維芽細胞を１×１０５細胞／ｍｌの密度でコラーゲンゲル中に播種し、３７℃でインキュベートした。あるいは、線維芽細胞の浮遊液にハララギン１００ｎＭを加えて３７℃で２０分間プレインキュベートしてから、コラーゲンゲルに播種した。残りの表面積を測定することでゲル収縮の比率をモニタした。
【００４６】
インテグリン結合試験の場合、トリプシン処理によってコンフルエントの単層培養物から細胞を剥がし、遠心分離で回収し、増殖培地に再懸濁させた。組織培養プラスチックプレートに播種する前に、異なる濃度の抗体の存在下３７℃で２０分間細胞をプレインキュベートした。細胞の生存度を、トリパンブルー排除法で測定した。
α２インテグリンを検出するために、線維芽細胞をチャンバースライド上で培養した。４８時間後、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、次に冷アセトンで固定した。タンパク質の細胞質ドメインに対するウサギ抗α２抗体（ケミコン）を使用して４％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中４℃で終夜染色を行い、続いてヤギ抗ウサギ−Ｃｙ３抗体（１：４００、ＰＢＳ／２％ＢＳＡ中、ダイアノバ（Ｄｉａｎｏｖａ））を加えて加湿チャンバー中室温で１時間インキュベートした。１次抗体を使用しないものをネガティブコントロールとした。
【００４７】
（接着アッセイ）
セミコンフルエントな線維芽細胞の単層培養物をトリプシン処理し、細胞をＰＢＳで洗浄し、０．５％のＢＳＡ、及びインスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウムを製造元（シグマ（Ｓｉｇｍａ））推奨の濃度で含有するＤＭＥＭ中に再懸濁させた。競合アッセイの場合、抗体を細胞懸濁液に加えてプレートに播いた。既報の方法と同様に接着アッセイを実施した（２６）。簡潔に述べると、９６ウェルマイクロタイタープレートに、１００μｌの活性又は１，１０−フェナントロリン−不活性化ハララギン（４μｇ／ｍｌ）、モノマーコラーゲンＩ型（４０μｇ／ｍｌ）、又は５０％ＦＣＳをコーティングして４℃で終夜静置した。熱変性ＢＳＡ（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋非含有ＰＢＳ中１％のＢＳＡ）を加えて室温で１時間インキュベートすることによって、ＢＳＡコーティングと非特異的結合部位のブロッキングを行った。ウェルを２回洗浄した後、細胞（２×１０４細胞／ウェル）を播種し、３７℃で２時間インキュベートした。接着しなかった細胞をＰＢＳで２回洗浄することで除去し、接着した細胞は３％ホルムアルデヒド含有ＰＢＳ（ｐＨ７．６）で固定し、０．５％のクリスタルバイオレットを含む２０％（ｖ／ｖ）メタノールで染色した。０．１Ｍのクエン酸ナトリウムの５０％（ｖ／ｖ）エタノール溶液を加えることによって発色させた。発色した溶液の光学濃度を５９５ｎｍで測定した。コントロールアッセイ（ＦＣＳ又はハララギンをあらかじめコーティングしたプレート）で得られた値を１００％に設定して、これに対する値を計算した。統計分析をＡＮＯＶＡ Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定で行った。
【００４８】
（可溶性α２β１の固定化ハララギンへの結合）
既述の方法（２７）で細胞質ドメインと膜貫通ドメインをＦｏｓ及びＪｕｎ二量化モチーフで置き換えた発現プラスミドを使用して昆虫細胞中で、組換え可溶性ヒトインテグリンα２β１外部ドメインヘテロ二量体を調製した。
３ｍＭのＭｇＣｌ２及び０．１Ｍの酢酸を含有するトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中４μｇ／ｍｌと４０μｇ／ｍｌの濃度のハララギン及びウシＩ型コラーゲンでマイクロタイタープレートをコーティングした。終夜インキュベートした後、ウェルを熱変性ＢＳＡでブロックし、１０ｍＭのＥＤＴＡの非存在下又は存在下で６μｇ／ｍｌの可溶性α２β１インテグリンを加え室温で２時間インキュベートした。続いて、ウェルを２回洗浄し、ウサギ抗ヒトβ１インテグリン抗血清及びアルカリホスファターゼ結合抗ウサギＩｇＧ抗体をそれぞれ１次抗体及び２次抗体として使用して、基質結合インテグリンをＥＬＩＳＡで検出した。ｐ−ニトロフェニルホスフェートをＥＬＩＳＡの基質として使用し、４０５ｎｍで生成物を測定した。各値は２回ずつ測定し、標準偏差を計算した。
【００４９】
（細胞膜の調製及びウエスタンブロット分析）
粗原形質膜を調製するために、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、プロテアーゼインヒビターのアプロチニン（１０μｇ／ｍｌ）、Ｐｅｆａｂｌｏｃ（０．２５ｍｇ／ｍｌ）、及びロイペプチン（１μｇ／ｍｌ）を含有するＰＢＳでプレートをこすり取った。ドライアイス・エタノール／３７℃浴中で細胞懸濁液の凍結溶解を３サイクル実施し、細胞の溶解を顕微鏡で確認した。５００×ｇで遠心分離して溶解物を細胞核から分離した。次に、上清を７０００×ｇで４℃において１５分間遠心分離した。粗原形質膜をＰＢＳ／インヒビターで１回洗浄し、遠心分離後、ＰＢＳに再懸濁させた。全溶解物の調製のため、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、０．５％のＮＰ４０を含有するＰＢＳ中に溶解させた。溶解物を１５０００×ｇで４℃において２０分間遠心分離した。タンパク質濃度は市販のアッセイ（バイオラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））を使用して測定した。
ウエスタンブロッティングのために、膜調製物、溶解物、又は調整培地から等量のタンパク質を、還元条件下で１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離させて、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｃ Ｓｕｐｅｒ（登録商標）（ファルマシア・バイオテック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ））上に転写した。非特異的結合部位を、５％の脱脂粉乳を含有し０．５％のＴｗｅｅｎ（ｖ／ｖ）を含有するＰＢＳでブロックした後、ブロットに１次抗体を加えて４℃で終夜インキュベートした。結合した１次抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼの結合した２次抗体（１：２０００；ダコ（Ｄａｋｏ））を使用して検出し、ＥＣＬシステム（ＥＣＬ（商標）、ファルマシア・バイオテック）で可視化した。
【００５０】
（線維芽細胞に結合するハララギンの分析）
精製ハララギンにビオチン−ＸＸスルホスクシンイミジルエステルを使用してビオチンと結合させた。ビオチン標識ハララギンの標識及び精製を、ＦｌｕｏＲｅｐｏｒｔｅｒ（登録商標） Ｍｉｎｉ−Ｂｉｏｔｉｎ−ＸＸ ＰｒｏｔｅｉｎＬａｂｅｌｉｎｇキット（モレキュラー・プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、ライデン、オランダ）で行った。結合から離れるハララギンの能力、ビオチン化ハララギンが線維芽細胞から離れる能力を分析するため、ビオチン化ハララギンの存在下で線維芽細胞を２４時間インキュベートした後、濃度の異なる未標識ハララギンを加えてさらに２４時間インキュベートした。処理から４８時間後、細胞表面と結合する全ハララギン（ハララギン及びビオチン化ハララギン）及びビオチン化ハララギンを測定するために、冷ＰＢＳで２回洗浄し、還元性試料緩衝液で直接溶解して調製した細胞溶解物のウエスタンブロットを行った。ブロッティング後、膜に抗ハララギン抗体（結合する全ハララギンの可視化のため）、又はエクストラアビジン（ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ）（登録商標）−ペルオキシダーゼ（ビオチン化ハララギンのみの可視化のため）（１：１０００、シグマ）を加えて１時間インキュベートして、前述のように検出を行った。
【００５１】
（ザイモグラフ分析）
ハララギン刺激を使用又は使用せずに細胞を単層培養した。種々の時点で、培地を回収し、ウシゼラチン（シグマ）を含有する１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離させた（２０μｌ／レーン）。次に、ゲルを２．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００で３０分間洗浄した後、メタロプロテイナーゼ基質緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭのＣａＣｌ２）中で終夜インキュベートした（２８）。クマシーブルーＲ２５０でゲルを染色し、水中で脱染色した。
【００５２】
（ノーザンブロット分析）
チオシアン酸グアニジンで細胞を直接溶解し、続いてフェノール−クロロホルム抽出を行って全ＲＮＡを単離した（２９）。全ＲＮＡ（５μｇ）をホルムアルデヒド／アガロースゲルに展開し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋膜（ファルマシア・バイオテック）上にブロットし、ＭＴ１−ＭＭＰ（３０）、ＭＭＰ−１（３１）、及びα２インテグリン鎖用のランダムプライム３２Ｐ−標識ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた（３２）。
【００５３】
［実施例１］
ハララギンは線維芽細胞の接着を支援し、コラーゲン格子収縮を阻害する［この実施例は、ＰＩＩＩ ＳＶＭＰハララギンがコラーゲン格子収縮を阻害し、またインテグリンα２β１への結合が伴うことを示す。収縮及びその結果得られる収縮力は、肥厚性瘢痕などの線維症の重要な要素である］
【００５４】
ハララギンをコーティングした皿と、Ｉ型コラーゲンをコーティングした皿で線維芽細胞の接着量は同程度であることが分かった（図１Ａ）。線維芽細胞のハララギン又は１，１０−フェナントロリン−不活性化ハララギンへの接着の間に有意差は見られなかった。図１Ｂに見られるように、α２又はβ１インテグリンサブユニットに対する阻止抗体の存在下ではハララギンへの細胞接着が約３０％減少したが、どちらもコラーゲン受容体として作用しうるα１又はα３インテグリンに対する他の機能阻止抗体では阻害は起こらなかった（２）。α２及びβ１抗体の両方を組合せて使用すると、ハララギンへの細胞接着は使用量に依存して最大約６０％阻害された。
線維芽細胞ハララギンで予備処理した後、コラーゲン格子中で細胞をインキュベートすると、格子の収縮の遅れが顕著となった（図２）。２４時間では、未処理の線維芽細胞は、初期表面積の約３０％までゲルを収縮させた。しかしながら、１００ｎＭのハララギンの存在下では、同程度の収縮は４８時間経過しても観察されなかった。細胞生存率は、処理及び未処理線維芽細胞培養で同等であった。線維コラーゲンＩ型格子の収縮はインテグリンα２β１によって調節されることが示されているので（１２−１４）、これらの結果から、ハララギンがα２β１−コラーゲンの相互作用を妨害することによって収縮を遅らせると考えられる。
【００５５】
［実施例２］
ハララギンとインテグリン受容体α２β１の相互作用［この実施例は、ハララギンがインテグリンα２β１の可溶性外部ドメインと結合し、この結合は２価の陽イオンの存在に依存しないと思われることを示す。さらに、この実験は、ディスインテグリン様／システインリッチドメインを含むハララギンのフラグメントによって観察される生物学的活性が得られることを示す。このことは、ディスインテグリン様／システインリッチドメインを有する他のＰＩＩＩ ＳＶＭＰ及びＡＤＡＭも、ハララギンと同様に使用できるか、あるいは少なくとも修飾することができるという仮定を裏付ける重要な観察である。］
【００５６】
先行する研究では、ＰＩＩＩ ヘビ毒メタロプロテイナーゼによるα２β１インテグリンの血小板への結合の結果、通常は有効な血小板凝集が連動してコラーゲン刺激血小板で誘導されるシグナル伝達が阻害されることが示されている（２２，２３）。ハララギンが細胞表面タンパク質と結合するかどうかを調べるために、上清と粗線維芽細胞膜の両方をハララギンで２４時間及び４８時間インキュベートした後にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した（図３）。ハララギン特異的抗体を使用したイムノブロットにより５５ｋＤａのバンドが検出され、細胞培養上清にハララギンが存在することが示された。約３３ｋＤａの別のバンドは、ディスインテグリン様／システインリッチドメイン（ハララギン−Ｃ）で構成されるハララギンのタンパク分解フラグメントを示していると思われる（図３Ａ）。２４時間で単離した膜の場合、無傷のハララギンに対応する弱く染色された５５ｋＤａのバンドが検出された。このバンドの強度は４８時間で顕著に増大した（図３Ｂ）。５２ｋＤａのもう一つのバンドは、回復していないハララギン又はタンパク分解した形態を表していると思われる（１３）。さらに、これらのデータから、線維芽細胞の細胞表面タンパク質と結合するハララギンは、ハララギン−Ｃを形成する部位でタンパク分解から保護すると思われる。
ハララギンの細胞表面への結合の特異性を示すための分析を行った。これらの実験では、線維芽細胞の細胞表面からビオチン化ハララギンを置換するために未標識ハララギンを使用した。図４Ａに示されるように、未標識ハララギンは、細胞表面と結合するビオチン化ハララギンを濃度依存的に置換することができる。
図４Ｂでは、インテグリンα２β１の可溶性外部ドメインが固定化ハララギンと結合している。しかしながら、コラーゲンＩ型とは対照的に、可溶性α２β１受容体のハララギンへの結合は、２価の陽イオンの存在に依存しないように思われた。これは、ハララギンとコラーゲンの場合では、受容体分子上の結合部位が異なる可能性を示唆している。
【００５７】
［実施例３］
コラーゲンゲル培養で増殖させた線維芽細胞をハララギン処理しても、ＭＭＰのコラーゲン誘導合成に影響しなかった［この実験は、実施例４と合わせて、ハララギン様コラーゲンがＭＴ１−ＭＭＰ及びＭＭＰ−１の転写を誘導することを示す。］
【００５８】
コラーゲン格子中で２４時間及び４８時間増殖させた後、１００ｎＭのハララギンで前処理した線維芽細胞から全ＲＮＡを単離し、ＭＭＰ−１及びＭＴ１−ＭＭＰの転写量をノーザンブロット分析で調べた（図５）。コラーゲンゲル中で増殖したコントロールの線維芽細胞では、ＭＴ１−ＭＭＰ及びＭＭＰ−１の転写量が２４時間の増殖で増加し、４８時間の培養ではさらに増加した。どちらの時点でも、ハララギンによる前処理の有無によって観察される転写量に有意差は認められなかった。さらに、未処理及びハララギン処理の両方の線維芽細胞でインテグリンα２のｍＲＮＡ量が同様な増加を示した。したがって、ハララギンによる前処理による、コラーゲン格子中の線維芽細胞の増殖への明らかな影響は認められなかった。
【００５９】
［実施例４］
線維芽細胞単層培養物のハララギン処理を行うと、コラーゲン格子中で増殖した線維芽細胞で観察されるのと同様の変化が見られた。［この実験は、ハララギンなどのＰＩＩＩ ＳＶＭＰは、α２β１インテグリンと結合してマトリックスメタロプロテイナーゼを活性化させることによって、コラーゲン格子ミメティックとして作用できることを示している。この観察から、ハララギン及び同様の結合特性を示すその誘導体は、線維症及び創傷治癒に重要な要素である、マトリックスメタロプロテイナーゼ発現を誘導するために使用することができると結論できる。さらに、ＭＭＰ発現又は活性に拮抗又はこれらを阻害する化合物を同定するアッセイ系を確立可能となる。このような化合物は癌、特にメラノーマの治療に非常に有用であると期待される。］
形態：濃度の増加するハララギンで処理した線維芽細胞細胞の形態分析によると、コラーゲンゲル中で増殖した線維芽細胞で報告されるものと同じ細胞の伸張による突起を有する特徴的な細長い形状を示した（９）。未処理の線維芽細胞は、平坦な細胞形状で紡錘状形態の特徴を維持した（図６）。
ＭＭＰのｍＲＮＡ発現：有意な変化が検出されないコラーゲン格子中で増殖する線維芽細胞とは対照的に、ハララギンで処理した単層培養では図５に示すように有意な差が生じた。単層培養では、ＭＴ１−ＭＭＰ及びＭＭＰ−１の転写は非常に少なかった。しかしながら、ハララギンで前処理した線維芽細胞では、ＭＴ１−ＭＭＰ及びＭＭＰ−１のｍＲＮＡ発現が強く誘導されるとともにα２−インテグリンの転写量も増加した。これらの増加は２４時間で明らかであり、４８時間でこの増加はコラーゲン格子中で培養した線維芽細胞で得られるものに匹敵した。さらに、ＭＭＰのｍＲＮＡ量の誘導は濃度に依存することが分かり、細胞を２００ｎＭのハララギンで前処理した場合に刺激が最大となった（図７）。
ハララギンのメタロプロテイナーゼ活性がＭＭＰ−１及びＭＴ１−ＭＭＰの発現の誘導に必要かどうかを調べるために、線維芽細胞の単層培養物を活性ハララギン又は１，１０−フェナントロリン−不活性化ハララギンで処理した（２２）。図８に見られるように、タンパク分解で不活性となったハララギンで線維芽細胞を処理すると、活性ハララギンで処理した線維芽細胞と比較してＭＭＰ−１及びＭＴ１−ＭＭＰのｍＲＮＡ量に有意差は見られなかった。不活性化ハララギンによる処理後に観察されるｍＲＮＡ量にわずかな減少が見られるのは、１，１０−フェナントロリンによるコントロール線維芽細胞処理で示されるように、一般メタロプロテイナーゼインヒビター１，１０−フェナントロリンが存在することによるものであった。
ＭＭＰタンパク質発現：ハララギンで処理した細胞の粗膜調製物のＭＴ１−ＭＭＰのウエスタンブロット分析では、未処理線維芽細胞と比較して、産生される活性６０ｋＤａＭＴ１−ＭＭＰタンパク質量が２４時間及び４８時間の両時点において増加することが示された（図９Ａ）。不活性状態のチモーゲンに対応する、６３ｋＤａの別の免疫反応性タンパク質も少量検出された（３３，３４）。処理した単層培養におけるＭＴ１−ＭＭＰ産生の増加と並行して、活性酵素に対応する６２／５９ｋＤａの形態で示されるｐｒｏＭＭＰ−２の活性化が向上された（図９Ｂ）。ハララギンで処理した細胞の上清中のＭＭＰ−１タンパク質を分析すると、２４時間及び４８時間処理の両方で、不活性ＭＭＰ−１形態の５２／５７ｋＤａが増加し、活性ＭＭＰ−１の４２／４７ｋＤａも見られた（図９Ｃ）。
ハララギンのタンパク分解活性が、ＭＴ１−ＭＭＰ及びｐｒｏＭＭＰ−２の活性化と直接関連があるという可能性について評価した。ｐｒｏ形態のＭＴ１−ＭＭＰのみを含有するＭＴ１−ＭＭＰを安定に発現する細胞株（３４）から調製した細胞膜をハララギンで処理すると、ｐｒｏＭＴ１−ＭＭＰの活性化は生じなかった。さらに、ｐｒｏＭＭＰ−２を含有する培地をハララギンで処理してもチモーゲンの活性化は見られなかった。これらの観察から、ｐｒｏＭＴ１−ＭＭＰの活性化もｐｒｏＭＭＰ−２の活性化もハララギンのタンパク分解活性と関係がないと示唆された。
α ２ β １ タンパク質発現：前述したように、コラーゲン格子中で増殖した線維芽細胞において、α２β１に誘導されるＭＭＰ−１及びＭＴ１−ＭＭＰの増強をハララギンは阻害しなかった。驚くべきことに、単層培養では、ハララギンを加えることによって、α２−インテグリンサブユニットならびにＭＭＰ−１及びＭＴ１−ＭＭＰの転写量が増加し、このことは、このインテグリン受容体を阻害するのではなくむしろ活性化することを示している。コラーゲン格子中で増殖する線維芽細胞はα２β１インテグリン発現の増加に反応し、一方、線維芽細胞が単層で増殖する場合には変化は見られない（１６）ことが分かった。線維芽細胞をハララギンで処理した後に単層で増殖させると、α２β１−インテグリン免疫染色が有意に増加し、一方未処理の単層培養では特異的な染色は見られなかった（図１０Ａ）。ハララギンで処理した細胞中のα２インテグリンサブユニットのウエスタンブロット分析によると、２４時間でタンパク質量のわずかな増加が見られ、４８時間処理では有意な増加となった（図１０Ｂ）。細胞表面におけるα２インテグリン量の増加は、図３に示されるハララギンの結合の増加を説明できる。
これらのデータは、線維芽細胞をハララギンで処理することによって、コラーゲン格子中で増殖する線維芽細胞において観察されるのと同様に、遺伝子発現が変化し、また細胞の表現型が変化することを示している。したがって、この系では、ハララギンは、α２β１インテグリンと結合してシグナル伝達を活性化させることによってコラーゲン格子ミメティックとして作用することができる。
【００６０】
Ｉｎ ｖｉｖｏでは皮膚線維芽細胞は、線維コラーゲンを含む細胞外マトリックスに囲まれている。ｉｎ ｖｉｖｏ環境を再現するアプローチとしてｉｎ ｖｉｔｒｏモデルが数年前に確立され、このモデルはｉｎ ｖｉｖｏ環境をある程度模倣していると考えられている（９、３５）。ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルでは、線維芽細胞は主に線維状Ｉ型コラーゲンからなる３次元マトリックスに埋め込まれる。コラーゲン環境では、ＭＭＰ−１、ＭＴ１−ＭＭＰ、及びα２β１インテグリンなどの多様なタンパク質の発現を変化させるα２β１媒介性細胞内シグナル伝達が生ずる（１０、１６、１３）。最近、単層で接着する場合と比べると、３次元マトリックス中で接着する場合の線維芽細胞は、局所的な接着複合体、形態、及び生物学的活性が非常に異なることが示された（３６）。これらの結果は、それが接着する細胞外マトリックスの構造が異なると細胞の反応が異なるという概念を強く肯定するものである。
ヘビ毒メタロプロテイナーゼハララギンは、α２β１インテグリンと結合することによってコラーゲン誘導性血小板凝集を阻害し、それによってコラーゲンの結合を遮断し、引き続く細胞表面受容体媒介性シグナル伝達も阻害する（１８、１９）。本発明の目的は、ハララギンなどのＰＩＩＩ ＳＶＭＰが、線維コラーゲンと接触する場合に観察される、α２β１が媒介する線維芽細胞の変化を阻害しうるかどうかを調べることであった。
本発明によると、ハララギンは線維芽細胞の細胞表面と結合し、興味深いことに経時によって結合量が増加することが示された。これは、線維芽細胞にハララギンを加えて初期にインキュベートすると観察される、細胞表面で発現されるα２β１受容体の増加によって説明できる。ハララギンと線維芽細胞の相互作用は、結合した標識ハララギンがハララギンと特異的に置換され得ることから（図４Ａ）、ハララギンと細胞表面との間の一つ又は複数の特異的な相互作用を介して生ずると考えられる。
固定化ハララギンへの線維芽細胞の結合はＳＶＭＰのタンパク分解活性に依存しなかった（図８）。コラーゲン結合性インテグリンのサブユニット（α２、α１、α３、及びβ１）に対する抗体、あるいはα２及びβ１のインテグリン鎖に対する抗体の混合物で線維芽細胞をプレインキュベートすると、コントロールの約４０％まで結合量が阻害された（図１Ｂ）。この不完全な阻害に対する説明の一つとして考えられるのは、α２β１インテグリン以外に、他のインテグリン又はマトリックス結合受容体が線維芽細胞のハララギンへの接着に関与しているということである。このことは、タンパク質の複数のドメイン（メタロプロテイナーゼ、ディスインテグリン様、及びシステインリッチ）のそれぞれが細胞表面相互作用と関与しうると仮定すれば必ずしも驚くべきことではない（３７）。さらに、組換えα２β１の外部ドメインとハララギンの直接の結合は陽イオンに依存しないことも示された（図４Ｂ）。コラーゲンを含むほとんどのマトリックス成分は、陽イオンに依存してα２β１インテグリンと結合する（３８）。しかしながら、最近の報告では、ｐｒｏＭＭＰ−１との結合を補助するα２サブユニットのＩ−ドメインに非陽イオン依存性部位が存在することが示された（３９）。したがって、ハララギンは、陽イオン依存性部位とは異なる部位でα２β１インテグリンと相互作用することによって線維芽細胞と結合し、抗α２抗体が使用されても、それはＩ−ドメインの非陽イオン依存性部位における結合を効率的に阻害するように作用するとは限らない。これは、ハララギンの可溶性α２β１に対する不完全な阻害に対する可能性のある説明である。いくつかの報告では、α２β１インテグリンはハララギンと結合することが示されており（１８、１９、２３）、本発明の結果はこれを裏付けているが、他の受容体もハララギンの細胞表面への結合に関与しているという可能性を排除するものではない。
単層での線維芽細胞の増殖とは対照的に、線維状Ｉ型コラーゲンを含むコラーゲン格子中（１６）で線維芽細胞を増殖させると遺伝子発現の顕著な変化が観察された。したがって、本発明者らは、線維芽細胞をハララギンで処理してからコラーゲン格子中で増殖させると、コラーゲンフィブリルとα２β１結合に関して競合し、コラーゲン格子中で増殖する線維芽細胞に観察される、典型的なα２β１媒介性シグナル伝達反応が阻害されると予想した。しかしながら、コラーゲン格子中で増殖する線維芽細胞をハララギン処理によって、コラーゲンで誘導されるＭＴ１−ＭＭＰ及びＭＭＰ−１転写量の増強が全く阻害されなかった。ハララギン処理によってコラーゲン格子収縮が遅延したが、この現象はインテグリンα２β１が媒介するものであることが示されている（１１、１３、１４）。本発明のデータでは、試験した濃度においてハララギンのα２β１インテグリン受容体に対する結合は、未変性基質コラーゲンとわずかしか競合しなかった。他の研究者らは、ハララギン又はハララギン−Ｃの存在量が増加すると、血小板のモノマーコラーゲンへの接着が濃度依存的に阻害されることを示している（２３）。
コラーゲン結合に対して線維芽細胞のハララギン処理が部分的に競合したが（コラーゲンゲル収縮が遅れることで示される）、コラーゲン誘導性のＭＴ１−ＭＭＰ及びＭＭＰ−１のｍＲＮＡ発現については変化がなかった。このことから、ハララギンが結合したα２β１インテグリン集団では、インテグリンの線維コラーゲンへの結合が繰り返されるという、同様のシグナル伝達現象が生じていたと考えられる。これはコラーゲン格子中（１６）で増殖する細胞で観察される反応と類似の反応を、単層培養によってハララギンが誘導したという結果でさらに実証された。これらは、ＭＭＰ−１及びＭＴ１−ＭＭＰの発現、ならびにｐｒｏＭＭＰ−２活性化の誘導を伴った。ＭＴ１−ＭＭＰの外見上の増加は緩やかなものであったが、ＭＴ１−ＭＭＰ、ＴＩＭＰ−２、及びｐｒｏＭＭＰ−２の機能的な化学量論を得るためには十分であり、このため、ザイモグラフィーで観察されるようにｐｒｏＭＭＰ−２の全体的な活性化が見られる。
ハララギン処理した単層培養で観察される効果は、α２β１インテグリンが媒介しているコラーゲンゲル中で起こる効果と類似しているため、ハララギンは、生理学的なリガンドの効果を実質的に模倣していると推測される。このことは、ハララギンがα２β１インテグリンの可溶性外部ドメインと結合するという発見によって裏付けられている。
ハララギンはα２β１外部ドメインの結合をサポートすることができるが、ＥＤＴＡがこの過程を阻害しないこと、即ちこの結合は２価の陽イオンに依存しないことは驚くべきことであった。リガンド−インテグリン相互作用の大部分は２価イオンに依存しているが（３８）、コラーゲンとα２Ｉ−ドメインの結合は金属イオンが無くても起こりうることが最近になって報告されている（４０）。これらの著者は、コラーゲンの結合はＩ−ドメインのコンフォメーションが「開いた状態」では金属依存性となり、「閉じた状態」では金属非依存性となる可能性があることを示唆している。
線維芽細胞の処理によって観察される活性が、ハララギンのどの領域によるものなのかは分かっていない。ＰＩＩＩ ＳＶＭＰの異なる領域がα２β１インテグリンと結合することが示されている。これらの領域の一つは、ディスインテグリン様ドメイン中にあるＥＣＤモチーフである（４１）。ハララギンの第２の領域であるＲＫＫＨモチーフは、メタロプロテイナーゼドメイン内にある（２４）。可能性のある第３の部位はシステインリッチドメインである。Ｃｒｏｔａｌｕｓ ａｔｒｏｘの毒液から単離されたＰＩＩＩ ＳＶＭＰであるａｔｒｏｌｙｓｉｎ Ａの組換えシステインリッチドメインは、コラーゲン刺激性血小板凝集を阻害することが示されており、したがって血小板α２β１インテグリンと結合可能であることを示している（３７）。ディスインテグリン様／システインリッチドメインのみを含有する毒タンパク質を使用した本発明による予備的研究によると、これらのドメインは、線維芽細胞の処理に使用する場合にハララギンに見られる活性と同様の活性を誘導できることが分かった。したがって、プロテイナーゼドメインは、これらの活性に関して重要な役割を果たしていないと思われる。
Ｋａｍｉｇｕｔｉ及び共同研究者によるデータ（２５）は、コラーゲン誘導性の血小板凝集の阻害は、血小板上のα２インテグリンサブユニットのＩ−ドメインとハララギンが結合することにより起こることを示している。対照的に、線維芽細胞がハララギンで処理されると、ＭＭＰ合成が増強されることにより、α２β１インテグリン受容体の活性化が観察された。Ｋａｍｉｇｕｔｉ及び共同研究者（２２）は、コラーゲン誘導性の血小板凝集の阻害によって、チロシンキナーゼｐｐ７２ｓｙｋのコラーゲン刺激性リン酸化の現象が引き起こされることも示している。
血小板において、コラーゲンによって誘導される活性化及び凝集はα２β１、ＧＰＶＩ、及びαＩＩｂβ３の協同作用に依存し（４２）、そのためハララギンのα２β１への結合は、効率的なシグナル伝達には十分とならない可能性がある。さらに、ハララギンと血小板α２β１の結合によって、コラーゲンとα２β１及び／又はＧＰＶＩの十分な結合は、これら２つの受容体と近接している場合には阻害される可能性がある。これらの事象は、全体的な効果として血小板凝集を阻害しうる。しかしながら、線維芽細胞についての状況はかなり異なる。ハララギンとα２β１インテグリンの結合は、線維コラーゲンの場合に観察されるものと実質的に同一の細胞のシグナル伝達を誘導するために十分である。したがって、異なる細胞が信号の伝達に同じインテグリンを使用することができるが、他の受容体又は細胞のシグナル経路が存在することで異なる活性が得られると考えられる。本発明により実施される実験で示されるように、血小板中でハララギンはα２β１受容体に結合して血小板凝集を阻害することができるが、線維芽細胞中ではハララギンはα２β１受容体の媒介するシグナル伝達を促進して、ＭＭＰ−１、ＭＴ１−ＭＭＰ、及びα２β１インテグリンの発現を促進する。したがって、意外ではないが、リガンドがシグナル伝達受容体と結合して得られる活性を考慮する場合、受容体と他の細胞表面受容体との関係、ならびに信号伝達に利用されるパスウェイの理解に注意を払う必要がある。
ＲｅｐｒｏｌｙｓｉｎのＡＤＡＭファミリー内の分子は、種々のインテグリンと結合することが示されている（４３）。例えば、ＡＤＡＭ１２とＡＤＡＭ１５は、それらのディスインテグリン様／システインリッチドメインを介してα９β１インテグリンと結合し、それによって細胞間の接触を調節することが示されている（４４）。その他の例として、ＡＤＡＭ２３はαｖβ３インテグリンと結合し、天然由来の細胞の細胞相互作用を調節することが示されている（４５）。これは精子−卵子の融合を促進するが、ＡＤＡＭ／インテグリン相互作用につながるシグナル伝達に関するデータは非常にわずかである。これらに提示されるデータに基づくと、ＡＤＡＭによるα２β１インテグリンの結合後の細胞シグナル伝達によって、ハララギン結合の場合と同一又は類似の生物学的活性が誘導されると推測するのが合理的である。
当業者であれば、日常的な実験によって、本明細書に記載される特定の実施態様に限らず、これらと等価な多くの実施態様を認識し、また確認することができる。このような等価物は請求項に含まれるものである。
【００６１】
以下、本明細書における参考文献を記載する。
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１８． Ｊｉａ Ｌ．−Ｇ．， Ｓｈｉｍｏｋａｗａ Ｋ．−Ｉ．， Ｂｊａｒｎａｓｏｎ Ｊ．Ｂ．， Ｊ． Ｆｏｘ． （１９９６） Ｔｏｘｉｃｏｎ ３４， １２６９−１２７６．
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３８． Ｅｍｓｌｅｙ， Ｊ．， Ｋｎｉｇｈｔ， Ｃ．Ｇ．， Ｆａｒｎｄａｌｅ， Ｒ．Ｗ．， Ｂａｒｎｅｓ， Ｍ．Ｊ．， ａｎｄ Ｌｉｄｄｉｎｇｔｏｎ， Ｒ．Ｃ． （２０００） Ｃｅｌｌ １００， ４７−５６
３９． Ｓｔｒｉｃｋｅｒ ＴＰ， Ｄｕｍｉｎ ＪＡ， Ｄｉｃｋｅｓｏｎ ＳＫ， Ｃｈｕｎｇ Ｌ， Ｎａｇａｓｅ Ｈ， Ｐａｒｋｓ ＷＣ， Ｓａｎｔｏｒｏ ＳＡ． （２００１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６， ２９３７５−８１
４０． Ｓｍｉｔｈ， Ｃ．， Ｅｓｔａｖｉｌｌｏ， Ｄ．， Ｅｍｓｌｅｙ， Ｊ．， Ｂａｎｋｓｔｏｎ， Ｌ．Ａ．， Ｌｉｄｄｉｎｇｔｏｎ， Ｒ．Ｃ．， ａｎｄ Ｃｒｕｚ， Ｍ．Ａ． （２０００） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５， ４２０５−４２０９
４１． Ｋａｍｉｇｕｔｉ， Ａ．Ｓ．， Ｚｕｚｅｌ， Ｍ．， ａｎｄ Ｔｈｅａｋｓｔｏｎ， Ｒ．Ｄ．Ｇ． （１９９８） Ｂｒａｚ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｓ． ３１， ８５３−８６２
４２． Ｋａｍｉｇｕｔｉ， Ａ．Ｓ．， Ｔｈｅａｋｓｔｏｎ， Ｒ．Ｄ．Ｇ．， Ｗａｔｓｏｎ， Ｓ．Ｐ．， Ｂｏｎ， Ｃ．， Ｌａｉｎｇ， Ｇ．Ｄ．， Ｚｕｚｅｌ， Ｍ． （２０００） Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ３７４， ３５６−３６２
４３． Ｅｖａｎｓ ＪＰ． （２００１） Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ ２３， ６２８−３９
４４． Ｅｔｏ Ｋ， Ｐｕｚｏｎ−ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ Ｗ， Ｓｈｅｐｐａｒｄ Ｄ， Ｓｅｈａｒａ−Ｆｕｊｉｓａｗａ Ａ， Ｚｈａｎｇ Ｘ−Ｐ，Ｔａｋａｄａ Ｙ． （２０００） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５， ３４９２２−３４９３０
４５． Ｃａｌ Ｓ， Ｆｒｅｉｊｅ ＪＭＰ， Ｌｏｐｅｚ ＪＭ， Ｔａｋａｄａ Ｙ， Ｌｏｐｅｚ−Ｏｔｉｎ Ｃ． （２０００） Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｃｅｌｌ １１， １４５７−１４６９
【００６２】
以下、次の事項を開示する。
１１． 患者の線維症または硬化症の治療または予防に十分な量の、請求項１から９のいずれかにおいて規定されるＰＩＩＩ ＳＶＭＰ、又はそのフラグメント、ペプチド、誘導体、同族体、若しくはミメティック、あるいは核酸を患者に投与するステップを含む、線維症又は硬化症の治療又は予防方法。
１２． 前記核酸が、普遍的及び／又は組織特異的プロモーターによって制御される、目的のタンパク質又はペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有する組換えベクターである、１１．に記載の方法。
１３． 前記線維症又は硬化症が、肝臓繊維症、肺繊維症、腎臓繊維症、及び心臓線維症、アテローム性動脈硬化症、肝硬変、局所性及び全身性強皮症、ケロイド、肥厚性瘢痕、並びに増殖性硝子体網膜症からなる群より選択される疾患である、１１．又は１２．に記載の方法。
１４． 前記線維症が皮膚線維症である、１１．に記載の方法。
１５． 生理学的有効量の、請求項１から９のいずれかにおいて規定されるＰＩＩＩ ＳＶＭＰ、又はそのフラグメント、ペプチド、誘導体、同族体、若しくはミメティック、あるいは核酸を、治療を必要とする患者に投与するステップを含む、皮膚再建又は創傷治療方法。
【図面の簡単な説明】
【図１】「ハララギンは細胞接着基質である」 Ａ：実施例における「材料及び方法」に記載されるように、４μｇ／ｍｌのハララギン又は１，１０−フェナントロリン−不活性化ハララギン、４０μｇ／ｍｌのコラーゲンＩ型、あるいは５０％ＦＣＳのいずれかをコーティングしたマイクロタイタープレート（２×１０４細胞／ウェル）に線維芽細胞を播種した。ネガティブコントロールとしてＢＳＡをコーティングしたウェルも使用した。２時間後、非接着性の細胞を取り除き、接着性の細胞を固定後にクリスタルバイオレットで染色した。棒グラフは、それぞれ２回ずつ繰り返した３つの独立した実験で発色した後に測定した光学濃度の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍを表している。ＦＣＳをコーティングした皿（ＯＤ５９５ｎｍ＝０．６６±０．０８）で得られた平均値を１００％と設定した。Ｂ：線維芽細胞に、α２、α１、α３、又はβ１インテグリン鎖に対するモノクローナル抗体（２．５μｇ／ｍｌ）、又はα２及びβ１インテグリン鎖に対する抗体の混合物（各２．５μｇ／ｍｌ又は５μｇ／ｍｌ）を加えてインキュベートした。次にこれらの細胞を、ハララギン（４μｇ／ｍｌ）をあらかじめコーティングしたプレートに播種し、２時間培養した。ＨＬＡ抗体（５μｇ／ｍｌ）をコントロールとして使用した。棒グラフは、それぞれ２回ずつ実施した３つの独立した実験で発色した後に測定した光学濃度の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍを表している。処理をしないハララギンをコーティングしたウェルへの付着で得られた平均光学濃度（ＯＤ５９５ｎｍ＝０．５±０，０９）を１００％と設定した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
【図２】「ハララギンはコラーゲンゲル収縮を阻害する」 ハララギン非存在下（白いバー）又は１００ｎＭ存在下（黒いバー）のコラーゲンゲル中でヒト線維芽細胞を増殖させた。図示される各時点でゲル表面積を測定した。初期ゲル表面積を１００％としたときのパーセント値として収縮度合が示される。結果はそれぞれ３回繰り返した２つの独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍで表される。
【図３】「ハララギンと結合する線維芽細胞からの膜の調製」 線維芽細胞を、ハララギン非存在、又は１００ｎＭのハララギンの存在下で（＋Ｊ）２４時間及び４８時間単層培養（ｍ）した。２４時間後、培地を取り替え、新しいハララギンを加えた。各時点で培地を回収し、使用するまで−２０℃で保存した。これと並行して、「材料及び方法」に記載のように細胞を膜調製に使用した。２０μｌの調整培地（Ａ）と４０μｇの未精製膜画分（Ｂ）を、還元条件下で１０％ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル上に展開した。ブロッティング後、ハララギンに対するポリクローナル抗体（５μｇ／ｍｌ）を使用して免疫検出することによって特定のタンパク質バンドを可視化した。ハララギンに特異的な５５及び３３ｋＤａのバンドを矢印で示している（後者は分解生成物であると思われる）。分子量標準が示される（ｋＤａ）。
【図４】「組換え可溶性α２β１インテグリンはハララギンと結合する」 Ａ：細胞に１００ｎＭのビオチン化ハララギン（Ｊ＊）を加えて２４時間インキュベートした後、所定濃度（５０〜１００ｎＭ）の未標識ハララギン（Ｊ）を加えてさらに２４時間インキュベートした。４８時間処理した後にハララギン及びビオチン化ハララギンと結合した細部表面をウエスタンブロットで測定した。ブロッティング後、膜を抗ハララギン抗体、又はエクストラビジン（ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ、登録商標）−ペルオキシダーゼで調べた。Ｂ：精製ハララギン（Ｊ）又はＩ型コラーゲン（Ｃｏｌｌ Ｉ）を等モル濃度でコーティングした（４μｇ／ｍｌのハララギン及び４０μｇ／ｍｌのコラーゲン）。可溶性α２β１インテグリンを、２ｍＭのＭｇＣｌ２（白いバー）又は１０ｍＭのＥＤＴＡ（黒いバー）のいずれかの存在下で固定化リガンドに結合させた。洗浄及び固定の後、α２β１インテグリンと結合した量を、「材料及び方法」に記載のようにして定量化した。これらのバーは、それぞれ２回繰り返した３つの独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍを表している。
【図５】「単層で増殖させた線維芽細胞のハララギン処理によって、コラーゲンゲル中で増殖された場合と同様の変化の誘導が観察される」 同数の線維芽細胞を、細胞培養プラスチック上の単層（ｍ）、又は３次元コラーゲンゲル中（ｇ）で、ハララギン非存在下又は１００ｎＭのハララギン存在下（＋Ｊ）で増殖させた。培養の２４時間後及び４８時間後に全ＲＮＡを抽出し、ノーザンブロット分析に供した（５μｇ／レーン）。ＭＴ１−ＭＭＰ、ＭＭＰ−１、及びα２インテグリンサブユニットに対する３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブを使用して転写物量を検出した。ＲＮＡ量は、１８ ＳｒＲＮＡオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって評価した。転写物長はＭＴ１−ＭＭＰで４．５ｋｂ、ＭＭＰ−１で２．２ｋｂ、そしてα２インテグリン鎖で８ｋｂであった。
【図６】「ハララギンは線維芽細胞の形態を変化させる」 ハララギン非存在下（−）又は所定量のハララギン存在下（５０ｎＭ、１００ｎＭ、及び２００ｎＭ）で単層培養により４８時間増殖させた線維芽細胞を光学顕微鏡で分析した。バーは２５μｍを表す。
【図７】「ララギンによって誘導される変化は添加量に依存する」 ハララギン非存在下（−）又は所定量のハララギン存在下（５０ｎＭ、１００ｎＭ、及び２００ｎＭ）で単層培養により４８時間増殖させた線維芽細胞を、ノーザンブロット分析、及びゼラチンザイモグラフィーで分析した。５μｇの全ＲＮＡをホルムアルデヒド／アガロースゲル上で展開し、ナイロン膜に転写し、ＭＴ１−ＭＭＰ及びＭＭＰ−１に対する３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。ＲＮＡ量は、１８ＳｒＲＮＡとのハイブリダイゼーションによって評価した。
【図８】「ハララギンのメタロプロテイナーゼドメインを不活性化させてもｍＲＮＡ量には影響しない」 ハララギン非存在下、あるいは１００ｎＭのハララギン（＋Ｊ）、１００ｎＭの１，１０−フェナントロリン−不活性化ハララギン（＋ｉＪ）、又は１００ｎＭの１，１０−フェナントロリン（＋Ｐｈ）の存在下で、線維芽細胞を単層培養（ｍ）により４８時間増殖させた。４８時間後、全ＲＮＡを単離し、ホルムアルデヒド／アガロースゲル上で分離した（５μｇ／レーン）。ＲＮＡを転写した後、ＭＴ１−ＭＭＰ及びＭＭＰ−１に対する３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブとそのナイロン膜をハイブリダイズさせた。１８ ＳｒＲＮＡのハイブリダイゼーションからＲＮＡ量は等しいことが分かる。
【図９】「ハララギン処理によって、処理された線維芽細胞内の活性ＭＴ１−ＭＭＰ及びＭＭＰ−１量が増加する」 ハララギン非存在下又は１００ｎＭのハララギン存在下（＋Ｊ）で、単層（ｍ）で２４時間又は４８時間増殖させた線維芽細胞から、未精製膜調製物（Ａ）又は調整培地（Ｂ，Ｃ）を調製した。ウエスタンブロット分析から、４０μｇの膜調製物又は２０μｌの調整培地を、還元条件下で１０％ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ＭＴ１−ＭＭＰタンパク質（Ａ）をヒトＭＴ１−ＭＭＰ（１１４−１Ｆ２、１μｇ／ｍｌ）に対する単一特異性抗体を使用して検出し、一方ＭＭＰ−１タンパク質はヒトＭＭＰ−１に対するウサギポリクローナル抗体を使用して検出した（Ｃ）。結合した抗体はＥＣＬを使用して可視化した。プロＭＴ１−ＭＭＰ（６３ｋＤａ）、活性ＭＴ１−ＭＭＰ（６０ｋＤａ）、プロＭＭＰ−１（５２／５７ｋＤａ）、及び活性ＭＭＰ−１（４２／４６ｋＤａ）の分子量は右に示している。ゼラチンザイモグラフィー（Ｂ）のために、非還元条件下で１５μｌの調整培地を１０％ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル上で分離した。プロＭＭＰ−２（７２ｋＤａ）及び活性化ＭＭＰ−２形態（６２／５９ｋＤａ）の分子サイズを右に示している。
【図１０】「ハララギンで処理した後には、線維芽細胞中でα２インテグリンが増加する」線維芽細胞を、ハララギン非存在下（ａ）又はハララギン存在下（ｂ）で４８時間単層増殖させた。Ａ：固定後、これらの細胞をウサギ抗α２インテグリン抗体（１：４００）で染色した。結合した抗体を、ヤギ抗ウサギＣｙ３−結合抗体を使用して検出した。バーは２０μｍを表す。Ｂ：一方、２０μｇの全溶解産物を還元条件下で、１０％ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル上に展開した。α２インテグリンサブユニットは、ポリクローナル抗α２インテグリン抗体（１：２００）を使用して検出した。結合した抗体はＥＣＬで可視化した。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention comprises administering an effective amount of a nucleic acid encoding a PIII snake venom Zn-metalloproteinase (SVMP) or a fragment, peptide, derivative, homologue, or mimetic thereof, or any one of these compounds. And a method for inducing matrix metalloproteinase (MMP) expression in fibroblasts. In particular, the invention relates to the use of the above compounds for the treatment or prevention of patients in need of treatment or prevention of fibrosis or sclerosis. Further, the present invention provides for the patient's skin reconstruction or wound comprising administering to a patient in need of treatment a physiologically effective amount of PIII SVMP, preferably jarraghagin, or a functionally equivalent derivative thereof. It relates to a treatment method. Furthermore, the present invention includes cell-based identification and isolation methods for compounds that modulate MMP activity or expression, as well as their use in methods of manufacturing anti-cancer drugs and anti-cancer drugs that assist wound treatment. The present invention also relates to kits useful for carrying out the methods as described above, and artificial connective tissue comprising PIIISVMP or functionally equivalent derivatives thereof.
[0002]
Several documents are cited herein. Each document cited herein (including manufacturer's specifications, instructions for use) is incorporated herein by reference, but not all cited documents are prior art with respect to the present invention.
[0003]
[Prior art]
Fibrosis, ie excessive formation of fibrous or scar tissue, is a major problem in medicine. Scar tissue blocks the arteries, immobilizes joints, damages internal organs, and greatly disrupts the body's ability to maintain vital functions.
Fibrosis can occur in the form of adhesions, keloid tumors, or hypertrophic (very severe) scarring after surgery. Fibrosis can cause contracture and joint dislocation after severe collisions, wounds, or orthopedic trauma and can occur in any organ, including hepatitis (cirrhosis), hypertension (heart failure), tuberculosis (pulmonary fibrosis) ), Scleroderma (fibrotic skin and viscera), diabetes (nephropathy), and atherosclerosis (fibrous blood vessels).
Ironically, the process planned to repair the body itself can cause very dangerous problems. Like epoxy resin, scar tissue only plays a structural role. This fills the gap, but cannot contribute to the function of the organ in which this tissue appears. For example, when the heart muscle damaged by hypertension is replaced with fibrous scar tissue, the elasticity of the heart begins to decline, thus reducing its function. Similarly, pulmonary fibrosis can become a life-threatening symptom of hardening and atrophying of the lungs. Also, fiber growth spreads and invades the surrounding healthy tissue even after the original trauma has healed. Thus, if there is too much scar tissue, these become physiological obstacles that cause deformation, physical disability, or death.
In most cases, fibrosis is a reactive process, and it has been shown that several different factors can regulate the pathway that leads tissue to fibrosis. Such factors include an early inflammatory response, a local increase in the fibroblast population, changes in the synthesis function of fibroblasts, and changes in the control of collagen biosynthesis and degradation.
Thus, one method of treatment is directed at early inflammatory responses. Treatment with topical corticosteroids has been successful only when used for early fibrosis. However, steroid treatment has little or no effect after scar tissue has already formed. Furthermore, symptoms may worsen when hydrocortisone is administered for a long period of time in pulmonary fibrosis and the like.
The second method is to slow down the proliferation of cells involved in increased collagen synthesis. In general, this involves fibroblasts, except for the vasculature where smooth muscle cells deposit collagen.
A number of therapies have been devised based on modulation of the synthetic function of fibroblasts or smooth muscle cells. Like most cells, fibroblasts and smooth muscle cells are regulated by cytokines (factors secreted in response to effects that modify the function of target cells). γ interferon is a lymphokine (cytokine produced by lymphocytes) known to suppress fibroblast proliferation and collagen synthesis. Similarly, β-interferon, a monokine (a cytokine produced by macrophages), performs the same function. For example, US Pat. No. 5,312,621 teaches the use of these cytokines for the treatment of fibrosis. Although promising, many of these substances and compositions are known to have serious side effects, which limits their effectiveness.
Yet another treatment strategy involves directly affecting the metabolism of collagen and other components of fibrous tissue. For example, drugs that interfere with collagen biosynthesis, accumulation, and catabolism have been used to treat fibrosis. Many drugs have been used to inhibit collagen synthesis, including, for example, pyridone, alkadiene, benzoquinone, pyridine, oxalyl amino acids, and derivatives of proline analogs. However, all of these drugs have the disadvantage that they inhibit the harmful synthesis that occurs during fibrosis, as well as the necessary collagen synthesis during normal times. Another possible approach is to deliver therapeutic genes, such as human metalloprotease or collagenase, human MMP-1, MMP-2, to fibrous tissue and / or fibroblasts, which are deposited Decompose excess collagen protein and / or inhibit excessive synthesis of collagen protein.
[0004]
The adhesion of fibroblasts to natural type I collagen is1β1And α2β1Regulated by integrin receptors (1,2). Recently, Knight et al. (3) showed that the triple helical collagen type I and type IV sequence GFOGER (O, hydroxyproline) is α1β1And α2β1It was shown to be recognized by both integrins. Several studies have identified the collagen binding site of the I-domain of the α chain integrin subunit. The I-domain is composed of about 200 amino acids and has homology with the von Willebrand factor A domain (4-6).
When human dermal fibroblasts come into contact with fibrillar collagen type I, a series of events occur. Acquired phenotypic tissue-like properties in fibroblasts, which are not seen in fibroblasts grown in monolayer cultures on plastics or on monomeric collagen type I (7, 8). When fibroblasts are seeded in the loose network structure of these collagen fibrils, the expression of type I collagen is suppressed (9), MMP-1 synthesis is induced (10), and pro-MMP-2 is activated. (11). In addition, α2β1It was observed in fibroblasts that collagen bound to integrin contributes to collagen matrix reconstitution and contraction (12, 13) and induces MMP-1 synthesis (14, 15). Inhibition of type I collagen synthesis in this system1β1It was caused by binding to integrin (14). Recently, in addition to MMP-1, the inventors have also developed MT1-MMP as α2β1We found that integrin receptors are induced at both the mRNA and protein levels by linking to fibrillar collagen (16). In the collagen lattice structure, α2β1While integrin synthesis is increased, α1β1And α3β1It was found that the expression of other collagen integrin receptors such as was not affected (13).
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, an active substance that regulates the expression of matrix metalloproteinases, which is considered extremely useful for the treatment of fibrosis, is desired, and other diseases involving fibrosis and abnormal collagen turnover such as cancer, particularly melanoma. There is also a need for a method of identifying substances used in the treatment of this.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
In one embodiment, the present invention provides an effective amount of a PIII snake venom Zn-metalloproteinase (SVMP) or fragment, peptide, derivative, homologue, or mimetic, or any one of these compounds. Methods and compositions for inducing the expression of matrix metalloproteinases (MMPs) in fibroblasts comprising administering a nucleic acid encoding one. In a preferred embodiment, the MMP is MMP-1 or membrane-type MT1-MMP (MMP-14). A preferred compound that induces expression of MMP is a snake venom metalloproteinase hararagin, or a fragment, peptide, derivative, homologue, or mimetic compound thereof. These substances can be administered in vitro or in vivo with a pharmaceutical carrier or excipient. Preferred embodiments of the substances of the invention can be administered topically to patients in need of treatment, for example the skin, in particular hypertrophic scars and keloids (by local intradermal injection), lungs (eg drug inhalation) Or by the liver (by liver perfusion).
[0007]
In preferred embodiments, the present invention provides liver, lung, kidney, and heart fibrosis, atherosclerosis, cirrhosis, local and systemic scleroderma, keloids, hypertrophic scars, and proliferative vitreous retina. A method of treating or preventing fibrosis such as symptom or sclerosis is provided. Also provided are compositions for use in these methods. Preferably, the method of the invention comprises an amount of PIII SVMP sufficient to induce MMP expression, or a fragment, peptide, derivative, homologue, or mimetic thereof, or a nucleic acid encoding any one of these compounds, Administration to a patient in need of treatment or prevention. Therefore, the composition of the present invention preferably contains an amount of the compound or nucleic acid sufficient for inducing the expression of MMP. In yet another embodiment, the present invention relates to the use of these compounds for methods of patient skin reconstruction or wound treatment.
[0008]
In another aspect, the present invention relates to the MMP activity of a candidate compound or mixture of compounds in the presence of PIII SVMP, or a fragment, peptide, derivative, homologue, or mimetic thereof, or a nucleic acid as defined above. The present invention relates to cell-based identification and isolation methods for compounds that modulate MMP activity and expression, including examining (assessing) the ability to promote or suppress expression.
The present invention further provides a gel contraction assay to identify compounds that prevent the progression of fibrosis. In general, this assay involves contacting a cell with a test compound and a known substance that stimulates gel shrinkage, and whether the presence of the test compound inhibits gel shrinkage compared to the absence of the test compound. Including examining. Compounds isolated in this way can be compounds that enhance or suppress PIII SVMP-mediated induction of MMP expression, and are therefore considered to be agonists or antagonists / inhibitors, respectively. The cell-based assay of the present invention is preferably performed on fibroblasts, most preferably performed on dermal fibroblasts.
If the compound is found to reduce MMP activity or reduce the amount of active MMP, the compound is advantageously used in the manufacture of anticancer drugs (preferably for the treatment of melanoma). In another embodiment, the compound can be used in the manufacture of a medicament to aid in wound treatment.
The present invention further provides kits useful for performing the methods and assays described above. Furthermore, the present invention provides an artificial tissue containing at least one of the above PIII SVMP and related compounds.
[0009]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention, in contrast to the phenomenon observed in platelets, is included in jararahagin, one element of the PIII snake venom metalloproteinase (SVMP), and so-called ADAM (disintegrin-like and metalloproteinase family of mammalian proteins) The homologue of the molecule is the fibroblast integrin receptor α2β1And is based at least in part on the finding that collagen-like cell signaling such as up-regulation of MMP1 and MT1-MMP is performed. Thus, such venom metalloproteinases and their active fragments and derivatives can be used to induce MMP expression in fibroblasts and are therefore associated with abnormal collagen deposition such as fibrosis (eg hypertrophic scars) Can be used to treat diseases. The present invention relates to the use of a cell in vitro model in which fibroblasts are incorporated into a three-dimensional matrix based on fibrillar type I collagen, as well as human skin fibroblasts when halalagine is compared to other types of cells. It is also based on the finding that it will be a useful tool for studying the molecular mechanisms of cellular activity induced by collagen.
Accordingly, one embodiment of the present invention encodes an effective amount of a PIII snake venom Zn-metalloproteinase (SVMP) or fragment, peptide, derivative, homologue, or mimetic, or any one of these compounds. The present invention relates to a method for inducing expression of matrix metalloproteinase (MMP) in fibroblasts, which comprises a nucleic acid. Preferably the fibroblast is a dermal fibroblast.
[0010]
Matrix metalloproteinases (MMPs) are a family of zinc-dependent extracellular endoproteinases. They can degrade all components of the extracellular matrix (ECM) and basement membrane. New proteolytic functions are defined by degradation of non-matrix macromolecules such as myelin basic protein, inactivation of α-antitrypsin, release of growth factors from ECM, and cleavage of bioactive molecules from the cell surface . These have been implicated in numerous pathogenic processes such as tumor invasion and metastasis, rheumatoid and osteoarthritis, angiogenesis, and wound healing, see, for example, Skiles et al., Curr. Med. Chem. 8 (2001), 425-474, Woessner, Mol. Biotechnol. 22 (2002), 33-49, Overall and Lopez-Otin, Nat. Rev. Reference may be made to Cancer 2 (2002), 657-672.
[0011]
MMPs play a major role in normal development, morphogenesis, homeostasis, and tissue remodeling. Thus, compounds that modulate MMP expression or activity can be used in the treatment of the pathogenic process and / or as substances that aid in tissue remodeling.
[0012]
Snake venom metalloproteinases (SVMP) are included in the Reprolsin family of metalloproteinases (M13). The ADAM (disintegrin-like and metalloproteinase) / MDC (metalloproteinase, disintegrin, cysteine-rich) group of proteins is also included in the Reprolsin family (17). The SVMP PIII class and ADAM share homologous metalloproteinases, disintegrins, and cysteine-rich domains (18). Because of these similarities, SVMP has functioned as an early model of ADAM function. PIII SVMP is responsible for proteolysis of extracellular matrix and platelet α2β1It has been shown that it is possible to inhibit platelet aggregation by blocking the binding of collagen to (17).
Halragin, a hemorrhagic metalloproteinase of Bothrops jararaca, is one of the major toxic components responsible for the local and systemic hemorrhage observed in poisoned individuals (19). Halalagins have been shown to degrade components of the microvasculature basement membrane and some plasma proteins important for hemostasis (20, 21). In addition, it promotes bleeding by inhibiting collagen-induced platelet aggregation (22). With respect to this poison, the metalloproteinase domain of halalagine produces halalagin-C, a fragment of halalagine disintegrin and cysteine-rich domain, through a proteolytic process. α2β1Integrins can also interact with halalagin-C, but this interaction appears to be weaker than that with halalagine (23), which is a further N-terminal structure of halalagin-α.2β1Suggests an association with binding. Interestingly, synthetic peptides based on the sequence of the metalloproteinase domain of halalagin are recombinant α2Binds to the I-domain of the integrin chain and thereby α2It has been shown that the binding of the -I domain to collagens I and IV and to laminin-1 is prevented (24).
According to the present invention, integrin α mimics the interaction of fibrocollagen with fibroblasts.2β1And the ability of halalagin to regulate the expression of matrix metalloproteinases MMP-1 and MT1-MMP was examined in detail. In contrast to previous work done on platelets, halalagin that binds to fibroblasts2β1Cell activity similar to that induced by fibrillar type I collagen bound via integrin was obtained. These results indicate that other disintegrin-like / cysteine-rich domain-containing proteins (eg, ADAM) can not only bind to integrins as previously shown, but also cellular activities such as gene and protein expression. It is expected that a signal that alters the activity will be generated through the integrin and show similar biological activity, although it may not be identical to halalagin.
[0013]
As described above, halalagins have been shown to regulate MMP-1 and MT1-MMP expression. Accordingly, it is preferred that the PIII SVMP or a compound derived therefrom is capable of modulating the expression of MMP-1 and / or membrane-type MT1-MMP (also referred to as MMP-14). The invention also relates to the use of fragments, peptides or derivatives, homologues, analogs or mimetics derived from PIII SVMP (preferably halalagine). The nucleotide and amino acid sequences of halalagine are known to those skilled in the art, see the previous literature and references section. These sequences are available from GenBank as Accession No. X68251 S49385 (Version X68251.1 GI: 62467) and published by Paine et al. (J. Biol. Chem. 267 (1992), 22869-22876). Similarly, the nucleotide and amino acid sequences of Catrocollastatin, a snake venom protein of Crotalus atrox that inhibits platelet adhesion to collagen, were also obtained from GenBank by Accession No. U21003 (Version U21003.1 GI: 710353) and published by Zhou et al. (Biochem. J.307 (1995), 411-417).
[0014]
Preferably, any one of these derivatives has an amino acid sequence that is at least 40% similar, more preferably 60%, even more preferably 80% similar or identical to the amino acid sequence of halalagine, MMP expression can be regulated as described in the Examples. In addition to or alternatively to the PIII SVMP and fragments, peptides, derivatives, homologues or mimetics thereof may also be α2β1Compete with native hararagins for integrin receptor binding. According to the discovery of halalagin, the bond is α2β1It is preferably performed in the soluble ectodomain of the integrin. Competition assays to detect compounds that can bind well to halalagin can be designed according to the examples. Optimal sequence alignment for aligning comparison windows is described by Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2 (1981), 482, a local homology algorithm, Needleman and Wunsch J. et al. Mol. Biol. 48 (1970), 443 homology alignment algorithm, Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (US SA) 85 (1988), 2444 Study of similar methods, computer implementation of these algorithms (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFSTA, Genetics Computer Group, 5 by Wisconsin Genetics Software Release 7.0) Science Dr., Madison, Wis.), Or tests obtained with various selected methods and optimal alignments (ie, maximizing the homology ratio over the comparison window). Preferably, residue positions that are not identical differ by conservative amino acid substitutions. A conservative amino acid substitution means interchangeable with a residue having a similar side chain. For example, the group of amino acids having an aliphatic side chain is glycine, alanine, valine, leucine, and isoleucine, and the group of amino acids having an aliphatic hydroxyl side chain is serine and threonine, having an amide-containing side chain The group of amino acids is asparagine and glutamine, the group of amino acids having aromatic side chains is phenylalanine, tyrosine, and tryptophan, and the group of amino acids having basic side chains is lysine, arginine, and histidine A group of amino acids having sulfur-containing side chains are cysteine and methionine. Preferred conservative amino acid substitution groups are valine-leucine-isoleucine, phenylalanine-tyrosine, lysine-arginine, alanine-valine, and asparagine-glutamine. Preferably, said fragment, derivative, homologue, analogue or mimetic is itself a peptide compound.
[0015]
The terms “protein”, “polypeptide”, and “peptide” are used interchangeably herein. Preferably, however, the peptide comprises a proteinaceous molecule comprising from about 2 amino acid residues to about 50 amino acid residues. The integrin-binding motif of hararagin is not known so far. However, α2β1A peptide of about 8 amino acids capable of binding to is reported. This peptide has the sequence motif RKKH present in the metalloproteinase domain of halalagine as described by Ivaska et al. (24).
Preferably, the peptides in the present invention have from about 3 amino acid residues to about 40 amino acid residues. Even more preferably, the peptides in the present invention have from about 4 amino acid residues to about 30 amino acid residues. Particularly preferred embodiments of the invention include peptides having from about 4 amino acid residues to about 20 amino acid residues (eg, 4-15 amino acid residues and 6-8 amino acid residues). The amino acid sequence of the peptide is derived from or based on snake venom, but does not necessarily correspond to the full length of snake venom, but rather is part of it.
The peptide may be glycosylated or non-glycosylated and / or may include other molecules in a range that is condensation, cross-linking, binding, or other methods associated with the peptide, such as amino acids , Lipids, carbohydrates, or other peptides, polypeptides, or proteins. As used herein, “peptide” includes peptides having a certain amino acid sequence, as well as peptides related to amino acids, lipids, hydrocarbons, or other molecules such as other peptides, polypeptides, or proteins. In the description of the present invention, molecules having a sequence of at least about 50 amino acids are considered peptides.
The peptide of the present invention can be produced by a chemical synthesis technique or can be produced by a recombinant DNA technique described in detail later. The peptides of the present invention may be fragments of larger molecules derived from snake venom. Fragments can be natural fragments or they can be obtained by the action of proteases, peptidases, amidases, lysins, or other enzymes, and by ultrasonic disruption, heat, chemical disruption, and / or shearing.
The amino acid sequence of the PIII SVMP peptide is believed to be derived from or based on a snake venom toxin, more specifically halalagine. However, this does not necessarily mean that the preferred peptide is a derivative of the natural snake venom toxin, and a particularly useful peptide according to the present invention is chemically synthesized based on the amino acid sequence of the larger snake venom toxin. The Preferred snakes include Viperidae and Crotalidae snakes, such as the genus Bothrops and Crotalus. Particularly preferred snakes are Bothrops jararaca and Crotalus atrox.
[0016]
As previously mentioned, integrin receptor alpha is present in fibroblasts as opposed to that seen in platelets.2β1It has been shown that halalagine bound to collagen causes signaling of collagen-like cells such as MMP-1 and MT1-MMP upregulation. Inactivation of the metalloproteinase domain did not affect such properties of halalagin. Thus, in fibroblasts, the snake venom metalloproteinase halalagine functions as a collagen-mimetic substrate that binds and activates integrins. Assuming that there is homology between molecules within the metalloproteinases, halalagine disintegrin-like and cysteine-rich domains, and ADAM (disintegrin-like and metalloproteinase) protein families, the present invention provides biological functions of these proteins. 2 shows the ability of disintegrin-like / cysteine-rich domains in ADAM as cell signaling agents to induce responses associated with. In addition to the domain structure described for the P-III class of venom proteins, ADAM has an epidermal growth factor-like domain, a transmembrane domain, and a cytoplasmic domain. These domains are not necessarily required for use according to the present invention and therefore may not be used or may be replaced with other functional domains. Descriptions of venom metalloproteinase structures and similarities and differences between venom proteins and the ADAM family of proteins are described, for example, in Jia et al., Toxicon 34 (1996), 1269-1276. The relationship between ADAM proteins and their PIII SVMP is well known to those skilled in the art and is described, for example, in Calvete et al., Protein Science 9 (2000), 1365-1373. The nucleotide and amino acid sequences of ADAM are readily available from www (world wide web) and GenBank. For example, the known ADAM GenBank Accession No. And three websites that have access to sequence alignments and are frequently updated are Howard et al., Biochem. J. et al. 348 (2000), 21-27, which is incorporated herein by reference. This discovery is the result of the recently published Bridges et al. Biol. Chem. 277 (2002), 3784-3792, which is a member of the ADAM family and integrin alpha.4β1Have reported the interaction. Accordingly, the PIII SVMP homologue that can be used in the present invention may belong to disintegrin and metalloproteinase (ADAM). Methods for the preparation of homologues, derivatives, muteins, or equivalents of ADAM proteins are also known to those skilled in the art, see for example WO 97/40072 (the contents of which are incorporated herein). The vectors and host cells described in WO97 / 40072 can also be used for the expression of the aforementioned proteins.
[0017]
As shown in the examples, PIII SVMP halalagine affects the biological activity observed in the absence of metalloproteinase activity. Thus, this particular activity of certain PIII SVMPs can be stopped. Alternatively, some or all of the proteinase domain can be deleted or replaced. Here, the disintegrin-like / cysteine-rich domain of PIII SVMP is α2β1It has been shown that it is involved in binding to integrins and therefore will most affect the induction of matrix metalloproteinase expression and the delay of collagen lattice contraction. Therefore, in the method of the present invention, it is considered sufficient to use at least the disintegrin-like / cysteine-rich domain of PIII SVMP. Thus, said fragment, peptide, derivative, homologue, analogue or mimetic of PIII SVMP has these domains, has at least a part of these domains or is derived from these domains, Or it is preferable to design based on these structures.
[0018]
As used herein, “derivative” includes a portion, fragment, and portion of the subject PIII SVMP (particularly halalagine). Derivatives may also contain one or more amino acid substitutions, deletions and / or additions. Homologues include (poly) peptides that are functionally, structurally, or stereochemically similar to snake venoms of the same species or genus or family. Alternatively, some of the amino acids of the original PIII SVMP polypeptide may be replaced with amino acids that have a similar charge, spatial configuration, conformation, or effect on peptide conformation. All these homologs are contemplated by the present invention. Analogs and mimetics include molecules that contain unnatural amino acids or molecules that do not contain amino acids but have the same function as PIII SVMP in the assays described in the Examples. Natural product screening is one useful method for identifying analogs and mimetics. However, analogs of PIII SVMP that are considered in the present invention include side chain modifications, the introduction of unnatural amino acids and / or their derivatives during (poly) peptide synthesis, and the use of crosslinkers, (poly) The use of other methods of constraining the conformation of peptide molecules or their analogs is also contemplated.
Examples of side chain modifications contemplated in the present invention include amino group modifications such as NaBHL after reaction with an aldehyde.4Reductive alkylation by reaction with methylamine, transfer of amidine with methylacetimidate, acylation with acetic anhydride, carbamylation of amino group with cyanate, amino group with 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) Trichlorobenzylation, acylation of amino acids with succinic anhydride and tetrahydrophthalic anhydride, and reaction with pyridoxal-5-phosphate followed by NaBH4And pyridoxylation of lysine to be reacted with. Further possible modifications and suitable methods for generating peptides and peptide analogs are described, for example, in Goodman et al., Biopolymers 47 (1998), 127-142, WO 99/24055, and WO 99/50281. These descriptions are incorporated herein by reference.
Furthermore, in the present invention, a chemical analog of the subject PIII SVMP that can act as an antagonist or agonist of MMP can also be used. Chemical analogs do not necessarily have to be derived from the peptide itself, but may have some degree of conformational similarity. For example, analogs in the present invention are represented by antibodies or anti-idiotype antibodies that represent the internal structure of the epitope of the binding site of halalagine. Such antibodies or their corresponding binding sites are particularly important. Because, as shown in Examples 1 and 2, the known α2And β1The antibody does not completely inhibit the binding of halalagin to the receptor, and when combined with the observation that the binding of halalagin does not appear to depend on the presence of a divalent cation, This is because the binding site for collagen may be different. Therefore, Hararagin α2β1Antibodies or corresponding binding molecules that mimic binding to integrin are expected to be particularly useful in the methods of the invention. Methods for preparing antibodies and anti-idiotypic antibodies are known to those of skill in the art, see, eg, Vogel et al. Mol. Biol. 19 (2002), 729-735. Alternatively, chemical analogs can be specifically designed to mimic certain physiological properties of PIII SVMP. Chemical analogs can be chemically synthesized or detected by natural product screening or the like.
[0019]
Most of the embodiments are described herein by way of example of PIII SVMP, particularly halalagine, and their derivatives. However, these descriptions also apply to the aforementioned fragments, peptides, homologues, analogs, and mimetic compounds, and nucleic acids encoding any one of these compounds.
[0020]
In yet another aspect, the present invention relates to a method of treating or preventing fibrosis or sclerosis in a patient, wherein the patient's PIII SVMP, or a fragment, peptide, derivative, homologue, or mimetic thereof, or a nucleic acid as described above. Administration to a patient in an amount effective to treat or prevent fibrosis or sclerosis. The present invention also relates to a composition used for the treatment or prevention of fibrosis or sclerosis in a patient, the composition comprising PIII SVMP, or a fragment, peptide, derivative, homologue, or mimetic thereof, or the nucleic acid described above. In an amount effective to treat or prevent fibrosis or sclerosis in the patient.
[0021]
In one embodiment, PIII SVMP or a derivative thereof is first generated in vitro and then administered to the cell or patient in need thereof. In another embodiment, a nucleic acid encoding PIII SVMP, or a cell or derivative expressing said nucleic acid is administered to the cell or a patient in need thereof.
Typically, an expression vector used for expression of a PIII SVMP protein in vivo or in vitro comprises a nucleic acid encoding PIII SVMP or a derivative thereof linked under the control of at least one transcription control sequence. Regulatory sequences are known in the art and are selected to directly express the protein of interest in the desired manner (time and place). Transcriptional control sequences are described, for example, in Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Examples of vectors suitable for the expression of foreign proteins include pBR322-derived plasmids, pEMBL-derived plasmids, pEX-derived plasmids, pBTac-derived plasmids, and pUC-derived plasmids. It is used for expression in prokaryotic cells such as E. coli.
Preferred mammalian expression vectors have a prokaryotic sequence to facilitate the propagation of the vector in bacteria and also have one or more eukaryotic transcription units that are expressed in eukaryotic cells. Vectors derived from pcDNAI / amp, pcDNAI / neo, pRc / CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo, and pHyg are suitable mammals for transfection of eukaryotic cells. It is an example of an animal expression vector. Some of these vectors are modified with sequences from bacterial plasmids such as pBR322 to facilitate replication and drug resistance selection in both prokaryotic and eukaryotic cells. Alternatively, derivatives of viruses such as bovine papilloma virus (BPV-1), or Epstein Barr virus (pHEBo, derived from pREP, and p205) can also be used for transient expression of eukaryotic proteins. Various methods used for the preparation of plasmids and transformation of host organisms are known in the art. For other expression systems suitable for both prokaryotic and eukaryotic cells, as well as general recombination methods, see Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed. , Ed. , Sambrook, Fritsch, and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989) Chapters 16 and 17.
In a preferred embodiment, the promoter is a constitutive promoter, such as a strong viral promoter, such as a CMV promoter. The promoter may be cell specific or tissue specific where substantial transcription of DNA occurs only in certain cells (eg, technically antigen presenting cells), such as fibroblasts or smooth muscle cells, It may be a promoter specific for retinal cells or RPE cells. A relatively specific promoter for fibroblasts is α2(I) It is considered to be a collagen promoter (also present in bone cells) (Zheng et al., Am. J. Pathol. 160 (2002), 1609-1617, Antoniv J. Biol. Chem. 276 (2001), See 21754-21774). The promoter specific to smooth muscle is, for example, the promoter of SM22alpha, a smooth muscle cell marker (Akyura et al., Mol. Med. 6 (2000), 983). A promoter specific for retinal pigment epithelial cells is, for example, the promoter of the Rpe65 gene (Boulanger et al., J. Biol. Chem. 275 (2000), 31274). The promoter may be an inducible promoter, for example a metallothionein promoter. Other inducible promoters include promoters that are controlled by inducible binding or activation of transcription factors, for example, US Pat. Nos. 5,869,337 and 5,830,462 to Crabtree et al. Molecular inducible gene expression (gene switch) is described), international patent applications WO94 / 18317, WO96 / 06111, WO96 / 41865, etc., and reports on tetracycline system reported by Bujard et al. Other heterologous transcription systems, also commonly referred to as allosteric “off-switches”, Gossen and Bujard (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 5547) and Bujard et al., US Pat. Nos. 5,464,758, 5, 650,298, and 5,589,362. Other inducible transcription systems include control of steroids or other hormonal systems.
A nucleic acid can also be introduced into a cell so that it is expressed with another DNA sequence encoding another substance (which may be the same or different DNA molecule as the nucleic acid). Specific substances will be described in detail later. In one embodiment, the DNA encodes a polymerase for transcription of the DNA, can include a recognition site for the polymerase, and the injectable formulation can include an initial amount of polymerase.
In some cases, it is preferred that the nucleic acid be translated for a limited time such that delivery of the polypeptide is transient. This can be achieved, for example, by using an inducible promoter.
The nucleic acid used in the present invention can be partially or wholly produced by chemical synthesis, for example, see Beaucage and Carruthers, Tetra. Letts. 22 (1981), 1859-1862, or Matteucci et al., J. Biol. Am. Chem, Soc. 103 (1981), 3185, and can be produced by a commercially available automated oligonucleotide synthesizer. Double-stranded fragments can be obtained from single-stranded products by chemical synthesis, either by synthesizing complementary strands and annealing each other's strands under appropriate conditions, or using a DNA polymerase with appropriate primer sequences. And can be obtained by synthesizing complementary strands.
Nucleic acid operably linked to all necessary transcriptional and translational control elements can be injected into a patient as naked DNA. In a preferred embodiment, the nucleic acid and the necessary control elements are used as they are present in the plasmid or vector. Accordingly, the nucleic acid of the present invention may be non-replicating DNA, but is inserted into a plasmid that may further contain a replicator. The DNA may be a sequence designed not to integrate into the host cell genome.
Preferred vectors used according to the invention are expression vectors, ie vectors that allow the expression of nucleic acids in cells. Preferred expression vectors are expression vectors that contain both prokaryotic sequences to promote vector propagation in bacteria and one or more eukaryotic transcription units that are expressed in eukaryotic cells, See above. Any means for introducing a nucleic acid into a mammal (human or non-human) can be utilized in carrying out the present invention to carry various vectors into the intended recipient. In one embodiment of the invention, the vector is introduced into the cell by transfection, ie by delivery of a complex with “naked” DNA or colloidal dispersion. Colloidal systems include polymer complexes, nanocapsules, microspheres, beads, and lipid systems such as oil-in-water emulsions, micelles, mixed micelles, and liposomes. Such delivery systems can also be used for PIII SVMP proteins, peptides and derivatives thereof. A preferred colloidal system of the present invention is a lipid-complexed DNA or a DNA mixed with liposomes. In the former method, prior to DNA formation, for example, a plasmid containing a transgene having the desired DNA construct plus lipid is first experimentally optimized for expression (eg, 5 ′ An intron is introduced into the untranslated region to remove unwanted sequences (Felner et al., Ann. NY. Acad. Sci. (1995) 126-139). DNA construction (eg, blending with various lipid or liposomal materials) can then be performed by known methods and materials and introduced into a host mammal, see, for example, Canonico et al., Am. J. et al. Respir. Cell. Mol. Biol. 10 (1994) 24-29, Tsan et al., Am. J. et al. Physiol. 268, Alton et al., Nat. Genet. 5 (1993), 135-142, and Carson et al. (US Pat. No. 5,679,647).
In a preferred method of the invention, a viral vector is used. The transgene is incorporated into various viral vectors useful for gene therapy such as recombinant retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus (AAV), and herpes simplex virus-1, or recombinant bacteria or eukaryotic plasmids. used. A variety of viral vectors can be used in the practice of the invention, but methods utilizing AAV and adenovirus are particularly important. Such vectors are generally understood to be recombinant gene transfer (delivery) systems suitable for exogenous gene transfer into vivo, particularly humans. The following further guidance regarding the selection and use of viral vectors is useful in the practice of the present invention. As described in detail below, such embodiments of the subject expression constructs can be used specifically in various in vivo and ex vivo gene therapy protocols.
Therapeutic proteins useful for the treatment of eg cirrhosis and systemic fibrosis (eg renal fibrosis, pulmonary fibrosis, hypertrophic scars and skin keloids) and / or other target organs that may be affected Vectors that can be used for expression of the exogenous gene encoding are described, for example, in WO01 / 21761.
[0022]
A preferred method of using the recombinant vector is by intravenous administration, in which a therapeutically effective amount is administered in a unit dosage regime convenient for fibrosis patients. This dosage regimen may be adjusted according to the degree of the disease. Generally about 10 per patient for viral vectors10Individual virus particles are used in unit dose. Preparation of pharmaceutical compounds, including recombinant vectors, can be performed using standard techniques well known to those skilled in the art in combination with conventional pharmaceutically acceptable carriers, and as conventional pharmaceutically acceptable carriers. Starch, glucose, lactose, sucrose, gel, malt, rice, flour, chalk, silica gel, magnesium stearate, sodium stearate, glyceryl monostearate powder, NaCl, glycerol, propylene glycol, water, ethanol, and these However, the present invention is not limited to these. These compounds can take pharmaceutical forms such as solutions, suspensions, pills, tablets, capsules, powders, sustained release formulations and the like.
[0023]
Another method according to the invention for the treatment or prevention of fibrosis or sclerosis in a patient involves a cell therapy protocol. For example, dermal fibroblasts genetically engineered to express PIII SVMP or its derivatives can be used to deliver these compounds systemically over a long period of time. Corresponding methods for in vivo production and systemic delivery of therapeutic antibodies are described, for example, by Noel et al. Invest. Dermatol. 115 (2000) 740-745. Similarly, this method can be used to deliver MMP antagonist compounds identified and isolated by the methods of the present invention, which are described in further detail below.
[0024]
When using protein or peptide material, a cloned nucleic acid encoding the PIII SVMP or derivative thereof described herein by performing molecular cloning into an expression vector having a suitable promoter and other suitable transcriptional control elements Can be expressed recombinantly and transferred to prokaryotic or eukaryotic host cells, thereby producing recombinant proteins. Such operating methods are described in detail in the aforementioned Sambrook et al. Document and are well known in the art. Expression vectors are described herein and are described in E. coli. It can be used to express eukaryotic genes in various hosts such as bacteria such as E. coli, cyanobacterium, plant cells, insect cells, fungal cells such as yeast cells, and animal cells. An expression vector can be introduced into a host cell by any method selected from transformation, transfection, protoplast fusion, lipofection, and electroporation, but is not limited to these methods. Cells containing the expression vector can be propagated by cloning and analyzed for the production of PIII SVMP protein or a derivative thereof for each. Identification of these host cell clones can be done by several means, including but not limited to, immunological activity against anti-PIII SVMP antibodies and / or the presence of host cell associated PIII SVMP activity. It is not a thing.
Expression of PIII SVMP DNA can also be performed using synthetic mRNAs generated in vitro. Synthetic mRNA, or mRNA isolated from PIII SVMP producing cells, can be efficiently translated in a variety of cell-free systems such as, but not limited to, wheat germ extract and erythrocyte extract, Although not limited, cell-based systems such as microinjection into frog oocytes can also be efficiently translated, and microinjection into frog oocytes is generally preferred. Therefore, PIII SVMP or a derivative thereof can be obtained by culturing the host of the present invention under conditions where the nucleic acid is expressed, or performing in vitro translation of the nucleic acid and recovering the produced protein.
The transformed host can be grown in a fermentor and cultured by techniques known in the art to optimize cell growth. The protein can then be isolated from the growth medium, cell lysate, or cell membrane fraction. The expressed protein can be purified by standard methods in the art such as ammonium sulfate fractionation, affinity column, column chromatography, gel electrophoresis, eg, Scopes, “Protein Purification”, Springer-Verlag, N. . Y. (1982). For pharmaceutical applications, a substantially pure protein with a homogeneity of at least about 90-95% is preferred, with a homogeneity of 98-99% or more being most preferred. After partial or total purification as required, the protein can be used for therapy (including in vitro) or used in the development and implementation of analytical methods.
[0025]
The size of the compound constituting the present invention is preferably less than 500 to 600 Da which is the “wall of bioavailability” so that it can pass through the lipophilic cell membrane of the cell. On the other hand, in the case of protein therapy, it has recently been shown that enzymes that fuse with a portion of the HIV virus protein can cross the cell membrane and maintain in vivo enzymatic activity in mice (Schwarze, Science 285). (1999), 1569-1572). It has been known for almost 10 years that the HIV virus trans-transcriptional activity promoting protein (TAT protein) has a unique ability to cross cell membranes without the use of receptors or transporters or the need for ATP. (Green and Loewenstein, Cell 55 (1988), 1179-1188). The exact mechanism is unknown, but the protein transduction domain (PTD) of TAT opens a “hole” in the lipid bilayer of the cell membrane, binds covalently into the hole, and closes the hole again. It has been known. This is a special method and other methods do not damage the cells. Thus, a polypeptide of the invention, an antibody of the invention or other compound can be bound to a PTD by a linker and passed through the cell membrane, see also DDT 4 (1999), 537.
[0026]
In general, the present invention relates to alpha in fibroblasts such as MMP expression, cell migration, cell proliferation, contraction, and / or extracellular matrix synthesis or secretion.2β1Methods are provided for normalizing integrin-mediated cellular responses. In a preferred embodiment, the present invention provides a method for the treatment or prevention of fibrosis or disease. Such diseases or disorders generally occur because new cells and extracellular matrix become excessive or randomly deposited at specific sites such as wound treatment sites. This extra material can cause diseases or disorders by interfering with normal tissue function. Excess material can be an obstacle. Newly deposited cells and extracellular matrix are commonly referred to as scar tissue. In most fibrosis, shrinkage of scar tissue occurs, so another undesirable thing can happen. Representative fibrosis includes pulmonary fibrosis (pulmonary fibrosis), glomerulonephritis (kidney fibrosis), cirrhosis (liver fibrosis), epithelial or skin wound treatment, atherosclerosis, and Examples include proliferative vitreoretinopathy (PVR). Fibrosis includes repair of tendon injury, healing of collision injury, healing of trauma of the central nervous system (CNS), symptoms of formation of scar tissue in the CNS, formation of scar tissue due to stroke, tissue by trauma or surgery, etc. Can also be mentioned. Thus, the method of the present invention makes it possible to reduce scarring and treat wounds or fibrosis.
Wound healing after tissue injury is a process that can be divided into three phases: inflammation, proliferation, and scar regulation. The first phase is caused by the destruction of the blood eye barrier immediately after trauma and the initial inflammatory response. At this stage, platelets are thought to move to the site of injury and release growth factors such as PDGF, TGF-β, and EGF. These factors then attract multinucleated leukocytes several hours after wounding, which releases other factors that attract circulating blood monocytes, which can become macrophages, which are It releases additional growth factors such as fibroblast growth factor (FGF). In the second stage of the wound healing process, macrophages stimulate the proliferation and accumulation of connective tissue cells and tissue granulation occurs. The third phase of the wound healing process consists of the reorganization of cells and extracellular matrix, i.e. the modulation of previously formed tissue. The fibroblasts then contract and become mature scars by granulation (Pastor JC Survey of Ophthalmology 43 (1998), 3).
In one embodiment, the method of the invention contacts a vector having the nucleic acid with a site for wound healing or fibrosis such that the transgene is delivered to a fibroblast that undergoes undesirable contraction with collagen. Including. Transgene expression results in the expression of PIII SVMP or a derivative thereof, which results in a decrease or inhibition of collagen lattice contraction as shown in the Examples. As shown in the examples, it is not necessary to use large amounts of PIII SVMP even when collagen is present in the tissue. Of course, instead of contacting the vector containing the transgene with the trauma site, it is also possible to deliver the PIII SVMP or derivative protein directly to the cell in such a way that the protein or peptide is taken up by the cell, for example, This is made possible by a method using a fusion protein in which PIII SVMP or a derivative thereof is fused to a TAT transduction domain (see above). In order to reach the desired cells, vectors or carriers that specifically target the desired cells can be used. Alternatively, or when the vector is delivered to the trauma site, in combination with such a vector or vehicle, a transgene is directly expressed specifically in the desired cell using a tissue or cell specific promoter. be able to.
Fibrosis treatable by the method of the present invention is preferably liver, lung, kidney, and heart fibrosis, atherosclerosis, cirrhosis, local and systemic scleroderma, keloids, hypertrophic scars, and Fibrosis or sclerosis selected from the group consisting of proliferative vitreoretinopathy. Preferably, the fibrosis is dermatofibrosis.
[0027]
In yet another aspect, the invention requires a physiologically effective amount of PIII SVMP, or a fragment, peptide, derivative, homologue, or mimetic thereof, or a nucleic acid that is further identified as defined above or after the foregoing. The present invention relates to a method for treating skin remodeling or wound treatment of a patient, including administering to a patient.
As mentioned above, according to the present invention, the PIII SVMP compound can be administered to a patient to treat conditions characterized by unwanted tissue growth (eg, fibrosis). Alternatively, compounds that optionally inhibit PIII SVMP-mediated MMP expression or activity can be identified to destroy unwanted tissue (eg, non-healing wounds, chronic ulcers, actinic (sunlight) elastic fibrosis, and aging It can be administered to patients to treat symptoms characterized by associated skin atrophy, tumor cell infiltration. Inhibition of MMP activity can also be useful in the treatment of patients with tumors because it can prevent migration of tumor cells to other sites (ie, metastasis) by preventing the destruction of the extracellular matrix (ECM). A striking example of how proteases can alter protein properties is described in Blobel, Current Opinion in Cell Biology 12 (2000), 606-612, which is a matrix metalloproteinase 2 (MMP-2) or This is the case of laminin 5 treated with membrane-type matrix metalloproteinase 1 (MT1-MMP). Intact laminin 5 supports cell adhesion, whereas laminin 5 cleaved by MMP-2 and MT1-MMP promotes cell migration. Interestingly, cleaved laminin 5 fragments are detected in tissues reconstituted in vivo, eg, in skin cancer, and mammary gland tissue of pregnant rats, but in normal and immature females. It is not detected from mammary tissue. MT1-MMP is also important for bone and extracellular connective tissue development. MT1-MMP deficient mice have severe skeletal and extraskeletal abnormalities such as cranial dysplasia, arthritis, osteopenia, dwarfism, and soft tissue fibrosis. MT1-MMP has been proposed to be required for activation of another enzyme, MMP2 / gelatinase A. Indeed, MMP2 activation was reduced in tissue extracts from mice lacking MT1-MMP. The above provides a further important use of the present invention, as it is shown by the present invention that PIII SVMP can promote the expression of matrix metalloproteinases, especially MT1-MMP. Thus, the aforementioned PIII SVMPs and their derivatives, and nucleic acids encoding these compounds, can be used for the treatment of disorders associated with matrix metalloproteinase expression or activity, particularly MT1-MMP or more. On the other hand, compounds that antagonize matrix metalloproteinase expression or activity, in particular MT1-MMP expression or activity, can be used for the treatment of diseases such as skin cancer associated with the undesired cleavage activity of MMP. Accordingly, it is also an object of the present invention to provide compounds and methods for the identification and isolation of compounds that modulate the activity or expression of MMPs, particularly MMP-1 and / or MT1-MMP. It can be useful for therapeutic applications as described above and below.
[0028]
Accordingly, the present invention includes cell-based methods for the identification and isolation of compounds that modulate MMP activity or expression, which preferably include PIII SVMP as defined above, or fragments, peptides, derivatives, homologues thereof. Testing the ability of a candidate compound or mixture of compounds to promote or inhibit MMP activity or expression in the presence of a body, or mimetic, or nucleic acid.
The present invention further provides assays for identifying compounds, preferably small molecule compounds, that can be used in the treatment of fibrosis. This assay generally involves examining the effect of a test compound on the contraction of a fibroblast population that is present in a substantially monolayer in a cell culture dish. In an even more preferred embodiment, the cells are cultured in a gel such as a collagen gel. A preferred collagen gel is a collagen type I gel. The cells may be cultured on a gel or may be cultured inside the gel. Preferred contraction assays are described in the examples. Briefly, cells are dispersed in a gel (eg, collagen gel), seeded in a culture dish, and media is added to the culture dish. The gel diameter is then measured (control diameter). The test substance is added and the cells are incubated for an appropriate time and the diameter is again measured to see if contraction has occurred. When investigating the effect of a test substance on the stimulation of contraction caused by a substance such as collagen, the effect of the substance on the contraction induced by collagen is caused by incubating the cells after adding the test substance and a substance such as collagen type I. Check out. In embodiments that seek to identify therapeutic agents for the treatment of fibrosis, for example, collagen and a test substance are added to the cells and incubated, and then the contraction of the cells incubated with the collagen and the test substance is added, and the test substance is added. Compare the contraction of the cells with no addition. Therefore, when the contraction induced by collagen in the presence of the test substance is reduced compared to the case where the test substance is not used, it indicates that the test substance prevents the contraction of the cells. It is effective in the treatment of diseases or disorders in which cell contraction, such as excessive scarring, is at least part of the cause. In a preferred embodiment, the collagen is partially or completely replaced with PIII SVMP or a derivative thereof.
Thus, in general, the present invention provides a method of identifying a substance that is effective in treating fibrosis in a patient, said method comprising fibrosis of said substance under conditions in which cells contract in the presence of a stimulating substance. Contact with a blast and a stimulating substance, wherein the contraction of the cell in the presence of the substance is less than the contraction in the absence of the substance, the substance is used to treat a patient's fibrosis. Shown to be effective. Fibroblasts may be dispersed in a defined size collagen matrix, and the method of the invention comprises comparing the size of the collagen matrix in the presence of the substance to the size in the absence of the substance. .
The cells used in this assay may be from primary cultures but are preferably from established cell lines. In fact, it is more convenient to use cell lines than to isolate new cells and establish new cell cultures. Cell lines can also be established from primary cultures by methods known in the art, such as infection with SV40. Even more preferred cells are fibroblasts. These cells may be mammalian cells such as human, mouse, rat, dog, sheep, bovine or chicken cells. In a preferred embodiment, the cells are (immortalized) dermal fibroblasts.
Certain gel contraction assays are known in the art, see, for example, Bell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76 (1979), 1274-1278, but unlike platelet cell culture, it was discovered that fibroblasts can be used in gel contraction assays to predict the effect of substances in the treatment of diseases associated with fibrosis (Described in the examples). It is much more advantageous to use cell lines because the assay can be performed at any time without the need to isolate new cells. Rather than using new cells from different patients or animals, the reproducibility is better because the assay is based on the same cells.
The preferred assay of the present invention is further different from the collagen contraction assay described in that the cells are inside a three-dimensional gel. Gel shrinkage assays can be easily performed in the form of high throughput assays that test millions of compounds simultaneously.
The contraction assay of the present invention can be used to identify compounds for treating various diseases such as fibrosis with cell and / or matrix contraction. When identifying compounds to identify which fibrosis, the cells used in the assay are selected to be similar to cells that contract with specific stimuli in diseases that cause specific fibrosis and cell contraction Can be done. Thus, for example, when identifying compounds that prevent excessive scarring in skin wound treatment, dermal fibroblasts can be used in the assay and the stimulant may be collagen, more preferably PIII SVMP or its Is a derivative. In a preferred embodiment, the cells are dispersed in a defined size collagen-like matrix and the method of the invention comprises comparing the size of the collagen-like matrix in the presence and absence of the compound. The method of the invention preferably also includes the isolation of the identified compound.
[0029]
As starting material, usually about 10 different5Mixtures of compounds such as compound collections containing as many molecules as possible can be used and the methods of the invention can include isolating one or more sub-collections. By performing the methods of the invention (ie, “screening assays”), one of ordinary skill in the art would2β1Can identify candidates or test compounds or agents (eg, peptides, peptidomimetics, small molecules, or other drugs) that bind to integrins and / or have stimulatory or inhibitory effects on MMP expression or MMP activity, etc. is there. Preferably, the MMP is MMP-1 and / or MMP-14. For example, screening for candidate or test compounds that modulate MMP activity or expression is possible. Test compounds can be obtained using any of a variety of libraries known in the field of combinatorial library methods, such as biological libraries, spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries, Synthetic library methods that require evolution, the “one bead one compound” library method, and synthetic library methods that use affinity chromatography sorting can be used. Biological library methods are limited to peptide libraries, while the other four methods are applicable to peptide, non-peptide oligomer, or small molecule compound libraries (Lam, Anticancer Drug Des. 12 (1997), 145). Examples of methods for synthesizing molecular libraries are known in the art and are described in, for example, DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 6909, Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994), 11422, Zuckermann et al., J. MoI. Med. Chem. 37 (1994), 2678; Cho et al., Science 261 (1993), 1303; Carrell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33 (1994), 2059, Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 338 (1994), 2061, and Gallop et al. Med. Chem. 37 (1994), 1233. Compound libraries can be in solution (eg, Houghten, Bio / Techniques 13 (1992), 412-421), or on beads (Lam, Nature 354 (1991), 82-84), chips (Fodor, Nature 364 (1993)). , 555-556), bacteria (US Pat. No. 5,223,409), spores (US Pat. Nos. 5,571,698, 5,403,484, and 5,223,409), plasmids (Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 1865-1869) or on phage (Scott and Smith, Science 249 (1990), 386-390, Devlin, Science 249 (1990), 404. -406, C Wirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 6378-6382, and Felici, J. Mol. Biol. 222 (1991), 301-310).
[0030]
In a preferred embodiment, the present invention relates to a method for producing an anticancer drug comprising any one of the aforementioned steps, and a decrease in the amount of MMP activity or a decrease in the amount of active MMP is an indicator for the anticancer drug. Recently, Kurschat et al. Pathol. 197 (2002), 179-187, showed that the increased proteolysis by matrix metalloproteinases is mainly localized in the stroma adjacent to the tumor cells. In particular, strong expression of MP1-MMP and MMP-2 can be shown at the tumor-stromal interaction site. Accordingly, compounds identified and isolated according to the present invention as inhibiting or antagonizing matrix metalloproteinase activity are particularly useful in the treatment of malignant melanoma.
[0031]
In another preferred embodiment, the present invention relates to a method for producing a medicament for assisting wound treatment, which method comprises any one of the steps of the aforementioned screening and isolation method of the present invention, wherein the amount of MMP activity is reduced. Alternatively, a decrease in the amount of active MMP is an indicator for the drug.
[0032]
Accordingly, the present invention further relates to a process for the production of a pharmaceutical composition, in particular cancer, preferably melanoma, or general such as fibrosis as described above, wound treatment, and tissue reconstitution which may have some cosmetic value. The present invention relates to a method for producing a pharmaceutical composition for practical use. The method of the invention comprises the use of any one of the aforementioned PIII SVMPs or derivatives thereof, or performing any one of the steps of the method of the invention for identifying and obtaining a modulator of the aforementioned MMP. And (a) esterification of a carboxyl group, or (ii) esterification of a hydroxyl group and a carboxylic acid, or (iii) esterification of a hydroxyl group with, for example, phosphate, pyrophosphate, or sulfate or hemisulfate. Or (iv) formation of a pharmaceutically acceptable salt, or (v) formation of a pharmaceutically acceptable complex, or (vi) synthesis of a pharmacologically active polymer, or (vii) introduction of a hydrophilic moiety. Or (viii) introduction or exchange of aromatic moieties or side chain substituents, alteration of substitution patterns, or (ix) isosteric moieties or living Modification by introduction of a chemical equivalent, or (x) synthesis of a homologous compound, (xi) introduction of a branched side chain, or (xii) conversion of an alkyl substituent to a cyclic analog, or (xiii) a hydroxyl group Derivatization to ketals, acetals, or (xiv) N-acetylation to amides, phenyl carbamates, or (xv) Mannich bases, imine synthesis, or (xvi) Schiff bases, oximes, acetals of ketones or aldehydes. PIII SVMP or a derivative thereof, or a compound isolated as a lead compound, by conversion to, ketal, enol ester, oxazolidine, thiozolidine, or combinations thereof, to modify (i) action, activity spectrum, or organ-specific Sex modification sites and / or (ii) increased efficacy and / or ( ii) reduced toxicity (increased therapeutic index) and / or (iv) reduced side effects and / or (v) onset of therapeutic effect, altered duration of effect, and / or (vi) pharmacokinetic parameters ( Modification of absorption, distribution, metabolism, and excretion) and / or (vii) modification of physicochemical parameters (solubility, hygroscopicity, color, taste, smell, stability, condition) and / or (viii) overall Improving specific specificity, organ / tissue specificity, and / or (ix) optimizing usage and route, and (b) obtaining a product from the modified compound and a pharmaceutically acceptable carrier Steps.
The various steps described above are generally known in the art. For example, computer programs for implementing these techniques can be used, for example, Rein, Computer-Assisted Modeling of Receptor-Land Interactions (Alan List, New York, 1989). Methods for the preparation of chemical derivatives and analogs are known to those skilled in the art and are described, for example, in Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer edition New York Inc. 175 Fifth Avenue, New York, N .; Y. 10010 U.S. S. A. , And Organic Synthesis, Wiley, New York, USA. In addition, peptidomimetics and / or computer-aided design of appropriate derivatives and analogs can be used, such as by the methods described above. Lead compound creation methods for drug discovery also include the use of protein and mass spectrometry (Cheng et al., J. Am. Chem. Soc. 117 (1995), 8859-8860), and nuclear magnetic resonance (NMR) methods (Fejzo et al., Chem. Biol.6 (1999), 755-769, Lin et al., J. Org.Chem.62 (1997), 8930-8931). These are quantitative structure-action relationships (QSAR) analysis (Kubinyi, J. Med. Chem. 41 (1993), 2553-2564, Kubinyi, Pharm. Unser Zeit 23 (1994), 281-290) combinatorial biochemistry. , Classical chemistry, and others, and may be based on them (see, for example, Holzgrave and Bechold, Pharm. Acta Helv. 74 (2000), 149-155). Furthermore, examples of carriers and formulation methods can be referred to Remington's Pharmaceutical Sciences. When a drug is selected by any one of the above-described methods of the present invention, the drug or prodrug thereof can be synthesized in a therapeutically effective amount. As used herein, a “therapeutically effective amount” means a significant benefit to a patient, ie, treatment, cure, prevention, or amelioration of symptoms associated with apoptosis, or treatment of such symptoms, Means the total amount of drug or prodrug sufficient to show an increased rate of healing, prevention, or recovery. In addition or alternatively, “therapeutically effective amount”, particularly when referring to preclinical studies of drugs, means the total amount of the drug or prodrug sufficient to elicit a physiological response in a non-human animal study.
[0033]
In addition, drugs or prodrugs after administration in vivo are metabolized for elimination or removal by metabolism to one or more active or inactive metabolites (Meyer, J. Pharmacokine. Biopharm. 24 (1996)). , 449-459). Thus, rather than using the actual compound or drug identified and obtained by the method of the present invention, a formulation that acts as a prodrug that changes to the active form in the patient can be used. Preliminary measurements that can be made on the use of prodrugs and drugs are described in the literature and are reviewed in Ozama, J. et al. Toxicol. Sci. 21 (1996), 323-329.
Furthermore, the present invention relates to the use of a composition comprising a vector or cell comprising the aforementioned PIII SVMP or the aforementioned related compounds, or chemical derivatives thereof, or nucleic acids, or any of them. The composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier. The term “chemical derivative” means a molecule that contains another chemical moiety that is not normally present as part of the base molecule. Such a moiety can improve the solubility, half-life, absorption, etc. of the base molecule. Alternatively, these moieties may reduce unwanted side effects of the base molecule or reduce the toxicity of the base molecule. Examples of such parts are described in various documents such as Remington's Pharmaceutical Sciences. Examples of suitable pharmaceutical carriers are known to those skilled in the art and include phosphate buffers, water, emulsions such as oil / water emulsions, various wetting agents, sterile solutions and the like. A composition containing such a carrier can be formulated by a known conventional method. These pharmaceutical compositions can be administered to the patient at an appropriate dose. Administration of suitable compositions can be accomplished by a variety of methods such as intravenous administration, intraperitoneal administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, topical administration, or intradermal administration. Aerosol formulations such as nasal spray formulations include purified aqueous solutions or other solutions in which preservatives and isotonic agents are added to the active substance. Such formulations are preferably adjusted so that the pH and isotonic state are compatible with the nasal mucosa. Formulations for rectal or vaginal administration can be provided as suppositories using a suitable carrier.
The dosage regimen will be determined by the attending physician and clinical factors. As is well known in the medical field, patient dosage may vary depending on the patient's body type, body surface area, age, specific compound being administered, sex, time and route of administration, overall health status, and others Depends on many factors such as drugs. A typical dose can be, for example, in the range of 0.001 μg to 10 mg (the nucleic acid for expression or inhibition of expression is also in this range), especially less than this range, taking into account the above factors, Alternatively, a large dose may be set. In general, dosage regimes for regular administration of pharmaceutical compositions range from 0.01 μg to 10 mg units per day. When the administration plan is continuous infusion, the body weight is 1 kg, and the range is 0.01 μg to 10 mg per minute. Progress can be monitored by regular diagnosis. Depending on the case, the preferred dosage of DNA by intravenous administration is about 106-1012Copy DNA molecule.
[0034]
The compositions of the invention can be administered locally or systemically. Administration is generally parenterally, for example intravenous administration, and when DNA is used, it can also be administered directly to the target site, for example, particle delivery to an internal or external target site. ), Or can be administered to a site in the artery by a catheter or the like. Formulations for parenteral administration include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, and emulsions. Examples of non-aqueous solvents are propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable organic esters such as ethyl oleate. Aqueous carriers include water, alcoholic / aqueous solutions, emulsions or suspensions, including saline and buffered media. Parenteral vehicles include sodium chloride solution, Ringer dextrose, dextrose and sodium chloride, lactated Ringer's solution, or non-volatile oil. Examples of intravenous media include fluid nutrient replenishers, electrolyte replenishers (such as those based on Ringer dextrose), and the like. Preservatives and other additives can also be used, for example, antibacterial agents, antioxidants, chelating agents, inert gases, and the like. Furthermore, the pharmaceutical composition of the present invention can also contain drugs such as interleukins and interferons depending on the use of the pharmaceutical composition.
[0035]
The therapeutic or diagnostic composition of the present invention is administered to a patient at an effective dosage sufficient to treat or diagnose an abnormality in which modulation of MMP activity is observed. The effective amount may vary depending on factors such as the patient's condition, weight, sex, and age. Other factors include dosage forms. The pharmaceutical composition of the present invention is administered to a patient by various routes such as intracoronary, intraperitoneal, subcutaneous, intravenous, transdermal, intrasynovial, intramuscular, or oral route. In addition, simultaneous or sequential administration of other drugs may be desirable.
A therapeutically effective dose refers to a dose of the aforementioned PIII SVMP and related compounds, polynucleotides, and vectors of the present invention that ameliorates symptoms and conditions. The therapeutic efficacy and toxicity of such compounds can be determined by standard pharmaceutical procedures utilizing cell cultures or experimental animals, eg ED50 (a therapeutically effective dose in 50% of the population). ) And LD50 (the dose at which 50% of the population dies). The dose ratio between therapeutic and toxic effects is the therapeutic index and can be expressed as the ratio LD50 / ED50.
[0036]
The present invention also provides a kit for performing the above-described method, the kit comprising PIII SVMP as defined above, or a fragment, peptide, derivative, homologue, or mimetic thereof, or a nucleic acid, further comprising a cell, One or more of agarose gel, collagen, antibody, cell growth medium, and nucleic acid probe may be included. In one aspect, a container containing a predetermined amount of the above components is included. The kit of the present invention may include devices (eg, syringes) useful for administering other compositions and compounds containing them to cells or tissues. Moreover, the instruction manual may be included. The kit of the present invention can be enclosed in a packaging material, such as a box, blister pack, or similar packaging material used to contain liquids. The packaging material can be coated with an impermeable cover to help maintain the sterility of the contents during shipping and storage. The container is preferably a glass bottle, but made of any inert material such as a rigid or flexible plastic in the form of a bottle or bag that can transport and store the liquid without loss of liquid or contamination of the contents can do. Other forms of the kits of the invention include the components of the gel contraction assay described herein. For example, the kit of the present invention can be used to assay cells (eg, cell lines, preferably fibroblasts), gels (eg, collagen type I), cell growth media, stimulating substances (eg, PIII SVMP), and Standard reagents may be included.
[0037]
In yet another aspect, the present invention relates to the aforementioned PIII SVMP, or an artificial connective tissue comprising a fragment, peptide, derivative, homologue, or mimetic.
[0038]
There is a great medical need for artificial implants to promote effective wound repair.
Examples of chronic or defective large wounds include bedsores (decubitus ulcers), diabetic skin ulcers, venous stasis ulcers, burns, and abnormalities that appear after tumor resection. The treatment of large-scale full-thickness thermal wounds has been greatly improved by the development of surgical skin grafting methods such as interlayer skin grafting and autologous reticulation. However, the quality of the regenerated skin is insufficient compared to normal intact tissue. Therefore, wound contraction and scar formation can occur and can be a major dysfunction when the joint is in close proximity to the trauma. Preliminary results based on experimental and clinical data indicate that the use of surrogate dermis can suppress wound contraction and improve skin construction. A more effective treatment plan reduces dysfunction and discomfort and reduces the need and cost of plastic surgery for scar correction. Such treatment has important socio-economic consequences, ie fewer hospitalizations, improved quality of life and reduced medical costs.
[0039]
Accordingly, the present invention provides a surrogate dermis, which typically supports a support structure capable of assisting in the penetration, adhesion, proliferation, and formation of a new matrix of fibroblasts (possibly further endothelial cells), dermal components and It consists of a substitute dermis capable of supporting both epidermal components and a substitute skin of a combination of substitute epidermis. The potential effectiveness of the materials used in this artificial tissue depends on the ability to support the cells that grow inside, the provision of a suitable substrate for adhesion, the promotion of cell proliferation and extracellular matrix production, and controlled methods Depends on several factors such as resorption of the wound site.
Further requirements are minimal toxicity, low immunogenicity, tensile properties similar to intact tissue, and the like. A number of materials have been evaluated as experimental models of repair, such as collagen (mostly from bovine or porcine), fibrin, fibronectin, chitin / chitosan, chondroitin-6-sulfate, basement membrane protein, Examples include hyaluronic acid, polylactic acid, and polyglycolic acid. The cellular component of any tissue engineering product may be an autologous cell, allogeneic cell, xenogeneic tissue, or a collagen sponge incorporating fibroblasts.
[0040]
In the present invention, the cultured tissue or the substitute dermis / epidermis and the representative skin each contain any one of the aforementioned PIII SVMP or its derivatives as an additional component or a substitute for collagen I. Furthermore, the above-mentioned PIII SVMP or a derivative thereof, or an artificial connective tissue containing a compound obtained by the method of the present invention can be used as a substitute bone graft material in periodontal treatment for promoting osteogenesis. In this embodiment, PIII SVMP is used as an alternative to collagen type I to promote cell attachment to mineral bovine bone matrix and promote bone regeneration. In this regard, see, for example, Lallier et al. Dent. Res. 80 (2001), 1748-1752.
[0041]
These and other embodiments are disclosed and illustrated by the description and examples of the present invention. More detailed literature on any of the PIII SVMPs, methods, usages, and compounds used in accordance with the present invention can be obtained from public libraries and databases using electronic devices and the like. For example, the public database “Medline” provided by the National Center for Biotechnology Information and / or the National Library of Medicine at the National Institutes of Health can be used. Additional databases and web addresses, such as the European Bioinformatics Institute (EBI), which is part of the European Molecular Biology Laboratory (EMBL), are known to those skilled in the art and can be searched using Internet search engines . An overview of biotechnology patent information and an overview of related information on patent information useful for retrospective and current status surveys is described in Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.
[0042]
The above disclosure generally describes the present invention. A more complete understanding can be obtained by reference to the following specific examples, which are provided for purposes of illustration only and are not intended to limit the scope of the invention. The contents of all cited references (references, issued patents, published patent applications, etc. described throughout this application) are specifically incorporated herein by reference.
Unless otherwise stated, the practice of the present invention uses conventional techniques of cell biology, cell culture, molecular biology, genetic recombination biology, microbiology, recombinant DNA, and immunology, which are well known to those skilled in the art. Is known. These techniques are fully explained in the publicly known literature. For example, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed. , Ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989), DNA Cloning, Volumes I and II (DN Glovered. 1985), Oligonity. U.S. Pat. No. 4,683,195, Nucleic Acid Hybridization (BD Hames & S. J. Higgins eds. 1984), Transcribation And Translation (B. D. Hames & S. J. Higs 4). , Culture Of Animal Cells ( R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987), Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986), B.C. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984), Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., NY Y.), Gene Transfer Vectors. , 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. Eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987), Handbox. C. C. Blackwell, eds., 1986).
[0043]
【Example】
[Materials and methods]
(Antibodies and reagents)
The following antibodies were used. β1(4B4; Coulter Corporation), α2(P1E6; Biomol), and α3(Biomole) Blocked mouse mAb against integrin chain. A monospecific mouse antibody against MT1-MMP was raised against a peptide corresponding to residues 160-173 of human MT1-MMP (114-1F2; Fuji Chemicals). Rabbit polyclonal antibodies against human MMP-1 are available from Dr. Courtesy of P Angel (DKFZ, Heidelberg). A commercially available monoclonal antibody against human MMP-1 is sold by Fuji Chemical (Toyama, Japan). Human α used for immunoblotting1Function blocking mouse antibody against integrin chain, mouse antibody against human HLA-ABC, and β1The antibody against the integrin subunit antibody is manufactured by Chemicon. Rabbit polyclonal antibodies against halalagin are available from Dr. A. S. Provided by Kamiguti and described in reference 19.
[0044]
As in the previously reported method (19), B.I. Haralagine was purified from jararaca venom. Proteolytic activity was inactivated by treatment with 5 mM 1,10-phenanthroline at 37 ° C. for 5 minutes (25).
[0045]
(Cell culture and immunostaining)
Human dermal fibroblasts obtained from growth of explants in DMEM medium (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) supplemented with 10% fetal calf serum (FCS), 2 mM glutamine, and 100 U / ml penicillin and streptomycin, respectively. Cells were cultured. Fibroblasts with passage numbers 1-9 were used. A three-dimensional collagen gel was prepared by a previously reported method (9). Briefly, type I collagen (3 mg / ml, Vitrogen) and 10 × DMEM were mixed at a ratio of 10: 1 and neutralized by adding 0.1 M NaOH. 1 × 10 fibroblasts5The cells were seeded in collagen gel at a density of cells / ml and incubated at 37 ° C. Alternatively, 100 nM halalagine was added to the suspension of fibroblasts, preincubated for 20 minutes at 37 ° C., and then seeded on a collagen gel. The ratio of gel shrinkage was monitored by measuring the remaining surface area.
[0046]
For the integrin binding test, cells were detached from confluent monolayer cultures by trypsin treatment, collected by centrifugation, and resuspended in growth medium. Cells were preincubated for 20 minutes at 37 ° C. in the presence of different concentrations of antibody before seeding on tissue culture plastic plates. Cell viability was measured by trypan blue exclusion.
α2To detect integrins, fibroblasts were cultured on chamber slides. After 48 hours, cells were washed twice with phosphate buffered saline (PBS) and then fixed with cold acetone. Rabbit anti-α against the cytoplasmic domain of the protein2The antibody (Chemicon) was used to stain overnight at 4 ° C. in PBS containing 4% BSA, followed by goat anti-rabbit-Cy3 antibody (1: 400, Dianova in PBS / 2% BSA). In addition, it was incubated for 1 hour at room temperature in a humidified chamber. Those without primary antibody were used as negative controls.
[0047]
(Adhesion assay)
Semi-confluent fibroblast monolayer cultures are trypsinized, cells are washed with PBS, and 0.5% BSA and insulin, transferrin, sodium selenite recommended by manufacturer (Sigma) recommended concentrations Resuspended in DMEM. For competitive assays, antibodies were added to the cell suspension and plated. Adhesion assays were performed as described previously (26). Briefly, a 96-well microtiter plate is coated with 100 μl of active or 1,10-phenanthroline-inactivated halalagine (4 μg / ml), monomeric collagen type I (40 μg / ml), or 50% FCS. It was left at 4 ° C. overnight. Heat-denatured BSA (Ca2+/ Mg2+BSA coating and nonspecific binding sites were blocked by adding 1% BSA in PBS without PBS) and incubating at room temperature for 1 hour. After washing the wells twice, cells (2 × 104Cells / well) and seeded at 37 ° C. for 2 hours. Non-adherent cells were removed by washing twice with PBS. Adherent cells were fixed with PBS containing 3% formaldehyde (pH 7.6) and 20% (v / v) containing 0.5% crystal violet. ) Stained with methanol. Color was developed by adding 0.1 M sodium citrate in 50% (v / v) ethanol. The optical density of the colored solution was measured at 595 nm. The value obtained in the control assay (plate pre-coated with FCS or halalagine) was set to 100% and the value for this was calculated. Statistical analysis was performed with the ANOVA Dunnett multiple comparison test.
[0048]
(Soluble α2β1Binding to immobilized hararagins)
Recombinant soluble human integrin α in insect cells using an expression plasmid in which the cytoplasmic and transmembrane domains are replaced with Fos and Jun dimerization motifs as previously described (27)2β1An ectodomain heterodimer was prepared.
3 mM MgCl2And microtiter plates with halalagine and bovine type I collagen at concentrations of 4 μg / ml and 40 μg / ml in Tris-buffered saline (TBS, 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl) containing 0.1 M acetic acid Coated. After overnight incubation, the wells were blocked with heat-denatured BSA and 6 μg / ml soluble α in the absence or presence of 10 mM EDTA.2β1Integrin was added and incubated at room temperature for 2 hours. Subsequently, the wells were washed twice and rabbit anti-human β1Substrate-bound integrin was detected by ELISA using integrin antiserum and alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit IgG antibody as primary and secondary antibodies, respectively. The product was measured at 405 nm using p-nitrophenyl phosphate as the substrate for the ELISA. Each value was measured twice and the standard deviation was calculated.
[0049]
(Preparation of cell membrane and Western blot analysis)
To prepare the crude plasma membrane, cells were washed twice with PBS and with PBS containing the protease inhibitors aprotinin (10 μg / ml), Pefabloc (0.25 mg / ml), and leupeptin (1 μg / ml). The plate was scraped off. Three cycles of freeze lysis of the cell suspension were performed in a dry ice / ethanol / 37 ° C. bath, and the lysis of the cells was confirmed with a microscope. The lysate was separated from cell nuclei by centrifugation at 500 × g. The supernatant was then centrifuged at 7000 × g for 15 minutes at 4 ° C. The crude plasma membrane was washed once with PBS / inhibitor, centrifuged and resuspended in PBS. For preparation of total lysate, cells were washed twice with PBS and lysed in PBS containing 0.5% NP40. The lysate was centrifuged at 15000 × g for 20 minutes at 4 ° C. Protein concentration was measured using a commercially available assay (Bio-Rad).
For western blotting, equal amounts of protein from membrane preparations, lysates, or conditioned media were separated on 10% SDS-polyacrylamide gels under reducing conditions and Hybond-C Super® (Pharmacia) -Transferred onto Biotech (Pharmacia Biotech). Non-specific binding sites were blocked with PBS containing 5% nonfat dry milk and 0.5% Tween (v / v), then the primary antibody was added to the blot and incubated overnight at 4 ° C. Bound primary antibody was detected using a secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (1: 2000; Dako) and visualized with an ECL system (ECL ™, Pharmacia Biotech).
[0050]
(Analysis of halaragin binding to fibroblasts)
Purified halalagine was conjugated with biotin using biotin-XX sulfosuccinimidyl ester. Labeling and purification of biotin-labeled halalagin was performed with the FluoReporter® Mini-Biotin-XX ProteinLabeling kit (Molecular Probes, Leiden, The Netherlands). To analyze the ability of hararagins to leave the binding and the ability of biotinylated hararagins to leave the fibroblasts, the fibroblasts were incubated for 24 hours in the presence of biotinylated hararagins, and then added with unlabeled hararagins of different concentrations for an additional 24 hours. Incubated for hours. Forty-eight hours after treatment, to measure total hararagins bound to the cell surface (Hararagins and biotinylated hararagins) and biotinylated hararagins, it was prepared by washing twice with cold PBS and lysing directly with reducing sample buffer. Western blots of cell lysates were performed. After blotting, add anti-halalagin antibody (for visualization of all halalagin bound) or extraavidin®-peroxidase (for visualization of biotinylated halalagine only) (1: 1000, sigma) to membrane Incubated for 1 hour and detected as described above.
[0051]
(Zymograph analysis)
Cells were monolayer cultured with or without halalagine stimulation. At various time points, the media was collected and separated on a 10% SDS-polyacrylamide gel containing bovine gelatin (Sigma) (20 μl / lane). Next, the gel was washed with 2.5% Triton-X 100 for 30 minutes, and then metalloproteinase substrate buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 5 mM CaCl2) Incubate overnight (28). Gels were stained with Coomassie Blue R250 and destained in water.
[0052]
(Northern blot analysis)
Cells were directly lysed with guanidine thiocyanate followed by phenol-chloroform extraction to isolate total RNA (29). Total RNA (5 μg) was developed on a formaldehyde / agarose gel and Hybond-N+Blotted onto membrane (Pharmacia Biotech), MT1-MMP (30), MMP-1 (31), and α2Random prime for integrin chains32Hybridized with P-labeled cDNA probe (32).
[0053]
[Example 1]
Haralagine supports fibroblast adhesion and inhibits collagen lattice contraction [This example shows that PIII SVMP halalagin inhibits collagen lattice contraction and also integrin α2β1Indicates that there is a binding to. Contraction and the resulting contraction force is an important component of fibrosis such as hypertrophic scars]
[0054]
It was found that the adhesion amount of fibroblasts was the same between the dish coated with halalagin and the dish coated with type I collagen (FIG. 1A). There was no significant difference between the adherence of fibroblasts to halalagine or 1,10-phenanthroline-inactivated halalagine. As seen in FIG. 1B, α2Or β1In the presence of blocking antibodies against the integrin subunit, cell adhesion to halalagin was reduced by approximately 30%, both of which can act as collagen receptors1Or α3No inhibition occurred with other function blocking antibodies to integrins (2). α2And β1When both antibodies were used in combination, cell adhesion to halalagin was inhibited up to about 60% depending on the amount used.
When cells were incubated in the collagen lattice after pre-treatment with fibroblast halalagin, the delay of lattice contraction became significant (FIG. 2). At 24 hours, untreated fibroblasts contracted the gel to about 30% of the initial surface area. However, in the presence of 100 nM halalagin, comparable contraction was not observed after 48 hours. Cell viability was comparable between treated and untreated fibroblast cultures. The contraction of fibrillar collagen type I lattice is integrin α2β1(12-14), these results indicate that halalagin is α2β1-It is thought to delay contraction by interfering with collagen interactions.
[0055]
[Example 2]
Hararagin and integrin receptor alpha2β1[In this example, hararagin is integrin α2β1, Indicating that this binding appears not to be dependent on the presence of a divalent cation. Furthermore, this experiment shows that the biological activity observed with a fragment of halalagin containing a disintegrin-like / cysteine rich domain is obtained. This is an important observation that supports the assumption that other PIII SVMPs and ADAMs with disintegrin-like / cysteine-rich domains can be used as well, or at least modified, with hararagins. ]
[0056]
Previous work has shown that α by PIII snake venom metalloproteinase2β1As a result of integrin binding to platelets, it has been shown that signaling induced by collagen-stimulated platelets is usually inhibited in conjunction with effective platelet aggregation (22, 23). To examine whether halalagin binds to cell surface proteins, both supernatant and crude fibroblast membrane were analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis after incubation with halalagine for 24 and 48 hours (FIG. 3). A 55 kDa band was detected by immunoblotting using a halalagin-specific antibody, indicating that halalagin was present in the cell culture supernatant. Another band of approximately 33 kDa appears to indicate a proteolytic fragment of halalagin composed of a disintegrin-like / cysteine-rich domain (Hararagin-C) (FIG. 3A). In the case of membranes isolated at 24 hours, a weakly stained 55 kDa band corresponding to intact hararagin was detected. The intensity of this band increased significantly at 48 hours (FIG. 3B). Another band of 52 kDa appears to represent an unrecovered halalagine or proteolytic form (13). Furthermore, these data suggest that halalagin that binds to cell surface proteins of fibroblasts protects against proteolysis at sites that form halalagin-C.
Analysis was performed to demonstrate the specificity of halalagin binding to the cell surface. In these experiments, unlabeled halalagin was used to displace biotinylated hararagins from the cell surface of fibroblasts. As shown in FIG. 4A, unlabeled halalagine can displace biotinylated halalagine that binds to the cell surface in a concentration-dependent manner.
In FIG. 4B, integrin α2β1The soluble ectodomain of is bound to immobilized halalagine. However, in contrast to collagen type I, soluble α2β1The binding of the receptor to hararagin appeared to be independent of the presence of a divalent cation. This suggests that the binding site on the receptor molecule may be different between halalagine and collagen.
[0057]
[Example 3]
Treatment of fibroblasts grown in collagen gel culture with hararagin did not affect the collagen-induced synthesis of MMP. [This experiment was combined with Example 4 where halalagine-like collagens were MT1-MMP and MMP-1] It induces the transcription of. ]
[0058]
After growth for 24 and 48 hours in the collagen lattice, total RNA was isolated from fibroblasts pretreated with 100 nM halalagine, and transcripts of MMP-1 and MT1-MMP were examined by Northern blot analysis (FIG. 5). In control fibroblasts grown in collagen gel, the amount of MT1-MMP and MMP-1 transcripts increased with growth for 24 hours and further increased with 48 hours of culture. At either time point, no significant difference was observed in the amount of transcription observed depending on the presence or absence of pretreatment with hararagin. In addition, integrin alpha was found in both untreated and hararagin-treated fibroblasts.2Showed similar increases in mRNA levels. Therefore, no apparent effect on the proliferation of fibroblasts in the collagen lattice by pretreatment with halalagin was observed.
[0059]
[Example 4]
When the fibroblast monolayer culture was treated with halalagine, changes similar to those observed in fibroblasts grown in the collagen lattice were seen. [In this experiment, PIII SVMP such as hararagin2β1It shows that it can act as a collagen lattice mimetic by binding to integrins and activating matrix metalloproteinases. From this observation it can be concluded that halalagin and its derivatives exhibiting similar binding properties can be used to induce matrix metalloproteinase expression, an important factor in fibrosis and wound healing. Furthermore, an assay system can be established that identifies compounds that antagonize or inhibit MMP expression or activity. Such compounds are expected to be very useful in the treatment of cancer, particularly melanoma. ]
Form: Morphological analysis of fibroblast cells treated with increasing concentrations of halalagin showed a characteristic elongated shape with protrusions due to the same cell elongation as reported for fibroblasts grown in collagen gel (9). Untreated fibroblasts maintained a fusiform morphology with a flat cell shape (FIG. 6).
MMP mRNA expression: In contrast to fibroblasts growing in the collagen lattice where no significant changes were detected, monolayer cultures treated with halalagin produced significant differences as shown in FIG. In monolayer culture, there was very little transcription of MT1-MMP and MMP-1. However, in fibroblasts pretreated with hararagin, MT1-MMP and MMP-1 mRNA expression is strongly induced and α2-Increased integrin transcription. These increases were evident at 24 hours, and at 48 hours this increase was comparable to that obtained with fibroblasts cultured in the collagen lattice. Furthermore, it was found that the induction of MMP mRNA level was dependent on the concentration, and stimulation was maximized when cells were pretreated with 200 nM halalagine (FIG. 7).
To investigate whether halolargin metalloproteinase activity is required for induction of MMP-1 and MT1-MMP expression, monolayer cultures of fibroblasts were treated with active halalagine or 1,10-phenanthroline-inactivated halalagine. (22). As shown in FIG. 8, when fibroblasts were treated with proteolytically inactivated halalagine, there was a significant difference in the amounts of MMP-1 and MT1-MMP mRNA compared to fibroblasts treated with active halalagine. Was not seen. A slight decrease in the amount of mRNA observed after treatment with inactivated halalagine is due to the presence of the general metalloproteinase inhibitor 1,10-phenanthroline, as shown by control fibroblast treatment with 1,10-phenanthroline. It was by doing.
MMP protein expression: MT1-MMP Western blot analysis of crude membrane preparations of cells treated with halalagine showed that the amount of active 60 kDa MT1-MMP protein produced was both at 24 and 48 hours compared to untreated fibroblasts. It was shown to increase (FIG. 9A). A small amount of another 63 kDa immunoreactive protein corresponding to inactive zymogen was also detected (33, 34). In parallel with the increase in MT1-MMP production in the treated monolayer culture, the activation of proMMP-2, shown in the 62/59 kDa form corresponding to the active enzyme, was improved (FIG. 9B). Analysis of MMP-1 protein in the supernatant of cells treated with halalagine increased the inactive MMP-1 form 52/57 kDa, both 42 and 47 kDa of active MMP-1 in both 24-hour and 48-hour treatments. Was also seen (FIG. 9C).
The possibility that the proteolytic activity of halalagin is directly related to the activation of MT1-MMP and proMMP-2 was evaluated. When the cell membrane prepared from a cell line (34) stably expressing MT1-MMP containing only pro-form MT1-MMP was treated with halalagine, proMT1-MMP activation did not occur. Furthermore, activation of zymogen was not observed even when the medium containing proMMP-2 was treated with halalagin. These observations suggested that neither proMT1-MMP activation nor proMMP-2 activation was related to the proteolytic activity of hararagin.
α 2 β 1 Protein expression: As described above, in fibroblasts grown in the collagen lattice, α2β1Haralagin did not inhibit the enhancement of MMP-1 and MT1-MMP induced by. Surprisingly, in monolayer culture, by adding halalagine, α2-Increased transcription levels of integrin subunits and MMP-1 and MT1-MMP indicating that this integrin receptor is activated rather than inhibited. Fibroblasts growing in the collagen lattice are α2β1It was found that in response to increased integrin expression, no change was seen when fibroblasts grew in monolayers (16). When fibroblasts are treated with halalagin and grown in monolayers, α2β1-Integrin immunostaining increased significantly, while no specific staining was seen in untreated monolayer cultures (Figure 10A). Α in cells treated with halalagin2According to Western blot analysis of integrin subunits, there was a slight increase in protein content at 24 hours, with a significant increase at 48 hours treatment (FIG. 10B). Α on the cell surface2The increase in the amount of integrin can explain the increase in the binding of halalagine shown in FIG.
These data show that treatment of fibroblasts with halalagin alters gene expression and cell phenotype as observed in fibroblasts growing in the collagen lattice. Show. Therefore, in this system, hararagin is α2β1It can act as a collagen lattice mimetic by binding to integrins and activating signaling.
[0060]
In vivo, dermal fibroblasts are surrounded by an extracellular matrix containing fibrous collagen. An in vitro model was established several years ago as an approach to reproduce the in vivo environment, and this model is believed to mimic the in vivo environment to some extent (9, 35). In the in vitro model, fibroblasts are embedded in a three-dimensional matrix mainly composed of fibrillar type I collagen. In a collagen environment, MMP-1, MT1-MMP, and α2β1Α changes the expression of various proteins such as integrins2β1Mediated intracellular signaling occurs (10, 16, 13). Recently, it has been shown that fibroblasts when adhered in a three-dimensional matrix are very different in local adhesion complex, morphology, and biological activity when compared in the case of adherence in a monolayer ( 36). These results strongly affirm the notion that the structure of the extracellular matrix to which it adheres is different for different cellular responses.
Snake venom metalloproteinase halalagin2β1Binding to integrins inhibits collagen-induced platelet aggregation, thereby blocking collagen binding and subsequent cell surface receptor-mediated signaling (18, 19). The purpose of the present invention is to observe when PIII SVMPs such as halalagine come into contact with fibrous collagen,2β1Was able to inhibit fibroblast-mediated changes mediated by.
According to the present invention, it has been shown that halalagine binds to the cell surface of fibroblasts and, interestingly, the amount of binding increases with time. This is a cell surface expressed α observed when filar cells are added to hararagin and incubated early.2β1This can be explained by the increase in receptors. The interaction of halalagin and fibroblasts is via one or more specific interactions between halalagin and the cell surface, since the bound labeled halalagin can be specifically replaced by halalagin (FIG. 4A). This is thought to occur.
The binding of fibroblasts to immobilized hararagin did not depend on the proteolytic activity of SVMP (FIG. 8). Collagen-binding integrin subunit (α2, Α1, Α3, And β1) Antibody to α) or α2And β1Pre-incubation of fibroblasts with a mixture of antibodies to the integrin chains of these inhibited the amount of binding to approximately 40% of the control (FIG. 1B). One possible explanation for this incomplete inhibition is α2β1In addition to integrins, other integrins or matrix-bound receptors are involved in the adhesion of fibroblasts to hararagins. This is not necessarily surprising given that each of the multiple domains of the protein (metalloproteinases, disintegrin-like, and cysteine-rich) can be involved in cell surface interactions (37). In addition, recombinant α2β1It was also shown that the direct binding of the ectodomain to halalagine is independent of cations (FIG. 4B). Most matrix components, including collagen, depend on cations2β1Bind to integrin (38). However, recent reports show that α assists in binding to proMMP-1.2It has been shown that there is a non-cation-dependent site in the subunit I-domain (39). Therefore, halalagin is a site that is different from the cation-dependent site.2β1Binds to fibroblasts by interacting with integrins and anti-α2Even if an antibody is used, it does not necessarily act to efficiently inhibit binding at non-cation dependent sites of the I-domain. This is the soluble alpha of hararagin2β1Is a possible explanation for incomplete inhibition of. In some reports, α2β1Integrins have been shown to bind hararagins (18, 19, 23), and the results of the present invention support this, but other receptors are also involved in the binding of hararagins to the cell surface. It does not exclude the possibility.
In contrast to the growth of fibroblasts in monolayers, significant changes in gene expression were observed when fibroblasts were grown in a collagen lattice containing fibrillar type I collagen (16). Thus, when the inventors treated fibroblasts with halalazine and then propagated in the collagen lattice, collagen fibrils and α2β1Typical α observed in fibroblasts that compete for binding and grow in the collagen lattice2β1It was expected that the mediated signaling reaction would be inhibited. However, the enhancement of MT1-MMP and MMP-1 transcripts induced by collagen was not inhibited at all by the treatment with halaragin on fibroblasts growing in the collagen lattice. Halargin treatment delayed collagen lattice contraction, but this phenomenon2β1Has been shown to mediate (11, 13, 14). In the data of the present invention, the alpha of halalagine at the tested concentrations2β1Binding to the integrin receptor competed only slightly with native matrix collagen. Other researchers have shown that increasing the abundance of halalagine or halalagin-C inhibits platelet adhesion to monomeric collagen in a concentration-dependent manner (23).
Although filarblast treatment with halalagin partially competed for collagen binding (indicated by delayed collagen gel contraction), there was no change in collagen-induced MT1-MMP and MMP-1 mRNA expression. . From this, α combined with hararagin2β1In the integrin population, it is considered that a similar signal transduction phenomenon occurred in which the integrin was repeatedly bound to the fiber collagen. This was further demonstrated by the results that halalagin induced a similar reaction to that observed in cells growing in the collagen lattice (16) by monolayer culture. These were accompanied by the expression of MMP-1 and MT1-MMP, and induction of proMMP-2 activation. Although the apparent increase in MT1-MMP was modest, it was sufficient to obtain the functional stoichiometry of MT1-MMP, TIMP-2, and proMMP-2, and thus zymography As can be seen in FIG. 1, there is an overall activation of proMMP-2.
The effect observed in monolayer cultures treated with halalagine is α2β1Because it is similar to the effect that occurs in collagen gels mediated by integrins, it is speculated that hararagins substantially mimic the effects of physiological ligands. This is supported by the discovery that halalagin binds to the soluble ectodomain of α2β1 integrin.
Hararagin is α2β1Although it can support ectodomain binding, it was surprising that EDTA does not inhibit this process, ie, this binding is not dependent on divalent cations. The majority of ligand-integrin interactions are dependent on divalent ions (38), but collagen and α2Recently, it has been reported that I-domain binding can occur without metal ions (40). These authors suggest that collagen binding can be metal-dependent in the “open state” of the I-domain conformation and metal-independent in the “closed state”.
It is not known which region of hararagin is responsible for the activity observed by the treatment of fibroblasts. Different regions of PIII SVMP are α2β1It has been shown to bind to integrins. One of these regions is an ECD motif in a disintegrin-like domain (41). The second region of halalagin, the RKKH motif, is within the metalloproteinase domain (24). A possible third site is the cysteine rich domain. The recombinant cysteine-rich domain of atrolsin A, a PIII SVMP isolated from the venom of Crotalus atrox, has been shown to inhibit collagen-stimulated platelet aggregation, and thus platelet α2β1It has been shown that it can bind to integrin (37). According to preliminary studies according to the present invention using venom proteins containing only disintegrin-like / cysteine-rich domains, these domains have activity similar to that seen in halalagin when used in the treatment of fibroblasts. I found that it can be guided. Thus, the proteinase domain does not appear to play an important role with respect to these activities.
Data by Kamiguchi and co-workers (25) show that inhibition of collagen-induced platelet aggregation occurs by binding of the I-domain of the α2 integrin subunit on platelets and hararagin. In contrast, when fibroblasts are treated with halalagin, MMP synthesis is enhanced, resulting in α2β1Integrin receptor activation was observed. Kamiguti and co-workers (22) have reported that tyrosine kinase pp72 is inhibited by inhibiting collagen-induced platelet aggregation.sykIt also shows that the phenomenon of collagen-stimulated phosphorylation is caused.
In platelets, collagen-induced activation and aggregation is a2β1, GPVI, and αIIbβ3Depends on the cooperative action of the2β1Binding to may not be sufficient for efficient signaling. In addition, halalagine and platelet α2β1The combination of collagen and α2β1And / or sufficient binding of GPVI may be inhibited when in close proximity to these two receptors. These events can inhibit platelet aggregation as an overall effect. However, the situation for fibroblasts is quite different. Hararagin and α2β1The integrin binding is sufficient to induce substantially the same cellular signaling as observed for fibrillar collagen. Thus, different cells can use the same integrin for signal transmission, but the presence of other receptors or cellular signaling pathways may provide different activities. As shown in experiments carried out according to the present invention, halalagine is2β1It can bind to the receptor and inhibit platelet aggregation, but in fibroblasts halalagin is alpha2β1Promotes receptor-mediated signaling, MMP-1, MT1-MMP, and α2β1Promotes integrin expression. Therefore, not surprisingly, when considering the activity obtained when a ligand binds to a signaling receptor, be aware of the relationship between the receptor and other cell surface receptors and the pathways used for signaling. Need to pay.
Molecules within the ADAM family of Replysin have been shown to bind various integrins (43). For example, ADAM12 and ADAM15 are linked to α through their disintegrin-like / cysteine-rich domains.9β1It has been shown to bind integrins and thereby regulate cell-cell contact (44). As another example, ADAM23 is αvβ3It has been shown to bind to integrins and regulate cell interactions of naturally derived cells (45). While this promotes sperm-egg fusion, there is very little data on signal transduction leading to ADAM / integrin interactions. Based on the data presented to them, α by ADAM2β1It is reasonable to speculate that cell signaling after integrin binding induces the same or similar biological activity as halalazine binding.
Those skilled in the art will recognize, and be able to ascertain using no more than routine experimentation, not only the specific embodiments described herein, but many embodiments equivalent thereto. Such equivalents are intended to be encompassed by the claims.
[0061]
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[0062]
The following matters are disclosed below.
11. A patient with a PIII SVMP as defined in any of claims 1-9, or a fragment, peptide, derivative, homologue, or mimetic, or nucleic acid in an amount sufficient to treat or prevent fibrosis or sclerosis in the patient A method for the treatment or prevention of fibrosis or sclerosis, comprising the step of:
12 10. The nucleic acid is a recombinant vector containing a DNA sequence encoding a protein or peptide of interest controlled by a universal and / or tissue specific promoter. The method described in 1.
13. Said fibrosis or sclerosis is liver fibrosis, pulmonary fibrosis, renal fibrosis, and cardiac fibrosis, atherosclerosis, cirrhosis, local and systemic scleroderma, keloid, hypertrophic scar, and proliferation 10. a disease selected from the group consisting of vitreous retinopathy, Or 12. The method described in 1.
14 10. the fibrosis is dermatofibrosis; The method described in 1.
15. Administering to a patient in need of treatment a physiologically effective amount of PIII SVMP as defined in any of claims 1 to 9, or a fragment, peptide, derivative, homologue, or mimetic, or nucleic acid thereof. A method of skin reconstruction or wound treatment comprising.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 “Hararagin is a cell adhesion substrate” A: 4 μg / ml halalagine or 1,10-phenanthroline-inactivated halalagine, 40 μg / ml as described in “Materials and Methods” in the Examples. Microtiter plate coated with either collagen type I or 50% FCS (2 × 104Cells / well) were seeded with fibroblasts. A well coated with BSA was also used as a negative control. After 2 hours, non-adherent cells were removed, and the adherent cells were stained and then stained with crystal violet. The bar graph shows the mean ± S.D. Of optical density measured after color development in three independent experiments, each repeated twice. E. M is represented. FCS-coated dish (OD595 nm= 0.66 ± 0.08), the average value obtained was set to 100%. B: α in fibroblasts2, Α1, Α3Or β1Monoclonal antibody against integrin chain (2.5 μg / ml) or α2And β1A mixture of antibodies against the integrin chain (each 2.5 μg / ml or 5 μg / ml) was added and incubated. These cells were then seeded on plates pre-coated with halalagine (4 μg / ml) and cultured for 2 hours. HLA antibody (5 μg / ml) was used as a control. The bar graph shows the mean ± S.D. Of optical density measured after color development in three independent experiments, each performed twice. E. M is represented. Average optical density (OD) obtained by adherence to untreated halalagine-coated wells595 nm= 0.5 ± 0,09) was set as 100% (*P <0.05,**P <0.01).
FIG. 2. “Hararagin inhibits collagen gel contraction” Human fibroblasts were grown in collagen gel in the absence of hararagin (white bars) or in the presence of 100 nM (black bars). The gel surface area was measured at each time point shown. The degree of shrinkage is shown as a percentage when the initial gel surface area is 100%. Results are the mean ± SEM of 2 independent experiments, each repeated 3 times. E. Represented by M.
FIG. 3: “Preparation of membranes from fibroblasts that bind to hararagins” Fibroblasts were monolayer cultured (m) in the absence of hararagins or in the presence of 100 nM hararagins (+ J) for 24 and 48 hours. . After 24 hours, the medium was changed and fresh hararagin was added. At each time point, the medium was collected and stored at -20 ° C until use. In parallel, cells were used for membrane preparation as described in “Materials and Methods”. 20 μl of conditioned medium (A) and 40 μg of unpurified membrane fraction (B) were developed on a 10% SDS / polyacrylamide gel under reducing conditions. After blotting, specific protein bands were visualized by immunodetection using a polyclonal antibody against halalagine (5 μg / ml). The 55 and 33 kDa bands specific for halalagine are indicated by arrows (the latter appear to be degradation products). The molecular weight standard is indicated (kDa).
FIG. 4 “Recombinant soluble α2β1Integrin binds to halalagin. ”A: 100 nM biotinylated halalagine (J*) Was added and incubated for 24 hours, and then unlabeled halalagine (J) at a predetermined concentration (50 to 100 nM) was added and further incubated for 24 hours. Fine surfaces bound to hararagin and biotinylated hararaggin after 48 hours treatment were measured by Western blot. After blotting, membranes were examined with anti-halalagin antibody or extravidin®-peroxidase. B: Purified halalagine (J) or type I collagen (Col I) was coated at equimolar concentrations (4 μg / ml halalagine and 40 μg / ml collagen). Soluble alpha2β1The integrin was replaced with 2 mM MgCl.2Bound to immobilized ligand in the presence of either (white bar) or 10 mM EDTA (black bar). After washing and fixing, α2β1The amount bound to integrin was quantified as described in “Materials and Methods”. These bars represent the mean ± SEM of three independent experiments, each repeated twice. E. M is represented.
FIG. 5 “Halaragin treatment of monolayer-grown fibroblasts induces the same changes as when grown in collagen gel.” The same number of fibroblasts on cell culture plastic Monolayers (m) or in 3D collagen gels (g) were grown in the absence of hararagin or in the presence of 100 nM hararagin (+ J). Total RNA was extracted after 24 and 48 hours of culture and subjected to Northern blot analysis (5 μg / lane). MT1-MMP, MMP-1, and α2Against integrin subunit32The amount of transcript was detected using a P-labeled cDNA probe. RNA amount was assessed by hybridization with 18 SrRNA oligonucleotide. Transcript length is 4.5 kb for MT1-MMP, 2.2 kb for MMP-1, and α2The integrin chain was 8 kb.
FIG. 6: “Hararagins change the morphology of fibroblasts” Fibroblasts grown in monolayer culture for 48 hours in the absence (−) or in the presence of a predetermined amount of hararagins (50 nM, 100 nM, and 200 nM). Cells were analyzed with a light microscope. The bar represents 25 μm.
FIG. 7: “Laragin-induced changes depend on the amount added”. Grown for 48 hours in monolayer culture in the absence of (−) or in the presence of a predetermined amount of hararagin (50 nM, 100 nM, and 200 nM). Fibroblasts were analyzed by Northern blot analysis and gelatin zymography. 5 μg of total RNA was developed on a formaldehyde / agarose gel, transferred to a nylon membrane, and against MT1-MMP and MMP-1.32Hybridized with P-labeled cDNA probe. RNA amount was assessed by hybridization with 18S rRNA.
FIG. 8: “Inactivation of the metalloproteinase domain of halalagine does not affect the amount of mRNA.” In the absence of halalagin, or 100 nM halalagine (+ J), 100 nM 1,10-phenanthroline-inactivated halalagin ( + IJ), or fibroblasts were grown in monolayer culture (m) for 48 hours in the presence of 100 nM 1,10-phenanthroline (+ Ph). After 48 hours, total RNA was isolated and separated on a formaldehyde / agarose gel (5 μg / lane). After transcription of RNA, against MT1-MMP and MMP-132A P-labeled cDNA probe and its nylon membrane were hybridized. It can be seen from the hybridization of 18 SrRNA that the amount of RNA is equal.
FIG. 9: Haralagin treatment increases the amount of active MT1-MMP and MMP-1 in treated fibroblasts. Monolayer (m) in the absence of hararagin or in the presence of 100 nM hararagin (+ J). A crude membrane preparation (A) or conditioned medium (B, C) was prepared from fibroblasts grown for 24 hours or 48 hours. From Western blot analysis, 40 μg of membrane preparation or 20 μl of conditioned medium was separated on a 10% SDS / polyacrylamide gel under reducing conditions. MT1-MMP protein (A) is detected using a monospecific antibody against human MT1-MMP (114-1F2, 1 μg / ml), while MMP-1 protein uses a rabbit polyclonal antibody against human MMP-1 (C). Bound antibody was visualized using ECL. The molecular weights of pro-MT1-MMP (63 kDa), active MT1-MMP (60 kDa), pro-MMP-1 (52/57 kDa), and active MMP-1 (42/46 kDa) are shown on the right. For gelatin zymography (B), 15 μl of conditioned medium was separated on a 10% SDS / polyacrylamide gel under non-reducing conditions. The molecular sizes of pro-MMP-2 (72 kDa) and activated MMP-2 form (62/59 kDa) are shown on the right.
FIG. 10: “After treatment with hararagin, α2Fibroblasts with increased integrin were grown monolayer for 48 hours in the absence (a) or in the presence (b) of hararagin. A: After fixation, these cells were treated with rabbit anti-α2Stained with integrin antibody (1: 400). Bound antibody was detected using a goat anti-rabbit Cy3-conjugated antibody. The bar represents 20 μm. B: On the other hand, 20 μg of the total lysate was developed on a 10% SDS / polyacrylamide gel under reducing conditions. α2The integrin subunit is a polyclonal anti-α2Detected using integrin antibody (1: 200). Bound antibody was visualized by ECL.
