JP2004208647A

JP2004208647A - High-copy-number expression vector

Info

Publication number: JP2004208647A
Application number: JP2003001885A
Authority: JP
Inventors: Kimiyuki Uno; 公之宇野
Original assignee: Kumamoto Technology and Industry Foundation
Current assignee: Kumamoto Technology and Industry Foundation
Priority date: 2003-01-08
Filing date: 2003-01-08
Publication date: 2004-07-29

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a high-copy-number expression vector that can be used for easily producing a large amount of protein and a transformant with the vector. <P>SOLUTION: This invention provides a sequence element that is necessary for high copy number of the target gene, a sequence element that is necessary for expression of the target gene, a vector including one or more cloning sites, and the like. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する分野】
本発明は、新規な高コピー高発現ベクター、該ベクターを有する形質転換体、及び該形質転換体を用いて酵素等の蛋白質を製造する方法、並びに該酵素を用いて薬剤の投与処方を決定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
米国の統計では、治療薬物による副作用発現患者は毎年２２０万人、副作用により死亡した患者数は１０万人以上、副作用にかかる医療費は７００億ドルにも達すると報告されている。
【０００３】
このように副作用が発生する原因の一つに各個人における薬物代謝能力の違いが挙げられている。このような薬物代謝能力の違いは一塩基多型（ＳＮＰ）の存在によるものであり、薬害を最小限に抑えるためには、個々の患者のゲノム解析から得られる患者の遺伝子情報に基づいたオーダーメード医療の展開が急務の課題となっている。
【０００４】
酵素による薬物代謝機構の解明と遺伝子レベルでのＳＮＰ解析との対応をつけられれば、副作用を低減させる薬物投与設計を可能にするとともに、我国にとって極めて深刻な医療費の高騰という問題を解決する道が開けるであろう。
【０００５】
酵素による薬物代謝機構の解明と遺伝子レベルでのＳＮＰ解析とを対応した報告としては、肝臓に発現し、薬物の代謝に関与する酵素群であるヒトＣＹＰのＳＮＰについて、ＣＤＹＰ２Ｃ９の３５９位にはＩｌｅ（コドン：ＡＴＣ）が存在するが、ＳＮＰによりＬｅｕ（コドン：ＣＴＣ）へ変異したケース（ＣＹＰ２Ｃ９＊３）が白人の６％、黒人の０．５％に認められ、東洋人では２．６％の頻度で出現する。この変異により薬物の代謝速度が低下する結果、常用量の投与により薬が効きすぎる、すなわち副作用が現れることがワルファリンなどで報告されている。（例えばＰｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ１９９６．６．３４１）
【０００６】
しかしながら、ＳＮＰと薬物代謝との相関を調べるためには、ＳＮＰを有する患者に由来する肝細胞を用いるか、数多くのボランティアを対象とした広汎な疫学的調査を調べなければならないのが現状であり、詳細な解析が出来ていない。
【０００７】
ＳＮＰについては製薬会社を含めた世界的規模のコンソーシアムが設立されており、次々と情報が蓄積されている。（例えばＨＹＰＥＲＬＩＮＫｈｔｔｐ：／／ｓｎｐ．．ｃｓｈｌ．ｏｒ／ｈｔｔｐ：／／ｓｎｐ．．ｃｓｈｌ．ｏｒ／）しかし、この情報が医療に生かされているとは言えないのが現状である。
【０００８】
薬物の代謝に関与する酵素群のＳＮＰと薬物代謝との関係を求めるにはＳＮＰによる変異を持つ酵素群を大量に産生する必要があるが、これまで酵素等の蛋白質を大量に産生するには、一旦蛋白質をコードする遺伝子をベクターに組み込んだ大腸菌を増殖させて遺伝子のコピーを増幅し、そのようにして増幅した遺伝子を、蛋白質を発現するベクターに組み込んで、そのベクターを大腸菌にトランスフェクトすることにより蛋白質を発現させており、多大な労力がかかっていた。
【０００９】
【非特許文献１】
Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ１９９６．６．３４１
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記問題点を解決することを目的としている。すなわち本発明の第一の目的は、蛋白質を容易に大量に産生するために用いることができる高コピー高発現ベクターおよび該ベクターを有する形質転換体を提供することにある。本発明の第二の目的は副作用の少ない患者毎の薬物投与処方の設計方法を提供することを目的とする。本発明の他の目的は、患者毎の薬物投与処方の設計を患者の遺伝子に基づき行う方法を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、遺伝子のコピーと蛋白質の発現とを同時に行うことのできる配列要素を一つのベクター中に組み込むことによって、蛋白質を容易に大量に産生するために用いることができる高コピー高発現ベクターを構築することに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
即ち、本発明によれば、目的遺伝子の高コピーに必要な配列要素、該目的遺伝子の発現に必要な配列要素、及び１以上のクローニング部位を含むベクターが提供される。
【００１３】
好ましくは、目的遺伝子の高コピーに必要な配列要素は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）由来の配列であり、さらに好ましくは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）をＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで切断した断片である。
好ましくは、目的遺伝子の発現に必要な配列要素は、プロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結部位であり、リボソーム結合部位と転写終結部位との間にクローニング部位が存在する。さらに好ましくは、リボソーム結合部位及び転写終結部位はｐＥＴ３ａ由来の配列である。
【００１４】
本発明のベクターは、特に好ましくは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）のＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ部位に、リボソーム結合部位（ＳＤ配列）、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩクローニング部位及び転写終結部位を含むｐＥＴ３ａ由来の配列を挿入することによって作製されるものであり、少なくとも５’から３’方向にＴ７プロモーター配列、ＳＤ配列、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩクローニング部位および転写終結部位を含むものである。本発明のベクターの一例は、配列番号１に記載の塩基配列を有するベクターである。
【００１５】
本発明の別の側面によれば、上記した本発明のベクターのクローニング部位に目的遺伝子が挿入されている、組み換えベクターが提供される。
好ましくは、目的遺伝子は、薬物代謝に関与する酵素の遺伝子であり、さらに好ましくは、ＣＹＰ酵素遺伝子であり、例えば、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６またはＣＹＰ２Ａ６である。
好ましくは、目的遺伝子は、ＣＹＰ酵素遺伝子を宿主での発現に最適化して試験管内合成した遺伝子であり、及び／又はＮ末端の膜貫通領域を欠失させた遺伝子である。特に好ましくは、目的遺伝子は、配列番号２に記載の塩基配列を有する遺伝子である。
【００１６】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の何れかのベクターを有する形質転換体が提供される。好ましくは、形質転換体は大腸菌である。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の形質転換体を用いる、蛋白質の製造方法が提供される。好ましくは、製造される蛋白質は薬物代謝に関与する酵素である。
【００１７】
本発明のさらに別の側面によれば、予め薬物代謝に関与する酵素の一塩基多型遺伝子（ＳＮＰ）を有する酵素群を作製し、該酵素群の薬物に対する代謝能力を調べておき、薬物を投与すべき患者の薬物代謝に関与する酵素をコードする遺伝子を調べることにより、患者への薬剤の投与処方を決定する方法が提供される。
【００１８】
好ましくは、薬物代謝に関与する酵素が肝臓に存在する酵素であり、さらに好ましくは肝臓に存在する酵素はＣＹＰ酵素である。
【００１９】
好ましくは、ＳＮＰを有する酵素群をコードする遺伝子を上記した本発明のベクターのクローニング部位に挿入した組み換えベクターを有する形質転換体を培養することによりＳＮＰを有する酵素群を作製することによって、薬剤の投与処方を決定する。好ましくは、酵素群の薬物に対する代謝能力の検査をｉｎｖｉｔｒｏで行うことによって、薬剤の投与処方を決定する。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
（１）本発明のベクター及びそれを有する形質転換体
本発明のベクターは、目的遺伝子の高コピーに必要な配列要素、該目的遺伝子の発現に必要な配列要素、及び１以上のクローニング部位を含むものであり、目的遺伝子のコピーと発現を同時に行なうことが可能である。本発明のベクターは、コピー用配列要素と発現用配列要素が組込まれている高コピー高発現ベクターである。具体的には、本発明のベクターには、クローニングサイトとともにリボソーム結合部位と転写の終結に必要なターミネータ部位を含むＤＮＡ配列が組込まれている。
【００２１】
本発明のベクターの由来としては、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する細菌プラスミド、酵母プラスミド、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノアソシエーテッドウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター等を挙げることができる。これらのうちでは細菌プラスミドを由来とすることが好ましく、２種類の細菌プラスミドに由来する配列要素（即ち、目的遺伝子の高コピーに必要な配列要素、及び該目的遺伝子の発現に必要な配列要素）を組み合わせて使用することができる。
【００２２】
目的遺伝子の高コピーに必要な配列要素としては、例えば、宿主に適合した複製起点及び薬剤耐性遺伝子を含む配列要素が挙げられる。宿主に適合した複製起点としては、例えば、宿主が大腸菌の場合には、ｐＵＣｏｒｉ、ｆ１（＋）ｏｒｉなどが挙げられる。薬剤耐性遺伝子としては例えば、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子などが挙げられる。
【００２３】
本発明で用いる目的遺伝子の高コピーに必要な配列要素としては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）由来の配列を使用することが好ましく、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）をＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで切断した断片を使用することができる。
【００２４】
目的遺伝子の発現に必要な配列要素が、プロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結部位であり、リボソーム結合部位と転写終結部位との間にクローニング部位が存在するような配列要素である。プロモーターの種類は、用いる宿主で作動可能なものであれば特に限定されない。細菌細胞で作動可能なプロモーターとしては、大腸菌のｌａｃ、ｔｒｐ若しくはｔａｃプロモーター、ファージ・ラムダのＰ_Ｒ若しくはＰ_Ｌプロモーターなどが挙げられる。哺乳動物細胞で作動可能なプロモーターの例としては、ＳＶ４０プロモーター、メタロチオネイン遺伝子プロモータ、またはアデノウイルス２主後期プロモータなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロモーターの例としては、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーター、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性蛋白プロモーター、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモーター、またはバキュウロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモーター等がある。酵母宿主細胞で作動可能なプロモーターとしては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、ＴＰＩ１プロモーター、ＡＤＨ２−４ｃプロモーターなどが挙げられる。糸状菌細胞で作動可能なプロモーターの例としては、ＡＤＨ３プロモーターまたはｔｐｉＡプロモーターなどがある。
【００２５】
リボソーム結合部位としては、ＳＤ配列などが挙げられる。
【００２６】
転写終結部位としては、ポリアデニル化部位などが挙げられる。
【００２７】
本発明では、リボソーム結合部位及び転写終結部位としてプラスミドｐＥＴ３ａ由来の配列を使用することができる。
本発明のベクターの一例としては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）のＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ部位に、リボソーム結合部位（ＳＤ配列）、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩクローニング部位及び転写終結部位を含むｐＥＴ３ａ由来の配列を挿入することによって作製され、少なくとも５’から３’方向にＴ７プロモーター配列、ＳＤ配列、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩクローニング部位および転写終結部位を含むベクターを挙げることができ、さらに具体的には、配列番号１に記載の塩基配列を有するベクターを挙げることができる。
【００２８】
本発明のベクターのクローニング部位に目的遺伝子を挿入することによって、該目的遺伝子を発現させるための組み換え発現ベクターを作製することができる。目的遺伝子の種類は特に限定されないが、発現させたい蛋白質をコードする遺伝子であることが好ましい。目的遺伝子としては、例えば、薬物代謝に関与する酵素の遺伝子を使用することができ、さらに具体的には、ＣＹＰ酵素遺伝子（例えば、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６またはＣＹＰ２Ａ６など）などを使用することができる。
本発明の好ましい態様によれば、目的遺伝子としては、ＣＹＰ酵素遺伝子を宿主での発現に最適化して試験管内合成した遺伝子であって、Ｎ末端の膜貫通領域を欠失させた遺伝子を使用することができる。そのような遺伝子の一例としては、配列番号２に記載の塩基配列を有する目的遺伝子を挙げることができる。
【００２９】
本発明のベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることにより形質転換体を作製することができる。本発明で用いることができる宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真菌細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞等を挙げることができる。本発明では、特に大腸菌を使用することが、増殖が容易であるという観点から好ましい。
【００３０】
ベクターの宿主細胞への導入は、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング、弾丸導入、感染等により行うことができる。
【００３１】
本発明の高コピー高発現ベクターを有する形質転換体（好ましくは、大腸菌）を大量に培養することにより目的とする蛋白質（例えば、薬物代謝に関与する酵素）を含む形質転換体を大量に得ることができる。形質転換体として大腸菌を使用する場合、大腸菌の培養は好ましくは３０〜４０℃で、公知の培地、例えばＴＢ培地等を用いて培養することができる。酵素の産生量を増加させるために、酵素の基質、酵素がＣＹＰ２Ｃ９の場合はアミノレブリン酸を培地に添加して培養することが好ましい。
【００３２】
上記した形質転換体を含む培養物から、目的蛋白質（例えば、薬物代謝に関与する酵素）を回収し精製するには、例えばリン酸系緩衝液中でＥＤＴＡ等を配合して菌体を例えば硫酸アンモニウム又はエタノールにより沈殿凝集沈殿させた後に、濾過、あるいは遠心分離して菌体を回収し、次いで緩衝液中で例えば超音波処理等により菌体を破砕し、この破砕物混合液にＥＤＴＡとリン酸カリウムついで遠心して菌体を除去し、上澄みを回収し、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、次いでセファロースクロマトグラフィーにより酵素溶液を通して最終溶出液を透析することにより精製する等の方法を採用することができる。目的の蛋白質は、例えば緩衝液／グリセリン混合液中に濃縮して保存し、以下の試験に供することが好ましい。
【００３３】
（２）患者への薬剤の投与処方の決定
本発明によれば、上記した本発明の高コピー高発現ベクターを有する形質転換体を用いて薬物代謝に関与する酵素の一塩基多型遺伝子（ＳＮＰ）を有する酵素群を作製し、該酵素群の薬物に対する代謝能力を調べておき、薬物を投与すべき患者の薬物代謝に関与する酵素をコードする遺伝子を調べることにより、患者への薬剤の投与処方を決定する方法も提供される。
【００３４】
本発明で対象とする酵素は、薬剤の代謝に関与する酵素である。通常薬剤の代謝に関与する酵素は、肝臓に存在する。このような薬剤代謝に関与している酵素の代表例はＣＹＰ（シトクロムＰ４５０族）であるため、薬剤の代謝に重要な役割を担うＣＹＰ酵素群を対象とすることが好ましい。ＣＹＰ酵素群とその基質となる薬物を列挙すると次のようになる。
【００３５】
【表１】

【００３６】
ＣＹＰの中でも、ＣＹＰ２Ｃ９は薬剤代謝に特に係わりのあるシトクロムＰ４５０であり、この酵素を対象とすることが特に好ましい。
【００３７】
本発明の薬剤の投与処方を決定する方法では、まずこのような薬剤代謝に関与する特定の酵素をコードする遺伝子、その部位の遺伝子のＳＮＰ情報に基づき変異（ジェノタイプ）を導入した酵素を調製する。
【００３８】
上記本発明の方法で用いる薬剤代謝に関与している酵素のＳＮＰを大量に製造するには、本発明の高コピー高発現ベクターを有する形質転換体（特に、大腸菌）を用いて以下の方法で産生することが好ましい。
まずアミノ酸配列の報告されている酵素のアミノ酸配列を変えないまま、コドンを用いてＤＮＡの塩基配列を設計する。
次に上記ＤＮＡをＰＣＲ等の手法によりＤＮＡを増幅する。酵素を構成するＤＮＡはコード領域が長いため、制限酵素部位を導入したいくつかのフラグメントに分割してＰＣＲ増幅を行うことが好ましい。
【００３９】
ＰＣＲで増幅したフラグメントを本発明の高コピー高発現ベクターに組み込み、このプラスミドを組み込んだ大腸菌を増殖させてクローニングとコピーを行う。フラグメントは最後に繋ぎ合わせ全長ＤＮＡとする。
【００４０】
上記においては、１つのアミノ酸配列を持つ薬剤代謝酵素の合成方法について述べたが、ＳＮＰについても報告されているＳＮＰ情報に基づき、あるいは様々な薬効を示す患者の薬剤代謝酵素のアミノ酸配列を調べる等により得た情報に基づいて、上記と同様の方法により薬剤代謝酵素の変異体を大量に合成することができる。
【００４１】
以上の方法により合成した薬剤代謝酵素による薬物代謝の確認は、例えば、患者への投与を予定する各種の薬剤と薬剤代謝酵素との結合親和性を紫外可視光線吸収スペクトルから算出することができる。具体的には、例えば、試験管中上記方法で得た薬剤代謝酵素濃縮液を緩衝液で希釈した液を注入する。次に代謝を確認したい薬剤の所定量を予めリン酸緩衝液に分散させた液を注入し、混合した後、恒温条件で一定時間放置する。その後試料液を測定用セルに移し紫外可視光線分光分析器で紫外可視光線スペクトルを測定し、得られたスペクトルの薬剤に由来するピークの高さをブランクのそれと対比することにより薬剤と薬剤代謝酵素との結合親和性を判断することができる。
【００４２】
患者の組織または細胞、好ましくは体液を採取し、定法によりそのＤＮＡを例えばシーケンサーを用いて、患者がどのタイプの薬剤代謝酵素を有しているかを確認する。これにより、薬剤投与対象患者の遺伝子情報を採取する。体液としては、血液、唾液または尿が好ましい。特に前述の薬剤代謝酵素をコードしている部位の遺伝子に限定して調べることが好ましい。
【００４３】
患者のＤＮＡの調査により薬剤代謝酵素のタイプが判明したら、予め求めておいたその薬剤代謝酵素の薬剤代謝性能から患者へ該薬剤を投与すべきか否か、投与するとしたら、どの程度にしたら副作用がないか等を判断して処方箋を作成することができる。
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００４４】
【実施例】
（１）薬剤代謝酵素をコードするＤＮＡの設計
薬剤代謝酵素としてヒトＣＹＰ２Ｃ９を対象とした。ヒトＣＹＰ２Ｃ９のアミノ酸配列は（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ；ＣＰＣ９＿ＨＵＭＡＮ）に報告されている。このアミノ酸の配列を変えないまま、大腸菌において高発現に成功しているコドンを用いてＤＮＡの塩基配列を設計した。ヒトＣＹＰ２Ｃ９のアミノ酸配列（配列番号３）および塩基配列（配列番号２）を図１および図２に示す。ＣＹＰ２Ｃ９は膜タンパク質であり、精製と実験的な取扱いが困難と考えられるので、膜貫通領域と考えられているアミノ末端の２０残基（Ｄ２〜Ｒ２１）を欠損させた。合成するＤＮＡはコード領域が１４１０塩基にわたるため、これを４つのフラグメント（Ａ，Ｂ．Ｃ，Ｄ）に分けて合成を行った。
【００４５】
（２）ＰＣＲ
上記（１）の設計に基づいてＤＮＡオリゴマーを合成した。フラグメントＡを例として各フラグメントの合成法について説明すると、まずＡｆ１、Ａｆ２、Ａｒ１、Ａｒ２を等モルで混合し、１回目のＰＣＲを行った。この溶液を少量とり、ＡＲ、ＡＦを加えて２回目のＰＣＲを行った。
【００４６】
（３）大腸菌を用いた増殖とクローニング
ＰＣＲで増幅したフラグメントＡを、末端に導入した制限酵素部位ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を用いて切りだし、同じ酵素で処理したプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）につないだ。宿主となる大腸菌ＸＬ−１ＢｌｕｅＭＲＦ’ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質変換し、アンピシリンを含むＬＢプレートにまいた。３７℃で１晩培養後、大腸菌コロニーをとり、アンピシリンを含むＬＢ培地を用いて液体培養した。菌体回収後、プラスミドを抽出（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）し、ＤＮＡシーケンサーを用いて塩基配列を調べた。予期しない変異が全くなく、期待通りのフラグメントが得られていることを確認した。
【００４７】
同様の方法でフラグメントＢ（ＰＣＲ１回目：Ｂｆ１、Ｂｆ２、Ｂｆ３、Ｂｒ１、Ｂｒ２、Ｂｒ３、ＰＣＲ２回目：ＢＲ、ＢＦ）、フラグメントＣ（ＰＣＲ１回目：Ｃｆ１、Ｃｆ２、Ｃｆ３、Ｃｒ１、Ｃｒ２、Ｃｒ３、ＰＣＲ２回目：ＣＲ、ＣＦ）、フラグメントＤ（ＰＣＲ１回目：Ｄｆ１、Ｄｆ２、Ｄｆ３、Ｄｒ１、Ｄｒ２、Ｄｒ３、ＰＣＲ２回目：ＤＲ、ＤＦ）を合成した。各フラグメント末端の制限酵素部位（フラグメントＢ：ＥｃｏＲＩ、Ｂｇ１ＩＩ、フラグメントＣ：Ｂｇ１ＩＩ、Ｃ１ａＩ、フラグメントＤ：Ｃ１ａＩ、ＢａｍＨＩ）を用いてクローニングした。期待しない変異が入っている部位については、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ変異導入キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて修正した。
【００４８】
（４）全長の接続
配列が確認された各フラグメントをつなぎ合わせ、全長ＤＮＡを得た。まずフラグメントＢをＥｃｏＲＩ、Ｂｇ１ＩＩを用いて切りだし、同じ酵素で処理したフラグメントＡを含むプラスミドに入れ込んだ。（フラグメントＡＢ）
また、フラグメントＤをＣ１ａＩ、ＢａｍＨＩを用いて切りだし、同じ酵素で処理したフラグメントＣを含むプラスミドに入れ込んだ。（フラグメントＣＤ）
最後にフラグメントＣＤをＢｇ１ＩＩ、ＳｐｅＩで切りだし、同じ酵素で処理したフラグメントＡＢを含むプラスミドに入れ込んだ。全長ＤＮＡ（フラグメントＡＢＣＤ）の配列はシーケンサーを用いて確認した。
【００４９】
（５）高コピー高発現ベクター
クローニングベクタ−であるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と発現ベクターであるｐＥＴ３ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて新たな高コピー発現ベクターを作成した。
図３にｐＥＴ３ａのクローニングサイト（Ｎｄｅｌ／ＢａｍＨＩ）周辺の塩基配列を示す。翻訳に必要なリボソーム結合部位（ＳＤ配列）と転写の終結に必要なターミネーター部位を含むプライマー（ＸＥｆ、ＸＥｒ）でＰＣＲすることにより増幅した。また、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）へのつなぎ換えを行えるように、ｐＥＴ３ａが持っているＥｃｏＲＶの認識配列をＥｃｏＲＩに改変した。このフラグメントをＸｂａＩとＥｃｏＲＩにて消化し、同じ制限酵素にて処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）に挿入した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）の多重クローニングサイト周辺の塩基配列を図４に示す。
【００５０】
ｐＥＴ３ａより増殖したフラグメントをＸｂａＩとＥｃｏＲＩのサイトに組込むことにより、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）のＴ７プロモータ、ｐＥＴ３ａのＳＤ配列、Ｎｄｅｌ、ＢａｍＨＩ、ｐＥＴ３ａのターミネーター部位が連結される。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）のものと合わせて、配列番号１に記載の全長３１４４塩基対の塩基配列を有する新たなベクター（ｐＢＥＸ）を作製した。以下、ベクター（ｐＢＥＸ）の具体的構築方法を説明する。
【００５１】
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）は高コピーベクターとしてクローニングに多用されており、多種の制限酵素切断部位が組み込まれたマルチクローニングサイトを有する（図４）。一方ｐＥＴ系のベクターは蛋白質の誘導・発現に必要なＴ７プロモーター（ＲＮＡポリメラーゼ結合部位）、ＳＤ配列（リボソーム結合部位）、ターミネーター（転写終結部位）を有し、ｐＥＴ３ａではＳＤ配列下流のＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩに目的遺伝子をクローニングして蛋白質の高発現を達成する（図３）。しかし、細胞あたりのベクターのコピー数は低い。ｐＢＥＸでは両者の利点を生かして、高コピー発現ベクターとして構築された。
【００５２】
構築法の概略を図５に示す。まず、ｐＥＴ３ａのＸｂａＩ、ＥｃｏＲＶ部位をそれぞれ含むプライマーｐＸＥｆ、ｐＸＥｒ（図３）を設計し、ＰＣＲによって目的配列を増幅した。この際、ｐＸＥｒにはＥｃｏＲＶの代わりにＥｃｏＲＩサイトを組み込んだ。これは、ＥｃｏＲＶは平滑末端を与えるのに対し、ＥｃｏＲＩは粘着末端を与えるため、次のライゲーションが容易になるためである。ＰＣＲによって、ｐＥＴ３ａのＳＤ配列、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩサイト、ターミネーターを含むフラグメントが得られる。これをＸｂａＩ、ＥｃｏＲＩにて処理し、同じ制限酵素で処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）にライゲーションした。これをＸＬ−１ＢｌｕｅＭＲＦ’に形質転換し、ｐＢＥＸを含む菌体を選別し、ストックとした。ｐＢＥＸの配列はＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩの領域の塩基配列をシークエンスすることにより確認した。なお、蛋白質の発現に必要なＴ７プロモーター領域は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）にもともと備わっている。また、ｐＢＥＸを用いた大量発現には、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現するＢＬ２１（ＤＥ３）を宿主とすることが望ましい。
【００５３】
（６）ｐＢＥＸベクターを用いたＣＹＰ２Ｃ９の大量生産
ＣＹＰ２Ｃ９（フラグメントＡＢＣＤ）を組込んだｐＢＥＸを大腸菌ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）に形質変換し、ＬＢ培地を用いて３７℃、１晩培養後、ＴＢ培地に植菌した。０．５ｍＭアミノレブリン酸を加え、３０℃で４８時間大量培養した。ヘムの合成基質であるアミノレブリン酸を添加することにより、ＣＹＰ２Ｃ９の発現量が大幅に増加した。
【００５４】
ＣＹＰ２Ｃ９を高発現を達成できた理由は以下の３つが考えられる。（１）ｐＢＥＸを用いたこと、（２）ＣＹＰ遺伝子を大腸菌での発現に最適化して試験管内全合成したこと、（３）Ｎ末端の膜貫通領域を欠失させたことである。
【００５５】
培養条件を最適化した結果、大腸菌１Ｌ培養あたり最大８００ｎｍｏｌのＣＹＰが発現していることがわかった。また、同様の方法でＣＹＰ２Ｃ１９の調製にも成功し、同程度の発現量を得ている。なお、ＣＹＰの定量は、他の文献と同じくＣＯ結合型と還元型の差スペクトルから行った。
【００５６】
なお、本発明の比較例として、以下のような発現例が報告されている。
（ｉ）ＣＹＰ２Ｃ１０のＮ末端アミノ酸を改変して大腸菌にて発現させた結果、発現量は最大で２０ｎｍｏｌ／Ｌｃｕｌｔｕｒｅであった。ただしＣＹＰ２Ｃ９は発現しなかった（Ｓｎｄｈｕｅｔａｌ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３０６，４４３−４５０（１９９３））。
（ｉｉ）ＣＹＰ２Ｃ９をＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓにて発現させた結果、発現量は最大で２５０ｎｍｏｌ／Ｌｃｕｌｔｕｒｅであった（Ｈａｉｎｉｎｇｅｔａｌ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３３３，４４４−４５８（１９９６））。
（ｉｉｉ）ＣＹＰ２Ｃ９のＮ末端アミノ酸７残基を改変して大腸菌にて発現させた結果、発現量は最大で５００ｎｍｏｌ／Ｌｃｕｌｔｕｒｅであった（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎｅｔａｌ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３２３，８７−９６（１９９５））。
【００５７】
（７）ＣＹＰ２Ｃ９の精製
遠心分離により菌体を回収後、１００ｍＭトリス酢酸緩衝液（ｐＨ７．４）、２０％グリセロール、０．５ｍＭＥＤＴＡ溶液にて菌体を懸濁し、更に０．２ｍｇ／ｍＬリゾチームを加えた。３０分撹拌後、遠心分離により沈殿を回収し、これを１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１４ｍＭ酢酸マグネシウム、６０ｍＭ酢酸カリウム緩衝液にて懸濁し、超音波処理により菌体を破砕した。
【００５８】
破砕した菌体に０．３％Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０溶液を加え、×３７０００ｇで６０分遠心分離して上澄液を回収した。これをヒドロキシアパタイトカラム、次いでオクチルセファロースカラムによりＣＹＰ２Ｃ９を精製した。最終溶出液を０．５Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７．４）、２０％グリセロール溶液中で透析し、試料を濃縮保存した。
【００５９】
（８）タンパク質の確認
最終製品をＳＤＳポリアクリルアマイド電気泳動し、予想される分子量約５２ｋＤの単一バンドを検出した。またＮ末端アミノ酸分析を行い、予想されるＣＹＰ２Ｃ９と同一であることを確認した。さらに、一酸化炭素結合型の紫外可視吸収スペクトルを測定したところ、４５０ｎｍ付近に吸収極大が観測された。変性ＣＹＰではこの極大が４２０ｎｍに現れることから、精製標品は変性していないことがわかった。
【００６０】
（９）薬物の結合性
上記で述べた方法にしたがって、ＣＹＰ２Ｃ９で代謝されることがわかっているいくつかの薬物の解離定数を算出した。イブプロフェンでは約４００μＭ、ジクロフェナクでは約１５μＭ、トルブタミドでは約３００μＭ、ワルファリンでは約２５μＭ、フェニトインでは約３０μＭという値を得た。
【００６１】
【発明の効果】
本発明の高コピー高発現ベクターを有する形質転換体を培養することにより、蛋白質を容易に大量に産生することができる。また、本発明の方法によれば、予めＳＮＰを患者のＤＮＡを調べることで、その配合量や最適薬剤等の処方を調整することができるため、従来は遺伝薬理学的・疫学的解析を待たねば結論がでなかった代謝効果のスクリーニングができるため、副作用が少なく薬効が最適の処方を短時間で、明確に決定することができる。
【００６２】
【配列表】

【００６４】

【００６５】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ヒトＣＹＰ２Ｃ９のアミノ酸配列および塩基配列（前半）を示す。
【図２】図２は、ヒトＣＹＰ２Ｃ９のアミノ酸配列および塩基配列（後半）を示す。
【図３】図３は、ｐＥＴ３ａのクローニングサイト（Ｎｄｅｌ／ＢａｍＨＩ）周辺の塩基配列を示す。
【図４】図４は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）の多重クローニングサイト周辺の塩基配列を示す。
【図５】図５は、本発明のベクターｐＢＥＸの構築法の概要を示す。[0001]
[Field of the Invention]
The present invention provides a novel high-copy high-expression vector, a transformant having the vector, a method for producing a protein such as an enzyme using the transformant, and a drug administration regimen using the enzyme. About the method.
[0002]
[Prior art]
U.S. statistics report that 2.2 million patients develop side effects each year from treatment drugs, more than 100,000 patients died from side effects, and that the medical costs of side effects can reach $ 70 billion.
[0003]
One of the causes of such side effects is the difference in the drug metabolizing ability of each individual. Such differences in drug metabolism are due to the presence of single nucleotide polymorphisms (SNPs). To minimize phytotoxicity, ordering based on patient genetic information obtained from genomic analysis of individual patients is important. The development of made medical treatment is an urgent issue.
[0004]
The ability to elucidate the mechanism of drug metabolism by enzymes and SNP analysis at the gene level will enable drug administration designs to reduce side effects, and will solve the problem of extremely high medical costs for Japan. Will open.
[0005]
As a report corresponding to the elucidation of the drug metabolism mechanism by the enzyme and the SNP analysis at the gene level, the SNP of human CYP, which is a group of enzymes expressed in the liver and involved in the metabolism of the drug, is expressed at position 359 of CDYP2C9 at Ile (CYP2C9 * 3) was found in 6% of Caucasians and 0.5% of Blacks, and 2.6% in Orientals, although (Codon: ATC) was present but mutated to Leu (Codon: CTC) by SNP. Appear at a frequency of Warfarin and the like have been reported to reduce the metabolic rate of a drug due to this mutation, resulting in the drug becoming too effective, ie, exhibiting side effects, when administered at a normal dose. (E.g. Pharmacogenetics 1996.6.3341).
[0006]
However, in order to investigate the correlation between SNP and drug metabolism, it is necessary at present to use hepatocytes derived from patients with SNP or to conduct extensive epidemiological studies on a large number of volunteers. , Detailed analysis is not done.
[0007]
A worldwide consortium of SNPs, including pharmaceutical companies, has been established and information is being accumulated one after another. (For example, HYPERLINK http: //snp..cshl.or/http: //snp..cshl.or/) However, at present, it cannot be said that this information is utilized in medical treatment.
[0008]
In order to determine the relationship between the SNPs of enzymes involved in drug metabolism and drug metabolism, it is necessary to produce a large number of enzymes having mutations caused by SNPs. Once a gene encoding a protein is incorporated into a vector, E. coli is propagated to amplify a copy of the gene, the gene thus amplified is incorporated into a protein-expressing vector, and the vector is transfected into E. coli. Thus, the protein was expressed, and a great deal of labor was required.
[0009]
[Non-patent document 1]
Pharmacogenetics 1996.6.3341
[0010]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to solve the above problems. That is, a first object of the present invention is to provide a high-copy, high-expression vector that can be used for easily producing a large amount of a protein, and a transformant having the vector. A second object of the present invention is to provide a method of designing a drug administration prescription for each patient with few side effects. Another object of the present invention is to provide a method for designing a drug administration prescription for each patient based on the gene of the patient.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, by incorporating sequence elements capable of simultaneously performing gene copy and protein expression into a single vector, proteins can be easily produced in large quantities. We succeeded in constructing a high-copy, high-expression vector that can be used for production, and completed the present invention.
[0012]
That is, according to the present invention, there is provided a vector comprising a sequence element required for high copy of a target gene, a sequence element required for expression of the target gene, and one or more cloning sites.
[0013]
Preferably, the sequence element required for high copy of the gene of interest is a sequence derived from pBluescriptII KS (+), and more preferably a fragment obtained by cutting pBluescriptII KS (+) with EcoRI and XbaI.
Preferably, the sequence elements necessary for expression of the target gene are a promoter, a ribosome binding site and a transcription termination site, and a cloning site exists between the ribosome binding site and the transcription termination site. More preferably, the ribosome binding site and the transcription termination site are sequences derived from pET3a.
[0014]
The vector of the present invention is particularly preferably obtained by inserting a sequence derived from pET3a containing a ribosome binding site (SD sequence), a NdeI / BamHI cloning site and a transcription termination site into the EcoRI and XbaI sites of pBluescriptII KS (+). It contains at least the T7 promoter sequence, SD sequence, NdeI / BamHI cloning site and transcription termination site in the 5 ′ to 3 ′ direction. One example of the vector of the present invention is a vector having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
[0015]
According to another aspect of the present invention, there is provided a recombinant vector in which a target gene is inserted into the cloning site of the above-described vector of the present invention.
Preferably, the target gene is a gene of an enzyme involved in drug metabolism, more preferably, a CYP enzyme gene, for example, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 or CYP2A6.
Preferably, the gene of interest is a gene synthesized in vitro by optimizing the CYP enzyme gene for expression in a host, and / or a gene from which the N-terminal transmembrane region has been deleted. Particularly preferably, the target gene is a gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
[0016]
According to still another aspect of the present invention, there is provided a transformant having any of the above-described vectors of the present invention. Preferably, the transformant is E. coli.
According to still another aspect of the present invention, there is provided a method for producing a protein using the above-described transformant of the present invention. Preferably, the protein produced is an enzyme involved in drug metabolism.
[0017]
According to still another aspect of the present invention, an enzyme group having a single nucleotide polymorphism gene (SNP) of an enzyme involved in drug metabolism is prepared in advance, the metabolic ability of the enzyme group for the drug is examined, and the drug is determined. Examination of genes encoding enzymes involved in drug metabolism of the patient to be administered provides a method of determining the prescription of administration of the drug to the patient.
[0018]
Preferably, the enzyme involved in drug metabolism is an enzyme present in the liver, and more preferably the enzyme present in the liver is a CYP enzyme.
[0019]
Preferably, the SNP-containing enzyme group is prepared by culturing a transformant having a recombinant vector in which the gene encoding the SNP-containing enzyme group is inserted into the above-described cloning site of the vector of the present invention, thereby obtaining the drug. Determine dosing regimen. Preferably, the dosage regimen of the drug is determined by performing a test of the metabolic capacity of the enzyme group for the drug in vitro.
[0020]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail.
(1) The vector of the present invention and a transformant having the same
The vector of the present invention contains a sequence element required for high copy of a target gene, a sequence element required for expression of the target gene, and one or more cloning sites, and is capable of simultaneously copying and expressing the target gene. Is possible. The vector of the present invention is a high-copy high-expression vector into which a sequence element for copy and a sequence element for expression are incorporated. Specifically, the vector of the present invention incorporates a DNA sequence containing a ribosome binding site and a terminator site necessary for termination of transcription as well as a cloning site.
[0021]
As the origin of the vector of the present invention, chromosomes, bacterial plasmids derived from episomes and viruses, yeast plasmids, papovavirus, vaccinia virus, adenovirus, adenoassociated virus, fowlpox virus, pseudorabies virus, retrovirus-derived vectors, Vectors derived from bacteriophages, transposons, and combinations thereof can be mentioned. Of these, bacterial plasmids are preferred, and sequence elements derived from two types of bacterial plasmids (ie, sequence elements required for high copy of the target gene and sequence elements required for expression of the target gene) Can be used in combination.
[0022]
Sequence elements required for high copy of the target gene include, for example, a sequence element containing a replication origin and a drug resistance gene suitable for a host. Examples of the replication origin suitable for the host include pUCori and f1 (+) ori when the host is Escherichia coli. Examples of the drug resistance gene include an antibiotic resistance gene such as an ampicillin resistance gene, a neomycin resistance gene, and a tetracycline resistance gene.
[0023]
As a sequence element required for high copy of the target gene used in the present invention, a sequence derived from pBluescriptII KS (+) is preferably used. For example, a fragment obtained by cutting pBluescriptII KS (+) with EcoRI and XbaI is used. be able to.
[0024]
Sequence elements necessary for expression of the target gene are a promoter, a ribosome binding site, and a transcription termination site, and are sequence elements such that a cloning site exists between the ribosome binding site and the transcription termination site. The type of the promoter is not particularly limited as long as it can operate in the host used. Promoters operable in bacterial cells include the lac, trp or tac promoters of E. coli, and P promoters of phage lambda. _R Or P _L Promoters and the like. Examples of promoters operable in mammalian cells include the SV40 promoter, the metallothionein gene promoter, or the adenovirus 2 major late promoter. Examples of promoters operable in insect cells include the polyhedrin promoter, the P10 promoter, the Autographa californica polyhedrosis basic protein promoter, the baculovirus immediate early gene 1 promoter, or the baculovirus 39K delayed early gene. There are promoters and the like. Examples of a promoter operable in a yeast host cell include a promoter derived from a yeast glycolysis gene, an alcohol dehydrogenase gene promoter, a TPI1 promoter, an ADH2-4c promoter, and the like. Examples of promoters operable in filamentous fungal cells include the ADH3 promoter and the tpiA promoter.
[0025]
Examples of the ribosome binding site include an SD sequence.
[0026]
Examples of the transcription termination site include a polyadenylation site.
[0027]
In the present invention, a sequence derived from the plasmid pET3a can be used as a ribosome binding site and a transcription termination site.
An example of the vector of the present invention is prepared by inserting a sequence derived from pET3a including a ribosome binding site (SD sequence), an NdeI / BamHI cloning site and a transcription termination site into the EcoRI and XbaI sites of pBluescriptII KS (+). And a vector containing at least a T7 promoter sequence, an SD sequence, an NdeI / BamHI cloning site and a transcription termination site in the 5 ′ to 3 ′ direction. More specifically, the base sequence of SEQ ID NO: 1 can be used. Can be mentioned.
[0028]
By inserting a target gene into the cloning site of the vector of the present invention, a recombinant expression vector for expressing the target gene can be prepared. The type of the target gene is not particularly limited, but is preferably a gene encoding a protein to be expressed. As the target gene, for example, a gene of an enzyme involved in drug metabolism can be used, and more specifically, a CYP enzyme gene (eg, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 or CYP2A6) can be used. .
According to a preferred embodiment of the present invention, as the target gene, a gene obtained by optimizing the CYP enzyme gene for expression in a host and synthesizing in vitro and deleting the N-terminal transmembrane region is used. be able to. An example of such a gene includes a target gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
[0029]
A transformant can be prepared by transfecting the vector of the present invention into a host cell. Examples of host cells that can be used in the present invention include bacterial prokaryotic cells such as Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus subtilis, Streptococcus, and Staphylococcus; fungal cells such as yeast and Aspergillus; and insect cells such as Drosophila S2 and Spodoptera Sf9. And the like. In the present invention, it is particularly preferable to use Escherichia coli from the viewpoint of easy growth.
[0030]
Vectors can be introduced into host cells by, for example, calcium phosphate transfection, DEAE-dextran mediated transfection, transvection, microinjection, cationic lipid mediated transfection, electroporation, transduction, scraping, bullet introduction. , Infection or the like.
[0031]
Obtaining a large amount of a transformant containing a target protein (eg, an enzyme involved in drug metabolism) by culturing a large amount of a transformant (preferably, Escherichia coli) having the high copy high expression vector of the present invention. Can be. When Escherichia coli is used as a transformant, Escherichia coli can be cultured preferably at 30 to 40 ° C. using a known medium such as a TB medium. In order to increase the production amount of the enzyme, when the substrate of the enzyme or the enzyme is CYP2C9, it is preferable to add aminolevulinic acid to the medium and culture.
[0032]
In order to recover and purify the target protein (for example, an enzyme involved in drug metabolism) from the culture containing the above-mentioned transformant, for example, EDTA or the like is mixed in a phosphate buffer, and the cells are made of, for example, ammonium sulfate. Alternatively, after precipitation and aggregation with ethanol, the cells are collected by filtration or centrifugation, and then the cells are disrupted in a buffer solution by, for example, ultrasonic treatment, and EDTA and phosphoric acid are added to the disrupted mixture. Potassium is then centrifuged to remove the cells, the supernatant is collected, and anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxyapatite chromatography and lectin chromatography and high performance liquid chromatography are performed. Known methods, including Mashiku may be employed a method such as purification by dialysis the final eluate hydroxyapatite chromatography, followed by Sepharose chromatography through enzyme solution. The target protein is preferably concentrated and stored, for example, in a buffer / glycerin mixture, and then subjected to the following tests.
[0033]
(2) Determination of prescription of drug administration to patients
According to the present invention, an enzyme group having a single nucleotide polymorphism gene (SNP) involved in drug metabolism is prepared using a transformant having the high copy high expression vector of the present invention, and the enzyme group The present invention also provides a method of determining the prescription of a drug to a patient by examining the metabolic ability of the patient to the drug and examining the gene encoding an enzyme involved in drug metabolism of the patient to whom the drug is to be administered.
[0034]
The enzymes targeted in the present invention are enzymes involved in drug metabolism. Enzymes normally involved in drug metabolism are present in the liver. Since a typical example of such an enzyme involved in drug metabolism is CYP (cytochrome P450 family), it is preferable to target a CYP enzyme group which plays an important role in drug metabolism. The CYP enzyme group and the drugs serving as its substrates are listed as follows.
[0035]
[Table 1]

[0036]
Among CYPs, CYP2C9 is a cytochrome P450 particularly involved in drug metabolism, and it is particularly preferable to target this enzyme.
[0037]
In the method of the present invention for determining a drug administration regimen, a gene encoding a specific enzyme involved in such drug metabolism and an enzyme having a mutation (genotype) introduced based on the SNP information of the gene at that site are prepared. I do.
[0038]
In order to produce a large amount of the SNP of the enzyme involved in drug metabolism used in the method of the present invention, a transformant (especially Escherichia coli) having the high copy high expression vector of the present invention is used in the following method. Preferably, it is produced.
First, a DNA base sequence is designed using codons without changing the amino acid sequence of the enzyme whose amino acid sequence is reported.
Next, the DNA is amplified by a technique such as PCR. Since the DNA constituting the enzyme has a long coding region, it is preferable to perform PCR amplification by dividing the fragment into several fragments into which restriction enzyme sites have been introduced.
[0039]
The fragment amplified by PCR is incorporated into the high-copy high-expression vector of the present invention, and Escherichia coli harboring this plasmid is propagated for cloning and copying. The fragments are finally ligated together to form full-length DNA.
[0040]
In the above, a method for synthesizing a drug-metabolizing enzyme having one amino acid sequence has been described. However, based on SNP information reported on SNPs, or examining the amino acid sequence of a drug-metabolizing enzyme in patients showing various medicinal effects, etc. Based on the information obtained by the above method, a large amount of a drug metabolizing enzyme mutant can be synthesized by the same method as described above.
[0041]
Confirmation of drug metabolism by the drug metabolizing enzyme synthesized by the above method can be performed, for example, by calculating the binding affinity between various drugs to be administered to a patient and the drug metabolizing enzyme from an ultraviolet-visible light absorption spectrum. Specifically, for example, a solution obtained by diluting the drug-metabolizing enzyme concentrate obtained by the above method with a buffer is injected into a test tube. Next, a solution in which a predetermined amount of the drug whose metabolism is to be confirmed is previously dispersed in a phosphate buffer solution is injected, mixed, and then left at a constant temperature for a certain period of time. Thereafter, the sample solution is transferred to a measurement cell, and the ultraviolet-visible light spectrum is measured by an ultraviolet-visible light spectrometer.The drug-drug metabolizing enzyme is obtained by comparing the peak height derived from the drug in the obtained spectrum with that of the blank. Can be determined.
[0042]
Tissues or cells, preferably body fluids, of the patient are collected and their DNA is routinely determined to determine which type of drug-metabolizing enzyme the patient has using, for example, a sequencer. Thereby, the genetic information of the drug administration target patient is collected. As body fluid, blood, saliva or urine is preferred. In particular, it is preferable to limit the search to the gene at the site encoding the drug metabolizing enzyme.
[0043]
When the type of drug-metabolizing enzyme is found by examining the patient's DNA, the drug-metabolizing performance of the drug-metabolizing enzyme determined in advance determines whether or not the drug should be administered to the patient. It is possible to create a prescription by judging whether or not there is any.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
[0044]
【Example】
(1) Design of DNA encoding drug metabolizing enzyme
Human CYP2C9 was targeted as a drug metabolizing enzyme. The amino acid sequence of human CYP2C9 is reported in (Swiss Prot; CPC9_HUMAN). Without changing the amino acid sequence, the DNA base sequence was designed using codons that were successfully expressed in Escherichia coli. The amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) and the base sequence (SEQ ID NO: 2) of human CYP2C9 are shown in FIGS. Since CYP2C9 is a membrane protein and is considered difficult to purify and handle experimentally, 20 amino-terminal residues (D2-R21) at the amino terminus, which are considered to be transmembrane regions, were deleted. Since the DNA to be synthesized has a coding region of 1410 bases, this was divided into four fragments (A, BC, D) and synthesized.
[0045]
(2) PCR
A DNA oligomer was synthesized based on the design of the above (1). The method of synthesizing each fragment will be described using fragment A as an example. First, Af1, Af2, Ar1, and Ar2 were mixed in equimolar amounts, and the first PCR was performed. A small amount of this solution was taken, AR and AF were added, and the second PCR was performed.
[0046]
(3) Propagation and cloning using E. coli
Fragment A amplified by PCR was cut out using restriction sites XhoI and EcoRI (New England Biolabs) introduced at the ends, and ligated to plasmid pBluescriptII SK (+) (Stratagene) treated with the same enzymes. Escherichia coli XL-1 Blue MRF '(Stratagene) as a host was transformed and spread on an LB plate containing ampicillin. After overnight cultivation at 37 ° C., E. coli colonies were picked and liquid-cultured using an LB medium containing ampicillin. After recovering the cells, the plasmid was extracted (Promega, Miniprep), and the nucleotide sequence was examined using a DNA sequencer. It was confirmed that there was no unexpected mutation and that the expected fragment was obtained.
[0047]
In the same manner, fragment B (first PCR: Bf1, Bf2, Bf3, Br1, Br2, Br3, second PCR: BR, BF), fragment C (first PCR: Cf1, Cf2, Cf3, Cr1, Cr2, Cr3, PCR) Second time: CR, CF) and fragment D (first time PCR: Df1, Df2, Df3, Dr1, Dr2, Dr3, second PCR: DR, DF) were synthesized. Cloning was performed using restriction enzyme sites (fragment B: EcoRI, Bg1II, fragment C: Bg1II, C1aI, fragment D: C1aI, BamHI) at the end of each fragment. Sites containing unexpected mutations were corrected using the QuikChange Mutagenesis Kit (Stratagene).
[0048]
(4) Full length connection
The fragments whose sequence was confirmed were connected to obtain a full-length DNA. First, fragment B was excised using EcoRI and Bg1II, and inserted into a plasmid containing fragment A treated with the same enzyme. (Fragment AB)
Fragment D was cut out using C1aI and BamHI, and inserted into a plasmid containing fragment C treated with the same enzyme. (Fragment CD)
Finally, the fragment CD was cut out with BglII and SpeI, and inserted into a plasmid containing fragment AB treated with the same enzyme. The sequence of the full-length DNA (fragment ABCD) was confirmed using a sequencer.
[0049]
(5) High copy high expression vector
A new high-copy expression vector was prepared using pBluescriptIIKS (+) (Stratagene) as a cloning vector and pET3a (Stratagene) as an expression vector.
FIG. 3 shows the nucleotide sequence around the cloning site (Ndel / BamHI) of pET3a. Amplification was performed by PCR with primers (XEf, XEr) containing a ribosome binding site (SD sequence) required for translation and a terminator site required for termination of transcription. In addition, the EcoRV recognition sequence of pET3a was changed to EcoRI so that reconnection to pBluescriptIIKS (+) could be performed. This fragment was digested with XbaI and EcoRI, and inserted into pBluescriptIIKS (+) treated with the same restriction enzymes. The base sequence around the multiple cloning site of pBluescriptIIKS (+) is shown in FIG.
[0050]
The T7 promoter of pBluescriptIIKS (+), the SD sequence of pET3a, Ndel, BamHI, and the terminator site of pET3a are ligated by incorporating the fragment grown from pET3a into the XbaI and EcoRI sites. A new vector (pBEX) having the full-length nucleotide sequence of 3144 base pairs shown in SEQ ID NO: 1 was prepared in combination with that of pBluescriptIIKS (+). Hereinafter, a specific method for constructing the vector (pBEX) will be described.
[0051]
pBluescriptII KS (+) is frequently used for cloning as a high copy vector, and has a multiple cloning site in which various restriction enzyme cleavage sites are integrated (FIG. 4). On the other hand, pET vectors have a T7 promoter (RNA polymerase binding site), a SD sequence (ribosome binding site), and a terminator (transcription termination site) necessary for protein induction and expression. To achieve high protein expression (FIG. 3). However, the copy number of the vector per cell is low. pBEX was constructed as a high copy expression vector taking advantage of both.
[0052]
The outline of the construction method is shown in FIG. First, primers pXEf and pXEr (FIG. 3) containing the XbaI and EcoRV sites of pET3a were designed, and the target sequence was amplified by PCR. At this time, an EcoRI site was incorporated in pXEr instead of EcoRV. This is because EcoRV gives blunt ends, whereas EcoRI gives sticky ends, which facilitates the next ligation. By PCR, a fragment containing the SD sequence of pET3a, NdeI / BamHI site, and terminator is obtained. This was treated with XbaI and EcoRI, and ligated to pBluescriptII KS (+) treated with the same restriction enzymes. This was transformed into XL-1 Blue MRF ', and cells containing pBEX were selected and used as stock. The sequence of pBEX was confirmed by sequencing the base sequence in the XbaI / EcoRI region. The T7 promoter region necessary for protein expression is originally provided in pBluescriptII KS (+). For large-scale expression using pBEX, it is desirable to use BL21 (DE3) expressing T7 RNA polymerase as a host.
[0053]
(6) Mass production of CYP2C9 using pBEX vector
PBEX incorporating CYP2C9 (fragment ABCD) was transformed into Escherichia coli BL21Gold (DE3), cultured overnight at 37 ° C. using LB medium, and then inoculated into TB medium. 0.5 mM aminolevulinic acid was added, and the cells were cultured at 30 ° C. for 48 hours. The addition of aminolevulinic acid, a heme synthetic substrate, greatly increased the expression level of CYP2C9.
[0054]
The following three conceivable reasons for achieving high expression of CYP2C9 can be considered. (1) pBEX was used; (2) CYP gene was optimized for expression in Escherichia coli; total synthesis was performed in a test tube; and (3) N-terminal transmembrane region was deleted.
[0055]
As a result of optimizing the culture conditions, it was found that a maximum of 800 nmol of CYP was expressed per 1 L of E. coli culture. In addition, CYP2C19 was successfully prepared by the same method, and a similar expression level was obtained. The quantification of CYP was performed from the difference spectrum between the CO-bonded type and the reduced type as in other documents.
[0056]
The following expression examples have been reported as comparative examples of the present invention.
(I) As a result of modifying the N-terminal amino acid of CYP2C10 and expressing it in Escherichia coli, the expression level was 20 nmol / L culture at maximum. However, CYP2C9 was not expressed (Sndhu et al, Arch. Biochem. Biophys. 306, 443-450 (1993)).
(Ii) As a result of expressing CYP2C9 in Baculovirus, the expression level was 250 nmol / L culture at maximum (Haining et al, Arch. Biochem. Biophys. 333, 444-458 (1996)).
(Iii) As a result of modifying the N-terminal amino acid 7 residues of CYP2C9 and expressing it in Escherichia coli, the expression amount was 500 nmol / L culture at maximum (Richardson et al, Arch. Biochem. Biophys. 323, 87). -96 (1995)).
[0057]
(7) Purification of CYP2C9
After recovering the cells by centrifugation, the cells were suspended in a 100 mM Tris acetate buffer (pH 7.4), 20% glycerol, 0.5 mM EDTA solution, and 0.2 mg / mL lysozyme was further added. After stirring for 30 minutes, the precipitate was collected by centrifugation, suspended in 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 14 mM magnesium acetate, and 60 mM potassium acetate buffers, and disrupted by ultrasonication.
[0058]
A 0.3% Nonidet-P40 solution was added to the crushed cells, and the supernatant was collected by centrifugation at × 37000 g for 60 minutes. This was purified with a hydroxyapatite column and then with an octyl sepharose column to purify CYP2C9. The final eluate was dialyzed in a 0.5 M potassium phosphate (pH 7.4), 20% glycerol solution, and the sample was concentrated and stored.
[0059]
(8) Confirmation of protein
The final product was subjected to SDS polyacrylamide electrophoresis, and a single band having an expected molecular weight of about 52 kD was detected. In addition, N-terminal amino acid analysis was performed, and it was confirmed that it was the same as the expected CYP2C9. Further, when an ultraviolet-visible absorption spectrum of a carbon monoxide bond type was measured, an absorption maximum was observed at around 450 nm. In the case of denatured CYP, this maximum appears at 420 nm, indicating that the purified sample was not denatured.
[0060]
(9) Drug binding properties
According to the method described above, the dissociation constants of some drugs known to be metabolized by CYP2C9 were calculated. The values were about 400 μM for ibuprofen, about 15 μM for diclofenac, about 300 μM for tolbutamide, about 25 μM for warfarin, and about 30 μM for phenytoin.
[0061]
【The invention's effect】
By culturing a transformant having the high copy high expression vector of the present invention, a large amount of protein can be easily produced. Further, according to the method of the present invention, by examining the DNA of a patient for SNPs in advance, it is possible to adjust the compounding amount and the prescription of the optimal drug, etc., and therefore, awaiting genetic pharmacological and epidemiological analysis. Since it is possible to screen for metabolic effects that could not be concluded otherwise, it is possible to clearly and quickly determine the optimal prescription with few side effects.
[0062]
[Sequence list]

[0064]

[0065]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the amino acid sequence and base sequence (first half) of human CYP2C9.
FIG. 2 shows the amino acid sequence and base sequence (second half) of human CYP2C9.
FIG. 3 shows the nucleotide sequence around the cloning site (Ndel / BamHI) of pET3a.
FIG. 4 shows the nucleotide sequence around the multiple cloning site of pBluescriptIIKS (+).
FIG. 5 shows an outline of a method for constructing a vector pBEX of the present invention.

Claims

A vector comprising a sequence element required for high copy of a target gene, a sequence element required for expression of the target gene, and one or more cloning sites.

The vector according to claim 1, wherein the sequence element required for high copy of the target gene is a sequence derived from pBluescriptII KS (+).

The vector according to claim 1 or 2, wherein the sequence element required for high copy of the target gene is a fragment obtained by cutting pBluescriptII KS (+) with EcoRI and XbaI.

The sequence element necessary for expression of the target gene is a promoter, a ribosome binding site and a transcription termination site, and a cloning site is present between the ribosome binding site and the transcription termination site. Vector.

The vector according to any one of claims 1 to 4, wherein the ribosome binding site and the transcription termination site are sequences derived from pET3a.

Created by inserting a sequence from pET3a containing a ribosome binding site (SD sequence), an NdeI / BamHI cloning site and a transcription termination site into the EcoRI and XbaI sites of pBluescriptII KS (+), at least in the 5 'to 3' direction. The vector according to any one of claims 1 to 5, further comprising a T7 promoter sequence, an SD sequence, an NdeI / BamHI cloning site and a transcription termination site.

A vector having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.

A recombinant vector having a target gene inserted into a cloning site of the vector according to any one of claims 1 to 7.

The recombinant vector according to claim 8, wherein the target gene is a gene of an enzyme involved in drug metabolism.

10. The recombinant vector according to claim 8, wherein the target gene is a CYP enzyme gene.

The recombinant vector according to any one of claims 8 to 10, wherein the target gene is CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, or CYP2A6.

12. The recombinant vector according to claim 10, wherein the target gene is a gene synthesized in vitro by optimizing a CYP enzyme gene for expression in a host.

The recombinant vector according to any one of claims 10 to 12, wherein the target gene is a gene in which an N-terminal transmembrane region has been deleted.

A recombinant vector comprising the target gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 inserted into the cloning site of the vector according to any one of claims 1 to 7.

A transformant having the vector according to claim 1.

The transformant according to claim 15, which is Escherichia coli.

A method for producing a protein, comprising using the transformant according to claim 15.

The method for producing a protein according to claim 17, wherein the protein is an enzyme involved in drug metabolism.

An enzyme group having a single nucleotide polymorphism gene (SNP) involved in drug metabolism is prepared in advance, the metabolic ability of the enzyme group for the drug is examined, and the enzyme involved in drug metabolism of a patient to whom the drug is to be administered is prepared. A method for determining the prescription of administration of a drug to a patient by examining the gene encoding

20. The method according to claim 19, wherein the enzyme involved in drug metabolism is an enzyme present in the liver.

21. The method of claim 20 wherein the enzyme present in the liver is a CYP enzyme.

8. A group of enzymes having SNPs is produced by culturing a transformant having a recombinant vector in which a gene encoding a group of enzymes having SNPs is inserted into the cloning site of the vector according to any one of claims 1 to 7. Item 22. A method for determining a drug administration regimen according to any one of Items 19 to 21.

23. The method for determining a dosage regimen of a drug according to any one of claims 19 to 22, wherein the metabolic ability of the enzyme group to the drug is tested in vitro.