JP2004205504A - Enzyme immunity measurement method for endocrine-disrupting chemical - Google Patents

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To simply, quickly, precisely, and economically measure an endocrine-disrupting chemical. <P>SOLUTION: The endocrine-disrupting chemical in a sample is made so as to immunologically react with an enzyme labeled antigen, by the competition with a solidly prepared solid antibody, and the luminous amount of the enzymatic reaction of the enzyme labeled antigen fixed to the solid phase is obtained by a solid phase antibody, arising from the addition of a luminescence reagent. The concentration of the endocrine disrupting chemical in the sample is determined indirectly, using a calibration curve. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO&NCIPI

Description

本発明は、内分泌撹乱化学物質である17β−エストラジオールを測定する酵素免疫測定法に関するものである。   The present invention relates to an enzyme immunoassay for measuring 17β-estradiol, which is an endocrine disrupting chemical.

内分泌撹乱化学物質(以下、環境ホルモンと称す。)は、アメリカのシーア・コルボーンらが発刊した「奪われし未来」によって、地球規模の環境問題の一つとして注目を集め、幅広い関心を呼ぶこととなった。それ以来、環境ホルモン問題に対して我が国では、科学的に未解明な点が多いことから、関係行政機関や各種研究機関が様々な視点から調査、研究に取り組んでいる。   Endocrine disrupting chemicals (hereafter referred to as environmental hormones) have been attracting attention as one of the global environmental issues and gaining widespread interest due to the publication of "The Deprived Future" published by Shia Colborn and others in the United States. It became. Since then, there have been many scientifically unclear points in Japan regarding the problem of endocrine disrupters, and related administrative agencies and various research institutes have been investigating and conducting research from various viewpoints.

内分泌撹乱作用を有すると疑われる化学物質は多数あるが、我が国においては、1998年に環境省が67物質をリストアップしている。(SPEED98:Strategic programs on Enviromental Endocrine Disruptors)そして、下記表1に示すとおり、その中から24物質に絞り込んでいる。   Although there are many chemicals suspected of having endocrine disrupting effects, in Japan, the Ministry of the Environment listed 67 substances in 1998. (SPEED98: Strategic programs on Enviromental Endocrine Disruptors) And as shown in Table 1 below, 24 substances have been narrowed down.

Figure 2004205504
Figure 2004205504

環境ホルモンは、女性ホルモンと同様の働きを有し、微量でも生殖機能に悪影響を与えることから問題になっている。   Environmental hormones have the same function as female hormones, and pose a problem because even a trace amount adversely affects reproductive function.

従来の環境ホルモンの測定方法として、高分解能のGC−MSやLC−MS/MS等による機器分析法(環境省暫定マニュアル等)がある。しかし高分解能のGC−MSやLC−MS/MS等の分析装置は高額であるため、自前で測定可能な研究室はごく僅かしかなく、煩雑な濃縮操作、抽出操作、及びクリーンアップ操作が必要である等の問題を有している。   As a conventional method for measuring environmental hormones, there is an instrumental analysis method using a high-resolution GC-MS or LC-MS / MS (a provisional manual of the Ministry of the Environment, etc.). However, high-resolution GC-MS, LC-MS / MS, and other analyzers are expensive, so there are only a few laboratories that can perform their own measurements, and complicated concentration, extraction, and cleanup operations are required. Is a problem.

近年は、特別な設備を必要とせず、比較的短時間で高感度に測定対象を検出でき、さらに目的物質を特異的に検出でき、しかも経済的であるため環境中に残存する環境物質を監視するモニタリングに適している酵素免疫測定法により環境ホルモンの測定が行われている。   In recent years, without special equipment, it is possible to detect an object to be measured in a relatively short time with high sensitivity, and to specifically detect the target substance, and to monitor environmental substances remaining in the environment because it is economical. Environmental hormones are measured by an enzyme immunoassay suitable for monitoring.

例えば、環境ホルモンを抗原とし、抗原を酵素で標識した標識抗原と競合法、または非競合により抗体との免疫反応を行い、反応終了後に発光基質試薬を添加して酵素と化学発光反応させ、発光量から環境ホルモンを測定する酵素免疫測定法が行われている(例えば、特許文献1参照。)。
特開2001−66311号公報
For example, an environmental hormone is used as an antigen, and an immunoreaction with an antibody is performed by a competitive method or non-competition with a labeled antigen obtained by labeling the antigen with an enzyme. An enzyme immunoassay for measuring environmental hormones from the amount has been performed (for example, see Patent Document 1).
JP-A-2001-66311

環境ホルモンの測定に際して、高分解能のGC−MSやLC−MS/MS等の分析装置を用いて測定を行う場合は、装置が非常に高額であり、濃縮操作、抽出操作、及びクリーンアップ操作等の前準備を必要とし、簡単で速やかな測定が困難である。   When measuring environmental hormones using an analyzer such as a high-resolution GC-MS or LC-MS / MS, the equipment is very expensive and requires a concentration operation, an extraction operation, a cleanup operation, etc. It requires preparation beforehand, and simple and quick measurement is difficult.

女性及び雌の動物の生殖器官の発育や性的特徴維持、機能調整等を司る女性ホルモンは、卵巣濾胞から分泌されるエストロゲンと卵巣黄体から分泌される黄体ホルモンとに大別される。エストロゲンは、主として生殖器官の発育や性的特徴の保持を司るのに対して、黄体ホルモンは、エストロゲンと協力して性周期を起こさせ、妊娠を継続させるものである。   Female hormones responsible for the development of the reproductive organs of female and female animals, maintenance of sexual characteristics, function adjustment, and the like are roughly classified into estrogen secreted from ovarian follicles and luteal hormone secreted from ovarian luteum. Estrogen is mainly responsible for the development of the reproductive organs and preservation of sexual characteristics, whereas progesterone, in cooperation with estrogen, causes the estrous cycle to continue pregnancy.

動物のエストロゲンの主要なものは、エストロン、17β−エストラジオール、エストリオールの3種類で、この3種類の中で17β−エストラジオールの作用が最も強い。   The main three types of animal estrogens are estrone, 17β-estradiol, and estriol, of which the action of 17β-estradiol is the strongest.

17β−エストラジオールは環境ホルモンの中でも特に女性ホルモン作用が強く、17β−エストラジオールの実用的な測定方法の確立が急務である。   17β-estradiol has a particularly strong female hormone action among environmental hormones, and it is urgently necessary to establish a practical method for measuring 17β-estradiol.

本発明は、かかる事情に鑑みなされたもので、その目的は17β−エストラジオールを経済的に、誤差なく、簡単、迅速に測定できる方法を提供することにある。   The present invention has been made in view of such circumstances, and an object of the present invention is to provide a method that can measure 17β-estradiol economically, without error, easily, and quickly.

前記課題を解決するために、請求項1に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法は、抗体を固相調製した後、前記固相に酵素標識抗原、および内分泌撹乱化学物質を添加して免疫反応を行わせ、免疫反応終了後、前記固相を洗浄してから発光試薬を添加して、酵素反応による発光量から前記内分泌撹乱化学物質を測定することを特徴とする。   In order to solve the above-mentioned problem, the enzyme immunoassay for endocrine disrupting chemicals according to claim 1 comprises preparing a solid phase of an antibody, and then adding an enzyme-labeled antigen and an endocrine disrupting chemical to the solid phase. An immunological reaction is performed, and after the immunological reaction is completed, the solid phase is washed, a luminescent reagent is added, and the endocrine disrupting chemical substance is measured from the amount of luminescence by the enzymatic reaction.

請求項2に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法は、請求項1において、前記内分泌撹乱化学物質が17β−エストラジオールであることを特徴とする。   The enzyme immunoassay for endocrine disrupting chemicals according to claim 2 is characterized in that, in claim 1, the endocrine disrupting chemical is 17β-estradiol.

請求項3に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法は、請求項2において、前記抗体は17β−エストラジオールに牛血清アルブミンを結合し、ウサギに免疫して調製したものであることを特徴とする。   The enzyme immunoassay for endocrine disrupting chemicals according to claim 3 is characterized in that, in claim 2, the antibody is prepared by binding bovine serum albumin to 17β-estradiol and immunizing rabbits. I do.

請求項4に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法は、請求項3において、前記抗体の濃度が0.75μg/mLであることを特徴とする。   According to a fourth aspect of the present invention, in the enzyme immunoassay for an endocrine disrupting chemical substance according to the third aspect, the concentration of the antibody is 0.75 μg / mL.

請求項5に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法は、請求項4において、前記抗体1mLに対して添加する前記酵素標識抗原および17β−エストラジオールの混合溶液の体積が100μLであることを特徴とする。   The enzyme immunoassay for endocrine disrupting chemicals according to claim 5 is characterized in that, in claim 4, the volume of the mixed solution of the enzyme-labeled antigen and 17β-estradiol added to 1 mL of the antibody is 100 μL. And

請求項6に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法は、請求項4において、前記混合溶液中の酵素標識抗原の濃度が0.125〜0.25μg/mLであることを特徴とする。   According to a sixth aspect of the present invention, in the enzyme immunoassay for endocrine disrupting chemicals according to the fourth aspect, the concentration of the enzyme-labeled antigen in the mixed solution is 0.125 to 0.25 μg / mL.

請求項7に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法は、請求項5または6において、前記免疫反応を200rpmの回転数で振とうしながら行うことを特徴とする。   An enzyme immunoassay for an endocrine disrupting chemical substance according to a seventh aspect is characterized in that, in the fifth or sixth aspect, the immune reaction is carried out while shaking at a rotation speed of 200 rpm.

請求項8に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法は、請求項5乃至7において、前記免疫反応を1時間以上行うことを特徴とする。   An enzyme immunoassay for an endocrine disrupting chemical substance according to claim 8 is the method according to claims 5 to 7, wherein the immune reaction is performed for 1 hour or more.

請求項9に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法は、第1抗体を固相調製した後、固相に酵素標識抗原、内分泌撹乱化学物質、および第2抗体を添加して免疫反応を行わせ、免疫反応終了後、前記固相を洗浄してから発光試薬を添加して、酵素反応による発光量から前記内分泌撹乱化学物質を測定することを特徴とする。   An enzyme immunoassay for an endocrine disrupting chemical substance according to claim 9, wherein after preparing the first antibody on a solid phase, an enzyme-labeled antigen, an endocrine disrupting chemical substance, and a second antibody are added to the solid phase to perform an immune reaction. After the completion of the immune reaction, the solid phase is washed, a luminescent reagent is added, and the endocrine disrupting chemical substance is measured from the amount of light emitted by the enzymatic reaction.

請求項10に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法は、請求項9において、前記内分泌撹乱化学物質が17β−エストラジオールであることを特徴とする。   An enzyme immunoassay for an endocrine disrupting chemical substance according to a tenth aspect is characterized in that, in the ninth aspect, the endocrine disrupting chemical substance is 17β-estradiol.

請求項11に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法は、請求項10において、前記第1抗体が抗ウサギIgGヤギ抗体であり、前記第2抗体が抗17β−エストラジオールウサギ抗体であることを特徴とする。   An enzyme immunoassay for an endocrine disrupting chemical substance according to claim 11 is the method according to claim 10, wherein the first antibody is an anti-rabbit IgG goat antibody, and the second antibody is an anti-17β-estradiol rabbit antibody. Features.

請求項12に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法は、請求項11において、前記抗ウサギIgGヤギ抗体の濃度が1.0μg/mLであり、前記抗17β−エストラジオールウサギ抗体の濃度が0.75μg/mLであることを特徴とする。   In the enzyme immunoassay for endocrine disrupting chemicals according to claim 12, the concentration of the anti-rabbit IgG goat antibody is 1.0 μg / mL and the concentration of the anti-17β-estradiol rabbit antibody is 0. .75 μg / mL.

請求項13に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法は、請求項11または12において、免疫反応を200rpmの回転数で振とうしながら行うことを特徴とする。   An enzyme immunoassay for an endocrine disrupting chemical substance according to a thirteenth aspect is characterized in that, in the eleventh or twelfth aspect, the immune reaction is performed while shaking at a rotation speed of 200 rpm.

酵素免疫測定法とは、酵素で標識した抗原または抗体を用いて抗原抗体反応を行い、酵素活性を測定することにより抗原抗体反応を検出して抗原または抗体の量を決定する方法である。   The enzyme immunoassay is a method in which an antigen-antibody reaction is performed using an antigen or antibody labeled with an enzyme, and the amount of the antigen or antibody is determined by detecting the antigen-antibody reaction by measuring the enzyme activity.

請求項1乃至8に記載の発明は、試料中の内分泌撹乱化学物質と、酵素標識抗原とを固相調製した抗体に競合させて免疫反応させ、発光試薬を加えることにより起こる固相抗体に固定された酵素標識抗原の発光反応の発光量を求め、検量線を用いて間接的に試料中の内分泌撹乱化学物質の測定を行うことができる。   The invention according to claims 1 to 8 is characterized in that an endocrine-disrupting chemical substance in a sample and an enzyme-labeled antigen are competed with an antibody prepared in solid phase for immunoreaction, and immobilized on a solid phase antibody caused by adding a luminescent reagent. The amount of luminescence of the luminescence reaction of the enzyme-labeled antigen thus obtained is obtained, and the endocrine disrupting chemical substance in the sample can be indirectly measured using a calibration curve.

また、請求項9乃至13に記載の発明は、試料中の内分泌撹乱化学物質と、酵素標識抗原と、を固相調製した第1抗体に反応されうる第2抗体に競合させて免疫反応させ、第2抗体と、第1抗体と、により固相に固定された酵素標識抗原を発光試薬を加えることにより起こる発光反応の発光量から測定することにより、試料中の内分泌撹乱化学物質の測定を行うことができる。   Further, the invention according to claims 9 to 13 is characterized in that an endocrine disrupting chemical substance in a sample and an enzyme-labeled antigen are competed with a second antibody capable of reacting with a first antibody prepared by solid-phase preparation to cause an immunoreaction, The endocrine disrupting chemical substance in the sample is measured by measuring the enzyme-labeled antigen immobilized on the solid phase by the second antibody and the first antibody from the amount of luminescence of the luminescence reaction caused by adding the luminescence reagent. be able to.

なお、酵素標識17β−エストラジオールの標識酵素は生物又は化学発光反応を触媒しうる限り、特に限定されないが、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシターゼ、グルコースオキシターゼ、ウレアーゼ等がある。   The labeling enzyme of enzyme-labeled 17β-estradiol is not particularly limited as long as it can catalyze a biological or chemiluminescent reaction, and examples thereof include peroxidase, alkaline phosphatase, β-galactosidase, glucose oxidase, urease and the like.

また、抗体についてはポリクロナール抗体、モノクロナール抗体のどちらを用いてもよい。   As for the antibody, either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody may be used.

以上の説明から明らかなように、本発明は以下の効果を奏する。   As is clear from the above description, the present invention has the following effects.

高価なGC−MSやLC−MS/MS等による機器分析装置を使用せず、17β−エストラジオールを酵素免疫測定法により、安価な装置で、簡単、迅速に測定することが可能である。   17β-estradiol can be easily and quickly measured by an enzyme immunoassay with an inexpensive device without using an expensive instrument analyzer such as GC-MS or LC-MS / MS.

17β−エストラジオールの測定に用いる抗体の濃度、酵素標識抗原の濃度、振とう効果、および反応時間について最適値を検討しているので、正確な測定が可能である。   Since optimal values are examined for the concentration of the antibody used for the measurement of 17β-estradiol, the concentration of the enzyme-labeled antigen, the shaking effect, and the reaction time, accurate measurement is possible.

以下、本発明の実施形態を図面に基づいて説明する。   Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings.

(第1実施の形態)
図1は本発明の第1実施の形態に係る、酵素免疫測定法の測定プロセスを示す測定操作の模式図である。図1において、まずポリスチレン製の試験管に17β−エストラジオール抗体を希釈緩衝液により希釈し、1mLずつ分注し、冷蔵庫で1晩保存し固相抗体の調製を固相11にて行う。
(First embodiment)
FIG. 1 is a schematic diagram of a measurement operation showing a measurement process of the enzyme immunoassay according to the first embodiment of the present invention. In FIG. 1, first, 17β-estradiol antibody is diluted with a dilution buffer in a polystyrene test tube, dispensed in 1 mL portions, and stored in a refrigerator overnight to prepare a solid phase antibody on the solid phase 11.

17β−エストラジオール抗体(固相抗体)は、17β−エストラジオールに牛血清アルブミン(BSA)を結合し、ウサギに免疫して調製する。また、固相抗体の希釈緩衝液は0.9%塩化ナトリウム、0.1%アジ化ナトリウムを含む0.05mol/Lのホウ酸緩衝液(pH=8.0)を用いる。   The 17β-estradiol antibody (solid phase antibody) is prepared by binding bovine serum albumin (BSA) to 17β-estradiol and immunizing a rabbit. As a solid phase antibody dilution buffer, a 0.05 mol / L borate buffer (pH = 8.0) containing 0.9% sodium chloride and 0.1% sodium azide is used.

次に、17β−エストラジオールにペルオキシダーゼ(酵素)を標識した酵素標識抗原(酵素標識17β−エストラジオール)と所望の濃度に調製した17β−エストラジオールとを試験管に添加し、200rpmの回転数で振とうしながら1時間免疫反応を行う。   Next, an enzyme-labeled antigen (enzyme-labeled 17β-estradiol) obtained by labeling 17β-estradiol with a peroxidase (enzyme) and 17β-estradiol adjusted to a desired concentration are added to a test tube, and shaken at 200 rpm. The immune reaction is performed for 1 hour while performing.

酵素標識抗原はSIGMA社製のESTRADIOL−PEROXIDAZEを購入して、0.1mol/Lのリン酸緩衝液(pH=6.0)で100μg/mLに調製する。ESTRADIOL−PEROXIDAZEを希釈して所望の濃度に調製するときは、2%ポリエチレングリコール、0.05%Tween20、0.9%塩化ナトリウムを含む0.05mol/Lのトリス塩酸緩衝液(pH=8.0)を調製して使用する。   Enzyme-labeled antigen is purchased from SIGMA, ESTRADIOL-PEROXIDAZE, and adjusted to 100 μg / mL with a 0.1 mol / L phosphate buffer (pH = 6.0). When ESTRADIOL-PEROXIDAZE is diluted to a desired concentration, a 0.05 mol / L Tris-HCl buffer (pH = 8.sup.2) containing 2% polyethylene glycol, 0.05% Tween 20, and 0.9% sodium chloride is used. Prepare and use 0).

前記のようにして得られた抗原抗体液12について、蒸留水を用いて試験管を5回洗浄する。洗浄後、発光試薬を添加して発光反応液13を得、この発光反応液13を発光測定装置で0〜30秒間の発光量を測定して、その測定データをデータ処理14にて処理する。   With respect to the antigen-antibody solution 12 obtained as described above, the test tube is washed five times with distilled water. After washing, a luminescence reagent is added to obtain a luminescence reaction solution 13, the luminescence amount of the luminescence reaction solution 13 is measured by a luminescence measuring device for 0 to 30 seconds, and the measurement data is processed in a data processor 14.

なお、発光試薬は6mmol/Lルミノール、10mol/L過酸化水素、18.2mmol/Lパラヨードフェノールを含むトリス塩酸緩衝液(pH=8.5)からなる試薬である。   The luminescent reagent is a reagent composed of a Tris-HCl buffer solution (pH = 8.5) containing 6 mmol / L luminol, 10 mol / L hydrogen peroxide, and 18.2 mmol / L paraiodophenol.

以下の実施例により、第1実施の形態を具体的に説明する。   The first embodiment will be specifically described with reference to the following examples.

(実施例1) 固相抗体濃度の検討
固相抗体濃度を緩衝液で、0.375、0.75、1.5、3.0、および6.0μg/mLの各濃度に調製し、ポリスチレン製の試験管に1mLずつ分注して、冷蔵庫で1晩保存することにより固相チューブを調製した。
(Example 1) Examination of solid phase antibody concentration The solid phase antibody concentration was adjusted to 0.375, 0.75, 1.5, 3.0, and 6.0 µg / mL with a buffer solution, and polystyrene was used. The solid phase tube was prepared by dispensing 1 mL at a time into a test tube made by Azuma and storing it overnight in a refrigerator.

前記固相チューブに1.0μg/mLに調製した酵素標識抗原を100μLずつ添加し、200rpmの回転数で振とうしながら1時間免疫反応を行った。   100 μL of the enzyme-labeled antigen prepared at 1.0 μg / mL was added to the solid-phase tube, and an immunoreaction was performed for 1 hour while shaking at a rotation speed of 200 rpm.

免疫反応終了後、蒸留水で5回洗浄した。   After the completion of the immune reaction, the cells were washed five times with distilled water.

洗浄後、6mMのルミノールを主成分とする発光試薬を添加して、発光測定装置(明電舎製のルミノメータUPD−4000)で0〜30秒間の発光量を測定した。   After washing, a luminescence reagent containing 6 mM luminol as a main component was added, and the luminescence amount for 0 to 30 seconds was measured with a luminescence measurement device (Luminometer UPD-4000 manufactured by Meidensha).

その測定結果を図2に示す。図2は、1.0μg/mLの酵素標識抗原濃度に対して前記固相抗体濃度範囲であれば、固相抗体濃度は充分であることを示している。   FIG. 2 shows the measurement results. FIG. 2 shows that the solid phase antibody concentration is sufficient if the solid phase antibody concentration is in the range of the enzyme-labeled antigen concentration of 1.0 μg / mL.

固相抗体は動物に免疫して作製するので、作製した抗体を多くの測定回数に供するようにするのが好ましい。そのためには、固相抗体濃度はできる限り低濃度であることが好ましいので、固相抗体濃度は、0.75μg/mLが最もよいと判断した。   Since a solid-phase antibody is prepared by immunizing an animal, it is preferable that the prepared antibody be subjected to a large number of measurements. For that purpose, the solid phase antibody concentration is preferably as low as possible, and therefore, it was determined that the solid phase antibody concentration was most preferably 0.75 μg / mL.

(実施例2) 酵素標識抗原濃度の検討
固相抗体濃度を緩衝液で0.75μg/mLに調製し、ポリスチレン製の試験管に1mLずつ分注して、冷蔵庫で1晩保存することにより複数の固相チューブを調製した。
(Example 2) Examination of enzyme-labeled antigen concentration The solid-phase antibody concentration was adjusted to 0.75 μg / mL with a buffer solution, dispensed into a polystyrene test tube at a volume of 1 mL, and stored in a refrigerator overnight. Was prepared.

酵素標識抗原を0.01μg/mLの濃度に調製し、これを複数のサンプルに分割した。また、17β−エストラジオールについて8×10-7〜5×10-4g/Lの濃度範囲で少なくとも7以上のサンプルを調製した。前記酵素標識抗原のサンプルと17β−エストラジオールのサンプルとを1対1の割合(体積比)で混合し、各混合液から100μLを分取して前記固相チューブに添加した。 The enzyme-labeled antigen was prepared at a concentration of 0.01 μg / mL, which was divided into a plurality of samples. Further, at least 7 or more samples were prepared in a concentration range of 8 × 10 −7 to 5 × 10 −4 g / L for 17β-estradiol. The sample of the enzyme-labeled antigen and the sample of 17β-estradiol were mixed at a ratio of 1: 1 (volume ratio), and 100 μL of each mixed solution was taken and added to the solid-phase tube.

添加後、200rpmの回転数で振とうしながら1時間免疫反応を行った。   After the addition, the immune reaction was performed for 1 hour while shaking at a rotation speed of 200 rpm.

免疫反応終了後、蒸留水で5回洗浄した。   After the completion of the immune reaction, the cells were washed five times with distilled water.

洗浄後、6mMのルミノールを主成分とする発光試薬を添加して、発光測定装置(明電舎製のルミノメータUPD−4000)で0〜30秒間の発光量を測定した。   After washing, a luminescence reagent containing 6 mM luminol as a main component was added, and the luminescence amount for 0 to 30 seconds was measured with a luminescence measurement device (Luminometer UPD-4000 manufactured by Meidensha).

また、酵素標識抗原濃度が0.1、0.25、0.5、0.75、および1.0μg/mLのものについても前記と同様の測定を行った。   In addition, the same measurement as described above was performed for the enzyme labeled antigen concentrations of 0.1, 0.25, 0.5, 0.75, and 1.0 μg / mL.

その測定結果を図3〜図8に示す。図3〜図8の結果から、図5および図6が17β−エストラジオール濃度と発光量との相関関係がよいことを確認し、酵素標識抗原の濃度範囲は0.25〜0.5μg/mLがよいと判断した。   The measurement results are shown in FIGS. 5 to 6 confirm that the correlation between the 17β-estradiol concentration and the luminescence amount is good, and the concentration range of the enzyme-labeled antigen is 0.25 to 0.5 μg / mL. I judged it to be good.

(実施例3) 酵素標識抗原濃度の検討2
前記実施例2では、酵素標識抗原と17β−エストラジオールとを1対1の割合で混合し、その混合液から100μLを分取して固相チューブに添加しているので、最終的な酵素標識抗原の濃度は、始めに調製した濃度の1/2になっている。実施例3では前記1対1の混合割合を変えたとき、前記実施例2と同様の結果が得られるかを検証した。
(Example 3) Examination of enzyme labeled antigen concentration 2
In Example 2 described above, the enzyme-labeled antigen and 17β-estradiol were mixed at a ratio of 1: 1 and 100 μL was taken from the mixture and added to the solid-phase tube. Is 1 / of the initially prepared concentration. In Example 3, it was verified whether the same result as in Example 2 was obtained when the mixing ratio of 1: 1 was changed.

固相抗体濃度を緩衝液で0.75μg/mLに調製し、ポリスチレン製の試験管に1mLずつ分注して、冷蔵庫で1晩保存することにより複数の固相チューブを調製した。   The solid phase antibody concentration was adjusted to 0.75 μg / mL with a buffer solution, dispensed 1 mL each into a polystyrene test tube, and stored in a refrigerator overnight to prepare a plurality of solid phase tubes.

酵素標識抗原を0.5μg/mLの濃度に調製し、これを複数のサンプルに分割した。また、17β−エストラジオールについて、8×10-7〜5×10-4g/Lの濃度範囲で少なくとも6以上のサンプルを調製した。 The enzyme-labeled antigen was prepared at a concentration of 0.5 μg / mL, which was divided into a plurality of samples. At least 6 or more samples of 17β-estradiol were prepared in a concentration range of 8 × 10 −7 to 5 × 10 −4 g / L.

0.5μg/mLの濃度に調製した酵素標識抗原のサンプル500μLと17β−エストラジオールのサンプル500μLとを混合し、各混合液から100μLを分取して前記固相チューブに添加した。   500 μL of a sample of the enzyme-labeled antigen prepared at a concentration of 0.5 μg / mL and 500 μL of a sample of 17β-estradiol were mixed, and 100 μL of each mixed solution was taken and added to the solid phase tube.

添加後、200rpmの回転数で振とうしながら1時間免疫反応を行った。   After the addition, the immune reaction was performed for 1 hour while shaking at a rotation speed of 200 rpm.

免疫反応終了後、蒸留水で5回洗浄した。   After the completion of the immune reaction, the cells were washed five times with distilled water.

洗浄後、6mMのルミノールを主成分とする発光試薬を添加して、発光測定装置(明電舎製のルミノメータUPD−4000)で0〜30秒間の発光量を測定した。   After washing, a luminescence reagent containing 6 mM luminol as a main component was added, and the luminescence amount for 0 to 30 seconds was measured with a luminescence measurement device (Luminometer UPD-4000 manufactured by Meidensha).

また、酵素標識抗原を1.0、および2.0μg/mLの各濃度に調製し、これらを少なくとも6以上のサンプルに分割した。1.0μg/mLの濃度に調製した酵素標識抗原のサンプル0.5mLと17β−エストラジオールのサンプル1.5mLとを混合した各混合溶液、および、2.0μg/mLの濃度に調製した酵素標識抗原のサンプル0.25mLと17β−エストラジオールのサンプル1.75mLとを混合した各混合溶液についても前記と同様の測定を行った。   In addition, enzyme-labeled antigens were prepared at concentrations of 1.0 and 2.0 μg / mL, respectively, and divided into at least 6 or more samples. Each mixed solution obtained by mixing a 0.5 mL sample of the enzyme-labeled antigen prepared at a concentration of 1.0 μg / mL and a 1.5 mL sample of 17β-estradiol, and an enzyme-labeled antigen prepared at a concentration of 2.0 μg / mL The same measurement as described above was performed for each mixed solution obtained by mixing 0.25 mL of the sample and 1.75 mL of the 17β-estradiol sample.

その測定結果を図9〜図11に示す。実施例3では最終的な酵素標識抗原の濃度はすべて0.25μg/mLであり、前記結果からこの酵素標識抗原の濃度であれば、混合比が1対1ではなくてもよいことを確認した。さらに、前記実施例2の結果と実施例3の結果とから、最終的な酵素標識抗原の濃度が0.125〜0.25μg/mLであればよいと判断した。   The measurement results are shown in FIGS. In Example 3, the final concentration of the enzyme-labeled antigen was all 0.25 μg / mL. From the above results, it was confirmed that the mixing ratio does not have to be 1: 1 as long as the concentration of the enzyme-labeled antigen was obtained. . Furthermore, from the results of Example 2 and Example 3, it was determined that the final concentration of the enzyme-labeled antigen should be 0.125 to 0.25 μg / mL.

(実施例4) 液量の検討
固相抗体濃度を緩衝液で0.75μg/mLに調製し、ポリスチレン製の試験管に1mLずつ分注して、冷蔵庫で1晩保存することにより複数の固相チューブを調製した。
(Example 4) Examination of liquid volume The solid phase antibody concentration was adjusted to 0.75 μg / mL with a buffer solution, dispensed in 1 mL portions into polystyrene test tubes, and stored in a refrigerator overnight to prepare a plurality of solid phase antibodies. A phase tube was prepared.

酵素標識抗原を0.5μg/mLの濃度に調製し、これを複数のサンプルに分割した。また、17β−エストラジオールを8×10-7、および4×10-6g/Lの各濃度に調製し、酵素標識抗原のサンプルと17β−エストラジオールのサンプルとを1対1の割合で混合した。各混合溶液から100、300、および500μLを分取して固相チューブに添加した。 The enzyme-labeled antigen was prepared at a concentration of 0.5 μg / mL, which was divided into a plurality of samples. In addition, 17β-estradiol was prepared at a concentration of 8 × 10 −7 and 4 × 10 −6 g / L, and a sample of the enzyme-labeled antigen and a sample of 17β-estradiol were mixed at a ratio of 1: 1. From each mixed solution, 100, 300, and 500 μL were dispensed and added to a solid phase tube.

添加後、200rpmの回転数で振とうしながら1時間免疫反応を行った。   After the addition, the immune reaction was performed for 1 hour while shaking at a rotation speed of 200 rpm.

免疫反応終了後、蒸留水で5回洗浄した。   After the completion of the immune reaction, the cells were washed five times with distilled water.

洗浄後、6mMのルミノールを主成分とする発光試薬を添加して、発光測定装置(明電舎製のルミノメータUPD−4000)で0〜30秒間の発光量を測定した。   After washing, a luminescence reagent containing 6 mM luminol as a main component was added, and the luminescence amount for 0 to 30 seconds was measured with a luminescence measurement device (Luminometer UPD-4000 manufactured by Meidensha).

その測定結果を図12に示す。図12から、固相チューブに添加する酵素標識抗原と17β−エストラジオールとの混合溶液量は100μLがよいということを確認した。また、100μL以下の液量では、分注精度が悪くなるので、100μLが適量であると判断した。   FIG. 12 shows the measurement results. From FIG. 12, it was confirmed that the amount of the mixed solution of the enzyme-labeled antigen and 17β-estradiol added to the solid-phase tube was preferably 100 μL. In addition, since the dispensing accuracy deteriorates with a liquid volume of 100 μL or less, 100 μL was determined to be an appropriate volume.

(実施例5) 免疫反応順序の検討
実施例5では、免疫反応を行う際に、酵素標識抗原と17β−エストラジオールとの混合溶液を固相チューブに100μL添加して1時間免疫反応を行う第1方法と、17β−エストラジオールを100μL固相チューブに添加して30分間免疫反応を行った後に酵素標識抗原を100μL添加して30分間免疫反応を行う第2方法と、酵素標識抗原を固相チューブに100μL添加して30分間免疫反応を行った後に17β−エストラジオールを100μL添加して30分間免疫反応を行う第3方法とを行い、どの方法が適しているかを検討した。なお、酵素標識抗原と17β−エストラジオールとの混合比および添加比はすべて1対1とした。
(Example 5) Examination of immune reaction sequence In Example 5, when performing an immune reaction, 100 μL of a mixed solution of an enzyme-labeled antigen and 17β-estradiol was added to a solid-phase tube to perform an immune reaction for 1 hour. A second method in which 17 β-estradiol is added to a 100 μL solid-phase tube to perform an immunoreaction for 30 minutes, and then 100 μL of an enzyme-labeled antigen is added and an immunoreaction is performed for 30 minutes. A third method in which 100 μL was added and the immune reaction was carried out for 30 minutes, and then 17β-estradiol was added in an amount of 100 μL and the immune reaction was carried out for 30 minutes, was carried out to examine which method was suitable. The mixing ratio and the addition ratio of the enzyme-labeled antigen and 17β-estradiol were all set to 1: 1.

固相抗体濃度を緩衝液で0.75μg/mLに調製し、ポリスチレン製の試験管に1mLずつ分注して、冷蔵庫で1晩保存することにより複数の固相チューブを調製した。   The solid phase antibody concentration was adjusted to 0.75 μg / mL with a buffer solution, dispensed 1 mL each into a polystyrene test tube, and stored in a refrigerator overnight to prepare a plurality of solid phase tubes.

17β−エストラジオールを8×10-7〜5×10-4g/Lの濃度範囲で5倍ずつ希釈して少なくとも6以上のサンプルを調製した。また、酵素標識抗原を0.5μg/mLの濃度に調製し、複数のサンプルに分割した。 At least 6 or more samples were prepared by diluting 17β-estradiol 5 times in a concentration range of 8 × 10 −7 to 5 × 10 −4 g / L. Further, the enzyme-labeled antigen was prepared at a concentration of 0.5 μg / mL and divided into a plurality of samples.

これらのサンプルについて前記第1〜3方法により免疫反応を行った。   An immune reaction was performed on these samples by the first to third methods.

免疫反応終了後、蒸留水で5回洗浄した。   After the completion of the immune reaction, the cells were washed five times with distilled water.

洗浄後、6mMのルミノールを主成分とする発光試薬を添加して、発光測定装置(明電舎製のルミノメータUPD−4000)で0〜30秒間の発光量を測定した。   After washing, a luminescence reagent containing 6 mM luminol as a main component was added, and the luminescence amount for 0 to 30 seconds was measured with a luminescence measurement device (Luminometer UPD-4000 manufactured by Meidensha).

その測定結果を図13に示す。第1方法と第2方法とはほぼ同等の結果を示しているが、第3方法は感度が悪いことを確認した。   FIG. 13 shows the measurement results. Although the first method and the second method showed almost the same results, it was confirmed that the third method had poor sensitivity.

(実施例6) 反応時間の検討1
固相抗体濃度を緩衝液で0.75μg/mLに調製し、ポリスチレン製の試験管に1mLずつ分注して、冷蔵庫で1晩保存することにより複数の固相チューブを調製した。
(Example 6) Study 1 of reaction time
The solid phase antibody concentration was adjusted to 0.75 μg / mL with a buffer solution, dispensed 1 mL each into a polystyrene test tube, and stored in a refrigerator overnight to prepare a plurality of solid phase tubes.

17β−エストラジオールを2×10-5g/Lの濃度に調製し、また、酵素標識抗原を0.25μg/mLの濃度に調製し、17β−エストラジオールのサンプルと酵素標識抗原のサンプルとを1対1の割合で混合し、混合液を100μLずつ分取して、固相チューブに添加した。 17β-estradiol was adjusted to a concentration of 2 × 10 −5 g / L, enzyme-labeled antigen was adjusted to a concentration of 0.25 μg / mL, and a sample of 17β-estradiol and a sample of the enzyme-labeled antigen were paired. The mixture was mixed at a ratio of 1 and the mixed solution was dispensed in 100 μL portions and added to a solid phase tube.

添加後、200rpmの回転数で振とうしながら、それぞれ、0分間、15分間、30分間、60分間、90分間、および120分間免疫反応を行った。   After the addition, immunoreactions were performed for 0, 15, 30, 60, 90, and 120 minutes, respectively, while shaking at 200 rpm.

免疫反応終了後、蒸留水で5回洗浄した。   After the completion of the immune reaction, the cells were washed five times with distilled water.

洗浄後、6mMのルミノールを主成分とする発光試薬を添加して、発光測定装置(明電舎製のルミノメータUPD−4000)で0〜30秒間の発光量を測定した。   After washing, a luminescence reagent containing 6 mM luminol as a main component was added, and the luminescence amount for 0 to 30 seconds was measured with a luminescence measurement device (Luminometer UPD-4000 manufactured by Meidensha).

その測定結果を図14に示す。図14から、60分間反応させた後は発光量の増加はほとんど無いことが確認でき、60分間以上免疫反応を行えば充分であると判断した。   FIG. 14 shows the measurement results. From FIG. 14, it was confirmed that there was almost no increase in the luminescence amount after the reaction was performed for 60 minutes, and it was determined that performing the immune reaction for 60 minutes or more was sufficient.

(実施例7) 反応時間の検討2
前記実施例6では2×10-5g/Lの濃度の17β−エストラジオールについて反応時間を検討したが、濃度によって反応性が異なってくることが考えられる。そこで実施例7では、17β−エストラジオールの濃度を変えて、免疫反応時間の検討を行った。
(Example 7) Study 2 of reaction time
In Example 6, the reaction time was examined for 17β-estradiol at a concentration of 2 × 10 −5 g / L, but it is considered that the reactivity may vary depending on the concentration. Therefore, in Example 7, the immune reaction time was examined by changing the concentration of 17β-estradiol.

固相抗体濃度を緩衝液で0.75μg/mLに調製し、ポリスチレン製の試験管に1mLずつ分注して、冷蔵庫で1晩保存することにより複数の固相チューブを調製した。   The solid phase antibody concentration was adjusted to 0.75 μg / mL with a buffer solution, dispensed 1 mL each into a polystyrene test tube, and stored in a refrigerator overnight to prepare a plurality of solid phase tubes.

17β−エストラジオールを8×10-7〜5×10-4g/Lの濃度範囲で5倍ずつ希釈して少なくとも6以上のサンプルを調製した。また、酵素標識抗原を0.25μg/mLの濃度に調製し、複数のサンプルに分割した。17β−エストラジオールのサンプルと酵素標識抗原のサンプルとを1対1の割合で混合し、混合液を100μLずつ分取して、固相チューブに添加した。 At least 6 or more samples were prepared by diluting 17β-estradiol 5 times in a concentration range of 8 × 10 −7 to 5 × 10 −4 g / L. The enzyme-labeled antigen was prepared at a concentration of 0.25 μg / mL and divided into a plurality of samples. A sample of 17β-estradiol and a sample of the enzyme-labeled antigen were mixed at a ratio of 1: 1, 100 μL of the mixed solution was added, and added to the solid phase tube.

添加後、200rpmの回転数で振とうしながら、それぞれ、30分間、45分間、および60分間免疫反応を行った。   After the addition, immunoreaction was performed for 30 minutes, 45 minutes, and 60 minutes, respectively, while shaking at a rotation speed of 200 rpm.

免疫反応終了後、蒸留水で5回洗浄した。   After the completion of the immune reaction, the cells were washed five times with distilled water.

洗浄後、6mMのルミノールを主成分とする発光試薬を添加して、発光測定装置(明電舎製のルミノメータUPD−4000)で0〜30秒間の発光量を測定した。   After washing, a luminescence reagent containing 6 mM luminol as a main component was added, and the luminescence amount for 0 to 30 seconds was measured with a luminescence measurement device (Luminometer UPD-4000 manufactured by Meidensha).

その測定結果を図15〜図17に示す。図15〜図17の結果から、反応時間が60分間のものが濃度と発光量との相関関係がよいということを確認し、免疫反応時間30分間〜60分間の範囲では、60分間が最もよいと判断した。   The measurement results are shown in FIGS. From the results of FIGS. 15 to 17, it was confirmed that the one having a reaction time of 60 minutes had a good correlation between the concentration and the amount of luminescence. In the range of the immune reaction time of 30 to 60 minutes, 60 minutes was the best. Was determined.

(実施例8) 振とうの効果についての検討
免疫反応を静置して行う場合と、200rpmで振とうしながら行う場合との相違について検討した。
(Example 8) Investigation on the effect of shaking The difference between the case where the immune reaction was carried out while standing and the case where the immune reaction was carried out while shaking at 200 rpm was examined.

固相抗体濃度を緩衝液で0.75μg/mLに調製し、ポリスチレン製の試験管に1mLずつ分注して、冷蔵庫で1晩保存することにより複数の固相チューブを調製した。   The solid phase antibody concentration was adjusted to 0.75 μg / mL with a buffer solution, dispensed 1 mL each into a polystyrene test tube, and stored in a refrigerator overnight to prepare a plurality of solid phase tubes.

17β−エストラジオールを8×10-7〜5×10-4g/Lの濃度範囲で5倍ずつ希釈して少なくとも6以上のサンプルを調製し、また、酵素標識抗原を0.25μg/mLの濃度に調製し複数のサンプルに分割した。17β−エストラジオールのサンプルと酵素標識抗原のサンプルとを1対1の割合で混合し、混合液を100μLずつ分取して、固相チューブに添加した。 17β-estradiol was diluted 5-fold in a concentration range of 8 × 10 −7 to 5 × 10 −4 g / L to prepare at least 6 or more samples, and the enzyme-labeled antigen was diluted to a concentration of 0.25 μg / mL. And divided into multiple samples. A sample of 17β-estradiol and a sample of the enzyme-labeled antigen were mixed at a ratio of 1: 1, 100 μL of the mixed solution was added, and added to the solid phase tube.

添加後、それぞれ、静置して1時間、および200rpmの回転数で振とうしながら1時間、免疫反応を行った。   After the addition, the immune reaction was carried out for 1 hour while standing, and for 1 hour while shaking at a rotation speed of 200 rpm.

その測定結果を図18、図19に示す。図18および図19の結果から免疫反応時間が1時間の場合には、200rpmの回転数で振とうするのがよいことを確認した。   The measurement results are shown in FIGS. From the results of FIGS. 18 and 19, it was confirmed that when the immune reaction time was 1 hour, it was better to shake at a rotation speed of 200 rpm.

(第2実施の形態)
図20は本発明の第2実施の形態に係る、酵素免疫測定法の測定プロセスを示す測定操作の模式図である。図20において、まずポリスチレン製の試験管に第1抗体である抗ウサギIgGヤギ抗体(固相抗体)を希釈緩衝液により希釈し、1mLずつ分注し、冷蔵庫で1晩保存し固相抗体の調製を固相21にて行う。抗ウサギIgGヤギ抗体は日本バイオテスト研究所の市販品を購入して使用し、固相抗体の希釈緩衝液は0.9%塩化ナトリウム、0.1%アジ化ナトリウムを含む、0.05mol/Lのホウ酸緩衝液(pH=8.0)を調製して使用する。
(Second embodiment)
FIG. 20 is a schematic diagram of a measurement operation showing a measurement process of the enzyme immunoassay according to the second embodiment of the present invention. In FIG. 20, first, an anti-rabbit IgG goat antibody (solid phase antibody), which is the first antibody, is diluted with a dilution buffer in a polystyrene test tube, dispensed in 1 mL portions, and stored in a refrigerator overnight to store the solid phase antibody. Preparation is performed on solid phase 21. The anti-rabbit IgG goat antibody was purchased and used as a commercial product from Japan Biotest Research Institute, and the dilution buffer for the solid-phase antibody was 0.05 mol / l containing 0.9% sodium chloride and 0.1% sodium azide. Prepare and use L of borate buffer (pH = 8.0).

次に、17β−エストラジオールにペルオキシダーゼ(酵素)を標識した酵素標識抗原(酵素標識17β−エストラジオール)、所望の濃度に調製した17β−エストラジオール、第2抗体である抗17β−エストラジオールウサギ抗体の順に固相抗体の調製を行った試験管に添加し、200rpmの回転数で振とうしながら1時間免疫反応を行う。抗17β−エストラジオールウサギ抗体は、17β−エストラジオールに牛血清アルブミン(BSA)を結合し、ウサギに免疫して調製する。酵素標識抗原はSIGMA社製のESTRADIOL−PEROXIDAZEを購入して使用する。   Next, an enzyme-labeled antigen (enzyme-labeled 17β-estradiol) obtained by labeling 17β-estradiol with peroxidase (enzyme), 17β-estradiol adjusted to a desired concentration, and an anti-17β-estradiol rabbit antibody as the second antibody were solid-phased in this order. The antibody is added to the test tube in which the antibody has been prepared, and the immune reaction is carried out for 1 hour while shaking at 200 rpm. An anti-17β-estradiol rabbit antibody is prepared by conjugated 17β-estradiol with bovine serum albumin (BSA) and immunizing a rabbit. As the enzyme-labeled antigen, ESTRADIOL-PEROXIDAZE manufactured by SIGMA is purchased and used.

抗17β−エストラジオールウサギ抗体、及びESTRADIOL−PEROXIDAZEを希釈して所望の濃度に調製するときは、2%ポリエチレングリコール、0.05%Tween20、0.9%塩化ナトリウムを含む0.05mol/Lのトリス塩酸緩衝液(pH=8.0)を調製して使用する。   When diluting anti-17β-estradiol rabbit antibody and ESTRADIOL-PEROXIDAZE to a desired concentration, 0.05 mol / L Tris containing 2% polyethylene glycol, 0.05% Tween 20, and 0.9% sodium chloride is used. Prepare and use hydrochloric acid buffer (pH = 8.0).

上記のようにして得られた抗原抗体液22と固相抗体との免疫反応終了後、蒸留水を用いて試験管を5回洗浄する。洗浄後、発光試薬を添加して発光反応液23を得、この発光反応液23を発光測定装置で0〜30秒間の発光量を測定して、その測定データをデータ処理24にて処理する。   After the completion of the immune reaction between the antigen-antibody solution 22 obtained as described above and the solid-phase antibody, the test tube is washed five times with distilled water. After washing, a luminescence reagent is added to obtain a luminescence reaction solution 23, the luminescence amount of the luminescence reaction solution 23 is measured by a luminescence measuring device for 0 to 30 seconds, and the measurement data is processed by a data processor 24.

なお、発光試薬は6mmol/Lの濃度に調製し、10mol/L過酸化水素、18.2mmol/Lパラヨードフェノールを含むトリス塩酸緩衝液(pH=8.5)を調製して使用する。   The luminescent reagent is prepared at a concentration of 6 mmol / L, and a Tris-HCl buffer (pH = 8.5) containing 10 mol / L hydrogen peroxide and 18.2 mmol / L paraiodophenol is used.

以下の実施例により、第2実施の形態を具体的に説明する。   The second embodiment will be specifically described with reference to the following examples.

(実施例9) 固相抗体濃度の検討
固相は、固相抗体濃度を緩衝液で、1.0、2.0、および3.0μg/mLの各濃度に調製し、ポリスチレン製の試験管に1mLずつ分注して、冷蔵庫で1晩保存することにより固相チューブを調製した。
Example 9 Examination of Solid Phase Antibody Concentration The solid phase was prepared by adjusting the solid phase antibody concentration to 1.0, 2.0, and 3.0 μg / mL with a buffer solution, and using a polystyrene test tube. , And stored in a refrigerator overnight to prepare a solid phase tube.

前記固相チューブに0.75μg/mLに調製した酵素標識抗原を100μLずつ添加した。その後、抗17β−エストラジオールウサギ抗体を0.75、1.5、3.0、および6.0μg/mLの各濃度に調製し、これらを前記固相チューブに100μLずつ添加し、200rpmの回転数で振とうしながら1時間免疫反応を行った。   100 μL of the enzyme-labeled antigen prepared at 0.75 μg / mL was added to the solid phase tube. Then, anti-17β-estradiol rabbit antibody was prepared at each concentration of 0.75, 1.5, 3.0, and 6.0 μg / mL, and these were added to the solid-phase tube at 100 μL each, and the rotation speed was changed to 200 rpm. The immune reaction was carried out for 1 hour while shaking with.

免疫反応終了後、蒸留水で5回洗浄した。   After the completion of the immune reaction, the cells were washed five times with distilled water.

洗浄後、6mMのルミノールを主成分とする発光試薬を添加して、発光測定装置(明電舎製のルミノメータUPD−4000)で0〜30秒間の発光量を測定した。その測定結果を図21に示す。   After washing, a luminescence reagent containing 6 mM luminol as a main component was added, and the luminescence amount for 0 to 30 seconds was measured with a luminescence measurement device (Luminometer UPD-4000 manufactured by Meidensha). FIG. 21 shows the measurement results.

図21に示すとおり、固相抗体濃度は1μg/mLが良いことが判明した。   As shown in FIG. 21, it was found that the solid phase antibody concentration was 1 μg / mL.

(実施例10) 抗17β−エストラジオールウサギ抗体濃度の検討
固相は、固相抗体濃度を緩衝液で1.0μg/mLに調製し、ポリスチレン製の試験管に1mLずつ分注して、冷蔵庫で1晩保存することにより固相チューブを調製した。
(Example 10) Examination of anti-17β-estradiol rabbit antibody concentration The solid phase was prepared by adjusting the concentration of the solid phase antibody to 1.0 µg / mL with a buffer solution, dispensing 1 mL each into a polystyrene test tube, and refrigeration. A solid phase tube was prepared by storing overnight.

前記固相チューブに0.5μg/mLに調製した酵素標識抗原を100μLずつ添加した。その後、0.75、1.5、3.0、および6.0μg/mLに調製した抗17β−エストラジオールウサギ抗体を前記固相チューブに100μLずつ添加し、200rpmの回転数で振とうしながら1時間免疫反応を行った。   100 μL of the enzyme-labeled antigen prepared at 0.5 μg / mL was added to the solid phase tube. Thereafter, 100 μL of anti-17β-estradiol rabbit antibody prepared at 0.75, 1.5, 3.0, and 6.0 μg / mL was added to the solid-phase tube, and the mixture was shaken at 200 rpm for 1 hour. An immunological reaction was performed for an hour.

免疫反応終了後、蒸留水で5回洗浄した。   After the completion of the immune reaction, the cells were washed five times with distilled water.

洗浄後、6mMのルミノールを主成分とする発光試薬を添加して、発光測定装置(明電舎製のルミノメータUPD−4000)で0〜30秒間の発光量を測定した。その測定結果を図22に示す。   After washing, a luminescence reagent containing 6 mM luminol as a main component was added, and the luminescence amount for 0 to 30 seconds was measured with a luminescence measurement device (Luminometer UPD-4000 manufactured by Meidensha). FIG. 22 shows the measurement results.

図22に示すとおり、抗17β−エストラジオールウサギ抗体濃度は0.75μg/mLが良いことが判明した。   As shown in FIG. 22, it was found that the concentration of the anti-17β-estradiol rabbit antibody was preferably 0.75 μg / mL.

(実施例11) 免疫反応時間の検討1
固相は、固相抗体濃度を緩衝液で1.0μg/mLに調製し、ポリスチレン製の試験管に1mLずつ分注して、冷蔵庫で1晩保存することにより固相チューブを調製した。
(Example 11) Examination of immune reaction time 1
The solid phase was prepared by adjusting the solid phase antibody concentration to 1.0 μg / mL with a buffer solution, dispensing 1 mL each into a polystyrene test tube, and storing it in a refrigerator overnight to prepare a solid phase tube.

前記固相チューブに0.75μg/mLに調製した酵素標識抗原を200μLずつ添加し、さらに17β−エストラジオールの希釈緩衝液を100μL添加した。その後、0.75μg/mLに調製した抗17β−エストラジオールウサギ抗体を前記固相チューブに100μLずつ添加した。   200 μL of the enzyme-labeled antigen prepared at 0.75 μg / mL was added to the solid phase tube, and 100 μL of a 17β-estradiol dilution buffer was further added. Thereafter, 100 μL of anti-17β-estradiol rabbit antibody adjusted to 0.75 μg / mL was added to the solid-phase tube.

添加後、200rpmの回転数で振とうしながら0分間、15分間、30分間、45分間、60分間、90分間、120分間、150分間、180分間、210分間、および240分間免疫反応を行った。   After the addition, immunoreaction was performed for 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 210, and 240 minutes while shaking at 200 rpm. .

免疫反応終了後、蒸留水で5回洗浄した。   After the completion of the immune reaction, the cells were washed five times with distilled water.

洗浄後、6mMのルミノールを主成分とする発光試薬を添加して、発光測定装置(明電舎製のルミノメータUPD−4000)で0〜30秒間の発光量を測定した。その測定結果を図23に示す。   After washing, a luminescence reagent containing 6 mM luminol as a main component was added, and the luminescence amount for 0 to 30 seconds was measured with a luminescence measurement device (Luminometer UPD-4000 manufactured by Meidensha). FIG. 23 shows the measurement results.

図23から、免疫反応は反応開始直後から徐々に進行し、90分過ぎからはそれほど大きな免疫反応の進行はないことが判明した。   From FIG. 23, it was found that the immune reaction gradually progressed immediately after the start of the reaction, and that the immune reaction did not progress so much after 90 minutes.

(実施例12) 免疫反応時間の検討2
実施例11では、17β−エストラジオールの希釈緩衝液で最適反応時間について検討したが、濃度によって17β−エストラジオールの反応性が異なることも考えられるので、17β−エストラジオールの濃度を6.40×10−9〜1.0×10−4g/Lの濃度範囲に5倍ずつ希釈調製して最適反応時間について検討した。
(Example 12) Examination of immune reaction time 2
In Example 11, although the optimal reaction time was examined using a 17β-estradiol dilution buffer, the reactivity of 17β-estradiol may vary depending on the concentration. Therefore, the concentration of 17β-estradiol was set to 6.40 × 10 −9. The dilution was adjusted by a factor of 5 into a concentration range of 1.0 to 10-4 g / L, and the optimal reaction time was examined.

固相は、固相抗体濃度を緩衝液で1.0μg/mLに調製し、ポリスチレン製の試験管に1mLずつ分注して、冷蔵庫で1晩保存することにより固相チューブを調製した。   The solid phase was prepared by adjusting the solid phase antibody concentration to 1.0 μg / mL with a buffer solution, dispensing 1 mL each into a polystyrene test tube, and storing it in a refrigerator overnight to prepare a solid phase tube.

前記固相チューブに0.75μg/mLに調製した酵素標識抗原を200μLずつ添加し、これに、6.40×10−9〜1.0×10−4g/Lの濃度範囲に5倍ずつ希釈調製した17β−エストラジオールを100μLずつ添加した。その後、0.75μg/mLに調製した抗17β−エストラジオールウサギ抗体をを200μLずつ添加した。   200 μL of the enzyme-labeled antigen prepared at 0.75 μg / mL was added to the solid-phase tube, and the mixture was diluted 5-fold to a concentration range of 6.40 × 10 −9 to 1.0 × 10 −4 g / L. 100 μL of the prepared 17β-estradiol was added thereto. Thereafter, 200 μL of anti-17β-estradiol rabbit antibody adjusted to 0.75 μg / mL was added thereto.

添加後、200rpmの回転数で振とうしながら、30分間、60分間、および90分間免疫反応を行った。   After the addition, immunoreaction was performed for 30, 60, and 90 minutes while shaking at a rotation speed of 200 rpm.

免疫反応終了後、蒸留水で5回洗浄した。   After the completion of the immune reaction, the cells were washed five times with distilled water.

洗浄後、6mMのルミノールを主成分とする発光試薬を添加して、発光測定装置(明電舎製のルミノメータUPD−4000)で0〜30秒間の発光量を測定した。その測定結果を図24に示す。   After washing, a luminescence reagent containing 6 mM luminol as a main component was added, and the luminescence amount for 0 to 30 seconds was measured with a luminescence measurement device (Luminometer UPD-4000 manufactured by Meidensha). FIG. 24 shows the measurement results.

図24に示す結果から、免疫反応時間が30分間〜90分間の範囲でそれほど大きな差異は観測されなかったが、低濃度領域の測定では60分間以上免疫反応を行ったほうが良いことが判明した。   From the results shown in FIG. 24, no significant difference was observed when the immune reaction time was in the range of 30 minutes to 90 minutes, but it was found that it was better to perform the immune reaction for 60 minutes or more in the measurement of the low concentration region.

(実施例13) 攪拌効果の検討
免疫反応を静置で行う場合と、200rpmで行う場合の相違について検討した。
(Example 13) Investigation of stirring effect The difference between the case where the immune reaction was carried out at rest and the case where it was carried out at 200 rpm was examined.

固相は、固相抗体濃度を緩衝液で1.0μg/mLに調製し、ポリスチレン製の試験管に1mLずつ分注して、冷蔵庫で1晩保存することにより固相チューブを調製した。   The solid phase was prepared by adjusting the solid phase antibody concentration to 1.0 μg / mL with a buffer solution, dispensing 1 mL each into a polystyrene test tube, and storing it in a refrigerator overnight to prepare a solid phase tube.

前記固相チューブに0.75μg/mLに調製した酵素標識抗原を200μLずつ添加し、これに、6.40×10−9〜1.0×10−4g/Lの濃度範囲に5倍ずつ希釈調製した17β−エストラジオールを100μLずつ添加した。その後、0.75μg/mLに調製した抗17β−エストラジオールウサギ抗体をを200μLずつ添加した。   200 μL of the enzyme-labeled antigen prepared at 0.75 μg / mL was added to the solid-phase tube, and the mixture was diluted 5-fold to a concentration range of 6.40 × 10 −9 to 1.0 × 10 −4 g / L. 100 μL of the prepared 17β-estradiol was added thereto. Thereafter, 200 μL of anti-17β-estradiol rabbit antibody adjusted to 0.75 μg / mL was added thereto.

添加後、静置で1時間、および200rpmの回転数で振とうしながら1時間免疫反応を行った。   After the addition, the immune reaction was carried out for 1 hour while standing and for 1 hour while shaking at 200 rpm.

免疫反応終了後、蒸留水で5回洗浄した。   After the completion of the immune reaction, the cells were washed five times with distilled water.

洗浄後、6mMのルミノールを主成分とする発光試薬を添加して、発光測定装置(明電舎製のルミノメータUPD−4000)で0〜30秒間の発光量を測定した。測定結果を図25に示す。   After washing, a luminescence reagent containing 6 mM luminol as a main component was added, and the luminescence amount for 0 to 30 seconds was measured with a luminescence measurement device (Luminometer UPD-4000 manufactured by Meidensha). FIG. 25 shows the measurement results.

図25の測定結果から、、免疫時間が1時間の場合には200rpmの回転数で行った方が良いことが判明した。   From the measurement results in FIG. 25, it was found that when the immunization time was 1 hour, it was better to perform the rotation at 200 rpm.

(実施例14) 実試料(下水処理水)の測定1
いろいろな夾雑物が混入する下水処理水や河川水中に含まれる環境ホルモン(17β−エストラジオール)の測定に適応できるかを検討するために、都内下水処理場の流入下水および放流水に17β−エストラジオールを添加して、添加回収試験を行った。
(Example 14) Measurement 1 of actual sample (sewage treatment water)
In order to examine whether it can be applied to the measurement of environmental hormones (17β-estradiol) contained in sewage treated water or river water mixed with various contaminants, 17β-estradiol was added to the inflow sewage and discharge water of a sewage treatment plant in Tokyo. After addition, an addition recovery test was performed.

固相は、固相抗体濃度を緩衝液で1.0μg/mLに調製し、ポリスチレン製の試験管に1mLずつ分注して、冷蔵庫で1晩保存することにより固相チューブを調製した。   The solid phase was prepared by adjusting the solid phase antibody concentration to 1.0 μg / mL with a buffer solution, dispensing 1 mL each into a polystyrene test tube, and storing it in a refrigerator overnight to prepare a solid phase tube.

前記固相チューブに0.75μg/mLに調製した酵素標識抗原を200μLずつ添加し、これに、5.0×10−8〜5.0×10−4g/Lの濃度範囲に希釈調製した17β−エストラジオールと下水処理水(S浄水場の曝気槽入口水と放流水)に17β−エストラジオール濃度が5.0×10−7g/L、5.0×10−5g/Lになるように調製した処理水を添加した。その後、0.75μg/mLに調製した抗17β−エストラジオールウサギ抗体を200μLずつ添加した。   200 μL of the enzyme-labeled antigen adjusted to 0.75 μg / mL was added to the solid phase tube, and 17β diluted and adjusted to a concentration range of 5.0 × 10 −8 to 5.0 × 10 −4 g / L. -Estradiol and sewage treatment water (aeration tank inlet water and discharge water of S water purification plant) were prepared so that 17β-estradiol concentration was 5.0 × 10 −7 g / L and 5.0 × 10 −5 g / L. Treated water was added. Thereafter, 200 μL of anti-17β-estradiol rabbit antibody adjusted to 0.75 μg / mL was added.

添加後200rpmの回転数で振とうしながら1時間免疫反応を行った。   After the addition, an immunoreaction was performed for 1 hour while shaking at 200 rpm.

免疫反応終了後、蒸留水で5回洗浄した。   After the completion of the immune reaction, the cells were washed five times with distilled water.

洗浄後、6mMのルミノールを主成分とする発光試薬を添加して、発光測定装置(明電舎製のルミノメータUPD−4000)で0〜30秒間の発光量を測定した。測定結果を図26に示す。   After washing, a luminescence reagent containing 6 mM luminol as a main component was added, and the luminescence amount for 0 to 30 seconds was measured with a luminescence measurement device (Luminometer UPD-4000 manufactured by Meidensha). FIG. 26 shows the measurement results.

図26の測定結果から、本発明の酵素免疫測定法は非常に特異的な反応であるために、いろいろな夾雑物が混入する下水処理水であっても、交差反応性の影響をあまり受けずに測定できることが判明した。   From the measurement results in FIG. 26, it can be seen that the enzyme immunoassay of the present invention is a very specific reaction. It was found that it could be measured.

(実施例15) 実試料(下水処理水)の測定2
下水処理場の処理水は、下水処理場によって処理水質が異なる。例えば、汚泥処理設備を有する処理上では、汚泥処理からの返流水があり、その返流水中には比較的多くの硫化物が含まれている。その意味で、実施例14とは異なる都内下水処理場の流入下水および放流水に17β−エストラジオールを添加して、添加回収試験を行った。
(Example 15) Measurement 2 of actual sample (sewage treatment water)
The quality of treated water at sewage treatment plants varies depending on the sewage treatment plant. For example, on a process having a sludge treatment facility, there is return water from sludge treatment, and the return water contains a relatively large amount of sulfide. In that sense, 17β-estradiol was added to the inflow sewage and the effluent of a sewage treatment plant in Tokyo different from that in Example 14, and an addition recovery test was performed.

固相は、固相抗体濃度を緩衝液で1.0μg/mLに調製し、ポリスチレン製の試験管に1mLずつ分注して、冷蔵庫で1晩保存することにより固相チューブを調製した。   The solid phase was prepared by adjusting the solid phase antibody concentration to 1.0 μg / mL with a buffer solution, dispensing 1 mL each into a polystyrene test tube, and storing it in a refrigerator overnight to prepare a solid phase tube.

前記固相チューブに0.75μg/mLに調製した酵素標識抗原を200μLずつ添加し、これに、5.0×10−8〜5.0×10−4g/Lの濃度範囲に希釈調製した17β−エストラジオールと下水処理水(C処理場の一沈流出水と放流水)に17β−エストラジオール濃度が5.0×10−7g/L、5.0×10−5g/Lになるように調製した処理水を添加した。その後、0.75μg/mLに調製した抗17β−エストラジオールウサギ抗体を200μLずつ添加した。   200 μL of the enzyme-labeled antigen adjusted to 0.75 μg / mL was added to the solid phase tube, and 17β diluted and adjusted to a concentration range of 5.0 × 10 −8 to 5.0 × 10 −4 g / L. -Estradiol and sewage treatment water (one sedimentation effluent and discharge water of C treatment plant) were prepared so that the 17β-estradiol concentration was 5.0 × 10 −7 g / L and 5.0 × 10 −5 g / L. Treated water was added. Thereafter, 200 μL of anti-17β-estradiol rabbit antibody adjusted to 0.75 μg / mL was added.

添加後200rpmの回転数で振とうしながら1時間免疫反応を行った。   After the addition, an immunoreaction was performed for 1 hour while shaking at 200 rpm.

免疫反応終了後、蒸留水で5回洗浄した。   After the completion of the immune reaction, the cells were washed five times with distilled water.

洗浄後、6mMのルミノールを主成分とする発光試薬を添加して、発光測定装置(明電舎製のルミノメータUPD−4000)で0〜30秒間の発光量を測定した。測定結果を図27に示す。   After washing, a luminescence reagent containing 6 mM luminol as a main component was added, and the luminescence amount for 0 to 30 seconds was measured with a luminescence measurement device (Luminometer UPD-4000 manufactured by Meidensha). FIG. 27 shows the measurement results.

図27の測定結果から、、本発明の酵素免疫測定法は非常に特異的な反応であるために、いろいろな夾雑物が混入する下水処理水であっても、交差反応性の影響をあまり受けずに測定できることが判明した。   From the measurement results shown in FIG. 27, it can be seen that the enzyme immunoassay of the present invention is a very specific reaction, and therefore, even in the case of sewage treated water mixed with various contaminants, there is little influence of cross-reactivity. It was found that the measurement could be performed without the need.

(実施例16) 実試料(河川水)の測定3
いろいろな夾雑物が混入する下水処理水や河川水中に含まれる17β−エストラジオールの測定に適応できるかを検討するために、都内の河川水に17β−エストラジオールを添加して、添加回収試験を行った。
(Example 16) Measurement 3 of actual sample (river water)
In order to examine whether it can be applied to the measurement of 17β-estradiol contained in sewage treated water or river water containing various contaminants, 17β-estradiol was added to river water in Tokyo, and an addition recovery test was performed. .

固相は、固相抗体濃度を緩衝液で1.0μg/mLに調製し、ポリスチレン製の試験管に1mLずつ分注して、冷蔵庫で1晩保存することにより固相チューブを調製した。   The solid phase was prepared by adjusting the solid phase antibody concentration to 1.0 μg / mL with a buffer solution, dispensing 1 mL each into a polystyrene test tube, and storing it in a refrigerator overnight to prepare a solid phase tube.

前記固相チューブに0.75μg/mLに調製した酵素標識抗原を200μLずつ添加し、これに、5.0×10−8〜5.0×10−4g/Lの濃度範囲に希釈調製した17β−エストラジオールと河川水(M川)に17β−エストラジオール濃度が5.0×10−7g/L、5.0×10−5g/Lになるように調製した処理水を添加した。その後、0.75μg/mLに調製した抗17β−エストラジオールウサギ抗体を200μLずつ添加した。   200 μL of the enzyme-labeled antigen adjusted to 0.75 μg / mL was added to the solid phase tube, and 17β diluted and adjusted to a concentration range of 5.0 × 10 −8 to 5.0 × 10 −4 g / L. -Estradiol and treated water prepared so that the 17β-estradiol concentration became 5.0 × 10 −7 g / L and 5.0 × 10 −5 g / L to river water (M river). Thereafter, 200 μL of anti-17β-estradiol rabbit antibody adjusted to 0.75 μg / mL was added.

添加後200rpmの回転数で振とうしながら1時間免疫反応を行った。   After the addition, an immunoreaction was performed for 1 hour while shaking at 200 rpm.

免疫反応終了後、蒸留水で5回洗浄した。   After the completion of the immune reaction, the cells were washed five times with distilled water.

洗浄後、6mMのルミノールを主成分とする発光試薬を添加して、発光測定装置(明電舎製のルミノメータUPD−4000)で0〜30秒間の発光量を測定した。測定結果を図28に示す。   After washing, a luminescence reagent containing 6 mM luminol as a main component was added, and the luminescence amount for 0 to 30 seconds was measured with a luminescence measurement device (Luminometer UPD-4000 manufactured by Meidensha). FIG. 28 shows the measurement results.

図28の測定結果から、本発明の酵素免疫測定法は非常に特異的な反応であるために、いろいろな夾雑物が混入する河川水であっても、交差反応性の影響をあまり受けずに測定できることが判明した。   From the measurement results in FIG. 28, since the enzyme immunoassay of the present invention is a very specific reaction, even in the case of river water mixed with various contaminants, there is little influence of cross-reactivity. It turned out to be measurable.

本発明の第1実施の形態の測定操作の模式図である。It is a schematic diagram of the measurement operation of the first embodiment of the present invention. 本発明の実施例1の結果を示す特性図である。FIG. 4 is a characteristic diagram showing the results of Example 1 of the present invention. 本発明の実施例2の結果を示す特性図(酵素標識抗原濃度が0.01μg/ml)である。FIG. 4 is a characteristic diagram (concentration of enzyme-labeled antigen: 0.01 μg / ml) showing the results of Example 2 of the present invention. 本発明の実施例2の結果を示す特性図(酵素標識抗原濃度が0.1μg/ml)である。FIG. 4 is a characteristic diagram (concentration of enzyme-labeled antigen: 0.1 μg / ml) showing the results of Example 2 of the present invention. 本発明の実施例2の結果を示す特性図(酵素標識抗原濃度が0.25μg/ml)である。FIG. 4 is a characteristic diagram (concentration of enzyme-labeled antigen: 0.25 μg / ml) showing the results of Example 2 of the present invention. 本発明の実施例2の結果を示す特性図(酵素標識抗原濃度が0.5μg/ml)である。FIG. 4 is a characteristic diagram showing the results of Example 2 of the present invention (concentration of enzyme-labeled antigen is 0.5 μg / ml). 本発明の実施例2の結果を示す特性図(酵素標識抗原濃度が0.75μg/ml)である。FIG. 5 is a characteristic diagram (concentration of enzyme-labeled antigen: 0.75 μg / ml) showing the results of Example 2 of the present invention. 本発明の実施例2の結果を示す特性図(酵素標識抗原濃度が1.0μg/ml)である。FIG. 4 is a characteristic diagram (concentration of enzyme-labeled antigen: 1.0 μg / ml) showing the results of Example 2 of the present invention. 本発明の実施例3の結果を示す特性図(酵素標識抗原濃度が0.5μg/mL)である。FIG. 5 is a characteristic diagram (concentration of enzyme-labeled antigen: 0.5 μg / mL) showing the results of Example 3 of the present invention. 本発明の実施例3の結果を示す特性図(酵素標識抗原濃度が1.0μg/mL)である。FIG. 4 is a characteristic diagram showing the results of Example 3 of the present invention (concentration of enzyme-labeled antigen is 1.0 μg / mL). 本発明の実施例3の結果を示す特性図(酵素標識抗原濃度が2.0μg/mL)である。FIG. 4 is a characteristic diagram (concentration of enzyme-labeled antigen: 2.0 μg / mL) showing the results of Example 3 of the present invention. 本発明の実施例4の結果を示す特性図である。FIG. 14 is a characteristic diagram showing the results of Example 4 of the present invention. 本発明の実施例5の結果を示す特性図である。FIG. 14 is a characteristic diagram showing the results of Example 5 of the present invention. 本発明の実施例6の結果を示す特性図である。FIG. 13 is a characteristic diagram showing the results of Example 6 of the present invention. 本発明の実施例7の結果を示す特性図(免疫反応時間が30分間)である。FIG. 11 is a characteristic diagram (immune reaction time: 30 minutes) showing the results of Example 7 of the present invention. 本発明の実施例7の結果を示す特性図(免疫反応時間が45分間)である。FIG. 10 is a characteristic diagram (immune reaction time: 45 minutes) showing the results of Example 7 of the present invention. 本発明の実施例7の結果を示す特性図(免疫反応時間が60分間)である。FIG. 14 is a characteristic diagram (immune reaction time: 60 minutes) showing the results of Example 7 of the present invention. 本発明の実施例8の結果を示す特性図(静置して1時間反応)である。FIG. 10 is a characteristic diagram (reacted for 1 hour after standing still) showing the results of Example 8 of the present invention. 本発明の実施例8の結果を示す特性図(200rpmの振とうで1時間反応)である。FIG. 11 is a characteristic diagram (reaction for 1 hour with shaking at 200 rpm) showing the results of Example 8 of the present invention. 本発明の第2実施の形態の測定操作の模式図である。It is a schematic diagram of the measurement operation of the second embodiment of the present invention. 本発明の実施例9の結果を示す特性図である。FIG. 14 is a characteristic diagram showing the results of Example 9 of the present invention. 本発明の実施例10の結果を示す特性図である。FIG. 14 is a characteristic diagram showing the results of Example 10 of the present invention. 本発明の実施例11の結果を示す特性図である。FIG. 14 is a characteristic diagram showing the results of Example 11 of the present invention. 本発明の実施例12の結果を示す特性図である。FIG. 14 is a characteristic diagram showing the results of Example 12 of the present invention. 本発明の実施例13の結果を示す特性図である。FIG. 14 is a characteristic diagram showing the results of Example 13 of the present invention. 本発明の実施例14の結果を示す特性図である。FIG. 14 is a characteristic diagram showing the results of Example 14 of the present invention. 本発明の実施例15の結果を示す特性図である。FIG. 14 is a characteristic diagram showing the results of Example 15 of the present invention. 本発明の実施例16の結果を示す特性図である。FIG. 14 is a characteristic diagram showing the results of Example 16 of the present invention.

符号の説明Explanation of reference numerals

11、21…固相
12、22…抗原抗体液
13、23…発光反応液
14、24…データ処理
11, 21 ... solid phase 12, 22 ... antigen-antibody solution 13, 23 ... luminescence reaction solution 14, 24 ... data processing

Claims (13)

抗体を固相調製した後、前記固相に酵素標識抗原、および内分泌撹乱化学物質を添加して免疫反応を行わせ、
免疫反応終了後、前記固相を洗浄してから発光試薬を添加して、酵素反応による発光量から前記内分泌撹乱化学物質を測定することを特徴とする内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法。
After preparing the antibody on a solid phase, an enzyme-labeled antigen is added to the solid phase, and an endocrine disrupting chemical substance is added to cause an immune reaction,
After the end of the immune reaction, the solid phase is washed, a luminescent reagent is added, and the endocrine disrupting chemical is measured from the amount of light emitted by the enzymatic reaction.
前記内分泌撹乱化学物質が17β−エストラジオールであることを特徴とする請求項1に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法。   The method of claim 1, wherein the endocrine disrupting chemical is 17β-estradiol. 前記抗体は17β−エストラジオールに牛血清アルブミンを結合し、ウサギに免疫して調製したものであることを特徴とする請求項2に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法。   The method according to claim 2, wherein the antibody is prepared by immunizing rabbits by binding bovine serum albumin to 17β-estradiol. 前記抗体の濃度が0.75μg/mLであることを特徴とする請求項3に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法。   The method according to claim 3, wherein the concentration of the antibody is 0.75 µg / mL. 前記抗体1mLに対して添加する前記酵素標識抗原および17β−エストラジオールの混合溶液の体積が100μLであることを特徴とする請求項4に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法。   5. The method according to claim 4, wherein a volume of the mixed solution of the enzyme-labeled antigen and 17β-estradiol added to 1 mL of the antibody is 100 μL. 前記混合溶液中の酵素標識抗原の濃度が0.125〜0.25μg/mLであることを特徴とする請求項4に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法。   The method according to claim 4, wherein the concentration of the enzyme-labeled antigen in the mixed solution is 0.125 to 0.25 µg / mL. 前記免疫反応を200rpmの回転数で振とうしながら行うことを特徴とする請求項5または6に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法。   The method according to claim 5 or 6, wherein the immune reaction is performed while shaking at a rotation speed of 200 rpm. 前記免疫反応を1時間以上行うことを特徴とする請求項5乃至7に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法。   8. The method according to claim 5, wherein the immune reaction is performed for 1 hour or more. 第1抗体を固相調製した後、固相に酵素標識抗原、内分泌撹乱化学物質、および第2抗体を添加して免疫反応を行わせ、
免疫反応終了後、前記固相を洗浄してから発光試薬を添加して、酵素反応による発光量から前記内分泌撹乱化学物質を測定することを特徴とする内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法。
After preparing the first antibody on a solid phase, an enzyme-labeled antigen, an endocrine disrupting chemical substance, and a second antibody are added to the solid phase to cause an immune reaction,
After the end of the immune reaction, the solid phase is washed, a luminescent reagent is added, and the endocrine disrupting chemical substance is measured from the amount of light emitted by the enzymatic reaction.
前記内分泌撹乱化学物質が17β−エストラジオールであることを特徴とする請求項9に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法。   The method of claim 9, wherein the endocrine disrupting chemical is 17β-estradiol. 前記第1抗体が抗ウサギIgGヤギ抗体であり、前記第2抗体が抗17β−エストラジオールウサギ抗体であることを特徴とする請求項10に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法。   The method according to claim 10, wherein the first antibody is an anti-rabbit IgG goat antibody, and the second antibody is an anti-17β-estradiol rabbit antibody. 前記抗ウサギIgGヤギ抗体の濃度が1.0μg/mLであり、前記抗17β−エストラジオールウサギ抗体の濃度が0.75μg/mLであることを特徴とする請求項11に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法。   The endocrine disrupting chemical substance according to claim 11, wherein the concentration of the anti-rabbit IgG goat antibody is 1.0 µg / mL, and the concentration of the anti-17β-estradiol rabbit antibody is 0.75 µg / mL. Enzyme immunoassay. 免疫反応を200rpmの回転数で振とうしながら行うことを特徴とする請求項11または12に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法。   13. The method according to claim 11, wherein the immune reaction is carried out while shaking at a rotation speed of 200 rpm.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014083668A1 (en) * 2012-11-29 2014-06-05 ミライアル株式会社 Antigen-antibody reaction measurement method using sandwich technique

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