JP2004189724A - Material containing physiologically active substance and its production method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、滅菌の難しい生理活性物質を含む材料において、滅菌された生理活性物質を含む材料およびその製造方法に関するものであり、生理活性物質とカチオン性物質の複合体とアニオン性表面をもつ材料を別々に滅菌した後で、無菌的に混合することにより、容易に滅菌された生理活性物質を含む材料を提供できる。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a material containing a physiologically active substance which is difficult to sterilize, and relates to a material containing a sterilized physiologically active substance and a method for producing the same, and a material having a complex of a physiologically active substance and a cationic substance and an anionic surface Can be easily aseptically mixed to provide a material containing a physiologically active substance that is easily sterilized.
近年、生理活性物質を含む材料が血液浄化用途、細胞分離用途、細胞培養用途、組織形成用途などの医療材料として利用されてきた。生理活性物質を含む材料の担体素材としては、セルロース、セルロース誘導体、アガロース、ポリオレフィン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリル酸メチル、ポリスルホン系ポリマー、キチン、キトサン、ポリウレタンなどの高分子化合物が用いられてきた。これら担体の形状としては、ビーズ、繊維、中空糸膜、平膜、ゲル、カットファイバーなどが用いられている。 In recent years, a material containing a physiologically active substance has been used as a medical material for blood purification, cell separation, cell culture, tissue formation, and the like. As a carrier material of a material containing a physiologically active substance, polymer compounds such as cellulose, cellulose derivatives, agarose, polyolefin, polyester, polyacrylonitrile, polymethyl methacrylate, polysulfone-based polymers, chitin, chitosan, and polyurethane have been used. . As the shape of these carriers, beads, fibers, hollow fiber membranes, flat membranes, gels, cut fibers and the like are used.
しかし、これら担体素材になんらかの物質を固定する際は、臭化シアンで活性基を表面に導入したり、スクシンイミド基、α−クロロアセトアミドメチル基などの活性基を表面に導入したり、担体官能基と物質の官能基を結合させてやるためにカルボジイミドなどを利用したりして、物質を共有結合などにより固定してやる必要があった（例えば、非特許文献１参照）。例えば、生理活性物質として、抗体を不織布担体に化学的に固定した材料を用い、抗体と相互作用するある特定の細胞を除去する技術が検討されている（例えば、特許文献１参照）。これらの手法は研究用途などでは頻繁に用いられているが、医療用途などの製造に用いる場合は、製造コストがかかってしまう問題があった。さらに医療用途の場合は製品を滅菌しなければならないが、抗体などの生理活性物質は、放射線や熱による滅菌により失活してしまうため、抗体などの生理活性物質を固定したような医療用具を製造する場合は製造プロセスをすべて無菌状態にして製造するなどされており、莫大な製造コストを必要としている。 However, when any substance is immobilized on these carrier materials, an active group is introduced to the surface with cyanogen bromide, an active group such as a succinimide group or an α-chloroacetamidomethyl group is introduced to the surface, or a carrier functional group is immobilized. For example, it is necessary to use carbodiimide or the like to bond the functional groups of the substance and the substance, and to fix the substance by a covalent bond or the like (for example, see Non-Patent Document 1). For example, a technique for removing a specific cell that interacts with an antibody by using a material in which an antibody is chemically fixed to a nonwoven fabric carrier as a physiologically active substance has been studied (for example, see Patent Document 1). These methods are frequently used in research applications and the like, but when used for manufacturing in medical applications and the like, there is a problem that the production cost is increased. In the case of medical applications, the product must be sterilized.However, bioactive substances such as antibodies are inactivated by sterilization by radiation or heat. In the case of manufacturing, all manufacturing processes are performed under aseptic conditions and the like, which requires enormous manufacturing costs.
材料に含まれる生理活性物質が滅菌可能な合成物質のようなリガンドであれば、そのリガンドの含まれる材料の製造コストは安く、滅菌は容易であるが、血液中から種々の物質を除去したり、培養材料に利用したりする場合には特異性に欠け、血液浄化用途の場合には有用物質も同時に除去されてしまう可能性がある。 If the physiologically active substance contained in the material is a ligand such as a sterilizable synthetic substance, the production cost of the material containing the ligand is low and sterilization is easy, but various substances can be removed from the blood. However, when used for culture materials, it lacks specificity, and when used for blood purification, useful substances may be removed at the same time.
細胞分離、培養用途の場合は、ポリスチレンなどのディッシュに生理活性物質をコーティングすることにより、細胞分離や培養が行われているが、コーティングできる量は非常に少なく、細胞分離や培養における生理活性物質の効果は低い。 In the case of cell separation and culture, cell separation and culture are performed by coating a dish such as polystyrene with a physiologically active substance.However, the amount that can be coated is very small, and physiologically active substances in cell separation and culture are used. The effect is low.
一方、静電的相互作用を利用して生理活性物質を固定した医療材料としては、例えば、カチオン性材料にアニオン性の生理活性物質であるヘパリンを固定した抗血栓性材料（例えば特許文献２参照）などがあるが、固定した生理活性物質と血液中の物質との相互作用を利用して該物質を回収するといった方法はなされていない。
本発明では、上記の問題を考慮して、生理活性物質を含む材料の滅菌に関わる問題を解決し、生理活性物質と材料を別々に滅菌した後で、無菌的に混合することにより容易に滅菌された、有用物質や病因物質等を回収可能な生理活性物質を含む材料を提供することを目的とする。 In the present invention, in consideration of the above problems, the problem relating to sterilization of a material containing a physiologically active substance is solved, and after the physiologically active substance and the material are separately sterilized, they are easily sterilized by aseptically mixing. It is an object of the present invention to provide a material containing a physiologically active substance capable of recovering useful substances, pathogenic substances, and the like.
上記目的を達成するために、本発明は主として以下の構成を有する。すなわち、「アニオン性表面をもつ材料に、生理活性物質とカチオン性物質との複合体が固定された生理活性物質を含む材料。」、「生理活性物質とカチオン性物質の複合体を水溶液状態にし、アニオン性表面をもつ材料に接触し固定させることを特徴とする生理活性物質を含む材料の製造方法。」、「生理活性物質とカチオン性物質の複合体を水溶液状態で無菌ろ過滅菌し、ろ過滅菌した生理活性物質とカチオン性物質の複合体の水溶液を別に滅菌されたアニオン性表面をもつ材料に無菌的に接触し固定させることを特徴とする生理活性物質を含む材料の製造方法。」である。 In order to achieve the above object, the present invention mainly has the following configurations. That is, “a material containing a physiologically active substance and a complex of a physiologically active substance and a cationic substance immobilized on a material having an anionic surface.” , A method for producing a material containing a physiologically active substance, which is in contact with and immobilized on a material having an anionic surface. "," Sterile filtration and sterilization of a complex of a physiologically active substance and a cationic substance in an aqueous solution state, and filtration. A method for producing a material containing a physiologically active substance, which comprises aseptically contacting and fixing an aqueous solution of a complex of a sterilized physiologically active substance and a cationic substance to a separately sterilized material having an anionic surface. " is there.
本発明により、生理活性物質を含む材料の滅菌に関わる問題を解決し、生理活性物質とカチオン性物質の複合体とアニオン性表面をもつ材料を別々に滅菌した後で、無菌的に混合することにより、容易に滅菌された生理活性物質を含む材料を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to solve a problem relating to sterilization of a material containing a physiologically active substance, and aseptically mix a substance having a complex of a physiologically active substance and a cationic substance and a material having an anionic surface, and then aseptically mix them. Accordingly, a material containing a physiologically active substance that is easily sterilized can be provided.
本発明は、アニオン性表面をもつ材料に、生理活性物質とカチオン性物質との複合体が固定された材料である。 The present invention is a material in which a complex of a physiologically active substance and a cationic substance is fixed to a material having an anionic surface.
本発明で用いられるアニオン性表面をもつ材料の素材は、アニオン性表面を有するものまたは表面にアニオン性を付与できるものであれば特に限定されないが、具体的にはセルロース、セルロースアセテート、セルローストリアセテート、ポリオレフィン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリアリレート、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリル酸メチル、ポリアミド、ポリウレタン、ポリスルホン系ポリマー、ゼラチン、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、コラーゲン、アガロースなどの高分子化合物、ステンレス、チタン、白金などの金属、ハイドロキシアパタイト、トルカルシウムホスフェートなどが挙げられる。なかでも、加工性等の点から、高分子化合物が好ましい。 The material of the material having an anionic surface used in the present invention is not particularly limited as long as it has an anionic surface or can impart an anionic property to the surface.Specifically, cellulose, cellulose acetate, cellulose triacetate, Polyolefin, polyimide, polycarbonate, polyarylate, polyester, polyacrylonitrile, polymethyl methacrylate, polyamide, polyurethane, polysulfone polymer, gelatin, chitin, chitosan, hyaluronic acid, collagen, agarose and other high molecular compounds, stainless steel, titanium, platinum And the like, hydroxyapatite, tolucalcium phosphate and the like. Among them, a polymer compound is preferred from the viewpoint of processability and the like.
材料の形状としては平膜状、粒子状、中空糸状、繊維状、スポンジ状、カットファイバーなど何でもよいが、血液浄化用途、細胞培養用途の場合は、閉鎖系で圧力損失を伴わず、細胞を傷つけず循環できる利点から中空糸膜が望ましく、三次元的な立体空間を利用し、細胞を捕捉できる利点からは繊維状が望ましい。また、中空糸膜の場合、表面積を確保する点からこれらは多孔質であることがのぞましい。中空糸膜を多孔質として用いる場合は、透析やろ過機能を付与することができ、血液浄化用途のみならず、バイオリアクターなどの細胞培養用途としても用いることができる。多孔質材料の場合は、製造条件を制御することにより孔の制御も可能である。繊維状の場合、繊維くずの流出などを防ぐという点で長繊維からなることが望ましい。また、繊維は織布でもよいし、不織布でもよいが、細胞の通過する空間を保持させるという観点から不織布が望ましい。不織布を用いる場合は、細胞が通過できる空間を保持されていれば、どのような繊維径、密度でもよいが、繊維系については０．１μｍ以上１００μｍ以下であることが望ましく、密度は０．００５〜０．５０ｇ／ｃｍ3であることが望ましい。 The shape of the material may be any of a flat membrane, a particle, a hollow fiber, a fiber, a sponge, and a cut fiber.However, in the case of a blood purification application or a cell culture application, the cells are closed without pressure loss in a closed system. A hollow fiber membrane is desirable from the viewpoint of being able to circulate without damage, and a fibrous shape is desirable from the advantage that a cell can be trapped by utilizing a three-dimensional space. In the case of hollow fiber membranes, these are preferably porous from the viewpoint of securing a surface area. When the hollow fiber membrane is used as porous, it can be provided with a dialysis or filtration function, and can be used not only for blood purification but also for cell culture such as a bioreactor. In the case of a porous material, the pores can be controlled by controlling the manufacturing conditions. In the case of a fibrous form, it is desirable to be made of long fibers from the viewpoint of preventing outflow of fiber waste. The fiber may be a woven fabric or a non-woven fabric, but a non-woven fabric is desirable from the viewpoint of maintaining a space through which cells pass. When a nonwoven fabric is used, any fiber diameter and density may be used as long as a space through which cells can pass is maintained. However, the fiber system preferably has a fiber diameter of 0.1 μm or more and 100 μm or less, and has a density of 0.005 μm or less. It is desirably 0.50 g / cm 3 .
これらの材料にアニオン性を付与するために用いられる物質としては、硫酸、デキストラン硫酸、ヘパリン、ＤＮＡ、ポリアクリル酸、ポリビニル硫酸、アクリル酸、ビニル硫酸、パラスチレンスルホン酸ナトリウム、末端アミノ基の封鎖されたポリアミドなど、アニオン性の官能基をもつ低分子、高分子物質が用いられる。 Substances used to impart anionic properties to these materials include sulfuric acid, dextran sulfate, heparin, DNA, polyacrylic acid, polyvinyl sulfate, acrylic acid, vinyl sulfate, sodium parastyrene sulfonate, and blocking of terminal amino groups. Low-molecular and high-molecular substances having an anionic functional group, such as a polyamide produced, are used.
これらの材料にアニオン性を付与する方法としては、化学反応、グラフト反応、放射線架橋、共重合、ブレンド、イオン注入、真空蒸着、コーティングなど材料表面にアニオン性を付与できる方法であれば何でも良い。 As a method for imparting anionic property to these materials, any method can be employed as long as it can impart anionic property to the material surface, such as chemical reaction, graft reaction, radiation crosslinking, copolymerization, blending, ion implantation, vacuum deposition, and coating.
例えば、セルロースにアミノ基を導入し、カルボジイミドでヘパリンを固定させてやることにより、アニオン性表面を導入できる。ポリスルホンとポリビニルピロリドンからなる材料の場合は、デキストラン硫酸の水溶液中で放射線を照射することにより、材料表面にアニオン性を付与できる。また、ポリスチレンからなる材料の場合は、濃硫酸で処理してやることにより、表面に硫酸基を導入でき、表面にアニオン性官能基を導入できる。また、ポリメチルメタクリレートを通常のラジカル重合によって得る際、カルボキシル基や、スルホン酸基などのアニオン性基を含有するビニルモノマーと共重合したものを、材料に成形することにより、材料表面にアニオン性を付与できる。また、アニオン性ポリマーをポリメチルメタクリレートのようなポリマーとブレンドして成形することによっても材料表面にアニオン性を付与することができる。ナイロンやポリエステルにアクリル酸をグラフトすることによっても得ることができる。ナイロンのようなポリアミドの重合時に末端アミノ基を酢酸などで封鎖して重合したものはカルボキシル基を有しており、その高分子を用いて成形することによってアニオン性表面をもつ材料を得ることができる。金属の負イオン注入によっても得ることができる。 For example, an anionic surface can be introduced by introducing an amino group into cellulose and fixing heparin with carbodiimide. In the case of a material composed of polysulfone and polyvinylpyrrolidone, an anionic property can be imparted to the surface of the material by irradiating the material with an aqueous solution of dextran sulfate. Further, in the case of a material made of polystyrene, a sulfate group can be introduced to the surface and an anionic functional group can be introduced to the surface by treating with concentrated sulfuric acid. In addition, when polymethyl methacrylate is obtained by ordinary radical polymerization, a material obtained by copolymerizing a vinyl monomer containing an anionic group such as a carboxyl group or a sulfonic acid group into a material is formed into an anionic surface on the material surface. Can be given. Alternatively, anionic properties can be imparted to the material surface by blending and molding an anionic polymer with a polymer such as polymethyl methacrylate. It can also be obtained by grafting acrylic acid to nylon or polyester. A polymer obtained by blocking the terminal amino group with acetic acid or the like during the polymerization of polyamide such as nylon has a carboxyl group, and it is possible to obtain a material having an anionic surface by molding using the polymer. it can. It can also be obtained by negative ion implantation of metal.
材料に生理活性物質を固定し、生理活性物質を脱離させるようにするには材料は親水性であることが望ましい。親水化の方法としては、血漿やアルブミンなどで親水化処理したり、ポリエチレングリコールやポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールなどをブレンドまたはコーティングしたりする方法が挙げられる。 In order to immobilize a physiologically active substance on a material and to release the physiologically active substance, the material is desirably hydrophilic. Examples of the method of hydrophilization include a method of hydrophilizing with plasma, albumin, or the like, or a method of blending or coating polyethylene glycol, polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol, or the like.
本発明の生理活性物質を含む材料は、アニオン性表面をもつ材料にカチオン性物質と複合した生理活性物質を含む水溶液を添加することにより、容易に生理活性物質を材料に固定することができる。これはアニオン性表面とカチオン性物質の静電的相互作用により固定されるためである。 The physiologically active substance-containing material of the present invention can be easily fixed to a material having an anionic surface by adding an aqueous solution containing a physiologically active substance complexed with a cationic substance to the material. This is because they are fixed by the electrostatic interaction between the anionic surface and the cationic substance.
活性基を導入した材料に生理活性物質を導入する場合、通常、１ｍｇ／ｍｌ以上の高濃度の生理活性物質の溶液濃度を必要とするが、本発明における生理活性物質の固定化方法であれば、０．１ｍｇ／ｍｌであっても、材料に固定することが可能である。 When a physiologically active substance is introduced into a material into which an active group has been introduced, a solution concentration of the physiologically active substance at a high concentration of 1 mg / ml or more is usually required. , 0.1 mg / ml can be fixed to the material.
本発明に用いられるカチオン性物質はカチオン性ポリマーが好ましい。ここでいうカチオン性ポリマーの分子量は、特に限定されない。カチオン性ポリマーは窒素原子を含有するポリマー、すなわち１級、２級、３級アミノ基、４級アンモニウム塩のいずれか１種以上を有するアミノ基含有ポリマー、イミノ基含有ポリマー、アミド基含有ポリマーなどが好ましく用いられる。これらのポリマーを構成する原料成分の共重合体またはノニオン、アニオン性化合物との共重合体なども好ましく使用される。ここで、該カチオン性ポリマーは直鎖状、分岐状、環状のいずれであってもよい。また、分子量は好ましくは６００以上１０００万以下、より好ましくは１０００以上１０万以下である。 The cationic substance used in the present invention is preferably a cationic polymer. The molecular weight of the cationic polymer mentioned here is not particularly limited. The cationic polymer is a polymer containing a nitrogen atom, that is, an amino group-containing polymer having at least one of primary, secondary, tertiary amino groups, and quaternary ammonium salts, an imino group-containing polymer, an amide group-containing polymer, and the like. Is preferably used. A copolymer of the raw material components constituting these polymers or a copolymer with a nonionic or anionic compound is also preferably used. Here, the cationic polymer may be linear, branched, or cyclic. Further, the molecular weight is preferably 600 or more and 10,000,000 or less, more preferably 1,000 or more and 100,000 or less.
アミノ基含有ポリマーの例としては、ポリアルキレンイミン、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ジアルキルアミノアルキルデキストラン、ポリヒスチジン、ポリアルギニン、キトサン、ポリオルニチン、ポリリジン、アジリジン（エチレンイミン）化合物を有するポリマー、およびそれらに置換基の導入されたもの、およびこれらを構成するモノマー単位からなる共重合体などが挙げられる。 Examples of the amino group-containing polymer include polyalkyleneimine, polyallylamine, polyvinylamine, dialkylaminoalkyldextran, polyhistidine, polyarginine, chitosan, polyornithine, polylysine, polymers having an aziridine (ethyleneimine) compound, and Examples thereof include those having a substituent introduced therein, and copolymers comprising monomer units constituting these.
ポリエチレンイミンには、分子量６００以上１０００万以下の直鎖状、分岐状のものが好ましく用いられる。より好ましくは分子量１０００以上１０万以下のものが用いられる。 As the polyethyleneimine, a linear or branched one having a molecular weight of 600 to 10,000,000 is preferably used. More preferably, those having a molecular weight of 1,000 to 100,000 are used.
また、ポリエチレンイミン誘導体としては、ポリエチレンイミンをアルキル化、カルボキシル化、フェニル化、リン酸化、スルホン化など、所望の割合で誘導体化したものが挙げられる。 Examples of the polyethyleneimine derivative include those obtained by derivatizing polyethyleneimine at a desired ratio such as alkylation, carboxylation, phenylation, phosphorylation, and sulfonation.
カチオン性ポリマーの中でも毒性の低さ、入手のしやすさ、取り扱いのしやすさなどから、分岐状のポリエチレンイミンやジエチルアミノエチルデキストランが特に好適に用いられる。 Among the cationic polymers, branched polyethyleneimine and diethylaminoethyldextran are particularly preferably used because of their low toxicity, easy availability, and easy handling.
本発明で使用する生理活性物質は、ａ）細胞や病因物質などのターゲット物質と相互作用をもつものや、ｂ）抗血栓性を有するもの、ｃ）細胞を活性化するもの、ｄ）アポトーシスを誘導するもの、ｅ）増殖、分化因子、ｆ）サイトカイン、ｇ）接着因子などがあげられる。これらは単独、または複数組み合わせて用いられる。
ａ）細胞や病因物質などのターゲット物質と相互作用をもつもの
細胞や病因物質などのターゲット物質と相互作用をもつものの場合、特異性の点から抗体およびレセプターを好ましく用いることができる。用いる抗体としては、例えば、抗ＣＤ１ａ抗体、抗ＣＤ１ｂ抗体、抗ＣＤ１ｃ抗体、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ１０抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＤ１１ｃ抗体、抗ＣＤｗ１２抗体、抗ＣＤ１３抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１５抗体、抗ＣＤ１６ａ抗体、抗ＣＤ１６ｂ抗体、抗ＣＤ１８抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ２３抗体、抗ＣＤ２４抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ２６抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ３２抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ４２ａ抗体、抗ＣＤ４４抗体、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体、抗ＣＤ４５ＲＯ抗体、抗ＣＤ４９ｄ抗体、抗ＣＤ５０抗体、抗ＣＤ５４抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ５７抗体、抗ＣＤ５８抗体、抗ＣＤ６１抗体、抗ＣＤ６２Ｌ抗体、抗ＣＤ６２Ｐ抗体、抗ＣＤ６６抗体、抗ＣＤ６９抗体、抗ＣＤ７０抗体、抗ＣＤ７１抗体、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８１抗体、抗ＣＤ８６抗体、抗ＣＤ９５抗体、抗ＣＤ１０２抗体、抗ＣＤ１０５抗体、抗ＣＤ１０６抗体、抗ＣＤ１０９抗体、抗ＣＤｗ１１９抗体、抗ＣＤ１２０ａ抗体、抗ＣＤ１２０ｂ抗体、抗ＣＤ１２１ａ抗体、抗ＣＤｗ１２１ｂ抗体、抗ＣＤ１２２抗体、抗ＣＤ１２３抗体、抗ＣＤ１２６抗体、抗ＣＤｗ１２８ａ抗体、抗ＣＤ１３０抗体、抗ＣＤｗ１３１抗体、抗ＣＤ１３２抗体、抗ＣＤ１３３抗体、抗ＣＤ１３４抗体、抗ＣＤ１０５抗体、抗ＣＤ１３８抗体、ＣＤ１５２抗体、抗ＣＤ１５４抗体、抗ＣＤ１９９抗体、抗免疫グロブリン抗体、抗低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ）抗体、抗酸化ＬＤＬ抗体、抗β２ミクログロブリン抗体、抗ＡＧＥ抗体、抗ＣＣＲ１抗体、抗ＣＣＲ２抗体、抗ＣＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ４抗体、抗ＣＣＲ５抗体、抗ＣＣＲ７抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＸ３ＣＲ１抗体、抗ＣＸＣＲ５抗体、抗ＣＸＣＲ１抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。また、レセプターとしては例えば、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＲ５等のサイトカインレセプターやＦｃγ、Ｆｃε等のイムノグロブリンレセプター、ＲＡＧＥ、ＬＤＬレセプター等のスカベンジャ−レセプター等、Ｔ細胞レセプターや主要組織適合性抗原等の細胞認識レセプター等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの抗体やレセプターは単独で固定しても良いし、複数の抗体やレセプターを組み合わせても良い。抗体は、アフィニティーの高さからモノクローナル抗体が好ましい。
The physiologically active substances used in the present invention include: a) a substance interacting with a target substance such as a cell or a pathogen; b) an antithrombotic substance; c) a cell activating substance; and d) apoptosis. Inducers, e) proliferation and differentiation factors, f) cytokines, g) adhesion factors and the like. These may be used alone or in combination.
a) Interacting with target substances such as cells and pathogenic substances In the case of interacting with target substances such as cells and pathogenic substances, antibodies and receptors can be preferably used from the viewpoint of specificity. Antibodies to be used include, for example, anti-CD1a antibody, anti-CD1b antibody, anti-CD1c antibody, anti-CD2 antibody, anti-CD3 antibody, anti-CD4 antibody, anti-CD8 antibody, anti-CD10 antibody, anti-CD11a antibody, anti-CD11b antibody, anti-CD11c antibody Anti-CDw12 antibody, anti-CD13 antibody, anti-CD14 antibody, anti-CD15 antibody, anti-CD16a antibody, anti-CD16b antibody, anti-CD18 antibody, anti-CD19 antibody, anti-CD20 antibody, anti-CD22 antibody, anti-CD23 antibody, anti-CD24 antibody, CD25 antibody, anti-CD26 antibody, anti-CD27 antibody, anti-CD28 antibody, anti-CD30 antibody, anti-CD31 antibody, anti-CD32 antibody, anti-CD33 antibody, anti-CD34 antibody, anti-CD38 antibody, anti-CD40 antibody, anti-CD42a antibody, anti-CD44 antibody , Anti-CD45 antibody, anti-CD45RA antibody, anti-CD45RO antibody, CD49d antibody, anti-CD50 antibody, anti-CD54 antibody, anti-CD56 antibody, anti-CD57 antibody, anti-CD58 antibody, anti-CD61 antibody, anti-CD62L antibody, anti-CD62P antibody, anti-CD66 antibody, anti-CD69 antibody, anti-CD70 antibody, anti-CD71 antibody Anti-CD80 antibody, anti-CD81 antibody, anti-CD86 antibody, anti-CD95 antibody, anti-CD102 antibody, anti-CD105 antibody, anti-CD106 antibody, anti-CD109 antibody, anti-CDw119 antibody, anti-CD120a antibody, anti-CD120b antibody, anti-CD121a antibody, CDw121b antibody, anti-CD122 antibody, anti-CD123 antibody, anti-CD126 antibody, anti-CDw128a antibody, anti-CD130 antibody, anti-CDw131 antibody, anti-CD132 antibody, anti-CD133 antibody, anti-CD134 antibody, anti-CD105 antibody, anti-CD138 antibody, CD152 Body, anti-CD154 antibody, anti-CD199 antibody, anti-immunoglobulin antibody, anti-low-density lipoprotein (LDL) antibody, anti-oxidized LDL antibody, anti-β2 microglobulin antibody, anti-AGE antibody, anti-CCR1, anti-CCR2 antibody, anti-CCR3 Examples include, but are not limited to, antibodies, anti-CCR4 antibodies, anti-CCR5 antibodies, anti-CCR7 antibodies, anti-CXCR3 antibodies, anti-CX3CR1 antibodies, anti-CXCR5 antibodies, anti-CXCR1 antibodies, and the like. Examples of the receptor include cytokine receptors such as CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CXCR1, CXCR3, CX3CR1, and CXCR5, immunoglobulin receptors such as Fcγ and Fcε, and scavenger receptors such as RAGE and LDL receptors. And cell recognition receptors such as T cell receptors and major histocompatibility antigens, but are not limited thereto. These antibodies and receptors may be fixed alone, or a plurality of antibodies and receptors may be combined. The antibody is preferably a monoclonal antibody because of its high affinity.
これら抗体やレセプターは目的によって種々選定することができ、血液中の有用物質や病因物質を特異的に除去、回収する場合は細胞、無機物、タンパク質、ＤＮＡ、脂質、糖、ウィルスなどがターゲットとして挙げられる。例えば、本発明における細胞分離用途として、抗ＣＤ２抗体を用いればＴ細胞およびＮＫ細胞を分離でき、抗ＣＤ３抗体を用いればＴ細胞をを分離でき、抗ＣＤ４抗体を用いればヘルパーＴ細胞を分離でき、抗ＣＤ８抗体を用いればサイトトキシックＴ細胞を分離でき、抗ＣＤ１１ａを用いれば白血球を分離でき、抗ＣＤ１１ｂを用いれば単球を分離でき、抗ＣＤ１４抗体を用いれば単球やマクロファージを分離でき、抗ＣＤ１５抗体を用いれば顆粒球やミエロイド細胞を分離でき、抗ＣＤ１６細胞を用いれば好中球あるいは休止期ＮＫ細胞を分離でき、抗ＣＤ１９抗体を用いればＢ細胞を分離でき、抗ＣＤ２２抗体を用いればＢ細胞を分離でき、抗ＣＤ２７抗体を用いればナイーブＢ細胞やメモリーＢ細胞を分離でき、抗ＣＤ３０抗体を用いれば活性化Ｂ細胞および活性化Ｔ細胞を分離でき、抗ＣＤ３３細胞を用いれば単球、顆粒球およびミエロイド細胞を分離でき、抗ＣＤ３４抗体を用いれば造血幹細胞を分離でき、抗ＣＤ４５抗体を用いれば白血球を分離でき、抗ＣＤ５６抗体を用いればＮＫ細胞を分離でき、抗ＣＤ６１抗体を用いれば巨核球及びその前駆細胞を分離でき、抗ＣＤ６６抗体を用いれば顆粒球を分離でき、抗ＣＤ６９抗体を用いれば活性化Ｔ細胞や活性化Ｂ細胞やＮＫ細胞を分離でき、抗ＣＤ７１抗体を用いれば赤芽球や活性化されたリンパ芽球を分離でき、抗ＣＤ１０５抗体を用いれば内皮細胞、抗ＣＤ１３３抗体を用いれば神経幹細胞を分離できる。抗免疫グロブリン抗体を用いればＢ細胞を分離できる。
ｂ）抗血栓性を有するもの
生理活性物質において、抗血栓性を有するものとしては、ヘパリン、トロンモボジュリン、ヒルジンなどがあげられる。これらを材料に固定したものは、例えば、本発明における血液浄化用途として、人工腎臓や血液吸着材などに、組織形成用途における人工血管などに利用できる。
ｃ）細胞を活性化するもの
細胞を活性化するものとして、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン−２、インターロイキン−４、インターロイキン−１２、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ４４抗体、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体、抗ＣＤ４５ＲＯ抗体、やＴ細胞レセプター、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスIおよびクラスIIやそれらに抗原ペプチドを複合したもの等が挙げられる。例えば、本発明における細胞培養用途として、材料に抗ＣＤ３抗体や抗ＣＤ２８抗体を固定したものを用いてリンパ球を培養すれば、培養によりリンパ球が活性化され、培養されたリンパ球をがん免疫療法に用いることができる。
ｄ）アポトーシスを誘導する生理活性物質
アポトーシスを誘導する生理活性物質としてはＦａｓリガンドやＣＤ４０リガンドなどある。
ｅ）増殖、分化因子
増殖、分化因子としては、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、FGF-2、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、オステオネクチン、アンジオポイエチン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）インターフェロン-α、インターフェロン-β、インターフェロン-γ、腫瘍壊死因子-α、腫瘍壊死因子-β、ノッチリガンド（Delta1,Delta2,Delta3,Delta4,Jagged1,Jagged2,DNER,Deltex）などが挙げられる。また、上記タンパク質の組み換え体および機能的に活性をもつ断片を含むタンパク質またはその誘導体、またはその断片、または同じ作用をもつ上記タンパクの遺伝子をもちいることもできる。生理活性物質として増殖因子を含有した材料は、例えば、本発明における組織形成用途として、人工皮膚、塞栓物質、人工血管、人工神経、人工骨、人工気管、人工軟骨、人工粘膜、人工食道、肝再生足場、膵再生足場、心筋再生足場、腎臓再生足場、角膜再生足場、毛髪再生足場などに利用される。また、本発明における細胞培養用途として、神経分化用、ＥＳ細胞培養用、造血幹細胞培養用、神経幹細胞培養用、免疫細胞培養用、間葉系幹細胞培養用、多能性幹細胞培養用、血管内皮細胞培養用、繊維芽細胞培養用、心筋細胞培養用、膵β細胞培養用、肝細胞培養用などに利用される。
ｆ）サイトカイン
サイトカインとして、インターロイキン-1α、インターロイキン-1β、インターロイキン-2、インターロイキン-4、インターロイキン-5、インターロイキン-6 、インターロイキン-6レセプター、インターロイキン-7、インターロイキン-8、インターロイキン-10、インターロイキン-11、インターロイキン-12、インターロイキン-13、インターロイキン-14、インターロイキン-15、インターロイキン-16、インターロイキン-17、インターロイキン-18、顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ、）顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、単球遊走因子（ＭＣＰ−１）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）などが挙げられる。
These antibodies and receptors can be variously selected depending on the purpose. When specifically removing and recovering useful substances and pathogenic substances from blood, cells, inorganic substances, proteins, DNA, lipids, sugars, viruses, etc. are mentioned as targets. Can be For example, in the cell separation application of the present invention, T cells and NK cells can be separated by using an anti-CD2 antibody, T cells can be separated by using an anti-CD3 antibody, and helper T cells can be separated by using an anti-CD4 antibody. Using anti-CD8 antibody, cytotoxic T cells can be separated, anti-CD11a can be used to separate leukocytes, anti-CD11b can be used to separate monocytes, and anti-CD14 antibody can be used to separate monocytes and macrophages, Granulocytes and myeloid cells can be separated using an anti-CD15 antibody, neutrophils or resting NK cells can be separated using an anti-CD16 cell, B cells can be separated using an anti-CD19 antibody, and an anti-CD22 antibody can be used. B cells can be isolated, and naive B cells and memory B cells can be isolated using an anti-CD27 antibody. Can be used to separate activated B cells and activated T cells, anti-CD33 cells can be used to separate monocytes, granulocytes and myeloid cells, anti-CD34 antibodies can be used to separate hematopoietic stem cells, and anti-CD45 antibodies can be used. Can be used to separate leukocytes, NK cells can be separated by using anti-CD56 antibody, megakaryocytes and their precursor cells can be separated by using anti-CD61 antibody, granulocytes can be separated by using anti-CD66 antibody, and anti-CD69 antibody can be separated. When used, activated T cells, activated B cells and NK cells can be separated, erythroblasts and activated lymphoblasts can be separated using an anti-CD71 antibody, and endothelial cells and anti-CD133 can be separated using an anti-CD105 antibody. Neural stem cells can be isolated using antibodies. B cells can be isolated using an anti-immunoglobulin antibody.
b) Those having antithrombotic properties Among the physiologically active substances, those having antithrombotic properties include heparin, thromobodulin, hirudin and the like. Those immobilized on a material can be used, for example, in artificial kidneys and blood adsorbents for blood purification in the present invention, and in artificial blood vessels in tissue formation.
c) Activating cells As activating cells, interferon α, interferon β, interferon γ, interleukin-2, interleukin-4, interleukin-12, anti-CD2 antibody, anti-CD3 antibody, anti-CD4 Antibody, anti-CD11a antibody, anti-CD27 antibody, anti-CD28 antibody, anti-CD44 antibody, anti-CD45 antibody, anti-CD45RA antibody, anti-CD45RO antibody, T cell receptor, major histocompatibility complex (MHC) class I and class II Those in which an antigenic peptide is conjugated to them are exemplified. For example, as a cell culture application in the present invention, if lymphocytes are cultured using a material in which an anti-CD3 antibody or an anti-CD28 antibody is immobilized on the material, the lymphocytes are activated by the culture, and the cultured lymphocytes are transformed into cancer cells. It can be used for immunotherapy.
d) Physiologically active substance that induces apoptosis Examples of the physiologically active substance that induces apoptosis include Fas ligand and CD40 ligand.
e) Proliferation and differentiation factors Proliferation and differentiation factors include vascular endothelial cell growth factor (VEGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), acidic fibroblast growth factor (aFGF), FGF-2, platelet-derived proliferation Factor (PDGF), transforming growth factor-β (TGF-β), osteonectin, angiopoietin, hepatocyte growth factor (HGF), epidermal growth factor (EGF), platelet-derived growth factor (PDGF), insulin-like growth Factor (IGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), ciliary neurotrophic factor (CNTF), glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), nerve growth factor (NGF), leukemia inhibitory factor (LIF), stem cells Growth factor (SCF), bone morphogenetic protein (BMP) interferon-α, interferon-β, interferon-γ, tumor necrosis factor -α, tumor necrosis factor-β, Notch ligands (Delta1, Delta2, Delta3, Delta4, Jagged1, Jagged2, DNER, Deltex) and the like. In addition, a protein or a derivative thereof containing a recombinant and a functionally active fragment of the above protein, or a fragment thereof, or a gene of the above protein having the same action can also be used. Materials containing a growth factor as a physiologically active substance include, for example, artificial skin, embolic substance, artificial blood vessel, artificial nerve, artificial bone, artificial trachea, artificial cartilage, artificial mucosa, artificial esophagus, liver It is used as a regeneration scaffold, pancreatic regeneration scaffold, myocardium regeneration scaffold, kidney regeneration scaffold, cornea regeneration scaffold, hair regeneration scaffold, and the like. In addition, cell culture applications in the present invention include neural differentiation, ES cell culture, hematopoietic stem cell culture, neural stem cell culture, immune cell culture, mesenchymal stem cell culture, pluripotent stem cell culture, and vascular endothelium. It is used for cell culture, fibroblast cell culture, cardiomyocyte culture, pancreatic β cell culture, hepatocyte culture, and the like.
f) Cytokines As cytokines, interleukin-1α, interleukin-1β, interleukin-2, interleukin-4, interleukin-5, interleukin-6, interleukin-6 receptor, interleukin-7, interleukin- 8, interleukin-10, interleukin-11, interleukin-12, interleukin-13, interleukin-14, interleukin-15, interleukin-16, interleukin-17, interleukin-18, granulocyte stimulation Factor (G-CSF), granulocyte / macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), macrophage colony stimulating factor (M-CSF), monocyte chemotactic factor (MCP-1), erythropoietin (EPO), thrombopoietin (TPO), Flk-2 / Flt-3 ligand (FL) It is.
がん細胞を認識するものとして、マンノース−６−リン酸などが挙げられ、例えば、本発明における細胞分離用途として、癌患者の血中に存在するガン細胞を除去し、転移を抑制するための血液浄化カラムに用いることができる。
ｇ）接着因子
接着因子として、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、カテニンやカドヘリン等のカドヘリンファミリー、Ｉ−ＣＡＭなどのＩｇスーパーファミリー、セレクチンファミリー、シアロムチンファミリーやこれらの活性部位を含む組み換え体などがあげられる。
Those that recognize cancer cells include mannose-6-phosphate and the like. For example, as a cell separation application in the present invention, for removing cancer cells present in the blood of a cancer patient and suppressing metastasis It can be used for blood purification columns.
g) Adhesion factor Examples of the adhesion factor include collagen, proteoglycan, fibronectin, laminin, cadherin families such as catenin and cadherin, Ig superfamily such as I-CAM, selectin family, sialomucin family, and recombinants containing these active sites. can give.
用いる生理活性物質は市販の生理活性物質や医薬品を用いても良いし、抗体の場合には、ハイブリドーマから作製してもよい。 As the physiologically active substance to be used, a commercially available physiologically active substance or a pharmaceutical may be used, and in the case of an antibody, it may be produced from a hybridoma.
本発明における複合体とは、物質が複合したものをいい、本発明における複合とは、共有結合、イオン結合（静電相互作用）、疎水性相互作用による結合などのことをいう。カチオン性物質と生理活性物質を複合するには、アミノ基をもったカチオン性物質、特にアミノ基をもったカチオン性ポリマーを利用するのが望ましい。 The complex in the present invention refers to a complex of substances, and the complex in the present invention refers to a covalent bond, an ionic bond (electrostatic interaction), a bond by a hydrophobic interaction, and the like. In order to composite a cationic substance and a physiologically active substance, it is desirable to use a cationic substance having an amino group, particularly a cationic polymer having an amino group.
生理活性物質とカチオン性物質を複合するには、カチオン性物質と生理活性物質を容易に解離しないような結合形式で複合してもよいし、外部刺激で解離できるようなスペーサーを介して結合することにより複合してもよい。外部刺激で解離できるようなスペーサーを介して結合した場合、生理活性物質を材料に固定した際、生理活性物質または生理活性物質と結合した物質、細胞などを外部刺激により回収することができる。 In order to complex the physiologically active substance and the cationic substance, the cationic substance and the physiologically active substance may be combined in a binding form that does not easily dissociate, or may be combined via a spacer that can be dissociated by an external stimulus. It may be combined by doing so. When bound via a spacer that can be dissociated by an external stimulus, when the physiologically active substance is immobilized on the material, the physiologically active substance or a substance or cell bound to the physiologically active substance can be collected by the external stimulus.
複合するには、生理活性物質中にある官能基、例えば、蛋白質の場合はアミノ基などを利用すればよい。アミノ基であれば、スクシンイミド基を導入したカチオン性物質を用いて複合することができる。また、カルボキシル基を有するカチオン性物質であれば、カルボジイミドなどの縮合剤を用いて複合することができる。 For conjugation, a functional group in a physiologically active substance, for example, an amino group in the case of a protein may be used. An amino group can be compounded using a cationic substance into which a succinimide group has been introduced. Further, as long as it is a cationic substance having a carboxyl group, it can be compounded using a condensing agent such as carbodiimide.
生理活性物質とカチオン性物質を外部刺激で解離可能なスペーサーを介して複合する場合に用いられうる外部刺激としては光、熱、ｐＨ、塩濃度、化学反応などがあるが、生理活性物質の安定性などから化学反応により化学結合を切断して生理活性物質が解離できるスペーサーを用いることが好ましく、化学的な結合が切断される反応として、加水分解反応、酸化反応、還元反応、酵素反応などがあげられる。材料がセルロースである場合には、生理活性物質を固定して、セルラーゼを用いて、材料そのものを酵素処理したり、生理活性物質をＤＮＡを介して結合し、ＤＮＡ分解酵素（ＤＮａｓｅ）で酵素処理したり、生理活性物質そのものをパパイン等で消化することができるが、取り扱い性、コスト、水中での安定性や細胞の生存率維持の必要性から還元反応が好ましい。特に、ジスルフィド結合を還元剤による還元反応により切断させる反応は、タンパク質のリフォールディングなど生体内で良く行われる反応であり、生理活性物質を解離する反応として好適である。また、ここで使用する還元剤としてジチオスレイトール、メルカプトエタノール、システイン、還元型グルタチオンなどがあげられる。 External stimuli that can be used when complexing a physiologically active substance and a cationic substance via a spacer that can be dissociated by an external stimulus include light, heat, pH, salt concentration, and chemical reactions. It is preferable to use a spacer capable of dissociating a physiologically active substance by breaking a chemical bond by a chemical reaction due to its properties.Examples of the reaction that breaks the chemical bond include hydrolysis, oxidation, reduction, and enzyme reactions. can give. When the material is cellulose, the bioactive substance is immobilized, and the material itself is treated with an enzyme using cellulase, or the bioactive substance is bound via DNA, and the enzyme treatment is performed with a DNA degrading enzyme (DNase). Alternatively, the physiologically active substance itself can be digested with papain or the like, but a reduction reaction is preferred from the viewpoint of handleability, cost, stability in water, and necessity of maintaining cell viability. In particular, a reaction of cleaving a disulfide bond by a reduction reaction with a reducing agent is a reaction often performed in a living body such as protein refolding, and is suitable as a reaction for dissociating a physiologically active substance. Examples of the reducing agent used here include dithiothreitol, mercaptoethanol, cysteine, and reduced glutathione.
カチオン性物質にジスルフィド結合を介して生理活性物質を複合する方法としては、メルカプト基同士の酸化反応やあるいは下記のようなジスルフィド交換反応を利用してジスルフィド結合を形成させる方法をとる。ジスルフィド交換反応を利用する方法としては、ピリジルジスルフィド基とメルカプト基の交換反応を用いるのが反応性の点から好ましく、ピリジルジスルフィド基やメルカプト基を生理活性物質およびカチオン性物質に導入して結合させる。この際、通常架橋剤を利用する。カチオン性物質にピリジルジスルフィド基を導入した場合は、生理活性物質にピリジルジスルフィド基を導入して還元し、メルカプト基を導入したものや生理活性物質が抗体である場合は、抗体をペプシンで消化し、抗体の可変部位のみに精製した後、生成するメルカプト基を用いて結合することができる。生理活性物質にピリジルジスルフィド基を導入して、還元する場合、生理活性物質が抗体である場合は、抗体自体の還元による失活を防ぐためには酢酸緩衝液中などで還元することにより抗体自身の還元を抑えることができる。カチオン性物質にメルカプト基を導入した場合は、生理活性物質にピリジルジスルフィド基を導入したものと反応させればよい。 As a method of complexing a physiologically active substance with a cationic substance via a disulfide bond, a method of forming a disulfide bond using an oxidation reaction between mercapto groups or a disulfide exchange reaction as described below is used. As a method using a disulfide exchange reaction, it is preferable to use an exchange reaction between a pyridyl disulfide group and a mercapto group from the viewpoint of reactivity, and a pyridyl disulfide group or a mercapto group is introduced into a physiologically active substance and a cationic substance to be bound. . At this time, a crosslinking agent is usually used. When a pyridyl disulfide group is introduced into a cationic substance, a pyridyl disulfide group is introduced into a physiologically active substance to reduce the substance, and when a mercapto group is introduced or the physiologically active substance is an antibody, the antibody is digested with pepsin. After purification to only the variable site of the antibody, it can be bound using the resulting mercapto group. When a pyridyl disulfide group is introduced into a physiologically active substance and reduced, when the physiologically active substance is an antibody, in order to prevent inactivation by reduction of the antibody itself, the antibody itself is reduced by reducing it in an acetate buffer or the like. Reduction can be suppressed. When a mercapto group is introduced into a cationic substance, it may be reacted with a substance having a pyridyl disulfide group introduced into a physiologically active substance.
生理活性物質やカチオン性物質にメルカプト基やピリジルジスルフィド基を導入する場合に、スクシンイミド基を有する架橋剤を利用する場合は、生理活性物質中にアミノ基があればよく、カチオン性物質の場合はアミノ基をもったものがよい。 When introducing a mercapto group or a pyridyl disulfide group into a physiologically active substance or a cationic substance, when using a cross-linking agent having a succinimide group, an amino group may be present in the physiologically active substance, and in the case of a cationic substance, Those having an amino group are preferred.
上記のようなジスルフィド結合を介した複合に利用できるような架橋剤としては、カチオン性物質同士あるいは生理活性物質同士の結合を防ぐため二種類の違った官能基と反応する活性基をもつ架橋剤を使用することが好ましく、活性基として、アミノ基と反応するＮ−ヒドロキシスクシンイミド基、イミドエステル基、ニトロアリールハライド基、イミダゾリルカルバミン酸基、メルカプト基と反応するマレイミド基、ピリジルジスルフィド基、チオフタルイミド基、活性化ハロゲン基、光化学反応により架橋するフェニルアジド基、ジアゾカルベン基、などを持つような架橋剤を利用することができる。なかでも、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基とピリジルジスルフィド基を持つような架橋剤を利用することにより、アミノ基を有するカチオン性物質や抗体などのアミノ基を有する生理活性物質にピリジルジスルフィド基を導入できる。また、このピリジルジスルフィド基を還元剤により還元することによりメルカプト基に変換できる。このような架橋剤として、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート、スクシンイミジル−６−［３’−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエートや水溶性のスルフォスクシンイミジル−６−［３’−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエートなどが挙げられる。水に不溶性の架橋剤を用いる場合は、ジメチルスルホキシドやメタノールなどの可溶性の有機溶媒に溶解後、水系の反応液に添加することにより利用できる。 As a cross-linking agent that can be used for a complex via a disulfide bond as described above, a cross-linking agent having an active group that reacts with two different functional groups to prevent bonding between cationic substances or biologically active substances It is preferable to use an N-hydroxysuccinimide group, an imide ester group, a nitroaryl halide group, an imidazolyl carbamic acid group, a maleimide group that reacts with a mercapto group, a pyridyl disulfide group, or a thiophthalimide as an active group. A crosslinking agent having a group, an activated halogen group, a phenylazide group, a diazocarbene group, or the like, which crosslinks by a photochemical reaction, can be used. In particular, by using a crosslinking agent having an N-hydroxysuccinimide group and a pyridyl disulfide group, a pyridyl disulfide group can be introduced into a cationic substance having an amino group or a physiologically active substance having an amino group such as an antibody. The pyridyl disulfide group can be converted to a mercapto group by reducing with a reducing agent. Examples of such a crosslinking agent include N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) -propionate, succinimidyl-6- [3 ′-(2-pyridyldithio) -propionamido] hexanoate and water-soluble sulfosuccinimidyl. -6- [3 '-(2-pyridyldithio) -propionamide] hexanoate and the like. When a water-insoluble cross-linking agent is used, it can be used by dissolving it in a soluble organic solvent such as dimethyl sulfoxide or methanol and then adding it to an aqueous reaction solution.
メルカプト基を導入する場合は、２−イミノチオランを利用すれば、一段階でメルカプト基を導入できる。 When a mercapto group is introduced, the use of 2-iminothiolane allows the mercapto group to be introduced in one step.
生理活性物質へのピリジルジスルフィド基の導入率は生理活性物質１モルあたり１モル以上であることが必要であるが、導入率を上げるためにピリジルジスルフィド化剤の仕込量を上げると失活したり、凝集したりするおそれがある。望ましくは仕込量はリガンド１モルあたり５０モル以下が望ましい。 The rate of introduction of the pyridyl disulfide group into the physiologically active substance needs to be 1 mol or more per mol of the physiologically active substance. May be aggregated. Desirably, the charged amount is 50 mol or less per 1 mol of ligand.
本発明における血液浄化用途とは、腎不全患者の治療に用いられる人工透析、腎不全、高脂血症、敗血漿など血中に病因物質が混入した患者における血液吸着療法などのことをいう。細胞分離用途では、患者血中から病因物質となる細胞を分離したり、患者および健常者の血液や組織から治療に必要な細胞を分離したりする。細胞培養用途では、患者および健常者の血液や組織から採取した細胞を培養して、それを治療や分析、タンパク生産に用いたりする。組織形成用途では、材料を埋め込んで、血管などの組織を体内で形成させたり、体外で培養して組織を形成してから埋め込んだりして用いられる。 The blood purification use in the present invention refers to artificial dialysis, renal failure, hyperlipidemia, blood adsorption therapy and the like in patients with pathogenic substances mixed in blood such as septic plasma used for treatment of patients with renal failure. In the cell separation application, cells that are pathogenic substances are separated from the blood of a patient, and cells necessary for treatment are separated from blood or tissues of a patient and a healthy person. In cell culture applications, cells collected from blood and tissues of patients and healthy persons are cultured and used for treatment, analysis, and protein production. In the tissue formation application, a material is implanted to form a tissue such as a blood vessel in the body, or a tissue is formed by culturing the body outside the body and then implanted.
生理活性物質を含む材料を医療用として提供する場合は、滅菌されている必要がある。本発明の場合、生理活性物質とカチオン性物質の複合体とアニオン性表面をもつ材料は別々に滅菌され、その後、無菌的に混合することにより製造される。 When a material containing a physiologically active substance is provided for medical use, it must be sterilized. In the case of the present invention, the complex of the physiologically active substance and the cationic substance and the material having the anionic surface are separately sterilized, and then manufactured by aseptically mixing.
生理活性物質とカチオン性物質の複合体は医薬品と同様、無菌ろ過により滅菌される。滅菌された生理活性物質とカチオン性物質の複合体は水溶液の状態でもよいし、滅菌後、凍結乾燥されたものでもよい。凍結乾燥されたものであれば、材料と混合する前に滅菌済みの生理食塩水などで溶解してから用いられる。 The complex of the physiologically active substance and the cationic substance is sterilized by aseptic filtration as in the case of pharmaceuticals. The sterilized complex of a physiologically active substance and a cationic substance may be in the form of an aqueous solution, or may be sterilized and freeze-dried. If freeze-dried, it is used after dissolving with sterilized physiological saline or the like before mixing with the material.
アニオン性表面をもつ材料の滅菌を行う場合は、蒸気滅菌、放射線滅菌、エチレンオキサイド滅菌などが医療用の材料の滅菌においては好適に用いられる。 When sterilizing a material having an anionic surface, steam sterilization, radiation sterilization, ethylene oxide sterilization and the like are preferably used in sterilizing medical materials.
本発明の材料を利用すれば、上記で示したようなターゲットとなる有用物質や病因物質を生理活性物質により捕捉でき、さらに、外部刺激により生理活性物質を材料から脱離させることにより、捕捉した有用物質や病因物質を回収する事が可能である。また、ターゲット物質を捕捉あるいは回収する際に使用する溶媒として、様々なｐＨ値のリン酸、酢酸、クエン酸などの緩衝液をもちいることができ、さらに緩衝液の中にウシ血清アルブミンや抗体などのタンパク質あるいはカチオン性、アニオン性などのポリマーなどを含有していても良い。 By utilizing the material of the present invention, a useful substance or a pathogenic substance serving as a target as shown above can be captured by a physiologically active substance, and further, the biologically active substance is captured by detaching the physiologically active substance from the material by external stimulus. It is possible to collect useful substances and pathogenic substances. In addition, buffers such as phosphoric acid, acetic acid, and citric acid having various pH values can be used as a solvent used when capturing or recovering the target substance, and bovine serum albumin or antibody can be contained in the buffer. Or a polymer such as a cationic or anionic polymer.
細胞を回収する際は全血と作用させてもよいし、血漿分画や単核球分画などにした後、作用させてもよい。 When recovering cells, the cells may be allowed to act on whole blood, or may be allowed to act after plasma fractionation or mononuclear cell fractionation.
以上のような方法で、回収した有用物質、病因物質を分析に用いることが可能である。また、細胞の場合はそれを培養し、分析や治療などに利用できる。例えば、生理活性物質として抗ＣＤ４抗体を使用し、この生理活性物質を固定した本発明の材料に血液を通してＣＤ４陽性のＴ細胞を捕捉し、ジチオスレイトールなどの還元剤で生理活性物質を脱離することにより、捕捉した細胞を大量に回収し、この細胞に様々な刺激を加えて活性化させ体内に戻すことにより、癌、アレルギー、感染症、臓器移植、あるいは自己免疫疾患の治療やワクチンとしてもちいることができる。 With the method as described above, the collected useful substances and pathogenic substances can be used for analysis. In the case of cells, they can be cultured and used for analysis and treatment. For example, an anti-CD4 antibody is used as a physiologically active substance, CD4 positive T cells are captured by passing blood through the material of the present invention on which the physiologically active substance is immobilized, and the physiologically active substance is desorbed with a reducing agent such as dithiothreitol. By recovering a large amount of captured cells and activating them by applying various stimuli to the body, the cells can be used as a treatment or vaccine for cancer, allergies, infectious diseases, organ transplantation, or autoimmune diseases. You can use it.
また、例えば、生理活性物質として抗ＣＤ３４抗体を使用し、この生理活性物質を固定した本発明の材料に末梢血や臍帯血を通して、造血幹細胞を捕捉し、ジチオスレイトールなどの還元剤で生理活性物質を脱離することにより、造血幹細胞を大量に回収し、回収した造血幹細胞を培養して輸血医療に用いたり、様々な組織幹細胞に分化させることにより、肝疾患や神経疾患、血管傷害などの細胞療法に用いることができる。 In addition, for example, an anti-CD34 antibody is used as a physiologically active substance, hematopoietic stem cells are captured through peripheral blood or umbilical cord blood in the material of the present invention on which the physiologically active substance is immobilized, and physiologically active with a reducing agent such as dithiothreitol. Hematopoietic stem cells are recovered in large quantities by detaching the substance, and the recovered hematopoietic stem cells are cultured and used for blood transfusion medicine, or differentiated into various tissue stem cells, and used for liver disease, neurological disease, vascular injury, etc. Can be used for cell therapy.
また、例えば、生理活性物質として抗ＣＤ１３３抗体を使用し、この生理活性物質を固定した本発明の材料に末梢血や臍帯血を通して、神経幹細胞を捕捉し、ジチオスレイトールなどの還元剤で生理活性物質を脱離することにより、神経幹細胞を大量に回収し、回収した神経幹細胞を培養して神経幹細胞移植に用いたり、様々な神経細胞に分化させることにより、パーキンソン病やアルツハイマー病など神経疾患、脳梗塞により壊死した神経細胞の修復などの細胞療法に用いることができる。 Further, for example, an anti-CD133 antibody is used as a physiologically active substance, neural stem cells are captured through peripheral blood or umbilical cord blood through the material of the present invention on which the physiologically active substance is immobilized, and physiologically active with a reducing agent such as dithiothreitol. By detaching the substance, a large amount of neural stem cells are collected, and the collected neural stem cells are cultured and used for neural stem cell transplantation, and differentiated into various nerve cells, thereby cultivating neurological diseases such as Parkinson's disease and Alzheimer's disease. It can be used for cell therapy such as repair of nerve cells necrotic due to cerebral infarction.
以下に実施例を示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。 Examples are shown below, but the present invention is not limited to these.
＜実施例１＞
１．メルカプト基を持つポリエチレンイミン誘導体の作製
１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にポリエチレンイミン（数平均分子量１００００、和光純薬製）を５ｍｇ／ｍｌとなるように溶解した。この溶液３ｍｌに、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ピアース社製、以下ＳＰＤＰ）を２０ｍＭになるように溶解したジメチルスルホキシド溶液を０．５ｍｌ添加し、室温で３０時間撹拌した。反応させた溶液をＰＤ−１０カラム（ファルマシア社製）で高分子量分画に精製した。
<Example 1>
1. Preparation of polyethyleneimine derivative having mercapto group Polyethyleneimine (number average molecular weight 10,000, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to a 20 mM phosphate buffer (pH 7.5) containing 150 mM NaCl and 1 mM disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA). It dissolved so that it might be set to 5 mg / ml. To 3 ml of this solution was added 0.5 ml of a dimethyl sulfoxide solution in which N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) -propionate (Pierce, SPDP) was dissolved to a concentration of 20 mM, and the mixture was stirred at room temperature for 30 hours. did. The reacted solution was purified to a high molecular weight fraction using a PD-10 column (Pharmacia).
合成したＳＰＤＰ化ポリエチレンイミンを２５ｍＭのジチオスレイトール（ピアース社製、以下ＤＴＴ）を含むリン酸緩衝液中で還元反応を行った後、ＰＤ−１０カラム（ファルマシア社製）で高分子量分画に精製することにより、メルカプト基を有するポリエチレンイミン誘導体（以下、ＨＳ−ＰＥＩ）を合成した。還元反応について、反応により生成するピリジン−２−チオンの吸収（３４３ｎｍ）を測定することにより、メルカプト基の導入量を測定したところ、ポリエチレンイミン１分子当たり５モルのメルカプト基が導入されていることが分かった。
２．ヒト免疫グロブリンＧのＳＰＤＰ化
ＮａＣｌを１５０ｍＭ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に５ｍｇ／ｍｌに溶解した精製ヒト免疫グロブリンＧ（シグマ社製）にＳＰＤＰを２０ｍＭに溶解したジメチルスルホキシド溶液をヒト免疫グロブリンＧ１モルに対して１０モル添加し、室温で３０分反応させた後、ＰＤ−１０カラム（ファルマシア社製）で高分子量分画に精製した。ヒト免疫グロブリンＧ１モルあたりのＳＰＤＰ導入量は４．２モルであった。
３．ジスルフィド基を介してヒト免疫グロブリンＧを複合したポリエチレンイミンの合成
１．で得られたＨＳ−ＰＥＩを２．１ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液と２．で得られたＳＰＤＰ化ヒト免疫グロブリンＧを１ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液をモル比で１：０．５となるように混合し、室温で１４時間反応させ、ヒト免疫グロブリンＧをポリエチレンイミンにジスルフィド結合を介して複合した。複合化は反応液を高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣ、測定条件は、カラム：東ソーＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷＸＬ、溶出液：０．５Ｍ酢酸バッファー、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ）を用いて分析し、高分子量側にシフトすることにより確認した。さらに、ヒト免疫グロブリンＧ−ポリエチレンイミン複合体の溶液にＤＴＴを２５ｍＭとなるように添加して複合体を還元後再びＨＰＬＣ測定すると、もとのヒト免疫グロブリンＧとポリエチレンイミンのピークになることが確認され、複合体が還元により分離できることがわかった。得られたジスルフィド結合を介して複合されたポリエチレンイミン化ヒト免疫グロブリンＧは無菌ろ過滅菌により滅菌した。
The synthesized SPDP-modified polyethyleneimine was subjected to a reduction reaction in a phosphate buffer containing 25 mM dithiothreitol (Pierce, hereinafter DTT), and then subjected to high molecular weight fractionation using a PD-10 column (Pharmacia). By purifying, a polyethyleneimine derivative having a mercapto group (hereinafter, HS-PEI) was synthesized. When the amount of mercapto groups introduced was measured by measuring the absorption (343 nm) of pyridine-2-thione generated by the reaction in the reduction reaction, it was found that 5 mol of mercapto groups were introduced per one molecule of polyethyleneimine. I understood.
2. SPDP conversion of human immunoglobulin G A dimethyl sulfoxide solution obtained by dissolving SPDP at 20 mM in purified human immunoglobulin G (manufactured by Sigma) dissolved in 20 mM phosphate buffer (pH 7.5) containing 150 mM NaCl was used. After 10 moles were added to 1 mole of immunoglobulin G and reacted at room temperature for 30 minutes, the mixture was purified to a high molecular weight fraction using a PD-10 column (Pharmacia). The amount of SPDP introduced per mol of human immunoglobulin G was 4.2 mol.
3. Synthesis of polyethyleneimine complexed with human immunoglobulin G via a disulfide group 1. a phosphate buffer containing 2.1 mg / ml of HS-PEI obtained in The phosphate buffer containing 1 mg / ml of SPDP-converted human immunoglobulin G obtained in the above was mixed at a molar ratio of 1: 0.5, and reacted at room temperature for 14 hours. Complexed via disulfide bond. For the complexation, the reaction solution is analyzed using high performance liquid chromatography (hereinafter, HPLC, measurement conditions are as follows: column: Tosoh TSKgelG3000SWXL, eluent: 0.5 M acetate buffer, flow rate: 0.5 ml / min), and the Confirmed by shifting. Furthermore, when DTT was added to the solution of the human immunoglobulin G-polyethyleneimine complex to a concentration of 25 mM and the complex was reduced, and HPLC measurement was performed again, the peaks of the original human immunoglobulin G and polyethyleneimine could be obtained. It was confirmed that the complex could be separated by reduction. The obtained polyethyleneiminated human immunoglobulin G conjugated via a disulfide bond was sterilized by aseptic filtration sterilization.
＜実施例２＞
１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にポリエチレンイミン（数平均分子量１００００、和光純薬製）を５ｍｇ／ｍｌとなるように溶解した。この溶液３ｍｌに、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸（ピアース社製）を２０ｍＭになるように溶解したジメチルスルホキシド溶液を０．５ｍｌ添加し、室温で３０時間撹拌した。反応させた溶液をＰＤ−１０カラム（ファルマシア社製）で高分子量分画に精製した。
<Example 2>
Polyethyleneimine (number average molecular weight 10,000, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved in a 20 mM phosphate buffer (pH 7.5) containing 150 mM NaCl and 1 mM EDTA to a concentration of 5 mg / ml. To 3 ml of this solution, 0.5 ml of a dimethyl sulfoxide solution in which succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylic acid (manufactured by Pierce) was dissolved to a concentration of 20 mM was added, and the mixture was stirred at room temperature for 30 hours. . The reacted solution was purified to a high molecular weight fraction using a PD-10 column (Pharmacia).
上記で得られたマレイミド化ポリエチレンイミンを２．１ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液とヒト免疫グロブリンＧを１ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液をモル比で１：１となるように混合し、室温で１４時間反応させ混合し、ヒト免疫グロブリンＧをポリエチレンイミンと複合した。複合化は反応液をＨＰＬＣを用いて分析し、高分子量側にシフトすることにより確認した。得られたポリエチレンイミン化ヒト免疫グロブリンＧは無菌ろ過滅菌により滅菌した。 The phosphate buffer containing 2.1 mg / ml of the maleimidated polyethyleneimine obtained above and the phosphate buffer containing 1 mg / ml of human immunoglobulin G were mixed at a molar ratio of 1: 1. After reacting for 14 hours and mixing, human immunoglobulin G was conjugated with polyethyleneimine. Complexation was confirmed by analyzing the reaction solution using HPLC and shifting to a higher molecular weight side. The obtained polyethyleneimylated human immunoglobulin G was sterilized by aseptic filtration sterilization.
＜実施例３＞
１．ポリスルホン（テイジンアモコ社製”ユーデル”（登録商標）Ｐ−３５００）１８重量部、ポリビニルピロリドン（ＢＡＳＦ社製”Ｋ３０”（登録商標））９重量部をＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド７２重量部、水１重量部に加え、９０℃、１４時間加熱溶解した。この溶液を０．１ｍｍスペーサー付きのガラス板に塗布し、ドクターブレードにて溶液を引き延ばしたものを水中にいれて、凝固させ、ポリスルホン／ポリビニルピロリドンブレンドからなる平膜状の材料を作製した。
<Example 3>
1. 18 parts by weight of polysulfone (“Udel” (registered trademark) P-3500 manufactured by Teijin Amoko), 9 parts by weight of polyvinylpyrrolidone (“K30” (registered trademark) manufactured by BASF) are 72 parts by weight of N, N-dimethylacetamide, and water is used. In addition to 1 part by weight, the mixture was heated and dissolved at 90 ° C. for 14 hours. This solution was applied to a glass plate having a 0.1 mm spacer, and the solution obtained by stretching the solution with a doctor blade was put into water and solidified to prepare a flat film-like material composed of a polysulfone / polyvinylpyrrolidone blend.
２．上記、ポリスルホン／ポリビニルピロリドンブレンド材料を十分水洗した後、１ｗｔ％のデキストラン硫酸（分子量５０万、和光純薬製）水溶液に浸漬して、２５ｋＧｙにてγ線照射して、表面に硫酸基をもつ平膜を作製した（滅菌を兼ねる）。 2. After thoroughly washing the above-mentioned polysulfone / polyvinylpyrrolidone blend material with water, it is immersed in a 1 wt% aqueous solution of dextran sulfate (molecular weight: 500,000, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and irradiated with γ rays at 25 kGy to have a sulfate group on the surface. A flat membrane was prepared (also used for sterilization).
３．２．で作製したアニオン性平膜１ｃｍ2を実施例１で合成したジスルフィド基を介してヒト免疫グロブリンＧを複合したポリエチレンイミンを０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液に室温で２時間浸漬させた。２時間後のリン酸緩衝液に含まれるヒト免疫グロブリンＧの吸光度（２８０ｎｍ）を測定したところ、吸光度が減少し、ヒト免疫グロブリンＧ−ポリエチレンイミン複合体がアニオン性平膜に固定されていることが確認された。また、この膜を２５ｍＭのジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液で還元反応し、脱離されたヒト免疫グロブリン量をＨＰＬＣおよび吸光度で測定したところ、還元処理により７．７μｇ／ｃｍ2のヒト免疫グロブリンＧがアニオン性平膜から脱離された。 3.2. 1 cm 2 of the anionic flat membrane prepared in the above was immersed in a phosphate buffer containing 0.2 mg / ml of polyethyleneimine conjugated with human immunoglobulin G via the disulfide group synthesized in Example 2 at room temperature for 2 hours. When the absorbance (280 nm) of the human immunoglobulin G contained in the phosphate buffer solution after 2 hours was measured, the absorbance decreased, and the human immunoglobulin G-polyethyleneimine complex was fixed to the anionic flat membrane. Was confirmed. Further, this membrane was subjected to a reduction reaction with a phosphate buffer containing 25 mM dithiothreitol, and the amount of the desorbed human immunoglobulin was measured by HPLC and absorbance. As a result, 7.7 μg / cm 2 of human immunoglobulin was obtained by the reduction treatment. Globulin G was detached from the anionic flat membrane.
＜実施例４＞
実施例３の２．で作製したアニオン性平膜１ｃｍ2を実施例２で合成したヒト免疫グロブリンＧを複合したポリエチレンイミンを０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液に室温で２時間浸漬させた。２時間後のリン酸緩衝液に含まれるヒト免疫グロブリンＧの吸光度（２８０ｎｍ）を測定したところ、吸光度が減少し、ヒト免疫グロブリンＧ−ポリエチレンイミン複合体がアニオン性平膜に固定されていることが確認された。
<Example 4>
Example 3-2. 1 cm 2 of the anionic flat membrane prepared in Example 2 was immersed in a phosphate buffer containing 0.2 mg / ml of polyethyleneimine conjugated with human immunoglobulin G synthesized in Example 2 at room temperature for 2 hours. When the absorbance (280 nm) of the human immunoglobulin G contained in the phosphate buffer solution after 2 hours was measured, the absorbance decreased, and the human immunoglobulin G-polyethyleneimine complex was fixed to the anionic flat membrane. Was confirmed.
＜比較例１＞
実施例３の１．で得られた表面にポリビニルピロリドン層を有するポリスルホン製平膜に、実施例１で合成したジスルフィド基を介してヒト免疫グロブリンＧを複合したポリエチレンイミンを０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液に室温で２時間浸漬させたが、ヒト免疫グロブリンＧは平膜に固定されなかった。
<Comparative Example 1>
Example 3 of 1. The polysulfone flat membrane having a polyvinylpyrrolidone layer on the surface obtained in the above was placed in a phosphate buffer solution containing 0.2 mg / ml of polyethyleneimine, to which human immunoglobulin G was conjugated via the disulfide group synthesized in Example 1, at room temperature. For 2 hours, the human immunoglobulin G was not fixed to the flat membrane.
＜比較例２＞
実施例３の２．で作製したアニオン性平膜にヒト免疫グロブリンＧを０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液に室温で２時間浸漬させたが、ヒト免疫グロブリンＧは平膜に固定されなかった。
<Comparative Example 2>
Example 3-2. Was immersed in a phosphate buffer containing 0.2 mg / ml of human immunoglobulin G at room temperature for 2 hours, but the human immunoglobulin G was not fixed to the flat membrane.
＜実施例５＞
表面に硫酸基をもつ東レ製繊維状イオン交換体“アイオネックス”０．１ｇを２５ｋＧｙのγ線で滅菌した後、ヒト血漿またはヒトアルブミンで親水化した後、実施例１で合成したジスルフィド基を介してヒト免疫グロブリンＧを複合したポリエチレンイミンを０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液に室温で２時間浸漬させた。２時間後のリン酸緩衝液に含まれるヒト免疫グロブリンＧの吸光度（２８０ｎｍ）を測定したところ、吸光度が減少し、ヒト免疫グロブリンＧ−ポリエチレンイミン複合体が繊維に固定されていることが確認された。また、この繊維を２５ｍＭのジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液で還元反応し、脱離されたヒト免疫グロブリン量をＨＰＬＣおよび吸光度で測定したところ、還元処理により１０μｇ／０．１ｇ繊維のヒト免疫グロブリンＧが繊維から脱離された。
<Example 5>
0.1 g of Toray's fibrous ion exchanger "Ionex" having a sulfate group on the surface was sterilized with 25 kGy of gamma rays, hydrophilized with human plasma or human albumin, and then the disulfide group synthesized in Example 1 was obtained. Immersed in a phosphate buffer containing 0.2 mg / ml of polyethyleneimine complexed with human immunoglobulin G at room temperature for 2 hours. When the absorbance (280 nm) of human immunoglobulin G contained in the phosphate buffer solution after 2 hours was measured, the absorbance decreased, and it was confirmed that the human immunoglobulin G-polyethyleneimine complex was fixed to the fiber. Was. The fiber was subjected to a reduction reaction with a phosphate buffer containing 25 mM dithiothreitol, and the amount of the desorbed human immunoglobulin was measured by HPLC and absorbance. Globulin G was detached from the fiber.
＜実施例６＞
２５ｋＧｙでγ線滅菌された表面に硫酸基を有するＰＭＭＡ中空糸膜からなる東レ製“フィルトライザー”人工腎臓（ＢＧ）を解体して中空糸膜を取り出し、中空糸膜を３６本束ね、中空糸膜中空部を閉塞しないようにエポキシ系ポッティング剤で両末端をモジュールケースに固定し、ミニモジュールを作製した。該ミニモジュールの直径は約７ｍｍ、長さは約１０ｃｍである。作製したミニモジュールの中空糸内部に実施例１で合成したジスルフィド基を介してヒト免疫グロブリンＧを複合したポリエチレンイミンを０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液１．５ｍｌを室温で２時間灌流した。２時間後のリン酸緩衝液に含まれるヒト免疫グロブリンＧの吸光度（２８０ｎｍ）を測定したところ、吸光度が減少し、ヒト免疫グロブリンＧ−ポリエチレンイミン複合体が中空糸内部に固定されていることが確認された。得られたヒト免疫グロブリンＧ固定化中空糸膜は、分子量６０００のポリエチレングリコールで親水化処理した。この中空糸内部を２５ｍＭのジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液で灌流して中空糸内表面を還元し、脱離されたヒト免疫グロブリン量をＨＰＬＣおよび吸光度で測定したところ、還元処理により１０μｇのヒト免疫グロブリンＧがミニモジュールから脱離された。
<Example 6>
A Toray “Filtrizer” artificial kidney (BG) made of PMMA hollow fiber membrane having a sulfate group on the surface sterilized with 25 kGy by γ-ray is disassembled, and the hollow fiber membrane is taken out. Both ends were fixed to the module case with an epoxy potting agent so as not to block the hollow portion of the fiber membrane, thereby producing a mini-module. The mini-module has a diameter of about 7 mm and a length of about 10 cm. 1.5 ml of a phosphate buffer containing 0.2 mg / ml of polyethyleneimine conjugated with human immunoglobulin G via the disulfide group synthesized in Example 1 was perfused at room temperature for 2 hours inside the hollow fiber of the prepared minimodule. . When the absorbance (280 nm) of the human immunoglobulin G contained in the phosphate buffer solution after 2 hours was measured, the absorbance decreased, and it was found that the human immunoglobulin G-polyethyleneimine complex was fixed inside the hollow fiber. confirmed. The obtained human immunoglobulin G-immobilized hollow fiber membrane was hydrophilized with polyethylene glycol having a molecular weight of 6000. The inside of the hollow fiber was perfused with a phosphate buffer containing 25 mM dithiothreitol to reduce the inner surface of the hollow fiber, and the amount of human immunoglobulin desorbed was measured by HPLC and absorbance. Human immunoglobulin G has been detached from the minimodule.
＜実施例７＞
ヘパリン固定化セルロースビーズ（アマシャム製）０．１ｇをγ線で滅菌した後、実施例２で合成したヒト免疫グロブリンＧを複合したポリエチレンイミンを０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液１．５ｍｌに室温で２時間浸漬させた。２時間後のリン酸緩衝液に含まれるヒト免疫グロブリンＧの吸光度（２８０ｎｍ）を測定したところ、吸光度が減少し、ヒト免疫グロブリンＧ−ポリエチレンイミン複合体が０．３ｍｇ固定されたヘパリンビーズを作製できた。
<Example 7>
After 0.1 g of heparin-immobilized cellulose beads (manufactured by Amersham) was sterilized with γ-ray, 1.5 ml of phosphate buffer containing 0.2 mg / ml of polyethyleneimine conjugated with human immunoglobulin G synthesized in Example 2 was added. It was immersed at room temperature for 2 hours. When the absorbance (280 nm) of the human immunoglobulin G contained in the phosphate buffer solution after 2 hours was measured, the absorbance decreased, and heparin beads in which 0.3 mg of the human immunoglobulin G-polyethyleneimine complex was immobilized were prepared. did it.
＜実施例８＞
硫酸化セルロファインビーズ（チッソ製）０．１ｇをγ線で滅菌した後、実施例１で合成したヒト免疫グロブリンＧを複合したポリエチレンイミンを０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液１．５ｍｌに室温で２時間浸漬させた。２時間後のリン酸緩衝液に含まれるヒト免疫グロブリンＧの吸光度（２８０ｎｍ）を測定したところ、吸光度が減少し、ヒト免疫グロブリンＧ−ポリエチレンイミン複合体が０．３ｍｇ固定された硫酸化セルロファインビーズを作製できた。このビーズを２５ｍＭのジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液に浸漬してビーズ表面を還元し、脱離されたヒト免疫グロブリン量をＨＰＬＣおよび吸光度で測定したところ、還元処理により１００μｇヒト免疫グロブリンＧがビーズから脱離された。
Example 8
After sterilizing 0.1 g of sulfated cellulofine beads (manufactured by Chisso) with γ-ray, 1.5 ml of phosphate buffer containing 0.2 mg / ml of polyethyleneimine conjugated with human immunoglobulin G synthesized in Example 1 was added. It was immersed at room temperature for 2 hours. When the absorbance (280 nm) of human immunoglobulin G contained in the phosphate buffer solution after 2 hours was measured, the absorbance decreased, and the sulfated cellulofine in which 0.3 mg of the human immunoglobulin G-polyethyleneimine complex was immobilized. Beads could be made. The beads were immersed in a phosphate buffer containing 25 mM dithiothreitol to reduce the surface of the beads, and the amount of desorbed human immunoglobulin was measured by HPLC and absorbance. It was detached from the beads.
＜実施例９＞
酢酸でアミノ基末端の封鎖された６，６−ナイロンからなるナイロン長繊維不織布０．１ｇをオートクレーブで滅菌した後、実施例１で合成したヒト免疫グロブリンＧを複合したポリエチレンイミンを０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液１．５ｍｌに室温で２時間浸漬させた。２時間後のリン酸緩衝液に含まれるヒト免疫グロブリンＧの吸光度（２８０ｎｍ）を測定したところ、吸光度が減少し、ヒト免疫グロブリンＧ−ポリエチレンイミン複合体が０．２ｍｇ固定されたナイロン繊維を作製できた。このナイロン繊維を２５ｍＭのメルカプトエタノールを含むリン酸緩衝液に浸漬して繊維表面を還元し、脱離されたヒト免疫グロブリン量をＨＰＬＣおよび吸光度で測定したところ、還元処理により５０μｇヒト免疫グロブリンＧが繊維から脱離された。
<Example 9>
After autoclaving 0.1 g of a nylon long-fiber nonwoven fabric composed of 6,6-nylon whose amino group ends were blocked with acetic acid, 0.2 mg / polyethyleneimine synthesized with human immunoglobulin G synthesized in Example 1 was added. The resultant was immersed in 1.5 ml of a phosphate buffer solution containing 2 ml at room temperature for 2 hours. When the absorbance (280 nm) of human immunoglobulin G contained in the phosphate buffer solution after 2 hours was measured, the absorbance decreased, and a nylon fiber in which 0.2 mg of the human immunoglobulin G-polyethyleneimine complex was fixed was prepared. did it. The nylon fiber was immersed in a phosphate buffer containing 25 mM mercaptoethanol to reduce the fiber surface, and the amount of the released human immunoglobulin was measured by HPLC and absorbance. Desorbed from fiber.
＜実施例１０＞
酢酸でアミノ基末端の封鎖された６，６−ナイロンにポリビニルピロリドンが５重量％ブレンドされた親水化ナイロン長繊維不織布０．１ｇをγ線で滅菌した後、実施例１で合成したヒト免疫グロブリンＧを複合したポリエチレンイミンを０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液１．５ｍｌに室温で２時間浸漬させた。２時間後のリン酸緩衝液に含まれるヒト免疫グロブリンＧの吸光度（２８０ｎｍ）を測定したところ、吸光度が減少し、ヒト免疫グロブリンＧ−ポリエチレンイミン複合体が０．１５ｍｇ固定されたナイロン繊維を作製できた。このナイロン繊維を２５ｍＭのメルカプトエタノールを含むリン酸緩衝液に浸漬して繊維表面を還元し、脱離されたヒト免疫グロブリン量をＨＰＬＣおよび吸光度で測定したところ、還元処理により７０μｇヒト免疫グロブリンＧが繊維から脱離された。
<Example 10>
0.1 g of a hydrophilic nylon long-fiber nonwoven fabric in which 5% by weight of polyvinylpyrrolidone is blended with 6,6-nylon whose amino group ends are blocked with acetic acid is sterilized with γ-rays, and then the human immunoglobulin synthesized in Example 1 is used. It was immersed in 1.5 ml of a phosphate buffer containing 0.2 mg / ml of polyethyleneimine in which G was conjugated at room temperature for 2 hours. When the absorbance (280 nm) of human immunoglobulin G contained in the phosphate buffer solution after 2 hours was measured, the absorbance decreased, and a nylon fiber in which 0.15 mg of the human immunoglobulin G-polyethyleneimine complex was fixed was prepared. did it. The nylon fiber was immersed in a phosphate buffer containing 25 mM mercaptoethanol to reduce the fiber surface, and the amount of the desorbed human immunoglobulin was measured by HPLC and absorbance. Desorbed from fiber.
＜実施例１１＞
１．ＮａＣｌを１５０ｍＭ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に５ｍｇ／ｍｌに溶解したＯＫＴ３（抗ＣＤ３抗体、ヤンセンファーマ社製）にＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ピアス社製、ＳＰＤＰ）を２０ｍＭに溶解したジメチルスルホキシド溶液を抗体１モルに対して１０倍モル量添加し、室温で３０分反応させた後、ＰＤ−１０カラム（ファルマシア社製）で高分子量分画に精製した。ＯＫＴ３が１モルに対してＳＰＤＰ導入量は３．８モルであった。
<Example 11>
1. N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) -propionate (Pierce, Inc.) was dissolved in OKT3 (anti-CD3 antibody, manufactured by Janssen Pharmaceutical Co., Ltd.) dissolved at 5 mg / ml in 20 mM phosphate buffer (pH 7.5) containing 150 mM NaCl. (SPDP), dissolved in 20 mM, was added in a 10-fold molar amount to 1 mol of the antibody, reacted at room temperature for 30 minutes, and then subjected to high-molecular-weight fractionation using a PD-10 column (Pharmacia). Purified. The amount of SPDP introduced was 3.8 mol per 1 mol of OKT3.
実施例１の１．で得られたＨＳ−ＰＥＩを２．１ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液と得られたＳＰＤＰ化ＯＫＴ３を１ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液をモル比で１：１となるように混合し、室温で１４時間反応させ混合し、ＯＫＴ３をポリエチレンイミンにジスルフィド結合を介して複合した。複合化は反応液をＨＰＬＣを用いて分析し、高分子量側にシフトすることにより確認した。得られたＯＫＴ３とポリエチレンイミンの複合体水溶液は無菌ろ過滅菌した。
２．実施例３の２．で作製したアニオン性平膜１ｃｍ2をジスルフィド基を介して複合したＯＫＴ３−ポリエチレンイミン複合体０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液１．５ｍｌに室温で２時間浸漬させた。２時間後のリン酸緩衝液に含まれる複合体の吸光度（２８０ｎｍ）を測定したところ、吸光度が減少し、ＯＫＴ３−ポリエチレンイミン複合体がアニオン性平膜に固定されていることが確認された。
1. of Embodiment 1 The phosphate buffer containing 2.1 mg / ml of HS-PEI obtained in the above and the phosphate buffer containing 1 mg / ml of the SPDP-modified OKT3 obtained were mixed at a molar ratio of 1: 1. After reacting for 14 hours and mixing, OKT3 was conjugated to polyethyleneimine via a disulfide bond. Complexation was confirmed by analyzing the reaction solution using HPLC and shifting to a higher molecular weight side. The resulting complex aqueous solution of OKT3 and polyethyleneimine was sterile-filtered and sterilized.
2. Example 3-2. In the anionic flat membrane 1 cm 2 was prepared by 2 hours immersion at room temperature in a phosphate buffer 1.5ml containing polyethyleneimine complex 0.2 mg / ml OKT3-conjugated via a disulfide group. When the absorbance (280 nm) of the complex contained in the phosphate buffer after 2 hours was measured, the absorbance decreased, and it was confirmed that the OKT3-polyethyleneimine complex was fixed to the anionic flat membrane.
こうして得られたＯＫＴ３−ポリエチレンイミン複合体固定化平膜１ｃｍ2に健常者血液から得た単核球からなる細胞懸濁液を５×１０5個添加して２０分後、洗浄した材料に５ｍＭのメルカプトエタノールを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を添加して、ジスルフィド結合を還元することによりＯＫＴ３に結合したＣＤ３陽性細胞を脱離させた。フローサイトメトリーにより求められる細胞懸濁液中のＣＤ３陽性細胞の比率は６０％から８０％になり、ＣＤ３陽性細胞を分離することができた。 To 1 cm 2 of the thus obtained OKT3-polyethyleneimine complex-immobilized flat membrane, 5 × 10 5 cell suspensions composed of mononuclear cells obtained from blood of a healthy individual were added, and after 20 minutes, 5 mM was added to the washed material. By adding a phosphate buffer solution (pH 7.5) containing mercaptoethanol to reduce disulfide bonds, CDT-positive cells bound to OKT3 were detached. The proportion of CD3-positive cells in the cell suspension determined by flow cytometry was changed from 60% to 80%, and CD3-positive cells could be separated.
＜実施例１２＞
１．ＮａＣｌを１５０ｍＭ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に２ｍｇ／ｍｌに溶解した抗ヒト免疫グロブリン抗体（ＩＣＮファーマシューティカル社製）にＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ピアス社製、ＳＰＤＰ）を２０ｍＭに溶解したジメチルスルホキシド溶液を抗体１モルに対して３６倍モル量添加し、室温で３０分反応させた後、ＰＤ−１０カラム（ファルマシア社製）で高分子量分画に精製した。抗ヒト免疫グロブリン抗体が１モルに対してＳＰＤＰ導入量は５．０モルであった。
<Example 12>
1. N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) -propionate was added to an anti-human immunoglobulin antibody (manufactured by ICN Pharmaceutical) dissolved at 2 mg / ml in a 20 mM phosphate buffer (pH 7.5) containing 150 mM NaCl. A dimethyl sulfoxide solution in which 20 mM of Pierce's SPDP was dissolved was added in a molar amount of 36 times with respect to 1 mol of the antibody, and the mixture was reacted at room temperature for 30 minutes. Purified. The amount of the SPDP introduced was 5.0 mol per mol of the anti-human immunoglobulin antibody.
実施例１の１．で得られたＨＳ−ＰＥＩを２．１ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液と得られたＳＰＤＰ化抗ヒト免疫グロブリン抗体を０．７ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液をモル比で１：１となるように混合し、室温で１４時間反応させ混合し、抗ヒト免疫グロブリン抗体をポリエチレンイミンにジスルフィド結合を介して複合した。複合化は反応液をＨＰＬＣを用いて分析し、高分子量側にシフトすることにより確認した。得られた抗ヒト免疫グロブリン抗体とポリエチレンイミンの複合体水溶液は無菌ろ過滅菌した。
２．繊維径１０μｍの長繊維からなる末端アミノ基封鎖６，６−ナイロン長繊維不織布０．１ｇにジスルフィド基を介して複合した抗ヒト免疫グロブリン抗体−ポリエチレンイミン複合体０．２ｍｇ／ｍｌを含むリン酸緩衝液１．５ｍｌに室温で２時間浸漬させた。２時間後のリン酸緩衝液に含まれる複合体の吸光度（２８０ｎｍ）を測定したところ、吸光度が減少し、抗ヒト免疫グロブリン抗体−ポリエチレンイミン複合体がナイロン不織布に固定されていることが確認された。
1. of Embodiment 1 The molar ratio of the phosphate buffer containing 2.1 mg / ml of HS-PEI and the phosphate buffer containing 0.7 mg / ml of the SPDP-conjugated anti-human immunoglobulin antibody obtained was adjusted to 1: 1. The mixture was allowed to react at room temperature for 14 hours to mix, and an anti-human immunoglobulin antibody was conjugated to polyethyleneimine via a disulfide bond. Complexation was confirmed by analyzing the reaction solution using HPLC and shifting to a higher molecular weight side. The resulting complex aqueous solution of the anti-human immunoglobulin antibody and polyethyleneimine was sterile-filtered and sterilized.
2. Phosphoric acid containing 0.2 mg / ml of an anti-human immunoglobulin antibody-polyethyleneimine complex conjugated to 0.1 g of non-woven 6,6-nylon long fiber non-woven fabric comprising long fibers with a fiber diameter of 10 μm via a disulfide group It was immersed in 1.5 ml of buffer solution for 2 hours at room temperature. When the absorbance (280 nm) of the complex contained in the phosphate buffer solution after 2 hours was measured, the absorbance decreased, and it was confirmed that the anti-human immunoglobulin antibody-polyethyleneimine complex was fixed to the nylon nonwoven fabric. Was.
こうして得られた抗ヒト免疫グロブリン抗体−ポリエチレンイミン複合体固定化ナイロン繊維０．１ｇに健常者血液から得た単核球からなる細胞懸濁液を５×１０5個添加して２０分後、洗浄した材料に２５ｍＭのメルカプトエタノールを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を添加して、ジスルフィド結合を還元することにより抗ヒト免疫グロブリン抗体に結合したＢ細胞を脱離させた。フローサイトメトリーにより求められる細胞懸濁液中のＢ細胞（ＣＤ１９陽性細胞）の比率は１１％から８０％になり、Ｂ細胞を分離することができた。 To 0.1 g of the thus-obtained anti-human immunoglobulin antibody-polyethyleneimine complex-immobilized nylon fiber, 5 × 10 5 cell suspensions composed of mononuclear cells obtained from blood of a healthy individual were added, and after 20 minutes, A phosphate buffer solution (pH 7.5) containing 25 mM mercaptoethanol was added to the washed material to reduce disulfide bonds, thereby desorbing B cells bound to the anti-human immunoglobulin antibody. The ratio of B cells (CD19-positive cells) in the cell suspension determined by flow cytometry was changed from 11% to 80%, and B cells could be separated.
＜実施例１３＞
１．ＮａＣｌを１５０ｍＭ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に１ｍｇ／ｍｌに溶解した抗ＣＤ４抗体（ベクトンディキンソン社製）にＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ピアス社製、ＳＰＤＰ）を２０ｍＭに溶解したジメチルスルホキシド溶液を抗体１モルに対して１０倍モル量添加し、室温で３０分反応させた後、ＰＤ−１０カラム（ファルマシア社製）で高分子量分画に精製した。抗ＣＤ４抗体が１モルに対してＳＰＤＰ導入量は３．０モルであった。
<Example 13>
1. N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) -propionate (Pierce, Inc.) was added to an anti-CD4 antibody (Becton Dickinson) dissolved at 1 mg / ml in 20 mM phosphate buffer (pH 7.5) containing 150 mM NaCl. A solution of dimethyl sulfoxide in which SPDP was dissolved in 20 mM was added in a 10-fold molar amount to 1 mol of the antibody, reacted at room temperature for 30 minutes, and then purified to a high molecular weight fraction using a PD-10 column (Pharmacia). . The amount of SPDP introduced was 3.0 mol per mol of the anti-CD4 antibody.
実施例１の１．で得られたＨＳ−ＰＥＩを２．１ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液と得られたＳＰＤＰ化抗ＣＤ４抗体を０．５ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液をモル比で１：１となるように混合し、室温で１４時間反応させ混合し、抗ＣＤ４抗体をポリエチレンイミンにジスルフィド結合を介して複合した。複合化は反応液をＨＰＬＣを用いて分析し、高分子量側にシフトすることにより確認した。得られた抗ＣＤ４抗体とポリエチレンイミンの複合体水溶液は無菌ろ過滅菌した。
２．表面に硫酸基をもつ東レ製繊維状イオン交換体“アイオネックス”０．１ｇを２５ｋＧｙのγ線で滅菌した後、ヒトアルブミンで親水化処理した材料にジスルフィド基を介して複合した抗ＣＤ４抗体−ポリエチレンイミン複合体０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液１．５ｍｌに室温で２時間浸漬させた。２時間後のリン酸緩衝液に含まれる複合体の吸光度（２８０ｎｍ）を測定したところ、吸光度が減少し、抗ＣＤ４抗体−ポリエチレンイミン複合体が“アイオネックス”に固定されていることが確認された。
1. of Embodiment 1 The phosphate buffer containing 2.1 mg / ml of HS-PEI obtained in the above and the phosphate buffer containing 0.5 mg / ml of the obtained SPDP-conjugated anti-CD4 antibody were mixed at a molar ratio of 1: 1. The mixture was allowed to react at room temperature for 14 hours, mixed, and conjugated with the anti-CD4 antibody to polyethyleneimine via a disulfide bond. Complexation was confirmed by analyzing the reaction solution using HPLC and shifting to a higher molecular weight side. The obtained complex aqueous solution of anti-CD4 antibody and polyethyleneimine was sterile-filtered and sterilized.
2. An anti-CD4 antibody complexed via a disulfide group to a material obtained by sterilizing 0.1 g of a fibrous ion exchanger “IONEX” manufactured by Toray having a sulfate group on the surface with 25 kGy of γ-ray and then hydrophilizing with human albumin. It was immersed in 1.5 ml of a phosphate buffer containing 0.2 mg / ml of the polyethyleneimine complex at room temperature for 2 hours. When the absorbance (280 nm) of the complex contained in the phosphate buffer solution after 2 hours was measured, the absorbance decreased, and it was confirmed that the anti-CD4 antibody-polyethyleneimine complex was fixed to "IONEX". Was.
こうして得られた抗ＣＤ４抗体−ポリエチレンイミン複合体固定化“アイオネックス”０．１ｇに健常者血液から得た単核球からなる細胞懸濁液を５×１０5個添加して２０分後、洗浄した材料に２５ｍＭのメルカプトエタノールを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を添加して、ジスルフィド結合を還元することにより抗ＣＤ４抗体に結合したＣＤ４陽性細胞を脱離させた。フローサイトメトリーにより求められる細胞懸濁液中のＣＤ４陽性細胞の比率は３０％から８０％になり、ＣＤ４陽性細胞を分離することができた。 To 0.1 g of the thus obtained anti-CD4 antibody-polyethyleneimine complex-immobilized “IONEX”, 5 × 10 5 cell suspensions composed of mononuclear cells obtained from blood of a healthy subject were added, and after 20 minutes, A phosphate buffer solution (pH 7.5) containing 25 mM mercaptoethanol was added to the washed material to reduce disulfide bonds, thereby desorbing CD4-positive cells bound to the anti-CD4 antibody. The proportion of CD4-positive cells in the cell suspension determined by flow cytometry was 30% to 80%, and CD4-positive cells could be separated.
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