JP2004184093A

JP2004184093A - Photo-ablation apparatus for biopolymer and photo-ablation method using the same

Info

Publication number: JP2004184093A
Application number: JP2002347786A
Authority: JP
Inventors: Katsutoshi Takahashi; 勝利高橋; Kazuhiko Fukui; 一彦福井; Yasushi Akiyama; 泰秋山; Kunio Awazu; 邦男粟津
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2002-11-29
Filing date: 2002-11-29
Publication date: 2004-07-02
Anticipated expiration: 2022-11-29
Also published as: WO2004051233A1; AU2003284664A1; JP3928043B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a photo-ablation apparatus for a biopolymer which cuts the biopolymer without using enzyme, and a photo-ablation method using the same. <P>SOLUTION: The photo-ablation apparatus is equipped with a support means for supporting a specimen of the biopolymer under a normal pressure and an infrared laser irradiation means for irradiating the specimen of the biopolymer with an infrared laser. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体高分子光切断装置および生体高分子光切断方法に関する。さらに詳しくは、常圧下で赤外線レーザーを用いる生体高分子光切断装置および生体高分子光切断方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
（Ｉ）従来、プロテアーゼ（タンパク質分解酵素）を用いてタンパク質の特定のアミノ酸部位を切断することや、多糖類を分解する酵素を用いて多糖類を分解することは、生化学プロセスにおいて日常的に行われる基本的な反応であり、生化学実験室のみならず、様々な工業プロセスにおけるバイオリアクター等に広く用いられている。例えば、菌体に産生させたタンパク質をプロテアーゼによって分解して生理活性ペプチドを合成するなどの工業プロセスに用いられている。
【０００３】
（ＩＩ）また、プロテオーム研究においてタンパク質を分離、同定する場合にも、プロテアーゼを用いた分解反応は必要不可欠なものである。すなわち、１次元または２次元のポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離したタンパク質は通常ゲルに強く吸着しているため、溶液中に溶出させてその後の分析にかけることは困難である。そこでゲルに吸着したタンパク質をそのままプロテアーゼ溶液中でインキュベートし、分解することにより可溶なペプチド断片として溶出させるインゲル消化法（プロテアーゼ法）がプロテオーム解析の主流となっている。
【０００４】
（ＩＩＩ）さらに、タンパク質を赤外線レーザーにより分解する方法としては、タンパク質をイオン化し、真空中で強力なＣＯ_２レーザーを照射する赤外線多光子吸収解離反応（ＩｎｆｒａＲｅｄＭｕｌｔｉＰｈｏｔｏｎＤｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ；ＩＲＭＰＤ）が知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００５】
（ＩＶ）また、タンパク質を紫外線により分解する方法も知られている（例えば非特許文献２、３参照）。
【０００６】
【非特許文献１】
リトルら（Ｌｉｔｔｌｅ，Ｄ．Ｐ．ｅｔａｌ．）、アナリティカルケミストリー（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．）、１９９４年、６６巻、ｐ．２８０９−２８１５。
【非特許文献２】
ボワーズら（Ｂｏｗｅｓ，Ｗ．Ｄ．ｅｔａｌ．）、ジャーナルオブアメリカンケミカルソサエティー（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、１９８４年、１０６巻、ｐ．７２８８−７２８９。
【非特許文献３】
ウイリアムズら（ＷｉｌｌｉａｍｓＥ．Ｒ．ｅｔａｌ．）、ジャーナルオブアメリカンソサエティーマススペクトロメトリー（Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ．）、１９９０年、１巻、ｐ．２８８−２９４。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、前記従来の記述（Ｉ）にあっては、反応液中にプロテアーゼや、多糖類分解酵素を混入して反応を行うにあたり、これらの酵素を回収する工程が必要になってしまう。しかも、固体単体にプロテアーゼや、多糖類分解酵素を結合させた固定化酵素を用いる場合も多いものの、固定化されたプロテアーゼや、多糖類分解酵素は反応性が低く、長期間の使用により失活するという問題点がある。
【０００８】
また、前記従来の技術（ＩＩ）にあっては、プロテアーゼを用いたタンパク質分解や、多糖類分解酵素を用いた多糖類の分解においては、酵素活性を引き出すために、溶液系でかつ至適温度、至適ｐＨなどの生化学的環境を注意深く整える必要があり、プロテオーム解析等の自動化や試料適用範囲の拡大が難しいという問題点がある。
【０００９】
さらに、前記従来の技術（ＩＩＩ）にあっては、真空中で反応させるのもであるので、工業プロセスやプロテオーム研究にそのまま利用できるものではない。
【００１０】
また、前記従来の技術（ＩＶ）にあっては、分解を制御することが難しく、タンパク質が極度に分解されすぎるという問題点がある。
【００１１】
本発明は、前記従来の技術の問題点に着目し、これを解決せんとしたものであり、その目的は、酵素を用いることなく適度にタンパク質や多糖類などの生体高分子を分解する生体高分子光切断装置および生体高分子光切断方法を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決すべく検討した結果、常圧下で赤外線レーザーを照射することにより適度に生体高分子を切断できることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明の生体高分子光切断装置は、常圧下において生体高分子試料を支持する支持手段と、赤外線レーザーを生体高分子試料に照射する赤外線レーザー照射手段と、を備えたことを特徴とする。
【００１３】
この生体高分子光切断装置によれば、生体高分子試料が、常圧下において支持手段にて支持される。そして、支持手段にて常圧下において支持された生体高分子試料に対して、赤外線レーザー照射手段にて赤外線レーザーが照射される。
【００１４】
また、本発明の生体高分子光切断装置は、上記の生体高分子光切断装置において、赤外線レーザーがパルスレーザーである態様のものである。
【００１５】
この生体高分子光切断装置によれば、上記支持手段にて常圧下において支持された生体高分子試料に対して、赤外線レーザー照射手段にてパルスレーザー（赤外線レーザー）が照射される。
【００１６】
さらに、本発明の生体高分子光切断装置は、上記の生体高分子光切断装置において、赤外線レーザーの波長が、生体高分子の切断しようとする化学結合の固有振動に共鳴する波長である態様のものである。
【００１７】
この生体高分子光切断装置によれば、上記支持手段にて常圧下において支持された生体高分子試料に対して、生体高分子の切断しようとする化学結合の固有振動に共鳴する波長である赤外線レーザーが照射される。
【００１８】
また、本発明の生体高分子光切断装置は、上記の生体高分子光切断装置において、生体高分子の切断しようとする部位の情報を入力する情報入力手段と、生体高分子の特定部位を切断するのに適したレーザー波長の情報を記憶する記憶手段と、前記記憶手段を参照して、前記情報入力手段により入力された生体高分子の切断しようとする部位に対応する波長のレーザーを生体高分子試料に照射させる波長制御手段と、をさらに含む態様のものである。
【００１９】
この生体高分子光切断装置によれば、情報入力手段にて生体高分子の切断しようとする部位の情報が入力される。そして、記憶手段にて生体高分子の特定部位を切断するのに適したレーザー波長の情報が記憶される。前記記憶手段を参照して、前記情報入力手段により入力された生体高分子の切断しようとする部位に対応する波長のレーザーが、波長制御手段にて生体高分子試料に対して照射される。
【００２０】
また、本発明の生体高分子光切断装置は、上記の生体高分子光切断装置において、赤外線レーザー照射後の生体高分子試料を回収して質量分析を行う質量分析手段と、前記質量分析手段により得られた情報に基づいて切断された生体高分子の切断部位を解析し、照射した赤外線レーザーの波長情報とともに、前記質量分析手段により得られた情報を前記記憶手段に記憶させる情報解析手段と、をさらに含む態様のものである。
【００２１】
この生体高分子光切断装置によれば、質量分析手段にて赤外線レーザー照射後の生体高分子試料を回収して質量分析が行われる。そして、情報解析手段にて、前記質量分析手段により得られた情報に基づいて切断された生体高分子の切断部位が解析され、照射した赤外線レーザーの波長情報とともに前記質量分析手段により得られた情報が記憶手段に記憶される。
【００２２】
また、本発明の生体高分子光切断装置は、上記の生体高分子光切断装置において、赤外線レーザー照射後の生体高分子試料を回収して質量分析を行う質量分析手段と、前記質量分析手段により得られた情報から次回の生体高分子の切断しようとする部位の情報を波長制御手段に伝達する情報解析手段と、をさらに含む態様のものである。
【００２３】
この生体高分子光切断装置によれば、質量分析手段にて赤外線レーザー照射後の生体高分子試料が回収されて質量分析が行われる。そして、情報解析手段にて、前記質量分析手段により得られた情報から次回の生体高分子の切断しようとする部位の情報が波長制御手段に伝達される。
【００２４】
また、本発明の生体高分子光分解装置は、上記の生体高分子光切断装置において、上記生体高分子の特定部位を切断するのに適したレーザー波長が、切断する部位の化学結合の固有振動に共鳴する波長である態様のものである。
【００２５】
この生体高分子光分解装置によれば、情報入力手段にて生体高分子の切断しようとする部位の情報が入力される。そして、記憶手段にて生体高分子の特定部位を切断するのに適したレーザー波長の情報が記憶される。ここで、前記生体高分子の特定部位を切断するのに適した前記レーザー波長を、切断する部位の化学結合の固有振動に共鳴する波長としており、前記記憶手段を参照して、前記情報入力手段により入力された生体高分子の切断する部位の化学結合の固有振動に共鳴する波長のレーザーが、波長制御手段にて生体高分子試料に対して照射される。
【００２６】
また、本発明の生体高分子光切断装置は、上記の生体高分子光切断装置において、生体高分子がタンパク質または多糖類である態様のものである。
【００２７】
この生体高分子光切断装置によれば、切断対象の生体高分子としてタンパク質または多糖類が、常圧下において支持手段にて支持される。そして、支持手段にて常圧下において支持されたタンパク質または多糖類に対して、赤外線レーザー照射手段にて赤外線レーザーが照射される。
【００２８】
また、本発明の生体高分子光切断装置は、上記の生体高分子光切断装置において、上記切断しようとする部位の情報が、タンパク質を構成する少なくとも１つのアミノ酸に関する情報、または、多糖類を構成する少なくとも１つの単糖に関する情報、である態様のものである。
【００２９】
この生体高分子光切断装置によれば、上記切断しようとする部位の情報が、タンパク質を構成する少なくとも１つのアミノ酸に関する情報、または、多糖類を構成する少なくとも１つの単糖に関する情報、であり、情報入力手段にて、生体高分子の切断しようとする部位の情報として、タンパク質を構成する少なくとも１つのアミノ酸に関する情報、または、多糖類を構成する少なくとも１つの単糖に関する情報、が入力される。そして、記憶手段にて、生体高分子（タンパク質、多糖類等）の特定部位を切断するのに適したレーザー波長の情報が記憶される。前記記憶手段を参照して、前記情報入力手段により入力された、生体高分子（タンパク質、多糖類等）の切断しようとする部位に対応する波長のレーザーが、波長制御手段にて生体高分子（タンパク質、多糖類等）試料に対して照射される。
【００３０】
また、本発明の生体高分子光切断方法は、常圧下において赤外線レーザーを照射することにより生体高分子を切断することを特徴とする。
【００３１】
この生体高分子光切断方法によれば、常圧下において、生体高分子に対して、赤外線レーザーが照射され、生体高分子が切断される。
【００３２】
また、本発明の生体高分子光切断方法は、上記の生体高分子光切断方法において、上記赤外線レーザーがパルスレーザーである態様のものである。
【００３３】
この生体高分子光切断方法によれば、上記赤外線レーザーがパルスレーザーであり、常圧下において生体高分子に対してパルスレーザー（赤外線レーザー）が照射され、このパルスレーザー（赤外線レーザー）が照射されることにより生体高分子が切断される。
【００３４】
また、本発明の生体高分子光切断方法は、上記の生体高分子光切断方法において、赤外線レーザーの波長が、生体高分子の切断しようとする化学結合の固有振動に共鳴する波長である態様のものである。
【００３５】
この生体高分子光切断方法によれば、赤外線レーザーの波長が、生体高分子の切断しようとする化学結合の固有振動に共鳴する波長であり、常圧下において、生体高分子に対して、生体高分子の切断しようとする化学結合の固有振動に共鳴する波長の赤外線レーザーが照射され、生体高分子が切断される。
【００３６】
また、本発明の生体高分子光切断方法は、上記の生体高分子光切断方法において、生体高分子がタンパク質または多糖類である態様のものである。
【００３７】
この生体高分子光切断方法によれば、切断対象の生体高分子がタンパク質または多糖類であり、生体高分子（タンパク質、多糖類等）に対して、赤外線レーザーが照射され、生体高分子（タンパク質、多糖類等）が切断される。
【００３８】
【発明の実施の形態】
本発明において、生体高分子とは、生物内に存在する高分子であれば特に制限はないが、例えば、タンパク質や多糖類といった生体高分子のほか、グライコプロテイン、プロテオグリカン、グライコリピット等の生体高分子をあげることができる。
【００３９】
本発明におけるタンパク質とは、複数のアミノ酸がペプチド結合したものを意味し、２つのアミノ酸からなるジペプチドをはじめ、オリゴペプチド、ポリペプチド、さらには、分子量が１０００ｋＤａを超えるものも含まれる。また、荷電したもの、すなわち、タンパク質イオンも本発明におけるタンパク質に含まれる。さらに、本発明におけるタンパク質は修飾されたものでもよく、例えば、アセチル化、メチル化、リン酸化、ヒドロキシル化されたもの、ジスルフィド結合を形成したもの、糖鎖が付加したものなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４０】
また、本発明における多糖類とは、加水分解によって１以上の単糖を生じる炭水化物を意味し、同一種類の単糖から構成される単純多糖、異種の単糖から構成される複合多糖のいずれをも含む。さらに、タンパク質と結合したグライコプロテイン、プロテオグリカン、グライコリピット等も含まれる。
【００４１】
本発明における常圧下とは、真空以外の気圧のことを意味し、大気圧のみならず、これをある程度減圧もしくは加圧した気圧も含まれる。従って、常圧下としては、例えば１．３３ｈＰａ（１Ｔｏｒｒ）以上の気圧があげられ、切断処理の容易さから、大気圧（１０１３ｈＰａ）付近が好ましい。具体的には、例えば７００〜１５００ｈＰａ、好ましくは９００〜１１００ｈＰａをあげることができるが、これらに限定されるものではない。
【００４２】
以下、図面を参照して本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、これらの図面に限定されるものではない。
【００４３】
まず、本発明の第１の実施形態について説明する。
図１は、本発明の生体高分子光切断装置の一例を示すものである。図１において、本発明の生体高分子光切断装置は、レーザー発振器１、シャッター２、ガルバノミラー３、パワーメーター４、レンズ５、フッ化バリウム（ＢａＦ_２）板６、サンプル１０、サンプルホルダー７、スライドガラス８の順に配置されている。
なお、レーザー発振器１は、本発明の赤外線レーザー照射手段を構成し、フッ化バリウム（ＢａＦ_２）板６、サンプルホルダー７、スライドガラス８は、本発明の試料の支持手段を構成する。
本発明は、上記のように構成されており、以下その作用について説明する。
図１において、レーザー発振器１から放射された赤外線レーザー光は、シャッター２により所定の時間開放される。
シャッター２を通過したレーザー光は、ガルバノミラー３を通り、レンズ５によって集光されサンプル１０に照射される。
サンプル１０は、スライドガラス８上に置かれ、側面をサンプルホルダー７により固定され、上面がＢａＦ_２板６によりカバーされている。
ガルバノミラー３は、内部に備えたミラーの角度を変化させることによりレーザー光を走査してサンプル１０に照射する働きを有する。これにより、生体高分子であるサンプル１０が切断されることとなる。
なお、パワーメーター４は、ガルバノミラー３とレンズ５の間に挿入され、レーザー光強度を測定できるようになっている。
【００４４】
ここで、図１では、サンプル１０として液層試料を用いているが、本発明に用いる試料を支持する支持手段としては、試料を支持して赤外線レーザーを照射できれば特に制限はなく、固層試料、液層試料それぞれに応じ、適切なものを選択して用いることができる。
【００４５】
例えば、液層試料の場合は、図４（ａ）〜（ｅ）に示すように、サンプルホルダーで囲んだスライドガラス上に、目的とする生体高分子を滴下し、上面をフッ化バリウム（ＢａＦ_２）や臭化カリウム（ＫＢｒ）などの赤外線の吸収が少ない素材からなる板でカバーすることにより、液体のまま試料を支持することができる。
この場合、赤外線レーザーにより生体高分子を切断した後、溶液系のまま次の分析工程等に移すことが可能となる。
【００４６】
また、固層試料の場合は、図５（ａ）〜（ｆ）に示すように、ＢａＦ_２やＫＢｒなどの基盤を用い、これらの基盤に、目的とする生体高分子溶液を滴下し、乾燥させることにより、容易に試料を基盤に支持することができる。
【００４７】
さらに、試料を支持する他の手段としては、例えばポリアクリルアミドゲル等の生体高分子の分離担体をあげることができる。
この場合、ポリアルリルアミドゲル電気泳動によりタンパク質等の生体高分子を分離し、その生体高分子が吸着したポリアクリルアミドゲルをそのまま試料を支持する支持手段として用いることができ、タンパク質等の生体高分子の解析を効率的に進めることが可能となる。
【００４８】
本発明の赤外線レーザー照射手段としては、赤外線を照射できるものであれば特に制限はないが、例えば、自由電子レーザー、ＹＡＧレーザー、ＣＯ_２レーザー等をあげることができる。
【００４９】
本発明に用いる赤外線レーザーの波長としては、生体高分子の化学結合を切断できる波長であれば特に制限はないが、目的とする化学結合を選択的に切断することが可能となるという観点から、切断しようとする化学結合の固有振動に共鳴する波長を用いることが好ましい。
実際に用いる波長の範囲としては、例えば、０．７〜１００μｍ、好ましくは１〜５０μｍをあげることができる。
【００５０】
また、本発明に用いる赤外線レーザーとしては、生体高分子の化学結合を効率的に切断するという観点から、パルスレーザーを用いることが好ましい。
すなわち、赤外線レーザーを試料に照射して切断しようとする化学結合に振動励起をおこした場合でも、通常は振動緩和（減衰）がおこり、効率的にエネルギーを伝えることが難しい場合がある。
この場合、この振動緩和（減衰）よりもはやいタイミングでパルスとしてレーザー照射することにより、効率的に目的とする化学結合を切断することが可能となる。
パルス幅としては、切断する化学結合の種類により適宜決定してよいものであるが、例えば、数ｆｓｅｃ（フェムト秒）〜数百ｐｓｅｃ（ピコ秒）のものをあげることができる。
【００５１】
本発明に用いる赤外線レーザーの照射エネルギーとしては、生体高分子の化学結合を切断できるエネルギーであれば特に制限はないが、例えば、１〜１０００ｍＪ、好ましくは１０〜５００ｍＪをあげることができる。
【００５２】
次に、本発明の第２の実施態様について説明する。
図２は、本発明の生体高分子光切断装置の他の一例を示すものである。制御部２０は、情報入力部３０、記憶部３２、波長制御部３５、情報解析部３８を含むコンピューターにより構成されている。
制御部２０は、波長制御部３５を介して、レーザー発振器１に接続されている。
また、制御部２０は、情報解析部３８を介して質量分析部４０に接続されている。その他の構成部位は、図１と同様である。
なお、情報入力部３０、記憶部３２、波長制御部３５、情報解析部３８、質量分析部４０は、本発明の情報入力手段、記憶手段、波長制御手段、情報解析手段、質量分析手段をそれぞれ構成する。
本発明は、上記のように構成されており、以下その作用について説明する。
図２において、情報入力部３０には、生体高分子の切断しようとする部位の情報が入力される。生体高分子がタンパク質の場合は、切断しようとする部位の情報の例として、タンパク質を構成する少なくとも１つのアミノ酸に関する情報、または、タンパク質を構成する連続する少なくとも２つのアミノ酸配列があげられる。
また、生体高分子が多糖類の場合は、切断しようとする部位の情報の例として、多糖類を構成する少なくとも一つの単糖の情報、または、多糖類を構成する連続する少なくとも２つの単糖配列の情報があげられる。
【００５３】
記憶部３２には、生体高分子の特定部位を切断するのに適したレーザー波長の情報が記憶されている。
生体高分子の特定部位を切断するのに適したレーザー波長の例としては、切断する部位の化学結合の固有振動に共鳴する波長があげられる。
これらの固有振動に共鳴する波長は、例えば、図６に示されるように、分子軌道法を用いた計算シミュレーションやＦＴ−ＩＲを用いた赤外吸収測定等の方法により取得することができる。
【００５４】
波長制御部３５は、記憶部３２を参照して、情報入力部３０により入力された生体高分子の切断しようとする部位に対応する波長のレーザーを、レーザー発振器１から放射させる。
これにより、例えば、生体高分子がタンパク質の場合は、タンパク質の切断しようとする特定部位のアミノ酸の情報を入力することにより、そのアミノ酸部分を選択的に切断することが可能となる。
【００５５】
より具体的には、例えば、「ヒスチジン−プロリン」を情報入力部３０に入力することにより、タンパク質のヒスチジン−プロリン間の結合部位を選択的に切断することが可能となる。
この場合、図７に示されるように、プロリンの５員環のブリージングモード（ＢｒｅａｔｈｉｎｇＭｏｄｅ）を与える波長が４００ｃｍ^−１であることが上記の計算シミュレーションによって求められており、この波長を照射することによりプロリンの５員環にエネルギーを与え、振動共鳴によりヒスチジンとプロリン間の結合にエネルギーを伝達させて、この結合を切断することが可能となる。
なお、タンパク質を切断する場合には、図３の切断部位Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄで示されるように、いくつかの切断部位が存在する。従って、例えば、図３のＲ_ｍ−１がヒスチジン残基、Ｒ_ｍがプロリン残基の場合における切断部位Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ各々の固有振動に共鳴する波長をあらかじめ求めておき、記憶部３２に記憶しておくことにより、任意の切断部位で切断することが可能となる。
この場合、情報入力部３０に、例えば「ヒスチジン−プロリン」および「切断部位Ｂ」を入力することにより、タンパク質のヒスチジン−プロリン間のペプチド結合を選択的に切断することができるようになる。
なお、図３においてＲは、アミノ酸残基を示す。
【００５６】
また、質量分析部４０では、赤外線レーザーを照射後の生体高分子試料を回収して質量分析が行われる。
質量分析部４０から得られた情報は、情報解析部３８に送られ、情報解析部３８では、赤外線レーザーの照射により切断された生体高分子の切断部位が解析される。
解析された結果（解析結果情報）は、照射した波長情報とともに記憶部３２に記憶される。
これにより、実際に照射した赤外線レーザーによって、生体高分子のどの部位が切断されるかを実測により求めることができる。
【００５７】
さらに、情報解析部３８にて得られた解析結果情報を記憶部３２に記憶することにより、生体高分子の特定部位を切断するのに適した波長のより的確な情報を取得することができ、または、計算により求めた切断に適した波長を実測値に更新することができる。
さらに、情報解析部３８は、次回の生体高分子の切断しようとする部位の情報を波長制御部３５に伝達（指示）することもできる。
例えば、生体高分子がタンパク質の場合において、「ヒスチジン−プロリン」の情報を情報入力部３０に入力して赤外線レーザーを照射した後のタンパク質試料を回収して、質量分析部４０にて分析した結果、切断が起こっていないことが判明した場合は、例えばあらかじめ定めておいた次に切断すべきアミノ酸配列情報を波長制御部３５に伝達（指示）し、次回の赤外線レーザー照射を行なうことができる。
【００５８】
なお、本発明で用いられる質量分析手段としては、質量分析が行えるものであれば特に制限はないが、生体高分子を精度良く分析できるという観点から、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦが特に好ましい。
【００５９】
【実施例】
以下に実施例を用いて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は実施例に限定されるのもではない。
＜サブスタンスＰの切断の例＞
図１の生体高分子光切断装置を用いて、以下の手順でサブスタンスＰ（配列番号：１、ＳＵＢＰ）を切断した。
なお、サブスタンスＰは、神経細胞から放出される化学伝達物質である神経ペプチドとして知られており、そのアミノ酸配列は、「Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｙｌ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ」である。
まず、サブスタンスＰ粉末（ＳＩＧＭＡ社製）をＭｉｌｌｉＱ水で溶解して２ｐｍｏｌ／μＬ溶液とし、１０μＬを図４（ｂ）に示すようなサンプルホルダーを持つスライドグラスの上に滴下し、ＢａＦ_２板で覆った。
図１に示す生体高分子光切断装置を用いて波長可変赤外線レーザーを照射し、サブスタンスＰを切断した後、ＭｉｌｌｉＱ水とメタノール（５０：５０）の混合液（１％酢酸を含む）を用いてスライドグラス上のサンプルおよびＢａＦ_２基盤上からレーザー照射後のサンプルを回収し、２０ｐｍｏｌ／μＬ溶液とした。回収したペプチドをエッペンドルフチューブに入れ、その後四倍希釈した５ｐｍｏｌ／μＬを使い、質量分析を行った。
その手順の概略を、図４（ａ）〜（ｅ）に示す。
なお、質量分析は、タンデム四重極・飛行時間ハイブリッド型（ｑｑ−ＴＯＦ）質量分析計（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＱＳＴＡＲＰＵＬＳＡＲ）を用いて行った。
まず、レーザー照射することなく、レファレンスとして、サブスタンスＰをスライドガラスに滴下し３０分後に回収し質量分析を行った。
その結果は、図８に示すとおりである。図８に示されるように、２価の親イオン［ＳＵＢＰ＋２Ｈ］^２＋（ｍ／ｚ＝６７４．３Ｄａ）と、ｍ／ｚ＝４３７．２のピークが最も強く観測された。
次に波長可変赤外線レーザーを用いて、照射実験を行った。その際使用したレーザーとしては、パルス幅約５ｐｓの極短ミクロパルスであることを特徴とし、このパルスは４４．８ｎｓ毎に約２０ｍｓ間出力されるものである。これらのミクロパルス４５０個からマクロパルスが形成され、マクロパルスは１０Ｈｚで出力された。
この波長可変赤外線レーザーを使い、波長を６．１μｍに調整した後３０分間サンプルに照射を行い、レーザー照射後のサンプルを回収し質量分析を行った。その結果は、図９に示されるように、サブスタンスＰの２価（［ＳＵＢＰ＋２Ｈ］^２＋）に相当する、ｍ／ｚ＝６７４．３が照射した試料からはほとんど観測されず、低い試料側（ｍ／ｚ＜４００）にレファレンスでは観測されなかったイオンを見つけることができる。また、レファレンスで観測されたｍ／ｚ＝４３７．２のピークも同様に観測された。
この方法で波長を７．７μｍ、８．１μｍ、１０．６μｍに調整し、波長依存性によるペプチド切断部位の選択性をそれぞれ調査した。なお、ガルバノミラーとレンズとの間に挿入したパワーメーターによるレーザー光強度は、１２〜１５ｍＷ（波長：６．１μｍ）であり、２２〜２５ｍＷ（波長：７．７〜１０．６μｍ）であった。
赤外線レーザーを照射していない試料と照射した試料との違いを明白にするために、図９の値から図８の値を差し引くことにより得られた差スペクトラを、図１０（ａ）（波長：６．１μｍ）に示す。
さらに、波長が７．７μｍ、８．１μｍ、１０．６μｍの各波長のレーザー光をそれぞれ照射した際の差スペクトラも、図１０に併せて示す。これらすべてのスペクトラで、低ｍ／ｚ側にピークが現れており、図１０（ｃ）に示すようにピークを同定するができ、サブスタンスＰが分解していることが確認された。
以上の結果から、本発明の生体高分子光切断装置および生体高分子光切断方法の有用性が確認された。
【００６０】
【発明の効果】
本発明により、酵素を用いることなく、生体高分子を切断する生体高分子光切断装置および生体高分子光切断方法を提供することができる。
【００６１】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施形態の概略構成図である。
【図２】本発明の第２の実施形態の概略構成図である。
【図３】タンパク質の切断部位を説明する図である。
【図４】本発明の実施手順（液層試料の場合）を示す図である。
【図５】本発明の実施手順（固層試料の場合）を示す図である。
【図６】ＩＲ波長領域での主なグループ振動を示す図である。
【図７】切断する生体高分子の特定部位と、その特定部位を切断するのに適したレーザー波長との関係を示す図である。
【図８】レファレンス（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）として、レーザー照射していないサブスタンスＰの質量分析結果を示す図である。
【図９】レーザー照射（波長：６．１μｍ）により切断したサブスタンスＰの質量分析結果を示す図である。
【図１０】レーザー照射（波長：６．１μｍ、７．７μｍ、８．１μｍ、１０．６μｍ）により切断したサブスタンスＰの差スペクトラを示す図である。
【符号の説明】
１レーザー発振器
２シャッター
３ガルバノミラー
４パワーメーター
５レンズ
６ＢａＦ_２板
７サンプルホルダー
８スライドガラス
１０サンプル
２０制御部
３０情報入力部
３２記憶部
３５波長制御部
３８情報解析部
４０質量分析部
Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ切断部位[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a biopolymer photocleaving device and a biopolymer photocutting method. More specifically, the present invention relates to a biopolymer photocleaving apparatus and a biopolymer photocutting method using an infrared laser under normal pressure.
[0002]
[Prior art]
(I) Conventionally, cleaving a specific amino acid site of a protein using a protease (proteolytic enzyme) or decomposing a polysaccharide using an enzyme that degrades a polysaccharide is routinely performed in biochemical processes. This is a basic reaction that is performed, and is widely used not only in biochemical laboratories but also in bioreactors in various industrial processes. For example, it is used in an industrial process such as synthesizing a physiologically active peptide by decomposing a protein produced by bacterial cells with a protease.
[0003]
(II) Also, when separating and identifying proteins in proteome research, a degradation reaction using a protease is indispensable. That is, since proteins separated by one-dimensional or two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis are usually strongly adsorbed to the gel, it is difficult to elute them in a solution and to perform subsequent analysis. Therefore, the mainstream of proteome analysis is the ingel digestion method (protease method) in which the protein adsorbed on the gel is directly incubated in a protease solution and decomposed to elute as a soluble peptide fragment.
[0004]
(III) Further, as a method of decomposing a protein by an infrared laser, the protein is ionized and a strong CO ₂ BACKGROUND ART An infrared multiphoton absorption dissociation reaction (IRMPD) that irradiates a laser is known (for example, see Non-Patent Document 1).
[0005]
(IV) Also, a method of decomposing proteins by ultraviolet rays is known (for example, see Non-Patent Documents 2 and 3).
[0006]
[Non-patent document 1]
Little et al., DP, et al., Analytical Chemistry, Anal. Chem., 1994, vol. 66, p. 2809-2815.
[Non-patent document 2]
Bowes, W. D. et al., Journal of American Chemical Society (J. Am. Chem. Soc.), 1984, 106, p. 7288-7289.
[Non-Patent Document 3]
Williams ER et al., Journal of American Society Mass Spectrometry, 1990, Volume 1, p. 288-294.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
However, according to the above-mentioned conventional description (I), a step of recovering these enzymes is required in carrying out the reaction by mixing a protease or a polysaccharide-decomposing enzyme into the reaction solution. In addition, although an immobilized enzyme in which a protease or a polysaccharide-degrading enzyme is bound to a solid substance is often used, the immobilized protease or the polysaccharide-degrading enzyme has low reactivity and is inactivated by long-term use. There is a problem that.
[0008]
Further, in the above-mentioned conventional technique (II), in the case of proteolysis using a protease or decomposing a polysaccharide using a polysaccharide-degrading enzyme, a solution system and an optimal temperature are used in order to extract enzyme activity. In addition, it is necessary to carefully prepare a biochemical environment such as an optimum pH, and there is a problem that it is difficult to automate proteome analysis and the like and to expand a sample application range.
[0009]
Further, in the above-mentioned conventional technology (III), since the reaction is performed in a vacuum, it cannot be directly used for industrial processes or proteome research.
[0010]
In addition, in the conventional technique (IV), there is a problem that it is difficult to control the decomposition, and the protein is excessively decomposed.
[0011]
The present invention focuses on the problems of the conventional technology and solves the problems. The purpose of the present invention is to reduce the biodegradation of biopolymers such as proteins and polysaccharides without using enzymes. It is an object of the present invention to provide a molecular photocleaving device and a biopolymer photocleaving method.
[0012]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have studied to solve the above-mentioned problems, and as a result, have found that a biopolymer can be appropriately cut by irradiating an infrared laser under normal pressure, and have completed the present invention.
That is, the biopolymer photocleaving device of the present invention includes a support means for supporting the biopolymer sample under normal pressure, and an infrared laser irradiation means for irradiating the biopolymer sample with an infrared laser. I do.
[0013]
According to this biopolymer photocleaving device, the biopolymer sample is supported by the support means under normal pressure. Then, an infrared laser is radiated by the infrared laser irradiating means to the biopolymer sample supported under normal pressure by the supporting means.
[0014]
Further, the biopolymer optical cutting device of the present invention is an embodiment in which the infrared laser is a pulse laser in the above biopolymer optical cutting device.
[0015]
According to this biopolymer photocleaving apparatus, a pulse laser (infrared laser) is irradiated by the infrared laser irradiation means on the biopolymer sample supported by the support means under normal pressure.
[0016]
Further, in the biopolymer photocleaving device of the present invention, in the above biopolymer photocutting device, the wavelength of the infrared laser is a wavelength that resonates with the natural vibration of a chemical bond to be cut by the biopolymer. Things.
[0017]
According to this biopolymer photocleaving apparatus, an infrared ray having a wavelength that resonates with a natural vibration of a chemical bond to be cut by the biopolymer is applied to the biopolymer sample supported at normal pressure by the support means. The laser is irradiated.
[0018]
Further, the biopolymer photocleaving device of the present invention is the biopolymer photocleaving device described above, wherein the information input means for inputting information of a portion to be cut of the biopolymer, and a specific portion of the biopolymer is cut. A storage unit for storing information of a laser wavelength suitable for performing the processing, and referring to the storage unit, a laser having a wavelength corresponding to a portion of the biopolymer to be cut, which is input by the information input unit, is used as a biological height. Wavelength control means for irradiating the molecular sample.
[0019]
According to this biopolymer photocleaving device, information on a portion of the biopolymer to be cut is input by the information input means. Then, information on a laser wavelength suitable for cutting a specific portion of the biopolymer is stored in the storage means. With reference to the storage means, a laser having a wavelength corresponding to a portion of the biopolymer to be cut, which is input by the information input means, is applied to the biopolymer sample by the wavelength control means.
[0020]
Further, the biopolymer photocleaving device of the present invention, in the above biopolymer photocleaving device, mass spectrometry means for collecting the biopolymer sample after infrared laser irradiation and performing mass spectrometry, and the mass spectrometry means Analyzing the cut portion of the biopolymer cut based on the obtained information, together with the wavelength information of the irradiated infrared laser, information analysis means for storing the information obtained by the mass analysis means in the storage means, Is an aspect further including:
[0021]
According to this biopolymer photocleaving apparatus, the mass spectrometry unit collects the biopolymer sample after irradiation with the infrared laser and performs mass spectrometry. Then, the information analysis means analyzes the cut portion of the biopolymer cut based on the information obtained by the mass analysis means, and the information obtained by the mass analysis means together with the wavelength information of the irradiated infrared laser. Is stored in the storage means.
[0022]
Further, the biopolymer photocleaving device of the present invention, in the above biopolymer photocleaving device, mass spectrometry means for collecting the biopolymer sample after infrared laser irradiation and performing mass spectrometry, and the mass spectrometry means And information analysis means for transmitting information on the site of the biopolymer to be cut next from the obtained information to the wavelength control means.
[0023]
According to this biopolymer photocleaving apparatus, the biopolymer sample after the irradiation of the infrared laser is recovered by the mass spectrometer and mass analysis is performed. Then, the information on the site where the biopolymer is to be cut next time is transmitted from the information obtained by the mass analysis unit to the wavelength control unit.
[0024]
Further, in the biopolymer photocleaving device of the present invention, in the biopolymer photocleaving device, a laser wavelength suitable for cutting a specific portion of the biopolymer may have a characteristic vibration of a chemical bond at a portion to be cut. The wavelength is a wavelength that resonates with the wavelength.
[0025]
According to this biopolymer photodecomposition device, information on a portion of the biopolymer to be cut is input by the information input means. Then, information on a laser wavelength suitable for cutting a specific portion of the biopolymer is stored in the storage means. Here, the laser wavelength suitable for cutting the specific site of the biopolymer is a wavelength that resonates with the natural vibration of the chemical bond of the site to be cut, and the information input unit is referred to the storage unit. A laser having a wavelength that resonates with the natural vibration of the chemical bond at the site where the biopolymer is to be cut is applied to the biopolymer sample by the wavelength control means.
[0026]
The biopolymer photocleaving device of the present invention is an embodiment in which the biopolymer is a protein or a polysaccharide in the above biopolymer photocleaving device.
[0027]
According to this biopolymer photocleaving device, a protein or polysaccharide is supported by the support means under normal pressure as a biopolymer to be cut. The protein or polysaccharide supported by the support means under normal pressure is irradiated with an infrared laser by the infrared laser irradiation means.
[0028]
Further, in the biopolymer photocleaving device of the present invention, in the biopolymer photocleaving device described above, the information on the site to be cut is information on at least one amino acid constituting a protein or polysaccharide. And information on at least one monosaccharide.
[0029]
According to this biopolymer photocleaving apparatus, the information on the site to be cut is information on at least one amino acid constituting a protein or information on at least one monosaccharide constituting a polysaccharide, In the information input means, information on at least one amino acid constituting a protein or information on at least one monosaccharide constituting a polysaccharide is inputted as information on a site to be cleaved of a biopolymer. Then, information on a laser wavelength suitable for cutting a specific portion of the biopolymer (protein, polysaccharide, etc.) is stored in the storage means. With reference to the storage means, a laser having a wavelength corresponding to a site to be cut of a biopolymer (protein, polysaccharide, etc.) input by the information input means is transmitted to the biopolymer ( Irradiate the sample (protein, polysaccharide, etc.).
[0030]
Further, the biopolymer photocleaving method of the present invention is characterized in that the biopolymer is cut by irradiating an infrared laser under normal pressure.
[0031]
According to the biopolymer photocleaving method, the biopolymer is irradiated with an infrared laser under normal pressure to cut the biopolymer.
[0032]
The biopolymer photocleaving method of the present invention is an embodiment in which the infrared laser is a pulse laser in the above biopolymer photocleavage method.
[0033]
According to the biopolymer photocleaving method, the infrared laser is a pulse laser, and the biopolymer is irradiated with a pulse laser (infrared laser) under normal pressure, and the pulse laser (infrared laser) is irradiated. Thereby, the biopolymer is cleaved.
[0034]
Further, the biopolymer photocleaving method of the present invention is the biopolymer photocutting method described above, wherein the wavelength of the infrared laser is a wavelength that resonates with a natural vibration of a chemical bond to be cut of the biopolymer. Things.
[0035]
According to this biopolymer photocleaving method, the wavelength of the infrared laser is a wavelength that resonates with the natural vibration of the chemical bond to be cut of the biopolymer, and the biopolymer is under normal pressure at a high An infrared laser having a wavelength that resonates with the natural vibration of the chemical bond to be cut by the molecule is irradiated to cut the biopolymer.
[0036]
The biopolymer photocleaving method of the present invention is an embodiment in which the biopolymer is a protein or a polysaccharide in the above biopolymer photocleavage method.
[0037]
According to this biopolymer photocleaving method, the biopolymer to be cut is a protein or a polysaccharide, and the biopolymer (protein, polysaccharide, etc.) is irradiated with an infrared laser, and the biopolymer (protein , Polysaccharides, etc.) are cleaved.
[0038]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
In the present invention, the biopolymer is not particularly limited as long as it is a polymer existing in an organism.For example, in addition to biopolymers such as proteins and polysaccharides, biomolecules such as glycoprotein, proteoglycan, and glycolipit can be used. Polymers can be given.
[0039]
The protein in the present invention refers to a protein in which a plurality of amino acids are peptide-bonded, and includes a dipeptide consisting of two amino acids, an oligopeptide, a polypeptide, and a protein having a molecular weight of more than 1000 kDa. In addition, a charged substance, that is, a protein ion is also included in the protein of the present invention. Furthermore, the protein in the present invention may be modified, for example, acetylated, methylated, phosphorylated, hydroxylated, disulfide bond-formed, sugar chain-added, and the like. It is not limited to these.
[0040]
Further, the polysaccharide in the present invention means a carbohydrate which produces one or more monosaccharides by hydrolysis, and is either a simple polysaccharide composed of the same kind of monosaccharide or a complex polysaccharide composed of different kinds of monosaccharides. Including. Further, glycoproteins, proteoglycans, glycolipids, and the like bound to proteins are also included.
[0041]
The term “normal pressure” in the present invention means a pressure other than a vacuum, and includes not only the atmospheric pressure but also a pressure obtained by reducing or increasing the pressure to some extent. Accordingly, the atmospheric pressure may be, for example, an atmospheric pressure of 1.33 hPa (1 Torr) or more, and preferably around atmospheric pressure (1013 hPa) from the viewpoint of ease of the cutting process. Specifically, for example, 700 to 1500 hPa, preferably 900 to 1100 hPa can be used, but the present invention is not limited thereto.
[0042]
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the drawings, but the present invention is not limited to these drawings.
[0043]
First, a first embodiment of the present invention will be described.
FIG. 1 shows an example of a biopolymer photocleaving device of the present invention. In FIG. 1, a biopolymer optical cutting device of the present invention includes a laser oscillator 1, a shutter 2, a galvanometer mirror 3, a power meter 4, a lens 5, a barium fluoride (BaF). ₂ ) A plate 6, a sample 10, a sample holder 7, and a slide glass 8 are arranged in this order.
The laser oscillator 1 constitutes the infrared laser irradiation means of the present invention, and uses barium fluoride (BaF). ₂ ) The plate 6, the sample holder 7, and the slide glass 8 constitute the sample supporting means of the present invention.
The present invention is configured as described above, and its operation will be described below.
In FIG. 1, an infrared laser beam emitted from a laser oscillator 1 is opened by a shutter 2 for a predetermined time.
The laser light that has passed through the shutter 2 passes through the galvanometer mirror 3 and is condensed by the lens 5 and irradiates the sample 10.
The sample 10 is placed on a slide glass 8, the side is fixed by the sample holder 7, and the top is BaF ₂ Covered by plate 6.
The galvano mirror 3 has a function of scanning the laser beam and irradiating the sample 10 by changing the angle of a mirror provided inside. Thereby, the sample 10 which is a biopolymer is cut.
The power meter 4 is inserted between the galvanometer mirror 3 and the lens 5 so as to measure the laser beam intensity.
[0044]
Here, in FIG. 1, a liquid layer sample is used as the sample 10. However, the support means for supporting the sample used in the present invention is not particularly limited as long as the sample can be supported and an infrared laser can be irradiated. An appropriate material can be selected and used according to each liquid layer sample.
[0045]
For example, in the case of a liquid layer sample, as shown in FIGS. 4A to 4E, a target biopolymer is dropped on a slide glass surrounded by a sample holder, and the upper surface is made of barium fluoride (BaF). ₂ ) Or potassium bromide (KBr), the sample can be supported as it is by covering it with a plate made of a material having low infrared absorption.
In this case, after the biopolymer is cut by the infrared laser, it is possible to move to the next analysis step or the like while keeping the solution system.
[0046]
In addition, in the case of a solid layer sample, as shown in FIGS. ₂ The sample can be easily supported on the substrate by using a substrate such as KBr or KBr and dropping the target biopolymer solution onto these substrates and drying the solution.
[0047]
Further, as another means for supporting a sample, a separation carrier for biopolymers such as polyacrylamide gel can be used.
In this case, a biopolymer such as a protein is separated by polyallylamide gel electrophoresis, and the polyacrylamide gel to which the biopolymer is adsorbed can be used as it is as a supporting means for supporting a sample. Analysis of molecules can be efficiently performed.
[0048]
The infrared laser irradiating means of the present invention is not particularly limited as long as it can irradiate infrared rays. For example, a free electron laser, a YAG laser, a CO ₂ Lasers and the like can be given.
[0049]
The wavelength of the infrared laser used in the present invention is not particularly limited as long as it can cut a chemical bond of a biopolymer, but from the viewpoint that it is possible to selectively cut a chemical bond of interest. It is preferable to use a wavelength that resonates with the natural vibration of the chemical bond to be broken.
The range of the wavelength actually used is, for example, 0.7 to 100 μm, preferably 1 to 50 μm.
[0050]
In addition, as the infrared laser used in the present invention, it is preferable to use a pulse laser from the viewpoint of efficiently breaking chemical bonds of biopolymers.
That is, even when a sample is irradiated with an infrared laser and a chemical bond to be cut is vibrated, vibration is usually relaxed (attenuated), and it may be difficult to transmit energy efficiently.
In this case, by irradiating the laser as a pulse at a timing no longer than the vibration relaxation (attenuation), it is possible to efficiently cut the target chemical bond.
The pulse width may be appropriately determined depending on the type of the chemical bond to be cut. For example, the pulse width may be several fsec (femtosecond) to several hundred psec (picosecond).
[0051]
Irradiation energy of the infrared laser used in the present invention is not particularly limited as long as it can break a chemical bond of a biopolymer, and examples thereof include 1 to 1000 mJ, preferably 10 to 500 mJ.
[0052]
Next, a second embodiment of the present invention will be described.
FIG. 2 shows another example of the biopolymer photocleaving device of the present invention. The control unit 20 is configured by a computer including an information input unit 30, a storage unit 32, a wavelength control unit 35, and an information analysis unit 38.
The control unit 20 is connected to the laser oscillator 1 via the wavelength control unit 35.
The control unit 20 is connected to the mass analysis unit 40 via the information analysis unit 38. Other components are the same as those in FIG.
The information input unit 30, the storage unit 32, the wavelength control unit 35, the information analysis unit 38, and the mass analysis unit 40 correspond to the information input unit, the storage unit, the wavelength control unit, the information analysis unit, and the mass analysis unit of the present invention, respectively. Constitute.
The present invention is configured as described above, and its operation will be described below.
In FIG. 2, information on a portion of the biopolymer to be cut is input to an information input unit 30. When the biopolymer is a protein, examples of information on the site to be cleaved include information on at least one amino acid constituting the protein or a sequence of at least two consecutive amino acids constituting the protein.
When the biopolymer is a polysaccharide, examples of information on the site to be cleaved include information on at least one monosaccharide constituting the polysaccharide or at least two continuous monosaccharides constituting the polysaccharide. Sequence information.
[0053]
The storage unit 32 stores information on a laser wavelength suitable for cutting a specific portion of the biopolymer.
An example of a laser wavelength suitable for cutting a specific site of a biopolymer is a wavelength that resonates with natural vibration of a chemical bond at the site to be cut.
The wavelengths that resonate with these natural vibrations can be obtained by, for example, a calculation simulation using the molecular orbital method or an infrared absorption measurement using FT-IR, as shown in FIG.
[0054]
The wavelength control unit 35 causes the laser oscillator 1 to emit a laser having a wavelength corresponding to the portion of the biopolymer to be cut, which is input by the information input unit 30, with reference to the storage unit 32.
Thus, for example, when the biopolymer is a protein, it becomes possible to selectively cleave the amino acid portion by inputting information on the amino acid at the specific site to be cleaved from the protein.
[0055]
More specifically, for example, by inputting "histidine-proline" to the information input unit 30, it becomes possible to selectively cut the binding site between histidine-proline of the protein.
In this case, as shown in FIG. 7, the wavelength giving a breathing mode of a 5-membered ring of proline is 400 cm. ^-1 It has been determined by the above calculation simulation that by irradiating this wavelength, energy is given to the 5-membered ring of proline, energy is transmitted to the bond between histidine and proline by vibrational resonance, and this bond is formed. It becomes possible to cut.
When a protein is cleaved, there are several cleavage sites as shown by cleavage sites A, B, C, and D in FIG. Therefore, for example, R in FIG. _m-1 Is a histidine residue, R _m In the case where is a proline residue, the wavelength that resonates with the natural vibration of each of the cleavage sites A, B, C, and D is determined in advance, and stored in the storage unit 32, so that cleavage at an arbitrary cleavage site can be performed. It becomes possible.
In this case, by inputting, for example, "histidine-proline" and "cleavage site B" to the information input unit 30, the peptide bond between histidine-proline of the protein can be selectively cleaved.
In FIG. 3, R represents an amino acid residue.
[0056]
Further, the mass spectrometry unit 40 collects the biopolymer sample after irradiation with the infrared laser and performs mass spectrometry.
The information obtained from the mass spectrometry unit 40 is sent to the information analysis unit 38, and the information analysis unit 38 analyzes the cut portion of the biopolymer cut by the irradiation of the infrared laser.
The analysis result (analysis result information) is stored in the storage unit 32 together with the irradiated wavelength information.
Accordingly, it is possible to determine which part of the biopolymer is cut by the actually irradiated infrared laser by actual measurement.
[0057]
Furthermore, by storing the analysis result information obtained by the information analysis unit 38 in the storage unit 32, more accurate information of a wavelength suitable for cutting a specific portion of the biopolymer can be obtained, Alternatively, the wavelength suitable for cutting calculated by calculation can be updated to an actually measured value.
Further, the information analysis unit 38 can also transmit (instruct) the wavelength control unit 35 with information on the site where the biopolymer is to be cut next time.
For example, in the case where the biopolymer is a protein, information on "histidine-proline" is input to the information input unit 30 and a protein sample after irradiation with an infrared laser is collected and analyzed by the mass spectrometer 40. When it is found that no cleavage has occurred, for example, the predetermined amino acid sequence information to be subsequently cut is transmitted (instructed) to the wavelength control unit 35, and the next infrared laser irradiation can be performed.
[0058]
The mass spectrometry means used in the present invention is not particularly limited as long as it can perform mass spectrometry, but MALDI-TOF is particularly preferable from the viewpoint that biopolymers can be analyzed with high accuracy.
[0059]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to Examples.
<Example of cutting substance P>
Using the biopolymer photocleaving device of FIG. 1, substance P (SEQ ID NO: 1, SUB P) was cut in the following procedure.
In addition, substance P is known as a neuropeptide which is a chemical messenger released from nerve cells, and its amino acid sequence is “Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gyl-Leu”. -Met ".
First, Substance P powder (manufactured by SIGMA) is dissolved in MilliQ water to make a 2 pmol / μL solution, and 10 μL is dropped on a slide glass having a sample holder as shown in FIG. ₂ Covered with boards.
After irradiating a wavelength-tunable infrared laser using the biopolymer photocleaving device shown in FIG. 1 and cutting the substance P, a mixture of MilliQ water and methanol (50:50) (containing 1% acetic acid) is used. Sample on slide glass and BaF ₂ The sample after the laser irradiation was collected from the substrate and used as a 20 pmol / μL solution. The collected peptide was put into an Eppendorf tube, and then mass spectrometry was performed using 5 pmol / μL diluted four-fold.
The outline of the procedure is shown in FIGS.
The mass spectrometry was performed using a tandem quadrupole / time-of-flight hybrid (qq-TOF) mass spectrometer (QSTAR PULSAR manufactured by Applied Biosystems).
First, substance P was dropped on a slide glass as a reference without laser irradiation, and was collected 30 minutes later and subjected to mass spectrometry.
The result is as shown in FIG. As shown in FIG. 8, the divalent parent ion [SUB P + 2H] ²⁺ (M / z = 674.3 Da) and the peak of m / z = 437.2 were observed most strongly.
Next, an irradiation experiment was performed using a tunable infrared laser. The laser used at this time is characterized by an extremely short micro pulse having a pulse width of about 5 ps, and this pulse is output for about 20 ms every 44.8 ns. A macro pulse was formed from 450 of these micro pulses, and the macro pulse was output at 10 Hz.
Using this wavelength-tunable infrared laser, the wavelength was adjusted to 6.1 μm, and then the sample was irradiated for 30 minutes. The sample after the laser irradiation was collected and subjected to mass spectrometry. The result is, as shown in FIG. 9, the divalent value of substance P ([SUB P + 2H] ²⁺ ), Which are hardly observed from the sample irradiated with m / z = 674.3, and ions not observed by reference on the lower sample side (m / z <400) can be found. Also, the peak at m / z = 437.2 observed in the reference was similarly observed.
The wavelength was adjusted to 7.7 μm, 8.1 μm, and 10.6 μm by this method, and the selectivity of the peptide cleavage site due to the wavelength dependence was investigated. In addition, the laser beam intensity by the power meter inserted between the galvanometer mirror and the lens was 12 to 15 mW (wavelength: 6.1 μm) and 22 to 25 mW (wavelength: 7.7 to 10.6 μm). .
In order to clarify the difference between the sample not irradiated with the infrared laser and the sample irradiated with the infrared laser, the difference spectrum obtained by subtracting the value in FIG. 8 from the value in FIG. 9 is shown in FIG. 6.1 μm).
Further, FIG. 10 also shows the difference spectra when the laser beams having the wavelengths of 7.7 μm, 8.1 μm, and 10.6 μm were respectively irradiated. In all these spectra, peaks appeared on the low m / z side, and the peaks could be identified as shown in FIG. 10 (c), confirming that substance P was decomposed.
From the above results, the utility of the biopolymer photocleaving device and the biopolymer photocleavage method of the present invention was confirmed.
[0060]
【The invention's effect】
According to the present invention, it is possible to provide a biopolymer photocleaving apparatus and a biopolymer photocleaving method for cutting a biopolymer without using an enzyme.
[0061]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a first embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a schematic configuration diagram of a second embodiment of the present invention.
FIG. 3 is a diagram illustrating a cleavage site of a protein.
FIG. 4 is a diagram showing a procedure for implementing the present invention (in the case of a liquid layer sample).
FIG. 5 is a diagram showing a procedure for implementing the present invention (in the case of a solid layer sample).
FIG. 6 is a diagram showing main group vibrations in an IR wavelength region.
FIG. 7 is a diagram showing a relationship between a specific site of a biopolymer to be cut and a laser wavelength suitable for cutting the specific site.
FIG. 8 is a diagram showing a result of mass spectrometry of Substance P not irradiated with laser as a reference.
FIG. 9 is a diagram showing the results of mass spectrometry of Substance P cut by laser irradiation (wavelength: 6.1 μm).
FIG. 10 is a diagram showing a difference spectrum of substance P cut by laser irradiation (wavelength: 6.1 μm, 7.7 μm, 8.1 μm, 10.6 μm).
[Explanation of symbols]
1 Laser oscillator
2 shutter
3 Galvo mirror
4 Power meter
5 lens
6 BaF ₂ Board
7 Sample holder
8 slide glass
10 samples
20 control unit
30 Information input section
32 storage unit
35 Wavelength control unit
38 Information Analysis Department
40 Mass spectrometer
A, B, C, D cleavage site

Claims

What is claimed is: 1. A biopolymer photocleaving device, comprising: a support means for supporting a biopolymer sample under normal pressure; and an infrared laser irradiation means for irradiating the biopolymer sample with an infrared laser.

The biopolymer photocleaving device according to claim 1, wherein the infrared laser is a pulse laser.

The biopolymer photocleaving device according to claim 1 or 2, wherein the wavelength of the infrared laser is a wavelength that resonates with natural vibration of a chemical bond to be cut by the biopolymer.

Information input means for inputting information of a site to be cut of the biopolymer,
Storage means for storing information of a laser wavelength suitable for cutting a specific portion of a biopolymer,
With reference to the storage means, a wavelength control means for irradiating the biopolymer sample with a laser having a wavelength corresponding to the site to be cut of the biopolymer input by the information input means,
The biopolymer photocleaving device according to claim 1 or 2, further comprising:

Mass spectrometry means for performing mass spectrometry by collecting the biopolymer sample after infrared laser irradiation,
Information analyzing means for analyzing the cut portion of the biopolymer cut from the information obtained by the mass spectrometry means and transmitting the information obtained by the data analysis means together with the wavelength information of the irradiated infrared laser to the storage means; When,
The biopolymer photocleaving device according to claim 4, further comprising:

Mass spectrometry means for performing mass spectrometry by collecting the biopolymer sample after infrared laser irradiation,
Information analysis means for transmitting the information of the site to be cut of the next biopolymer from the information obtained by the mass analysis means to the wavelength control means,
The biopolymer photocleaving device according to claim 4 or 5, further comprising:

The biopolymer light according to any one of claims 4 to 6, wherein the laser wavelength suitable for cutting the specific site of the biopolymer is a wavelength that resonates with natural vibration of a chemical bond at the site to be cut. Cutting device.

The biopolymer photocleaving device according to any one of claims 1 to 7, wherein the biopolymer is a protein or a polysaccharide.

The biopolymer photocleaving device according to claim 8, wherein the information on the site to be cleaved is information on at least one amino acid constituting a protein or information on at least one monosaccharide constituting a polysaccharide. .

A biopolymer photocleaving method for cutting a biopolymer by irradiating an infrared laser under normal pressure.

The method according to claim 10, wherein the infrared laser is a pulse laser.

The biopolymer photocleaving method according to claim 10 or 11, wherein the wavelength of the infrared laser is a wavelength that resonates with natural vibration of a chemical bond to be cut of the biopolymer.

The biopolymer photocleaving method according to any one of claims 10 to 12, wherein the biopolymer is a protein or a polysaccharide.