【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、可溶性ｇｐ１３０又はその類縁体を有効成分とする医薬に関するものであり、更に詳細には、ＩＬ−６／可溶性ＩＬ−６受容体複合体によるＩＬ−６トランスシグナリングに対する中和活性により病態改善を行なうことのできる、炎症性腸疾患等各種の炎症性疾患又は悪性腫瘍の予防治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
潰瘍性大腸炎やクローン病などの炎症性腸疾患（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓｅａｓｅ：ＩＢＤ）は、未だその原因が明らかにされていない消化管疾患であり、現在様々な治療・予防方法の確立が急務とされている。長期間に亘る腸炎病変の回復と再発が繰り返されるのが、炎症性腸疾患の特徴であり、現在のところ治療は長期間に亘る薬剤投与法によるしかない。
【０００３】
一方、我々のこれまでの研究によって、ヒトＩＢＤおよび動物ＩＢＤモデルのいずれでも、病変部の腸粘膜上皮細胞においてＳＴＡＴ（Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｕｔｉｏｎ ）−３のリン酸化応答が亢進していることが見出されている。ＳＴＡＴ−３分子のリン酸化に関わる分子としては、インターロイキン（ＩＬ）−６、白血病増殖阻止因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）等が知られている。
【０００４】
また、ヒトＩＢＤ及び動物ＩＢＤモデルにおいて、腸上皮細胞でのＩＬ−６産生が亢進していることも明らかとなっている。従って、ヒトＩＢＤおよびＩＢＤモデル動物に認められる腸上皮細胞のＳＴＡＴ−３のリン酸化は、炎症に伴って腸上皮細胞或いは粘膜固有層細胞において産生されるＩＬ−６に起因している可能性が高い。
【０００５】
ＩＬ−６は、炎症反応時、腸上皮細胞あるいは単球、マクロファージによって分泌される可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）と複合体を形成する。非リンパ系細胞を含めたほぼ全ての細胞に発現するＩＬ−６受容体のシグナル伝達鎖である膜糖タンパク質のｇｐ１３０分子は、複合体化したＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒと会合し、細胞内にシグナルを伝達する。
【０００６】
従って、複合体化したＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒは、ｇｐ１３０分子に結合することで、ＩＬ−６Ｒを発現していない細胞系へもシグナルを伝達し、炎症反応を誘導する。以上のことから、ＩＬ−６／ＳＴＡＴ−３リン酸化応答系の制御は、種々の炎症性腸疾患の抑制方法として現在注目されている。
【０００７】
ところで、ＩＬ−６受容体と同様に受容体がｇｐ１３０を共有しているオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）のアンタゴニストを、炎症性関節症又は炎症性疾患の治療又は予防用の医薬を製造する場合におけるＯＳＭのアンタゴニストの使用が提案されている（特許文献１参照）。即ち、ＯＳＭのアンタゴニストを炎症性疾患の治療又は予防に用いようとする提案である。
【０００８】
【特許文献１】
特表２００２−５０７５８０号公報
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ＯＳＭがマクロファージでＴＮＦα分泌を誘導することをきっかけとしてなされた先の提案は、ＩＬ−６ファミリーのメンバーを阻害することがない点で、炎症に伴って腸上皮細胞において産生されるＩＬ−６に起因すると考えられるＳＴＡＴ−３のリン酸化を妨げるものではない。
【００１０】
ところで、炎症性腸疾患において、従来のような長期間に亘る薬剤投与法による治療では、副作用が問題となっており、より治療効果の高い薬剤の開発が求められている。
【００１１】
また、上記の如く、炎症性腸疾患の病変部腸上皮細胞及び粘膜固有層細胞においても亢進が見られるＳＴＡＴ−３のリン酸化応答系の制御は、炎症性腸疾患の炎症性病変の抑制も期待できるため、そのような制御効果を有すると同時に安全性の高い物質を得られれば、炎症性腸疾患を始めとする炎症性疾患に効果的に予防あるいは治療することも可能となる。
【００１２】
従って、本発明は、上記問題点に鑑み、安全性が高く且つ有効性が高い物質を有効成分とすることを特徴とする炎症性疾患又は悪性腫瘍の予防治療剤を得ることを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
請求項１に記載された発明に係る炎症性疾患の予防治療剤は、可溶性ｇｐ１３０又はその類縁体を有効成分とするものである。
【００１４】
請求項２に記載された発明に係る炎症性疾患の予防治療剤は、請求項１に記載の予防治療剤が炎症性腸疾患予防治療剤であるものである。
【００１５】
請求項３に記載された発明に係る炎症性疾患の予防治療剤は、請求項１に記載の予防治療剤が抗リューマチ剤であるものである。
【００１６】
請求項４に記載された発明に係る炎症性疾患の予防治療剤は、請求項１に記載の予防治療剤が免疫抑制剤であるものである。
【００１７】
請求項５に記載された発明に係る悪性腫瘍の予防治療剤は、可溶性ｇｐ１３０又はその類縁体を有効成分とするものである。
【００１８】
請求項６に記載された発明に係る炎症性疾患又は悪性腫瘍の予防治療剤は、請求項１〜５の何れかに記載の予防治療剤がＩＬ−６／可溶性ＩＬ−６受容体複合体によるｇｐ１３０へのＩＬ−６トランスシグナリングを中和するものである。
【００１９】
請求項７に記載された発明に係る炎症性疾患又は悪性腫瘍の予防治療剤は、可溶性ｇｐ１３０又はその類縁体と、薬学的に許容される担体とを含むものである。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明においては、安全性が高く且つ有効性が高い物質である可溶性ｇｐ１３０又はその類縁体を有効成分とする炎症性疾患の予防治療剤である。
【００２１】
即ち、本発明者らは、上記のように、炎症性腸疾患の病変部腸上皮細胞においても亢進が見られたＳＴＡＴ−３リン酸化応答系について鋭意研究を行ない本発明をなした。
【００２２】
具体的には、細胞外へ一部を表出したｇｐ１３０へ結合する複合体化したＩＬ−６／可溶性ＩＬ−６受容体（ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ）に対して、予め中和することのできる物質を投与することにより、ＳＴＡＴ−３リン酸化応答系を制御し、有効に炎症腸疾患を予防治療できることを見出した。
【００２３】
即ち、炎症性腸疾患モデル（ＳＡＭＰ１／Ｙｉｔ系統（Ｇｕｔ （１９９８） ｖｏｌ４３ ｐ７８及びＪ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ （２００１） ｖｏｌ１０７ ｐ６９５））の炎症発症過程における腸粘膜組織のリン酸化ＳＴＡＴ−３分子の発現動態を解析し、ＩＬ−６／可溶性ＩＬ−６受容体複合体に結合し同複合体によるＩＬ−６トランスシグナリングに対する中和活性を有する可溶性ｇｐ１３０の病態制御の可能性について解析することにより、上記中和活性を有する可溶性ｇｐ１３０が、ＩＬ−６／ＳＴＡＴ−３による活性化シグナルを除去し、炎症性腸疾患モデルの腸炎を軽減することを見出し本発明を完成した。
【００２４】
本発明の可溶性ｇｐ１３０とは、ヒト又は動物のＩＬ−６受容体のｇｐ１３０分子の細胞外ドメインのことである。また、可溶性ｇｐ１３０の類縁体とは、可溶性ｇｐ１３０が有するＩＬ−６／ｓＩＬ−６受容体複合体によるｇｐ１３０へのトランスシグナリングの中和活性を保持した範囲内で、低分子化等の処理を施されたものを指す。可溶性ｇｐ１３０を炎症性脳疾患等のヒト疾患に用いる場合には、ヒト由来のものを用いることが好ましく、動物用の予防治療剤として用いる場合には、対象となる動物由来のものを用いることが好ましい。
【００２５】
可溶性ｇｐ１３０は、以下のようにして得ることができる。例えば、ヒトｇｐ１３０細胞外ドメイン６１９アミノ酸（可溶性ｇｐ１３０）をコードするｃＤＮＡ（Ｃｅｌｌ ｖｏｌ．１６３， ｐ１１４９−１１５７）をネオマイシン耐性遺伝子と共に、定法に従いｃｏｓ細胞等にトランスフェクションし、ポジティブクローンを得る。得られたポジティブクローンより可溶性ｇｐ１３０を精製することで、可溶性ｇｐ１３０を取得することができる。
【００２６】
可溶性ｇｐ１３０又はその類縁体による炎症性腸疾患の予防治療効果は、以下のようなメカニズムによるものと思われる。一般に、ＩＬ−６は、Ｔｈ２サイトカインとして、ヘルパーＴ細胞により、分泌されＢ細胞の抗体産生細胞への分化・増殖に重要なサイトカインである。しかし、炎症反応においては、マクロファージ等により、可溶性ＩＬ−６受容体（ｓｏｌｕｂｌｅ ＩＬ−６：ｓＩＬ−６Ｒ）が産生される。
【００２７】
ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ複合体は、ほぼすべての細胞に発現したＩＬ−６Ｒｂ鎖（ｇｐ１３０）分子を介してＩＬ−６シグナルを伝達し（トランスシグナリング）、炎症反応を助長すると考えられている。可溶性ｇｐ１３０（ｓｏｌｕｂｌｅ ｇｐ１３０ ：ｓｇｐ１３０）分子は、このようなＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒによるトランスシグナリングを中和し、結果的に腸炎の改善効果を奏していると考えられるのである。一方、上記中和活性は、悪性腫瘍におけるアポトーシス誘導の抑制シグナルを阻害するため（Ｌｅｕｋｅｍｉａ （２００２） ｖｏｌ．１６ ｐ１１８９−１１９６）、可溶性ｇｐ１３０は、こうした作用により悪性腫瘍の予防治療効果を奏すると考えられる。
【００２８】
このため、可溶性ｇｐ１３０又はその類縁体は、ｇｐ１３０を介したＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒによるトランスシグナリングにより制御される疾病、例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病、慢性関節リュウマチ等に代表される炎症性疾患の予防治療剤や抗腫瘍剤（悪性腫瘍の予防治療剤）等の用途に使用することが可能である。特に、炎症性腸疾患の予防治療剤として用いた場合に、その予防治療効果が顕著に発揮されるため好ましい。また、可溶性ｇｐ１３０は、動物用の炎症性疾患の予防治療剤、悪性腫瘍の予防治療剤として用いることも可能である。
【００２９】
本発明において、可溶性ｇｐ１３０等の炎症性腸疾患予防治療効果は、ＳＰＦ環境下においてヒトクローン病類似病変を発症するモデルマウス（ＳＡＭＰ１／Ｙｉｔ系統；Ｇｕｔ （１９９８） ｖｏｌ４３ ｐ７８及びＪ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ （２００１） ｖｏｌ１０７ ｐ６９５）を用いて確認した。即ち、後述する実施例に示すように、可溶性ｇｐ１３０の投与によりＳＴＡＴ−３リン酸化の抑制、回腸組織重量、腸炎組織学的スコア及びＭＰＯ活性の低下を伴った腸炎に対する改善効果が確認された。
【００３０】
本発明の可溶性ｇｐ１３０又はその類縁体は、上記のとおり優れた生理効果を奏するとともに、安全かつ安定な素材であるので、炎症性腸疾患や抗炎症剤、抗リュウマチ剤、免疫抑制剤、抗腫瘍剤等の用途を意図した医薬品等とすることが可能である。例えば医薬組成物として用いる場合であれば、上記可溶性ｇｐ１３０等を定法に従って薬学的に許容される担体とともに種々の剤型とすることができる。剤型としては、カプセル剤、顆粒剤、錠剤、被膜錠剤、散剤等の固形製剤あるいはシロップ剤、内服液剤、エリキシル剤等の液状製剤として経口投与する経口用製剤や、注射剤、直腸投与剤等の非経口用製剤とすることが可能であり、注射剤、直腸投与剤とすることが好ましい。
【００３１】
各製剤（医薬組成物）を製造する場合、例えば経口用製剤であれば、賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を加えた後、定法により上記剤型に加工し製造することができる。そのような添加剤としては、当該分野で一般的に使用されているものを用いることができ、例えば賦形剤としては、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、澱粉、結晶セルロース、微結晶セルロース、炭酸カルシウム、カオリン、乳酸カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、無水ケイ酸等を、結合剤あるいは崩壊剤としては、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、ヒドロキシプロピルスターチ、リン酸カルシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖、白糖等を、滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム等のステアリン酸塩、精製タルク、ホウ酸、ポリエチレングリコール等を、矯味剤としては、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が例示できる。
【００３２】
また、経口用液状製剤を調製する場合は、矯味剤、緩衝剤、安定化剤等を加えて定法により各種製剤化を行なうことができる。緩衝剤としてはクエン酸ナトリウム等が、安定化剤としてはトラガント、アラビアゴム、ゼラチン等を例示でき、その他は上記と同様である。
【００３３】
これら医薬組成物等の形態における可溶性ｇｐ１３０等の投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり一概には決定できないが、１ｍｇ／日／ヒト〜１０ｍｇ／日／ヒトとすることが好ましく、これを１日１回又は２〜３回程度に分け投与するのが好ましい。
【００３４】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１．
材料と方法
・動物：特定病原体未感染（ＳＰＦ：ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ）ＳＡＭＰ１／Ｙｉｔ系統（雄、６−４０週齢）、ＳＰＦ ＡＫＲ／Ｊマウス（雌、６−４０週齢）を実験に用いた。
【００３５】
・ＳＡＭＰ１／Ｙｉｔマウス腸粘膜におけるリン酸化ＳＴＡＴ検出
６−４０週齢ＳＡＭＰ１／Ｙｉｔマウス回腸粘膜を脱リン酸化酵素阻害剤並びに蛋白分解酵素阻害剤を加えたｌｙｓｉｓバッファーでホモゲナイズした（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ （２００１） ｖｏｌ１４ ｐ７０５）。ＡＫＲ／Ｊマウスの回腸粘膜を対照とした。２０，０００×ｇ，１０分の遠心分離で得られた上清の蛋白量を測定した。１０ｕｇの蛋白を８％ ＳＤＳゲルで電気泳動したのち、ナイロンメンブラン上に転写した。ナイロンメンブランを３％スキムミルク／ＰＢＳ溶液で一晩ブロッキングした。翌日、各リン酸化ＳＴＡＴ分子の特異抗体で反応させ、化学発光系で反応物を検出した。
【００３６】
・ＣＩＳ３／ＳＯＣＳ３ ｍＲＮＡの検出
ＳＡＭＰ１／Ｙｉｔマウス回腸炎症部位及び非炎症部位より、常法に従ってｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。ＲＮＡ ２０ｍｇ をアガロースゲルにて電気泳動した後、ナイロンメンブレン上に転写した。ＤＩＧ標識したＣＩＳ３／ＳＯＣＳ３ ＲＮＡプローブを用いてハイブリダイズを行った。化学発光系で反応物を検出した。ヒトＩＢＤ症例より分離したＲＮＡについても同様の検索を行った。
【００３７】
・可溶化ｇｐ１３０分子によるＳＡＭＰ１／Ｙｉｔ腸炎の抑制効果の検討
可溶化ｇｐ１３０分子（ｓｇｐ１３０）は、Ｒ＆Ｄシステム（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ）より購入した。ＰＢＳに溶解したｓｇｐ１３０ （１００ｎｇ／ｈｅａｄ）を３０週齢ＳＡＭＰ１／Ｙｉｔ系統（ｎ＝４）に対し、週１回、４週間投与した。対照マウスには、ＰＢＳを投与した。マウスを解剖後、回腸粘膜の組織重量、腸炎組織学的スコア、回腸ＭＰＯ活性の測定を行い、ｓｇｐ１３０の腸炎に対する影響を調査した。
【００３８】
結果と考察
図１はＳＡＭＰ１／Ｙｉｔマウス又はコントロールＡＫＲ／Ｊマウスの回腸組織のリン酸化されたＳＴＡＴ分子のゲル電気泳動の検出結果を示す模式図である。図において、各々のレーンは各マウスの週齢を示し、レーンＰはポジティブコントロールを示す。また、ＰＹ−ＭＡＰＫはリン酸化ＭＡＰキナーゼ、Ｅｒｋ２，ＰＹ−ｐ３８，ｐ３８はマクロファージ活性化のポジティブコントロールを示す。
【００３９】
図１に示す通り、ＳＡＭＰ１／Ｙｉｔマウスの腸粘膜におけるＳｔａｔ３分子のリン酸化の経時変化について、ＡＫＲ／Ｊマウスに対し、ＳＡＭＰ１／Ｙｉｔマウス腸粘膜においては連続的なＳｔａｔ３分子のリン酸化が観察された。Ｓｔａｔ３分子リン酸化は、生後６週ＳＡＭＰ１／Ｙｉｔマウスにおいて顕著であった。また、ＳＡＭＰ１／Ｙｉｔ系統の腸粘膜では、Ｓｔａｔ５及びｐ３８分子のリン酸化の亢進も観察された。
【００４０】
Ｓｔａｔ３リン酸化酵素であるＪＡＫ３蛋白質に結合し、Ｓｔａｔ３リン酸化を抑制する蛋白質ＣＩＳ３／ＳＯＣＳ３分子のｍＲＮＡの発現を、ＳＡＭＰ１／Ｙｉｔ腸炎部及び非腸炎部分より調製されたＲＮＡを用いてノザン法で調べた。図２はその結果を示す模式図である。図２において、上図は、ＳＡＭＰ１／Ｙｉｔの炎症部位と非炎症部位とを比較したもの、下図はヒトクローン病患者のものである。また、ＪＡＢはＳＴＡＴ３リン酸化を抑制するタンパク質である。Ｇ３ＰＤＨはノーザン法において全ＲＮＡが取れていることの保証（バンドが出ていればＲＮＡ取れているといえる）である。
【００４１】
図２に示す通り、ＳＡＭＰ１／Ｙｉｔ腸炎部分では、ＣＩＳ３／ＳＯＣＳ３ ｍＲＮＡの発現が亢進していた。また、ヒトクローン病患者においてもＣＩＳ３／ＳＯＣＳ３ ｍＲＮＡの発現が亢進していた。以上の結果より、ＳＡＭＰ１／Ｙｉｔ腸炎では、ヒトクローン病と同様ＩＬ−６／Ｓｔａｔ３／ＣＩＳ３経路が活性化されていることが分かった。
【００４２】
図３〜図５は腸炎発症ＳＡＭＰ１／Ｙｉｔマウスへのｇｐ１３０の投与による結果を示す説明図であり、図３は腸炎組織の図面代用写真、図４はＳＴＡＴとＳＴＡＴ３リン酸化とのウエスタンブロット法による電気泳動写真を比較した図面代用写真、図５は腸炎組織学的スコアを示す線図である。図３〜図５に示す通り、腸炎発症ＳＡＭＰ１／Ｙｉｔマウスへのｇｐ１３０の投与により、ＳＴＡＴ３リン酸化の抑制、腸炎組織学的スコア及びＭＰＯ活性の低下（データ示さず）を伴った腸炎に対する改善効果が観察された。即ち、ＳＡＭＰ１／Ｙｉｔ系統の腸粘膜においては、ＩＬ−６／Ｓｔａｔ３／ＣＩＳ３経路の活性化が観察され、ｓｇｐ１３０を用いた同経路の遮断は、ＳＡＭＰ１／Ｙｉｔ系統の回腸炎を改善した。
【００４３】
ところで、Ｎｅｕｒａｔｈら及びＩｔｏらの実験においても可溶性ＩＬ−６受容体モノクロナール抗体のクローン病モデル動物への適用が腸炎の改善を示した実験成績が報告されている（Ｎａｔ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ （２００１） ｖｏｌ６ ｐ５８３及びＪ Ｉｍｍｕｎｏｌ （２００１） ｖｏｌ１６４ ｐ４８７８）。以上の結果より、ＩＬ−６／Ｓｔａｔ３／ＣＩＳ３経路は、ヒトクローン病の治療戦略となりうる可能性が示唆された。
【００４４】
【発明の効果】
本発明は以上説明した通り、安全性が高く且つ有効性が高い物質である可溶性ｇｐ１３０又はその類縁体を有効成分とする炎症性疾患の予防治療剤を得ることができる。即ち、細胞外へ一部を表出したｇｐ１３０へ結合する複合体化したＩＬ−６／可溶性ＩＬ−６受容体（ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ）に対して、予め中和することのできる物質を投与することにより、ＳＴＡＴ−３リン酸化応答系を制御し、有効に炎症腸疾患を予防治療できるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＳＡＭＰ１／Ｙｉｔマウス又はコントロールＡＫＲ／Ｊマウスの回腸組織のリン酸化されたＳＴＡＴ分子のゲル電気泳動の検出結果を示す模式図である。
【図２】Ｓｔａｔ３リン酸化酵素であるＪＡＫ３蛋白質に結合し、Ｓｔａｔ３リン酸化を抑制する蛋白質ＣＩＳ３／ＳＯＣＳ３分子のｍＲＮＡの発現を、ＳＡＭＰ１／Ｙｉｔ腸炎部及び非腸炎部分より調製されたＲＮＡを用いてノザン法で調べた結果を示す模式図である。
【図３】腸炎発症ＳＡＭＰ１／Ｙｉｔマウスへのｇｐ１３０の投与による腸炎組織の図面代用写真である。
【図４】ＳＴＡＴとＳＴＡＴ３リン酸化とのウエスタンブロット法による電気泳動写真を比較した図面代用写真である。
【図５】腸炎組織学的スコアを示す線図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a medicament containing soluble gp130 or an analog thereof as an active ingredient, and more specifically, a disease state due to a neutralizing activity on IL-6 trans-signaling by an IL-6 / soluble IL-6 receptor complex. The present invention relates to a prophylactic and / or therapeutic agent for various inflammatory diseases or malignant tumors such as inflammatory bowel disease, which can be improved.
[0002]
[Prior art]
Inflammatory bowel disease (IBD) such as ulcerative colitis and Crohn's disease is a gastrointestinal tract disease whose cause has not yet been elucidated, and it is urgently necessary to establish various treatment and prevention methods at present. ing. Repeated recovery and recurrence of enteritis lesions over a long period of time is characteristic of inflammatory bowel disease, and at present, the only treatment is long-term drug administration.
[0003]
On the other hand, our studies show that the phosphorylation response of STAT (Signal Transducer and Activator of Transcription) -3 is enhanced in intestinal mucosal epithelial cells at the lesion site in both human IBD and animal IBD models. Have been found. Known molecules involved in the phosphorylation of the STAT-3 molecule include interleukin (IL) -6, leukemia growth inhibitory factor (LIF), oncostatin M (OSM), and the like.
[0004]
In human IBD and animal IBD models, it has also been revealed that IL-6 production in intestinal epithelial cells is enhanced. Therefore, the phosphorylation of STAT-3 in intestinal epithelial cells observed in human IBD and IBD model animals may be due to IL-6 produced in intestinal epithelial cells or lamina propria cells with inflammation. high.
[0005]
IL-6 forms a complex with the soluble IL-6 receptor (sIL-6R) secreted by intestinal epithelial cells or monocytes or macrophages during the inflammatory response. The gp130 molecule of the membrane glycoprotein, which is a signaling chain of the IL-6 receptor expressed in almost all cells including non-lymphoid cells, associates with the complexed IL-6 / sIL-6R, Signal.
[0006]
Thus, the complexed IL-6 / sIL-6R, by binding to the gp130 molecule, also transmits a signal to cell lines that do not express IL-6R and induces an inflammatory response. From the above, the control of the IL-6 / STAT-3 phosphorylation response system is currently receiving attention as a method for suppressing various inflammatory bowel diseases.
[0007]
By the way, an oncostatin M (OSM) antagonist in which the receptor shares gp130 like the IL-6 receptor is used as an OSM in the case of producing a medicament for treating or preventing inflammatory arthropathy or an inflammatory disease. The use of an antagonist has been proposed (see Patent Document 1). That is, it is a proposal to use an OSM antagonist for the treatment or prevention of an inflammatory disease.
[0008]
[Patent Document 1]
Japanese Unexamined Patent Publication No. 2002-507580
[Problems to be solved by the invention]
However, previous proposals, triggered by OSM inducing TNFα secretion in macrophages, suggest that IL-produced in intestinal epithelial cells with inflammation, in that it does not inhibit members of the IL-6 family. It does not prevent the phosphorylation of STAT-3, which is considered to be caused by No. 6.
[0010]
By the way, in the treatment of inflammatory bowel disease by the conventional drug administration method over a long period of time, side effects have become a problem, and the development of a drug having a higher therapeutic effect has been demanded.
[0011]
In addition, as described above, the regulation of the STAT-3 phosphorylation response system, which is also enhanced in the intestinal epithelial cells and the lamina propria cells in the lesion of inflammatory bowel disease, suppresses the inflammatory lesions of inflammatory bowel disease. Since a promising substance having such a control effect and high safety can be expected, it is possible to effectively prevent or treat inflammatory diseases such as inflammatory bowel disease.
[0012]
Accordingly, an object of the present invention is to provide a prophylactic / therapeutic agent for an inflammatory disease or a malignant tumor characterized in that a highly safe and highly effective substance is used as an active ingredient in view of the above problems.
[0013]
[Means for Solving the Problems]
The preventive and therapeutic agent for an inflammatory disease according to the invention described in claim 1 contains soluble gp130 or an analog thereof as an active ingredient.
[0014]
The preventive and therapeutic agent for an inflammatory disease according to the invention described in claim 2 is the prophylactic and therapeutic agent for inflammatory bowel disease according to claim 1.
[0015]
The preventive and therapeutic agent for inflammatory diseases according to the invention described in claim 3 is the one in which the preventive and therapeutic agent according to claim 1 is an anti-rheumatic agent.
[0016]
The preventive and therapeutic agent for an inflammatory disease according to the invention described in claim 4 is the one in which the preventive and therapeutic agent according to claim 1 is an immunosuppressant.
[0017]
The preventive and therapeutic agent for malignant tumor according to the invention described in claim 5 comprises soluble gp130 or an analog thereof as an active ingredient.
[0018]
The preventive / therapeutic agent for an inflammatory disease or malignant tumor according to the invention described in claim 6 is characterized in that the preventive / therapeutic agent according to any one of claims 1 to 5 uses an IL-6 / soluble IL-6 receptor complex. It neutralizes IL-6 trans-signaling to gp130.
[0019]
The preventive and therapeutic agent for an inflammatory disease or malignant tumor according to the invention described in claim 7 includes soluble gp130 or an analog thereof and a pharmaceutically acceptable carrier.
[0020]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
In the present invention, the present invention is a prophylactic / therapeutic agent for inflammatory diseases comprising soluble gp130, which is a highly safe and highly effective substance, or an analog thereof as an active ingredient.
[0021]
That is, as described above, the present inventors have made intensive studies on the STAT-3 phosphorylation response system, which has been enhanced in intestinal epithelial cells at the lesion of inflammatory bowel disease, and made the present invention.
[0022]
Specifically, the complexed IL-6 / soluble IL-6 receptor (IL-6 / sIL-6R), which binds to gp130 partially exposed outside the cell, is neutralized in advance. It has been found that administration of a substance capable of controlling the STAT-3 phosphorylation response system enables effective prevention and treatment of inflammatory bowel disease.
[0023]
That is, the expression kinetics of phosphorylated STAT-3 molecules in the intestinal mucosal tissue during the onset of inflammation in an inflammatory bowel disease model (SAMP1 / Yit strain (Gut (1998) vol43 p78 and J Clin Invest (2001) vol107 p695)) were analyzed. By analyzing the possibility of controlling the pathological condition of soluble gp130 which binds to the IL-6 / soluble IL-6 receptor complex and has a neutralizing activity on IL-6 trans-signaling by the complex, the neutralizing activity is determined. The present inventors have found that soluble gp130 having the formula (1) removes an activation signal by IL-6 / STAT-3 and reduces enteritis in an inflammatory bowel disease model, and completed the present invention.
[0024]
The soluble gp130 of the present invention refers to the extracellular domain of the gp130 molecule of the human or animal IL-6 receptor. Further, the analog of soluble gp130 refers to an analog of soluble gp130 that has been subjected to treatment such as depolymerization within a range in which the activity of neutralizing the transsignaling to gp130 by the IL-6 / sIL-6 receptor complex of soluble gp130 is retained. Refers to what was done. When soluble gp130 is used for human diseases such as inflammatory brain diseases, it is preferable to use one derived from humans, and when it is used as a prophylactic or therapeutic agent for animals, it is preferable to use one derived from the target animal. preferable.
[0025]
Soluble gp130 can be obtained as follows. For example, a cDNA (Cell vol. 163, p1149-1157) encoding 619 amino acids (soluble gp130) of the human gp130 extracellular domain is transfected together with a neomycin resistance gene into cos cells or the like according to a standard method to obtain a positive clone. The soluble gp130 can be obtained by purifying the soluble gp130 from the obtained positive clone.
[0026]
The preventive and therapeutic effect of inflammatory bowel disease by soluble gp130 or its analogs is thought to be due to the following mechanism. In general, IL-6 is a Th2 cytokine that is secreted by helper T cells and is an important cytokine for the differentiation and proliferation of B cells into antibody-producing cells. However, in the inflammatory response, macrophages and the like produce soluble IL-6 receptor (soluble IL-6: sIL-6R).
[0027]
The IL-6 / sIL-6R complex is thought to transduce the IL-6 signal (trans-signaling) via the IL-6Rb chain (gp130) molecule expressed in almost all cells and promote the inflammatory response. . It is thought that the soluble gp130 (solvable gp130: sgp130) molecule neutralizes such IL-6 / sIL-6R trans-signaling and consequently has an effect of improving enteritis. On the other hand, since the neutralizing activity inhibits an inhibitory signal of apoptosis induction in malignant tumors (Leukemia (2002) vol. 16 p1189-1196), it is considered that soluble gp130 exerts a preventive and therapeutic effect on malignant tumors by such an action. Can be
[0028]
Therefore, soluble gp130 or an analog thereof is a disease controlled by gp130-mediated transsignaling by IL-6 / sIL-6R, for example, inflammation represented by ulcerative colitis, Crohn's disease, rheumatoid arthritis and the like. It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for sexual diseases and an antitumor agent (prophylactic / therapeutic agent for malignant tumor). In particular, when used as a prophylactic / therapeutic agent for inflammatory bowel disease, the prophylactic / therapeutic effect is remarkably exhibited, which is preferable. In addition, soluble gp130 can also be used as a preventive and therapeutic agent for inflammatory diseases and a preventive and therapeutic agent for malignant tumors for animals.
[0029]
In the present invention, the preventive and therapeutic effects of inflammatory bowel disease such as soluble gp130 are determined by the model mice (SAMP1 / Yit strain; Gut (1998) vol43 p78 and J Clin Invest (2001)) which develop human Crohn's disease-like lesions under SPF environment. vol 107 p695). That is, as shown in Examples described below, administration of soluble gp130 was confirmed to have an effect of suppressing STAT-3 phosphorylation, improving ileum tissue weight, enteritis histological score and enteritis accompanied by a decrease in MPO activity.
[0030]
The soluble gp130 of the present invention or an analog thereof exhibits an excellent physiological effect as described above and is a safe and stable material. Therefore, it is an inflammatory bowel disease, an anti-inflammatory agent, an anti-rheumatic agent, an immunosuppressant, an anti-tumor agent. It can be used as a drug intended for use as an agent. For example, when used as a pharmaceutical composition, the above-mentioned soluble gp130 and the like can be made into various dosage forms together with a pharmaceutically acceptable carrier according to a standard method. Dosage forms include solid preparations such as capsules, granules, tablets, coated tablets and powders, and oral preparations for oral administration as liquid preparations such as syrups, internal liquids, elixirs, injections, rectal preparations, etc. And parenteral preparations, preferably injections and rectal administration.
[0031]
In the case of manufacturing each preparation (pharmaceutical composition), for example, in the case of an oral preparation, an excipient and, if necessary, a binder, a disintegrant, a lubricant, a coloring agent, a flavoring agent, a flavoring agent, and the like are added. Thereafter, it can be manufactured by processing into the above-mentioned dosage form by a conventional method. As such additives, those generally used in the art can be used.For example, as excipients, lactose, sucrose, sodium chloride, glucose, starch, crystalline cellulose, microcrystalline cellulose, Calcium carbonate, kaolin, calcium lactate, magnesium metasilicate aluminate, silicic anhydride, etc., as a binder or disintegrant, water, ethanol, propanol, simple syrup, glucose solution, starch solution, gelatin solution, hydroxypropyl starch, Calcium phosphate, hydroxypropylcellulose, polyvinylpyrrolidone, carboxymethylcellulose, carboxymethylcellulose calcium, dried starch, sodium alginate, agar powder, sodium bicarbonate, calcium carbonate, sodium lauryl sulfate, stearic acid Noglycerides, lactose, sucrose, etc., as lubricants, stearate such as magnesium stearate, purified talc, boric acid, polyethylene glycol, etc., as flavoring agents, sucrose, orange peel, citric acid, tartaric acid, etc. Can be illustrated.
[0032]
In the case of preparing a liquid preparation for oral use, various preparations can be made by a conventional method by adding a flavoring agent, a buffer, a stabilizer and the like. Examples of the buffer include sodium citrate and the like, and examples of the stabilizer include tragacanth, gum arabic, gelatin and the like, and the others are the same as described above.
[0033]
The dose of the soluble gp130 and the like in the form of these pharmaceutical compositions and the like depends on the patient's condition, body weight, age, gender, etc., and cannot be unconditionally determined, but may be 1 mg / day / human to 10 mg / day / human. Preferably, it is preferably administered once or twice or three times a day.
[0034]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
Embodiment 1 FIG.
Materials and Methods / Animals: Specific pathogen-free (SPF: specific pathogen-free) SAMP1 / Yit strain (male, 6 to 40 weeks old), SPF AKR / J mouse (female, 6 to 40 weeks old) used for experiments Was.
[0035]
-Detection of phosphorylated STAT in intestinal mucosa of SAMP1 / Yit mouse The ileal mucosa of 6-40-week-old SAMP1 / Yit mouse was homogenized with a lysis buffer containing a phosphatase inhibitor and a protease inhibitor (Immunity (2001) vol14). p705). The ileal mucosa of AKR / J mice was used as a control. The amount of protein in the supernatant obtained by centrifugation at 20,000 × g for 10 minutes was measured. After electrophoresis of 10 ug of the protein on an 8% SDS gel, the protein was transferred onto a nylon membrane. The nylon membrane was blocked overnight with a 3% skim milk / PBS solution. The next day, each phosphorylated STAT molecule was reacted with a specific antibody, and the reaction product was detected with a chemiluminescence system.
[0036]
-Detection of CIS3 / SOCS3 mRNA Total RNA was prepared from inflammatory and non-inflammatory sites in the ileum of SAMP1 / Yit mice according to a conventional method. After 20 mg of RNA was electrophoresed on an agarose gel, it was transcribed on a nylon membrane. Hybridization was performed using a DIG-labeled CIS3 / SOCS3 RNA probe. Reactants were detected with a chemiluminescent system. A similar search was performed for RNA isolated from human IBD cases.
[0037]
Examination of SAMP1 / Yit enteritis inhibitory effect by solubilized gp130 molecule Solubilized gp130 molecule (sgp130) was purchased from R & D Systems (R & D systems, Inc). Sgp130 (100 ng / head) dissolved in PBS was administered to a 30-week-old SAMP1 / Yit strain (n = 4) once a week for 4 weeks. Control mice received PBS. After dissection of the mouse, the tissue weight of the ileal mucosa, enterohistological score, and ileal MPO activity were measured to investigate the effect of sgp130 on enteritis.
[0038]
Results and Discussion FIG. 1 is a schematic diagram showing the results of gel electrophoresis detection of phosphorylated STAT molecules in ileal tissues of SAMP1 / Yit mice or control AKR / J mice. In the figure, each lane indicates the age of each mouse, and lane P indicates a positive control. PY-MAPK indicates phosphorylated MAP kinase, and Erk2, PY-p38 and p38 indicate positive controls for macrophage activation.
[0039]
As shown in FIG. 1, with respect to the time course of phosphorylation of the Stat3 molecule in the intestinal mucosa of the SAMP1 / Yit mouse, continuous phosphorylation of the Stat3 molecule was observed in the intestinal mucosa of the SAMP1 / Yit mouse compared to the AKR / J mouse. Was. Stat3 molecular phosphorylation was prominent in 6-week old SAMP1 / Yit mice. In the intestinal mucosa of the SAMP1 / Yit strain, enhanced phosphorylation of Stat5 and p38 molecules was also observed.
[0040]
Expression of mRNA of CIS3 / SOCS3 molecule, a protein that binds to JAK3 protein, which is a Stat3 kinase, and inhibits Stat3 phosphorylation, was examined by Northern method using RNA prepared from SAMP1 / Yit enteritis and non-enteritis parts. Was. FIG. 2 is a schematic diagram showing the result. In FIG. 2, the upper panel shows a comparison between the inflammatory site and the non-inflammatory site of SAMP1 / Yit, and the lower panel shows a human Crohn's disease patient. JAB is a protein that suppresses STAT3 phosphorylation. G3PDH is a guarantee that the total RNA has been obtained by the Northern method (if a band appears, it can be said that RNA has been obtained).
[0041]
As shown in FIG. 2, the expression of CIS3 / SOCS3 mRNA was enhanced in the SAMP1 / Yit enteritis. In addition, expression of CIS3 / SOCS3 mRNA was also enhanced in human Crohn's disease patients. From the above results, it was found that in SAMP1 / Yit enteritis, the IL-6 / Stat3 / CIS3 pathway was activated as in human Crohn's disease.
[0042]
3 to 5 are explanatory diagrams showing the results of administration of gp130 to enteritis-inducing SAMP1 / Yit mice. FIG. 3 is a drawing substitute photograph of enteritis tissue, and FIG. 4 is a western blotting method of STAT and STAT3 phosphorylation. A drawing substitute photograph comparing electrophoretic photographs, and FIG. 5 is a diagram showing histological scores of enteritis. As shown in FIGS. 3 to 5, administration of gp130 to enteritis-inducing SAMP1 / Yit mice has an effect of suppressing STAT3 phosphorylation, improving enteritis associated with enteritis histological score and reducing MPO activity (data not shown). Was observed. That is, activation of the IL-6 / Stat3 / CIS3 pathway was observed in the intestinal mucosa of the SAMP1 / Yit strain, and blocking the same pathway using sgp130 improved ileitis of the SAMP1 / Yit strain.
[0043]
By the way, in the experiments of Neuath et al. And Ito et al., Experimental results showing that application of a soluble IL-6 receptor monoclonal antibody to a Crohn's disease model animal showed improvement of enteritis have been reported (Nat Medicine (2001) vol6 p583). And J Immunol (2001) vol 164 p4878). These results suggested that the IL-6 / Stat3 / CIS3 pathway could be a therapeutic strategy for human Crohn's disease.
[0044]
【The invention's effect】
INDUSTRIAL APPLICABILITY As described above, the present invention can provide a prophylactic / therapeutic agent for an inflammatory disease containing soluble gp130, which is a highly safe and highly effective substance, or an analog thereof as an active ingredient. That is, a substance capable of neutralizing in advance a complexed IL-6 / soluble IL-6 receptor (IL-6 / sIL-6R) that binds to gp130 partially exposed outside the cell. Is effective in controlling the STAT-3 phosphorylation response system and effectively preventing and treating inflammatory bowel disease.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram showing the results of gel electrophoresis detection of phosphorylated STAT molecules in ileal tissues of SAMP1 / Yit mice or control AKR / J mice.
FIG. 2 shows the expression of mRNA of the protein CIS3 / SOCS3 molecule, which binds to JAK3 protein which is a Stat3 kinase and inhibits Stat3 phosphorylation, using RNA prepared from SAMP1 / Yit enteritis and non-enteritis parts. It is a schematic diagram which shows the result investigated by the Northern method.
FIG. 3 is a photograph substituted for a drawing of enteritis tissue by administration of gp130 to enteritis-inducing SAMP1 / Yit mice.
FIG. 4 is a drawing substitute photograph comparing electrophoretic photographs of STAT and STAT3 phosphorylation by Western blotting.
FIG. 5 is a diagram showing enteritis histological scores.
