JP2004180565A - プロスタグランジンｆ合成酵素の結晶化と構造、およびその利用 - Google Patents

Abstract

【課題】プロスタグランジンＦ_２αシンターゼに関連する疾患または障害を処置するための医薬および方法を提供すること。
【解決手段】プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの立体構造を解明したことにより、その構造データからプロスタグランジンＦ_２αシンターゼのアンタゴニストまたはアゴニストを同定し、そのようなアンタゴニストまたはアゴニストを含む組成物を製造することにより上記課題を解決した。
【選択図】 なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼに関する。より詳細には、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの立体構造、その構造に関する情報、その情報の利用、それにより得られるプロスタグランジンＦ_２αシンターゼの調節剤およびプロスタグランジンＦ_２αシンターゼに関連する疾患または障害の処置もしくは予防剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プロスタグランジンＦ_２α（ＰＧＦ_２α）は、種々の生理学的プロセスおよび病理学的プロセスの強力なメディエイタである（非特許文献１〜４を参照）。これまでに、ＰＧＦ_２αは、肝臓の実質細胞から産生される糖の代謝制御や胆汁酸の分泌および血流量の調節などの実質・非実質細胞間のメディエイタとして機能することが考えられている（非特許文献５を参照）。またＰＧＦ_２αは、血管緊張状態、流産、卵巣機能不全、子宮筋肉および肺動脈の収縮などを調節し（非特許文献６〜１０を参照）、そして脂肪分解ホルモンとして、発情周期の間および分娩前の脂肪分解を引き起こすことも知られている（非特許文献１１を参照）。さらにＰＧＦ_２αは、原生寄生生物であるＡｍｏｅｂａ ｐｒｏｔｅｕｓにおいて、液胞形成を引き起こすことによって食作用の間のシグナルを連結する役割を果たし得る（非特許文献１２を参照）。現在では、ＰＧＦは、その子宮筋収縮作用に基づいて、陣痛促進剤として広く臨床応用されている。
【０００３】
ＰＧＦ_２は、以下の３つの経路により合成されることが公知であり、この３つの経路はいずれも、補因子を必要とする還元反応である：（１）ＰＧＨ_２（プロスタノイド生合成に共通した基質であるアラキドン酸のシクロオキシゲナーゼ代謝産物）からＰＧＦ_２αへの経路（ＰＧＨ９，１１−エンドペルオキシドレダクターゼ）；（２）ＰＧＥ_２からＰＧＦ_２αへの経路（ＰＧＥ９−ケトレダクターゼ）；および（３）ＰＧＤ_２から９α，１１β−ＰＧＦ_２への経路（ＰＧＤ１１−ケトレダクターゼ）（非特許文献１３〜１５を参照）。ＰＧＦ_２αは、最も早く発見されたプロスタノイドの１つであり、そしてその生理学的機能および生合成経路を解明しようとかなりの試みがなされてきた。しかし、ＰＧＦ_２αシンターゼの構造およびＰＧＦ_２α合成の基本的な触媒機構は、依然として十分には解明されていない。これまでに、上記の３つのＰＧＦ_２合成経路を触媒するいくつかの酵素が単離されている。上記（１）の合成経路を触媒する酵素の存在は古くから示唆されていたが、単離された酵素としての報告は近年になってからである。１９８５年に、上記（３）の経路を触媒する酵素（ウシ肺由来ＰＧＤ１１−ケトレダクターゼ）が同時に上記（１）の経路を触媒することが報告されたのに続いて、１９９７年には、ＰＧＤ_２の還元は触媒し得ないＰＧＨ９，１１−エンドペルオキシドレダクターゼがヒツジ精嚢腺ミクロソームから単離された。上記（２）の合成経路または上記（３）の合成経路を触媒する酵素も、種々の組織から単離されており、その精製、一次アミノ酸配列決定、ＰＧＦ_２合成を触媒する活性の検定などについて報告されている（非特許文献１５を参照）。しかしこれまで、ＰＧＦ_２シンターゼの三次元立体構造を解析して原子座標を明らかにし、その活性部位ポケットの位置および構造を決定したという報告はない。
【０００４】
Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉは、ヒトにおけるアフリカ睡眠病および動物におけるナガナの病因である。本発明者らの研究室での寄生性原生動物におけるアラキドン酸（ＡＡ）代謝に関する初期の研究において、本発明者らは、アルド／ケトレダクターゼ（ＡＫＲ）スーパーファミリーの５Ａ２サブファミリーのメンバーとして、ＴｂＰＧＦＳと称されるＴ．ｂｒｕｃｅｉ ＰＧＦ_２αシンターゼ（ＥＣ １．１．１．１８８）を同定した（非特許文献１６〜１７を参照）。ＡＫＲは、哺乳動物、両生類、植物、酵母、細菌および原生動物に広く分布した単量体オキシドレダクターゼを表す。ＡＫＲは、正規のロスマンフォールドモチーフを有さずに、ＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）に結合する（非特許文献１８〜２１を参照）。ＡＫＲは、広範でありそして時折重複する基質特異性を示し、未だ完全には解明されていない触媒機構によって、ＰＧ、ステロイドホルモン、モノサッカリド、イソフラビノイド、脂肪族性および芳香族性のアルデヒド、ならびに多環式芳香族性炭化水素のような基質の酸化／還元を触媒することが公知である（非特許文献２２〜２４を参照）。Ｔ．ｂｒｕｃｅｉのＰＧＦ_２αシンターゼは、９，１１−エンドペルオキシドＰＧＨ_２からＰＧＦ_２αへのＮＡＤＰＨ（ＮＡＤＰＨ＝ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）依存性還元を触媒する。Ｔ．ｂｒｕｃｅｉがプロスタグランジン（ＰＧ）を産生する理由は、未だ解明されていない。しかし、この生物が、この生物学的に活性な分子であるＰＧＦ_２αを合成する酵素を有するという事実は、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉが、ＰＧＦ_２αの関連する疾患の病原において役割を果たし得ることを示唆する。従って、ＴｂＰＧＦＳ構造の解明は興味深い。なぜなら、この構造の解明は、このＴｂＰＧＦＳ酵素の生理学的役割を研究するために必要とされる特異的インヒビターの設計に有用であり得るからである。また、このＴｂＰＧＦＳ酵素の特異的インヒビターは、ＰＧＦ_２αが関与する疾患または障害の予防薬または治療薬として有望である。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｂｙｇｄｅｍａｎ，Ｍ．，Ｒｏｔｈ−Ｂｒａｎｄｅｌ，Ｕ．ａｎｄ Ｗｉｑｖｉｓｔ，Ｎ．（１９７０）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｇｙｎａｅｃ．Ｏｂｓｔｅｔ．，８，１６２．
【非特許文献２】
Ｄａｖｉｅｓ，Ｐ．，Ｂａｉｌｅｙ，Ｐ．Ｊ．，Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｍ．ａｎｄ Ｆｏｒｄ−Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，Ａ．Ｗ．（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２，３３５−３５７．
【非特許文献３】
Ｈｏｒｔｏｎ，Ｅ．Ｗ．ａｎｄ Ｐｏｙｓｅｒ，Ｎ．Ｌ．（１９７６）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．，５６，５９５−６５１．
【非特許文献４】
Ｎａｒｕｍｉｙａ，Ｓ．，Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｙ．ａｎｄ Ｕｓｈｉｋｕｂｉ，Ｆ．（１９９９）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．，７９，１１９３−１２２６．
【非特許文献５】
Ａ．Ａｔｈａｒｉ，Ｊｕｎｇｅｒｍａｎｎ，Ｋ．，（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６３，１２３５−１２４５
【非特許文献６】
Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎ，Ｂ．（１９７９−８０）Ｈａｒｖｅｙ Ｌｅｃｔ．，７５，１−４０
【非特許文献７】
Ｍａｔｈｅ’，Ａ．Ａ．，Ｈｅｄｑｖｉｓｔ，Ｐ．，Ｓｔａｎｄｂｅｒｇ，Ｋ．ａｎｄ Ｌｅｓｌｉｅ，Ｃ．Ａ．（１９７７）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２９６，８５０−８５５．
【非特許文献８】
Ｏｌｉｗ，Ｅ．，Ｇｒａｎｓｔｒｏｅｍ，Ｅ．ａｎｄ Ａｎｇｇａｒｄ，Ｅ．（１９８３）Ｐａｃｅ−Ａｓｃｉａｋ，Ｃ．ａｎｄ Ｇｒａｎｓｔｒｏｅｍ，Ｅ．（ｅｄ．），Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ｐｐ．１１−１９．
【非特許文献９】
Ｇｌｅｗ，Ｒ．Ｈ．（１９９２）Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｒｏｍｂｏｘａｎｅｓ．Ｉｎ Ｄｅｖｌｉｎ，Ｔ．Ｍ．（ｅｄ），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．４６１−４６６
【非特許文献１０】
Ｄｕｂｏｉｓ，Ｒ．Ｎ．，Ａｂｒａｍｓｏｎ，Ｓ．Ｂ．，Ｃｒｏｆｆｏｒｄ，Ｌ．，Ｇｕｐｔａ，Ｒ．Ａ．，Ｓｉｍｏｎ，Ｌ．Ｓ．，Ｖａｎ Ｄｅ Ｐｕｔｔｅ，Ｌ．Ｂ．ａｎｄ Ｌｉｐｓｋｙ，Ｐ．Ｅ．（１９９８）ＦＡＳＥＢ Ｊ．，１２，１０６３−１０７３
【非特許文献１１】
ＭｃＣｒａｃｋｅｎ，Ｊ．Ａ．，Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｇｌｅｗ，Ｍ．Ｅ．，Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｒ．，Ｂａｉｒｄ，Ｄ．Ｔ．，Ｇｒｅｅｎ，Ｋ．ａｎｄ Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎ，Ｂ．（１９７２）Ｎａｔ．Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ．，２３８，１２９−１３４
【非特許文献１２】
Ｐｒｕｓｃｈ，Ｒ．Ｄ．，Ｇｏｅｔｔｅ，Ｓ．Ｍ．，Ｈａｂｅｒｍａｎ，Ｐ．（１９８９）Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．，２５５，５５３−５５７
【非特許文献１３】
Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｓ．（１９８３）．Ｐａｃｅ−Ａｓｃｉａｋ，Ｃ．ａｎｄＧｒａｎｓｔｒｏｅｍ，Ｅ．（ｅｄ．），Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ｐｐ．１７１−２０２
【非特許文献１４】
Ｗｉｎｔｅｒｇａｌｅｎ，Ｎ．，Ｔｈｏｌｅ，Ｈ．Ｈ．，Ｇａｌａ，Ｈ．Ｊ．ａｎｄ Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，Ｗ．（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３４，２６４−２７０
【非特許文献１５】
Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．，（２０００）Ｊｉｋｋｅｎ Ｉｇａｋｕ Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．２（Ｅｘｔｒａ Ｉｓｓｕｅ）４４−５２
【非特許文献１６】
Ｋｕｂａｔａ，Ｂ．Ｋ．，Ｄｕｓｚｅｎｋｏ，Ｍ．，Ｋａｂｕｔｕｔｕ，Ｚ．，Ｒａｗｅｒ，Ｍ．，Ｓｚａｌｌｉｅｓ，Ａ．，Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，Ｋ．，Ｉｎｕｉ，Ｔ．，Ｎｏｚａｋｉ，Ｔ．，Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｋ．，Ｈｏｒｉｉ，Ｔ．，Ｕｒａｄｅ，Ｙ．ａｎｄ Ｈａｙａｉｓｈｉ，Ｏ．（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９２，１３２７−１３３７
【非特許文献１７】
Ｊｅｚ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ Ｐｅｎｎｉｎｇ，Ｔ．Ｍ．（２００１）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔ．，１３０−１３２，４９９−５２５
【非特許文献１８】
Ｗｉｌｓｏｎ，Ｄ．Ｋ．，Ｂｏｈｒｅｎ，Ｋ．Ｍ．，Ｇａｂｂａｙ，Ｋ．Ｈ．ａｎｄ Ｑｕｉｏｃｈｏ，Ｆ．Ａ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７，８１−８４
【非特許文献１９】
Ｈｏｏｇ，Ｓ．Ｓ．，Ｐａｗｌｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｅ．，Ａｌｚａｒｉ，Ｐ．Ｍ．，Ｐｅｎｎｉｎｇ，Ｔ．Ｍ．ａｎｄ Ｌｅｗｉｓ，Ｍ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，２５１７−２５２１
【非特許文献２０】
Ｅｌ−Ｋａｂｂａｎｉ，Ｏ．，Ｊｕｄｇｅ，Ｋ．，Ｇｉｎｅｌｌ，Ｓ．Ｌ．，Ｍｙｌｅｓ，Ｄ．Ａ．，ＤｅＬｕｃａｓ，Ｌ．Ｊ．ａｎｄ Ｆｌｙｎｎ，Ｔ．Ｇ．（１９９５）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２，６８７−６９２
【非特許文献２１】
Ｗｉｌｓｏｎ，Ｄ．Ｋ．，Ｎａｋａｎｏ，Ｔ．，Ｐｅｔｒａｓｈ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ Ｑｕｉｏｃｈｏ，Ｆ．Ａ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４，１４３２３−１４３３０
【非特許文献２２】
Ｗｅｌｌｅ，Ｒ．，Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，Ｇ．，Ｓｃｈｉｌｔｚ，Ｅ．，Ｇｒｉｓｅｂａｃｈ，Ｈ．ａｎｄ Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，Ｊ．（１９９１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９６，４２３−４３０．
【非特許文献２３】
Ｐｅｔｒａｓｈ，Ｊ．Ｍ．，Ｔａｒｌｅ，Ｉ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｄ．Ｋ．ａｎｄ Ｑｕｉｏｃｈｏ，Ｆ．Ａ．（１９９４）Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４３，９５５−９５９
【非特許文献２４】
Ｐｅｎｎｉｎｇ，Ｔ．Ｍ．，Ｐａｗｌｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｅ．，Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，Ｂ．Ｐ．，Ｊｅｚ，Ｊ．Ｍ．，Ｌｉｎ，Ｈ．Ｋ．，Ｈｏｏｇ，Ｓ．Ｓ．，Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ Ｌｅｗｉｓ，Ｍ．（１９９６）Ｓｔｅｒｏｉｄｓ，６１，５０８−５２３
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
プロスタグランジンＦ_２αシンターゼに関連する疾患または障害を処置するための医薬および方法を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明では、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの立体構造を解明したことにより、その構造データからプロスタグランジンＦ_２αシンターゼのアンタゴニストまたはアゴニストを同定し、そのようなアンタゴニストまたはアゴニストを含む組成物を製造することによって、上記課題を解決した。
【０００８】
トリパノソーマ由来のプロスタグランジンＦ_２αシンターゼ（ＴｂＰＧＦＳ）の結晶化および三次元立体構造解析により、この構造を利用してプロスタグランジンＦ_２αシンターゼの相同体または活性調節剤（例えば、インヒビター）などの候補リード化合物をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで検索することが容易となり、より正確なものを決定することができる。プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの立体構造は本発明によりはじめて開示された。プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの種間にわたる類似性などから、他の種（ヒト、ウシ、ヒツジ、ラット、マウスなどの哺乳動物）のプロスタグランジンＦ_２αシンターゼの相同体または活性調節剤（例えば、インヒビター）などの候補リード化合物をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで検索することが容易となり、より正確なものを決定することができるようになった。
【０００９】
この構造解析データを利用したｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの候補リード化合物の検索方法は、数十万という化合物の中からランダムスクリーニングによってインヒビターの候補リード化合物を選択し、その誘導化およびｉｎ ｖｉｖｏでの実験を繰り返し、より強力なインヒビターを開発するという従来の方法を飛躍的に簡便化し、かつ、より確実にする。候補リード化合物を改良開発できた化合物は、ＰＧＦ_２αが関与する疾患または障害の予防薬または治療薬として使用され得る。特に、本発明の方法により得られた候補リード化合物を改良開発できた化合物は、アフリカ睡眠病の病態の１つである家畜の流産の防止薬として利用できるほか、ヒトに対しても流産防止薬として利用され得る。
【００１０】
従って、本発明は以下を提供する。
【００１１】
（１） プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体の原子座標のデータで生成される、立体構造コンピュータモデル。
【００１２】
（２） 上記原子座標は、図９に記載のプロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標またはその相同体もしくは改変体である、項目１に記載の立体構造コンピューターモデル。
【００１３】
（３） 上記原子座標はＮＡＤＰＨの原子座標を含み、かつ、図９に記載のＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ原子座標またはその相同体もしくは改変体である、項目１に記載の立体構造コンピューターモデル。
【００１４】
（４） プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体の原子座標を含むデータアレイであって、ここで上記データアレイは、三次元分子モデリングアルゴリズムを使用することにより三次元構造を提示し得る、データアレイ。
【００１５】
（５） 上記原子座標は、図９に記載の原子座標であるかまたはその相同体もしくは改変体である、項目４に記載のデータアレイ。
【００１６】
（６） 上記原子座標はＮＡＤＰＨの原子座標を含み、かつ、図９に記載のＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ原子座標またはその相同体もしくは改変体である、項目４に記載のデータアレイ。
【００１７】
（７） プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体の原子座標をコードした、コンピューター読み取り可能な記録媒体。
【００１８】
（８） 上記原子座標は、図９に記載の原子座標であるかまたはその相同体もしくは改変体である、項目７に記載のコンピューター読み取り可能な記録媒体。
【００１９】
（９） 上記原子座標はＮＡＤＰＨの原子座標を含み、かつ、図９に記載のＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ原子座標またはその相同体もしくは改変体である、項目７に記載のコンピューター読み取り可能な記録媒体。
【００２０】
（１０） プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体の立体構造解析方法を提供するためのプログラムであって、
Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体の原子座標をコードしたデータ；および
Ｂ）三次元立体構造の解析をコンピュータに実行させるアプリケーションのコード、
を含む、プログラム。
【００２１】
（１１） 上記原子座標は、図９に記載の原子座標であるかまたはその相同体もしくは改変体である、項目１０に記載のプログラム。
【００２２】
（１２） 上記原子座標はＮＡＤＰＨの原子座標を含み、かつ、図９に記載のＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ原子座標またはその相同体もしくは改変体である、項目１０に記載のプログラム。
【００２３】
（１３） 上記アプリケーションは、
Ａ）上記原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；および
Ｂ）候補化合物の三次元分子モデルを、上記三次元分子モデルと比較する工程をコンピュータに実行させる、項目１０に記載のプログラム。
【００２４】
（１４） 図９に記載の原子座標によって定義される構造を有する、単離および精製された、タンパク質またはその相同体もしくは改変体。
【００２５】
（１５） 上記タンパク質は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの活性を含む、項目１４に記載のタンパク質またはその相同体もしくは改変体。
【００２６】
（１６） 上記タンパク質は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼのＰＧＨ_２還元活性を有する、項目１４に記載のタンパク質またはその相同体もしくは改変体。
【００２７】
（１７） 正方晶系の空間群Ｐ４_１２_１２、および配列番号１に示されるアミノ酸配列、または上記アミノ酸配列に１以上の置換、付加もしくは欠失を含む配列、もしくは上記アミノ酸配列と少なくとも約３０％以上の相同性を有する、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体の結晶。
【００２８】
（１８） 上記結晶は、ＮＡＤＰＨと複合体化されている、項目１７に記載の結晶。
【００２９】
（１９） 上記結晶は、ａ＝１１２．３±０．３Å、ｂ＝１１２．３±０．３Å、ｃ＝１４０．０±０．７Åの単位格子定数を有する、項目１７に記載の結晶。
【００３０】
（２０） 上記結晶は、非対称単位中に２分子を有する、項目１７に記載の結晶。
【００３１】
（２１） プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体の活性ポケットを含む、タンパク質。
【００３２】
（２２） 上記活性ポケットは、ＮＡＤＰＨと複合体化されたものである、項目２１に記載のタンパク質。
【００３３】
（２３） 上記活性ポケットは、図９に記載されるアミノ酸残基４７、５２、７７、および１１０またはそれに対応するアミノ酸残基の原子座標によって定義される、項目２１に記載のタンパク質。
【００３４】
（２４） 上記活性ポケットは、図９に記載されるアミノ酸残基４７、４９、５２、７７、７９、および１１０またはそれに対応するアミノ酸残基の原子座標によって定義される、項目２１に記載のタンパク質。
【００３５】
（２５） 上記活性ポケットは、図９に記載されるアミノ酸残基２２、２３、４７、４９、５１、５２、７７、７９、１１０、１１１、１３９、１４０、１６１、および１８７またはそれに対応するアミノ酸残基の原子座標によって定義される、項目２１に記載のタンパク質。
【００３６】
（２６） 上記活性部位ポケットは、スルフェートアニオンを含む、項目２１に記載のタンパク質。
【００３７】
（２７） 上記タンパク質は、ＰＧＨ_２還元活性を有する、項目２１に記載のタンパク質。
【００３８】
（２８） 項目２１に記載のタンパク質のアミノ酸配列をコードする、核酸分子。
【００３９】
（２９） プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの相同体を得る方法であって、上記方法は、候補化合物の原子座標と、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標とを比較する工程を包含する、方法。
【００４０】
（３０） 上記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼは、ＮＡＤＰＨと複合体化されている、項目２９に記載の方法。
【００４１】
（３１） 上記原子座標は、図９に記載の原子座標を含む、項目２９に記載の方法。
【００４２】
（３２） プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの相同体を得る方法であって、上記方法は、以下の工程：
Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；および
Ｂ）候補化合物の三次元分子モデルを、上記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの三次元分子モデルと比較する工程
を包含する、方法。
【００４３】
（３３） 上記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼは、ＮＡＤＰＨと複合体化されている、項目３２に記載の方法。
【００４４】
（３４） 上記原子座標は、図９に記載の原子座標を含む、項目３２に記載の方法。
【００４５】
（３５） 項目２９または３２に記載の方法によって同定された、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ相同体。
【００４６】
（３６） プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの改変体を得る方法であって、上記方法は、以下の工程：
Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；および
Ｂ）候補化合物の三次元分子モデルを、上記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの三次元分子モデルと比較し、所定のパラメータに基づき変異を導入する工程、
を包含する、方法。
【００４７】
（３７） 上記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼは、ＮＡＤＰＨと複合体化されている、項目３６に記載の方法。
【００４８】
（３８） 上記原子座標は、図９に記載の原子座標を含む、項目３６に記載の方法。
【００４９】
（３９） 上記改変体は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ活性が亢進されている、項目３６に記載の方法。
【００５０】
（４０） 上記改変体は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ活性が低減されている、項目３６に記載の方法。
【００５１】
（４１） 項目３６に記載の方法によって同定された、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ改変体。
【００５２】
（４２） 項目２９もしくは３２に記載の方法によって同定されたプロスタグランジンＦ_２αシンターゼ相同体のアミノ酸配列、または項目３６に記載の方法によって同定されたプロスタグランジンＦ_２αシンターゼ改変体のアミノ酸配列をコードする核酸分子。
【００５３】
（４３） プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法であって、上記方法は、以下の工程：
Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に対して三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの活性部位ポケットの空間座標を決定する工程；および
Ｂ）上記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体の活性部位ポケットの空間座標に対して、電子的に候補化合物のセットの空間座標をスクリーニングして、上記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する工程、
を包含する、方法。
【００５４】
（４４） 上記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼは、ＮＡＤＰＨと複合体化されている、項目４３に記載の方法。
【００５５】
（４５） 上記原子座標は、図９に記載の原子座標を含む、項目４３に記載の方法。
【００５６】
（４６） 上記相同体または改変体は、項目２９、３２または３６に記載の方法によって得られたものである、項目４１に記載の方法。
【００５７】
（４７） 上記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼは、哺乳動物またはＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉのプロスタグランジンＦ_２αシンターゼを含む、項目４３に記載の方法。
【００５８】
（４８） 上記工程ａ）において決定された空間座標は、図９に記載されるアミノ酸残基４７、５２、７７、および１１０またはそれに対応するアミノ酸残基の原子座標によって定義される、項目４３に記載の方法。
【００５９】
（４９） 上記工程ａ）において決定された空間座標は、図９に記載されるアミノ酸残基４７、４９、５２、７７、７９、および１１０またはそれに対応するアミノ酸残基の原子座標によって定義される、項目４３に記載の方法。
【００６０】
（５０） 上記工程ａ）において決定された空間座標は、図９に記載されるアミノ酸残基２２、２３、４７、４９、５１、５２、７７、７９、１１０、１１１、１３９、１４０、１６１、および１８７またはそれに対応するアミノ酸残基の原子座標によって定義される、項目４３に記載の方法。
【００６１】
（５１） 上記工程ａ）において決定された空間座標は、図９に記載されるスルフェートアニオンまたはそれに対応するスルフェートアニオンの原子座標を含む、項目４３に記載の方法。
【００６２】
（５２） 候補化合物の三次元分子モデルを、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体の三次元分子モデルと比較することによって、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法であって、上記方法は、以下の工程：
Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；
Ｂ）上記三次元分子モデルの座標データをデータ構造に入力して、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子間の距離を検索する工程；および
Ｃ）候補化合物において水素結合を形成するヘテロ原子と、上記三次元分子モデルにおいて活性部位ポケットを形成するヘテロ原子との間の距離を比較して、２つの構造の間での最適な水素結合に基づいて、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの三次元分子モデルの活性部位ポケットと安定な複合体を理論上形成する候補化合物種を同定する工程、
を包含する、方法。
【００６３】
（５３） 上記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼは、ＮＡＤＰＨと複合体化されている、項目５２に記載の方法。
【００６４】
（５４） 上記原子座標は、図９に記載の原子座標を含む、項目５２に記載の方法。
【００６５】
（５５） 上記相同体または改変体は、項目２９、３２または３６に記載の方法によって得られたものである、項目５２に記載の方法。
【００６６】
（５６） 上記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼは、哺乳動物またはＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉのプロスタグランジンＦ_２αシンターゼを含む、項目５２に記載の方法。
【００６７】
（５７） 上記候補化合物は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼのＰＧＨ_２還元活性を阻害する活性を有する、項目５２に記載の方法。
【００６８】
（５８） 上記候補化合物は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼのＰＧＨ_２還元活性を活性化する活性を有する、項目５２に記載の方法。
【００６９】
（５９） 項目５２に記載の方法により同定された、化合物。
【００７０】
（６０） 項目５２に記載の方法により同定された化合物を有効成分として含む、医薬組成物。
【００７１】
（６１） 項目５２に記載の方法により同定された化合物を有効成分として含む、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼに関連する疾患または障害を処置または予防するための医薬組成物。
【００７２】
（６２） 項目５２に記載の方法により同定された化合物の名称および構造を含むデータをコードした、データベース。
【００７３】
（６３） 項目５２に記載の方法により同定された化合物の名称および構造を含むデータをコードした、データベースを含む記録媒体。
【００７４】
（６４） 項目５２に記載の方法により同定された化合物の名称および構造を含むデータをコードした、データベースを含む伝送媒体。
【００７５】
（６５） 以下の式によって定義される原子の空間的配置を有するファルマコフォアモデルであって、
式Ｉ
【００７６】
【化６】

【００７７】
ここで、イミダゾリウムイオンはプロトン供与体として、ペルオキシド基の１つの酸素原子をプロトン化し、上記ペルオキシド基の他方の酸素原子は、ニコチンアミド環から１つのプロトンおよび２つの電子を受容することにより還元され、Ｒは任意の基を表し、ニコチンアミド環のＣ４位とイミダゾリウムイオンのＮ１位との間の距離（Ｘ）は任意であり、原子間距離は各原子の中心間の距離を示す、ファルマコフォアモデル。
【００７８】
（６６） 上記式において、上記ニコチンアミド環のＣ４位とイミダゾリウムイオンのＮ１位との間の距離（Ｘ）は、５．１４±０．２５Åである、項目６５に記載のファルマコフォアモデル。
【００７９】
（６７） 項目６５に記載のファルマコフォアモデルの、医薬候補分子のスクリーニングにおける使用。
【００８０】
（６８） 項目６５に記載のファルマコフォアモデルを使用したスクリーニングによって同定された医薬候補分子。
【００８１】
（６９） プロスタグランジンＦ_２αシンターゼのＰＧＨ_２還元活性を阻害する活性を有する、項目６８に記載の医薬候補分子。
【００８２】
（７０） 項目６８または６９に記載の医薬候補分子を含む、医薬組成物。
【００８３】
（７１） 以下の式によって定義される原子の空間的配置を有するファルマコフォアモデルであって、
式ＩＩ
【００８４】
【化７】

【００８５】
ここで、Ｏは酸素原子を表し、Ｒは任意の基を表し、ニコチンアミド環のＣ４位とイミダゾリウムイオンのＮ１位との間の距離（Ｘ）は任意であり、原子間距離は各原子の中心間の距離を示す、ファルマコフォアモデル。
【００８６】
（７２） 上記式において、上記ニコチンアミド環のＣ４位とイミダゾリウムイオンのＮ１位との間の距離（Ｘ）は、５．１４±０．２５Åである、項目７１に記載のファルマコフォアモデル。
【００８７】
（７３） 項目７１に記載のファルマコフォアモデルの、医薬候補分子のスクリーニングにおける使用。
【００８８】
（７４） 項目７１に記載のファルマコフォアモデルを使用したスクリーニングによって同定された医薬候補分子。
【００８９】
（７５） プロスタグランジンＦ_２αシンターゼのＰＧＨ_２還元活性を阻害する活性を有する、項目７４に記載の医薬候補分子。
【００９０】
（７６） 項目７４または７５に記載の医薬候補分子を含む、医薬組成物。
【００９１】
（７７） 以下の式によって定義される原子の空間的配置を有するファルマコフォアモデルであって、
式ＩＩＩ
【００９２】
【化８】

【００９３】
ここで、原子間距離は各原子の中心間の距離を示し、Ａ〜Ｅは任意の原子であるが、ただし、ＡおよびＢが両方ともが酸素原子である場合を除く、ファルマコフォアモデル。
【００９４】
（７８） 上記Ａ〜Ｅの少なくとも１つは非反応性の原子である、項目７７に記載のファルマコフォアモデル。
【００９５】
（７９） 上記Ａ〜Ｅの少なくとも１つは炭素原子である、項目７７に記載のファルマコフォアモデル。
【００９６】
（８０） 上記ＡまたはＢの少なくとも１つは非反応性の原子である、項目７７に記載のファルマコフォアモデル。
【００９７】
（８１） 上記Ａは、非反応性の原子である、項目７７に記載のファルマコフォアモデル。
【００９８】
（８２） 上記Ｂは、非反応性の原子である、項目７７に記載のファルマコフォアモデル。
【００９９】
（８３） 上記ＡまたはＢの少なくとも１つは炭素原子である、項目７７に記載のファルマコフォアモデル。
【０１００】
（８４） 上記Ａは、炭素原子である、項目７７に記載のファルマコフォアモデル。
【０１０１】
（８５） 上記Ｂは、炭素原子である、項目７７に記載のファルマコフォアモデル。
【０１０２】
（８６） 上記ＡおよびＢのいずれか一方は電子供与体原子または水素結合をし得る原子であり、他方は非反応性の原子である、項目７７に記載のファルマコフォアモデル。
【０１０３】
（８７） 上記電子供与体原子または水素結合をし得る原子は酸素原子である、項目８６に記載のファルマコフォアモデル。
【０１０４】
（８８） 上記非反応性の原子は炭素原子である、項目８４に記載のファルマコフォアモデル。
【０１０５】
（８９） 上記Ｃ、ＤおよびＥは炭素原子である、項目７７に記載のファルマコフォアモデル。
【０１０６】
（９０） 上記Ａは炭素原子であり、上記Ｂは酸素原子である、項目７７に記載のファルマコフォアモデル。
【０１０７】
（９１） 上記Ａは酸素原子であり、上記Ｂは炭素原子である、項目７７に記載のファルマコフォアモデル。
【０１０８】
（９２） 項目７７に記載のファルマコフォアモデルによって定義される、化合物またはその塩。
【０１０９】
（９３） 以下の式
【０１１０】
【化９】（９，１１−ジデオキシ−９α，１１α−メタノエポキシプロスタグ

【０１１１】
ランジンＦ_２α）
または
【０１１２】
【化１０】（９，１１−ジデオキシ−９α，１１α−エポキシメタノプロスタ

【０１１３】
グランジンＦ_２α）
で示される構造を有する、項目９２に記載の化合物またはその塩。
【０１１４】
（９４） 項目９２に記載の化合物またはその塩を含む、医薬組成物。
【０１１５】
（９５） 項目７７に記載のファルマコフォアモデルの、医薬候補分子のスクリーニングにおける使用。
【０１１６】
（９６） 項目７７に記載のファルマコフォアモデルを使用したスクリーニングによって同定された医薬候補分子。
【０１１７】
（９７） プロスタグランジンＦ_２αシンターゼのＰＧＨ_２還元活性を阻害する活性を有する、項目９６に記載の医薬候補分子。
【０１１８】
（９８） 項目９６または９７に記載の医薬候補分子を含む、医薬組成物。
【０１１９】
（９９） プロスタグランジンＦ_２αシンターゼに関連する疾患または障害を処置または予防するための医薬組成物を調製する方法であって、
Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；
Ｂ）上記三次元分子モデルと、上記医薬組成物に含まれるべき候補化合物のライブラリーとの相互作用を評価する工程；
Ｃ）上記候補化合物のうち、上記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの活性を調節する作用を有する化合物種を選択する工程；および
Ｄ）上記化合物種と、薬学的に受容可能なキャリアとを混合する工程、
を包含する、方法。
【０１２０】
（１００） 上記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼは、ＮＡＤＰＨと複合体化されている、項目９９に記載の方法。
【０１２１】
（１０１） 上記原子座標は、図９に記載の原子座標を含む、項目９９に記載の方法。
【０１２２】
（１０２） 上記相同体または改変体は、項目２９、３２または３６に記載の方法によって得られたものである、項目９９に記載の方法。
【０１２３】
（１０３） 上記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼは、哺乳動物またはＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉのプロスタグランジンＦ_２αシンターゼを含む、項目９９に記載の方法。
【０１２４】
（１０４） 上記化合物種を合成して大量に上記化合物種を製造する工程、をさらに包含する、項目９９に記載の方法。
【０１２５】
（１０５） 上記化合物種について、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ活性に関する生物学的試験を行う工程をさらに包含する、項目９９に記載の方法。
【０１２６】
（１０６） プロスタグランジンＦ_２αシンターゼに関連する疾患または障害を処置または予防するための方法であって、
Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；
Ｂ）上記三次元分子モデルに基づいて、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの活性を調節する手段を同定する工程；および
Ｃ）上記調節手段を上記疾患または障害に罹患するかまたはその可能性のある被検体に投与する工程、
を包含する、方法。
【０１２７】
（１０７） 上記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼは、ＮＡＤＰＨと複合体化されている、項目１０６に記載の方法。
【０１２８】
（１０８） 上記原子座標は、図９に記載の原子座標を含む、項目１０６に記載の方法。
【０１２９】
（１０９） 上記相同体または改変体は、項目２９、３２または３６に記載の方法によって得られたものである、項目１０６に記載の方法。
【０１３０】
（１１０） 上記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼは、哺乳動物またはＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉのプロスタグランジンＦ_２αシンターゼを含む、項目１０４に記載の方法。
【０１３１】
（１１１） プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの相同体を得る方法をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、上記方法は、
Ａ）候補化合物の原子座標と、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標とを比較する工程、
を包含する、プログラム。
【０１３２】
（１１２） プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの相同体を得る方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、上記方法は、
Ａ）候補化合物の原子座標と、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標とを比較する工程、
を包含する、記録媒体。
【０１３３】
（１１３） プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの相同体を得る方法を実行するコンピュータであって、上記方法は、
Ａ）候補化合物の原子座標と、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標とを比較する手段、
を包含する、コンピュータ。
【０１３４】
（１１４） プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの相同体を得る方法をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、上記方法は、
Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；および
Ｂ）候補化合物の三次元分子モデルを、上記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの三次元分子モデルと比較する工程、
を包含する、プログラム。
【０１３５】
（１１５） プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの相同体を得る方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、上記方法は、
Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；および
Ｂ）候補化合物の三次元分子モデルを、上記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの三次元分子モデルと比較する工程、
を包含する、記録媒体。
【０１３６】
（１１６） プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの相同体を得る方法を実行するコンピュータであって、上記方法は、
Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；および
Ｂ）候補化合物の三次元分子モデルを、上記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの三次元分子モデルと比較する工程、
を包含する、コンピュータ。
【０１３７】
（１１７） プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの改変体を得る方法をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、上記方法は、
Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；および
Ｂ）候補化合物の三次元分子モデルを、上記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの三次元分子モデルと比較し、所定のパラメータに基づき変異を導入する工程、
を包含する、プログラム。
【０１３８】
（１１８） プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの改変体を得る方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、上記方法は、
Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；および
Ｂ）候補化合物の三次元分子モデルを、上記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの三次元分子モデルと比較し、所定のパラメータに基づき変異を導入する工程、
を包含する、記録媒体。
【０１３９】
（１１９） プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの改変体を得る方法を実行するコンピュータであって、上記方法は、
Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；および
Ｂ）候補化合物の三次元分子モデルを、上記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの三次元分子モデルと比較し、所定のパラメータに基づき変異を導入する工程、
を包含する、コンピュータ。
【０１４０】
（１２０） プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、上記方法は、
Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に対して三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの活性部位ポケットの空間座標を決定する工程；および
Ｂ）上記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体の活性部位ポケットの空間座標に対して、電子的に候補化合物のセットの空間座標をスクリーニングして、上記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する工程、
を包含する、プログラム。
【０１４１】
（１２１） プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、上記方法は、
Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に対して三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの活性部位ポケットの空間座標を決定する工程；および
Ｂ）上記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体の活性部位ポケットの空間座標に対して、電子的に候補化合物のセットの空間座標をスクリーニングして、上記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する工程、
を包含する、記録媒体。
【０１４２】
（１２２） プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法を実行するコンピュータであって、上記方法は、
Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に対して三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの活性部位ポケットの空間座標を決定する工程；および
Ｂ）上記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体の活性部位ポケットの空間座標に対して、電子的に候補化合物のセットの空間座標をスクリーニングして、上記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する工程、
を包含する、コンピュータ。
【０１４３】
（１２３） 候補化合物の三次元分子モデルを、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体の三次元分子モデルと比較することによって、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、上記方法は、
Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；
Ｂ）上記三次元分子モデルの座標データをデータ構造に入力して、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子間の距離を検索する工程；および
Ｃ）候補化合物において水素結合を形成するヘテロ原子と、上記三次元分子モデルにおいて活性部位ポケットを形成するヘテロ原子との間の距離を比較して、２つの構造の間での最適な水素結合に基づいて、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの三次元分子モデルの活性部位ポケットと安定な複合体を理論上形成する候補化合物種を同定する工程、
を包含する、プログラム。
【０１４４】
（１２４） プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、上記方法は、
Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；
Ｂ）上記三次元分子モデルの座標データをデータ構造に入力して、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子間の距離を検索する工程；および
Ｃ）候補化合物において水素結合を形成するヘテロ原子と、上記三次元分子モデルにおいて活性部位ポケットを形成するヘテロ原子との間の距離を比較して、２つの構造の間での最適な水素結合に基づいて、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの三次元分子モデルの活性部位ポケットと安定な複合体を理論上形成する候補化合物種を同定する工程、
を包含する、記録媒体。
【０１４５】
（１２５） プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法を実行するコンピュータであって、上記方法は、
Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；
Ｂ）上記三次元分子モデルの座標データをデータ構造に入力して、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子間の距離を検索する工程；および
Ｃ）候補化合物において水素結合を形成するヘテロ原子と、上記三次元分子モデルにおいて活性部位ポケットを形成するヘテロ原子との間の距離を比較して、２つの構造の間での最適な水素結合に基づいて、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの三次元分子モデルの活性部位ポケットと安定な複合体を理論上形成する候補化合物種を同定する工程、
を包含する、コンピュータ。
【０１４６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
【０１４７】
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【０１４８】
本明細書において、「プロスタグランジン」または「ＰＧ」とは、五員環をもつ脂肪族のＣ２０モノカルボン酸であるプロスタン酸を基本構造とし，これに水酸基、二重結合、ケト基などの置換基または改変が導入されてできる化合物をいう。
【０１４９】
本明細書において「プロスタグランジンＦ_２α」とは、以下の構造式
【０１５０】
【化１１】

【０１５１】
を有する化合物およびその等価物をいう。
【０１５２】
本明細書において、「プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ」とは、上記プロスタグランジンＦ_２αを基質たる物質（例えば、ＰＧＤ_２、ＰＧＨ_２、ＰＧＥ_２など）から合成する酵素をいう。本明細書では、特にＰＧＨ_２を基質とするものをさすことがある。本明細書においてプロスタグランジンＦ_２αシンターゼはどのような生物由来のものでもよく、脊椎動物または無脊椎動物由来のものが含まれる。１つの好ましい実施形態では、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼは、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ由来であるが、それに限定されない。したがって、本発明の開示に従ってコンピュータでモデリング可能である限り、他の動物（ヒト、ウシ、ヒツジ、マウス、ラットなどの哺乳動物など）のプロスタグランジンＦ_２αシンターゼもまた、本発明において使用され得る。したがって、別の実施形態では、その生物は、脊椎動物（例えば、哺乳動物、爬虫類、両生類、魚類、鳥類など）であり、より好ましくは、哺乳動物（例えば、ウシ、ヒツジなどの家畜、齧歯類（マウス、ラットなど）、霊長類（ヒトなど）など）であり得る。
【０１５３】
本明細書において、「プロスタグランジンＦ_２αシンターゼに関連する疾患または障害」とは、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの内的（例えば、ヒトが宿主であれば、ヒト由来のもの）または外的（例えば、ヒトが宿主であって、その寄生体がトリパノゾーマである場合はそのトリパノゾーマ由来のもの）な要因による異常なレベルまたは性質、あるいはプロスタグランジンＦ_２αの体内における異常なレベルよって引き起こされる疾患または障害をいう。そのような疾患または障害としては、例えば、アフリカ睡眠病、流産、気管支収縮に関する疾患、子宮筋収縮作用、消化管蠕動亢進、眼圧異常（緑内障など）などが挙げられるがそれらに限定されない。したがって、本発明では、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ自体の活性が通常であっても、プロスタグランジンＦ_２αのレベルが異常である場合は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼに関連する疾患または障害の範囲内にある。
【０１５４】
本明細書において「プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの活性を調節する」とは、あるプロスタグランジンＦ_２αシンターゼについて使用されるとき、通常そのシンターゼが有する活性を通常有しない活性に変更することをいう。従って、調節には、シンターゼ活性の増加（亢進）または減少が含まれる。
【０１５５】
本明細書において「アルド／ケトレダクターゼ」または「ＡＫＲ」とは、アルデヒド基またはケトン基を還元する酵素をいう。
【０１５６】
本明細書において「予防」（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓまたはｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）とは、ある疾患または障害について、そのような状態が引き起こされる前に、そのような状態が起こらないように処置することをいう。
【０１５７】
本明細書において「治療」とは、ある疾患または障害について、そのような状態になった場合に、そのような疾患または障害の悪化を防止、好ましくは、現状維持、より好ましくは、軽減、さらに好ましくは消長させることをいう。
【０１５８】
本明細書において「候補化合物」とは、目的とする疾患または障害を処置するために使用され得る化合物の候補をいう。したがって、ある化合物は、目的とする疾患または障害について効果があると予測される場合は、候補化合物と呼ばれ得る。
【０１５９】
本明細書において「化合物種」とは、ある化合物の集合において、特定の目的とする活性を有するなど、所望の性質を有する１種の化合物についていう。例えば、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの活性を調節する化合物の集合において、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの活性を調節する化合物が特定される場合、そのような化合物は、化合物種と称され得る。
【０１６０】
本明細書において「ライブラリー」とは、スクリーニングをするための化合物などの一定の集合をいう。ライブラリーは、同様の性質を有する化合物の集合であっても、ランダムな化合物の集合であってもよい。好ましくは、同様の性質を有すると予測される化合物の集合が使用されるが、それに限定されない。
【０１６１】
本明細書において「相互作用」とは、２以上の分子が存在する場合、ある分子と別の分子との間の作用をいう。そのような相互作用としては、水素結合、ファンデルワールス力、イオン性相互作用、非イオン性相互作用、レセプター−リガンド相互作用、静電的相互作用およびホスト−ゲスト相互作用が挙げられるがそれらに限定されない。本発明のスクリーニングにおいては、特に水素結合が用いられ得る。
【０１６２】
本明細書において「評価」とは、スクリーニングにおいて用いられるとき、ある指標（例えば、医薬としての活性）に関して、候補化合物がそのような指標の要件を満たすかどうか決定することをいう。そのような評価は、当該分野において公知の方法を用いて行うことができ、例えば、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの場合は、その基質となるＰＧＨ_２などを用いて、そのＰＧＦ_２合成活性が変化したかどうかを見ることによって行うことができる。
【０１６３】
本明細書においてタンパク質の「立体構造（コンピュータ）モデル」とは、コンピュータを用いて表現された、ある化合物の立体構造のモデルをいう。そのようなモデルは、当該分野において公知のコンピュータプログラムを用いて表示することができ、そのようなプログラムとしては、例えば、ＣＣＰ４でサポートされるプログラム、ＤＥＮＺＯ（ＨＫＬ２０００）、ＭｏｌＳｃｒｉｐｔ（Ａｖａｔａｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＡＢ）、Ｒａｓｔｅｒ３Ｄ、ＰｙＭＯＬ（ＤｅＬａｎｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＴＵＲＢＯ−ＦＲＯＤＯ（ＡＦＭＢ−ＣＮＲＳ）、Ｏ（Ａ．Ｊｏｎｅｓ、Ｕｐｐｓａｌａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｔ、Ｓｗｅｄｅｎ）、ＩｍａｇｅＭａｇｉｃ（Ｊｏｈｎ Ｃｈｒｙｓｔｙ）、ＲａｓＭｏｌ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ， ＡｍｈｅｒｓｔＭＡ ＵＳＡ）などがあるがそれらに限定されない。そのようなプログラムは、例えば、図９に示されるような原子座標のデータを用いてモデルを生成することができる。
【０１６４】
本明細書において「データアレイ」とは、原子座標を示すもののような一連のデータを示す。
【０１６５】
本明細書において「記録媒体」は、データを記録することができる限り、どのような媒体でも用いることができる。そのような媒体としては、例えば、ＭＯ、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＡＭ、ＤＶＤ−Ｒ、ＤＶＤ−ＲＷ、ＤＶＤ＋ＲＷ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、メモリーカードなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１６６】
本明細書において「伝送媒体」は、データを伝送することができる限り、どのような媒体でも用いることができる。そのような媒体としては、例えば、インターネット、イントラネット、ＬＡＮ、ＷＡＮなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１６７】
本明細書において「アプリケーション」とは、コンピュータを利用するための， 個々の使用目的に応じたプログラムをいう。
【０１６８】
本明細書において「ファルマコフォア」とは、原子と官能基との組み合わせ（およびそれらの三次元的な位置）をいい、これを用いることによって薬物が特定の方式で標的タンパク質と相互作用できるようにし、その薬理学的活性を示す。薬物分子の立体（物理的）および電場によって形成される三次元の「機能的形態」であり、これにより分子の薬理学的活性が生じる。医薬のリード化合物、および特定の標的に対するリード化合物の測定可能な活性を研究する様々なアプローチ法が開発され、一連の構造活性の関係からファルマコフォアが設計され得る。
【０１６９】
本明細書において「生物学的試験」とは、実際の生体反応を用いてある化合物がある活性を有するかどうかを判定することをいう。生物学的試験は、インビトロおよびｉｎ ｖｉｖｏでの試験を包含する。したがって、生物学的試験は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏとは対立する概念である。
【０１７０】
本明細書において「アンタゴニスト」とは、ある生体作用物質（またはアゴニスト）のレセプターへの結合に拮抗的に働らき，それ自身はその受容体を介した生理作用を現わさない物質をいう。アンタゴニストは、インヒビターの範疇に入る。
【０１７１】
本明細書において「インヒビター」とは、ある生体作用物質の作用を阻害する分子をいう。
【０１７２】
本明細書において「アゴニスト」とは、ある生体作用物質のレセプターに結合し、その物質のもつ作用と同じまたは類似の作用を現わす物質をいう。
【０１７３】
本明細書において「結合ポケット」とは、その形状の結果として、他の化学物質または化合物と会合する、分子または分子複合体の領域をいう。
【０１７４】
本明細書において「活性ポケット」とは、あるタンパク質について言及されるとき、その基質または補酵素と相互作用することができる部位を含む、分子または分子複合体の領域をいう。
【０１７５】
本明細書において「ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ活性部位結合ポケット」は、その形状が、一般的なリガンドと結合するために、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの活性部位結合ポケットの全てまたは任意の部分と類似する、分子もしくは分子複合体の一部を意味する。この形状の共通性は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼにおける結合ポケットを構成するアミノ酸の骨格原子の構造座標（図９中に記載される）からの例えば１．５Å以下の根二乗平均偏差により定義される。この計算を得る方法は、本明細書の別の場所に記載されるとおりである。
【０１７６】
ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの「活性部位結合ポケット」または「活性部位」は、９，１１−エンドペルオキシドＰＧＨ_２からＰＧＦ_２αへのＮＡＤＰＨ依存性還元を触媒する、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ酵素表面上の領域を意味する。ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの結晶構造の解明において、アミノ酸残基４７、５２、７７、および１１０が、基質（９，１１−エンドペルオキシドＰＧＨ_２）と相互作用するのに十分に近く配置されていることが測定された。より詳細には、アミノ酸残基４７、４９、５２、７７、７９、および１１０が、基質（９，１１−エンドペルオキシドＰＧＨ_２）と相互作用するのに十分に近く配置されていることが測定された。さらに詳細には、アミノ酸残基２２、２３、４７、４９、５１、５２、７７、７９、１１０、１１１、１３９、１４０、１６１、および１８７が、基質（９，１１−エンドペルオキシドＰＧＨ_２）と相互作用するのに十分に近く配置されていることを測定された。これらの各アミノ酸は、図９に示されるような構造座標のセットにより定義される。
【０１７７】
本明細書において「構造座標」は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその複合体の原子（散乱中心）によりＸ線の単色ビームの回折上で得られるパターンに関する数式に由来する直交座標をいう。回折データを使用して結晶の反復単位の電子密度マップを計算する。次いで、電子密度マップを使用して、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの個々の原子の位置を確定する。
【０１７８】
プロスタグランジンＦ_２αシンターゼなどの酵素または酵素複合体またはその一部についての構造座標のセットが、３次元における形状を定義する相対的な点のセットであることを当業者は容易に理解する。従って、座標の全体の異なるセットが類似のまたは同一の形状を定義することが可能である、さらに、個々の座標におけるわずかな変化は、全体の形状においてはほとんど影響はない。結合ポケットに関しては、これらの変化は、これらのポケットに会合し得るリガンドの性質を顕著に変化させるとは予測されない。
【０１７９】
本明細書において「会合する」は、化学物質または化合物、もしくはその一部と、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ分子またはその一部との間の近接の条件をいう。会合は、非共有結合であり得る（ここで、結合点は、エネルギー的に水素結合またはファンデルワールスもしくは静電気的相互作用により好都合である）か、または共有結合であり得る。
【０１８０】
上記の座標における変化は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ構造座標の数学的操作によって生成され得る。例えば、図９に示される構造座標は、構造座標の結晶学的な置換、構造座標の分割、構造座標のセットへの整数的加算または減算、もしくは任意の上記の組合せにより操作され得る。
【０１８１】
（遺伝子工学の一般的説明）
遺伝子工学、分子生物学および組換えＤＮＡ技術は、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（１９８２）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒならびにその第二版（１９８７）およびその第三版（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆＭｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【０１８２】
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。オリゴヌクレオチドは、一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは一本鎖が使用されるが、本発明では一本鎖に限定されるわけではない。従って、本明細書においてオリゴヌクレオチドの「誘導体」とは、上述のようなヌクレオチドの誘導体を含むオリゴヌクレオチドをいう。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。
【０１８３】
用語「核酸」はまた、本明細書において、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡの概念を包含する。特定の核酸配列はまた、「スプライス改変体」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を包含する。その名が示唆するように「スプライス改変体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス改変体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。
【０１８４】
本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされ得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。
【０１８５】
本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定する構造遺伝子といい、その発現を左右する調節遺伝子という。本明細書では、特定の状況において、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／あるいは「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」をさすことがある。
【０１８６】
本明細書において遺伝子（例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチドなど）の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。
【０１８７】
本明細書では配列の同一性、相同性および類似性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。
【０１８８】
本発明のポリペプチドまたは核酸はまた、本明細書において具体的に野生型のアミノ酸配列または核酸配列が記載された配列（例えば、配列番号１および２など）に対して同一ではないが相同性のあるものものまた使用され得る。そのような野生型のポリペプチドまたは核酸に対して相同性を有する本発明のポリペプチドまたは核酸分子としては、核酸の場合、例えば、Ｂｌａｓｔのデフォルトパラメータを用いて比較した場合に、比較対象の配列に対して、少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％の同一性または類似性を有する核酸配列を含む核酸分子、またはポリペプチドの場合少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％の同一性または類似性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられるが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１８９】
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがｉｎ ｖｉｖｏで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一形態であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。
【０１９０】
本明細書において、「アミノ酸」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体アミノ酸」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体アミノ酸およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。用語「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸のＬ−異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はＬ体であるが、Ｄ体のアミノ酸を用いた形態もまた本発明の範囲内にある。用語「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ−ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フルオロフェニルアラニン、３−アミノ−２−ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのＤ体またはＬ体およびＤ−フェニルアラニンが挙げられる。「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および／または機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、エチオニン、カナバニン、２−メチルグルタミンなどが挙げられる。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいう。
【０１９１】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。そのような略号は、以下のとおりである。
【０１９２】
以下の略号は、本出願を通して用いられる：
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン Ｔ＝Ｔｈｒ＝トレオニン
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン
Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン Ｋ＝Ｌｙｓ＝リジン
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン
ヌクレオチドも同様に、一般に受け入れられた１文字コードにより言及され得る。
【０１９３】
本明細書において、「対応する」アミノ酸（または残基）とは、あるタンパク質分子またはポリペプチド分子において、比較の基準となるタンパク質またはポリペプチドにおける所定のアミノ酸（または残基）と同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸（または残基）をいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。例えば、配列番号１に示されるＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ由来のＰＧＦ_２αシンターゼのアミノ酸配列のＨ１１０に対応するアミノ酸配列は、図１に示されるように当業者に明らかである。また、そのような対応するアミノ酸は、立体構造解析をすることによって決定することもできる。そのような立体構造解析の技術は当業者に周知である。また、そのような対応するアミノ酸は、基質などの対象のポリペプチドと相互作用する物質との複合体を解析することによっても同定することができる。そのような同定方法もまた、当業者には周知であり、そのような方法の例示はＬａｕｂｅ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１，２７３５−２７４８にも記載されている。
【０１９４】
本明細書において、「対応する」遺伝子（例えば、ＰＧＦ_２αシンターゼ遺伝子）とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子の対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。
【０１９５】
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１９６】
本明細書において、「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、それぞれ１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または加減としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。
【０１９７】
本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能を発揮する活性が包含される。例えば、ある因子が酵素（例えば、ＰＧＦ_２αシンターゼ）である場合、その生物学的活性は、その酵素活性（例えば、ＰＧＦ_２αシンターゼ活性）を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。また、ＰＧＦ_２αシンターゼ活性が生物学的活性である場合は、そのような活性は、本明細書の記載にしたがって測定することができる。
【０１９８】
あるタンパク質におけるあるアミノ酸は、本発明において目的とする改変を導入すること（例えば、ＰＧＨ２との相互作用領域における置換）に加え、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域またはエピトープ部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。
【０１９９】
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。
【０２００】
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることは、当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。米国特許第４，５５４，１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
【０２０１】
本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２０２】
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものまたはその立体構造データ（または原子座標）をいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。原子座標の改変体の場合、一次配列が同じであっても、異なる原子座標を採る場合、このような改変体と呼ばれ得る。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体または相同体（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかであり、当該分野において公知のものをＤＤＢＪなどのデータベースから情報を取得することもできる。本明細書では、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉのプロスタグランジンＦ_２αシンターゼが特に開示されているが、本発明ではこのような配列には限定されず、ヒトなどの哺乳動物の同様のシンターゼもまた本発明の範囲内にある。
【０２０３】
「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトαヘモグロビン遺伝子とマウスのαヘモグロビン遺伝子とはオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子とβヘモグロビン遺伝子のαヘモグロビン遺伝子とはパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用であることから、本発明のＰＧＦ_２αシンターゼのオルソログもまた、本発明において有用であり得る。
【０２０４】
本明細書においてＰＧＦ_２αシンターゼの「野生型」とは、天然に存在するＰＧＦ_２αシンターゼのうち、由来となる生物種においてもっとも広汎に存在するものをいう。通常、ある種において最初に同定されるＰＧＦ_２αシンターゼは野生型といえる。野生型はまた、「天然標準型」ともいう。そのような野生型ＰＧＦ_２αシンターゼは、配列番号１に示す配列を有するものである。
【０２０５】
本発明のＰＧＦ_２αシンターゼ改変体は、本発明の目的とする改変が導入されていることが１つの特徴である。本明細書では、そのような「目的とする改変」とは、例えば、ＰＧＦ_２αシンターゼのアミノ酸配列において、ＰＧＦ_{２ α}シンターゼの基質（ＰＧＨ_２など）または補酵素（ＮＡＤＰＨ）との相互作用をする部位またはアミノ酸残基における改変またはそのような相互作用する部位が変動するような改変をいう。
【０２０６】
したがって、そのような目的とする改変は、例えば、配列番号１に示されるＰＧＦ_２αシンターゼの２２、２３、４７、４９、５１、５２、７７、７９、１１０、１１１、１３９、１４０、１６１および１８７からなる群より選択される少なくとも１つの残基に対応する、該野生型ＰＧＦ_２αシンターゼポリペプチドの残基において、配列番号１において示されるそれぞれの位置におけるアミノ酸以外のアミノ酸を有することを包含する。
【０２０７】
基質または補酵素などとの相互作用を担うドメインはまた、当該分野において周知のＸ線結晶構造解析の手法（例えば、ＢＷ７ｂビームライン（ＤＥＳＹ／ＥＭＢＬ、Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたＸ線解析、ＭａｒＲｅｓｅａｃｈイメージングプレート検出器を用いたデータ測定、ＤＥＮＺＯおよびＳＣＬＡＥＰＡＣＫなどのプログラムを用いたデータ処理）、およびコンピュータモデリングの手法（例えば、ＣＮＳプログラム、ＸＰＬＯ２Ｄプログラム、プログラムＯ、ＰＲＯＣＨＥＣＫ，ＷＨＡＴＣＨＥＣＫ，ＷＨＡＴＩＦなどを用いた精密化など）を用いて同定することができる。したがって、任意のＰＧＦ_２αシンターゼは、上述の方法を用いて同定された基質または補酵素などとの相互作用ドメインにおいて改変を導入することによって本発明の目的の改変を導入することができる。そのような改変は、好ましくは、野生型におけるアミノ酸を他のアミノ酸に置換することを包含する。例えば、配列番号１に示されるＰＧＦ_２αシンターゼの場合、１１０位ヒスチジンの他のアミノ酸への置換が挙げられる。本発明のＰＧＦ_２αシンターゼは、補酵素または基質との相互作用ドメインにあるアミノ酸残基を改変することによって、酵素活性が高まり、副反応が減少し得る。このような相互作用ドメインは従来では不明であったことから、本発明は、従来の技術では予想不可能な効果を奏するといえる。
【０２０８】
「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント改変を包含する。サイレント改変には、コードする核酸が変化しない「サイレント置換」と、そもそも核酸がアミノ酸をコードしない場合を包含する。ある核酸がアミノ酸をコードする場合、サイレント改変は、サイレント置換と同義である。本明細書において「サイレント置換」とは、核酸配列において、あるアミノ酸をコードする核酸配列を、同じアミノ酸をコードする別の核酸配列に置換することをいう。遺伝コード上の縮重という現象に基づき、あるアミノ酸をコードする核酸配列が複数ある場合（例えば、グリシンなど）、このようなサイレンと置換が可能である。したがって、サイレント置換により生成した核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、もとのポリペプチドと同じアミノ酸配列を有する。したがって、本発明のＰＧＦ_２αシンターゼにおいて、本発明の目的とする改変（ＰＧＦ_２αシンターゼポリペプチドの基質（たとえば、プロスタグランジンＨ）と相互作用するアミノ酸残基の、野生型のアミノ酸残基以外のアミノ酸残基への置換（例えば、配列番号２に示されるＰＧＦ_２αシンターゼの２２、２３、４７、４９、５１、５２、７７、７９、１１０、１１１、１３９、１４０、１６１、および１８７からなる群より選択される少なくとも１つの残基に対応する、該野生型ＰＧＦ_２αシンターゼポリペプチドの残基において、配列番号１において示されるそれぞれの位置におけるアミノ酸以外のアミノ酸を有すること））に加えて、核酸配列レベルでは、サイレント置換を含ませることも可能である。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチオニンをコードする唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンをコードする唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。
【０２０９】
本明細書において、本発明のＰＧＦ_２αシンターゼ改変体と機能的に等価なポリペプチドを作製するために、本発明の目的の改変に加えて、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。
【０２１０】
本明細書において使用される用語「ペプチドアナログ」または「ポリペプチドアナログ」は互換可能に使用され、ペプチドまたはポリペプチドとは異なる化合物であるが、ペプチドまたはポリペプチドと少なくとも１つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ペプチドアナログには、もとのペプチドに対して、１つ以上のアミノ酸アナログが付加または置換されているものが含まれる。ペプチドアナログは、その機能が、もとのペプチドの機能（例えば、ｐＫａ値が類似していること、官能基が類似していること、他の分子との結合様式が類似していること、水溶性が類似していることなど）と実質的に同様であるように、このような付加または置換がされている。そのようなペプチドアナログは、当該分野において周知の技術を用いて作製することができる。したがって、ペプチドアナログは、アミノ酸アナログを含むポリマーであり得る。本明細書において「ポリペプチド」は、特に言及しない限り、このペプチドアナログを包含する。
【０２１１】
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるものをいう。そのようなベクターとしては、動物個体などの宿主細胞において自律複製が可能であるか、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。本明細書において、ベクターはプラスミドであり得る。
【０２１２】
「発現ベクター」は、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、動物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
【０２１３】
「組換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、動物個体などの宿主細胞において自律複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。
【０２１４】
「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、ポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。
【０２１５】
本明細書において用いられる「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。プロモーターの領域は、通常、推定タンパク質コード領域の第１エキソンの上流約２ｋｂｐ以内の領域であることが多いので、ＤＮＡ解析用ソフトウエアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモータ領域を推定することはできる。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。好ましくは、推定プロモーター領域は、第一エキソン翻訳開始点から上流約２ｋｂｐ以内に存在する。
【０２１６】
「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ得る。そのようなエンハンサーは当該分野において周知である。エンハンサーは複数個用いられ得るが１個用いられてもよいし、用いなくともよい。
【０２１７】
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
【０２１８】
本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよく、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。 そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。
【０２１９】
従って、本発明において同定されたタンパク質は、上述のような方法を用いて生産することができる。
【０２２０】
（免疫化学）
本発明のポリペプチドを認識する抗体の作製もまた当該分野において周知である。例えば、ポリクローナル抗体の作製は、取得したポリペプチドの全長または部分断片精製標品、あるいは本発明のタンパク質の一部のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として用い、動物に投与することにより行うことができる。
【０２２１】
本発明では、立体構造が明らかになったことから、図９に示される原子座標を参考にしてエピトープとして適切な部位を選択することにより効率的な抗体の作製を行うことができる。
【０２２２】
抗体を生産する場合、投与する動物として、ウサギ、ヤギ、ラット、マウス、ハムスター等を用いることができる。その抗原の投与量は動物１匹当たり５０〜１００μｇが好ましい。ペプチドを用いる場合は、ペプチドをスカシガイヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ）またはウシチログロブリン等のキャリアタンパク質に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい。抗原とするペプチドは、ペプチド合成機で合成することができる。その抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法［酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊 １９７６年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｖｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］等で確認する。
【０２２３】
免疫に用いた抗原に対し、その血清が充分な抗体価を示した非ヒト哺乳動物より血清を取得し、その血清より、周知技術を用いてポリクローナル抗体を分離、精製することができる。モノクローナル抗体の作製もまた当該分野において周知である。抗体産性細胞の調製のために、まず、免疫に用いた本発明のポリペプチドの部分断片ポリペプチドに対し、その血清が十分な抗体価を示したラットを抗体産生細胞の供給源として使用し、骨髄腫細胞との融合により、ハイブリドーマの作製を行う。その後、酵素免疫測定法になどより、本発明のポリペプチドの部分断片ポリペプチドに特異的に反応するハイブリドーマを選択する。このようにして得たハイブリドーマから産生されたモノクローナル抗体は種々の目的に使用することができる。
【０２２４】
このような抗体は、例えば、本発明のポリペプチドの免疫学的検出方法に使用することができ、本発明の抗体を用いる本発明のポリペプチドの免疫学的検出法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法・蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法等を挙げることができる。
【０２２５】
また、本発明ポリペプチドの免疫学的定量方法にも使用することができる。本発明ポリペプチドの定量方法としては、液相中で本発明のポリペプチドと反応する抗体のうちエピトープが異なる２種類のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法、^{１ ２５}Ｉ等の放射性同位体で標識した本発明のタンパク質と本発明のタンパク質を認識する抗体とを用いるラジオイムノアッセイ法等を挙げることができる。
【０２２６】
本発明ポリペプチドのｍＲＮＡの定量方法もまた、当該分野において周知である。例えば、本発明のポリヌクレオチドあるいはＤＮＡより調製した上記オリゴヌクレオチドを用い、ノーザンハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法により、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの発現量をｍＲＮＡレベルで定量することができる。このような技術は、当該分野において周知であり、本明細書において列挙した文献にも記載されている。
【０２２７】
（結晶構造解析）
タンパク質の結晶構造解析は、当該分野において周知の方法を用いて行うことができる。そのような方法は、例えば、タンパク質のＸ線結晶構造解析（シュプリンガー・フェアラーク東京社）、生命科学のための結晶解析入門（丸善）などに記載されており、本明細書ではそのような方法を任意に用いることができる。
【０２２８】
一般に、タンパク質の結晶は、Ｘ線によりかなり損傷を受けることが知られているので、Ｘ線結晶構造解析を成功させるためには、損傷を受け難い結晶を取得することが重要である。近年では、結晶を凍結させ、凍結状態のままで回折データを測定することで高品質、高分解能の回折データを取得することがよく行われている（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ 第２７６巻、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ、Ｐａｒｔ Ａ、Ｃ．Ｗ．Ｃａｒｔｅｒ、Ｊｒ．およびＲ．Ｍ．Ｓｗｅｅｔ編、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｃｒｙｏｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ（Ｄ．Ｗ．Ｒｏｄｇｅｒｓ））。一般に、タンパク質結晶の凍結には、凍結による結晶の崩壊を防ぐ目的で、グリセロールなどの凍結安定化剤を含む溶液で処理するなどの工夫がなされる。本発明においては、ＰＧＦ_２αシンターゼのネイティブ結晶（必要に応じて補酵素であるＮＡＤＰＨと複合体化させる）および重原子誘導体の凍結結晶は、凍結安定化剤を添加することなく、結晶化小滴あるいは浸漬溶液中の結晶を取り出し、液体窒素に直接浸漬して瞬時に凍結させることで調製し得る。凍結結晶はまた、凍結安定化剤を添加した保存液に浸漬した結晶に対して上記瞬時に凍結させる操作を行うことによっても調製し得る。
【０２２９】
重原子同型置換法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ 第１１５巻、Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｐｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、 Ｐａｒｔ Ｂ、Ｈ．Ｗ．Ｗｙｃｋｏｆｆ、Ｃ．Ｈ．Ｗ．Ｈｉｒｓ、およびＳ．Ｎ．Ｔｉｍａｓｈｅｆｆ編、ならびにＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ 第２７６巻、 Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ、Ｐａｒｔ Ａ、Ｃ．Ｗ．Ｃａｒｔｅｒ、Ｊｒ．およびＲ．Ｍ．Ｓｗｅｅｔ編）または多波長異常分散法（Ｓ．Ｎ．Ｔｉｍａｓｈｅｆｆ編、ならびにＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ第２７６巻、 Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ、Ｐａｒｔ Ａ、Ｃ．Ｗ．Ｃａｒｔｅｒ、Ｊｒ．およびＲ．Ｍ．Ｓｗｅｅｔ編）もまた利用して立体構造解析を行うことも可能である。ここでは、ネイティブ結晶および重原子誘導体結晶の回折データ間の回折強度差、あるいは異なる波長で測定した回折データ間の回折強度差から、電子密度を計算するための初期位相を求めることにより立体構造を決定し得る。重原子同型置換法または多波長異常分散法を適用するＰＧＦ_２αシンターゼの立体構造決定においては、重金属原子として例えば水銀、金、白金、ウラン、セレン原子などを含有した重原子誘導体結晶を用い得る。例えば、水銀化合物ＥＭＴＳまたはカリウムジシアノ金（Ｉ）を利用した浸漬法により得られる重原子誘導体結晶が用いられる。
【０２３０】
ネイティブ結晶および重原子誘導体結晶の回折データは、例えば、Ｒ−ＡＸＩＳ ＩＩｃ（理学電機）あるいはＳＰｒｉｎｇ−８（西播磨大型放射光施設）のタンパク質結晶構造解析用ビームラインを用いて測定し得る。多波長異常分散法を適用するための複数波長での回折データ測定は、例えば、ＳＰｒｉｎｇ−８のタンパク質結晶構造解析用ビームラインを用いて実施し得る。測定した回折画像データは、例えば、Ｒ−ＡＸＩＳ ＩＩｃ付属のデータ処理プログラムまたはプログラムＤＥＮＺＯ（マックサイエンス）または同様な画像処理プログラム（または単結晶解析用ソフトウェア）を用いて、反射強度データに処理される。ネイティブ結晶の反射強度データ、複数波長での重原子誘導体結晶の反射強度データ波長の測定により得られた反射強度データから、差Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ図を利用して結晶中のタンパク質に結合した重金属原子の位置を求めた後、例えば、プログラムＰＨＡＳＥＳ（Ｗ．Ｆｕｒｅｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａあるいはＣＣＰ４（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｓｉｌ、ＳＥＲＣ）または同様の回折データ解析プログラムを用いて重原子位置パラメータを精密化することにより初期位相が決定される。決定された初期位相は、例えば、プログラムＤＭ（ＣＣＰ４パッケージ）または同様な位相改良プログラム（電子密度改良プログラム）を用いた溶媒平滑化法およびヒストグラムマッチング法に従って、ＰＧＦ_{２ α}シンターゼ結晶中の溶媒領域を例えば３０〜５０％として、低分解能から高分解能まで徐々に位相拡張計算を行うことにより信頼性の高い位相へと改良される。タンパク質の結晶は、その体積の３０〜６０％がタンパク質以外の溶媒分子（主として水分子）で占有されている。本明細書において、溶液中の溶媒分子の占める体積を「溶媒領域」とする。一般に、得られたタンパク質結晶が非結晶学的な対称を有する場合には、非結晶学的対称（ＮＣＳ）平均化と呼ばれる電子密度の平均化を行うことにより、さらに位相の信頼性を高めることが可能である。ＰＧＦ_２αシンターゼの結晶は、結晶の密度測定の結果から非対称単位中に２分子が含まれることが判明した。溶媒平滑化法を適用した後の位相を用いて計算した電子密度図および精密化した重原子座標から、並進および回転を含む非結晶学的対称マトリックスが算出される。同時に溶媒平滑化法で得られた電子密度図から、マスクと呼ばれるタンパク質の分子が存在する領域を同定し得る。非結晶学的対称マトリックスおよびマスクを用いて、プログラムＤＭなどによりＮＣＳ平均化計算を行うことにより、信頼性の高い位相に改良され、立体構造モデルの構築に用いる電子密度図が得られる。
【０２３１】
ＰＧＦ_２αシンターゼの立体構造モデルは、プログラムＯ（オー）（Ａ．Ｊｏｎｅｓ、Ｕｐｐｓａｌａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｔ、Ｓｗｅｄｅｎ）などにより３次元グラフィックス上に表示した電子密度図から、以下の手順で構築し得る。まず、特徴的なアミノ酸配列を有する複数の領域（例えば、トリプトファン残基を含む部分配列など）を電子密度図上で探し出す。次に、見出した領域を起点にしてアミノ酸配列を参照しながら、電子密度に適合するアミノ酸残基の部分構造をプログラムＯを用いて３次元グラフィックス上で構築する。、順次この作業を繰り返すことにより、ＰＧＦ_２αシンターゼのすべてのアミノ酸残基を相当する電子密度に適合させ、分子全体の初期立体構造モデルを構築する。構築された立体構造モデルは、それを出発モデル構造として、構造精密化プログラムであるＸＰＬＯＲ（Ａ．Ｔ．Ｂｒｕｎｇｅｒ、Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の精密化プロトコルに従って、立体構造を記述する三次元座標が精密化される。また、ＰＧＦ_２αシンターゼ（例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＰＧＦ_２αシンターゼ）のネイティブ結晶の立体構造およびＰＧＦ_２αシンターゼ改変体（例えば、配列番号１に示される配列を有するＰＧＦ_２αシンターゼ改変体）ネイティブ結晶の立体構造は、得られたＥＭＴＳ誘導体結晶の立体構造を用いた分子置換法により初期位相を求め、前記の電子密度改良、モデル構築、構造精密化手順に従うことにより各々の立体構造を決定し得る。このことにより、本発明のＰＧＦ_２αシンターゼの立体構造の決定が完成される。決定したＰＧＦ_２αシンターゼの立体構造について、トポロジーなどの観点から、タンパク質立体構造の公的データバンクであるプロテインデータバンク（ＰＤＢ）に登録されている種々のタンパク質（ＰＧＦ_２αシンターゼと機能において類似する酵素を含む）の立体構造との比較を行い得る。
【０２３２】
本明細書において、「トポロジー」とは、本明細書中において、タンパク質の二次構造単位の並びまたは空間配置のことをいう。
【０２３３】
本明細書において、「αヘリックス」とは、タンパク質またはポリペプチドの二次構造の一つであり、アミノ酸が３．６残基ごとに１回転したピッチが５．４Ａの螺旋構造を有するエネルギー的に最も安定な構造の１つをいう。αヘリックスを形成しやすいアミノ酸としては、グルタミン酸、リジン、アラニン、およびロイシンなどが挙げられる。逆に、αヘリックスを形成しにくいアミノ酸としては、バリン、イソロイシン、プロリン、およびグリシンなどが挙げられる。また、本明細書において、「βシート」とは、タンパク質またはポリペプチドの二次構造の一つであり、ジグザグに伸びたコンフォメーションを有する二本以上のポリペプチド鎖が平行に並び、ペプチドのアミド基およびカルボニル基が、それぞれ隣接するペプチド鎖のカルボニル基およびアミド基との間に水素結合を形成することによりエネルギー的に安定なシート状により合わさった構造をいう。なお、「平行βシート」とは、βシートのうち、隣接するポリペプチド鎖のアミノ酸配列の並び方が同じ方向のものをいい、「逆平行βシート」とは、βシートのうち、隣接するポリペプチド鎖のアミノ酸の並び方が逆方向のものをいう。さらに、本明細書において、「βストランド」とは、βシートを形成するジグザグに伸びたコンフォメーションを有する１本のペプチド鎖をいう。
【０２３４】
従って、本発明のＰＧＦ_２αシンターゼ改変体を作製する際には、上述のようなトポロジーを考慮してもよい。
【０２３５】
タンパク質の「立体構造データ」または「原子座標データ」とは、そのタンパク質の三次元構造に関するデータをいう。タンパク質の立体構造データには、代表的に、原子座標データ、トポロジー、分子力場定数が挙げられる。原子座標データは、代表的に、Ｘ線結晶構造解析またはＮＭＲ構造解析から得られたデータであり、このような原子座標データは、新規にＸ線結晶構造解析またはＮＭＲ構造解析を行って得られ得るか、または公知のデータベース（例えば、プロテイン・データ・バンク（ＰＤＢ））から入手し得る。原子座標データはまた、モデリングまたは計算によって作成されたデータであり得る。
【０２３６】
トポロジーは、市販もしくはフリーウェアのツールプログラムを用いて算出し得るが、自作プログラムを用いてもよい。また、市販の分子力場計算プログラム（例えば、ＰＲＥＳＴＯ、タンパク質工学研究所株式会社、に付属のｐｒｅｐａｒプログラム）に付属の分子トポロジー計算プログラムを使用し得る。分子力場定数（または分子力場ポテンシャル）もまた、市販もしくはフリーウェアのツールプログラムを用いて算出し得るが、自作データを用いてもよい。また、市販の分子力場計算プログラム（例えば、ＡＭＢＥＲ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に付属の分子力場定数データを使用し得る。
【０２３７】
なお、ＰＧＦ_２αシンターゼの立体構造の具体的な座標データは、プロテインデータバンク（ＰＤＢ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ、Ｔｈｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｆｏｒ Ｓｔｒｕｃｔｕａｌ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＲＣＳＢ）が運営）に登録番号１ＭＺ７として２００２年１０月７日に登録（公知となるべき公開は２００３年１０月７日予定）されており、必要に応じ本明細書中でこのデータを援用する。
【０２３８】
本発明のＰＧＦ_２αシンターゼの立体構造決定が完成することによって、酵素の触媒活性に関与する残基を推定し得、さらに酵素単独の立体構造だけでなく、酵素に補酵素、インヒビター、アゴニストまたは基質などを結合させた複合体の立体構造モデルを分子モデリングの手法（Ｓｗｉｓｓ−ＰＤＢＶｉｅｗｅｒ（前出）、Ａｕｔｏｄｏｃｋ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）、Ｇｕｅｘ、Ｎ．およびＰｅｉｔｓｃｈ，Ｍ．Ｃ．（１９９７）ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ ａｎｄ ｔｈｅ Ｓｗｉｓｓ−ＰＤＢＶｉｅｗｅｒ：Ａｎ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｆｏｒ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｅｌｉｎｇ、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １８、２７１４−２７２３；Ｍｏｒｒｉｓ，Ｇ．Ｍら、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９：１６３９−１６６２、１９９８；Ｍｏｒｒｉｓ，Ｇ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔａｅｒ−Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｓｉｇｎ、１０、２９４−３０４、１９９６；Ｇｏｏｄｓｅｌｌ、Ｄ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ、９：１−５、１９９６）により容易に構築し得る。本立体構造および立体構造モデルから、活性部位に存在し、触媒反応群のアミノ酸残基に関する構造および活性部位における反応機構に関する知見を入手し得る。
【０２３９】
ＰＧＦ_２αシンターゼの活性部位は、配列番号１に示されるＰＧＦ_２αシンターゼのアミノ酸残基２２、２３、４７、４９、５１、５２、７７、７９、１１０、１１１、１３９、１４０、１６１、および１８７などを包含する。１１０位ヒスチジンは、基質と相互作用することが知られていることから、ある実施形態では、本発明の目的とする改変は、この１１０位チロシンに対応する残基が他のアミノ酸に改変されていることが好ましい。
【０２４０】
これら立体構造より得られた知見に基づいて、ＰＧＦ_２αシンターゼの安定性向上または酵素活性の向上を目的とした改変設計を行い得る。本明細書において、酵素の「熱安定性」とは、通常の生体環境よりも高い温度（例えば６０℃）で酵素を変性させた後でも、酵素活性が熱変性前と比較して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも９０％残存していることをいう。安定性の向上は、例えば、ΔＴｍ（変性温度の差分）で測定し得る。本明細書において「酵素活性」とは、特に言及しない場合「ＰＧＦ_２αシンターゼ活性」と同義で用いられ、ＰＧＦ_２αシンターゼ、グルコース−６−リン酸１００μＭ、ＮＡＤＰＨ２０μＭ、およびグルコース−６−リン酸脱水素酵素１Ｕを、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に入れ、これに^１４Ｃで標識したＰＧＨ_２を添加し、３７℃で２０分間インキュベーションし、その後、Ｓｔｏｐ溶液（３０：４：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｖｏｌ）のジエチルエーテル：メタノール：クエン酸）をいれ、その放射能を測定することによって計測される活性をいう。
【０２４１】
本明細書において、改変体分子の設計は、変異前のタンパク質またはポリペプチド分子（例えば、野生型分子）のアミノ酸配列および立体構造を解析することによって、各アミノ酸がどのような特性（例えば、触媒活性、他の分子との相互作用など）を担うかを予測し、所望の特性の改変（例えば、触媒活性の向上、タンパク質の安定性の向上など）をもたらすために適切なアミノ酸変異を算出することにより行われる。設計の方法は、好ましくはコンピューターを用いて行われる。このような設計方法で用いられるコンピュータープログラムの例としては、本明細書において言及されるように、以下が挙げられる：構造を解析するプログラムとして、Ｘ線回折データの処理プログラムであるＤＥＮＺＯ（マックサイエンス）；位相を決定するための処理プログラムとして、ＰＨＡＳＥＳ（Ｕｎｉｖ．ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、ＰＡ、ＵＳＡ）；初期位相の改良のためのプログラムとして、プログラムＤＭ（ＣＣＰ４パッケージ、ＳＥＲＣ）；３次元グラフィックスを得るためのプログラムとしてプログラムＯ（Ｕｐｐｓａｌａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｔ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）；立体構造精密化プログラムとして、ＸＰＬＯＲ（Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＣＴ、ＵＳＡ）；そして、変異導入モデリングのためのプログラムとして、Ｓｗｉｓｓ−ＰＤＢＶｉｅｗｅｒ（前出）。
【０２４２】
本発明では、本発明の開示をもとに、コンピュータモデリングによる薬物（例えば、インヒビター、活性化剤など）が提供されることも企図される。
【０２４３】
（コンピュータモデリング）
本発明は、分子設計技術の使用により、ＰＧＦ_２αシンターゼ（例えば、結合ポケット）に結合可能な化学物質（阻害化合物を含む）を同定、選択、および設計することを初めて可能にする。
【０２４４】
本発明はまた、１つの局面において、本発明において決定された結合ポケットを含むポリペプチドも提供する。
【０２４５】
ＰＧＦ_２αシンターゼ上の９，１１−エンドペルオキシドＰＧＨ_２および補酵素ＮＡＤＰＨの結合部位に関する本発明者らの解明は、ＰＧＦ_２αシンターゼ結合ポケットのいずれかまたはその両方と相互作用し得る新規な化学物質および化合物を設計するために必要な情報を、全部または一部について提供する。この解明はまた、ＴｂＰＧＦＳ様結合ポケットに結合する９，１１−エンドペルオキシドＰＧＨ_２または他の化合物のアナログについての構造活性データの評価を可能にする。
【０２４６】
モデリングでは、物質が、ＰＧＦ_２αシンターゼ様結合ポケットに結合するか、これと会合するか、またはこれを阻害する能力に関する議論は、物質の特徴のみを議論する。化合物がＰＧＦ_２αシンターゼに結合するかどうかを決定するためのアッセイは、当該分野で周知であり、例えば、Ｋｕｂａｔａ Ｂ．Ｋ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １９２，１３２７−１３３７ （２０００）に記載されている。
【０２４７】
本発明による、ＰＧＦ_２αシンターゼ（例えば、結合ポケット）に結合するかまたはこれを阻害する化合物の設計は、一般的に２つの要件の考慮を伴う。第１に、この物質は、ＰＧＦ_２αシンターゼの一部または全部と物理的および構造的に会合し得なければならない。この会合において重要な非共有結合的分子相互作用は、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水的相互作用、および静電的相互作用を含む。
【０２４８】
第２に、この物質は、それをＰＧＦ_２αシンターゼと直接会合可能にするコンフォメーションをとり得なければならない。この物質の特定の部分はこれらの会合に直接関与しないが、この物質のこれらの部分はなお、分子の全体のコンフォメーションに影響を及ぼし得る。次いで、これが効力に重大な影響を有し得る。このようなコンフォメーション要件は、結合ポケットの全部または一部に関連する化学物質の３次元構造全体および配向、あるいはＰＧＦ_２αシンターゼまたはその相同体と直接相互作用するいくつかの化学物質を包含する物質の官能基間の空間的配置を含む。
【０２４９】
ＰＧＦ_２αシンターゼに対する化学物質の阻害効果または結合効果の可能性は、その実際の合成および試験の前にコンピューターモデリング技術の使用により分析され得る。所与の物質の理論的構造が、その物質とＰＧＦ_２αシンターゼとの間での不十分な相互作用および会合を示唆するのであれば、物質の試験は除外される。しかし、コンピューターモデリングが強い相互作用を示すのであれば、次いで、この分子が合成され、ＰＧＦ_２αシンターゼへの結合能力について試験され得る。
【０２５０】
ＰＧＦ_２αシンターゼの調節因子の候補化合物は、その化学物質またはフラグメントをＰＧＦ_２αシンターゼとのそれらの会合能力についてスクリーニングする工程、およびポジティブ因子を選択する工程により計算的に評価され得る。
【０２５１】
当業者は、ＰＧＦ_２αシンターゼと会合する能力について化学物質またはフラグメントをスクリーニングするためのいくつかの方法のうちの１つを使用し得る。このプロセスは、例えば、図９のＰＧＦ_２αシンターゼの構造座標もしくはその改変体もしくは相同体またはコンピューター読み取り可能記録媒体から生じる同様の形状を定義する他の座標に基づく、コンピューター画面上でのＴｂＰＧＦＳ様結合ポケットの視覚的検査により開始され得る。次いで、選択されたフラグメントまたは化学物質を、上記に定義される結合ポケット内に、種々の配向で配置させ得るか、またはドッキングさせ得る。ドッキングは、ＱｕａｎｔａおよびＳｙｂｙｌのようなソフトウェア、続いて、ＣＨＡＲＭＭおよびＡＭＢＥＲのような標準的な分子力学的力場によるエネルギー最小化および分子動力学を用いて達成され得る。
【０２５２】
コンピュータモデリングを行うためのコンピュータープログラムもまた、フラグメントまたは化学物質を選択するプロセスにおいて使用され得る。このようなプログラムとしては、以下が挙げられる。
【０２５３】
１．ＧＲＩＤ（Ｐ．Ｊ．Ｇｏｏｄｆｏｒｄ，「Ａ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃａｌｌｙ Ｆａｖｏｒａｂｌｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅｓ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２８，８４９−８５７頁（１９８５））。ＧＲＩＤは、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫから入手可能である。
【０２５４】
２．ＭＣＳＳ（Ａ．Ｍｉｒａｎｋｅｒら，「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ Ｍａｐｓ ｏｆ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅｓ：Ａ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＣｏｐｙＳｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｓｅａｒｃｈ Ｍｅｔｈｏｄ」 Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１１，２９−３４頁（１９９１））。ＭＣＳＳは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能である。
【０２５５】
３．ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｄ．Ｓ．Ｇｏｏｄｓｅｌｌら，「ＡｕｔｏｍａｔｅｄＤｏｃｋｉｎｇ ｏｆ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ａｎｎｅａｌｉｎｇ」，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８，１９５−２０２頁（１９９０））。ＡＵＴＯＤＯＣＫは、Ｓｃｒｉｐｐｓ ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡから入手可能である。
【０２５６】
４．ＤＯＣＫ（Ｉ．Ｄ．Ｋｕｎｔｚら，「Ａ Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ−Ｌｉｇａｎｄ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６１，２６９−２８８頁（１９８２））。ＤＯＣＫは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡから入手可能である。
【０２５７】
一旦、適切な化合物質またはフラグメント（化合物種）が選択されると、それらは、単一化合物または複合体にアセンブリすることができる。構築に先だって、ＰＧＦ_２αシンターゼの構造座標に関連してコンピューター画面上に表示される３次元イメージ上で、互いのフラグメントの関連性の視覚的検査が行われ得る。これに続き、ＱｕａｎｔａまたはＳｙｂｙｌ［Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ］のようなソフトウェアを用いるマニュアルでのモデル構築が行われる。
【０２５８】
個々の化学物質またはフラグメントを連結させる際に使用され得る有用なプログラムは、以下を含む。
【０２５９】
１．ＣＡＶＥＡＴ（Ｐ．Ａ．Ｂａｒｔｌｅｔｔら、「ＣＡＶＥＡＴ：Ａ Ｐｒｏｇｒａｍ ｔｏ Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ ｔｈｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｂｌｅｍｓ，Ｓｐｅｃｉａｌ Ｐｕｂ．，Ｒｏｙａｌ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７８，１８２−１９６頁（１９８９））；Ｇ，ＬａｕｒｉおよびＰ．Ａ．Ｂａｒｔｌｅｔｔ，「ＣＡＶＥＡＴ：ａ Ｐｒｏｇｒａｍ ｔｏ Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ ｔｈｅ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．，８，５１−６６頁（１９９４））。ＣＡＶＥＡＴは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡから入手可能である。
【０２６０】
２．ＩＳＩＳ（ＭＤＬ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）のような３Ｄデータベースシステム 。この分野は、Ｙ．Ｃ．Ｍａｒｔｉｎ，「３Ｄ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ」，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３５，２１４５−２１５４頁（１９９２）において概説される。
【０２６１】
３．ＨＯＯＫ（Ｍ．Ｂ．Ｅｉｓｅｎら，「ＨＯＯＫ：Ａ Ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ Ｆｉｎｄｉｎｇ Ｎｏｖｅｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｓ ｔｈａｔ Ｓａｔｉｓｆｙ ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｔｅｒｉｃ Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ａ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ」，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔ．，Ｆｕｎｃｔ．，Ｇｅｎｅｔ．，１９，１９９−２２１頁（１９９４））。ＨＯＯＫは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能である。
【０２６２】
上記のように一度に１つのフラグメントまたは化学物質を段階的様式でＰＧＦ_２αシンターゼのインヒビターなどとして構築することを進める代わりに、阻害性または他のＰＧＦ_２αシンターゼ結合化合物は、空の結合部位を使用するか、または必要に応じていくつかの既知のインヒビターの部分を含めるかのいずれかで、全体的にまたはデノボで設計され得る。以下を含む、多くの新規リガンド設計方法が存在する。
【０２６３】
１．ＬＵＤＩ（Ｈ．−Ｊ．Ｂｏｈｍ，「Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｐｒｏｇｒａｍ ＬＵＤＩ：Ａ Ｎｅｗ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ａｉｄ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｅｓｉｇｎ，６ ６１−７８頁（１９９２））。ＬＵＤＩは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能である。
【０２６４】
２．ＬＥＧＥＮＤ（Ｙ．Ｎｉｓｈｉｂａｔａら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４７，８９８５頁（１９９１））。ＬＥＧＥＮＤは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能である。
【０２６５】
３．ＬｅａｐＦｒｏｇ（Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能である）。
【０２６６】
４．ＳＰＲＯＵＴ（Ｖ．Ｇｉｌｌｅｔら，「ＳＰＲＯＵＴ：Ａ Ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ」，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌ．Ｄｅｓｉｇｎ，７，１２７−１５３頁（１９９３））。ＳＰＲＯＵＴは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｅｅｄｓ，ＵＫから入手可能である。
【０２６７】
他の分子モデリング技術もまた、本発明に従って使用され得る［例えば、Ｎ．Ｃ．Ｃｏｈｅｎら，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３３，８８３−８９４頁（１９９０）を参照のこと；Ｍ．Ａ．ＮａｖｉａおよびＭ．Ａ．Ｍｕｒｃｋｏ，「Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ」，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２，２０２−２１０頁（１９９２）もまた参照のこと；Ｌ．Ｍ．Ｂａｌｂｅｓら，「Ａ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｆ Ｍｏｄｅｒｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｉｄｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ」，（Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．５，Ｋ．Ｂ．ＬｉｐｋｏｗｉｔｚおよびＤ．Ｂ．Ｂｏｙｄ編，ＶＣＨ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，３３７−３８０頁（１９９４））；Ｗ．Ｃ．Ｇｕｉｄａ，「Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｆｏｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｂａｓｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ」，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌｏｇｙ．，４，７７７−７８１頁（１９９４）］。
【０２６８】
一旦上記の方法により化合物が設計されるかまたは選択されると、その物質がＴｂＰＧＦＳ結合ポケットに結合し得る効率が、計算による評価により試験され、そして最適化され得る。例えば、有効なＴｂＰＧＦＳ結合ポケットインヒビターは、好ましくは、その結合状態と遊離状態との間に相対的に小さなエネルギー差（すなわち、結合の小さな変形エネルギー）を示さなければならない。従って、最も効率的なＰＧＦ_２αシンターゼインヒビターは、好ましくは、約１０ｋｃａｌ／モル以下（より好ましくは、７ｋｃａｌ／モル以下）結合の変形エネルギーを用いて設計されるべきである。ＰＧＦ_２αシンターゼインヒビターは、全結合エネルギーにおいて類似する２つ以上のコンフォメーションで結合ポケットと相互作用し得る。これらの場合、結合の変形エネルギーは、遊離物質のエネルギーとインヒビターがタンパク質に結合するとき観察されるこれらのコンフォメーションの平均エネルギーとの間の差であると考えられる。
【０２６９】
ＰＧＦ_２αシンターゼに結合するとして設計または選択される物質は、その結合状態において、好ましくは、標的酵素および周囲の水分子との静電的斥力相互作用がないように、計算によりさらに最適化され得る。このような非相補的静電的相互作用は、電荷−電荷斥力相互作用、双極子−双極子斥力相互作用および電荷−双極子斥力相互作用を含む。
【０２７０】
特定のコンピューターソフトウェアは、化合物変形エネルギーおよび静電的相互作用を評価する分野において入手可能である。このような使用のために設計されたプログラムの例として、以下が挙げられる：Ｇａｕｓｓｉａｎ ９４，ｒｅｖｉｓｉｏｎ Ｃ（Ｍ．Ｊ．Ｆｒｉｓｃｈ，Ｇａｕｓｓｉａｎ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ １９９５）；ＡＭＢＥＲ，ｖｅｒｓｉｏｎ ４．１（Ｐ．Ａ．Ｋｏｌｌｍａｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａａｔ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９９５）；ＱＵＡＮＴＡ／ＣＨＡＲＭＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ １９９５）；Ｉｎｓｉｇｈｔ ＩＩ／Ｄｉｓｃｏｖｅｒ，（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ１９９５）；ＤｅｌＰｈｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ １９９５）；およびＡＭＳＯＬ（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｅｘｃｈａｎｇｅ，Ｉｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）。これらのプログラムは、例えば、Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓワークステーション（例えば、「ＩＭＰＡＣＴ」グラフィクスを備えるＩｎｄｉｇｏ^２）を用いて実行され得る。他のハードウェアシステムおよびソフトウェアパッケージもまた、当業者に公知である。
【０２７１】
本発明により可能な別のアプローチは、ＰＧＦ_２αシンターゼに全体または部分的に結合し得る化学物質または化合物についての低分子データベースの計算的なスクリーニングである。このスクリーニングにおいて、結合部位へのこのような物質の適合の質は、形状的相補性または見積もられた相互作用エネルギーのいずれかにより判定され得る［Ｅ．Ｃ．Ｍｅｎｇら，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．，１６，５０５−５２４頁（１９９２）］。
【０２７２】
（コンビナトリアルケミストリ）
本発明で使用する化合物ライブラリは、例えば、コンビナトリアルケミストリー技術、醗酵方法、植物および細胞抽出手順などが挙げられるがこれらに限定されない、いずれかの手段により、作製することができるかまたは入手することができる。コンビナトリアルライブラリを作成する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｅ．Ｒ．Ｆｅｌｄｅｒ，Ｃｈｉｍｉａ １９９４，４８，５１２−５４１；Ｇａｌｌｏｐら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９４，３７，１２３３−１２５１；Ｒ．Ａ．Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１９９３，９，２３５−２３９；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ １９９１，３５４，８４−８６；Ｌａｍら、Ｎａｔｕｒｅ １９９１，３５４，８２−８４；Ｃａｒｅｌｌら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１９９５，３，１７１−１８３；Ｍａｄｄｅｎら、Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ２，２６９−２８２；Ｃｗｉｒｌａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９０，８７，６３７８−６３８２；Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９２，８９，５３８１−５３８３；Ｇｏｒｄｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９４，３７，１３８５−１４０１；Ｌｅｂｌら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ １９９５，３７ １７７−１９８；およびそれらで引用された参考文献を参照のこと。これらの参考文献は、その全体を、本明細書中で参考として援用する。
【０２７３】
（好ましい実施形態の説明）
本発明において、９，１１−エンドペルオキシドＰＧＨ_２をＰＧＦ_２αに還元する触媒機構に関して研究するために、本発明者らは、ＮＡＤＰＨと複合体化したＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ ＰＧＦ_２αシンターゼ（ＴｂＰＧＦＳ）の三次元（３−Ｄ）結晶構造を決定した。本明細書では、このＴｂＰＧＦＳ−ＮＡＤＰＨ二成分複合体の結晶構造を開示する。本明細書ではまた、この構造データから推測可能な他の構造データも開示する。
【０２７４】
１つの実施形態において、本発明では、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標のデータで生成される、立体構造コンピュータモデルが提供される。好ましくは、この原子座標は、図９に記載のプロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標またはその改変体であり得る。より好ましくは、前記原子座標はＮＡＤＰＨの原子座標を含み、かつ、図９に記載のＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ原子座標またはその改変体であってもよい。
【０２７５】
このような立体構造コンピュータモデル生成は、本明細書において上述されるような当該分野において周知の技術によって生成することができる。したがって、例えば、当業者は、図９に記載されるデータを入力することにより、本発明のモデルを容易に提供することができる。
【０２７６】
別の局面において、本発明は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を含むデータアレイであって、ここで該データアレイは、三次元分子モデリングアルゴリズムを使用することにより三次元構造を提示し得る、データアレイを提供する。好ましくは、この原子座標は、図９に記載の原子座標であるかまたはその改変体である。別の実施形態において、この原子座標はＮＡＤＰＨの原子座標を含み、かつ、図９に記載のＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ原子座標またはその改変体である。
【０２７７】
別の局面において、本発明は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標をコードした、コンピューター読み取り可能な記録媒体を提供する。好ましくは、この原子座標は、図９に記載の原子座標であるかまたはその改変体である。別の実施形態において、この原子座標はＮＡＤＰＨの原子座標を含み、かつ、図９に記載のＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ原子座標またはその改変体である。
【０２７８】
別の局面において、本発明は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの立体構造解析方法を提供するためのプログラムであって、Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標をコードしたデータ；およびＢ）三次元立体構造の解析をコンピュータに実行させるアプリケーションのコード、を含む、プログラムを提供する。このようなプログラムは、本明細書において上述したような、立体構造の精密化またはモデリングのような技法を実行させるものであり得る。好ましくは、上記原子座標は、図９に記載の原子座標であるかまたはその改変体である。上記原子座標は、ＮＡＤＰＨの原子座標を含み、かつ、図９に記載のＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ原子座標またはその改変体である。
【０２７９】
１つの好ましい実施形態において、上記アプリケーションは、Ａ）前記原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；およびＢ）候補化合物の三次元分子モデルを、該三次元分子モデルと比較する工程をコンピュータに実行させるものであり得る。そのようなモデルを比較するようなアプリケーションは、当該分野において周知であり、本明細書において上述された説明により当業者は容易に実施することができる。
【０２８０】
別の局面において、本発明は、図９に記載の原子座標によって定義される構造を有する、単離および精製された、タンパク質を提供する。高分解能Ｘ線結晶解析を用いて、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの３次元構造を解明したのは、本発明者らは初めてである。プロスタグランジンＦ_２αシンターゼは従来結晶化されておらず、構造解析も行われていなかった。したがって、図９に記載されるような結晶構造を保持したタンパク質は、従来になかった構造を有するものといえる。好ましくは、このようなタンパク質は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの活性を含む。このような活性は、当該分野において周知の技法を用いて測定することができる。そのような活性は、例えば、ＰＧＨ_２還元活性であり得る。従って、本発明の１つの実施形態では、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの結晶が提供される。この結晶は好ましくはＮＡＤＰＨと複合体化されたものであり得る。好ましくは、結晶は、正方晶空間群Ｐ４_１２_１２を有する。より好ましくは、この結晶は、ａ＝１１２．３±３Å、ｂ＝１１２．３±３Å、ｃ＝１４０．０±７Åの単位格子定数を有する。最も好ましくは、この結晶は、非対称単位中に２分子を含む。
【０２８１】
既知のＡＫＲ構造との比較によって、この酵素とＮＡＤＰＨとの結合に影響を及ぼすと考えられるいくつかの固有の特徴が示された。また、既知のＡＫＲ構造との比較により、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの触媒ポケットにおいてＡｓｐ４７、Ｔｙｒ５２、Ｌｙｓ７７およびＨｉｓ１１０の位置が保存されていることが明らかとなった。これらのアミノ酸残基の変異誘発研究によって、９，１１−エンドペルオキシドＰＧＨ_２をＰＧＦ_２αに還元する間にプロトン供与体として単独で作用するアミノ酸残基は、Ｈｉｓ１１０であることが同定された。この結果は、他のＡＫＲについて提唱されていたような、プロトンの供与体または受容体として機能するためにチロシンがアスパラギン酸、リジン、およびヒスチジンを必要とする触媒機構とは対照的である。
【０２８２】
従って、本発明は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの結合ポケットまたはその一部、あるいは類似の３次元形状を有するこれらの結合ポケットの相同体もしくは改変体を含む分子もしくは分子複合体を提供する。
【０２８３】
本発明はまた、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ（例えば、ＴｂＰＧＦＳ）の構造座標を含む、コンピューター読み取り可能な記録媒体（これは、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの結合ポケットの全部または一部を含んでいる）を提供する。これらのデータでコード化されるこのような記録媒体は、コンピューター画面または同様の視覚装置上で、分子もしくは分子複合体（これは、このような結合ポケットまたは同様の形状である相同体性結合ポケットを含む）の３次元グラフィック表示を表示し得る。
【０２８４】
本発明はまた、上記結合ポケットの全部または一部に結合する化合物を設計、評価、および同定するための方法を提供する。このような化合物は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体のインヒビターの候補であり得る。
【０２８５】
本発明はまた、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体のインヒビターとして有用な、新規なクラスの化合物およびそれらの医薬組成物を提供する。
【０２８６】
本発明はまた、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼに少なくともいくらか構造的に類似する特徴を含む分子もしくは分子複合体の３次元構造体の少なくとも一部を決定するための方法を提供する。これは、本発明によりプロスタグランジンＦ_２αシンターゼについて得られた構造座標の少なくともいくらかを用いることにより達成される。
【０２８７】
本発明はまた、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼおよび関連する複合体を結晶化させるための方法を提供する。
【０２８８】
そのような結晶は、従来の技術では全く提供することができなかった。本発明では、例えば、実施例に提供されるのような条件を用いることによって初めて、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの結晶化に成功し、その構造解析を行うことに成功した。従って、本発明のこのような結晶は、従来技術によっては得ることができなかったものであり、本発明は顕著な効果を奏するものといえる。なお、実施例に提供されるような条件を用いても、純度の問題からすべてが結晶化するとはいえなかった。本発明は、そのような条件を適宜改変することにより用いて、鋭意検討することにより、結晶化に成功したものである。
【０２８９】
本発明者らは、Ｘ線結晶解析に適切な、ＮＡＤＰＨと複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼを含む結晶を提供した。
【０２９０】
本発明者は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの活性部位結合ポケットの形状および構造についての情報を初めて提供した。
【０２９１】
結合ポケットは、薬物の発見などの分野において重要な用途を有する。天然のリガンドまたは基質と、それらの対応するレセプターまたは酵素の結合ポケットとの会合は、多くの生物学的作用機構の基礎である。同様に、多くの薬物は、レセプターまたは酵素の結合ポケットとの会合を通じてそれらの生物学的効果を発揮する。このような会合は、結合ポケットの全てまたは任意の部分で起こり得る。このような会合を理解することは、標的レセプターまたは酵素とより好適に会合する薬物を設計し、それにより生物学的効果を改良することを導くための助けとなる。従って、この情報は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体の結合ポケットのインヒビター候補を設計するのに有用である。
【０２９２】
従って、１つの局面において、本発明は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体の活性ポケットを含む、タンパク質を提供する。ここで、この活性ポケットは、ＮＡＤＰＨと複合体化されたものであってもよい。
【０２９３】
好ましくは、上記活性ポケットは、図９に記載されるアミノ酸残基４７、５２、７７、および１１０またはそれに対応するアミノ酸残基の原子座標によって定義される。
【０２９４】
より好ましくは、上記活性ポケットは、図９に記載されるアミノ酸残基４７、４９、５２、７７、７９、および１１０またはそれに対応するアミノ酸残基の原子座標によって定義される。
【０２９５】
より好ましくは、上記活性ポケットは、図９に記載されるアミノ酸残基２２、２３、４７、４９、５１、５２、７７、７９、１１０、１１１、１３９、１４０、１６１、および１８７またはそれに対応するアミノ酸残基の原子座標によって定義される。
【０２９６】
好ましくは、上記活性部位ポケットは、スルフェートアニオンを含む。
【０２９７】
好ましくは、上記タンパク質は、ＰＧＨ_２還元活性を有する。
【０２９８】
別の局面において、本発明は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体の活性ポケットを含む、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸分子、およびその情報を記録した記録媒体を提供する。当業者であれば、いったんタンパク質のアミノ酸配列を知ったならば、そのような配列をコードする核酸配列を有する核酸分子を得ることは容易に行うことができる。
【０２９９】
１つの局面において、本発明は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの相同体を得る方法であって、該方法は、候補化合物の原子座標と、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標とを比較する工程を包含する、方法を提供する。好ましくは、このプロスタグランジンＦ_２αシンターゼは、ＮＡＤＰＨと複合体化されているものであり得る。より好ましくは、この原子座標は、図９に記載の原子座標を含むが、図９に記載の原子座標から合理的にモデリング可能なものであればどのような原子座標であっても使用可能である。
【０３００】
別の局面において、本発明は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの相同体を得る方法を提供する。この方法は、以下の工程：Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；およびＢ）候補化合物の三次元分子モデルを、該プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの三次元分子モデルと比較する工程を包含する。三次元分子モデルを得る方法は、本明細書において上述されるような技術を用いることができる。上記比較工程もまた、当該分野において周知であり、そのような技術もまた、本明細書において上述されるような技術を用いることができる。好ましくは、このプロスタグランジンＦ_２αシンターゼは、ＮＡＤＰＨと複合体化されたものである。別の実施形態において、上記原子座標は、図９に記載の原子座標を含む。
【０３０１】
１つの実施形態において、本発明は、上記本発明の方法によって同定された、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ相同体を提供する。
【０３０２】
別の実施形態において、本発明は、上記本発明の方法によって同定された、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ相同体のアミノ酸配列をコードする核酸分子を提供する。
【０３０３】
別の局面において、本発明は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの改変体を得る方法を提供する。この方法は、以下の工程：Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；およびＢ）候補化合物の三次元分子モデルを、該プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの三次元分子モデルと比較し、所定のパラメータに基づき変異を導入する工程、を包含する。三次元分子モデルを得る方法は、本明細書において上述されるような技術を用いることができる。上記比較工程もまた、当該分野において周知であり、そのような技術もまた、本明細書において上述されるような技術を用いることができる。ここで、所定のパラメータとしては、タンパク質の物性に関連するパラメータを挙げることができ、例えば、水素結合、ファンデルワールス力、イオン性相互作用、非イオン性相互作用、静電的相互作用などの相互作用が挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、このプロスタグランジンＦ_２αシンターゼは、ＮＡＤＰＨと複合体化されたものである。別の実施形態において、上記原子座標は、図９に記載の原子座標を含む。
【０３０４】
１つの好ましい実施形態において、上記改変体は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ活性が亢進されている。ここで、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ活性が亢進されているかどうかは、例えば、ＰＧＨ_２を基質としてそのような改変体がＰＧＦ_２αの生成を野生型のプロスタグランジンＦ_２αシンターゼよりも有意に上昇させるかどうかを見ることによって判定することができる。本明細書では、そのような判定の際には、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ活性は、野生型ＰＧＦ２αシンターゼと同様のアッセイ条件を用いることができる。
【０３０５】
１つの好ましい実施形態において、上記改変体は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ活性が低減されている。ここで、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ活性が低減されているかどうかは、例えば、ＰＧＨ_２を基質としてそのような改変体がＰＧＦ_２αの生成を野生型のプロスタグランジンＦ_２αシンターゼよりも有意に減少させるかどうかを見ることによって判定することができる。
【０３０６】
別の実施形態において、本発明は、本発明の方法によって同定された、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ改変体を提供する。
【０３０７】
別の実施形態において、本発明は、上記本発明の方法によって同定された、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ改変体のアミノ酸配列をコードする核酸分子を提供する。
【０３０８】
上記のような相同体または改変体において、アミノ酸の変異、付加、置換および／または欠損に起因する結晶構造における改変、あるいは結晶を構成する任意の成分における他の変化はまた、構造座標における変化の原因であり得る。このような変化が、元の座標に比較して受容可能な標準誤差の範囲内である場合、得られる３次元形状は同じであるとみなされる。従って、例えば、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの活性部位結合ポケットに結合するリガンドはまた、別の結合ポケットに結合すると予測される。この結合ポケットの結合座標は、受容可能な誤差の範囲内におちつくような形状で定義した。このような改変複合体またはその結合ポケットはまた、本発明の範囲内である。
【０３０９】
このようなことを確認するために、分子またはその結合ポケット部分が、上記のプロスタグランジンＦ_２αシンターゼ結合ポケットのすべてまたは一部に十分に類似しているかどうかを決定するコンピューター分析が必要となり得る。このような分析は、現在のソフトウェアアプリケーション（例えば、ＱＵＡＮＴＡバージョン４．１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ アプリケーション）において、添付のユーザーズガイドに記載されるように実施され得る。
【０３１０】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙアプリケーションは、異なる構造、同じ構造の異なるコンフォメーション、および同じ構造の異なる部分の間の比較を可能にする。構造を比較するためにＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙにおいて使用される手順は、４つの工程に分割される：１）比較される構造をロードする；２）これらの構造における原子当量を定義する；３）適合操作を実施する；および４）結果を分析する。
【０３１１】
各構造は、名称で特定される。１つの構造は、標的として特定される（すなわち、固定構造）；すべての残りの構造は、作業構造である（すなわち、可変構造）。原子当量は、ＱＵＡＮＴＡ内でユーザーインプットにより定義されるので、本発明の目的のために、比較される２つの構造間の保存残基のすべてについて等価な原子を、タンパク質骨格原子（Ｎ、Ｃα、Ｃ，およびＯ）として本発明者らは定義する。本発明者らはまた、強固な適合操作のみを考慮する。
【０３１２】
強固な適合操作が使用される場合、作業構造は翻訳され、そして回転されて、標的構造との最適適合を得る。適合作業は、可変構造に適用される最適な翻訳および回転を計算するアルゴリズムを使用し、その結果、等価な原子の特定の対についての適合の根二乗平均差は絶対最低である。この数は、オングストロームで与えられ、ＱＵＡＮＴＡによって報告される。
【０３１３】
本発明の目的のために、図９にリストされる構造座標により記載される関連する骨格原子に重ね合わせた場合に１．５Å未満の保存された残基骨格原子（Ｎ、Ｃα、Ｃ，Ｏ）の根二乗平均偏差を有する任意の分子もしくは分子複合体、もしくはそれらの結合ポケットは、同一であるとみなされる。より好ましくは、根二乗平均偏差は、１．０Å未満である。
【０３１４】
用語「根二乗平均偏差」は、平均からの偏差の二乗の算術的平均の二乗根を意味する。これは、傾向または目的からの偏差（ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）または偏差（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を表現する方法である。本発明の目的のために、「根二乗平均偏差」は、ＴｂＰＧＦＳまたはその結合ポケット部分の骨格からのタンパク質の骨格における偏差を、本明細書に記載のＴｂＰＧＦＳの構造座標により定義されるように、定義する。
【０３１５】
１つの実施形態において、本発明は、図９に記載のアミノ酸４７、５２、７７、および１１０の構造座標により定義される結合ポケットのすべてまたは一部を含む、分子もしくは分子複合体、または１．５Å以下の該アミノ酸の骨格原子からの根二乗平均偏差を有する結合ポケットを含む該分子もしくは分子複合体の相同体を提供する。
【０３１６】
好ましくは、前記結合ポケットが、図９に記載のアミノ酸４７、４９、５２、７７、７９、および１１０の構造座標により定義される結合ポケットであるか、または１．５Å以下の該アミノ酸の骨格原子からの根二乗平均偏差を有する結合ポケットを含む該分子もしくは分子複合体の相同体である。
【０３１７】
より好ましくは、前記結合ポケットが、図９に記載のアミノ酸２２、２３、４７、４９、５１、５２、７７、７９、１１０、１１１、１３９、１４０、１６１、および１８７の構造座標により定義される結合ポケットであるか、または１．５Å以下の該アミノ酸の骨格原子からの根二乗平均偏差を有する結合ポケットを含む該分子もしくは分子複合体の相同体である。
【０３１８】
さらにより好ましいのは、図９における構造座標の全セットにより定義される分子もしくは分子複合体、±１．５Å以下の該アミノ酸の保存された骨格原子からの根二乗平均である。代替のより好ましい本発明の実施形態は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ分子である。
【０３１９】
ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ分子またはその結合ポケットもしくはその相同体について生成された構造座標を使用するために、それらを３次元形状に変換することがときに必要である。これは、市販のソフトウェアの使用により達成される。このソフトウェアは、構造座標のセットから分子またはその一部の３次元グラフィック表示をし得る。
【０３２０】
それゆえ、本発明の別の実施形態によれば、前記のデータを使用するための命令がプログラムされた機械を使用する場合、上記の本発明の分子もしくは分子複合体のいずれかのグラフィック３次元表示を表し得る、コンピューター読み取り可能なデータでコードされるデータ記憶物質を含むコンピューター読み取り可能記録媒体が提供される。
【０３２１】
別の実施形態によれば、本発明は、コンピューター読み取り可能データを用いてコードされたデータ記録材料を含むコンピューター読み取り可能データ記録媒体を提供し、該データを使用するための命令を用いてプログラムされた機械を使用する場合、該コンピューター読み取り可能データ記録媒体は、分子もしくは分子複合体のグラフィック３次元表示を表示し得、該分子もしくは分子複合体は、図９に記載のアミノ酸４７、５２、７７、および１１０、または該分子もしくは分子複合体の相同体の構造座標により定義される結合ポケットの全てのもしくは任意の部分を含み、ここで、該相同体は、１．５Å以下の該アミノ酸の骨格原子からの根二乗平均偏差を有する結合ポケットを含む。
【０３２２】
好ましくは、前記結合ポケットは、図９に記載のアミノ酸４７、４９、５２、７７、７９、および１１０、または前記分子もしくは分子複合体の相同体の構造座標により定義され、ここで、該相同体は、１．５Å以下の該アミノ酸の骨格原子からの根二乗平均偏差を有する結合ポケットを含む。
【０３２３】
より好ましくは、前記結合ポケットは、図９に記載のアミノ酸２２、２３、４７、４９、５１、５２、７７、７９、１１０、１１１、１３９、１４０、１６１、および１８７、または前記分子もしくは分子複合体の相同体構造座標により定義され、ここで、該相同体は、１．５Å以下の該アミノ酸の骨格原子からの根二乗平均偏差を有する結合ポケットを含む。
【０３２４】
さらにより好ましいのは、図９における全てのアミノ酸、±１．５Å以下の該アミノ酸の骨格原子からの根二乗平均偏差の構造座標により定義される、分子もしくは分子複合体のグラフィック３次元表示を表示し得るコンピューター読み取り可能データ記録媒体である。
【０３２５】
別の実施形態によれば、コンピューター読み取り可能データ記録媒体は、図９に記載の構造座標のフーリエ変換を含むコンピューター読み取り可能データの第一のセットを用いてコードされるデータ記憶物質を含み、該データを使用するための命令を用いてプログラムされた機械を使用する場合、該第一のセットは、コンピューター読み取り可能データの第二のセットと対応する構造座標の少なくとも一部を決定するために、分子もしくは分子複合体のＸ線回折パターンを含むコンピューター読み取り可能データの第二のセットと組み合わせられ得る。
【０３２６】
ここで、図１０を用いて、本発明のひとつの実施形態を示す。システム１０は、中央演算処理装置（「ＣＰＵ」）２０を含むコンピューター１１、作業メモリ２２（例えば、ＲＡＭ（ランダムアクセスメモリ）または「コア」メモリであり得る）、大容量記憶メモリ２４（例えば、１つ以上のディスクドライブまたはＣＤ−ＲＯＭドライブ）、１つ以上の陰極線管（「ＣＲＴ」）ディスプレイ端末２６、１つ以上のキーボード２８、１つ以上の入力ライン３０、１つ以上の出力ライン４０を含み、これらの全ては従来の双方向システムバス５０により相互に接続される。
【０３２７】
入力ライン３０によりコンピューター１１に接続された入力ハードウェア３６は、種々の方法で実行され得る。本発明のコンピューター読み取り可能データは、電話回線または専用データ回線３４により接続されたモデム３２の使用を介して入力され得る。あるいはまたはさらに、入力ハードウェア３６は、ＣＤ−ＲＯＭドライブまたはディスクドライブ２４を含み得る。ディスプレイ端末２６と共に、キーボード２８もまた、入力装置として使用され得る。
【０３２８】
出力ライン４０によりコンピューター１１に接続された出力ハードウェア４６は、通常の装置により同様に実行され得る。例として、出力ハードウェア４６は、本明細書中で記載されるＱＵＡＮＴＡのようなプログラムを使用して本発明の結合ポケットのグラフィック表示を表示するために、ＣＲＴディスプレイ端末２６を含み得る。出力ハードウェアはまた、後の使用のためにシステム出力を保存するために、ハードコピー出力を行い得るようにプリンター４２を、またはディスクドライブ２４を含み得る。
【０３２９】
操作において、ＣＰＵ ２０は、種々の入力および出力装置３６、４６と連係し、大容量記憶装置２４からデータアクセスならびに作業メモリ２２へのおよびここからのアクセスと連係し、そして配列のデータ処理ステップを決定する。多数のプログラムが、本発明のコンピューター読み取り可能データを処理するために使用され得る。このようなプログラムは、本明細書中に記載されるように薬物発見のコンピューター利用方法を参照して設計される。データ記録媒体の以下の記載の全体にわたって適切であるような、ハードウェアシステム１０の構成装置もまた本発明の範囲内にある。
【０３３０】
図１１は、図１０のシステム１０のようなシステムにより実行され得るコンピューター読み取り可能データを用いてコードされ得た、磁気データ記録媒体１００の横断面を示す。媒体１００は、片面または両面に、従来のものであり得る適切な基材１０１および従来のものであり得る適切なコーティング１０２を有する、従来のフロッピーディスケットまたはハードディスクであり得る。これは、その極性または配向が磁気的に変化され得る磁区（目に見えない）を含む。媒体１００はまた、ディスクドライブまたは他のデータ記憶装置２４の軸を受けるための開口部（示さない）を有し得る。
【０３３１】
媒体１００のコーティング１０２の磁区は、図１０のシステム１０のようなシステムによる実行のために、従来の様式で、本明細書中に記載されるようなコンピューター読み取り可能データをコードするように、極性化されるかまたは配向化される。
【０３３２】
図１２は、図１０のシステム１１のようなシステムにより実行され得る、このようなコンピューター読み取り可能データまたは命令のセットを用いてまたコードされ得る光学的読み取り可能データ記録媒体１１０の横断面を示す。媒体１１０は、従来のコンパクトディスク読み取り専用メモリ（ＣＤ−ＲＯＭ）、または光学的に読み取り可能でありそして光磁気的に書き込み可能である光磁気ディスクのような再書き込み可能媒体であり得る。媒体１００は、好ましくは、従来のものであり得る適切な基材１１１、および通常は基材１１１の片面に従来のものであり得る適切なコーティング１１２を有する。
【０３３３】
周知であるようなＣＤ−ＲＯＭの場合において、コーティング１１２は、反射的でありそしてコンピューター読み取り可能データをコードするために複数のピット１１３で押印される（ｉｍｐｒｅｓｓ）。ピットの配列は、レーザー光をコーティング１１２の表面に反射させる（ｒｅｆｌｅｃｔ ｏｆｆ）ことにより読まれる。好ましくは実質的に透明である保護コーティング１１４が、コーティング１１２の表面上に提供される。
【０３３４】
周知であるような光磁気ディスクの場合において、コーティング１１２は、ピット１１３を有さないが、レーザ（図示しない）により一定の温度を超えて加熱された場合にその極性または配向が磁気的に変化され得る、複数の磁区を有する。この区の配向は、コーティング１１２から反射されたレーザー光の偏光を測定することにより読み取られ得る。この区の配列は、上記のようにデータをコードする。
【０３３５】
本発明に従って、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの全部またはその一部ならびにそれらの構造的に類似の相同体の３次元構造を表示し得るデータは、構造のグラフィック３次元表示を表示し得る機械読み取り記録媒体中に保存される。このようなデータは、薬物発見のような種々の目的のために使用され得る。
【０３３６】
例えば、データによりコードされる構造は、化学物質と会合するその能力について、計算的に評価され得る。プロスタグランジンＦ_２αシンターゼと会合する化学物質は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼを阻害し得る。このような物質は候補薬物である。あるいは、データによりコードされる構造は、コンピューター画面上にグラフィック３次元表示で表示され得る。このことは、構造の視覚的検査、ならびに化学物質との構造の会合の視覚的検査を可能にする。
【０３３７】
従って、別の実施形態によれば、本発明は、化学物質が上記の任意の分子もしくは分子複合体と会合する能力を評価するための方法に関する。本方法は以下の工程を包含する：ａ）計算手段を用いて、化学物質と分子もしくは分子複合体の結合ポケットとの間の適合操作を行う工程：およびｂ）この適合操作の結果を分析して、化学物質と結合ポケットとの間の会合を定量化する工程。本明細書中で使用される用語「化学物質」は、化学化合物、少なくとも２つの化学化合物の複合体、およびこのような化合物または複合体のフラグメントを意味する。
【０３３８】
（医薬および治療・予防）
本発明は、本発明の方法によって同定された医薬ならびにそれを用いた治療および予防法を提供する。
【０３３９】
本明細書において「予防」（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓまたはｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）とは、ある疾患または障害について、そのような状態が引き起こされる前に、そのような状態が起こらないように処置することをいう。
【０３４０】
本明細書において「治療」とは、ある疾患または障害について、そのような状態になった場合に、そのような疾患または障害の悪化を防止、好ましくは、現状維持、より好ましくは、軽減、さらに好ましくは消長させることをいう。
【０３４１】
本発明の医薬組成物は、ＰＧＦ_２αシンターゼおよび／または本発明のスクリーニング方法により得られる相同体および／またはインヒビター；ならびに必要に応じて、任意の薬学的に受容可能なキャリア、アジュバントまたはビヒクルを含有する。このような組成物は、必要に応じて、他の追加薬剤を含有できる。
【０３４２】
医薬組成物を作製する場合には、好ましくは、当該分野において公知のＬｉｐｉｎｓｋｉ因子（「Ｌｉｐｉｎｓｋｉの５原則」としても公知）を考慮する。Ｌｉｐｉｎｓｋｉ因子とは、良好な生体内吸収プロフィールを有する化合物を識別するための指標である。良好な生体内吸収プロフィールを有する化合物を選択するためには、Ｌｉｐｉｎｓｋｉの５原則に従い、例えば、水素供与原子数５以下、水素結合許容原子数１０以下、分子量５００以下、およびｌｏｇＰの計算値が５以下の化合物が選択される（詳細には、Ｌｉｐｉｎｓｋｉ，ＣＡら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２００１ Ｍａｒ １；４６（１−３）：３−２６を参照のこと）。
【０３４３】
本明細書において「薬学的に受容可能なキャリア」は、医薬または動物薬を製造するときに使用される物質であり、有効成分に有害な影響を与えないものをいう。そのような薬学的に受容可能なキャリアとしては、例えば、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的アジュバントが挙げられるがそれらに限定されない。
【０３４４】
本発明の医薬組成物は、生物への移入に適した形態であれば、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。投与方法は、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、幹部への局所投与、皮膚投与、動脈内投与、滑膜内投与、胸骨内投与、胞膜内投与、病変内局注投与、および頭蓋内注射投与または注入技術など）、患部への直接投与などが挙げられる。そのような投与のための処方物は、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。本発明の医薬組成物は、全身投与されるとき、発熱物質を含ない、経口的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能なタンパク質溶液の調製は、ｐＨ、等張性、安定性などに相当な注意を払う限り、当業者の技術範囲内にある。
【０３４５】
本発明において医薬の処方のために使用される溶媒は、水性または非水性のいずれかの性質を有し得る。さらに、そのビヒクルは、処方物の、ｐＨ、容量オスモル濃度、粘性、明澄性、色、滅菌性、安定性、等張性、崩壊速度、または臭いを改変または維持するための他の処方物材料を含み得る。同様に、本発明の組成物は、有効成分の放出速度を改変または維持するため、または有効成分の吸収もしくは透過を促進するための他の処方物材料を含み得る。
【０３４６】
本発明は、医薬組成物として処方される場合、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）と、所望の程度の純度を有する選択された組成物とを混合することによって、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で、保存のために調製され得る。
【０３４７】
そのような適切な薬学的に受容可能な薬剤としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または農学的もしくは薬学的アジュバント。代表的には、本発明の医薬は、本発明の活性成分を、１つ以上の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに組成物の形態で投与され得る。例えば、適切なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的な他の物質を補充することが可能である。そのような受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、そして以下が挙げられる：リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））。
【０３４８】
注射剤は当該分野において周知の方法により調製することができる。例えば、適切な溶剤（生理食塩水、ＰＢＳのような緩衝液、滅菌水など）に溶解した後、フィルターなどで濾過滅菌し、次いで無菌容器（例えば、アンプルなど）に充填することにより注射剤を調製することができる。この注射剤には、必要に応じて、慣用の薬学的キャリアを含めてもよい。非侵襲的なカテーテルを用いる投与方法も使用され得る。例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、本発明の医薬は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、ｐＨ７．０−８．５のＴｒｉｓ緩衝剤またはｐＨ４．０−５．５の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。その溶液のｐＨはまた、種々のｐＨにおいて、本発明の活性成分の相対的溶解度に基づいて選択されるべきである。
【０３４９】
本発明の製剤の処方手順は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方、他の国の薬局方などに記載されている。従って、当業者は、本明細書の記載があれば、過度な実験を行うことなく、投与すべきポリペプチド量および細胞量を決定することができる。
【０３５０】
１つの実施形態において、本発明において同定される化合物は、徐放性形態で提供され得る。徐放性形態の剤型は、本発明において使用され得る限り、当該分野で公知の任意の形態であり得る。そのような形態としては、例えば、ロッド状（ペレット状、シリンダー状、針状など）、錠剤形態、ディスク状、球状、シート状のような製剤であり得る。徐放性形態を調製する方法は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方および他の国の薬局方などに記載されている。徐放剤（持続性投与剤）を製造する方法としては、例えば、複合体から薬物の解離を利用する方法、水性懸濁注射液とする方法、油性注射液または油性懸濁注射液とする方法、乳濁製注射液（ｏ／ｗ型、ｗ／ｏ型の乳濁製注射液など）とする方法などが挙げられる。
【０３５１】
本発明の医薬を被検体に投与する場合、そのような医薬の有効成分は、例えば１日当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重と約１００ｍｇ／ｋｇ体重との間、好ましくは１日当たり約０．５ｍｇ／ｋｇ体重と約７５ｍｇ／ｋｇ体重との間で投与され得る。そのような投与量は、対象とするプロスタグランジンＦ_２αシンターゼに関連する疾患または障害、予防または治療の別、被検体の年齢、サイズ、性別、病歴、併用する医薬などによって変動するが、当業者はそのような変動因子を考慮して適宜適切な投与量を決定することができる。代表的には、本発明の医薬組成物を投与する頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。例えば、１日当たり約１回〜約５回投与されるか、あるいは連続的な注入方法により投与され得る。このような投与は、慢性治療または急性治療で用いられ得る。単一の投与形態を与えるためにキャリア物質と組み合わせられ得る活性成分量は、治療される宿主および特定の投与方法に応じて変化する。代表的な調製物は、約５％〜約９５％（ｗ／ｗ）の活性化合物を含有する。好ましくは、このような調製物は、約２０％〜約８０％の活性化合物を含有する。
【０３５２】
本発明の組成物が、医薬の有効成分として１種以上の追加の医薬組成物または予防剤の組合せを含有する場合、本発明において同定された化合物種および追加薬剤の両方は、単一療法レジメンで通常投与される投薬量の約１０〜１００％の間、さらに好ましくは、約１０〜８０％の間の投薬量レベルで、与えられるべきである。
【０３５３】
（別の分子への応用）
図９で示した構造座標はまた、特に同じサブファミリーに属する他の結晶化分子もしくは分子複合体についての構造的な情報を得る際に、補助するのに使用できる。これは、任意の多くの分子置換を含む周知技術により、達成できる。
【０３５４】
従って、他の実施形態では、本発明は、構造が未知の分子もしくは分子複合体についての構造的な情報を得るために、分子置換を利用する方法を提供する。該方法は、以下の工程を包含する：
ａ） 未知の構造の上記分子もしくは分子複合体を結晶化する工程；
ｂ） 上記結晶化分子もしくは分子複合体から、Ｘ線回折パターンを得る工程；および
ｃ） 図９で示した構造座標の少なくとも一部を、上記Ｘ線回折パターンに適用して、構造が未知の上記分子もしくは分子複合体の３次元電子密度マップを得る工程。
【０３５５】
分子置換を使用することにより、本発明で提供される（そして図９で示す）ようなプロスタグランジンＦ_２αシンターゼに複合体の構造座標の全部または一部は、このような情報をａｂ ｉｎｉｔｉｏ法で決定する試みよりも迅速かつ効率的に、構造が未知の結晶化分子もしくは分子複合体の構造を決定するのに使用され得る。
【０３５６】
分子置換は、未知の構造の位相の正確な見積もりを提供する。位相は、直接決定できない結晶構造を解明するのに使用する式の因子である。分子置換以外の方法によって、位相の正確な値を得ることは、概算および洗練（ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）の反復サイクルを含む多くの時間を要するプロセスであり、そして結晶構造の解明を非常に妨げる。しかしながら、少なくとも相同部分を含むタンパク質の結晶構造が解明されたとき、既知構造の位相は、未知構造の位相の予測の基礎を提供する。
【０３５７】
この方法は、構造が未知の分子もしくは分子複合体の結晶の観察されたＸ線回折パターンを最もよく説明するよう、未知の分子もしくは分子複合体の結晶の単位格子内に、図９に記載のプロスタグランジンＦ_２αシンターゼの関連部分を配向し位置を決めることによって、構造座標が未知の分子もしくは分子複合体の予備モデルを作成することを包含する。次いで、位相がこのモデルから計算され、そして観察されたＸ線回折パターン振幅と組み合わせて、座標が未知の構造の電子密度マップを作成し得る。今度は、これは、任意の周知のモデル構築および構造洗練技術に供され、未知の結晶化分子もしくは分子複合体の最終的で正確な構造を提供し得る［Ｅ．Ｌａｔｔｍａｎ、「Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ」、ｉｎ Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１１５、５５〜７７頁（１９８５）；Ｍ．Ｇ．Ｒｏｓｓｍａｎｎ編、「Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄ」、Ｉｎｔ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｓｅｒ．、Ｎｏ．１３、Ｇｏｒｄｏｎ ＆Ｂｒｅａｃｈ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７２）］。
【０３５８】
プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの任意の部分と充分に相同である任意の結晶化分子もしくは分子複合体の任意の部分の構造は、この方法により解明され得る。
【０３５９】
好ましい実施形態では、分子置換方法は、分子もしくは分子複合体についての構造的な情報を得るのに使用され、ここで、この複合体は、少なくとも１個のプロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたは相同体を含有する。
【０３６０】
本発明により提供されるプロスタグランジンＦ_２αシンターゼの構造座標は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはプロスタグランジンＦ_２αシンターゼ複合体の他の結晶形態の構造を解明するのに、特に有用である。
【０３６１】
さらに、本発明により提供されるプロスタグランジンＦ_２αシンターゼの構造座標は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ変異体の構造（これは、必要に応じて、化学物質との複合体として結晶化されていてもよい）を解明するのに有用である。次いで、一連のこのような複合体の結晶構造は、分子置換により解明され、そして野生型プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの結晶構造と比較され得る。この酵素の種々の結合部位内での修飾部位の候補が、このように同定され得る。この情報は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼと化学物質または化合物との間の最も効率的な結合相互作用（例えば、増大した疎水性相互作用）を決定するさらなる手段を提供する。
【０３６２】
この構造座標はまた、種々の化学物質と共複合体化したプロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはプロスタグランジンＦ_２αシンターゼ相同体の結晶構造を解明するのに、特に有用である。このアプローチは、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼのインヒビター候補を含む化学物質とプロスタグランジンＦ_２αシンターゼとの間の相互作用のための最適部位の決定を可能とする。例えば、異なるタイプの溶媒に曝露した結晶から回収した高分解能Ｘ線回折データは、各タイプの溶媒分子が存在する場所の決定を可能とする。次いで、これらの部位に堅く結合する小分子が設計および合成され、そしてそれらのプロスタグランジンＦ_２αシンターゼ阻害活性について試験され得る。
【０３６３】
上で述べた全ての複合体は、周知のＸ線回折技術を用いて研究され得、そしてコンピューターソフトウェア（例えば、Ｘ−ＰＬＯＲ［Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、１９９２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｃ．により配布；例えば、Ｂｌｕｎｄｅｌｌ および Ｊｏｈｎｓｏｎ、上記；Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１１４ および １１５巻、Ｈ．Ｗ．Ｗｙｃｋｏｆｆら著、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８５）を参照のこと］）を用いて、Ｒ値約０．２０以下までの分解能１．５〜３ÅのＸ線データと対比して、洗練され得る。それゆえ、この情報は、既知のＴｂＰＧＦＳインヒビターを最適化するのに、そしてより重要には、新規のＴｂＰＧＦＳインヒビターを設計するのに、使用され得る。
【０３６４】
したがって、１つの局面において、本発明は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体に結合し得る化合物を同定する方法を提供する。このような方法は、以下の工程：ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に対して三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの活性部位ポケットの空間座標を決定する工程；およびｂ）上記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体の活性部位ポケットの空間座標に対して、電子的に候補化合物のセットの空間座標をスクリーニングして、上記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する工程、を包含する。活性部位ポケットは、本発明に記載の方法によって同定することができる。そのような活性ポケットの例は、本明細書において上述したとおりである。上述の結合し得る化合物の同定もまた、当該分野において周知の技術を用いて行うことができる。そのような方法は、本明細書において上述されている。結合は、タンパク質の一部であれば、どこでもよいが、好ましくは活性部位ポケットであり得る。あるタンパク質に結合し得るかどうかは、相互作用（例えば、水素結合、ファンデルワールス力、イオン性相互作用、非イオン性相互作用、静電的相互作用など）を計算することによって行うことができる。
【０３６５】
上記結合し得る化合物を同定する方法において、好ましくは、上記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼは、ＮＡＤＰＨと複合体化されたものであり得る。より好ましくは、上記原子座標は、図９に記載の原子座標を含む。
【０３６６】
別の実施形態において、上記相同体または改変体は、本発明の方法によって得られたものであり得る。
【０３６７】
より好ましくは、上述のプロスタグランジンＦ_２αシンターゼは、ヒト、ウシ、ヒツジなどの哺乳動物、またはＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉのプロスタグランジンＦ_２αシンターゼを含む。
【０３６８】
上記結合し得る化合物を同定する方法の１つの実施形態において、上記工程ａ）において決定された空間座標は、図９に記載されるアミノ酸残基４７、５２、７７、および１１０またはそれに対応するアミノ酸残基の原子座標によって定義される。より好ましくは、この空間座標は、図９に記載されるアミノ酸残基４７、４９、５２、７７、７９、および１１０またはそれに対応するアミノ酸残基の原子座標によって定義される。さらに好ましくは、この空間座標は、図９に記載されるアミノ酸残基２２、２３、４７、４９、５１、５２、７７、７９、１１０、１１１、１３９、１４０、１６１、および１８７またはそれに対応するアミノ酸残基の原子座標によって定義される。別の実施形態において、この空間座標は、図９に記載されるスルフェートアニオンまたはそれに対応するスルフェートアニオンの原子座標を含む。
【０３６９】
別の局面において、本発明は、候補化合物の三次元分子モデルを、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体の三次元分子モデルと比較することによって、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法を提供する。この方法は、以下の工程：Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；Ｂ）上記三次元分子モデルの座標データをデータ構造に入力して、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子間の距離を検索する工程；およびＣ）候補化合物において水素結合を形成するヘテロ原子と、上記三次元分子モデルにおいて活性部位ポケットを形成するヘテロ原子との間の距離を比較して、２つの構造の間での最適な水素結合に基づいて、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの三次元分子モデルの活性部位ポケットと安定な複合体を理論上形成する候補化合物種を同定する工程、を包含する。このようなモデルを得る工程および原子間の距離を検索する工程、および候補化合物種を同定する工程は、当該分野において周知であり、本明細書において上述のコンピュータによる解析を適宜用いて行うことができる。
【０３７０】
別の実施形態において、このプロスタグランジンＦ_２αシンターゼは、ＮＡＤＰＨと複合体化されたものであり得る。好ましくは、上記原子座標は、図９に記載の原子座標を含む。
【０３７１】
別の実施形態において、上記相同体または改変体は、本発明の方法によって得られたものである。
【０３７２】
好ましい実施形態において、使用されるプロスタグランジンＦ_２αシンターゼは、ヒト、ウシ、ヒツジ、マウスなどの哺乳動物またはＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ
ｂｒｕｃｅｉのプロスタグランジンＦ_２αシンターゼを含む。
【０３７３】
好ましくは、上記候補化合物は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼのＰＧＨ_２還元活性を阻害する活性を有する。
【０３７４】
ある実施形態において、上記候補化合物は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼのＰＧＨ_２還元活性を活性化する活性を有する。
【０３７５】
別の局面において、本発明は、本発明の方法によって同定された化合物に関する。そのような化合物は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼのアンタゴニストまたはアゴニスト、あるいはインヒビターであり得る。そのような化合物は、いったん原子座標が決まったならば、当業者は適宜、当該分野において公知の方法を応用して合成することができる。
【０３７６】
別の局面において、本発明は、本発明の方法により同定された化合物を有効成分として含む医薬組成物に関する。医薬組成物の製造法は、当該分野において周知であり、本明細書において上述されたとおりである。本発明の医薬組成物は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼに関連する疾患または障害を処置または予防するためのものであり得る。そのような疾患または障害は、当該分野において公知であり、例えば、アフリカ睡眠病、流産、気管支収縮に関する疾患などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０３７７】
別の局面において、本発明は、本発明の方法によって同定された化合物の名称および構造を含むデータをコードした、データベースを提供する。このようなデータをコードするデータベースの生成法は当該分野において周知であり、本明細書において上述されるような方法を用いて実行され得る。
【０３７８】
別の局面において、本発明は、本発明の方法により同定された化合物の名称および構造を含むデータをコードした、データベースを含む記録媒体を提供する。このような記録媒体は、どのような形態でもよく、例えば、ＭＯ、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＡＭ、ＤＶＤ−Ｒ、ＤＶＤ−ＲＷ、ＤＶＤ＋ＲＷ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、メモリーカードであってもよい。
【０３７９】
別の局面において、本発明は、本発明の方法により同定された化合物の名称および構造を含むデータをコードした、データベースを含む伝送媒体を提供する。そのような伝送媒体は、当該分野において周知のものが使用され得、例えば、インターネット、イントラネット、ＬＡＮ、ＷＡＮなどが挙げられるがそれに限定されない。
【０３８０】
別の局面において、本発明は、以下の式によって定義される原子の空間的配置を有するファルマコフォアモデルを提供する：
【０３８１】
【化１２】。

【０３８２】
このファルマコフォアでは、イミダゾリウムイオンはプロトン供与体として、ペルオキシド基の１つの酸素原子をプロトン化し、該ペルオキシド基の他方の酸素原子は、ニコチンアミド環から１つのプロトンおよび２つの電子を受容することにより還元され、Ｒは任意の基を表し、ニコチンアミド環のＣ４位とイミダゾリウムイオンのＮ１位との間の距離（Ｘ）は任意である。上記式において、原子間距離は各原子の中心間の距離を示す。好ましくは、上記式において、ニコチンアミド環のＣ４位と、イミダゾリウムイオンのＮ１位との間の距離（Ｘ）は、５．１４±０．２５Åである。
【０３８３】
別の局面において、本発明は、以下の式によって定義される原子の空間的配置を有するファルマコフォアモデルを提供する：
式ＩＩ
【０３８４】
【化１３】。

【０３８５】
この式において、Ｏは酸素原子を表し、Ｒは任意の基を表し、ニコチンアミド環のＣ４位とイミダゾリウムイオンのＮ１位との間の距離（Ｘ）は任意であり、原子間距離は各原子の中心間の距離を示す。好ましくは、上記式において、ニコチンアミド環のＣ４位と、イミダゾリウムイオンのＮ１位との間の距離（Ｘ）は、５．１４±０．２５である。
【０３８６】
他の局面において、本発明は、以下の式によって定義される原子の空間的配置を有するファルマコフォアモデルを提供する：
式ＩＩＩ
【０３８７】
【化１４】

【０３８８】
この式において、原子間距離は各原子の中心間の距離を示し、Ａ〜Ｅは任意の原子であるが、ただし、ＡおよびＢが両方ともが酸素原子である場合は除かれる。ＡおよびＢが両方とも酸素原子ではないものを選択することによって、酸化還元反応を阻害する効果を付与する能力が高まる。
【０３８９】
好ましい実施形態において、上記Ａ〜Ｅの少なくとも１つは非反応性の原子であってもよい。ここで、非反応性の原子とは、本明細書において、ＮＡＤＰＨとプロスタグランジンＦ_２αシンターゼとの複合体における酸化還元反応において、通常の反応よりも少ない程度で反応するかまたは全く反応しない原子をいう。そのような原子としては、例えば、炭素など、酸素原子以外のものが挙げられるがそれに限定されない。別の好ましい実施形態では、Ａ〜Ｅの少なくとも２つ、より好ましくは３つ、さらに好ましくは４つ、別の好ましい実施形態では５つの原子が、そのような非反応性原子であり得る。より好ましくは、Ａ〜Ｅの少なくとも１つは、炭素原子であり得る。非反応性の原子を有することにより、活性複合体には結合するものの反応を抑制するような化合物を得ることができる。ある好ましい実施形態では、上記ＡまたはＢの少なくとも１つは非反応性の原子である。別の実施形態では、Ａは、非反応性の原子である。他の実施形態では、Ｂは、非反応性の原子である。
【０３９０】
１つの好ましい実施形態では、ＡまたはＢの少なくとも１つは炭素原子である。別の好ましい実施形態では、Ａは、炭素原子である。他の好ましい実施形態では、Ｂは、炭素原子である。他の好ましい実施形態では、ＡおよびＢのいずれか一方は電子供与体原子または水素結合をし得る原子であり、他方は非反応性の原子である。電子供与体原子であるかどうかは、当該分野に周知の技術を用いてその原子と相互作用をする原子などとの相対的関係を考慮することに決定することができる。この電子供与体原子または水素結合をし得る原子は酸素原子であってもよい。上記実施形態において、非反応性の原子は炭素原子であってもよい。
【０３９１】
別の好ましい実施形態では、Ｃ、ＤおよびＥは炭素原子であってもよい。Ｃ、ＤおよびＥが炭素原子であることにより、ＰＧＨ_２と類似の形態が保持されることから、反応複合体に結合する能力を保持し得るからである。
【０３９２】
より好ましくは、Ａは炭素原子であり、Ｂは酸素原子である。別の好ましい実施形態では、Ａは酸素原子であり、Ｂは炭素原子である。
【０３９３】
他の局面において、本発明は、式ＩＩＩのファルマコフォアモデルによって定義される化合物またはその塩を提供する。そのような化合物は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼのインヒビターとして有用であり得る。
【０３９４】
ある好ましい実施形態では、本発明は、
【０３９５】
【化１５】

【０３９６】
（９，１１−ジデオキシ−９α，１１α−メタノエポキシプロスタグランジンＦ_２α）
または
【０３９７】
【化１６】

【０３９８】
（９，１１−ジデオキシ−９α，１１α−エポキシメタノプロスタグランジンＦ_２α）
で示される構造を有する化合物またはその塩を提供する。このような化合物またはその塩は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼのインヒビターとして有用であり、医薬組成物の有効成分として使用され得る。
【０３９９】
別の局面において、本発明は、本発明において同定されたファルマコフォアで規定された化合物を提供する。このような化合物は、本発明で同定されたファルマコフォアのデータを当該分野において周知の技術に適用して用いて、同定することができる。
【０４００】
別の局面において、本発明は、本発明のファルマコフォアモデルの、医薬候補分子のスクリーニングにおける使用を提供する。このようなファルマコフォアを上記スクリーニングで使用する場合、本明細書において記載されるようなコンピュータ解析技術を用いることができる。
【０４０１】
別の局面において、本発明は、本発明のファルマコフォアモデルを使用したスクリーニングによって同定された医薬候補分子を提供する。好ましくは、この分子は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼのＰＧＨ_２還元活性を阻害する活性を有する。別の好ましい実施形態では、本発明は、この医薬候補分子を含む、医薬組成物を提供する。
【０４０２】
別の局面において、本発明は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼに関連する疾患または障害を処置または予防するための医薬組成物を調製する方法を提供する。この方法は、Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；Ｂ）上記三次元分子モデルと、上記医薬組成物に含まれるべき候補化合物のライブラリーとの相互作用を評価する工程；Ｃ）上記候補化合物のうち、上記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの活性を調節する作用を有する化合物種を選択する工程；およびＤ）上記化合物種と、薬学的に受容可能なキャリアとを混合する工程、を包含する。ここで、上記Ａ）〜Ｃ）までは、本明細書において別の箇所において記載されるような技術を用いて行うことができる。Ｄ）混合する工程もまた、当該分野において周知の技術を用いて行うことができ、例えば、そのような方法は、日本薬局方において記載されるような技術を用いて実施することができる。好ましくは、上記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼは、ＮＡＤＰＨと複合体化されたものであり得る。より好ましくは、上記原子座標は、図９に記載の原子座標を含む。別の実施形態において、上記相同体または改変体は、本発明の方法によって得られたものを利用することができる。
【０４０３】
好ましい実施形態において、本発明において用いられるプロスタグランジンＦ_２αシンターゼは、ヒト、ウシ、ヒツジ、マウスなどの哺乳動物、またはＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉのプロスタグランジンＦ_２αシンターゼを含む。
【０４０４】
好ましくは、化合物種を合成して大量に該化合物種を製造する工程、をさらに包含する。そのような大量合成方法は、いったんその化合物種の合成方法が分かれば、当業者は当該分野において周知の方法を用いて実施することができる。
【０４０５】
より好ましい実施形態において、本発明の上記医薬組成物において含有される化合物種について、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ活性に関する生物学的試験を行う工程をさらに包含する。そのような生物学的試験は、インビトロまたはインビボあるいは動物実験であってもよい。そのような生物学的試験を行う方法は、当該分野において周知である。
【０４０６】
別の局面において、本発明は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼに関連する疾患または障害を処置または予防するための方法を提供する。この方法は、Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；Ｂ）上記三次元分子モデルに基づいて、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの活性を調節する手段を同定する工程；およびＣ）該調節手段を該疾患または障害に罹患するかまたはその可能性のある被検体に投与する工程、を包含する。好ましくは、このプロスタグランジンＦ_２αシンターゼは、ＮＡＤＰＨと複合体化されたものであり得る。より好ましくは、この原子座標は、図９に記載の原子座標を含む。別の実施形態において、上記相同体または改変体は、本発明の方法によって得られたものであってもよい。
【０４０７】
好ましい実施形態において、上記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼは、ヒト、ウシ、ヒツジ、マウス、ラットなどの哺乳動物、またはＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉのプロスタグランジンＦ_２αシンターゼを含む。ヒト、ウシ、ヒツジ、マウス、ラットなどの哺乳動物、であれば、自己に由来するプロスタグランジンＦ_２αシンターゼの活性を調節することによってプロスタグランジンＦ_２αシンターゼの異常に起因する疾患または障害を処置することができるからである。また、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉのプロスタグランジンＦ_２αシンターゼの場合もまた、ヒトにおけるアフリカ睡眠病および動物におけるナガナの病因であることが分かっていることから、その活性を調節することは、そのような病因を抑制または除去するのに有用であるからである。
【０４０８】
別の局面において、本発明は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの相同体を得る方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを提供する。他の実施形態において、本発明は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの相同体を得る方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体を提供する。他の実施形態において、本発明は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの相同体を得る方法を実行するコンピュータを提供する。１つの実施形態において、このプログラムが実行させる方法は、Ａ）候補化合物の原子座標と、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標とを比較する工程、を包含する。別の実施形態において、このプログラムを実行させる方法は、Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；およびＢ）候補化合物の三次元分子モデルを、該プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの三次元分子モデルと比較する工程、を包含する。このような三次元分子モデルを得る技術および比較工程をコンピュータに実行させる技術は、当該分野において周知であり、本明細書において他の場所において引用したプログラムを利用することもできる。
【０４０９】
別の局面において、本発明は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの改変体を得る方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを提供する。他の実施形態において、本発明は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの改変体を得る方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体を提供する。他の実施形態において、本発明は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの改変体を得る方法を実行するコンピュータを提供する。１つの実施形態において、このプログラムが実行させる方法は、Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；およびＢ）候補化合物の三次元分子モデルを、該プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの三次元分子モデルと比較し、所定のパラメータに基づき変異を導入する工程を包含する。このような三次元分子モデルを得る技術および変異導入工程をコンピュータに実行させる技術は、当該分野において周知であり、本明細書において他の場所において引用したプログラムを利用することもできる。ここで、所定のパラメータには、例えば、極性、疎水性、親水性、化学的性質、化学構造、分子量、水素結合、ファンデルワールス力、イオン性相互作用、非イオン性相互作用、錯体形成能、レセプター−リガンド相互作用、静電的相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０４１０】
別の局面において、本発明は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを提供する。他の実施形態において、本発明は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体を提供する。他の実施形態において、本発明は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法を実行するコンピュータを提供する。１つの実施形態において、このプログラムが実行させる方法は、Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に対して三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの活性部位ポケットの空間座標を決定する工程；およびＢ）該プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体の活性部位ポケットの空間座標に対して、電子的に候補化合物のセットの空間座標をスクリーニングして、該プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する工程を包含する。このような空間座標を決定する技術および電子的なスクリーニング工程をコンピュータに実行させる技術は、当該分野において周知であり、本明細書において他の場所において引用したプログラムを利用することもできる。
【０４１１】
別の局面において、本発明は、候補化合物の三次元分子モデルを、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体の三次元分子モデルと比較することによって、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを提供する。他の実施形態において、本発明は、候補化合物の三次元分子モデルを、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体の三次元分子モデルと比較することによって、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体を提供する。他の実施形態において、本発明は、候補化合物の三次元分子モデルを、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体の三次元分子モデルと比較することによって、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法を実行するコンピュータを提供する。１つの実施形態において、このプログラムが実行させる方法は、Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；Ｂ）該三次元分子モデルの座標データをデータ構造に入力して、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子間の距離を検索する工程；およびＣ）候補化合物において水素結合を形成するヘテロ原子と、該三次元分子モデルにおいて活性部位ポケットを形成するヘテロ原子との間の距離を比較して、２つの構造の間での最適な水素結合に基づいて、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの三次元分子モデルの活性部位ポケットと安定な複合体を理論上形成する候補化合物種を同定する工程を包含する。このような三次元分子モデルを得る技術、原子間の距離の検索、および活性部位ポケットと安定な複合体を理論上形成する候補化合物種を同定する工程をコンピュータに実行させる技術は、当該分野において周知であり、本明細書において他の場所において引用したプログラムを利用することもできる。
【０４１２】
上述の記録媒体は、上記プログラムを記録することができるものであれば、どのようなものでもよく、例えば、そのような媒体としては、例えば、ＭＯ、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＡＭ、ＤＶＤ−Ｒ、ＤＶＤ−ＲＷ、ＤＶＤ＋ＲＷ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、メモリーカードなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０４１３】
使用されるコンピュータも、上記プログラムが実行され得る限り、どのようなものでもよく、例えば、Ｗｉｎｄｏｗｓベース、ＵＮＩＸベース、Ｍａｃ ＯＳベース、ＬＩＮＵＸベースなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０４１４】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定されることが理解されるべきである。
【０４１５】
【実施例】
（実施例１：プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの結晶化および三次元構造解析）
（材料および方法）
（結晶化およびデータ収集）
Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉのプロスタグランジンＦ_２αシンターゼの結晶化は、当初マルトース結合タンパク質とプロスタグランジンＦ_２αシンターゼとの間の融合タンパク質として合成して行ったが、全く成功しなかった収量および純度のいずれかまたは両方に問題があったものと考えられた。これは、おそらく、プロテアーゼによる分解での段階の問題が考えられた。
【０４１６】
次に、本発明者らは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質としてこのプロスタグランジンＦ_２αシンターゼを発現させた。発現は、当該分野において周知の方法を用いて行った。詳細な手順は、以下に一部詳述する。
【０４１７】
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを用いても、疎水性が高いことにより膜などへの吸着性が高いという問題、精製の段階でのサンプル量が低減するという問題があった。したがって、このサンプルを用いた場合でも結晶化のためには詳細な条件検討を行う必要があった。
【０４１８】
そこで、本発明者らは、ＨＥＰＥＳまたはＴｒｉｓ−ＨＣｌを緩衝剤として使用して、適切な緩衝溶液を選定した。すると、ＨＥＰＥＳのほうが一般的に良好な結果を示した。同時に、硫酸アンモニウムの濃度を０．１Ｍ刻みで、およびｐＨを０．１刻みで振り、詳細な条件検討を行った。すると、ｐＨでは７．４以下でも７．６以上でも有意な結晶化は行われなかったが、ｐＨ７．５のとき、２．０Ｍ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４の濃度でうまく結晶化することが観察された。この（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４の濃度は、１．９Ｍ以下でも２．１Ｍ以上でもうまく結晶化する結果に至らなかったことにかんがみると、非常に特異な条件ということができる。
【０４１９】
上記結果にかんがみ、構造解析のために、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ ７．５）中のネイティブ酵素溶液（１５ｍｇ／ｍｌ）を、２５℃にて１：２の比率でリザーバー溶液［２％ＰＥＧ−４００，２．０Ｍ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４および１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）］を用いるハンギングドロップ蒸気拡散法により結晶化した。この条件下で３つの結晶を得ることができた。そのうち１つの結晶解析に成功した。
【０４２０】
結晶は、０．２×０．１×０．１ｍｍ^３の最終サイズを有し、そして正方晶に達した。この正方晶は空間群Ｐ４_１２_１２を有し、ａ＝１１２．３±０．３Å、ｂ＝１１２．３±０．３Å、ｃ＝１４０．０±０．７Åのセル寸法（結晶格子定数）を有し、そして非対称単位中に２分子を有する。複合体の結晶は、ＴｂＰＧＦＳのネイティブ結晶を５００ｍＭ ＮＡＤＰＨ溶液にソーキングして得た。回折データを、本発明者らの研究室において室温で収集した。プログラムＤＥＮＺＯおよびＳＣＡＬＥＰＡＣＫ（ＯｔｗｉｎｏｗｓｋｉおよびＭｉｎｏｒ，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２７６，３０７−３２６）を用いて、すべてのデータセットを指数付けし、積分し、そしてスケーリングした。
【０４２１】
（構造の決定および精密化）
初期モデルとしてＳｕｓ ｓｃｒｏｆａアルドースレダクターゼ（ＰＤＢコード：１ＡＨ３）の構造を使用し、プログラムＡＭｏＲｅ（Ｎａｖａｚａ，１９９４，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．，Ａ５０，１５７−１６３）による分子置換法によって構造を決定した。３．０Å分解能までのデータを用いて回転関数の計算の後、本発明者らは、非対称単位中に存在する２分子に対応した２つの解を得た。この結果、相関係数５２．１％および信頼度因子Ｒ＝４６．４％を生じた。引き続いて、プログラムＴＵＲＢＯ−ＦＲＯＤＯ（Ｊｏｎｅｓ Ｔ．Ａ．，ＦＲＯＤＯ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１１５：１５７−１７１（１９８５））を使用して構造精密化サイクルを行い、そして剛体近似最小化後にモデル構築を行うことによって、ポリペプチド鎖のトレースを完成した。構造の精密化を、プログラムＣＮＳ（Ｂｒｕｎｇｅｒ，Ａ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，８，６０６−６１１）で行った。この精密化手順は、以下を包含した：ＣＮＳによって提供される、シミュレートアニーリング、位置精密化、拘束温度因子精密化および最尤アルゴリズム（ｍａｘｉｍｕｍ−ｌｉｋｅｌｈｏｏｄ；マイキマムライクリフッド）。水分子を手動で挿入し、次いで、Ｆｏ−Ｆｃマップを検査することによって調べた。ＮＡＤＰＨおよびスルフェートアニオンは、精密化の初期サイクル後に電子密度上に明確に確認され、モデルに挿入した。非対称単位中にある両分子のすべての残基は類似しており、構造アラインメント上での０．２６Åのｒｍｓ偏差を示した。
【０４２２】
（部位特異的変異誘発）
ＴｂＰＧＦＳにおける点変異研究のために、高度に保存されたアミノ酸残基を点変異の対象として、ＴｂＰＧＦＳ−ＮＡＤＰＨ結晶複合体の詳細な構造情報に基づいて選択した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）変異誘発を行って、適切に変異させたｃＤＮＡを生成した。各変異体についてのミスマッチコドンを含む、一連のセンス（Ｆ）およびアンチセンス（Ｒ）プライマーを、ＰＣＲ−変異誘発のために設計した。部位特異的変異誘発を使用して、Ｄ４７Ｎ、Ａ４９Ｓ、Ｉ５１Ａ、Ｙ５２Ｆ、Ｋ７７Ｌ、Ｗ７９Ｆ、Ｗ７９Ｙ、Ｈ１１０Ｆ、Ｗ１１１Ｖ、Ｋ７７Ｒ、およびＷ１１１Ｆを生成するために用いたオリゴヌクレオチドプライマー対は、それぞれ、以下の通りであった：（Ｆ）５’−ＧＣＴＡＴＣＧＴＣＡＣＡＴＣＡＡＴＡＣＴＧＣＡＧＣＣＡＴＣＴＡＴＡＡＡＡＡＴＧ−３’（配列番号６）および（Ｒ）５’−ＧＴＡＴＴＧＡＴＧＴＧＡＣＧＡＴＡＧＣＣＧＣ−３’（配列番号７）；（Ｆ）５’−ＴＣＡＧＣＣＡＴＣＴＡＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡＧ−３’（配列番号８）および（Ｒ）５’−ＣＡＴＴＴＴＴＡＴＡＧＡＴＧＧＣＴＧＡＡＧＴＡＴＣＧＡＴＧＴＧＡＣＧＡＴＡＧ−３’（配列番号９）；（Ｆ）５’−ＧＣＡＧＣＣＧＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡＧＡＡＡＧ−３’（配列番号１０）および（Ｒ）５’−ＣＡＴＴＴＴＴＡＴＡＧＧＣＧＧＣＴＧＣＡＧＴＡＴＣＧＡＴＧＴＧ−３’（配列番号１１）；（Ｆ）５’−ＧＣＡＧＣＣＡＴＣＴＴＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡＧＡＡＡＧＣＧＣＴＧＧ−３’（配列番号１２）および（Ｒ）５’−ＣＡＴＴＴＴＴＡＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＧＴＡＴＣＧＡＴＧ−３’（配列番号１３）；（Ｆ）５’−ＧＡＣＧＣＴＧＣＴＴＴＧＧＡＡＣＴＣＣＧＡＣＣＡＧＧＧ−３’（配列番号１４）および（Ｒ）５’−ＣＧＧＡＧＴＴＣＣＡＡＡＧＣＡＧＣＧＴＣＧＴＧＡＣＧＡＡＴＡＧＣＴＣ−３’（配列番号１５）；（Ｆ）５’−ＧＡＣＧＡＡＧＣＴＴＴＴＣＡＡＣＴＣＣＧＡＣＣＡＧＧＧＡＴＡＴＧ−３’（配列番号１６）および（Ｒ）５’−ＣＧＧＡＧＴＴＧＡＡＡＡＧＣＴＴＣＧＴＣＧＴＧＡＣＧＡＡＴＡＧＣ−３’（配列番号１７）；（Ｆ）５’−ＧＡＣＧＡＡＧＣＴＴＴＡＣＡＡＣＴＣＣＧＡＣＣＡＧＧＧＡＡＴＧ−３’（配列番号１８）および（Ｒ）５’−ＣＧＧＡＧＴＴＧＴＡＡＡＧＣＴＴＣＧＴＣＧＴＧＡＣＧＡＡＴＡＧＣ−３’（配列番号１９）；（Ｆ）５’−ＡＴＣＴＴＣＴＧＧＣＣＧＧＧＧＡＡＧＧＡＣＡＡＧ−３’（配列番号２０）および（Ｒ）５’−ＴＣＣＴＴＣＣＣＣＧＧＣＣＡＧＡＡＧＡＴＧＡＧＧＴＡＴＡＧＧＴＣＡＡＣ−３’（配列番号２１）；（Ｆ）５’−ＡＴＣＣＡＣＧＴＧＣＣＧＧＧＧＡＡＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＡＴＴＧ−３’（配列番号２２）および（Ｒ）５’−ＴＣＣＴＴＣＣＣＣＧＧＣＡＣＧＴＧＧＡＴＧＡＧＧＴＡＴＡＧＧＴＣ−３’（配列番号２３）；（Ｆ）５’−ＴＣＡＣＧＡＣＧＡＧＧＣＴＴＴＧＧＡＡＣＴＣＣＧＡＣ−３’（配列番号２４）および（Ｒ）５’−ＧＴＴＣＣＡＡＡＧＣＣＴＣＧＴＣＧＴＧＡＣＧＡＡＴＡＧ−３’（配列番号２５）；（Ｆ）５’−ＣＣＴＣＡＴＣＣＡＣＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＡＧＧＡＣＡＡＧ−３’（配列番号２６）および（Ｒ）５’−ＴＣＣＣＣＧＧＧＡＡＧＴＧＧＡＴＧＡＧＧＴＡＴＡＧ−３’（配列番号２７）。下線を付したコドンは、変異させた部位を示す。ｐＧＥＸ４Ｔ−１からの野生型ＴｂＰＧＦＳ ＯＲＦを、ｐＵＣ１８中にサブクローニングした。得られたＷｔ−ｐＵＣ１８プラスミドを、ＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして使用した。第１のＰＣＲ反応は、ＰｙｒｏＢｅｓｔポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ，Ｊａｐａｎ）で増幅させた。この第１のＰＣＲ反応は、各変異体についての遺伝子特異的センスＦプライマーおよびアンチセンスＭ１３Ｒプライマー、ならびに、センスＭ１３Ｆプライマーおよび各変異体についての遺伝子特異的アンチセンスＲプライマーの両方を用いて実施した。各変異体の第１のＰＣＲ反応から得られた生成物を混合し、そして第２のＰＣＲ反応のためのテンプレートとして使用した。この第２のＰＣＲ反応は、各変異体についての遺伝子特異的センスＦプライマーおよびアンチセンスＭ１３Ｒプライマー、ならびに、各変異体についての遺伝子特異的アンチセンスＲプライマーおよびセンスＭ１３Ｆプライマーを用いた。各変異体の第２のＰＣＲ反応からの生成物をｐＵＣ１８中にクローニングし、そして配列決定した。引き続いて、ミスマッチコドンを含んだオープンリーディングフレームをｐＧＥＸ４Ｔ−１中にクローニングし、そしてその配列を調べた。
【０４２３】
（変異体ＴｂＰＧＦＳの発現および精製）
５’末端にそれぞれＥｃｏＲＩ制限部位およびＳａｌＩ制限部位を有する、野生型ＴｂＰＧＦＳ ｃＤＮＡおよび変異体ＴｂＰＧＦＳ ｃＤＮＡのコード領域を、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１発現ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）の対応する部位にクローン化した。得られた発現ベクターを、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換のために用いた。形質転換された細胞を、０．５ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の存在下において、３０℃で８〜１０時間培養した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換体を、遠心分離によって収集し、膵臓抽出物、プロナーゼ、サーモリシン、キモトリプシン、トリプシンおよびパパイン（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ^ＴＭ，Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の可逆的インヒビターおよび不可逆的インヒビター（２５ｍｌ中に１錠）を含むカクテルを含有するＰＢＳを用いて洗浄し、同じ緩衝液中に懸濁し、そして音波破砕によって破壊した。遠心分離によって細片を除去した後、上清中の組換えタンパク質を、製造業者のプロトコールに従って、ＧＳＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ樹脂（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）上にてアフィニティークロマトグラフィーを行うことによって精製した。ＧＳＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂゲルに結合した野生型ＴｂＰＧＦＳおよび変異体ＴｂＰＧＦＳを、トロンビンを用いてグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼから切断し、そしてＰＢＳを用いて溶出した。得られた組換えタンパク質を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｃｌ（ｐＨ８．０）緩衝液に対して透析し、そして同一緩衝液で平衡化したＤＥＡＥアニオン交換カラムに適用した。タンパク質を、同一緩衝液中における０〜５００ｍＭ ＮａＣｌの増加直線勾配で溶出した。
【０４２４】
タンパク質濃度を、ビシンキノン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｉｎｏｎｉｃ ａｃｉｄ）試薬（ＰＩＥＲＣＥ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌ）を使用して決定した。この決定において、製造業者のプロトコールに従ってＢＳＡを標準として用いた。タンパク質の純度を、１４％（ｗ／ｖ）ゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。このゲルを、Ｓｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）またはＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ（Ｄａｉｉｃｈｉ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で染色した。
【０４２５】
（酵素アッセイ）
ＰＧＨ_２レダクターゼ活性を、適切な酵素アリコート、５μＭ［１−^１４Ｃ］ＰＧＨ_２（最終濃度）、１００μｌの１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）および１００μＭ ＮＡＤＰＨ生成系（Ｋｕｂａｔａ，Ｂ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９２，１３２７−１３３７．）を含む反応混合物と共に、２分間３７℃でインキュベートすることによって測定した。反応を停止した後、このアリコートを、以前に記載されたように（Ｋｕｂａｔａら，２０００、前出）、薄層クロマトグラフィーに供した。
【０４２６】
（ＵＶ ＣＤ分光法）
野生型酵素および変異体酵素のＣＤスペクトルを、Ｊ−６００分光偏光計（Ｊａｓｃｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏ．Ｌｔｄ Ｔｏｋｙｏ）で記録した。このＪ−６００分光偏光計は、１ｍｍパス長のキュベットを備えた。セルホルダー内の温度を、循環水サーモスタットによって１０℃に維持した。野生型ＴｂＰＧＦＳおよび変異体ＴｂＰＧＦＳのスペクトルを、Ｔｒｉｓ／Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中において記録した。記録されたスペクトルは、５０ｎｍ／分での１０スキャンの平均である。
【０４２７】
（野生型酵素および変異体酵素の動態分析）
ｐＨの影響を、各５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ピロリン酸ナトリウムおよびＡＭＰＳＯを含有するトリプル緩衝液系を使用して、ｐＨ５．０〜ｐＨ９．０まで研究した。ＰＧＨ_２還元についてのκ_ｃａｔおよびＫ_ｍの値の測定を、１００μＭ ＮＡＤＰＨにて、種々の基質濃度で行った。
【０４２８】
（蛍光消光アッセイ）
野生型ＴｂＰＧＦＳおよび変異体ＴｂＰＧＦＳに対するＮＡＤＰＨの結合を評価するために、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を含む２００μｌの反応混合物中において、種々の濃度のＮＡＤＰＨ（２０μｌ）を、ＴｂＰＧＦＳと混合して、１．５μＭの最終酵素濃度を得た。３７℃での２分間のインキュベーション後に、ＦＰ−７５０分光蛍光計（Ｊａｓｃｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ）を励起波長２８２ｎｍおよび発光波長３３８ｎｍで使用することにより、固有トリプトファン蛍光を測定した。各リガンドとの非特異的な相互作用によって引き起こされるトリプトファン蛍光の消光を、１．５μＭ Ｎ−アセチル−Ｌ−トリプトファンアミドを用いて補正した。ＴｂＰＧＦＳに対するＮＡＤＰＨの結合についての解離定数（Ｋ_ｄ）値およびモル比（ｎ）を、Ｌｅｖｉｎｅ，Ｒ．Ｌ．（１９７７）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２３，２２９２−２３０１に記載されるようにして算出した。
【０４２９】
（結果および考察）
（全体的な構造の説明）
本発明者らは、ＴｂＰＧＦＳ−ＮＡＤＰＨ二成分複合体の結晶構造を得た。この複合体化酵素の結晶構造を、分子置換法によって決定し、そして２．６Åの分解能において、Ｒ＝０．１９４およびＲ_ｆｒｅｅ＝０．２２７まで精密化した。この複合体構造に関する精密化の他の統計学的特性および結晶学的特性を表１に示す。ラマチャンドランプロット（データは示さず）によって、８７．７％の残基が大半の有利な領域内に位置付けられるのに対して、残りの残基はさらなる認められた領域内に見出されることが示された。これにより、この複合体モデルが立体化学的に高度に良質であることが実証された。
【０４３０】
【表１】

【０４３１】
組換えＴｂＰＧＦＳは、２７６アミノ酸残基の一本鎖ポリペプチド（図１Ａ）からなり、３３ｋＤａの分子量を有する（Ｋｕｂａｔａら，２０００、前出）。ＴｂＰＧＦＳの全体的な構造（図１ＡおよびＢ）は、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸レダクターゼＡ（２，５ＤＫＧ）（Ｋｈｕｒａｎａ，Ｓ．，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５，６７６８−６７７３）、ヒトアルドースレダクターゼホロ酵素（ｈｕｍ ＡＤＲ）（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｄ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７，８１−８４）、ラット肝臓３α−ヒドロキシステロイド／ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ（ｒａｔ ３αＨＳＤ）（Ｈｏｏｇ，Ｓ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，２５１７−２５２１）などのようなＡＫＲメンバーについて記載されていた構造位相と本質的に類似した構造位相を示した。ＴｂＰＧＦＳはα／βバレルへと折り畳まれ、このバレルはトリオースホスフェートイソメラーゼにおいて最初に記載されていたもの（Ｂａｎｎｅｒ，Ｄ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，２５５，６０９−６１４）と類似した。ＴｂＰＧＦＳのα／βバレルは、βシートに対して逆方向に走る８個のαヘリックスによって囲まれた８個の平行なβ鎖の円筒形コアから構成される（図１Ｂ）。この（α／β）_８構造は、この分子のＣ末端側にある２個の過剰なαヘリックス（Ｈ１およびＨ２）に割り込まれる。ヘリックスＨ１は、β７とα７との間に位置し、一方でヘリックスＨ２は、α８の後ろに見出される（図１ＡおよびＢ）。このバレルの底面は、半径の小さなターンによって連結された逆平行に走る２個のさらなるβ鎖（Ｂ１およびＢ２；それぞれ、残基７〜９位および１４〜１６位に対応する（図１ＡおよびＢ））から構成されるβヘアピン様構造によって塞がれる。これらの過剰な構造Ｈ１、Ｈ２、Ｂ１およびＢ２はまた、ＡＫＲスーパーファミリーの他のメンバーにおいても見出された（Ｆａｒｂｅｒ Ｇ．Ｋ．＆Ｐｅｔｓｋｏ Ｇ．Ａ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１５：２２８−２３４（１９９０）；Ｂｏｒｈａｎｉ，Ｄ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２４８４１−２４８４７；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｄ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７，８１−８４）。Ｃ末端の１９アミノ酸残基は、中心のβバレルのＣ末端面の縁周辺にリップ様構造を構築することによって、基質結合ポケットの部分の概略を作り出す（図２ＡおよびＢ）。ＴｂＰＧＦＳといくつかの他のＡＫＲとの間での主要な構造的差異の１つは、このＴｂＰＧＦＳ酵素の構造にはショートループが存在する点である。ＴｂＰＧＦＳは、２，５ＤＫＧと共にＡＫＲスーパーファミリーの第５ファミリーに属する。このファミリーの中で、最初に３Ｄ構造が解析されたメンバーは、２，５ＤＫＧであり（Ｊｅｚ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ Ｐｅｎｎｉｎｇ，Ｔ．Ｍ．（２００１）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔ．，１３０−１３２，４９９−５２５）、ＴｂＰＧＦＳは、３Ｄ構造が解析された２番目のメンバーとなる。ＴｂＰＧＦＳモデルとｒａｔ ３α−ＨＳＤとを、対応するＣ_α原子からの１．５Åの平方自乗平均（ｒ．ｍ．ｓ．）偏差で重ね合わせると（図２ＡおよびＢ）、ｈｕｍ ＡＤＲ、ｐｏｒ ＡＤＲおよびｒａｔ ３α−ＨＳＤのようなＡＫＲの第１ファミリーの酵素において観察されるような顕著に長いループの存在とは著しく対照的な、ＴｂＰＧＦＳにおけるループＡ、Ｂおよびβ１−α１の欠失が明らかとなった（図１Ａおよび２）。ＴｂＰＧＦＳのショートループＡ、Ｂおよびβ１−α１は、それぞれ、β４−α４の間、β７−Ｈ１の間およびβ１−α１の間に見出され、そして２，５ＤＫＧについて記載されていたものと類似した（Ｋｈｕｒａｎａら，１９９８、前出）。このことは、このショートループの存在が、第５ファミリーのメンバーに共通した特徴である可能性が高いことを示唆する。
【０４３２】
（ＮＡＤＰＨ結合部位）
アルド／ケトレダクターゼは、ＮＡＤＰＨを結合するためのロスマンフォールドを有さない。従って、ピリジンヌクレオチドは、バレルの外縁から、バレルの中心コアの深部に位置付けられたニコチンアミド環を有する内部コアまで伸長する間隙内の伸長コンフォメーションにおいて結合される。一方、アデニンおよびピロホスフェート基は、一対のβ鎖とαヘリックスとの間で、βバレルの外側の凹部表面に押し込まれる（図２）。タンパク質分子全体におけるＮＡＤＰＨの電子密度（図３Ａ）および残基は、２．６Åの分解能で精密化された構造について予期されたように十分に解析された。酵素−ＮＡＤＰＨ複合体は、２，５ＤＫＧにおける場合（Ｋｈｕｒａｎａら，１９９８、前出）と同様に、１６個の水素および２つのイオン結合によって安定化される（図３Ｂ）。ＴｂＰＧＦＳとＮＡＤＰＨとの間における顕著に少ない数の相互作用は、このトリパノソーマの酵素と、ｈｕｍ ＡＤＲおよび３α−ＨＳＤのような第１ファミリーのアルド／ケトレダクターゼとで対照的である。なぜなら、ｈｕｍ ＡＤＲおよび３α−ＨＳＤのような第１ファミリーのアルド／ケトレダクターゼは、補因子と、１９個の水素結合、３つの塩橋、および底部における１つの芳香環スタッキングを形成するからである（Ｗｉｌｓｏｎら，１９９２、前出）。結果的に、ＴｂＰＧＦＳは、ｒａｔ ３α−ＨＳＤについてのＫ_ｄ＝１９５ｎＭと比較して非常に高いＫ_ｄ値（１３４μＭ）を、ＮＡＤＰＨに対して示した。このことは、補因子に対するより緩い結合を示す。これはまた、ｈｕｍ ＡＤＲ（Ｂｏｈｒｅｎら，１９９２、前出）のＫ_ｍ＝２μＭ（ＮＡＤＰＨに対して）に対して、ＴｂＰＧＦＳのＫ_ｍ値がより高かったこと（ＮＡＤＰＨに対して５．７μＭ）（Ｋｕｂａｔａら，２０００、前出）をも説明し得る。さらに、これまでに報告されているＡＫＲスーパーファミリーの他のメンバーとは異なり、ＴｂＰＧＦＳは、Ｔｒｐ１８７残基の後ろにあるループＢの領域中に欠失を示す。この欠失は、この領域内のタンパク質の長さを短くし、そしてＴｒｐ１８７残基を引き戻す。この結果として、Ｔｒｐ１８７は、ニコチンアミド環のＣ３−Ｃ４結合とＴｒｐ１８７インドール環のＣＧ−ＣＤ２結合との間で２２°の二面角を形成し、かつニコチンアミド環のアミド基とインドール環のＣＧ−ＣＤ１結合との間で７°の二面角を形成することによって、ニコチンアミド環に対して平行なコンフォメーションをとる（図３Ｃ）。ニコチンアミド環のＣ３、Ｃ４およびＣ７原子は、それぞれＴｒｐ１８７のＣＧ、ＣＤ２およびＣＤ１原子から、わずか３．６Å、３．３Åおよび３．７Åの距離であるので、ニコチンアミド環のＣ４から水素化物を取り除くことにより、低い活性化エネルギーで、ニコチンアミド環とＴｒｐ１８７との間でπ−π相互作用が形成される。従って、ＴｂＰＧＦＳが有するこの固有の構造的特徴は、ニコチンアミド環が、このスーパーファミリーの他の酵素において見出されるように底部からではなく、Ｔｒｐ１８７の側方にスタッキングされること（図３Ｃ）を実証する。さらに、本発明者らは、補因子のピロホスフェート基が、バレル表面上の間隙に結合することを見出した。この間隙は、一方の側面では、すべてループＢに結合している残基１８８、１９０、１９２が内表面となり、他方の側面では、ループ８に保持されるＬｙｓ２３０残基のみが内表面となる。ピロホスフェート基は、Ｓｅｒ１８８、Ｌｅｕ１９０、Ｇｌｎ１９２および１分子の水との特異的な水素結合性相互作用のみによって適所に保持された（図３ＡおよびＢ）。第１ファミリーのＡＫＲでは、その結晶構造は、補因子のピロホスフェート基上で折り畳まれ、そしてピロホスフェート部分が通過する「セイフティーベルト」として公知の短いトンネルを形成する、β７／ループＢのポリペプチド領域の伸長によって特徴付けられる。例えば、ｈｕｍ ＡＤＲ（Ｗｉｌｓｏｎら，１９９２、前出）では、この「セイフティーベルト」は、Ａｓｐ２１６とＬｙｓ２１とＬｙｓ２６２との間での塩橋によって安定化される。しかし、ＴｂＰＧＦＳの結晶構造では、残基２１６はループＢから欠失しており、そしてＬｙｓ２４（ｈｕｍ ＡＤＲにおけるＬｙｓ２１と類似する）は、ピロホスフェート基から約６．３Å離れて位置付けられる。従って、ＴｂＰＧＦＳは「セイフティーベルト」を有さない（図２Ａおよび３Ｃ）。第１ファミリーのＡＫＲにおけるセイフティーベルト構造はＮＡＤＰＨ補因子を覆うということ、そして、ループＢ領域における顕著なコンフォメーション変化が、ｈｕｍ ＡＤＲ（Ｗｉｌｓｏｎら，１９９２、前出）における補因子の結合および放出に必須であるように考えられていることから、本発明者らは、ＴｂＰＧＦＳに対する補因子の結合には、このような構造的転位が関与しないことを予期した。さらに、ＴｂＰＧＦＳ−ＮＡＤＰＨ複合体の形成および解離に必要とされるループＢの大きな移動もまた、アルドースレダクターゼにおけるＮＡＤＰＨの結合および放出の二相性動態を担うことが考えられていた（Ｇｒｉｍｓｈａｗ，Ｃ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９，９９４７−９９５５；Ｋｕｂｉｓｅｓｋｉ Ｔ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：６５１０−６５１７（１９９２））。しかし、本明細書中で開示された構造に基づき、本発明者らは、ＴｂＰＧＦＳに対する補因子の結合の動態が、二相性の特徴を示さないことを予期した。
【０４３３】
（活性部位および推定基質結合ポケット）
ＴｂＰＧＦＳの活性部位は、他のすべてのα／βバレル酵素において観察されているように、βバレルのＣ末端に位置付けられる（図４）（Ｆａｒｂｅｒら，１９９０、前出；Ｂｒａｎｄｅｎ Ｃ．Ｉ．，ＱＵＡＲＴＥＲＬＹ ＲＥＶＩＥＷＳ ＯＦ ＢＩＯＰＨＹＳＩＣＳ：１３：３１７−３３８（１９８０））。４−プロ−Ｒ水素が常にポケットの開口部を向く（図４、右側パネル）ようにニコチンアミド環が方向付けられる活性部位ポケットの切片から、活性部位ポケットは、ニコチンアミド環のＣ４位から約３．２Å×４．７Å×７．０Å（長さ×幅×深さ）の寸法を有することが明らかとなった。２，５ＤＫＧの活性部位ポケット［５Å×６Å×９Å］（Ｋｈｕｒａｎａら，１９９８、前出）またはｈｕｍ ＡＤＲの活性部位ポケット［７Å×１３Å×９Å］（Ｗｉｌｓｏｎら，１９９２、前出）と比較すると、ＴｂＰＧＦＳ活性部位の寸法は有意に小さい。Ｍｅｔ２２、Ａｓｐ４７、Ａｌａ４９、Ｌｙｓ７７、Ｓｅｒ１３９、Ａｓｎ１４０、およびＧｌｎ１６１の残基は、この活性部位ポケットの底部に見出される。一方、この活性部位ポケットの上側は、芳香族性および無極性の残基Ｔｒｙｐ２３、Ｉｌｅ５１、Ｔｙｒ５２、Ｔｒｐ７９、Ｈｉｓ１１０、Ｔｒｐ１１１およびＴｒｐ１８７から構成される。２，５−ＤＫＧ、ｈｕｍ ＡＤＲ、ｐｏｒ ＡＤＲおよびｒａｔ ３α−ＨＳＤの構造とＴｂＰＧＦＳの構造との比較によって、トリパノソーマ酵素（Ｊｅｚ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３２６，６２５−６３６）の活性部位において高度に保存された残基Ａｓｐ４７、Ａｌａ４９、Ｔｙｒ５２、Ｌｙｓ７７、Ｈｉｓ１１０およびＴｒｐ７９が明らかとなった。しかし、ＡＫＲにおいて基質の特異性を決定することが知られている５１位および１１１位のアミノ酸は異なっていた。ＴｂＰＧＦＳ結晶構造は、多くの点で、２，５ＤＫＧの結晶構造と類似した。しかし、この２つの酵素の間での大きな差異が、ＴｂＰＧＦＳ中には水分子が存在しないという点に見出された。２，５ＤＫＧの活性部位ポケットは、よく順序付けられた２個の水分子を含む。この水分子は、この活性部位ポケットの基質のカルボニル基およびヒドロキシル基の方向付けにおいて重要な役割を果たす（Ｄｅ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｈ．Ｌ．ａｎｄ Ｖｏｎ Ｉｔｚｓｔｅｉｎ，Ｍ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４，８２９９−８３０８）。しかしＴｂＰＧＦＳでは、おそらくこのポケットの高度な疎水性に起因して、これらの水分子が存在しない。ＴｂＰＧＦＳポケットは、これらの水分子の代わりに、スルフェートアニオンを含んだ。ＴｂＰＧＦＳモデルと、ｈｕｍ ＡＤＲ（Ｗｉｌｓｏｎら，１９９２、前出）、ｐｏｒｃ ＡＤＲ（Ｒｏｎｄｅａｕ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ，３５５，４６９−４７２）およびｒａｔ ３α−ＨＳＤ（Ｈｏｏｇ，Ｓ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，２５１７−２５２１）の構造の三成分複合体とを、ＮＡＤＰＨ分子のＣ４原子を対応させて、それぞれ０．２０Å、０．７Å、０．２０Åおよび０．２４Åのｒｍｓ偏差で重ね合わせると、これらの酵素における基質結合は、スルフェートアニオン結合部位に対応することが明らかとなった（図４）。この結果から、このスルフェートアニオン結合部位が、９，１１−エンドペルオキシドＰＧＨ_２結合部位である可能性が高い部位として同定された。しかし興味深いことに、他の酵素の基質はいずれも、このＴｂＰＧＦＳ基質結合ポケットモデルに合致し得なかった。これは、このポケットに固有の構造的配置および形状に起因する（図４、右側パネル）。これらの知見は、ＴｂＰＧＦＳが他の基質の還元を触媒しなかったので、ＴｂＰＧＦＳはＰＧＨ_２に高度に特異的であるとした本発明者らの以前の観察（Ｋｕｂａｔａら，２０００、前出）とよく一致し、そしてＴｂＰＧＦＳ酵素についての基質特異性の構造的基礎を提供する。これらの知見に基づき、本発明者らは、ＴｂＰＧＦＳに対するＰＧＨ_２の結合についてのモデルを提供する（図５）。このモデルでは、ＰＧＨ_２は、補因子のニコチンアミド環の上部の浅い楕円形間隙を横切って、伸長コンフォメーションにおいて結合する。ＰＧＨ_２のα鎖およびω鎖は、各々反対方向に伸長してこの間隙のリップをまたぎ、一方で、９，１１−エンドペルオキシド結合を有するシクロペンタン環は、ニコチンアミド環のＣ４の近傍に近いキャビティ内の深部に方向付けられる。
【０４３４】
（変異誘発分析および動態学的分析）
ＡＫＲに関するいくつかの結晶学的研究、変異誘発研究および動態学的研究によって、これらの酵素の活性部位ポケットにおけるＮＡＤＰＨのニコチンアミド環近傍において高度に保存された多数のアミノ酸残基が同定され、そしてこれらのアミノ酸残基が種々の基質の触媒に関与することが証明されていた（Ｒｏｎｄｅａｕら，１９９２、前出；Ｗｉｌｓｏｎら，１９９２、前出；Ｈｏｏｇら，１９９４、前出；Ｅｌ−Ｋａｂｂａｎｉ，Ｏ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２，６８７−６９２；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｄ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４，１４３２３−１４３３０；Ｊｅｚら，１９９７、前出；Ｓｃｈｌｅｇｅｌら，１９９８ａ）。ＴｂＰＧＦＳの構造分析によって、Ａｓｐ４７、Ｔｙｒ５２、Ｌｙｓ７７、およびＨｉｓ１１０が、ＴｂＰＧＦＳ酵素におけるこれらの残基の対応物であることが明らかとなった。ＴｂＰＧＦＳにおいてこれらのアミノ酸の位置が保存されていることは、すべてのＡＫＲに共通することが公知の触媒機構を使用して、このトリパノソーマ酵素が十分に作用し得ることを示唆する。このすべてのＡＫＲに共通することが公知の触媒機構では、Ｔｙｒが触媒中心であって、プロトンを供与／受容することにより一般酸／塩基触媒として作用し（Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，Ｂ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７，３５３８−３５４８）、Ｈｉｓは、還元の間のプロトン供与を容易にする（Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，Ｂ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７，１１００３−１１０１１）か、または活性部位において基質カルボニルを方向付け（Ｂｏｈｒｅｎ，Ｋ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３，２０２１−２０３２；Ｄｅ ＷｉｎｔｅｒおよびＩｔｚｓｔｅｉｎ，１９９５、前出）、Ｌｙｓは、ＴｙｒのｐＫ_ａ値を低下させる水素結合を作製することによって、酸化の間のＴｙｒによるプロトン除去を容易にし、そしてＡｓｐは、Ｌｙｓを安定化する塩橋を形成することが公知である（Ｈｏｏｇら，１９９４、前出；Ｐａｗｌｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｅ．ａｎｄ Ｐｅｎｎｉｎｇ，Ｔ．Ｍ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１３５０２−１３５１０；Ｗｉｌｓｏｎら，１９９５、前出）。この仮説を確証するため、そして９，１１−エンドペルオキシドＰＧＨ_２の還元に関する分子学的基礎を解明するために、本発明者らは、この活性部位ポケットにおける５つの変異体（すなわち、Ｄ４７Ｎ、Ｙ５２Ｆ、Ｋ７７Ｌ、Ｋ７７Ｒ、およびＨ１１０Ｆ）を作製した。また、本発明者らは、ＴｂＰＧＦＳ酵素の基質結合に関する洞察を得るために、基質を結合することが提案された残基における他の６つの変異体（すなわち、Ａ４９Ｓ、Ｉ５１Ａ、Ｗ７９Ｆ、Ｗ７９Ｙ、Ｗ１１１Ｖ、Ｗ１１１Ｆ）を作製した。次いで、本発明者らは、ＰＧＨ_２の還元に対する各変異体の影響を評価した。野生型ＴｂＰＧＦＳ酵素と比較して、変異体Ｋ７７ＬおよびＨ１１０Ｆは酵素活性をすべて失ったが（図６Ａ）、Ｄ４７ＮおよびＫ７７Ｒ変異体は、比活性のわずかな増加を生じた（ぞれぞれ、１６１％および１５８％）。対照的に、変異体Ｙ５２ＦはＰＧＨ_２の還元を変更しなかった。このことは、Ｔｙｒ５２のＯＨ基が触媒に必須ではないことを示す。さらに、疎水性ポケットに変異を導入した６つの変異体の中では、Ａ４９ＳおよびＩ５１Ａ変異体は影響を示さず（データは示さず）、Ｗ７９ＦおよびＷ１１１Ｖは、それぞれ野生型の０．１％未満および０．２５％未満のみの活性を保持し、そしてＷ７９ＹおよびＷ１１１Ｆは、それぞれ７５％および７８％の活性を保持した（図６Ａ）。
【０４３５】
本発明者らはさらに、触媒効率（κ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ）を決定することによって、ＰＧＨ_２の還元に対する変異の影響を研究した。これらの変異体の動態分析（表２）によって、Ｙ５２Ｆ変異体のκ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ値は、野生型酵素のκ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ値と類似することが明らかとなった。このことは、これらの変異によって、κ_ｃａｔもＫ_ｍも影響を受けないことを示す。対照的に、Ｄ４７Ｎ、Ｋ７７Ｒ、Ｗ７９ＹおよびＷ１１１Ｆ変異体は、主にＫ_ｍ値の増加（それぞれ、１０倍、２０倍、１２倍および１８倍）に起因して、κ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ値を有意に減少させた。従って、これらの結果は、これらのアミノ酸残基での変異が、触媒ではなく主にＰＧＨ_２結合に影響を及ぼしたことを示す。
【０４３６】
【表２】

【０４３７】
ＴｂＰＧＦＳの活性部位は、４個の残基（Ａｓｐ４７、Ｔｙｒ５２、Ｌｙｓ７７およびＨｉｓ１１０）を含む。これらの各アミノ酸は、触媒の間にプロトンを供与または受容することによって、一般酸／塩基触媒として作用し得る。Ａｓｐ４７およびＴｙｒ５２は触媒に影響を有さなかったので、これらのアミノ酸は、ＮＡＤＰＨからＰＧＨ_２への水素化物移動を容易にするための一般酸触媒としては機能し得ない。他方で、Ｋ７７ＬおよびＨ１１０Ｆが、検出不可能なκ_ｃａｔでＰＧＨ_２の還元を完全に無効にしたという知見は、触媒の間に一般酸／塩基触媒として作用し得る２つの可能な候補（Ｌｙｓ７７およびＨｉｓ１１０）の存在を示唆する。しかし、この２つのアミノ酸の中で、Ｈｉｓ１１０は、プロトン供与体である可能性が最も高いと考えられる。なぜなら、野生型ＴｂＰＧＦＳによるＰＧＨ_２の還元に対するｐＨの影響の研究から、最大活性のためにプロトン化されなければならない約６．８のｐＫ_ａを有するイオン化可能基が明らかにされたからである。このｐＫ_ａ値は、Ｈｉｓのイミダゾリウムイオンのプロトン化アミノ基の解離に必要とされる６．０〜７．０のｐＫ_ａ範囲内であり、そしてＬｙｓのプロトン化ε−アミノ基の解離に必要とされる７．６〜１０．６のｐＫ_ａ範囲外である。さらに、ＮＡＤＰＨのニコチンアミド環のＣ４に対してＨｉｓ１１０がより近傍にあること（すなわち、ニコチンアミドのＣ４およびスルフェートアニオン（推定基質結合部位）の酸素原子からＬｙｓ７７のε−アミノ基のＮ原子までが、それぞれ、５．９Åおよび６．６Åであるのと比較して、Ｈｉｓ１１０のイミダゾリウムイオンのＮ原子は、ニコチンアミドのＣ４およびスルフェートアニオンの酸素原子から、それぞれ、４．８Åおよび２．９Åに位置付けられること）は、プロトン供与体としてのＨｉｓ１１０の役割を支持する。従って、本発明者らの知見は、ＴｂＰＧＦＳのＨｉｓ１１０を変異させることによって、ＮＡＤＰＨからＰＧＨ_２への水素化物移動を容易にする一般酸触媒として機能するイオン化可能基が排除されることを示し、このＨｉｓ１１０アミノ酸残基をプロトン供与体として同定する。さらに、Ｗ７９ＦおよびＷ１１１Ｖ変異体による完全な活性損失は、これらの残基が、基質結合に干渉し得ることを示唆する。この考えは、Ｗ７９ＹおよびＷ１１１Ｆの置換が、κ_ｃａｔではなく主にＫ_ｍ値を変更したという事実によって支持される。
【０４３８】
しかし、本研究全体を通して観察された活性損失は、触媒または基質結合に対する特定変異の特異的な影響ではなくコンフォメーション変化に起因し得ることが考えられたので、本発明者らは、これらの変異体の全体的な三次元構造、特に、そのＮＡＤＰＨ結合部位および基質結合部位の全体的な三次元構造がインタクトであることを確認した。野生型酵素および変異体酵素のＣＤスペクトルは、変異体タンパク質の三次元構造のいかなる有意な変化をも示唆せず（データは示さず）、そしてこれらの変異体のＮＡＤＰＨ結合定数（Ｋ_ｄ）値は、野生型酵素について決定された値（Ｋ_ｄ＝１３４μＭ）の範囲内であることが見出された。このことは、これらの酵素とＮＡＤＰＨとの相互作用が影響を受けなかったことを示す。
【０４３９】
さらに、ＰＧＨ_２は、シクロペンタン環のＣ９における１つの酸素原子およびＣ１１における別の酸素原子によって化学的に特徴付けられる。次いで、これらの２つの酸素原子は共有結合して、エンドペルオキシドを作製する。プロトン受容体として機能する酸素原子を同定するために、本発明者らは、ＴｂＰＧＦＳによるこれらの基質の還元に対するＰＧＨ_２アナログＵ−４４０６９およびＵ−４６６１９の効果を試験した。Ｕ−４４０６９およびＵ−４６６１９は、ＰＧＨ_２レセプターのアゴニストであることが知られる。これらの構造は、以下のとおりである。
【０４４０】
【化１７】Ｕ−４６６１９

【０４４１】
および
【０４４２】
【化１８】Ｕ−４４０６９

【０４４３】
化学的に、これらの構造は、Ｕ−４４０６９ではＣ１１の酸素原子およびＵ−４６６１９ではＣ９の酸素原子が、ＣＨ_２基で置換されていることを除いて、ＰＧＨ_２と類似している。種々の濃度のＵ−４４０６９との野生型ＴｂＰＧＦＳのプレインキュベーションは、ＰＧＨ_２の還元に対して影響を有さなかった（図６Ｂ）。対照的に、Ｕ−４６６１９での処理は、用量依存的な様式で、ＴｂＰＧＦＳによるＰＧＨ_２の還元を部分的に不活化した（図６Ｂ）。これらの結果は、ＰＧＨ_２において、Ｃ−１１の酸素原子がこの基質の還元を触媒するために利用可能でなければならないことを強く示唆する。
【０４４４】
（ＰＧＨ_２還元の機構）
ＴｂＰＧＦＳによるＰＧＨ_２還元の触媒機構は、ＡＫＲのメンバーによる他の基質の触媒機構（Ｗｉｌｓｏｎら，１９９２、前出；Ｔａｒｌｅ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２５６８７−２５６９３；Ｊｅｚら，１９９７、前出；Ｋｈｕｒａｎａら，１９９８、前出）とは全く異なるように思われた。図７に示したように、ＰＧＨ_２の還元は２段階プロセスから構成される。第１段階は、Ｈｉｓ１１０とＰＧＨ_２のＣ１１位の酸素との間での水素結合、プロトンを供与するＨｉｓ１１０からのＣ１１位の基質酸素のプロトン化、およびこの酸素とプロトンとの間でのエンドペルオキシドの２つの電子の移動を含む。第２段階では、エンドペルオキシド結合が開くことによって、ＰＧＨ_２のＣ９位の酸素を活性化し、ＮＡＤＰＨから１つのプロトンおよび２つの電子を受け取る。これによりＮＡＤＰＨの酸化およびＰＧＦ_２αの形成が生じる。この反応全体は、最適にはｐＨ７で起こる。ＰＧＨ_２還元に関するこの触媒機構は、本研究データによりプロトン受容体としてＰＧＨ_２シクロペンタンのＣ１１の酸素が同定されたという事実、化学量論的分析によって、１モルのＴｂＰＧＦＳには１モルのＮＡＤＰＨが必要とされることが明らかになったという事実、および基質を還元するために、ＮＡＤＰＨが１つのプロトンおよび２つの電子を移動させるという事実に基づいて提案される。本発明者らの実験条件下では、ＮＡＤＰＨ単独ではＰＧＨ_２を還元しなかった。このことは、他のいくつかのＡＫＲ基質とは異なり（Ｔａｒｌｅら，１９９３、前出；Ｋｈｕｒａｎａら，１９９８、前出）、補因子から基質への水素化物イオン（Ｈ⁻）の移動が、第２段階においてであることを示唆する。さらに、他のＡＫＲメンバーによる基質還元の触媒機構では、プロトン供与体残基Ｔｙｒと残基Ｈｉｓとの間での相互作用が、プロトンの除去を容易にするために必要とされることが公知である（Ｗｉｌｓｏｎら，１９９２、前出；Ｔａｒｌｅら，１９９３、前出；Ｊｅｚら，１９９７、前出；Ｋｈｕｒａｎａら，１９９８、前出；Ｓｃｈｌｅｇｅｌら，１９９８、前出（３５３８−３５４８）；Ｓｃｈｌｅｇｅｌら，１９９８、前出（１１００３−１１０１１））。しかし本発明者らの結果は、ＴｂＰＧＦＳでは、そのような相互作用がＰＧＨ_２の還元に必要とされず、ＰＧＨ_２はＨｉｓ１１０単独によってプロトン化されることを示している。
【０４４５】
かねてからＰＧＨ_２の還元が知られており、そしてＰＧＦ_２αが、ＰＧＨ_２の９，１１−エンドペルオキシドの還元的切断によって酵素学的に合成されることも公知であった（Ｈａｍｂｅｒｇ，Ｍ．ａｎｄ Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎ，Ｂ．（１９６７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４２，５３４４−５３５４）。しかし、これまで、酵素がＰＧＨ_２の９，１１−エンドペルオキシドの還元的切断に如何にして作用するかは解明されていなかった。本発明において、本発明者らは、ＴｂＰＧＦＳが、生理的基質の還元を触媒する触媒機構を同定した。本発明によってＰＧＨ_２レダクターゼの構造的情報が初めて明らかとなり、そしてまた、この酵素の触媒部位の同定に関する確証的な証拠が初めて明らかとなった。本発明は、ＡＫＲの保存された触媒四分子における部位特異的変異誘発により、一般酸触媒としてヒスチジンを初めて同定した。
【０４４６】
（実施例２：他のプロスタグランジンＦ_２αシンターゼのモデル）
次に、上述で得られた情報をもとに、配列番号２８〜３１に記載される、ヒト、ヒツジおよびウシ（肺および肝臓）の配列を基にして、ホモロジーモデリングによる方法を行い、他のプロスタグランジンＦ_２αシンターゼの構造をモデリングした。具体的には、ＡｕｔｏＤｏｃｋ ３．０（Ｍｏｒｒｉｓ，Ｇ．Ｍ．，Ｇｏｏｄｓｅｌｌ，Ｄ．Ｓ．，Ｈａｌｌｉｄａｙ，Ｒ．Ｓ．，Ｈｕｅｙ，Ｒ．，Ｈａｒｔ，Ｗ．Ｅ．，Ｂｅｌｅｗ，Ｒ．Ｋ．ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ，Ａ．Ｊ．（１９９８），Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９：１６３９−１６６２）というプログラムを使用した。
【０４４７】
このプログラムにおいて、配列番号２８〜３１に記載されるアミノ酸配列の相同性を考慮し（図１Ｃを参照）、他に類似する構造または本発明のＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａの構造のアミノ酸配列から変更しながらモデリングした。その際、エネルギーの最小化により構造を決定した。構造は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼに類似する。
【０４４８】
（実施例３：バーチャルスクリーニング）
市販の化合物のデータベース（ＦＣＤ（Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ）という商業ベースの化学薬品データベース）より１つずつ化合物を取り出し、コンピュータグラフィクス上で活性部位の位置へ自動で近づけた。エネルギーの最小化により、最適な方位で化合物を酵素に結合させた。このときの安定化エネルギーΔＧを計算し、最もΔＧのマイナス値が大きな化合物を選定した。
【０４４９】
次に、あるデータベース（ＰＧＨ_２の類似体を含む）を用いたところ、
【０４５０】
【化１９】Ｕ−４６６１９

【０４５１】
および
【０４５２】
【化２０】Ｕ−４４０６９

【０４５３】
がプロスタグランジンＦ_２αシンターゼのインヒビターとして好ましいことが明らかになった。このうち、化１９の方がインヒビターとしてより好ましいこともわかった。この結果は実施例１の結果と相応する。
【０４５４】
（実施例４：インビトロスクリーニング）
次に、実施例３のバーチャルスクリーニングでインヒビターとして適切なものと判断された化合物を実際にインビトロ系で実験することによってその活性を確認した。プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ酵素アッセイは以下のとおり行った。
【０４５５】
（プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ酵素アッセイ）
プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの酵素活性を、適切な酵素アリコート、５μＭ［１−^１４Ｃ］ＰＧＨ_２（最終濃度）、１００μｌの１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）および１００μＭ ＮＡＤＰＨ生成系（Ｋｕｂａｔａら，２０００）を含む反応混合物と共に、２分間３７℃でインキュベートすることによって測定した。このアリコートを、反応停止後に、以前に記載されたように（Ｋｕｂａｔａら，２０００、前出）、薄層クロマトグラフィーに供した。
【０４５６】
ＰＧＨ_２からのＰＧＦ_２αの合成について試験するために、最終容量１００μｌにおいて１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、２０μＭ ＮＡＤＰ^＋、１００μＭグルコース−６−ホスフェート、１Ｕのグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、および酵素の希釈物を含む標準反応混合物を使用した。１μｌの５００μＭ １−［^１４Ｃ］ＰＧＨ_２（２．０４Ｇｂｑ／ｍｍｏｌ）を添加することによって反応を開始し、そしてこの反応を、３７℃で２分間にわたって行い、２５０μｌの停止溶液（３０：４：１（ｖ／ｖ／ｖ）のジエチルエーテル／メタノール／２Ｍクエン酸）を添加することによって停止させた。ＰＧＦ_２αの非酵素形態形成について試験するために、酵素の非存在下において、すべての成分を含む反応混合物をインキュベートした。有機相（５０μｌ）を、４℃で２０×２０ｃｍシリカゲルプレート（Ｍｅｒｃｋ）に適用し、そしてこのプレートを、−２０℃で９０：２：１（ｖ／ｖ／ｖ）のジエチルエーテル／メタノール／酢酸の溶媒系で展開した。このプレートの放射能を、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＦＬＡ ２０００およびＭａｃ Ｂａｓ Ｖ２．５ソフトウェア（Ｆｕｊｉ Ｐｈｏｔｏ Ｆｉｌｍ Ｃｏ．）によりモニターし、そして分析した。基質特異性の評価のための反応混合物は、以下から構成された：総容量５００μｌ中において、１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、精製された組換え酵素、１００μＭ ＮＡＤＰＨ、および種々の濃度の基質。この種々の濃度の基質としては、例えば、４０μＭの９，１０−フェナントレンキノン、４０μＭのｐ−ニトロベンズアルデヒド、５μＭのＰＧＨ_２、４０μＭのプロゲステロン、４０μＭのグルクロン酸ナトリウム、４０μＭのテストステロンなどが挙げられる。基質を添加することによって反応を開始し、そして３４０ｎｍでの吸光度の減少を、３７℃でモニターした。酵素を含まないブランクまたは基質を含まないブランクを含ませた。９，１０−フェナントレンキノンレダクターゼ活性を１００％の活性を表すとして選択した。１−［^１４Ｃ］ＰＧＤ_２およびＰＧＥ_２生成について、４０μＭの１−［^１４Ｃ］ＰＧＨ_２を、以下のいずれかと共にインキュベートした：２５０μｇの組換え造血性ＰＧＤＳ（Ｋａｎａｏｋａ，Ｙ．ら、Ｃｅｌｌ ９０：１０８５−１０９５（１９９７））または５００μｇの組換えＰＧＥＳ（Ｊａｋｏｂｓｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：７２２０−７２２５（１９９９））。２５℃で５分間のインキュベーション後に、冷却酢酸エチルを使用して、得られたＰＧを３回抽出し、真空下において低温で乾燥させ、そしてＴ．ｂｒｕｃｅｉプロスタグランジンＦ_２αシンターゼ（ＴｂＰＧＦＳ）の特異性研究のための基質として使用した。
【０４５７】
次いで、ＰＧの抽出および定量を行った。抽出の間の回収率を決定するためのトレーサーとして使用するための、［^３Ｈ］ＰＧＤ_２、［^３Ｈ］ＰＧＥ_２、および［^３Ｈ］ＰＧＦ_２α（１アッセイにつき各６０Ｂｑ；ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を添加した後、トリパノソーマ培養培地（１０ｍｌ）から回収されたＰＧおよび酵素のアリコート（３００μｌ）の培養物からの回収物を抽出し、そして以前に記載されたようにしてＨＰＬＣにより分離した（Ｋｕｂａｒａ，Ｂ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：１１９７−１２０２（１９９８）およびＵｊｉｈａｒａら、（１９８８）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２６０：５２１−５３１）。得られたＰＧＤ_２、ＰＧＥ_２、およびＰＧＦ_２αを、その個々のＥＩＡキット（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いる酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）により定量した。
【０４５８】
次いで、ガスクロマトグラフィー−質量分析法を行った。ガスクロマトグラフィー選択イオンモニタリング（ＧＣ−ＳＩＭ）分析を、Ｈｉｔａｃｈｉ Ｍ−８０Ｂ二重収束型質量分析装置で行った。この分析装置は、Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇの溶媒を含まない注入器および接合されたシリカキャピラリーカラム（Ｕｌｔｒａ ｎｏ．１；２５ｍ長、０．３２ｍｍ内径、２８０℃カラム温度）を備えた。培養培地から回収されたＰＧ、および酵素のアリコートをＡＡと共にインキュベートすることによって形成された生成物を、ＨＰＬＣによって分画し、そして以前に記載された方法（Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｈ．ら、Ｂｉｏｍｅｄ．ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ ８：５２１−５２６（１９８１））に従って、それぞれ対応するメチルエステル（ＭＥ）ジメチルイソプロピルシリル（ＤＭｉＰＳ）エーテルまたはＭＥ−メトキシム（ＭＯ）−ＤＭｉＰＳエーテル誘導体に変換した。
【０４５９】
（結果）
上記のアッセイの結果、実際に
【０４６０】
【化２１】Ｕ４６６１９

【０４６１】
および
【０４６２】
【化２２】Ｕ４４０６９

【０４６３】
がプロスタグランジンＦ_２αシンターゼのインヒビターとして好ましいことが明らかになった。このうち、化２１の方がインヒビターとしてより好ましいこともわかった（Ｕ４６６１９は、２．０μＭでは約５０％の阻害が見られ、Ｕ４４０６９では、顕著な阻害が見られなかった）。したがって、実際に、Ｕ４６６１９の構造を有するものがよりインヒビターとして適切であることが判明した。
【０４６４】
このように、本発明を用いて、実際に、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの活性を調節する分子を得ることができた。従って、本発明は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの活性調節剤のスクリーニングのほか、その実際の調製にも使用することができることが実証された。
【０４６５】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【０４６６】
【発明の効果】
本発明は、従来不可能であった、コンピュータモデリングによるプロスタグランジンＦ_２αシンターゼのアンタゴニストまたはアゴニストの設計を可能にし、それに基づく医薬を製造することを可能にした。
【０４６７】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】図１Ａは、ＴｂＰＧＦＳと、ＡＫＲスーパーファミリーのいくつかのメンバーとの構造アラインメントである。アラインメントを、ＣＯＭＰＡＲＥＲプログラム（ｗｗｗ．ｃｒｙｓｔ．ｂｉｏｃ．ｃｏｍ．ａｃ．ｕｋ／^〜ＣＯＭＰＡＲＥＲ）を用いて算出した。このアラインメントでは、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸レダクターゼＡ（Ｃｂ ２，５ｄｋｇ）、ヒトアルドースレダクターゼ（Ｈｕｍ ＡＤＲ）、ブタアルドースレダクターゼ（Ｐｏｒ ＡＤＲ）およびラット３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（Ｒａｔ ３αＨＳＤ）について、それぞれＰＤＢ実体１Ａ８０、２ＡＣＱ、１ＡＨ３および１ＡＦＳを用いた。ＴｂＰＧＦＳの二次構造を、このアラインメントの上部に示す。対応するアミノ酸残基を、βシートについては黄色で、αヘリックスについては青色で、ループについては茶色で、そして界面については赤色で強調した。（α／β）_８−バレル構造コアの部分ではないβシートおよびαヘリックスを、Ｂ１、Ｂ２、Ｈ１およびＨ２と名付けた。緑色アスタリスクは、試験された全ての酵素の間で位置が保存されていた残基を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、結合したＮＡＤＰＨ補因子を有するＴｂＰＧＦＳの全体構造の立体図である。左側のパネルは、βバレルのＣＯＯＨ−末端とＮＡＤＰＨ分子とを見下ろしてスティックモデルで描かれた全体構造を示す。αヘリックス（青色）とβシート（黄色）とは、界面（赤色）で互いに分離される。１個のスルフェート分子もまた、疎水性間隙中に示す。ＴｂＰＧＦＳの全体的なフォールドは、他のＡＫＲ酵素のフォールドと類似する。右側のパネルは、α／βバレルに対して垂直から見たＴｂＰＧＦＳの全体構造を示し、そして結合したＮＡＤＰＨ補因子およびスルフェート分子の位置を示す。これらの図は、プログラムＭＯＬＳＣＲＩＰＴおよびＲＡＳＴＥＲ３Ｄを用いて描いた。
【図１Ｃ】図１Ｃは、他の種のプロスタグランジンＦ_２αシンターゼとのホモロジー比較の図である。上から、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ、ヒツジ、ヒト、ウシ肺およびウシ肝臓由来のものを示す。
【図２】図２は、ＴｂＰＧＦＳに対するＮＡＤＰＨの結合を示す。図２Ａは、ラット３α−ＨＳＤ−ドメイン−テストステロン三成分複合体（赤色）とＴｂＰＧＦＳ−ＮＡＤＰＨ二成分複合体（青色）とを重ね合わせた全体構造を見下ろした図である。この図は、３α−ＨＳＤには存在するがＴｂＰＧＦＳには存在しないループ（β１−α１、ＡおよびＢ）の存在を示し、そしてＴｂＰＧＦＳに存在しない構造的特徴であるループＢが、３α−ＨＳＤにおけるＮＡＤＰＨ結合に対して如何にして影響を与えるかを示す。図２Ｂは、重ね合わせた全体構造を垂直から見た図を示す。この図は、ＴｂＰＧＦＳと３α−ＨＳＤとの間での主な構造的差異を示し、そしてＴｂＰＧＦＳが、浅い補因子結合部位および基質結合部位を有する理由を説明する詳細を示す。ループ（β１−α１、ＡおよびＢ）は、３α−ＨＳＤにおいて、セイフティーベルトの形成および深い基質結合部位の作製に寄与する。この重ね合わせた全体構造はまた、３α−ＨＳＤの基質（テストステロン）結合部位が、ＴｂＰＧＦＳにおけるスルフェート結合部位に対応することを示す。このスルフェート結合部位は、ＴｂＰＧＦＳにおける基質結合部位であり得る。３つのループの構造的差異を、プログラムＭＯＬＳＣＲＩＰＴおよびＲＡＳＴＥＲ３Ｄを用いて描いた。
【図３ａ】図３Ａは、ＮＡＤＰＨおよびスルフェートの電子密度表面を示す。酸素原子、窒素原子、硫黄原子、およびリン原子を、それぞれ、赤色、青色、黄色およびマゼンタ色で示す。標識された残基は、ＮＡＤＰＨとスルフェートとの結合に関連した残基を示す。
図３Ｂは、ＮＡＤＰＨとＴｂＰＧＦＳとの間の相互作用の概略図を示す。水素結合および静電的相互作用に加えて、Ｔｒｐ−１８７の側鎖が、補因子のニコチンアミド環との芳香環スタッキング相互作用に関与する。
【図３ｂ】図３Ｃは、ＴｂＰＧＦＳにおけるＴｒｐ−１８７によるＮＡＤＰＨの固有のスタッキングの構造的詳細を示す。
【図４】図４は、ＴｂＰＧＦＳと他のＡＫＲ酵素とを重ね合わせた構造を示す。左側のパネルは、ｈｕｍ ＡＤＲ、Ｐｏｒ ＡＤＲ、およびｒａｔ ３αＨＳＤに対してそれぞれ結合したグルコース−６−ホスフェート、トルレスタット（ｔｏｌｒｅｓｔａｔ）、テストステロンと重ね合わせた、ＴｂＰＧＦＳ−ＮＡＤＰＨ二成分複合体の全体構造を示す。単純化するために、各リガンドは適所に残したまま、他のＡＫＲメンバーのタンパク質構造を取り除いた。ＴｂＰＧＦＳを、透明な表面を有する淡青色リボンとしてモデル化した。右側のパネルは、ＴｂＰＧＦＳのリガンド結合ポケットの縦断面の近接図を示す。リガンドであるグルコース−６−ホスフェート（Ｇ６Ｐ）、トルレスタット、テストステロンを、それぞれ、桃色、緑色、および紫色で示す。ＮＡＤＰＨ分子を、マゼンタ色で示す。ＴｂＰＧＦＳの表面を、白色で示し、そしてリガンド結合ポケットを灰色で示す。この図を、プログラムＭＯＬＳＣＲＩＰＴおよびＲＡＳＴＥＲ３Ｄを用いて描いた。
【図５】図５は、ＴｂＰＧＦＳへのＰＧＨ_２の結合を見下ろして描かれた提案モデルを示す。ＴｂＰＧＦＳおよび補因子結合モデルの表面に対する静電ポテンシャルにより、ＴｂＰＧＦＳ酵素のＰＧＨ_２結合ポケットを示す（左側パネル）。近接図（右側パネル）は、ＰＧＨ_２（緑色で描かれる）が、如何にして基質結合間隙にフィットするかに関する詳細を与える。ＰＧＨ_２のシクロペンタン環は、ＮＡＤＰＨ（球とスティックのモデルで示される）のニコチンアミド環のＣ４の近接に入り、次いで、ＰＧＨ_２のα鎖およびω鎖が、細長い結合間隙内で互いに対して反対方向に位置する。ＰＧＨ_２結合モデルに用いられた合理的説明を、反応機構の節に記載する。ＰＧＨ_２結合モデルを、ＧＲＡＳＰ、ＭＯＬＳＣＲＩＰＴおよびＲＡＳＴＥＲ３Ｄプログラムで作製した。
【図６】図６Ａは、野生型酵素および変異体酵素によって触媒される、ＰＧＨ_２還元の比活性を示す。ＴｂＰＧＦＳの純粋な野生型または変異体（１〜２μｇ）を、実験手順の節において記載したように、ＮＡＤＰＨの存在下において５μＭ［１−^１４Ｃ］ＰＧＨ_２と共にインキュベートした。ＰＧＦ_２αへのＰＧＨ_２の変換を、薄層クロマトグラフィーによって分析した。
図６Ｂは、野生型ＴｂＰＧＦＳによるＰＧＨ_２の還元に対する、ＰＧＨ_２相同体Ｕ−４６６１９およびＵ−４４０６９の効果を示す。種々の濃度の相同体を、３７℃で２分間にわたりＴｂＰＧＦＳ（１〜２μｇ）と共にプレインキュベートし、次いで、ＮＡＤＰＨの存在下において、５μＭ［１−^１４Ｃ］ＰＧＨ_２と共にＴｂＰＧＦＳ酵素をインキュベートした。残存する酵素活性を、相同体の濃度に対してプロットした。Ｕ−４６６１９を白色バーで示し、そしてＵ−４４０６９を黒色バーで示す。
【図７】図７は、ＰＧＨ_２の酵素学的還元について提案される反応機構の概略図を示す。
【図８】
図８は、アルド／ケトレダクターゼ（ＡＫＲ）スーパーファミリーに属するメンバーで、ＰＤＢに登録されているものを示す。本発明のタンパク質は、このうち５Ａ２のサブファミリーに属する。５Ａ２のサブファミリーに属するタンパク質の構造が明らかになったのは本発明がはじめてである。
【図９ＡＡ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＡＢ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＡＣ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＡＤ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＡＥ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＡＦ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＡＧ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＡＨ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＡＩ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＡＪ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＡＫ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＡＬ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＡＭ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＡＮ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＡＯ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＡＰ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＡＱ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＡＲ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＡＳ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＡＴ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＡＵ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＡＶ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＡＷ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＡＸ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＡＹ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＡＺ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＢＡ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＢＢ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＢＣ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＢＤ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＢＥ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＢＦ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＢＧ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＢＨ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＢＩ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＢＪ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＢＫ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＢＬ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＢＭ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＢＮ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＢＯ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＢＰ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＢＱ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＢＲ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＢＳ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＢＴ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＢＵ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＢＶ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＢＷ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＢＸ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＢＹ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＢＺ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＣＡ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＣＢ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＣＣ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＣＤ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＣＥ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＣＦ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＣＧ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＣＨ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＣＩ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＣＪ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＣＫ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＣＬ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＣＭ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＣＮ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＣＯ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＣＰ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図９ＣＱ】図９（図９ＡＡ〜ＣＱ）は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標を示す。
【図１０】図１０は、図１１および図１２の記録媒体によりコード化される命令を実行するために用いられるシステムのダイヤグラムを示す。
【図１１】図１１は、磁気記録媒体の断面図を示す。
【図１２】図１２は、光学的に読み出し可能なデータ記録媒体の断面図を示す。

Claims (125)

1. プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体の原子座標のデータで生成される、立体構造コンピュータモデル。
2. 前記原子座標は、図９に記載のプロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標またはその相同体もしくは改変体である、請求項１に記載の立体構造コンピューターモデル。
3. 前記原子座標はＮＡＤＰＨの原子座標を含み、かつ、図９に記載のＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ原子座標またはその相同体もしくは改変体である、請求項１に記載の立体構造コンピューターモデル。
4. プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体の原子座標を含むデータアレイであって、ここで該データアレイは、三次元分子モデリングアルゴリズムを使用することにより三次元構造を提示し得る、データアレイ。
5. 前記原子座標は、図９に記載の原子座標であるかまたはその相同体もしくは改変体である、請求項４に記載のデータアレイ。
6. 前記原子座標はＮＡＤＰＨの原子座標を含み、かつ、図９に記載のＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ原子座標またはその相同体もしくは改変体である、請求項４に記載のデータアレイ。
7. プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体の原子座標をコードした、コンピューター読み取り可能な記録媒体。
8. 前記原子座標は、図９に記載の原子座標であるかまたはその相同体もしくは改変体である、請求項７に記載のコンピューター読み取り可能な記録媒体。
9. 前記原子座標はＮＡＤＰＨの原子座標を含み、かつ、図９に記載のＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ原子座標またはその相同体もしくは改変体である、請求項７に記載のコンピューター読み取り可能な記録媒体。
10. プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体の立体構造解析方法を提供するためのプログラムであって、
    Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体の原子座標をコードしたデータ；および
    Ｂ）三次元立体構造の解析をコンピュータに実行させるアプリケーションのコード、
    を含む、プログラム。
11. 前記原子座標は、図９に記載の原子座標であるかまたはその相同体もしくは改変体である、請求項１０に記載のプログラム。
12. 前記原子座標はＮＡＤＰＨの原子座標を含み、かつ、図９に記載のＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ原子座標またはその相同体もしくは改変体である、請求項１０に記載のプログラム。
13. 前記アプリケーションは、
    Ａ）前記原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；および
    Ｂ）候補化合物の三次元分子モデルを、該三次元分子モデルと比較する工程をコンピュータに実行させる、請求項１０に記載のプログラム。
14. 図９に記載の原子座標によって定義される構造を有する、単離および精製された、タンパク質またはその相同体もしくは改変体。
15. 前記タンパク質は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの活性を含む、請求項１４に記載のタンパク質またはその相同体もしくは改変体。
16. 前記タンパク質は、ＮＡＤＰＨ複合体化プロスタグランジンＦ_２αシンターゼのＰＧＨ_２還元活性を有する、請求項１４に記載のタンパク質またはその相同体もしくは改変体。
17. 正方晶系の空間群Ｐ４_１２_１２、および配列番号１に示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列に１以上の置換、付加もしくは欠失を含む配列、もしくは該アミノ酸配列と少なくとも約３０％以上の相同性を有する、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体の結晶。
18. 前記結晶は、ＮＡＤＰＨと複合体化されている、請求項１７に記載の結晶。
19. 前記結晶は、ａ＝１１２．３±０．３Å、ｂ＝１１２．３±０．３Å、ｃ＝１４０．０±０．７Åの単位格子定数を有する、請求項１７に記載の結晶。
20. 前記結晶は、非対称単位中に２分子を有する、請求項１７に記載の結晶。
21. プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体の活性ポケットを含む、タンパク質。
22. 前記活性ポケットは、ＮＡＤＰＨと複合体化されたものである、請求項２１に記載のタンパク質。
23. 前記活性ポケットは、図９に記載されるアミノ酸残基４７、５２、７７、および１１０またはそれに対応するアミノ酸残基の原子座標によって定義される、請求項２１に記載のタンパク質。
24. 前記活性ポケットは、図９に記載されるアミノ酸残基４７、４９、５２、７７、７９、および１１０またはそれに対応するアミノ酸残基の原子座標によって定義される、請求項２１に記載のタンパク質。
25. 前記活性ポケットは、図９に記載されるアミノ酸残基２２、２３、４７、４９、５１、５２、７７、７９、１１０、１１１、１３９、１４０、１６１、および１８７またはそれに対応するアミノ酸残基の原子座標によって定義される、請求項２１に記載のタンパク質。
26. 前記活性部位ポケットは、スルフェートアニオンを含む、請求項２１に記載のタンパク質。
27. 前記タンパク質は、ＰＧＨ_２還元活性を有する、請求項２１に記載のタンパク質。
28. 請求項２１に記載のタンパク質のアミノ酸配列をコードする、核酸分子。
29. プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの相同体を得る方法であって、該方法は、候補化合物の原子座標と、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標とを比較する工程を包含する、方法。
30. 前記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼは、ＮＡＤＰＨと複合体化されている、請求項２９に記載の方法。
31. 前記原子座標は、図９に記載の原子座標を含む、請求項２９に記載の方法。
32. プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの相同体を得る方法であって、該方法は、以下の工程：
    Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；および
    Ｂ）候補化合物の三次元分子モデルを、該プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの三次元分子モデルと比較する工程
    を包含する、方法。
33. 前記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼは、ＮＡＤＰＨと複合体化されている、請求項３２に記載の方法。
34. 前記原子座標は、図９に記載の原子座標を含む、請求項３２に記載の方法。
35. 請求項２９または３２に記載の方法によって同定された、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ相同体。
36. プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの改変体を得る方法であって、該方法は、以下の工程：
    Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；および
    Ｂ）候補化合物の三次元分子モデルを、該プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの三次元分子モデルと比較し、所定のパラメータに基づき変異を導入する工程、
    を包含する、方法。
37. 前記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼは、ＮＡＤＰＨと複合体化されている、請求項３６に記載の方法。
38. 前記原子座標は、図９に記載の原子座標を含む、請求項３６に記載の方法。
39. 前記改変体は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ活性が亢進されている、請求項３６に記載の方法。
40. 前記改変体は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ活性が低減されている、請求項３６に記載の方法。
41. 請求項３６に記載の方法によって同定された、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ改変体。
42. 請求項２９もしくは３２に記載の方法によって同定されたプロスタグランジンＦ_２αシンターゼ相同体のアミノ酸配列、または請求項３６に記載の方法によって同定されたプロスタグランジンＦ_２αシンターゼ改変体のアミノ酸配列をコードする核酸分子。
43. プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法であって、該方法は、以下の工程：
    Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に対して三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの活性部位ポケットの空間座標を決定する工程；および
    Ｂ）該プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体の活性部位ポケットの空間座標に対して、電子的に候補化合物のセットの空間座標をスクリーニングして、該プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する工程、
    を包含する、方法。
44. 前記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼは、ＮＡＤＰＨと複合体化されている、請求項４３に記載の方法。
45. 前記原子座標は、図９に記載の原子座標を含む、請求項４３に記載の方法。
46. 前記相同体または改変体は、請求項２９、３２または３６に記載の方法によって得られたものである、請求項４１に記載の方法。
47. 前記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼは、哺乳動物またはＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉのプロスタグランジンＦ_２αシンターゼを含む、請求項４３に記載の方法。
48. 前記工程ａ）において決定された空間座標は、図９に記載されるアミノ酸残基４７、５２、７７、および１１０またはそれに対応するアミノ酸残基の原子座標によって定義される、請求項４３に記載の方法。
49. 前記工程ａ）において決定された空間座標は、図９に記載されるアミノ酸残基４７、４９、５２、７７、７９、および１１０またはそれに対応するアミノ酸残基の原子座標によって定義される、請求項４３に記載の方法。
50. 前記工程ａ）において決定された空間座標は、図９に記載されるアミノ酸残基２２、２３、４７、４９、５１、５２、７７、７９、１１０、１１１、１３９、１４０、１６１、および１８７またはそれに対応するアミノ酸残基の原子座標によって定義される、請求項４３に記載の方法。
51. 前記工程ａ）において決定された空間座標は、図９に記載されるスルフェートアニオンまたはそれに対応するスルフェートアニオンの原子座標を含む、請求項４３に記載の方法。
52. 候補化合物の三次元分子モデルを、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体の三次元分子モデルと比較することによって、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法であって、該方法は、以下の工程：
    Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；
    Ｂ）該三次元分子モデルの座標データをデータ構造に入力して、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子間の距離を検索する工程；および
    Ｃ）候補化合物において水素結合を形成するヘテロ原子と、該三次元分子モデルにおいて活性部位ポケットを形成するヘテロ原子との間の距離を比較して、２つの構造の間での最適な水素結合に基づいて、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの三次元分子モデルの活性部位ポケットと安定な複合体を理論上形成する候補化合物種を同定する工程、
    を包含する、方法。
53. 前記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼは、ＮＡＤＰＨと複合体化されている、請求項５２に記載の方法。
54. 前記原子座標は、図９に記載の原子座標を含む、請求項５２に記載の方法。
55. 前記相同体または改変体は、請求項２９、３２または３６に記載の方法によって得られたものである、請求項５２に記載の方法。
56. 前記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼは、哺乳動物またはＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉのプロスタグランジンＦ_２αシンターゼを含む、請求項５２に記載の方法。
57. 前記候補化合物は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼのＰＧＨ_２還元活性を阻害する活性を有する、請求項５２に記載の方法。
58. 前記候補化合物は、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼのＰＧＨ_２還元活性を活性化する活性を有する、請求項５２に記載の方法。
59. 請求項５２に記載の方法により同定された、化合物。
60. 請求項５２に記載の方法により同定された化合物を有効成分として含む、医薬組成物。
61. 請求項５２に記載の方法により同定された化合物を有効成分として含む、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼに関連する疾患または障害を処置または予防するための医薬組成物。
62. 請求項５２に記載の方法により同定された化合物の名称および構造を含むデータをコードした、データベース。
63. 請求項５２に記載の方法により同定された化合物の名称および構造を含むデータをコードした、データベースを含む記録媒体。
64. 請求項５２に記載の方法により同定された化合物の名称および構造を含むデータをコードした、データベースを含む伝送媒体。
65. 以下の式によって定義される原子の空間的配置を有するファルマコフォアモデルであって、
    式Ｉ
    

    

    ここで、イミダゾリウムイオンはプロトン供与体として、ペルオキシド基の１つの酸素原子をプロトン化し、該ペルオキシド基の他方の酸素原子は、ニコチンアミド環から１つのプロトンおよび２つの電子を受容することにより還元され、Ｒは任意の基を表し、ニコチンアミド環のＣ４位とイミダゾリウムイオンのＮ１位との間の距離（Ｘ）は任意であり、原子間距離は各原子の中心間の距離を示す、ファルマコフォアモデル。
66. 前記式において、前記ニコチンアミド環のＣ４位とイミダゾリウムイオンのＮ１位との間の距離（Ｘ）は、５．１４±０．２５Åである、請求項６５に記載のファルマコフォアモデル。
67. 請求項６５に記載のファルマコフォアモデルの、医薬候補分子のスクリーニングにおける使用。
68. 請求項６５に記載のファルマコフォアモデルを使用したスクリーニングによって同定された医薬候補分子。
69. プロスタグランジンＦ_２αシンターゼのＰＧＨ_２還元活性を阻害する活性を有する、請求項６８に記載の医薬候補分子。
70. 請求項６８または６９に記載の医薬候補分子を含む、医薬組成物。
71. 以下の式によって定義される原子の空間的配置を有するファルマコフォアモデルであって、
    式ＩＩ
    

    

    ここで、Ｏは酸素原子を表し、Ｒは任意の基を表し、ニコチンアミド環のＣ４位とイミダゾリウムイオンのＮ１位との間の距離（Ｘ）は任意であり、原子間距離は各原子の中心間の距離を示す、ファルマコフォアモデル。
72. 前記式において、前記ニコチンアミド環のＣ４位とイミダゾリウムイオンのＮ１位との間の距離（Ｘ）は、５．１４±０．２５Åである、請求項７１に記載のファルマコフォアモデル。
73. 請求項７１に記載のファルマコフォアモデルの、医薬候補分子のスクリーニングにおける使用。
74. 請求項７１に記載のファルマコフォアモデルを使用したスクリーニングによって同定された医薬候補分子。
75. プロスタグランジンＦ_２αシンターゼのＰＧＨ_２還元活性を阻害する活性を有する、請求項７４に記載の医薬候補分子。
76. 請求項７４または７５に記載の医薬候補分子を含む、医薬組成物。
77. 以下の式によって定義される原子の空間的配置を有するファルマコフォアモデルであって、
    式ＩＩＩ
    

    

    ここで、原子間距離は各原子の中心間の距離を示し、Ａ〜Ｅは任意の原子であるが、ただし、ＡおよびＢが両方ともが酸素原子である場合を除く、
    ファルマコフォアモデル。
78. 前記Ａ〜Ｅの少なくとも１つは非反応性の原子である、請求項７７に記載のファルマコフォアモデル。
79. 前記Ａ〜Ｅの少なくとも１つは炭素原子である、請求項７７に記載のファルマコフォアモデル。
80. 前記ＡまたはＢの少なくとも１つは非反応性の原子である、請求項７７に記載のファルマコフォアモデル。
81. 前記Ａは、非反応性の原子である、請求項７７に記載のファルマコフォアモデル。
82. 前記Ｂは、非反応性の原子である、請求項７７に記載のファルマコフォアモデル。
83. 前記ＡまたはＢの少なくとも１つは炭素原子である、請求項７７に記載のファルマコフォアモデル。
84. 前記Ａは、炭素原子である、請求項７７に記載のファルマコフォアモデル。
85. 前記Ｂは、炭素原子である、請求項７７に記載のファルマコフォアモデル。
86. 前記ＡおよびＢのいずれか一方は電子供与体原子または水素結合をし得る原子であり、他方は非反応性の原子である、請求項７７に記載のファルマコフォアモデル。
87. 前記電子供与体原子または水素結合をし得る原子は酸素原子である、請求項８６に記載のファルマコフォアモデル。
88. 前記非反応性の原子は炭素原子である、請求項８４に記載のファルマコフォアモデル。
89. 前記Ｃ、ＤおよびＥは炭素原子である、請求項７７に記載のファルマコフォアモデル。
90. 前記Ａは炭素原子であり、前記Ｂは酸素原子である、請求項７７に記載のファルマコフォアモデル。
91. 前記Ａは酸素原子であり、前記Ｂは炭素原子である、請求項７７に記載のファルマコフォアモデル。
92. 請求項７７に記載のファルマコフォアモデルによって定義される、化合物またはその塩。
93. 以下の式
    

    

    （９，１１−ジデオキシ−９α，１１α−メタノエポキシプロスタグランジンＦ_２α）
    または
    

    

    （９，１１−ジデオキシ−９α，１１α−エポキシメタノプロスタグランジンＦ_２α）
    で示される構造を有する、請求項９２に記載の化合物またはその塩。
94. 請求項９２に記載の化合物またはその塩を含む、医薬組成物。
95. 請求項７７に記載のファルマコフォアモデルの、医薬候補分子のスクリーニングにおける使用。
96. 請求項７７に記載のファルマコフォアモデルを使用したスクリーニングによって同定された医薬候補分子。
97. プロスタグランジンＦ_２αシンターゼのＰＧＨ_２還元活性を阻害する活性を有する、請求項９６に記載の医薬候補分子。
98. 請求項９６または９７に記載の医薬候補分子を含む、医薬組成物。
99. プロスタグランジンＦ_２αシンターゼに関連する疾患または障害を処置または予防するための医薬組成物を調製する方法であって、
    Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；
    Ｂ）該三次元分子モデルと、該医薬組成物に含まれるべき候補化合物のライブラリーとの相互作用を評価する工程；
    Ｃ）該候補化合物のうち、該プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの活性を調節する作用を有する化合物種を選択する工程；および
    Ｄ）該化合物種と、薬学的に受容可能なキャリアとを混合する工程、
    を包含する、方法。
100. 前記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼは、ＮＡＤＰＨと複合体化されている、請求項９９に記載の方法。
101. 前記原子座標は、図９に記載の原子座標を含む、請求項９９に記載の方法。
102. 前記相同体または改変体は、請求項２９、３２または３６に記載の方法によって得られたものである、請求項９９に記載の方法。
103. 前記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼは、哺乳動物またはＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉのプロスタグランジンＦ_２αシンターゼを含む、請求項９９に記載の方法。
104. 前記化合物種を合成して大量に該化合物種を製造する工程、をさらに包含する、請求項９９に記載の方法。
105. 前記化合物種について、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼ活性に関する生物学的試験を行う工程をさらに包含する、請求項９９に記載の方法。
106. プロスタグランジンＦ_２αシンターゼに関連する疾患または障害を処置または予防するための方法であって、
     Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；
     Ｂ）該三次元分子モデルに基づいて、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの活性を調節する手段を同定する工程；および
     Ｃ）該調節手段を該疾患または障害に罹患するかまたはその可能性のある被検体に投与する工程、
     を包含する、方法。
107. 前記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼは、ＮＡＤＰＨと複合体化されている、請求項１０６に記載の方法。
108. 前記原子座標は、図９に記載の原子座標を含む、請求項１０６に記載の方法。
109. 前記相同体または改変体は、請求項２９、３２または３６に記載の方法によって得られたものである、請求項１０６に記載の方法。
110. 前記プロスタグランジンＦ_２αシンターゼは、哺乳動物またはＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉのプロスタグランジンＦ_２αシンターゼを含む、請求項１０４に記載の方法。
111. プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの相同体を得る方法をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、該方法は、
     Ａ）候補化合物の原子座標と、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標とを比較する工程、
     を包含する、プログラム。
112. プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの相同体を得る方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、該方法は、
     Ａ）候補化合物の原子座標と、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標とを比較する工程、
     を包含する、記録媒体。
113. プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの相同体を得る方法を実行するコンピュータであって、該方法は、
     Ａ）候補化合物の原子座標と、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標とを比較する手段、
     を包含する、コンピュータ。
114. プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの相同体を得る方法をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、該方法は、
     Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；および
     Ｂ）候補化合物の三次元分子モデルを、該プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの三次元分子モデルと比較する工程、
     を包含する、
     プログラム。
115. プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの相同体を得る方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、該方法は、
     Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；および
     Ｂ）候補化合物の三次元分子モデルを、該プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの三次元分子モデルと比較する工程、
     を包含する、記録媒体。
116. プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの相同体を得る方法を実行するコンピュータであって、該方法は、
     Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；および
     Ｂ）候補化合物の三次元分子モデルを、該プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの三次元分子モデルと比較する工程、
     を包含する、コンピュータ。
117. プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの改変体を得る方法をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、該方法は、
     Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；および
     Ｂ）候補化合物の三次元分子モデルを、該プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの三次元分子モデルと比較し、所定のパラメータに基づき変異を導入する工程、
     を包含する、プログラム。
118. プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの改変体を得る方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、該方法は、
     Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；および
     Ｂ）候補化合物の三次元分子モデルを、該プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの三次元分子モデルと比較し、所定のパラメータに基づき変異を導入する工程、
     を包含する、記録媒体。
119. プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの改変体を得る方法を実行するコンピュータであって、該方法は、
     Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；および
     Ｂ）候補化合物の三次元分子モデルを、該プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの三次元分子モデルと比較し、所定のパラメータに基づき変異を導入する工程、
     を包含する、コンピュータ。
120. プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、該方法は、
     Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に対して三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの活性部位ポケットの空間座標を決定する工程；および
     Ｂ）該プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体の活性部位ポケットの空間座標に対して、電子的に候補化合物のセットの空間座標をスクリーニングして、該プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する工程、
     を包含する、プログラム。
121. プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、該方法は、
     Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に対して三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの活性部位ポケットの空間座標を決定する工程；および
     Ｂ）該プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体の活性部位ポケットの空間座標に対して、電子的に候補化合物のセットの空間座標をスクリーニングして、該プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する工程、
     を包含する、記録媒体。
122. プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法を実行するコンピュータであって、該方法は、
     Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に対して三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの活性部位ポケットの空間座標を決定する工程；および
     Ｂ）該プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体の活性部位ポケットの空間座標に対して、電子的に候補化合物のセットの空間座標をスクリーニングして、該プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する工程、
     を包含する、コンピュータ。
123. 候補化合物の三次元分子モデルを、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体の三次元分子モデルと比較することによって、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、該方法は、
     Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；
     Ｂ）該三次元分子モデルの座標データをデータ構造に入力して、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子間の距離を検索する工程；および
     Ｃ）候補化合物において水素結合を形成するヘテロ原子と、該三次元分子モデルにおいて活性部位ポケットを形成するヘテロ原子との間の距離を比較して、２つの構造の間での最適な水素結合に基づいて、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの三次元分子モデルの活性部位ポケットと安定な複合体を理論上形成する候補化合物種を同定する工程、
     を包含する、プログラム。
124. プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、該方法は、
     Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；
     Ｂ）該三次元分子モデルの座標データをデータ構造に入力して、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子間の距離を検索する工程；および
     Ｃ）候補化合物において水素結合を形成するヘテロ原子と、該三次元分子モデルにおいて活性部位ポケットを形成するヘテロ原子との間の距離を比較して、２つの構造の間での最適な水素結合に基づいて、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの三次元分子モデルの活性部位ポケットと安定な複合体を理論上形成する候補化合物種を同定する工程、
     を包含する、記録媒体。
125. プロスタグランジンＦ_２αシンターゼまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法を実行するコンピュータであって、該方法は、
     Ａ）プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；
     Ｂ）該三次元分子モデルの座標データをデータ構造に入力して、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの原子間の距離を検索する工程；および
     Ｃ）候補化合物において水素結合を形成するヘテロ原子と、該三次元分子モデルにおいて活性部位ポケットを形成するヘテロ原子との間の距離を比較して、２つの構造の間での最適な水素結合に基づいて、プロスタグランジンＦ_２αシンターゼの三次元分子モデルの活性部位ポケットと安定な複合体を理論上形成する候補化合物種を同定する工程、
     を包含する、コンピュータ。

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