JP2004168739A - Water-soluble protein-calcium phosphate complex having osteogenesis promoting action and method for producing the same - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、水溶性タンパク質とリン酸カルシウムとを複合化させたタンパク質−リン酸カルシウム複合体およびその製造方法に関する。さらに詳しくは、水溶性タンパク質の徐放による骨形成促進とリン酸カルシウム自体の骨転化とにより新たな骨形成方法を提供しうるタンパク質−リン酸カルシウム複合体およびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
超高齢化社会の到来に伴い、骨粗しょう症などに代表される骨疾患の増加が大きな社会問題となっている。従来、骨欠損あるいは複雑な骨折治療には、無機骨成分の代表であるアパタイトを含むリン酸カルシウムが骨代替材料として使用されてきた。リン酸カルシウム（特にアパタイト）は体内で、経時的に骨に置換する性質を持つ。このような、いわゆる外科的治療に対して、有機性薬剤（たとえばタンパク質）を用いて、細胞レベルで骨形成を促進しようとする内科的な試みも行われてきた。代表的な薬剤としては、成長因子と呼ばれるＢＭＰ−２あるいは繊維芽細胞増殖因子ファミリー（ＦＧＦ）などが挙げられる。これらのタンパク質は、人体内で骨形成に必須の血管新生を行ったり、細胞増殖を促進して骨形成を補助する。
【０００３】
薬剤による骨形成治療の場合、対象部位で薬剤がある程度長期間に渡り徐放する必要がある。このため、従来、薬剤をゲルまたはポリマーなどに担持して骨欠損部位に輸送する方法がとられていた（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４）。たとえば、ゲルの水分含有量を調節することで、薬剤の徐放速度を制御する方法が知られている（特許文献１、特許文献２）。しかし、この方法では、ゲル自身が全く骨形成に関与しないこと、またウイルスや細菌感染を防ぐため取扱いに注意を要する必要があるという問題があった。そのため、リン酸カルシウムを骨代替材料として用いる外科的治療法を完全に凌駕するには至っていなかった。
【０００４】
一方、近年、材料自身が骨形成能力を持ついわゆる第３世代バイオマテリアルの概念が提唱されている。たとえば、従来使用されてきたリン酸カルシウム骨代替材料に、亜鉛を混合した骨代替材料が知られている（特許文献５）。
【０００５】
また、アパタイトを含む溶液にＦＧＦ−２を混入し、アパタイトを含む析出物を形成させた報告例があるが、アパタイトの析出物の態様に係る確認はなされておらず、析出物が如何なる化合物なのか不明である。また、析出物の析出条件などに関する記載もない。（非特許文献１）
【０００６】
【特許文献１】
ＵＳ６，４１０，６４５
【特許文献２】
特開２０００−１７８１８０号公報
【特許文献３】
特開２００１−１２２８００号公報
【特許文献４】
特開２００１−１３１０８６号公報
【特許文献５】
特許３１４３６６０号
【非特許文献１】
Ｖ．Ｍｉｄｙら著、”Ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ”、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌｕｍｅ ４１、１９９８年、４０５−４１１頁
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、有機系の骨成長因子の放出期間を制御しながら、体内で材料自身の骨形成、および骨形成促進を図ることを可能とする骨形成材料を提供することを目的としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行い、水溶性タンパク質を溶液中に単分子または会合体として、沈殿させずに微粒子状態で存在させて、この溶液をリン酸カルシウムを含有する溶液に混合させると、水溶性タンパク質とリン酸カルシウムとが複合体を形成できることを見出した。そしてこのようなタンパク質−リン酸カルシウム複合体を骨形成材料として用いると、体内において、複合体からの水溶性タンパク質の適切な徐放性を保ちながら、材料自体による骨形成、および水溶性タンパク質による骨形成促進を図ることができることを見出し、本願発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の概要は下記のとおりである。
【０００９】
本発明に係るタンパク質−リン酸カルシウム複合体の製造方法は、水溶性タンパク質単分子および／または水溶性タンパク質会合体からなる水溶性タンパク質を、水溶液中に実質的に沈殿しない状態で含有する水溶性タンパク質含有溶液を調製する工程、および
前記水溶性タンパク質含有溶液に、リン酸カルシウム含有溶液を添加して、タンパク質−リン酸カルシウム複合体を析出させる工程を含む。
【００１０】
前記水溶性タンパク質会合体の平均粒子径は、１μｍ以下の範囲にあることが好ましい。
【００１１】
前記リン酸カルシウム含有溶液は、過飽和リン酸カルシウム含有溶液であることが好ましい。
【００１２】
前記水溶性タンパク質の表面は、マイナスに帯電していることが好ましい。
【００１３】
前記水溶性タンパク質の表面は、リン酸基イオンによりマイナスに帯電していることが好ましい。
【００１４】
前記リン酸カルシウムは準安定リン酸カルシウムを含み、該準安定リン酸カルシウムを安定リン酸カルシウムに相転移させて、蛋白質−リン酸カルシウム複合体を形成することができる。
【００１５】
前記水溶性タンパク質は、骨形成促進物質であることが好ましい。
【００１６】
本発明に係るタンパク質−リン酸カルシウム複合体は、平均粒子径が１μｍ以下である水溶性タンパク質と、リン酸カルシウムとを含有する。
【００１７】
前記水溶性タンパク質は、骨形成促進物質であることが好ましい。
【００１８】
前記リン酸カルシウムは安定リン酸カルシウムであることが好ましい。
【００１９】
【発明の実施の態様】
本発明は、水溶性タンパク質１分子および／または水溶性タンパク質会合体からなる水溶性タンパク質を、水溶液中に実質的に沈殿しない状態で含有する水溶性タンパク質含有溶液を調製する工程、および前記水溶性タンパク質の含有溶液に、リン酸カルシウムを含有する溶液を添加して、タンパク質−リン酸カルシウム複合体を析出させる工程を含む、タンパク質−リン酸カルシウム複合体の製造方法およびタンパク質−リン酸カルシウム複合体を提供する。
【００２０】
以下、水溶性タンパク質、リン酸カルシウム、タンパク質−リン酸カルシウム複合体の製造方法、タンパク質−リン酸カルシウム複合体について詳説する。
【００２１】
水溶性タンパク質および水溶性タンパク質含有溶液
本発明で用いることのできる水溶性タンパク質は、たとえば体内で骨形成を促進しうる骨形成促進物質が挙げられる。骨形成促進物質とは、人体内で骨形成に必要な血管新生を行ったり、細胞増殖を促進して骨形成を補助する物質である。このような水溶性タンパク質は特に限定されないが、たとえば、成長因子と呼ばれるＢＭＰ−２、繊維芽細胞増殖因子ファミリー（ＦＧＦ）、ＩＧＦβなどが挙げられる。これらのうち、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）が好ましく用いられる。
【００２２】
本発明で用いる水溶性タンパク質は、水溶性タンパク質が単分子、および／または水溶性タンパク質会合体である。
【００２３】
本発明で用いる水溶性タンパク質含有溶液は、この水溶性タンパク質を水溶液中で実質的に沈殿しない状態で存在させた溶液である。実質的に沈殿しないとは、水溶液中で、目視で水溶性タンパク質の沈殿が確認されない状態、より好ましくは本研究における光散乱法により、初期溶液中における水溶性タンパク質の粒子径が経時的に極端に変化しないことを確認できる状態、あるいは初期溶液中の水溶性タンパク質濃度が経時的に変化しないことを適切な方法（例えば分光法）により確認できる状態をいう。なお、水溶性タンパク質が単分子の状態で存在している場合、通常、水溶液中で沈殿は起こらない。したがって、水溶性タンパク質会合体を実質的に沈殿させない状態で存在させる。
【００２４】
水溶性タンパク質がこのような状態の水溶性タンパク質含有溶液をリン酸カルシウム含有溶液と接触させると、水溶性タンパク質の粒子とリン酸カルシウムとを含む複合体を形成させることができる。一方、水溶性タンパク質が沈殿する状態となると、タンパク質−リン酸カルシウム複合体を有効に形成させることができない。
【００２５】
本発明で用いることのできる水溶性タンパク質含有溶液の水溶液として、各種の緩衝液を用いることができる。緩衝液としてはたとえば、トリスアミノメタン（以下「トリス」という。）、ＨＥＰＥＳ（ヘペス）などを含むバッファーが挙げられる。
【００２６】
また、本発明で用いられる水溶性タンパク質含有溶液には、必要に応じ、金属塩などの塩を添加することもできる。金属塩としてはアルカリ金属ハロゲン塩、アルカリ土類金属ハロゲン塩などを好ましく用いることができる。アルカリ金属ハロゲン塩としては、たとえば、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどが挙げられる。アルカリ土類金属ハロゲン塩としては、たとえば、塩化カルシウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。
【００２７】
これらのうちでは、塩化ナトリウム、塩化カリウムを好ましく用いることができる。
【００２８】
水溶性タンパク質会合体の平均粒子径は、好ましくは１μｍ以下、さらに好ましくは６００μｍ以下とすることが望ましい。また水溶性タンパク質会合体の平均粒子径の最小値は、タンパク質分子が２つ会合した状態における平均粒子径である。水溶性タンパク質の会合体の平均粒子径が上記範囲にあると、通常、水溶性タンパク質は沈殿しにくくなるか、または沈殿しない。
【００２９】
このような水溶性タンパク質の平均粒子径を制御することにより、本発明に係るタンパク質−リン酸カルシウム複合体を骨形性に用いる際、水溶性タンパク質の徐放時間を調整することができる。たとえば、水溶液中の水溶性タンパク質の平均粒子径を単分子サイズ（ＦＧＦ−２の場合、半径が１．５ｎｍ）近くにまで小さくして、水溶液中に分散させ、リン酸カルシウムと複合化させると、水溶性タンパク質の徐放時間を極めて長期に設定することができる。
【００３０】
このような水溶性タンパク質を超微粒子で水溶液中に分散させるには、水溶性タンパク質を溶解させる緩衝液のｐＨ、溶解時の撹拌時間を調整することにより行なうことができる。
【００３１】
たとえば、ＦＧＦ−２を用い、バッファーとしてトリス（５ｍＭ）を用いる場合、（１）ｐＨを７．０〜７．２としてＦＧＦ−２をトリスに溶解させ、（２）溶解後、ボルテックミキサー等で１分以上３分未満急速混合するか、または温度を４℃程度に設定して撹拌速度を約３回転／毎分として１週間程度の長時間撹拌させる。（３）この場合、ＦＧＦ−２の濃度は１００ｍｇ／Ｌ以上であることが好ましい。このようにして得られるＦＧＦ−２含有溶液は、ＦＧＦ−２の２量体もしくは３量体に相当するＦＧＦ−２粒子を含有させることができる。このようなＦＧＦ−２粒子の粒子径は長期にわたりほぼ変化なく、たとえば１週間以上安定に分散し、沈殿しない。
【００３２】
本発明で用いる水溶性タンパク質含有溶液では、水溶性タンパク質が沈殿しない状態で、しかも、水溶性タンパク質の平均粒子径が一定時間ほぼ一定であることが好ましい。一定時間とは、少なくとも、水溶性タンパク質含有溶液を調製した後、リン酸カルシウム含有溶液と接触させるまでの間であり、通常、水溶性タンパク質含有溶液の調製後、好ましくは２４時間程度、さらに好ましくは３時間程度の間、平均粒子径が一定に維持されていることが望ましい。
【００３３】
リン酸カルシウム含有溶液と接触させるまでの間平均粒子径が一定であると、タンパク質−リン酸カルシウム複合体に取り込まれた水溶性タンパク質の平均粒子径が一定粒子径となるので、徐放期間、徐放効果の精度を向上させることができる。
【００３４】
なお、平均粒子径が一定時間にわたり一定であるとは、たとえば、縦軸に平均粒子径、横軸に時間をプロットした場合に、最小二乗法により求めた直線の負時間（横軸が負の領域）への延長が、横軸と交差しない状態が挙げられ、前記直線は横軸と実質的に平行である（すなわち、粒子径が変化しない）ことが好ましい。
【００３５】
本発明では、水溶性タンパク質を溶解させるバッファーの濃度、水溶性タンパク質の濃度、あるいは水溶性タンパク質に必要に応じて添加する塩の濃度、ｐＨ、溶解時の撹拌時間、温度などを適宜調整して、水溶性タンパク質を水溶液中で沈殿させない状態にすることができる。また、水溶性タンパク質会合体の平均粒子径を任意に調整することもできる。
【００３６】
水溶性タンパク質会合体の平均粒子径は、タンパク質−リン酸カルシウム複合体の用途により異なるため、バッファーの濃度、水溶性タンパク質の濃度、塩の濃度などは限定されないが、たとえば、トリスなどのバッファーを用いる場合、水溶性タンパク質含有溶液１Ｌ中のトリス濃度は好ましくは０．０５〜１００ｍＭ（ミリモル／Ｌ。以下同じ。）、さらに好ましくは０．１〜５０ｍＭの範囲にあればよい。
【００３７】
また、塩を添加する場合は、バファー中のトリスなどの濃度、水溶性タンパク質の濃度などにより限定されないが、たとえば、水溶性タンパク質含有溶液１Ｌ中の塩濃度は好ましくは０．１〜５００ｍＭ、さらに好ましくは１〜２００ｍＭの範囲にあればよい。
【００３８】
さらに、水溶性タンパク質の溶液中での含有量は、水溶性タンパク質の種類、用いるトリスの濃度などにより限定されないが、たとえば、水溶性タンパク質含有溶液１Ｌ中の水溶性タンパク質濃度は好ましくは０．０１〜２０００ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．１〜１０００ｍｇ／Ｌの範囲にあればよい。
【００３９】
なお、前記水溶性タンパク質の平均粒子径は、光散乱法により測定することができる。光散乱法としては動的光散乱法および静的光散乱法を採用することができる。
【００４０】
具体的には、たとえば、水溶性タンパク質の溶液中における分散状態を動的光散乱法により詳細に測定し、溶液の化学組成変動が水溶性タンパク質のサイズや会合状態にいかなる影響を及ぼすかを測定することができる。
【００４１】
以下に動的光散乱法の簡略な説明を行う。
【００４２】
溶液中の粒子（この場合は水溶性タンパク質としてＦＧＦ−２）からの散乱光強度をＩとした場合、散乱光強度の時間変化に関して以下の自己相関関数を定義する。
【００４３】
【数１】
ｇ２（ｑ，ｔ）−１ ＝ ＜Ｉ（ｑ，ｔ） Ｉ（ｑ，０）＞ ／ ＜Ｉ（ｑ）＞２ （数式１）
【００４４】
数式１において、ｇ２（ｑ，ｔ）は二次自己相関関数であり、Ｉ（ｑ，ｔ）は時間ｔ、散乱角度（正確には散乱ベクトル）ｑにおける散乱光強度、Ｉ（ｑ，０）は測定開始時間における散乱角度ｑでの散乱光強度を、Ｉ（ｑ）は全測定時間内における散乱光強度の平均値を意味する。＜＞内はアンサンブル平均を表す。二次自己相関関数は粒子の緩和時間τ、と数式２の関係がある。
【００４５】
【数２】
ｇ２（ｑ，ｔ） −１＝ ［Σａｎ×ｅｘｐ｛−（１／τｎ ×ｔ）β｝］２ （ｎ＝１、２、３、・・・） （数式２）
【００４６】
最も単純な系は、粒子間相互作用が弱く粒子形態の異方性がない、単分散（平均粒径が１種類）の系でｎ＝１、β＝１となる。ポリマーのように粒子間相互作用が顕著になるような系では、βは必ずしも１とはならず、１以下の値も取りうる。一方、溶液中に平均サイズの異なる粒子群が存在した場合、二次自己相関関数は各々の粒子の緩和時間を足し併せたものとなる。すなわち、ｎ＝１、２、・・・である。粒子が大きくゆっくりと動く場合には、緩和時間も長くなり、逆に小さな粒子で激しくブラウン運動しているような場合には、緩和時間は短くなる。
【００４７】
実際の測定では溶液中にどのような粒子群が存在するかを仮定し、二次自己相関関数を解析して、散乱角度ｑにおける各粒子の緩和時間を求める。緩和時間と粒子の拡散係数、散乱角度の間には式（３）の関係がある。
【００４８】
【数３】
１／τ＝ｑ２×Ｄ （数式３）
【００４９】
ここで、散乱角度を変化させ、それぞれのｑ値で緩和時間を求め、１／τとｑ２を両軸としてプロットしたデータを原点を通過する直線で近似し、その傾きから並進拡散係数を求める。実際には真の拡散係数は粒子濃度が無限希釈時に定義されるものであるが、本研究では分子間相互作用等の検討は行わないので、概知ＦＧＦ−２濃度で求められた拡散係数をそのまま使用する。このような手順で求められた並進拡散係数と粒子径（流体力学的半径：ｒと呼ぶ）には以下の関係が成り立つ（Ｓｔｏｋｅｓ−Ｅｉｎｓｔｅｉｎの式）
【００５１】
【数４】
ｒ ＝ ｋＴ／６πηＤ （数式４）
【００５１】
ｋはボルツマン（Ｂｏｌｔｚｍａｎ）定数、Ｔは溶液の絶対温度、ηは溶媒の粘性である。
【００５２】
本発明で用いる水溶性タンパク質含有溶液中の水溶性タンパク質は、表面がマイナスに帯電していることが好ましい。水溶性タンパク質の表面電荷がマイナスに帯電していると、リン酸カルシウム溶液と水溶性タンパク質含有溶液の混合による複合体形成を効果的に行うことができる。
【００５３】
これは、水溶性タンパク質分子あるいは会合体の表面電荷をマイナス（負）に制御することにより、水溶液中で中性または弱い正電荷を有するリン酸カルシウム微粒子との静電気的な結合が促進されるためであると推測される。そして、リン酸カルシウムが水溶性タンパク質を核としてその周囲に集合して、水溶性タンパク質を被覆するようになるか、あるいは、水溶性タンパク質がリン酸カルシウムを核としてその周囲に集合して、リン酸カルシムを被覆するようになり、タンパク質−リン酸カルシウム複合体が有効に形成されるものと推測される。
【００５４】
また、水溶性タンパク質含有溶液中の水溶性タンパク質をマイナスに帯電させる場合、リン酸基イオンによりマイナスに帯電させることが好ましい。リン酸基イオンを配置させると、リン酸カルシウムとの親和性により、タンパク質−リン酸カルシウム複合体をさらに確実に生成させることができる。
【００５５】
水溶性タンパク質をマイナスに帯電させる方法としては、たとえば、リン酸溶液など陰イオン含有溶液にＦＧＦ−２などの水溶性タンパク質を溶解させればよい。
【００５６】
リン酸溶液としては、たとえば、ＰＢＳ（ＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４および水）と呼ばれるリン酸バッファー溶液を用いることができる。また、たとえば、ＦＧＦ−２をＰＢＳに溶解させる場合ｐＨ７．３〜７．６５の範囲にあることが好ましい。
【００５７】
この場合、たとえばＦＧＦ−２粒子の周囲にリン酸基イオンなどの陰イオンが配置され、リン酸基イオンの持つ強い負電荷のため、ＦＧＦ−２粒子はマイナスに帯電する。
【００５８】
更に、リン酸基イオン含有溶液中でも塩濃度、トリスなどバッファーの濃度、水溶性タンパク質濃度を適宜調整させることにより、水溶性タンパク質の沈殿、平均粒子径を制御できることができる。
【００５９】
リン酸カルシウムおよびリン酸カルシウム含有溶液
本発明においてリン酸カルシウムとは、カルシウムのリン酸塩を意味し、いわゆる第二リン酸カルシウム二水塩、アモルファスリン酸カルシウム、八リン酸カルシウム、アパタイトなどを含む。
【００６０】
このような本発明で用いるリン酸カルシウムは、準安定リン酸カルシウムと安定リン酸カルシウムとに区分することができる。準安定リン酸カルシウムとは、溶液中に溶解しているリン酸カルシウムが固体として析出した後、化学組成が経時変化するリン酸カルシウム（たとえば、Ｃａ３（ＰＯ４）２・ｎＨ２Ｏ→Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）であり、安定リン酸カルシウムとは、析出した後、化学組成が経時変化しないリン酸カルシウムである。
【００６１】
具体的には、常温中性付近の水溶液において、準安定リン酸カルシウムとしては、第二リン酸カルシウム二水塩（ＣａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ）、八リン酸カルシウム（化学式： Ｃａ８（ＨＰＯ４）２（ＰＯ４）４・５Ｈ２Ｏ）、アモルファスリン酸カルシウム（平均化学組成：Ｃａ３（ＰＯ４）２・ｎＨ２Ｏ）が挙げられる。安定リン酸カルシウムとしては、アパタイトが挙げられる。このうちアパタイトが好ましい。アパタイトとしては、水酸アパタイト、炭酸基置換水酸アパタイト、炭酸アパタイトが挙げられる。
【００６２】
このように、リン酸カルシウムには各種の態様が存在する。これらは溶解度が異なるが、中性付近の溶液で最も安定な物質はアパタイトであり、準安定リン酸カルシウムは、析出する際あるいは析出後、経時的にアパタイトに相転移する性質を有する。
【００６３】
本発明では、このようなリン酸カルシウムを水溶液に溶解させたリン酸カルシウム含有溶液を用いる。リン酸カルシウム含有溶液は、不飽和であっても飽和であってもよいが、過飽和リン酸カルシウム溶液であることが好ましい。本発明で定義する過飽和リン酸カルシウム溶液とは、上記いずれか一種類以上のリン酸カルシウムに過飽和な溶液を指す。過飽和リン酸カルシウム溶液を用いることにより、目的とするタンパク質−リン酸カルシウム複合体が容易に析出するという利点がある。
【００６４】
過飽和リン酸カルシウム溶液は、カルシウムイオン及びリン酸基イオンを含有している。このような過飽和リン酸カルシウム溶液を、３７℃以下の常温に置いてリン酸カルシウムを析出させる場合、通常、第二リン酸カルシウム二水塩（以下「ＤＣＰＤ」と略する場合がある）、アモルファスリン酸カルシウム（以下「ＡＣＰ」と略する場合がある）、八リン酸カルシウム（以下「ＯＣＰ」と略する場合がある）、アパタイトが単独あるいは混合物として析出する。
【００６５】
本発明に係るタンパク質−リン酸カルシウム複合体の形成で用いる水溶性タンパク質の量は、リン酸カルシウムに対して任意の量にすることができ限定されない。たとえば、使用量は、リン酸カルシウムに対して、好ましくは０．０１〜９９．９９質量％、さらに好ましくは０．０１〜７０質量％、特に好ましくは０．０１〜５０質量％の範囲にあればよい。
本発明に係るタンパク質−リン酸カルシウム複合体の形成で用いるリン酸カルシウムの量は、水溶性タンパク質に対して任意の量にすることができ限定されない。たとえば、使用量は、水溶性タンパク質に対して、好ましくは０．０１〜９９．９９質量％、さらに好ましくは３０〜９９．９９質量％、特に好ましくは５０〜９９．９９質量％の範囲にあればよい。
【００６６】
このようなリン酸カルシウム含有溶液は、必要に応じ、各種の塩を含有させることができる。このような塩としては、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩が挙げられ、アルカリ金属塩としては塩化ナトリウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。またアルカリ土類金属としては塩化カルシウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。
本発明では、リン酸カルシウム含有溶液に含まれる前記塩化ナトリウムなどの塩濃度、カルシウムイオン濃度、リン酸イオン濃度を適宜調整することにより、後述するタンパク質−リン酸カルシウム複合体の生成における該複合体の沈殿時間を制御することができる。
【００６７】
また沈殿時間の制御により、複合体に含まれる水溶性タンパク質の含有量を調整することができる。
【００６８】
タンパク質−リン酸カルシウム複合体およびその製造方法
本発明に係るタンパク質−リン酸カルシウム複合体の製造方法は、
水溶性タンパク質１分子および／または水溶性タンパク質会合体からなる水溶性タンパク質を、水溶液中に実質的に沈殿しない状態で含有する水溶性タンパク質含有溶液を調製する工程、
前記水溶性タンパク質含有溶液に、リン酸カルシウム含有溶液を添加して、タンパク質−リン酸カルシウム複合体を析出させる工程を含んでいる。
【００６９】
このようなタンパク質−リン酸カルシウム複合体の形成には、前記水溶性タンパク質含有溶液と、リン酸カルシウム含有溶液を接触させればよい。これによりタンパク質−リン酸カルシウム複合体を溶液中に析出させて得ることができる。
【００７０】
タンパク質−リン酸カルシウム複合体は、均一核形成または不均一核形成のいずれかの複合体形成パターンにより析出させることが好ましい。
【００７１】
ここで均一核形成とは、溶液中に結晶化の核となる微粒子が多数含まれ、その微粒子を核として微粒子と同一化学組成の結晶あるいは沈殿が３次元的に成長する場合である。
【００７２】
したがって、本発明においては、たとえば、リン酸カルシウムの会合体を核として、リン酸カルシウムが成長して結晶または沈殿を形成し、その成長の過程で、水溶性タンパク質がリン酸カルシウムの結晶または沈殿の隙間空間に入り込むことにより、タンパク質−リン酸カルシウム複合体が形成されて析出する場合があり得る。また、水溶性タンパク質の会合体を核として、水溶性タンパク質が成長し沈殿を形成し、その成長の過程で、リン酸カルシウムが水溶性タンパク質の沈殿の隙間空間に入り込むことにより、タンパク質−リン酸カルシウム複合体が形成されて析出する場合があり得る。
【００７３】
たとえば、リン酸カルシウムの含有濃度が高いかあるいは過飽和状態にある場合には、析出するリン酸カルシウムの沈殿の隙間に水溶性タンパク質が入り込んで、タンパク質−リン酸カルシウム複合体が沈殿すると推測される。
【００７４】
また、不均一核形成とは、結晶または沈殿の形成が異物質により助長される場合である。異物質と結晶核の結合による生成物の粒径が臨界半径を超えると核生成が起こるので、本発明においては、リン酸カルシウムの会合体を核として、水溶性タンパク質が成長し沈殿を形成する場合、または水溶性タンパク質の会合体を核として、リン酸カルシウムが成長し沈殿を形成する場合がある。
【００７５】
このような均一核形成、不均一核形成は、前記過飽和リン酸カルシウム含有溶液により誘起される。
本発明においては、それぞれの溶液の濃度、それぞれの会合体の平均粒子径の組み合わせにより、各種パターンで沈殿を形成させることができる。
【００７６】
本発明では、水溶性タンパク質含有溶液とリン酸カルシウム含有溶液との接触の初期段階は、リン酸カルシウム含有溶液中に準安定リン酸カルシウムを存在させ、経時的に安定リン酸カルシウムに相転移させてタンパク質−リン酸カルシウム複合体の析出を起こさせることが好ましい。
【００７７】
このような相転移は、経時的に自動進行するが、例えば溶液の攪拌や温度上昇により、促進することが可能である。
【００７８】
この場合、準安定リン酸カルシウムから安定リン酸カルシウムに転移する際に、水溶性タンパク質が安定リン酸カルシウムに取り込まれると推測される。このようなリン酸カルシウムの形態変化を利用してタンパク質−リン酸カルシウム複合体を析出させることにより、水溶性タンパク質とリン酸カルシウムとの強固な複合体を効果的に形成させることができる。また、たとえば、相転移により、内部構造の緻密化が起こることが望ましい。
【００７９】
相転移により、特に準安定リン酸カルシウムとしてアモルファスリン酸カルシウムを用いて、安定リン酸カルシウムに相転移させる場合に、タンパク質とリン酸カルシウムとが、特に強固に結合した複合体を得ることができる。
【００８０】
なお本発明者らは、アモルファスリン酸カルシウム会合体が内部に水分を含み、構造が極めてルーズであること、該アモルファスリン酸カルシウムの結晶化の過程で溶液中のリン及びカルシウムを構造中に取り込み、経時的に内部構造を強固なものに変換しながら、最終的には１時間程度でアパタイトに相転移し、リン酸カルシウムが析出することを見出しているが（Ｋ．Ｏｎｕｍａら著、”Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ−ａｎｇｌｅ ｌａｓｅｒ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ”、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｂ、Ｖｏｌｕｍｅ １０４、Ｉｓｓｕｅ ４５、２０００年、１０５６３−１０５６８頁）、アモルファスリン酸カルシウムからアパタイトへの相転移に併せて、リン酸カルシウムの構成成分と異なる成分が取り込まれるのか、さらにタンパク質といった巨大分子が取り込まれるのかについては、これまで何ら開示はない。
【００８１】
このようなリン酸カルシウムの相転移を利用する複合体の形成においても、水溶性タンパク質をマイナスに帯電、特にリン酸基イオンによりマイナスに帯電させた水溶性タンパク質を含有する水溶性タンパク質含有溶液を用いることにより、たとえば、アモルファスリン酸カルシウムからアパタイトへの相転移に伴って水溶性タンパク質がリン酸カルシウム中により確実に取り込まれ、しかも水溶性タンパク質の周囲のリン酸基が引き金となって水溶性タンパク質とリン酸カルシウムとの強固な結合を形成させ、複合体を得ることができる。
【００８２】
このようにして得られるタンパク質−リン酸カルシウム複合体における、タンパク質由来成分とリン酸カルシウム由来成分との含有割合は、用途により異なり限定されないが、含有割合は、たとえば、タンパク質由来成分が、リン酸カルシウム由来成分に対して、好ましくは０．０１〜９９．９９質量％、さらに好ましくは０．０１〜７０質量％、特に好ましくは０．０１〜５０質量％の範囲にあることが望ましい。また、リン酸カルシウム由来成分が、タンパク質由来成分に対して、好ましくは０．０１〜９９．９９質量％、さらに好ましくは３０〜９９．９９質量％、特に好ましくは５０〜９９．９９質量％の範囲にあることが望ましい。
【００８３】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。
【００８４】
【調製例１】
ＦＧＦ−２（商品名（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＦＧＦ ｂａｓｉｃ）、大日本製薬株式会社製）溶液１２．５ｍｇ／Ｌ（ＦＧＦ−２含有溶液１Ｌに換算したＦＧＦ−２の使用量。以下同じ。）を、生化学分野で最も標準的なバッファーであるトリスアミノメタン（商品名（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ株式会社製、以下「トリス」と略する。）５ｍＭ（ＦＧＦ−２含有溶液１Ｌに換算したトリスの使用量。以下同じ。））（ｐＨ７．４）に溶解した。２５℃で溶液を撹拌しながら、溶液中のＦＧＦ−２会合体の平均粒子径及びその経時変化を、動的光散乱法により測定した。
【００８５】
水溶液中のＦＧＦ−２会合体は、平均粒子半径が７５〜１００ｎｍであった。この会合体は安定に存在し、２４時間経過後もその平均粒子半径に変化は生じなかった。また、溶液中にＦＧＦ−２会合体の沈殿は生じなかった。
結果を表１に示す。また、撹拌開始から２時間後までの平均粒子半径の変化を図１に示す。
【００８６】
【調製例２】
調製例１において、ＦＧＦ−２を１２．５ｍｇ／Ｌ用いる代わりに、ＦＧＦ−２を７５ｍｇ／Ｌ用いた以外は、調製例１と同様にして、ＦＧＦ−２会合体を調製し、その平均粒子径およびその経時変化を動的光散乱法により測定した。
【００８７】
水溶液中のＦＧＦ−２会合体は、平均粒子半径が７５〜１００ｎｍであった。この会合体は安定に存在し、２４時間経過後もその平均粒子半径に変化は生じなかった。また、溶液中にＦＧＦ−２会合体の沈殿は生じなかった。
なお、調製例１〜２の条件の下では、ＦＧＦ−２の使用量が１２．５〜７５ｍｇ／Ｌの範囲では、会合体の平均粒子半径に顕著な相違は生じなかった。
結果を表１に示す。
【００８８】
【調製例３】
調製例１において、ＦＧＦ−２を１２．５ｍｇ／Ｌ用いる代わりに、ＦＧＦ−２を１５０ｍｇ／Ｌ用いた以外は、調製例１と同様にして、ＦＧＦ−２会合体を調製し、その平均粒子径およびその経時変化を動的光散乱法により測定した。
【００８９】
水溶液中のＦＧＦ−２会合体は、平均粒子半径が経時的に増大し、撹拌当初１００ｎｍであったものが、６時間程度経過後に約４００ｎｍとなった。また、溶液中にＦＧＦ−２会合体の沈殿は生じなかった。
結果を表１に示す。また、撹拌開始から６時間後までの平均粒子半径の変化を図２に示す。
【００９０】
【調製例４】
調製例１において、ＮａＣｌ水溶液を１５０ｍＭ（ＦＧＦ−２含有溶液１Ｌに換算したＮａＣｌの使用量。以下同じ。）を添加した以外は、調製例１と同様にして、ＦＧＦ−２会合体を調製し、その平均粒子径およびその経時変化を動的光散乱法により測定した。
【００９１】
水溶液中のＦＧＦ−２会合体は、平均粒子半径がほぼ２００ｎｍであった。この会合体は安定に存在し、２４時間経過後もその平均粒子半径に変化は生じなかった。また、溶液中にＦＧＦ−２会合体の沈殿は生じなかった。
結果を表１に示す。また、撹拌開始から７時間後までの平均粒子半径の変化を図３に示す。
【００９２】
【調製例５】
調製例４において、ＦＧＦ−２を１２．５ｍｇ／Ｌ用いる代わりに、ＦＧＦ−２を２５ｍｇ／Ｌ用いた以外は、調製例４と同様にして、ＦＧＦ−２会合体を調製し、その平均粒子径およびその経時変化を動的光散乱法により測定した。
【００９３】
水溶液中のＦＧＦ−２会合体は、平均粒子半径がほぼ３００ｎｍであった。この会合体は安定に存在し、２４時間経過後もその平均粒子半径に変化は生じなかった。また、溶液中にＦＧＦ−２会合体の沈殿は生じなかった。
結果を表１に示す。
【００９４】
【比較調製例１】
調製例４において、ＦＧＦ−２を１２．５ｍｇ／Ｌ用いる代わりに、ＦＧＦ−２を７５ｍｇ／Ｌ用いた以外は、調製例４と同様にして、ＦＧＦ−２会合体を調製し、その平均粒子径およびその経時変化を動的光散乱法により測定した。
【００９５】
水溶液中のＦＧＦ−２会合体は、平均粒子半径が経時的に増大し、撹拌当初６００ｎｍであったものが、１．５時間程度経過後に約１５００ｎｍとなった。また、溶液中にＦＧＦ−２会合体の沈殿が生じた。
結果を表１に示す。
なお、調製例４、５、比較調製例１において、ＦＧＦ−２の使用量の増大とともに、会合体の平均粒子半径が増大することが確認された。
【００９６】
【調製例６】
調製例１において、トリスを５ｍＭ用いる代わりに、トリスを０．５ｍＭ用い、さらにＮａＣｌ水溶液を１５ｍＭ添加した以外は、調製例１と同様にして、ＦＧＦ−２会合体を調製し、その平均粒子径およびその経時変化を動的光散乱法により測定した。
【００９７】
水溶液中のＦＧＦ−２会合体は、平均粒子半径が４０〜７０ｎｍであった。この会合体は安定に存在し、２４時間経過後もその平均粒子半径に大きな変化は生じなかった。また、溶液中にＦＧＦ−２会合体の沈殿は生じなかった。
結果を表２に示す。また、撹拌開始から８時間後までの平均粒子半径の変化を図４に示す。
【００９８】
【調製例７】
調製例６において、ＦＧＦ−２を１２．５ｍｇ／Ｌ用いる代わりに、ＦＧＦ−２を５０ｍｇ／Ｌ用いた以外は、調製例６と同様にして、ＦＧＦ−２会合体を調製し、その平均粒子径およびその経時変化を動的光散乱法により測定した。
【００９９】
水溶液中のＦＧＦ−２会合体は、平均粒子半径がほぼ８０ｎｍであった。この会合体は安定に存在し、２４時間経過後もその平均粒子半径に変化は生じなかった。また、溶液中にＦＧＦ−２会合体の沈殿は生じなかった。
結果を表２に示す。
【０１００】
【調製例８】
調製例６において、ＦＧＦ−２を１２．５ｍｇ／Ｌ用いる代わりに、ＦＧＦ−２を７５ｍｇ／Ｌ用いた以外は、調製例６と同様にして、ＦＧＦ−２会合体を調製し、その平均粒子径およびその経時変化を動的光散乱法により測定した。
【０１０１】
水溶液中のＦＧＦ−２会合体は、平均粒子半径が経時的に増大し、撹拌当初１００ｎｍ程度であったものが、６時間程度経過後に約５００ｎｍとなった。また、溶液中にＦＧＦ−２会合体の沈殿は生じなかった。
結果を表２に示す。また、撹拌開始から１０時間後までの平均粒子半径の変化を図５に示す。
なお、調製例６〜８において、ＦＧＦ−２の使用量の増大とともに、会合体の平均粒子半径も増大することが確認された。
【０１０２】
【調製例９】
ＦＧＦ−２（商品名（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＦＧＦ ｂａｓｉｃ）、大日本製薬株式会社製）溶液３３０ｍｇ／Ｌを、トリス（商品名（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ株式会社製。）５ｍＭ（ｐＨ７．２）に溶解した。溶解後、４℃の温度で、撹拌速度約３回転／毎分で１週間撹拌した。撹拌期間中の溶液中のＦＧＦ−２会合体の平均粒子径及びその経時変化を、動的光散乱法により測定した。
【０１０３】
水溶液中のＦＧＦ−２会合体は、平均粒子半径が３．２ｎｍであり、ＦＧＦ−２の二量体または三量体に相当する会合体が形成されていることが確認できた（単分子の半径は約１．５ｎｍである。）。この会合体は１週間以上安定に存在し、平均粒子半径に変化は生じなかった。また、溶液中にＦＧＦ−２会合体の沈殿は生じなかった。
結果を表２に示す。また、ＦＧＦ−２溶液の緩和時間と、散乱ベクトルの関係を図６に示す。
【０１０４】
【調製例１０】
ＦＧＦ−２（商品名（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＦＧＦ ｂａｓｉｃ）、大日本株式会社製）溶液１２．５ｍｇ／Ｌを、リン酸バッファー（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ， ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ， Ｎａ２ＨＰＯ４：１．１５ｇ／Ｌ， ＫＨ２ＰＯ４：０．２ｇ／Ｌ， 以下「ＰＢＳ」という。）２ｍＭ（ＦＧＦ−２含有溶液１Ｌに換算したＰＯ４ ３ −の使用量。以下同じ。）（ｐＨ７．４）に溶解した。２５℃で溶液を撹拌しながら、溶液中のＦＧＦ−２会合体の平均粒子径及びその経時変化を、動的光散乱法により測定した。
【０１０５】
水溶液中のＦＧＦ−２会合体は、平均粒子半径が１２０ｎｍであった。この会合体は安定に存在し、２４時間経過後もその平均粒子半径に変化は生じなかった。また、溶液中にＦＧＦ−２会合体の沈殿は生じなかった。
結果を表２に示す。また、撹拌開始から３時間後までの平均粒子半径の変化を図７に示す。
【０１０６】
【調製例１１】
調製例１０において、ＦＧＦ−２を１２．５ｍｇ／Ｌ用いる代わりに、ＦＧＦ−２を２５ｍｇ／Ｌ用いた以外は、調製例１０と同様にして、ＦＧＦ−２会合体を調製し、その平均粒子径およびその経時変化を動的光散乱法により測定した。
【０１０７】
水溶液中のＦＧＦ−２会合体は、平均粒子半径が経時的に増大し、撹拌開始後３０分で約２３０ｎｍであったものが、２．５時間程度経過後に約５５０ｎｍとなった。また、溶液中にＦＧＦ−２会合体の沈殿は生じなかった。
結果を表２に示す。また、撹拌開始から３時間後までの平均粒子半径の変化を図８に示す。
【０１０８】
【調製例１２】
調製例１において、さらに、リン酸（Ｎａ２ＨＰＯ４：１．１５ｇ／Ｌ， ＫＨ２ＰＯ４：０．２ｇ／Ｌ）２ｍＭを添加した以外は、調製例１と同様にして、ＦＧＦ−２会合体を調製し、その平均粒子径およびその経時変化を動的光散乱法により測定した。
【０１０９】
水溶液中のＦＧＦ−２会合体は、調製例１と同様に、平均粒子半径が７５〜１００ｎｍであった。この会合体は安定に存在し、２４時間経過後もその平均粒子半径に変化は生じなかった。また、溶液中にＦＧＦ−２会合体の沈殿は生じなかった。
【０１１０】
また、このＦＧＦ−２会合体の表面電位をゼータ電位測定方法、別名電気泳動光散乱方法によって測定したところ、−２３．７８ｍＶとマイナスに帯電していることが確認された。その結果を表２に示す。また、表面電位測定のグラフを図９に示す。
【０１１１】
【実施例１】
塩化カルシウム２．５ｍＭ（リン酸カルシウム含有溶液１Ｌに換算した塩化カルシウムの使用量。以下同じ。）、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）１ｍＭ（リン酸カルシウム含有溶液１Ｌに換算したリン酸の使用量。以下同じ。）を混合し、ｐＨが７．４となるようにＫＯＨ水溶液で調整し、リン酸カルシウム含有溶液を調製した。
【０１１２】
これに、調製例１０で調製したＦＧＦ−２含有溶液を、ＦＧＦ−２とリン酸カルシウム溶液とが等体積となるように混合した。
２５℃で１分間撹拌し、静置したところ、ＦＧＦ−２とリン酸カルシウム（アパタイト）複合体が析出した。
析出後に混合溶液中のＦＧＦ−２濃度を比色法により定量し、ＦＧＦ−２の濃度が析出前の約１／６に減少していることを確認した。すなわち、ＦＧＦ−２の総量の５／６が複合体に取り込まれたことが確認された。
【０１１３】
得られたＦＧＦ−２とリン酸カルシウム複合体のＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）写真（写真中のスケールバーが１ミクロン）を図１１に示す。
【０１１４】
【比較例１】塩化カルシウム２．５ｍＭ、リン酸（形態：Ｈ３ＰＯ４）１ｍＭを混合し、ｐＨが７．４となるようにＫＯＨ水溶液で調整し、リン酸カルシウム含有溶液を調製した。
この溶液を静置して、アパタイトを析出させた。
得られたアパタイト結晶のＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）写真（写真中のスケールバーが１ミクロン）を図１０に示す。
【０１１５】
図１０から、アパタイトのみを析出させた場合、アパタイト特有の鱗状析出物１が生じている。一方、図１１から、ＦＧＦ−２とリン酸カルシウム複合体の析出物には、直方体状のＦＧＦ−２粒子２が含有されている様子が明瞭に判別できる。
なお、析出物周囲の構造体はフィルター表面である。
【０１１６】
【表１】
【表２】
【発明の効果】
本発明に係るタンパク質−リン酸カルシウム複合体は、水溶性タンパク質が分子または会合体で、リン酸カルシウムと複合体を形成しているので、これを骨形成材料として用いると、体内における当該水溶性タンパク質の適切な徐放性を保ちながら、材料自体による骨形成、および骨形成促進を有効に行うことができる。
【０１１９】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＦＧＦ−２が１２．５ｍｇ／Ｌ、トリス５ｍＭ、ｐＨ７．４、２５℃の溶液中におけるＦＧＦ−２の粒子半径及びその時間変化を示すグラフである。
【図２】図２は、ＦＧＦ−２が１５０ｍｇ／Ｌ、トリス５ｍＭ、ｐＨ７．４、２５℃の溶液中におけるＦＧＦ−２の粒子半径及びその時間変化を示すグラフである。
【図３】図３は、ＦＧＦ−２が１２．５ｍｇ／Ｌ、トリス５ｍＭ、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、ｐＨ７．４、２５℃の溶液中におけるＦＧＦ−２の粒子半径及びその時間変化を示すグラフである。
【図４】図４は、ＦＧＦ−２が１２．５ｍｇ／Ｌ、トリス０．５ｍＭ、ＮａＣｌ １５ｍＭ、ｐＨ７．４、２５℃の溶液中におけるＦＧＦ−２の粒子半径及びその時間変化を示すグラフである。
【図５】図５は、ＦＧＦ−２が７５ｍｇ／Ｌ、トリス０．５ｍＭ、ＮａＣｌ １５ｍＭ、ｐＨ７．４、２５℃の溶液中におけるＦＧＦ−２の粒子半径及びその時間変化を示すグラフである。
【図６】図６は、ＦＧＦ−２が３３０ｍｇ／Ｌ、トリス５ｍＭ、ｐＨ７．２、４℃で一週間攪拌した２５度溶液中におけるＦＧＦ−２溶液の緩和時間と散乱ベクトルの関係図である。図の直線の傾きからＦＧＦ−２の半径は３．２ｎｍと計算される。
【図７】図７は、ＦＧＦ−２が１２．５ｍｇ／Ｌ、ＰＢＳ溶液、平均ｐＨ７．４、２５℃におけるＦＧＦ−２の粒子半径及びその時間変化を示すグラフである。
【図８】図８は、ＦＧＦ−２が２５ｍｇ／Ｌ、ＰＢＳ溶液、平均ｐＨ７．４、２５℃におけるＦＧＦ−２の粒子半径及びその時間変化を示すグラフである。
【図９】図９は、ＦＧＦ−２が１２．５ｍｇ／Ｌ、トリス５ｍＭ、リン酸２ｍＭ、ｐＨ７．４、２５℃の溶液におけるＦＧＦ−２会合体の表面電位を示すグラフである。
【図１０】図１０は、Ａ：塩化カルシウム２．５ｍＭ、リン酸１ｍＭ、ｐＨ７．４の溶液から析出したアパタイトのＳＥＭ写真である。
【図１１】図１１は、図１０のＡ溶液に、ＦＧＦ−２を１２．５ｍｇ／Ｌの量でＰＢＳバッファーに溶解した溶液を等体積混合した溶液より析出したＦＧＦ−２とアパタイトの複合体のＳＥＭ写真である。
【符号の説明】
１ アパタイト
２ ＦＧＦ−２粒子[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a protein-calcium phosphate complex in which a water-soluble protein and calcium phosphate are complexed, and a method for producing the same. More specifically, the present invention relates to a protein-calcium phosphate complex capable of providing a new bone formation method by promoting bone formation by sustained release of a water-soluble protein and inverting calcium phosphate itself, and a method for producing the same.
[0002]
[Prior art]
With the advent of a super-aging society, an increase in bone diseases represented by osteoporosis has become a major social problem. Conventionally, calcium phosphate containing apatite, which is a representative of inorganic bone components, has been used as a bone substitute material for treating bone defects or complicated fractures. Calcium phosphate (particularly apatite) has the property of replacing bone over time in the body. For such so-called surgical treatments, medical attempts have been made to promote bone formation at the cellular level using organic drugs (eg, proteins). Representative drugs include BMP-2 called growth factor or fibroblast growth factor family (FGF). These proteins perform angiogenesis essential for bone formation in the human body and promote bone growth to assist bone formation.
[0003]
In the case of bone formation treatment using a drug, it is necessary to release the drug at the target site over a long period of time. Therefore, conventionally, a method has been adopted in which a drug is carried on a gel or a polymer and transported to a bone defect site (
[0004]
On the other hand, in recent years, the concept of a so-called third-generation biomaterial in which the material itself has an osteogenic ability has been proposed. For example, a bone substitute material obtained by mixing zinc with a conventionally used calcium phosphate bone substitute material is known (Patent Document 5).
[0005]
In addition, there is a report example in which FGF-2 was mixed into a solution containing apatite to form a precipitate containing apatite.However, no confirmation was made on the form of the precipitate of apatite, and the precipitate was any compound. It is unknown what. Further, there is no description about the precipitation conditions of the precipitates. (Non-Patent Document 1)
[0006]
[Patent Document 1]
US 6,410,645
[Patent Document 2]
JP 2000-178180 A
[Patent Document 3]
JP 2001-122800 A
[Patent Document 4]
JP 2001-131806 A
[Patent Document 5]
Patent No. 3143660
[Non-patent document 1]
V. Midy et al., "Basic fibroblast growth factor adsorption and release properties of calcium phosphate", Journal of Biomedical, Vol. 41, 1998, Vol. 41, 1999.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made in view of such a situation, and a bone capable of promoting bone formation of the material itself and promoting bone formation in the body while controlling the release period of the organic bone growth factor. It is intended to provide a forming material.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies to solve the above-described problems, and present a water-soluble protein as a single molecule or an aggregate in a solution in the form of fine particles without precipitation. It was found that a water-soluble protein and calcium phosphate can form a complex when mixed with water. When such a protein-calcium phosphate complex is used as an osteogenic material, bone formation by the material itself and osteogenesis by the water-soluble protein are maintained in the body while maintaining appropriate sustained release of the water-soluble protein from the complex. They have found that it can be promoted, and have completed the present invention.
That is, the outline of the present invention is as follows.
[0009]
The method for producing a protein-calcium phosphate complex according to the present invention comprises a water-soluble protein containing a water-soluble protein monomolecule and / or a water-soluble protein aggregate in a state where the protein is not substantially precipitated in an aqueous solution. Preparing a solution; and
A step of adding a calcium phosphate-containing solution to the water-soluble protein-containing solution to precipitate a protein-calcium phosphate complex.
[0010]
The average particle size of the water-soluble protein aggregate is preferably in the range of 1 μm or less.
[0011]
The calcium phosphate-containing solution is preferably a supersaturated calcium phosphate-containing solution.
[0012]
Preferably, the surface of the water-soluble protein is negatively charged.
[0013]
It is preferable that the surface of the water-soluble protein is negatively charged by a phosphate ion.
[0014]
The calcium phosphate includes metastable calcium phosphate, and the metastable calcium phosphate can be phase-transferred to stable calcium phosphate to form a protein-calcium phosphate complex.
[0015]
The water-soluble protein is preferably an osteogenesis promoting substance.
[0016]
The protein-calcium phosphate complex according to the present invention contains a water-soluble protein having an average particle size of 1 μm or less, and calcium phosphate.
[0017]
The water-soluble protein is preferably an osteogenesis promoting substance.
[0018]
The calcium phosphate is preferably a stable calcium phosphate.
[0019]
DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS
The present invention provides a step of preparing a water-soluble protein-containing solution containing a water-soluble protein composed of one molecule of a water-soluble protein and / or a water-soluble protein aggregate in a state where the water-soluble protein is not substantially precipitated in an aqueous solution. Provided are a method for producing a protein-calcium phosphate complex and a protein-calcium phosphate complex, the method including a step of adding a solution containing calcium phosphate to a solution containing protein to precipitate a protein-calcium phosphate complex.
[0020]
Hereinafter, the water-soluble protein, calcium phosphate, the method for producing the protein-calcium phosphate complex, and the protein-calcium phosphate complex will be described in detail.
[0021]
Water-soluble proteins and solutions containing water-soluble proteins
Examples of the water-soluble protein that can be used in the present invention include a bone formation promoting substance that can promote bone formation in the body. An osteogenesis promoting substance is a substance that promotes angiogenesis necessary for bone formation in the human body and promotes cell proliferation to assist bone formation. Such a water-soluble protein is not particularly limited, and examples thereof include BMP-2 called a growth factor, fibroblast growth factor family (FGF), and IGFβ. Among these, basic fibroblast growth factor (FGF-2) is preferably used.
[0022]
The water-soluble protein used in the present invention is a single molecule of the water-soluble protein and / or a water-soluble protein complex.
[0023]
The water-soluble protein-containing solution used in the present invention is a solution in which this water-soluble protein is present in an aqueous solution without being substantially precipitated. The term “substantially no precipitation” refers to a state in which precipitation of water-soluble protein is not visually observed in an aqueous solution, and more preferably, the particle size of the water-soluble protein in the initial solution is extremely large over time by the light scattering method in this study. Or a state where the concentration of the water-soluble protein in the initial solution does not change with time can be confirmed by an appropriate method (for example, spectroscopy). When the water-soluble protein exists as a single molecule, precipitation does not usually occur in an aqueous solution. Therefore, the water-soluble protein aggregate is present in a state where it is not substantially precipitated.
[0024]
When the water-soluble protein-containing solution in such a state is brought into contact with a calcium phosphate-containing solution, a complex containing water-soluble protein particles and calcium phosphate can be formed. On the other hand, when the water-soluble protein precipitates, a protein-calcium phosphate complex cannot be effectively formed.
[0025]
Various buffers can be used as the aqueous solution of the water-soluble protein-containing solution that can be used in the present invention. Examples of the buffer include a buffer containing trisaminomethane (hereinafter referred to as “Tris”), HEPES (Hepes) and the like.
[0026]
In addition, a salt such as a metal salt can be added to the water-soluble protein-containing solution used in the present invention, if necessary. As the metal salt, an alkali metal halide, an alkaline earth metal halide and the like can be preferably used. Examples of the alkali metal halide include sodium chloride and potassium chloride. Examples of the alkaline earth metal halide include calcium chloride and magnesium chloride.
[0027]
Among them, sodium chloride and potassium chloride can be preferably used.
[0028]
It is desirable that the average particle size of the water-soluble protein aggregate is preferably 1 μm or less, more preferably 600 μm or less. The minimum value of the average particle diameter of the water-soluble protein aggregate is the average particle diameter in a state where two protein molecules are associated. When the average particle size of the aggregate of the water-soluble protein is in the above range, the water-soluble protein usually hardly precipitates or does not precipitate.
[0029]
By controlling the average particle size of such a water-soluble protein, it is possible to adjust the sustained release time of the water-soluble protein when the protein-calcium phosphate complex according to the present invention is used for bone formation. For example, when the average particle size of a water-soluble protein in an aqueous solution is reduced to near a single molecular size (in the case of FGF-2, the radius is 1.5 nm), dispersed in an aqueous solution, and complexed with calcium phosphate, The extended release time of the sex protein can be set to be extremely long.
[0030]
Dispersion of such a water-soluble protein in an aqueous solution using ultrafine particles can be performed by adjusting the pH of a buffer for dissolving the water-soluble protein and the stirring time during the dissolution.
[0031]
For example, when FGF-2 is used and Tris (5 mM) is used as a buffer, (1) FGF-2 is dissolved in Tris at a pH of 7.0 to 7.2, and (2) after dissolution, using a vortex mixer or the like. The mixture is rapidly mixed for 1 minute or more and less than 3 minutes, or the temperature is set to about 4 ° C. and the stirring speed is set to about 3 revolutions / minute, and the mixture is stirred for a long time of about 1 week. (3) In this case, the concentration of FGF-2 is preferably 100 mg / L or more. The FGF-2 containing solution thus obtained can contain FGF-2 particles corresponding to a dimer or trimer of FGF-2. The particle size of such FGF-2 particles is substantially unchanged over a long period of time, for example, it is stably dispersed for one week or more and does not precipitate.
[0032]
In the water-soluble protein-containing solution used in the present invention, it is preferable that the water-soluble protein does not precipitate, and that the average particle size of the water-soluble protein is substantially constant for a certain period of time. The certain period of time is at least between the time when the water-soluble protein-containing solution is prepared and the time when it is brought into contact with the calcium phosphate-containing solution, and usually after the preparation of the water-soluble protein-containing solution, preferably about 24 hours, more preferably about 3 hours. It is desirable that the average particle size be kept constant during about the time.
[0033]
If the average particle size is constant until contact with the calcium phosphate-containing solution, the average particle size of the water-soluble protein incorporated into the protein-calcium phosphate complex becomes a constant particle size, so that the sustained release period, Accuracy can be improved.
[0034]
Note that the average particle diameter is constant over a certain period of time means that, for example, when the average particle diameter is plotted on the vertical axis and time is plotted on the horizontal axis, the negative time of the straight line obtained by the least square method (the horizontal axis is negative) It is preferable that the straight line is substantially parallel to the horizontal axis (that is, the particle diameter does not change).
[0035]
In the present invention, the concentration of the buffer for dissolving the water-soluble protein, the concentration of the water-soluble protein, or the concentration of the salt added as necessary to the water-soluble protein, the pH, the stirring time during dissolution, the temperature, etc. are appropriately adjusted. Alternatively, the water-soluble protein can be prevented from precipitating in the aqueous solution. In addition, the average particle size of the water-soluble protein aggregate can be arbitrarily adjusted.
[0036]
Since the average particle size of the water-soluble protein aggregate varies depending on the use of the protein-calcium phosphate complex, the concentration of the buffer, the concentration of the water-soluble protein, the concentration of the salt, and the like are not limited. The concentration of Tris in 1 L of the water-soluble protein-containing solution is preferably 0.05 to 100 mM (mmol / L; the same applies hereinafter), and more preferably 0.1 to 50 mM.
[0037]
When a salt is added, the salt concentration is not limited by the concentration of Tris or the like in the buffer, the concentration of the water-soluble protein, and the like. For example, the salt concentration in 1 L of the water-soluble protein-containing solution is preferably 0.1 to 500 mM, and more preferably 0.1 to 500 mM. Preferably, it may be in the range of 1 to 200 mM.
[0038]
Furthermore, the content of the water-soluble protein in the solution is not limited by the type of the water-soluble protein, the concentration of Tris used, and the like. For example, the concentration of the water-soluble protein in 1 L of the water-soluble protein-containing solution is preferably 0.01 2,000 mg / L, more preferably 0.1-1000 mg / L.
[0039]
The average particle size of the water-soluble protein can be measured by a light scattering method. As the light scattering method, a dynamic light scattering method and a static light scattering method can be adopted.
[0040]
Specifically, for example, the dispersion state of a water-soluble protein in a solution is measured in detail by a dynamic light scattering method, and how the variation in the chemical composition of the solution affects the size and association state of the water-soluble protein is measured. can do.
[0041]
The following is a brief description of the dynamic light scattering method.
[0042]
Assuming that the intensity of scattered light from particles in the solution (in this case, FGF-2 as a water-soluble protein) is I, the following autocorrelation function is defined with respect to the time change of the intensity of scattered light.
[0043]
(Equation 1)
g2(Q, t) -1 = <I (q, t) I (q, 0)> / <I (q)>2 (Equation 1)
[0044]
In
[0045]
(Equation 2)
g2(Q, t) -1 = [Σan× exp ｛− (1 / τn Xt)β｝]2 (N = 1, 2, 3,...) (Equation 2)
[0046]
The simplest system is a monodisperse (one type of average particle size) system in which the interaction between particles is weak and there is no anisotropy in particle morphology, where n = 1 and β = 1. In a system such as a polymer in which the interaction between particles becomes remarkable, β is not always 1 but can be a value of 1 or less. On the other hand, when particles having different average sizes exist in the solution, the second-order autocorrelation function is the sum of the relaxation times of the particles. That is, n = 1, 2,... When the particles are large and move slowly, the relaxation time is long. Conversely, when the small particles are violently Browning, the relaxation time is short.
[0047]
In actual measurement, what kind of particle group is present in the solution is assumed, and a second-order autocorrelation function is analyzed to obtain a relaxation time of each particle at the scattering angle q. Equation (3) exists between the relaxation time and the diffusion coefficient and scattering angle of the particles.
[0048]
(Equation 3)
1 / τ = q2× D (Equation 3)
[0049]
Here, the scattering angle is changed, and the relaxation time is obtained at each q value, and 1 / τ and q2Is approximated by a straight line passing through the origin, and the translational diffusion coefficient is determined from the slope. Actually, the true diffusion coefficient is defined when the particle concentration is infinitely diluted. However, in this study, since the intermolecular interaction is not examined, the diffusion coefficient obtained with the known FGF-2 concentration is calculated. Use as is. The following relationship is established between the translational diffusion coefficient and the particle diameter (referred to as hydrodynamic radius: r) obtained by such a procedure (Stokes-Einstein equation).
[0051]
(Equation 4)
r = kT / 6πηD (Equation 4)
[0051]
k is the Boltzman constant, T is the absolute temperature of the solution, and η is the viscosity of the solvent.
[0052]
The surface of the water-soluble protein in the water-soluble protein-containing solution used in the present invention is preferably negatively charged. When the surface charge of the water-soluble protein is negatively charged, a complex can be effectively formed by mixing the calcium phosphate solution and the water-soluble protein-containing solution.
[0053]
This is because by controlling the surface charge of the water-soluble protein molecule or the aggregate to minus (negative), electrostatic binding with neutral or weakly positively charged calcium phosphate fine particles in an aqueous solution is promoted. It is presumed. Then, calcium phosphate aggregates around the water-soluble protein and coats the water-soluble protein, or the water-soluble protein aggregates around the calcium phosphate and coats calcium phosphate. It is presumed that the protein-calcium phosphate complex is effectively formed.
[0054]
When the water-soluble protein in the water-soluble protein-containing solution is negatively charged, it is preferable that the water-soluble protein is negatively charged by a phosphate group ion. When a phosphate group ion is disposed, a protein-calcium phosphate complex can be more reliably generated due to affinity with calcium phosphate.
[0055]
As a method for negatively charging the water-soluble protein, for example, a water-soluble protein such as FGF-2 may be dissolved in an anion-containing solution such as a phosphate solution.
[0056]
As the phosphoric acid solution, for example, PBS (NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4And water) can be used. Further, for example, when FGF-2 is dissolved in PBS, the pH is preferably in the range of 7.3 to 7.65.
[0057]
In this case, for example, an anion such as a phosphate group ion is arranged around the FGF-2 particle, and the FGF-2 particle is negatively charged due to the strong negative charge of the phosphate group ion.
[0058]
Further, even in the phosphate group ion-containing solution, the precipitation of the water-soluble protein and the average particle diameter can be controlled by appropriately adjusting the concentration of the salt, the concentration of the buffer such as Tris, and the concentration of the water-soluble protein.
[0059]
Calcium phosphate and calcium phosphate containing solutions
In the present invention, calcium phosphate means calcium phosphate, and includes so-called dicalcium phosphate dihydrate, amorphous calcium phosphate, calcium octaphosphate, apatite and the like.
[0060]
Such calcium phosphate used in the present invention can be classified into metastable calcium phosphate and stable calcium phosphate. Metastable calcium phosphate refers to calcium phosphate whose chemical composition changes over time after calcium phosphate dissolved in a solution precipitates as a solid (for example, Ca3(PO4)2・ NH2O → Ca10(PO4)6(OH)2), And stable calcium phosphate is calcium phosphate whose chemical composition does not change with time after precipitation.
[0061]
Specifically, in an aqueous solution near room temperature and neutrality, as metastable calcium phosphate, dibasic calcium phosphate dihydrate (CaHPO4・ 2H2O), calcium octaphosphate (chemical formula: Ca8(HPO4)2(PO4)4・ 5H2O), amorphous calcium phosphate (average chemical composition: Ca3(PO4)2・ NH2O). Apatite is mentioned as a stable calcium phosphate. Of these, apatite is preferred. Examples of apatite include hydroxyapatite, carbonate-substituted hydroxyapatite, and carbonate apatite.
[0062]
Thus, calcium phosphate has various aspects. Although these have different solubilities, the most stable substance in a solution near neutrality is apatite, and metastable calcium phosphate has a property of undergoing a phase transition to apatite over time during or after precipitation.
[0063]
In the present invention, a calcium phosphate-containing solution in which such calcium phosphate is dissolved in an aqueous solution is used. The calcium phosphate-containing solution may be unsaturated or saturated, but is preferably a supersaturated calcium phosphate solution. The supersaturated calcium phosphate solution defined in the present invention refers to a solution supersaturated with any one or more of the above calcium phosphates. The use of the supersaturated calcium phosphate solution has the advantage that the target protein-calcium phosphate complex is easily precipitated.
[0064]
The supersaturated calcium phosphate solution contains calcium ions and phosphate ions. When calcium phosphate is precipitated by placing such a supersaturated calcium phosphate solution at room temperature of 37 ° C. or lower, usually, dibasic calcium phosphate dihydrate (hereinafter sometimes abbreviated as “DCPD”), amorphous calcium phosphate (hereinafter “ACP”) ), Calcium octaphosphate (hereinafter sometimes abbreviated as “OCP”), and apatite are precipitated alone or as a mixture.
[0065]
The amount of the water-soluble protein used in the formation of the protein-calcium phosphate complex according to the present invention is not limited and can be any amount with respect to calcium phosphate. For example, the amount used is preferably in the range of 0.01 to 99.99% by mass, more preferably 0.01 to 70% by mass, and particularly preferably 0.01 to 50% by mass, based on calcium phosphate. .
The amount of calcium phosphate used in the formation of the protein-calcium phosphate complex according to the present invention can be any amount relative to the water-soluble protein, and is not limited. For example, the amount used is preferably in the range of 0.01 to 99.99% by mass, more preferably 30 to 99.99% by mass, and particularly preferably 50 to 99.99% by mass, based on the water-soluble protein. Just fine.
[0066]
Such a calcium phosphate-containing solution can contain various salts as necessary. Such salts include alkali metal salts and alkaline earth metal salts, and examples of the alkali metal salts include sodium chloride and calcium chloride. Examples of the alkaline earth metal include calcium chloride and magnesium chloride.
In the present invention, by appropriately adjusting the salt concentration of the sodium chloride and the like contained in the calcium phosphate-containing solution, the calcium ion concentration, and the phosphate ion concentration, the precipitation time of the protein-calcium phosphate complex described below can be reduced. Can be controlled.
[0067]
Further, the content of the water-soluble protein contained in the complex can be adjusted by controlling the precipitation time.
[0068]
Protein-calcium phosphate complex and method for producing the same
The method for producing a protein-calcium phosphate complex according to the present invention comprises:
A step of preparing a water-soluble protein-containing solution containing a water-soluble protein consisting of one molecule of a water-soluble protein and / or a water-soluble protein aggregate without substantially precipitating in an aqueous solution;
A step of adding a calcium phosphate-containing solution to the water-soluble protein-containing solution to precipitate a protein-calcium phosphate complex.
[0069]
To form such a protein-calcium phosphate complex, the solution containing the water-soluble protein and the solution containing calcium phosphate may be brought into contact. Thereby, the protein-calcium phosphate complex can be obtained by precipitating in a solution.
[0070]
Preferably, the protein-calcium phosphate complex is precipitated according to either a uniform nucleation or heterogeneous nucleation complex formation pattern.
[0071]
Here, the uniform nucleation is a case where a solution contains a large number of fine particles serving as crystallization nuclei, and crystals or precipitates having the same chemical composition as the fine particles grow three-dimensionally with the fine particles as nuclei.
[0072]
Therefore, in the present invention, for example, calcium phosphate grows with an aggregate of calcium phosphate as a nucleus to form a crystal or a precipitate, and during the growth process, the water-soluble protein enters into the interstitial space of the calcium phosphate crystal or the precipitate. May form and precipitate a protein-calcium phosphate complex. Further, the water-soluble protein grows and forms a precipitate with the aggregate of the water-soluble protein as a nucleus.In the growth process, calcium phosphate enters into the interstitial space of the precipitate of the water-soluble protein, whereby the protein-calcium phosphate complex is formed. It may form and precipitate.
[0073]
For example, when the calcium phosphate content is high or in a supersaturated state, it is presumed that the water-soluble protein enters the gaps between the precipitated calcium phosphate precipitates and precipitates the protein-calcium phosphate complex.
[0074]
Heterogeneous nucleation is the case where the formation of crystals or precipitates is promoted by foreign substances. Since the nucleation occurs when the particle size of the product by the binding of the foreign substance and the crystal nucleus exceeds the critical radius, in the present invention, when the aggregate of calcium phosphate is used as a nucleus, when a water-soluble protein grows and forms a precipitate, Alternatively, calcium phosphate may grow and form a precipitate with an aggregate of a water-soluble protein as a nucleus.
[0075]
Such uniform nucleation and heterogeneous nucleation are induced by the supersaturated calcium phosphate-containing solution.
In the present invention, precipitates can be formed in various patterns depending on the combination of the concentration of each solution and the average particle size of each associated body.
[0076]
In the present invention, the initial stage of the contact between the water-soluble protein-containing solution and the calcium phosphate-containing solution is such that metastable calcium phosphate is present in the calcium phosphate-containing solution, and phase-transfers to stable calcium phosphate over time to precipitate the protein-calcium phosphate complex. Is preferably caused.
[0077]
Such a phase transition automatically proceeds with time, but can be accelerated by, for example, stirring the solution or increasing the temperature.
[0078]
In this case, when transferring from metastable calcium phosphate to stable calcium phosphate, it is presumed that the water-soluble protein is incorporated into stable calcium phosphate. By precipitating a protein-calcium phosphate complex using such a change in the form of calcium phosphate, a strong complex of a water-soluble protein and calcium phosphate can be effectively formed. In addition, for example, it is desirable that the internal structure be densified by a phase transition.
[0079]
In particular, when phase transition is performed to stable calcium phosphate using amorphous calcium phosphate as metastable calcium phosphate by phase transition, a complex in which protein and calcium phosphate are particularly tightly bound can be obtained.
[0080]
Note that the present inventors have found that the amorphous calcium phosphate aggregate contains moisture inside, the structure is extremely loose, and phosphorus and calcium in a solution are incorporated into the structure during the crystallization of the amorphous calcium phosphate, and While transforming the internal structure to a strong one, it has been found that the phase transition to apatite finally occurs in about one hour, and calcium phosphate precipitates (K. Onuma et al., "Precipitation kinetics of hydroxyapatite regenerated by continuous". -Angle laser light scattering technique ", Journal of Physical Chemistry B, Volume 104,
[0081]
Even in the formation of such a complex utilizing the phase transition of calcium phosphate, use of a water-soluble protein-containing solution containing a water-soluble protein negatively charged by a water-soluble protein, particularly negatively charged by a phosphate group ion. Thus, for example, the water-soluble protein is more reliably incorporated into the calcium phosphate due to the phase transition from amorphous calcium phosphate to apatite, and the phosphate groups around the water-soluble protein are triggered to strengthen the water-soluble protein and calcium phosphate. And a complex can be obtained.
[0082]
In the protein-calcium phosphate complex obtained in this manner, the content ratio of the protein-derived component and the calcium phosphate-derived component varies depending on the application and is not limited, but the content ratio is, for example, that the protein-derived component is based on the calcium phosphate-derived component. , Preferably 0.01 to 99.99% by mass, more preferably 0.01 to 70% by mass, particularly preferably 0.01 to 50% by mass. Further, the content of the calcium phosphate-derived component is preferably 0.01 to 99.99% by mass, more preferably 30 to 99.99% by mass, and particularly preferably 50 to 99.99% by mass, based on the protein-derived component. Desirably.
[0083]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
[0084]
[Preparation Example 1]
A solution of 12.5 mg / L of FGF-2 (trade name (Recombinant human FGF basic, manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) (the amount of FGF-2 converted to 1 L of FGF-2 containing solution; the same applies hereinafter) was used as a raw material. Trisaminomethane (trade name (tris (hydroxymethyl) aminomethane), manufactured by Nacalai Tesque Co., Ltd .; hereinafter abbreviated as "Tris"), which is the most standard buffer in the chemical field, 5 mM (in 1 L of FGF-2 containing solution) (The converted amount of Tris, the same applies hereinafter.))) (PH 7.4). While stirring the solution at 25 ° C., the average particle size of the FGF-2 association in the solution and its change with time were measured by a dynamic light scattering method.
[0085]
The average particle radius of the FGF-2 aggregate in the aqueous solution was 75 to 100 nm. This aggregate was stably present, and the average particle radius did not change even after 24 hours. Further, no precipitation of the FGF-2 aggregate occurred in the solution.
Table 1 shows the results. FIG. 1 shows the change in the average particle radius from 2 hours after the start of stirring.
[0086]
[Preparation Example 2]
In Preparation Example 1, an FGF-2 aggregate was prepared in the same manner as in Preparation Example 1, except that 75 mg / L of FGF-2 was used instead of using 12.5 mg / L of FGF-2, and the average particle size thereof was measured. The diameter and its change with time were measured by a dynamic light scattering method.
[0087]
The average particle radius of the FGF-2 aggregate in the aqueous solution was 75 to 100 nm. This aggregate was stably present, and the average particle radius did not change even after 24 hours. Further, no precipitation of the FGF-2 aggregate occurred in the solution.
In addition, under the conditions of Preparation Examples 1 and 2, when the amount of FGF-2 used was in the range of 12.5 to 75 mg / L, there was no significant difference in the average particle radius of the aggregate.
Table 1 shows the results.
[0088]
[Preparation Example 3]
In Preparation Example 1, an FGF-2 aggregate was prepared in the same manner as in Preparation Example 1 except that FGF-2 was used at 150 mg / L instead of using 12.5 mg / L of FGF-2, and the average particle size thereof was determined. The diameter and its change with time were measured by a dynamic light scattering method.
[0089]
The average particle radius of the FGF-2 aggregate in the aqueous solution increased with time, and the average particle diameter was 100 nm at the beginning of the stirring, but became about 400 nm after about 6 hours. Further, no precipitation of the FGF-2 aggregate occurred in the solution.
Table 1 shows the results. FIG. 2 shows the change in the average particle radius from the start of stirring to 6 hours later.
[0090]
[Preparation Example 4]
In Preparation Example 1, an FGF-2 aggregate was prepared in the same manner as in Preparation Example 1, except that 150 mM of NaCl aqueous solution (the amount of NaCl converted to 1 L of FGF-2 containing solution; the same applies hereinafter) was added. , Its average particle size and its change with time were measured by a dynamic light scattering method.
[0091]
The average particle radius of the FGF-2 aggregate in the aqueous solution was approximately 200 nm. This aggregate was stably present, and the average particle radius did not change even after 24 hours. Further, no precipitation of the FGF-2 aggregate occurred in the solution.
Table 1 shows the results. FIG. 3 shows the change in the average particle radius up to 7 hours after the start of stirring.
[0092]
[Preparation Example 5]
In Preparation Example 4, an FGF-2 aggregate was prepared in the same manner as in Preparation Example 4 except that 25 mg / L of FGF-2 was used instead of using 12.5 mg / L of FGF-2, and the average particle size thereof was measured. The diameter and its change with time were measured by a dynamic light scattering method.
[0093]
The average particle radius of the FGF-2 aggregate in the aqueous solution was approximately 300 nm. This aggregate was stably present, and the average particle radius did not change even after 24 hours. Further, no precipitation of the FGF-2 aggregate occurred in the solution.
Table 1 shows the results.
[0094]
[Comparative Preparation Example 1]
In Preparation Example 4, an FGF-2 aggregate was prepared in the same manner as in Preparation Example 4, except that 75 mg / L of FGF-2 was used instead of 12.5 mg / L of FGF-2, and the average particle size thereof was measured. The diameter and its change with time were measured by a dynamic light scattering method.
[0095]
The average particle radius of the FGF-2 aggregate in the aqueous solution increased with time, and the average particle diameter was 600 nm at the beginning of stirring, but became about 1500 nm after about 1.5 hours. In addition, precipitation of the FGF-2 aggregate occurred in the solution.
Table 1 shows the results.
In Preparation Examples 4 and 5, and Comparative Preparation Example 1, it was confirmed that as the amount of FGF-2 used increased, the average particle radius of the aggregate increased.
[0096]
[Preparation Example 6]
In Preparation Example 1, an FGF-2 aggregate was prepared in the same manner as in Preparation Example 1 except that 0.5 mM Tris was used instead of 5 mM Tris, and 15 mM of an aqueous NaCl solution was further added. And its time-dependent change was measured by a dynamic light scattering method.
[0097]
The average particle radius of the FGF-2 aggregate in the aqueous solution was 40 to 70 nm. This aggregate was present stably, and no significant change in its average particle radius occurred after 24 hours. Further, no precipitation of the FGF-2 aggregate occurred in the solution.
Table 2 shows the results. FIG. 4 shows the change in the average particle radius from the start of stirring to after 8 hours.
[0098]
[Preparation Example 7]
In Preparation Example 6, an FGF-2 aggregate was prepared in the same manner as in Preparation Example 6, except that 50 mg / L of FGF-2 was used instead of using 12.5 mg / L of FGF-2. The diameter and its change with time were measured by a dynamic light scattering method.
[0099]
The average particle radius of the FGF-2 aggregate in the aqueous solution was approximately 80 nm. This aggregate was stably present, and the average particle radius did not change even after 24 hours. Further, no precipitation of the FGF-2 aggregate occurred in the solution.
Table 2 shows the results.
[0100]
[Preparation Example 8]
In Preparation Example 6, an FGF-2 aggregate was prepared in the same manner as in Preparation Example 6, except that 75 mg / L of FGF-2 was used instead of using 12.5 mg / L of FGF-2. The diameter and its change with time were measured by a dynamic light scattering method.
[0101]
The average particle radius of the FGF-2 aggregate in the aqueous solution increased with time, and was about 100 nm at the beginning of stirring, but became about 500 nm after about 6 hours. Further, no precipitation of the FGF-2 aggregate occurred in the solution.
Table 2 shows the results. FIG. 5 shows the change in the average particle radius from the start of stirring to 10 hours later.
In Preparation Examples 6 to 8, it was confirmed that the average particle radius of the aggregate increased as the amount of FGF-2 used increased.
[0102]
[Preparation Example 9]
A solution of 330 mg / L of FGF-2 (trade name (Recombinant human FGF basic), manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) was treated with Tris (trade name (tris (hydroxymethyl) aminomethane), nacalai tesque, Inc.) at 5 mM (pH 7). .2). After dissolution, the mixture was stirred at a temperature of 4 ° C. at a stirring speed of about 3 revolutions / minute for 1 week. The average particle size of the FGF-2 association in the solution during the stirring period and its change with time were measured by a dynamic light scattering method.
[0103]
The FGF-2 aggregate in the aqueous solution had an average particle radius of 3.2 nm, and it was confirmed that an aggregate corresponding to a dimer or trimer of FGF-2 was formed (single-molecule). The radius is about 1.5 nm.) This aggregate was stably present for one week or more, and the average particle radius did not change. Further, no precipitation of the FGF-2 aggregate occurred in the solution.
Table 2 shows the results. FIG. 6 shows the relationship between the relaxation time of the FGF-2 solution and the scattering vector.
[0104]
[Preparation Example 10]
12.5 mg / L of FGF-2 (Recombinant human FGF basic, manufactured by Dainippon Incorporated) solution was added to a phosphate buffer (NaCl: 8 g / L, KCl: 0.2 g / L, Na).2HPO4: 1.15 g / L, KH2PO4: 0.2 g / L, hereinafter referred to as “PBS”. ) 2 mM (PO converted to 1 L of FGF-2 containing solution)4 3 −Usage. same as below. ) (PH 7.4). While stirring the solution at 25 ° C., the average particle size of the FGF-2 association in the solution and its change with time were measured by a dynamic light scattering method.
[0105]
The average particle radius of the FGF-2 aggregate in the aqueous solution was 120 nm. This aggregate was stably present, and the average particle radius did not change even after 24 hours. Further, no precipitation of the FGF-2 aggregate occurred in the solution.
Table 2 shows the results. FIG. 7 shows the change in the average particle radius from the start of stirring to three hours later.
[0106]
[Preparation Example 11]
In Preparation Example 10, an FGF-2 aggregate was prepared in the same manner as in Preparation Example 10, except that 25 mg / L of FGF-2 was used instead of using 12.5 mg / L of FGF-2. The diameter and its change with time were measured by a dynamic light scattering method.
[0107]
The average particle radius of the FGF-2 aggregate in the aqueous solution increased with time, and was about 230
Table 2 shows the results. FIG. 8 shows the change in the average particle radius up to 3 hours after the start of stirring.
[0108]
[Preparation Example 12]
In Preparation Example 1, phosphoric acid (Na2HPO4: 1.15 g / L, KH2PO4: 0.2 g / L) An FGF-2 aggregate was prepared in the same manner as in Preparation Example 1 except that 2 mM was added, and the average particle diameter and its change with time were measured by a dynamic light scattering method.
[0109]
The FGF-2 aggregate in the aqueous solution had an average particle radius of 75 to 100 nm as in Preparation Example 1. This aggregate was stably present, and the average particle radius did not change even after 24 hours. Further, no precipitation of the FGF-2 aggregate occurred in the solution.
[0110]
The surface potential of this FGF-2 aggregate was measured by a zeta potential measuring method, also known as an electrophoretic light scattering method, and it was confirmed that the FGF-2 aggregate was negatively charged at -23.78 mV. Table 2 shows the results. FIG. 9 shows a graph of the surface potential measurement.
[0111]
2.5 mM calcium chloride (the amount of calcium chloride used in 1 L of a calcium phosphate-containing solution; the same applies hereinafter), phosphoric acid (H3PO4) 1 mM (the amount of phosphoric acid converted to 1 L of a calcium phosphate-containing solution; the same applies hereinafter) was mixed and adjusted with a KOH aqueous solution so as to have a pH of 7.4 to prepare a calcium phosphate-containing solution.
[0112]
To this, the FGF-2 containing solution prepared in Preparation Example 10 was mixed so that FGF-2 and the calcium phosphate solution had the same volume.
When the mixture was stirred at 25 ° C. for 1 minute and allowed to stand, FGF-2 and a calcium phosphate (apatite) complex were precipitated.
After the precipitation, the concentration of FGF-2 in the mixed solution was quantified by a colorimetric method, and it was confirmed that the concentration of FGF-2 was reduced to about 1/6 that before the precipitation. That is, it was confirmed that 5/6 of the total amount of FGF-2 was incorporated into the complex.
[0113]
FIG. 11 shows an SEM (scanning electron microscope) photograph (scale bar in the photograph is 1 micron) of the obtained FGF-2 and calcium phosphate complex.
[0114]
Comparative Example 1 Calcium chloride 2.5 mM, phosphoric acid (form: H3PO4) 1 mM was mixed and adjusted with a KOH aqueous solution so as to have a pH of 7.4 to prepare a calcium phosphate-containing solution.
The solution was allowed to stand to precipitate apatite.
FIG. 10 shows an SEM (scanning electron microscope) photograph (the scale bar in the photograph is 1 micron) of the obtained apatite crystal.
[0115]
From FIG. 10, when only apatite is precipitated, a scale-like precipitate 1 unique to apatite is generated. On the other hand, from FIG. 11, it can be clearly discriminated that the precipitate of the FGF-2 and the calcium phosphate complex contains the FGF-2
The structure around the precipitate is the filter surface.
[0116]
[Table 1]
[Table 2]
【The invention's effect】
In the protein-calcium phosphate complex according to the present invention, the water-soluble protein is a molecule or an aggregate and forms a complex with calcium phosphate. While maintaining sustained release, bone formation and promotion of bone formation by the material itself can be effectively performed.
[0119]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the particle radius of FGF-2 in a solution of 12.5 mg / L of FGF-2,
FIG. 2 is a graph showing the particle radius of FGF-2 in a solution of FGF-2 at 150 mg / L,
FIG. 3 is a graph showing the particle radius of FGF-2 in a solution of 12.5 mg / L of FGF-2, 5 mM of Tris, 150 mM of NaCl, pH 7.4, and 25 ° C., and its time change.
FIG. 4 is a graph showing the particle radius of FGF-2 in a solution containing 12.5 mg / L of FGF-2, 0.5 mM of Tris, 15 mM of NaCl, pH 7.4, and 25 ° C., and a change with time thereof. is there.
FIG. 5 is a graph showing the particle radius of FGF-2 in a solution containing 75 mg / L of FGF-2, 0.5 mM of Tris, 15 mM of NaCl, pH 7.4, and 25 ° C. and its time change.
FIG. 6 is a graph showing the relationship between the relaxation time and the scattering vector of an FGF-2 solution in a 25 ° C. solution which was stirred at 330 mg / L,
FIG. 7 is a graph showing a particle radius of FGF-2 at 12.5 mg / L of FGF-2, a PBS solution, an average pH of 7.4, and 25 ° C. and its time change.
FIG. 8 is a graph showing the particle radius of FGF-2 at 25 mg / L of FGF-2, a PBS solution, an average pH of 7.4, and 25 ° C. and its time change.
FIG. 9 is a graph showing the surface potential of an FGF-2 aggregate in a solution of FGF-2 at 12.5 mg / L,
FIG. 10 is a SEM photograph of apatite precipitated from a solution of A: calcium chloride 2.5 mM,
FIG. 11 shows a complex of FGF-2 and apatite precipitated from a solution obtained by mixing a solution obtained by dissolving FGF-2 in PBS buffer at a volume of 12.5 mg / L in the A solution of FIG. 10 in an equal volume. It is a SEM photograph of.
[Explanation of symbols]
1 Apatite
2 FGF-2 particles
Claims (10)
前記水溶性タンパク質含有溶液に、リン酸カルシウム含有溶液を添加して、タンパク質−リン酸カルシウム複合体を析出させる工程を含む、タンパク質−リン酸カルシウム複合体の製造方法。A step of preparing a water-soluble protein-containing solution containing a water-soluble protein consisting of a water-soluble protein single molecule and / or a water-soluble protein aggregate in a state in which the water-soluble protein does not substantially precipitate in an aqueous solution; A process for adding a calcium phosphate-containing solution to precipitate a protein-calcium phosphate complex.
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