【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定の精巣細胞分画に対する抗体、及びその抗体の作製方法、並びにその抗体の用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
精子形成過程の状態を正確に把握することは、ダイオキシンをはじめ、環境中の内分泌障害性物質などの暴露による精巣障害を鋭敏に検出することとなり、また医薬品の開発においても、精巣細胞の分化又は増殖に対する有効性及び安全性の評価に役立つこととなる。
【０００３】
哺乳動物の精子形成過程を大別すると、１）精祖細胞の増殖分化、２）精母細胞の減数分裂、３）精子細胞の形態変化があり、ラットでは１４のステージに、マウスでは１２のステージに分けられる。現在、哺乳動物の精子形成過程の全般にわたる培養系は確立されていないが、この理由として、精細管におけるサイトカイン等によるパラクリン形式の分化増殖調節機構が未知であることが挙げられる。他方、その機構を解明するために重要な精子形成過程の把握は、主として複雑な形態学的観察に基づいているため、時間がかかり、経験も必要であった。
【０００４】
従来の精巣細胞を用いた解析においては、精巣細胞の単離時の手法により細胞膜の障害が懸念され、細胞膜表面に対する抗体を作製するために精巣細胞を分取することは困難であると考えられていた。また、従来の精巣特異的抗体は、精巣細胞の分化系列に狭いスペクトルを示す特異的な抗体としては、精祖細胞に対する抗ｃ−ｋｉｔ抗体以外のものは報告されていない（Ｙｏｓｈｉｎａｇａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１３： ６８９−９９， １９９１）。これまで得られている精巣特異的な抗体もまた分化系列上の特異性は低く（非特許文献１及び２）、その原因としては、精巣の全細胞を感作することによるスクリーニング効率の低下が考えられる。
以上のような理由から、特定の分化系列にある精巣細胞分画の細胞膜表面に特異的な抗体の作製が望まれていた。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｆｅｎｄｅｒｓｏｎ， Ｂ．Ａ． ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ（ＵＳＡ），１９８４年，第１０３巻，ｐ．１１７−１２８
【非特許文献２】
Ｋｏｓｈｉｍｉｚｕ， Ｕ． ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（ＵＳＡ），１９９３年，第４９巻，ｐ．８７５−８８４
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、特定の精巣細胞分画に対する抗体及びその作製方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、セルソーター解析により精巣細胞をインタクトな状態で複数の分画に分取する方法を開発し、その精巣細胞分画を抗原として用いることにより、特定の精巣細胞分画に特異的な抗体を得ることができるという知見を得、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、倍数性がｓｕｂ−ｎの分画、一倍体の分画、二倍体の分画及び四倍体の分画からなる群より選択される少なくとも１つの精巣細胞分画に対する抗体である。
【０００９】
また本発明は、倍数性がｓｕｂ−ｎの分画、一倍体であって細胞の大きさが小さい分画及び大きい分画、二倍体であって細胞の大きさが小さい分画及び大きい分画、並びに四倍体であって細胞の大きさが小さい分画及び大きい分画からなる群より選択される少なくとも１つの精巣細胞分画に対する抗体である。
【００１０】
ここで、上記抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。また、該モノクローナル抗体としては、例えば受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−１８９１１であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体が挙げられる。
【００１１】
本発明はまた、上記モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマである。該ハイブリドーマとしては、例えば受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−１８９１１のものが挙げられる。
【００１２】
また本発明は、倍数性がｓｕｂ−ｎの分画、一倍体の分画、二倍体の分画及び四倍体の分画からなる群より選択される少なくとも１つの精巣細胞分画を抗原として用いることを特徴とする、精巣細胞分画特異的抗体の作製方法である。
【００１３】
本発明はまた、倍数性がｓｕｂ−ｎの分画、一倍体であって細胞の大きさが小さい分画及び大きい分画、二倍体であって細胞の大きさが小さい分画及び大きい分画、並びに四倍体であって細胞の大きさが小さい分画及び大きい分画からなる群より選択される少なくとも１つの精巣細胞分画を抗原として用いることを特徴とする、精巣細胞分画特異的抗体の作製方法である。
【００１４】
さらに本発明は、上記抗体を用いることを特徴とする、精巣細胞分画の精製方法である。
またさらに本発明は、上記抗体と被検サンプルとを接触させることを特徴とする、精巣細胞分画の検出方法である。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、特定の精巣細胞分画に対する抗体（以下、「精巣細胞分画特異的抗体」ともいう）に係るものであり、本発明の抗体は、その特定の精巣細胞分画を抗原として用いて作製される。そのため、本発明の抗体は、精巣細胞の分化を研究するため、精巣細胞分画を精製するため、精巣細胞分画を検出するため、また様々な化学物質などの外的要因、加齢などの内的要因による精巣障害性の検出、ＲＮＡの採取を介した精巣細胞分画特異的遺伝子の単離などに有用である。
【００１６】
１．精巣細胞分画の調製
本発明の抗体を作製するために、抗原となる精巣細胞分画を調製する。本発明において「精巣細胞」とは、精巣中に含まれる細胞を指す。精巣の精細管では、発生過程において、精原細胞（２ｎ）から精母細胞（４ｎ）を経て精子細胞（ｎ）となり、この精子細胞が形態変化した精子細胞（ｓｕｂ−ｎ）に形態変化（精子形成）することが知られている。ここで、「ｓｕｂ−ｎ」とは、形態変化した精子細胞の倍数性を表す。形態変化した精子細胞と精子細胞は、いずれも一組の染色体を含み、同量のＤＮＡを含有するが、形態変化した精子細胞の染色体は、精子細胞のものと比較して濃縮して存在している点で両者の存在形態が相違するため、形態変化した精子細胞の倍数性をｓｕｂ−ｎと表し、精子細胞の倍数性をｎと表す。また「倍数性」とは、細胞当たりの染色体の組の数に関し、染色体組の数に応じて、一倍体、二倍体などと呼ぶ。
【００１７】
従って、精巣には、以下の細胞が含まれる。
・二倍体の精原細胞（Ｓｐｅｒｍａｔｏｇｏｎｉａ）
・四倍体の精母細胞、すなわち、レプトテン期精母細胞（Ｌｅｐｔｏｔｅｎｅ）、ザイゴテン期精母細胞（Ｚｙｇｏｔｅｎｅ）、パキテン期精母細胞（Ｐａｃｈｙｔｅｎｅ）
・一倍体の精子細胞、すなわち、エロンゲイティング精子細胞（Ｅｌｏｎｇａｔｉｎｇ ｓｐｅｒｍａｔｉｄ）、円形精子細胞（Ｒｏｕｎｄ ｓｐｅｒｍａｔｉｄ）
・倍数性がｓｕｂ−ｎのエロンゲイティッド精子細胞（Ｅｌｏｎｇａｔｅｄ ｓｐｅｒｍａｔｉｄ）
・二倍体の体細胞、すなわち、セルトリ細胞（Ｓｅｒｔｏｌｉ）、ライディヒ細胞（Ｌｅｙｄｉｇ）、筋様細胞（Ｍｙｏｉｄ）
本発明においては、セルソーター解析を利用して、上記精巣細胞を、好ましくは４〜７つの分画、例えば７つ又は４つの分画に分取し、そのうち少なくとも１つの分画を抗原として利用する。
【００１８】
（１）精巣細胞の単離
精巣細胞は、精巣から単離して得る。被験体からの精巣の採取は、当技術分野で公知の方法により行うことができる。例えば、哺乳動物を麻酔下にて放血致死させ、ハサミなどを用いて精巣を摘出し、脂肪除去の後、精巣白膜及び血管系を除去する。
【００１９】
続いて、精巣から精巣細胞を単離する。本発明において細胞の「単離」とは、精巣から主として精巣細胞が優位に含まれている細胞画分のみを取り出し、かつ個々の細胞を分離させることを指す。「優位に」とは、単離細胞画分中の精巣細胞の割合が少なくとも９０％であることを意味する。この際、精巣細胞をセルソーター解析に耐えることができるように単離することが重要である。そのため、本発明者は、以下に記載する酵素的分離及び機械的分離を組み合わせて行うことによって、セルソーター解析に適した状態で精巣細胞を単離する手法を開発した。
【００２０】
本発明において酵素的分離は、コラゲナーゼを用いて行う。例えば、０．１〜０．５％コラゲナーゼ、好ましくは０．２５％コラゲナーゼ中に精巣を入れる。処理条件は、３０〜３８℃、好ましくは３２．５℃にて、１５〜６０分間、好ましくは２０〜３０分間行う。この際、１００〜２００ｃｙｃｌｅ／ｍｉｎ、好ましくは１５０〜１６０ｃｙｃｌｅ／ｍｉｎにて水浴にて振とうさせる。
【００２１】
機械的分離は、精巣を段階的に小さくしたメッシュに通すか、又は段階的に細い注射針に通すか、あるいはこれらを組み合わせて行う。メッシュは、４０μｍ〜１００μｍの範囲内、例えば、４０μｍ又は７０μｍのものを用いることができる。注射針は、１８Ｇ〜２７Ｇの範囲内、例えば、２４Ｇ、２６Ｇ又は２７Ｇのものを用いることができる。
【００２２】
本発明においては、上記酵素的分離を０．２５％コラゲナーゼを用いて行い、上記機械的分離をメッシュ上でピペッティングして、精巣細胞を単離することが好ましい。
【００２３】
続いて、単離した精巣細胞を、セルソーターで解析するために、細胞懸濁液として調製する。懸濁溶液は、精巣細胞を破壊せず、精巣細胞に一般的に使用されている溶液であれば特に限定されない。例えば懸濁溶液としては、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋不含のリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ−）、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）添加ＰＢＳ（−）などが挙げられる。セルソーター解析に最適な細胞懸濁濃度は、５×１０５〜５×１０７個／ｍｌであり、好ましくは１×１０６〜３×１０６個／ｍｌである。
上述したような操作により、精巣細胞を、セルソーター解析に十分耐えられるように、また、解析後も細胞の形態を維持可能なように単離することができる。
【００２４】
（２）精巣細胞ＤＮＡの染色
精巣細胞を単離した後、セルソーター解析により精巣細胞のＤＮＡ含量を測定するために、精巣細胞のＤＮＡを蛍光色素で染色する。
【００２５】
精巣細胞は、染色を行う前に固定化しておくことが好ましい。固定化により、ＤＮＡと結合する蛍光色素がはじめて細胞膜を通過し、細胞とＤＮＡとが結合することが可能となる。
細胞の固定化は、当技術分野で公知の方法により行うことができ、例えば、メタノールを用いる固定、エタノールを用いる固定などが挙げられる。
【００２６】
具体的に説明すると、例えばメタノールを用いて精巣細胞を固定する場合には、細胞懸濁液に、６０〜８０％メタノール、好ましくは７０％メタノールに細胞懸濁液を一滴ずつ撹拌しながら滴下して加え（細胞：メタノールが約１：３０となるように加える）、４℃にて１時間維持する。細胞は、このアルコール固定液を遠心分離後、ＰＢＳ（−）に置換することにより、この状態のまま保存することができる。
【００２７】
細胞固定後、アルコールをＰＢＳ（−）に置換した後、ＲＮＡによる蛍光色素のＤＮＡ結合性への干渉を阻止するために、ＲＮａｓｅ処理を行うことが好ましい。ＲＮａｓｅは、０．１〜０．５％、好ましくは０．２５％のものを使用し、３６〜３８℃、好ましくは３７℃のもとで、１０〜３０分間、好ましくは２０分間にわたり細胞をインキュベートする。
【００２８】
ＲＮａｓｅ処理後、精巣細胞のＤＮＡを染色する。ＤＮＡを染色するための蛍光色素は、当技術分野で一般的に用いられているものであれば特に限定されない。例えば、ヨードプロピディウム（ＰＩ）、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）、ヘキスト３３３４２などが挙げられる。ＰＩ及びＥｔＢｒは、核酸の二重らせん内に挿入され、蛍光強度を増強させることが知られている。またヘキスト３３３４２は、生細胞のＤＮＡ染色に有効であることが知られている。
【００２９】
例えば細胞をＰＩにより染色する場合には、遮光下で、精巣細胞に１０〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは５０μｇ／ｍｌのＰＩを加え、１０〜１℃、好ましくは４℃にて、１０〜６０分間、好ましくは３０分間かけて染色を行う。
【００３０】
また例えば細胞をヘキスト３３３４２により染色する場合には、精巣細胞に５〜１０μＭの濃度でヘキスト３３３４２を加え、１０〜３０℃、好ましくは室温にて、１０〜６０分間、好ましくは２０分間かけて染色を行う。
【００３１】
（３）セルソーター解析
上述のようにして調製した精巣細胞をセルソーター解析に供し、精巣細胞分画に分取する。セルソーターとは、細胞の有する各種パラメータに基づいて細胞を選別・分取する装置を指す。
【００３２】
（３．１）セルソーターの原理
セルソーターの原理は、サンプル中の細胞を１個ずつレーザー光の中心を通過させ、細胞がレーザー光中を通過するときに発する蛍光及び散乱光を検出し、それらの光を各種の電気パルス、続いてシグナル情報に変換し、目的とする細胞に関するヒストグラム解析とリストモードデータ解析を行って、その結果に基づいて細胞の分取を行う、というものである。そのため、セルソーターは、フローサイトメーターと細胞分取装置とを備えており、蛍光や散乱光のシグナル情報の測定結果を、例えばドットプロットとして表示する機能を有しており、また特定のシグナル情報を発する細胞を細胞分取装置により分取することができる。なお、このような方法はフローサイトメトリーと呼ばれている。
【００３３】
セルソーターは、生細胞を高い生存率でかつ無菌的に分取することができるため、当技術分野で広く利用されている。セルソーター解析についての詳細な説明に関しては、例えば、「動物細胞培養の実際」（１９９０年，三井洋司監訳，丸善株式会社）、「フローサイトメトリーの原理入門」（ベックマン・コールター株式会社，サイトメトリーグループホームページ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｃ−ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．ｃｏｍ／ａｄｄ＿ｐａｇｅ／ｆｃｍｐｒｉｎ．ｈｔｍｌ）を参照されたい。
【００３４】
本発明において利用可能なセルソーターは、上述したようなフローサイトメーターと細胞分取装置とを備えるものであれば特に限定されず、例えば、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）、ＥＰＩＣＳ ＡＬＴＲＡ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ製）などが挙げられる。セルソーターは、製造業者の取扱説明書に従って取り扱い、解析を行う。
【００３５】
（３．２）パラメータによる分取
本発明においては、精巣細胞がレーザー光を照射されて発する蛍光及び前方散乱光を利用して、精巣細胞のＤＮＡ含量及び／又は細胞の大きさの２つのパラメータを測定する。
【００３６】
蛍光は、細胞が蛍光色素を含有する場合に、レーザー光のエネルギーによってこの蛍光色素が励起され、細胞が蛍光と呼ばれる光をあらゆる方向に発することにより生じる。この蛍光を測定することにより、細胞の特徴を知ることができる。例えば本発明においては、精巣細胞のＤＮＡを蛍光色素で染色しているため、蛍光強度は、精巣細胞のＤＮＡ量に比例することになる。
【００３７】
蛍光は、蛍光色素によりその波長が異なる。従って、ＤＮＡの染色に使用した蛍光色素に応じて、照射する励起光を変更する必要がある。例えば蛍光色素ＰＩは、４８８ｎｍで励起し、最大放射スペクトルは約６１５ｎｍである。また蛍光色素ヘキスト３３３４２は、３５０〜３６３ｎｍで励起し、４５０ｎｍ以上で回復する。
【００３８】
蛍光によるセルソーター解析を行った場合の一例として、図１Ｂに、精巣細胞のＤＮＡ量（ＰＩ量）と細胞数のプロットを示す。精巣細胞のＤＮＡ量は染色体の倍数性と関連している。従って、ＤＮＡ量（ＰＩ）が異なる場合は、細胞数のピークが異なることとなる。例えば、図１Ｂに示すＩ〜ＩＶは、それぞれｓｕｂ−ｎ、ｎ（一倍体）、２ｎ（二倍体）及び４ｎ（四倍体）に対応する。ここで、ｓｕｂ−ｎ及びｎの精巣細胞は、いずれも一組の染色体を含み、同量のＤＮＡを含有するが、ｓｕｂ−ｎの精巣細胞の染色体は、ｎのものと比較して濃縮して存在している点で両者の存在形態が相違する。そのため、図１Ｂに示すように、ｓｕｂ−ｎとｎが区別可能なピークとして現れると考えられる。このように蛍光を利用することによって、精巣細胞を倍数性で分類することができる。
【００３９】
前方散乱光（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ；ＦＳＣ）は、主に細胞表面で生じるレーザー光の散乱であり、細胞表面積に比例する。すなわち、細胞が大きくなるほど、生じるＦＳＣは強くなる。従って、ＦＳＣを用いて精巣細胞の大きさを測定することができる。
【００４０】
ＦＳＣによるセルソーター解析を行った場合の一例として、図１Ａに精巣細胞のＦＳＣと細胞数のプロットを示す。図１Ａに示すように、精巣細胞の大きさ（ＦＳＣ）と細胞数との関連性はみとめられず、ピークがない。そのため、精巣細胞の大きさの測定のみでは精巣細胞を分類することはできない。
【００４１】
一方、蛍光とＦＳＣとを組み合わせた場合には、精巣細胞のＤＮＡ量と細胞の大きさの２つのパラメータに基づいて細胞を分類することができる。例えば、図１Ｄに示すように、ＤＮＡ量（ＰＩ）−ＦＳＣのプロットを作成した場合には、精巣細胞を次の７つの分画に分類することができる。すなわち、（１）倍数性がｓｕｂ−ｎの分画、（２）一倍体であって、細胞の大きさが小さい分画、（３）一倍体であって、細胞の大きさが大きい分画、（４）二倍体であって、細胞の大きさが小さい分画、（５）二倍体であって、細胞の大きさが大きい分画、（６）四倍体であって、細胞の大きさが小さい分画、及び／又は（７）四倍体であって、細胞の大きさが大きい分画、に分類することができ、セルソーターは、これらの情報に基づいて、精巣細胞分画を分取することとなる。
【００４２】
また、セルソーター解析に一般的に利用される側方散乱光（Ｓｉｄｅ Ｓｃａｔｔｅｒ；ＳＳＣ）は、照射されるレーザー光の軸に対して９０°の方向の角度で散乱する光であり、主に細胞内顆粒などの細胞内部構造の複雑さを表す。すなわち、細胞内部の構造が複雑になるほど、生じるＳＳＣは強くなる。従って、ＳＳＣを用いて精巣細胞の内部構造の複雑性を測定することができる。ＳＳＣによるセルソーター解析を行った場合の一例として、図１Ｃに精巣細胞のＦＳＣとＳＳＣのプロットを示す。図１Ｃに示すように、精巣細胞の大きさ（ＦＳＣ）と細胞内部構造の複雑性（ＳＳＣ）との関連性はみとめられず、ピークがない。そのため、細胞の内部構造の複雑性をパラメータとして精巣細胞を分類することはできない。
【００４３】
（３．３）精巣細胞の種類と７つの分画との関係
上述したように、セルソーター解析を利用することによって、ＤＮＡ含量と大きさに基づいて、精巣細胞を４つ又は７つの分画に分取することができる。４つ及び７つの精巣細胞分画について以下の表１にまとめる。４つの分画は、表１のＤＮＡ含量（倍数性）が同じものである。
【００４４】
【表１】
【００４５】
表１において、「分画」の欄に記載の数字は、本明細書及び図面に示す数字に対応し、「大きさ」の欄に記載のＬ及びＲは、同じ倍数性を有する細胞を大きさに基づいて２つの分画に分けた場合の、小さい分画（Ｌ）と大きい分画（Ｒ）を指す。本発明においては、図１Ｄに示すように、ｓｕｂ−ｎの細胞以外は、同じ倍数性を有する精巣細胞を、その大きさに基づいて２つの分画に分けることができる。ここで、「大きい」とは、細胞の体積が他のものよりも上回っていることを指す。また「小さい」とは、細胞の体積が他のものよりも少ないことを指す。本発明において「大きい」と「小さい」の境界は、ＤＮＡ（ＰＩ）−ＦＳＣのプロットの各分画における曲線の変曲点部位にて規定した。
また、図２に、各精巣細胞分画に含まれる細胞を示す。写真の枠内に示す細胞は、各分画の代表的な細胞を示す。
【００４６】
上述した手法は、精巣細胞の膜障害性の操作を取り入れないため、細胞膜をインタクトな状態で精巣細胞分画を分取することができる。このようにして分取した精巣細胞分画は、均質であり、かつ細胞が破壊されずに分取されているため、後述する抗体の作製に用いることができる。本発明において、「精巣細胞分画」とは、その細胞集団に含まれる全成分のうちの８０〜１００％、好ましくは９０〜１００％、さらに好ましくは９５％以上を、当該分画に特徴的なＤＮＡ含量及び／又は細胞の大きさを有する精巣細胞が占有することを指す。
【００４７】
２．本発明の抗体
本発明の抗体は、特定の精巣細胞分画と特異的に反応するという特徴を有するものであり、その特定の精巣細胞分画を抗原として用いて作製される。本発明の抗体のグロブリンタイプは、上記特徴を有するものである限り特に限定されるものではなく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれでもよいが、ＩｇＧが好ましい。
【００４８】
本発明において「抗体」とは、抗原である特定の精巣細胞分画に結合し得る抗体分子を意味し、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。本発明において、抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体）は、例えば以下の手法により作製することができる。
【００４９】
（１）免疫原の調製
本発明の抗体を作製するにあたり、免疫原（抗原）となるための精巣細胞を調製する。免疫原用の精巣細胞は、上記「１．精巣細胞の分類」の項に記載のように分取され、特定の精巣細胞分画を含むものとする。免疫原に含まれる精巣細胞分画は、１種の分画に属する細胞のみを含むものであってもよいし、２種以上の分画の細胞を含むものであってもよい。
【００５０】
次に、得られた精巣細胞分画を緩衝液に溶解して免疫原を調製する。なお、必要であれば、免疫を効果的に行うためにアジュバントを添加してもよい。アジュバントとしては、市販の完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント等が挙げられ、これらのいずれのものを混合してもよい。
【００５１】
（２）モノクローナル抗体
（２．１）免疫及び抗体産生細胞の採取
上記のようにして得られた免疫原を、哺乳動物、例えばラット、マウス（例えば近交系マウスのＢＡＬＢ／ｃ）、ウサギなどに投与する。免疫原の１回の投与量は、免疫動物の種類、投与経路などにより適宜決定されるものであるが、動物１匹当たり約１×１０６〜１×１０７細胞／動物、好ましくは４．９〜７．０×１０６細胞／動物である。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内に免疫原を注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、初回免疫後、数日から数週間間隔で、好ましくは２〜４週間間隔で、３〜５回、好ましくは３〜４回追加免疫を行う。初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したときは、免疫原を静脈内又は腹腔内に注射し、最終免疫とする。そして、最終免疫の日から２〜５日後、好ましくは３日後に、抗体産生細胞を採取する。
【００５２】
抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。免疫動物から抗体産生細胞を調製するには、当技術分野で公知のいずれの手法も用いることができる。例えば、脾臓細胞は、脾臓を無菌的に摘出した後に、例えばイーグル最少基本培地（ＭＥＭ）又はＲＰＭＩ１６４０培地中で細断し、ピンセットでほぐし、軽く遠心した後に上清を捨て、場合によりＴｒｉｓ−塩化アンモニウムバッファーで１〜２分間処理して赤血球を除去してもよく、最後に上記培地で数回洗浄して調製する。また例えば局所リンパ節細胞は、局所リンパ節を無菌的に摘出した後に、例えばＲＰＭＩ１６４０培地等において細断し、ピンセットですりつぶして細胞を培地中に浮遊させて調製する。
【００５３】
（２．２）細胞融合
ハイブリドーマを得るため、上述のように免疫動物から得た抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。
【００５４】
抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞としては、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。また株化細胞は、免疫動物と同種系の動物に由来するものが好ましい。ミエローマ細胞の具体例としては、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損細胞株である、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ．８株（ＡＴＣＣ ＴＩＢ９）、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ．８．Ｕ１株（癌研究リサーチソースバンク（ＪＣＲＢ）９０８５）、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１株（ＪＣＲＢ ０００９）、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３株（ＪＣＲＢ ００２８）又はＳｐ２／０−Ａｇ１４株（ＪＣＲＢ ００２９）などが挙げられる。
【００５５】
次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０培地などの動物細胞培養用の培地中で、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを約１：１〜１０：１の割合で混合し、細胞融合促進剤の存在下にて融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量１，５００〜４，０００ダルトンのポリエチレングリコール等を約１０〜８０％の濃度で使用することができる（ＰＥＧ法）。また場合によっては、融合効率を高めるために、ジメチルスルホキシドなどの補助剤を併用してもよい。さらに、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
【００５６】
（２．３）ハイブリドーマの選別及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。そのために、細胞懸濁液を、例えばウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に２×１０５個／ウエル程度まき、各ウエルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。培養温度は、３６〜３８℃、好ましくは約３７℃である。ミエローマ細胞がＨＧＰＲＴ欠損株又はチミジンキナーゼ（ＴＫ）欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選択培地（ＨＡＴ培地）を用いることにより、抗体産生能を有する細胞とミエローマ細胞のハイブリドーマのみを選択的に培養し、増殖させることができる。その結果、選択培地で培養開始後、約１４日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
【００５７】
次に、ハイブリドーマのスクリーニングを行う。スクリーニングは、次の３つの点について行う。
１）ハイブリドーマの培養上清中の、目的とする抗体の有無
２）ハイブリドーマにより産生される抗体の、精巣細胞に対する反応性の有無
３）ハイブリドーマにより産生される抗体の、抗原として用いた精巣細胞分画に対する反応性の有無
１）のスクリーニングは、当技術分野で一般的な方法に従って行うことができ、例えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採取し、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、及びＥＩＡ；Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓｓａｙ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ；ＲａｄｉｏＩｍｍｕｎｏ Ａｓｓａｙ）等によって行うことができる。
２）のスクリーニングもまた当技術分野で一般的な方法に従って行うことができ、例えば、間接蛍光抗体法を用いて、単離した精巣細胞に蛍光標識した当該抗体を反応させ、蛍光顕微鏡による観察を行うことによって行うことができる。
３）のスクリーニングも当技術分野で一般的な方法に従って行うことができ、例えば、セルソーターを用いて、単離した精巣細胞に蛍光標識した当該抗体を反応させ、各分画に対する反応性を検討するすることによって行うことができる。
【００５８】
融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立する。本発明のハイブリドーマは、後述するように、ＧＩＴ、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ等の基本培地中での培養において安定であり、精巣細胞の特定の分画と特異的に反応するモノクローナル抗体を産生、分泌するものである。
【００５９】
なお、上記「１．精巣細胞分画の調製」の項に記載の精巣細胞分画３（すなわち円形精子細胞）を抗原として用いて作製されたハイブリドーマは、独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、平成１４年７月２日に、ＦＥＲＭ Ｐ−１８９１１として寄託されている。
【００６０】
（２．５）モノクローナル抗体の採取
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。
【００６１】
細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地、ＭＥＭ培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃，５％ＣＯ２濃度）で３〜５日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。
【００６２】
腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約２×１０６個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜３週間後に腹水又は血清を採取する。
【００６３】
上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜に選択して、又はこれらを組み合わせることにより、精製された本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。
【００６４】
（３）ポリクローナル抗体の作製
ポリクローナル抗体を作製する場合は、前記と同様に動物を免疫し、最終の免疫日から６〜６０日後に、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ又はＥＩＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。その後は、抗血清中のポリクローナル抗体の反応性をＥＬＩＳＡ法などで測定する。
【００６５】
（４）抗体の性質
上記（２）及び（３）で作製された本発明の抗体は、これらの抗体を作製するために使用した精巣細胞分画と特異的に反応するものである。本発明の抗体の性質を調べるために、例えば、精巣細胞分画との反応性、精巣及び他の組織との反応性、動物種に対する特異性、動物種の年齢（日齢・月齢）による反応性の変化、又は、本発明の抗体を用いて抗体と反応する特異的精巣細胞分画を単離し、その細胞分画中の細胞の性質、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡなどについて、本発明の抗体を試験し、その性質を理解することができる。
【００６６】
上述の試験により明らかにした本発明の抗体の性質は、精巣細胞の分化、様々な化学物質、外的・内的要因による精巣障害性の検出、ＲＮＡ採取を介した精巣細胞分画特異的な遺伝子の単離などの研究及び解析を行う上で有用である。
【００６７】
３．本発明の抗体の用途
本発明の精巣細胞分画特異的抗体は、特定の精巣細胞分画と特異的に結合（反応）するため、その精巣細胞分画の精製、検出などに使用することができる。また、様々な化学物質などの外的要因、加齢などの内的要因による精巣障害性の検出、ＲＮＡの採取を介した精巣細胞分画特異的遺伝子の単離などに有用である。
【００６８】
（１）精巣細胞分画の精製方法
本発明の精製方法は、抗体を用いる精製方法を利用して行うことができる。抗体を用いる精製方法としては、限定するものではないが、アフィニティークロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００６９】
アフィニティークロマトグラフィーとは、生体物質の示す特異的な相互作用を利用したクロマトグラフィーを指し、本発明においてその相互作用とは、抗原−抗体反応をいう。具体的には、クロマトグラフィーのカラムに、本発明の抗体を固相化した担体を充填し、そのカラムにサンプルをアプライした時に、固相化された本発明の抗体とサンプル中に含まれる抗原（すなわち、特定の精巣細胞分画）とが結合し、その結果、サンプルから抗原を分離させることができるというものである。
本発明の精製方法において、サンプルとは、分離・精製させようとする特定の精巣細胞分画を含むサンプルを指し、例えば精巣細胞懸濁液などが挙げられる。
【００７０】
本発明の抗体を固相化する担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ラテックス、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなるビーズなどを用いることができる。固相化は、担体と本発明の抗体とを物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法に従って結合させることにより行うことができる。また、本発明の精製方法において使用可能なカラムは、使用する担体に応じて適切なアフィニティーカラムを選択することができる。
【００７１】
カラムに充填する担体の量は、固相化した抗体の量を計算し、またサンプル中に含まれる抗原（特定の精巣細胞分画）の量を推測して、その量比から決定することが好ましい。一般的には、担体の量は約０．５〜１ｍｌである。
【００７２】
続いて、カラムにサンプルをアプライする。サンプル中に含まれる特定の精巣細胞分画は、抗原として、固相化された本発明の抗体と結合し、カラム中に保持される。従って、未結合の成分をカラムから洗浄し、その後、本発明の抗体と抗原との結合を弱める操作を行うことによって、特定の精巣細胞分画を精製することができる。結合を弱める操作としては、公知の溶出溶液の使用が挙げられる。公知の溶出溶液としては、例えば、１Ｍプロピオン酸（ｐＨ２．５）、０．２Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）、０．０５Ｍジエチルアミン−ＨＣｌ（ｐＨ１１．５）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ−アンモニア（ｐＨ１１）、カオトロピックイオン（ｐＨ７．０〜８．０、３Ｍ）、１０％ジオキサン、５０％エチレングリコール、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ（ｐＨ３．１）、及び８Ｍ尿素を含むものが挙げられる。
【００７３】
上述の操作により、特定の精巣細胞分画を、その細胞及びＤＮＡを障害することなく分離・精製することができ、精製された精巣細胞分画をさらなる用途に用いることができる。例えば、円形精子細胞は、顕微受精において卵子と融合させることにより不妊治療に使用可能であることが示唆されているが、その際、円形精子細胞以外の精巣細胞を選択してしまう可能性があり、この技術の結果が予測できない旨が報告されている（社団法人日本不妊学会、「ヒト円形精子細胞を用いた授精法について」の倫理委員会報告）。従って、本発明の精製方法により、円形精子細胞のみを取得することが可能となるため、上述のような問題点を解消することができると考えられる。しかし、本発明の精製方法は、このような用途に限定されるものではない。
【００７４】
（２）精巣細胞分画の検出方法
本発明の検出方法は、免疫学的測定法において本発明の抗体を用いることにより、本発明の抗体に対し抗原として反応する特定の精巣細胞分画を検出（測定）することができる。免疫学的測定法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法、免疫比濁法、免疫比ろう法、ラテックス凝集反応、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応、粒子凝集反応又はウエスタンブロット法などが挙げられる。
【００７５】
本発明の検出方法において被検対象となるサンプルとしては、特定の精巣細胞分画の存在を検出しようとするサンプルであれば特に限定されるものではない。例えば、精巣の切片、精巣細胞懸濁液などが挙げられる。
【００７６】
本発明の検出方法においては、本発明の抗体と、サンプル中の特定の精巣細胞分画との反応を容易に検出するために、本発明の抗体を標識することにより該反応を直接検出するか、又は標識二次抗体を用いることにより間接的に検出する。本発明の検出方法においては、感度の点で、後者の間接的検出（例えばサンドイッチ法など）を利用することが好ましい。
【００７７】
標識物質としては、酵素免疫測定法の場合には、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素、アミラーゼ又はビオチン−アビジン複合体等を、蛍光免疫測定法の場合には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート又はジクロロトリアジンイソチオシアネート等を、そして放射免疫測定法の場合には、トリチウム、Ｉ１２５又はＩ１３１等を用いることができる。また、発光免疫測定法は、ＮＡＤＨ−ＦＭＮＨ２−ルシフェラーゼ系、ルミノール−過酸化水素−ＰＯＤ系、アクリジニウムエステル系又はジオキセタン化合物系等を用いることができる。
【００７８】
標識物質と抗体との結合法は、酵素免疫測定法の場合にはグルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法又は過ヨウ素酸法等の公知の方法を、放射免疫測定法の場合にはクロラミンＴ法、ボルトンハンター法等の公知の方法を用いることができる。
【００７９】
測定は、当技術分野で公知の方法により行うことができる（例えば、「抗体工学入門」金光修著，株式会社地人書館，１９９４年；「エンザイムイムノアッセイ」Ｐ．ＴＩＪＳＳＥＮ著，石川栄治監訳，株式会社東京化学同人，１９８９年などを参照のこと）。
【００８０】
例えば、本発明の抗体を直接標識する場合には、サンプル中の成分と、標識した本発明の抗体とを接触させて、抗原（精巣細胞分画）−本発明の抗体の複合体を形成させる。そして未結合の標識抗体を洗浄分離して、結合標識抗体量又は未結合標識抗体量よりサンプル中の抗原量、すなわち精巣細胞分画量を測定することができる。
【００８１】
また例えば、標識二次抗体を用いる場合には、本発明の抗体とサンプルとを接触させて反応させ（１次反応）、さらに標識二次抗体を反応させる（２次反応）。１次反応と２次反応は逆の順序で行ってもよいし、同時に行ってもよいし、又は時間をずらして行ってもよい。１次反応及び２次反応により、抗原−本発明の抗体−標識二次抗体の複合体、又は本発明の抗体−抗原−標識二次抗体の複合体が形成する。そして未結合の標識二次抗体を洗浄分離して、結合標識二次抗体量又は未結合標識二次抗体量よりサンプル中の抗原量、すなわち精巣細胞分画量を測定することができる。
【００８２】
具体的には、酵素免疫測定法の場合は標識酵素にその至適条件下で基質を反応させ、その反応生成物の量を光学的方法等により測定する。蛍光免疫測定法の場合には蛍光物質標識による蛍光強度を、放射免疫測定法の場合には放射性物質標識による放射能量を測定する。発光免疫測定法の場合は発光反応系による発光量を測定する。
【００８３】
本発明の検出方法は、免疫比濁法、ラテックス凝集反応、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応又は粒子凝集反応等の免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、目視的に測る測定法により実施する場合には、溶媒としてリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液又はグッド緩衝液等を用いることができ、更にポリエチレングリコール等の反応促進剤や非特異的反応抑制剤を含ませてもよい。
【００８４】
本発明の検出方法により、特定の精巣細胞分画を検出することができる。従って、本発明の検出方法は、特定の精巣細胞分画を欠損することによる精巣障害の検出、精子形成過程の把握による精巣細胞の分化に関する研究などに利用することができる。例えば、本発明の精巣細胞分画特異的抗体を用いることにより、特定の精巣細胞分画に含まれる細胞数の変化を調べることにより、精巣細胞の分化、精巣障害性を把握することができる。また、本発明の精巣細胞分画特異的抗体が認識するタンパク質の同定、及び当該遺伝子の単離を行うことによって、精巣細胞の分化制御因子を特定できる可能性もある。
【００８５】
またさらに、その他の本発明の精巣細胞分画特異的抗体の用途としては、精巣細胞を本発明の精巣細胞分画特異的抗体と反応させ、精巣細胞をその反応性に基づいて特定の精巣細胞分画を分取することができる。精巣細胞の分取は、「１．精巣細胞分画の調製」の項に記載されているようにセルソーターを用いて行うことができ、例えば本発明の精巣細胞分画特異的抗体を標識し、当該抗体と精巣細胞とを反応させ、標識によりセルソーターで精巣細胞を分取する。
【００８６】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は下記実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
【００８７】
〔実施例１〕精巣細胞の調製と分取
雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（１３週齢；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｊａｐａｎ， Ｉｎｃ．）の両精巣を摘出し、０．２５％コラゲナーゼ処理を３２．５℃にて３０分行うことにより単離精巣細胞を得た。
【００８８】
コラゲナーゼ処理後、まずピペッティングしながら７０μｍメッシュを通して濾過し、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ−：Ｃａ２＋，Ｍｇ２＋不含）に懸濁する。遠心洗浄後、ピペッティングしながら４０μｍメッシュを通してろ過し、ＰＢＳ（−）に懸濁する。
【００８９】
ＤＮＡの染色に際しては、７０％冷メタノール（４℃）で１時間かけて固定した後、０．２５％ＲＮａｓｅ処理を３７℃にて２０分間施し、５０μｇ／ｍｌヨードプロピディウム（ＰＩ）を２×１０６細胞／ｍｌの細胞懸濁液に添加した。上述のように調製した精巣細胞を、セルソーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ， Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて解析し、細胞分取をおこなった。
【００９０】
ＦＳＣ−ＤＮＡプロットによる解析の結果、精巣摘出後約４時間で、少なくとも７つの精巣細胞分画に分取することができた（図１Ｄ）。以下に、分取した精巣細胞の相対的な割合を示す（表２）。表２においては、ＤＮＡ含量に対応する倍数性を、ｓｕｂ−ｎ、ｎ、２ｎ及び４ｎで表し、同じ倍数性の細胞のうち、細胞が大きい分画をＲ、小さい分画をＬと表す。
【００９１】
さらに、セルソーティング後の観察により、各分画に含まれる精巣細胞の種類は共通しており、各分画に含まれる精巣細胞の種類を判定することができた（表２及び図２）。
【００９２】
【表２】
【００９３】
〔実施例２〕モノクローナル抗体の作製
細胞の免疫には、実施例１においてセルソーターを使用して分取した精巣細胞分画のうち、分画３（ｎ−Ｒ）の精巣細胞分画（円形精子細胞に相当する）を免疫源として使用した。免疫は、この免疫源を、雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（８週齢）３匹に、１回につき４．９〜７．０×１０６細胞／マウスとなるように、それぞれ３回又は４回腹腔内投与することでおこなった。ハイブリドーマの作製は、マウスミエローマ細胞（Ｘ６３−Ａｇ８．６５３）と感作動物由来の脾臓細胞とをＰＥＧ法にて細胞融合させた。その結果、計６０８ウエル分のハイブリドーマを得た。
【００９４】
続いて、ＨＡＴ培地を用いてハイブリドーマを選択した。ハイブリドーマのスクリーニングは、以下の３段階で行った。すなわち、１）ＥＬＩＳＡ法を用いた、細胞上清中の抗体産生の有無、２）間接蛍光抗体法を用いた、ラット精巣細胞に対する反応性の有無、３）セルソーターを用いたラット円形精子細胞に対する反応性の有無。この間のハイブリドーマの培養は、ＧＩＴ培地（日水製薬）を用いた。
【００９５】
最終的に、１種のハイブリドーマ（６Ｆ０３）から計２つのクローンを選別した（６Ｆ０３−２−１Ｈ１１−３Ｈ６及び６Ｆ０３−２−１Ｈ１１−４Ｃ９）。その後、６Ｆ０３−２−１Ｈ１１−３Ｈ６抗体について、腹水抗体を作製し、プロテインＡカラムにて精製した（以後、６Ｆ抗体と表記する）。なお、このモノクローナル抗体のアイソフォームの決定は、市販の検出キット（ＩｓｏｓｔｒｉｐＴＭ， Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）にて検討し、ＩｇＧ１κと判定した。
【００９６】
〔実施例３〕６Ｆ抗体の反応性の検討（セルソーターによる解析と細胞分取）本実施例においては、上記実施例２において作製した６Ｆ抗体の反応性を、セルソーターを用いて検討した。実施例１と同様の手法により各種系統の実験動物の精巣細胞を解析及び細胞分取した。抗体反応は、細胞固定前におこない、１次反応として６Ｆ抗体を０．１μｇ／１０６細胞で反応させ、続いて２次反応としてＦＩＴＣラベルした２次抗体（ＦＩＴＣポリクローナル抗マウスＩｇ（ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ＃５５４００１））を１μｇ／１０６細胞で反応させた。
【００９７】
また、各種系統の実験動物、すなわち３系統のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒｊ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮＣｒｊ、Ｃｒｊ：ＣＤ−１）、２系統のラット（Ｃｒｊ：Ｗｉｓｔａｒ、Ｆ３４４／ＤｕＣｒｊ）、モルモット（Ｓｔｄ：Ｈａｒｔｌｅｙ）、及びハムスター（Ｓｌｃ：Ｓｙｒｉａｎ）の各精巣を用いた。さらに、各日齢（生後７，１４，２１，２８，３５，４２，４９日及び１３週齢）のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）の精巣も用いた。
【００９８】
１３週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを用いたセルソーター解析の結果を図３に示す。図３Ｂは、６Ｆ抗体を用いて分取した精巣細胞分画を示すＤＮＡ含量−６Ｆ抗体反応プロットを示し、図３Ｃ〜Ｅは、図３Ｂにおいて枠で囲った陽性分画の細胞を示す。６Ｆ抗体は、一倍体及びｓｕｂ−ｎの分画の精巣細胞と反応し、特に、円形精子細胞の２４％の細胞集団、及びエロンゲイティング精子細胞の７３％の細胞集団と強く反応した（図３Ｂ、及び図３Ｃ及びＤ）。この反応性を倍数性から検討すると、一倍体の分画には、１）強陽性分画、２）弱陽性分画、及び３）陰性分画が存在し、倍数性ｓｕｂ−ｎの分画には、１）弱陽性分画、及び２）陰性分画が存在した。従って、円形精子細胞及びエロンゲイティング精子細胞（一倍体）、並びにエロンゲイティッド精子細胞（ｓｕｂ−ｎ）は、それらの６Ｆ抗体との反応性に基づいて、さらにそれぞれ３つ並びに２つの分画に分類することができる。
【００９９】
また、各系統のマウス、ラット、モルモット及びハムスターに由来する精巣を用いたセルソーター解析結果から、６Ｆ抗体との反応性は、ラットのみで認められた。従って、６Ｆ抗体は、抗原として使用した細胞を採取したラットに特異的であると言える。
【０１００】
さらに、各日齢（生後７，１４，２１，２８，３５，４２及び４９日）のＳＤラットの精巣を用いた実験から、生後２８日では、一倍体の分画の６Ｆ抗体に対する反応性は、弱陽性分画のみ認められ、強陽性分画は認められなかった。一方、生後３５日には、強陽性分画も認められるようになった。生後の各日齢の精巣を用いて、分化の時系列との関連性を検討した結果から、一倍体精巣細胞系列は、６Ｆ抗体と反応するサブグループと、反応しないサブグループとに分けられ、反応するサブグループにおいては、６Ｆ抗体の反応性は、細胞分化の時系列に従って、一倍体の分画で一過性に増加することが示唆された。このことは、６Ｆ抗体と反応する抗原分子が精巣の成熟段階と対応して発現していることがわかり、精巣細胞の分化を解析する上で重要な発見となった。
【０１０１】
〔実施例４〕６Ｆ抗体の反応性の検討（免疫組織化学的解析）
実施例２で作製した６Ｆ抗体を用いた免疫組織化学的検討は、雄性ＳＤラット（１３週齢）の脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、胸腺、精巣、精管、及び精巣上体を用いた。各組織は未固定のまま凍結切片（５μｍ）として使用した。なお、抗体はペルオキシダーゼで標識し、３，３’−ジアミノベンチジン（ＤＡＢ）を基質として発色させた。
【０１０２】
図４に示すように、精巣は、コントロール１次抗体（精製マウスＩｇＧ１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ＃０３００１０））（図４Ａ）と比較して、６Ｆ抗体と強く特異的に反応し、茶褐色を示した（図４Ｂ、矢印部分）。
【０１０３】
また、精巣組織内でも、精細管によっては、６Ｆ抗体と反応するものと、反応しないものが認められた（図４Ｂ）。これは、精子形成サイクル上、６Ｆ抗体と反応するステージと反応しないステージが存在するためである。従って、この６Ｆ抗体は、精子形成サイクルを研究する上で有用であることがわかる。
【０１０４】
〔実施例５〕６Ｆ抗体の反応性の検討（共焦点レーザー顕微鏡による解析）
実施例２で作製した６Ｆ抗体のラット精巣細胞との反応性を、間接蛍光抗体法にて検討し、共焦点レーザー顕微鏡にて解析した。
【０１０５】
その結果、蛍光は、円形精子細胞及びエロンゲイティング精子細胞の細胞表面のみに認められた（図５）。図５Ｂ〜Ｄは、円形精子細胞、エロンゲイティング精子細胞及びエロンゲイティッド精子細胞の拡大図を示している。図５Ｂ及びＣに示すように、６Ｆ抗体は、円形精子細胞及びエロンゲイティング精子細胞の細胞表面と特異的に反応していることがわかる。従って、精巣細胞分画の種類によって、精巣細胞表面上の抗原分子が異なることが示唆される。
【０１０６】
〔実施例６〕精巣障害モデルラットの作製と６Ｆ抗体を用いた解析
（１）精巣障害モデルラットの作製
２種の精巣障害性化学物質、すなわちアドリアマイシン（０，１，２ｍｇ／ｋｇ）、及びエチニルエストラジオール（０，３，１０ｍｇ／ｋｇ）を、各々６週齢及び９週齢の雄性ＳＤラットに、各々４週間及び２週間経口投与した。
【０１０７】
（２）セルソーターを用いた精巣細胞の分類と解析
実施例１と同様の手法で、ＤＮＡ量と細胞の大きさに基づき、単離精巣細胞を７つの分画に分類及び定量するとともに、６Ｆ抗体の陽性率を求めた。また、回収した全単離精巣細胞数は、添加した既知濃度の蛍光標識ビーズ（Ｆｌｏｗ−Ｃｏｕｎｔ， Ｅｐｉｃｓ）との比により求め、薬剤投与による精巣毒性を各分画の細胞数の変化として捉え、評価した。
【０１０８】
アドリアマイシン投与実験では、円形精子細胞での陰性及び弱陽性分画細胞数の減少が認められた。強陽性分画の細胞数については、２ｍｇ／ｋｇ群で減少する傾向は認められたが、それ程大きな変化ではなかった。エロンゲイティッド精子細胞及びエロンゲイティング精子細胞においては、６Ｆ抗体陰性及び陽性分画とも２ｍｇ／ｋｇ群で増加する傾向が認められた。
【０１０９】
また、エチニルエストラジオール投与実験では、円形精子細胞における弱陽性と強陽性分画細胞数の減少傾向が見られ、比率では、弱陽性分画の増加傾向と強陽性分画の減少傾向が円形精子細胞で認められた。
【０１１０】
６Ｆ抗体を用いることにより、精巣障害性物質の作用メカニズムや作用部位の特定という機能検査として有用である可能性が示唆された。また、精子形成過程解析法の有用性・妥当性を検討した結果、従来の手法に比べ、より感度よく、的確に障害を把握できる可能性が示唆された。
【０１１１】
【発明の効果】
本発明により、特定の精巣細胞分画と特異的に結合（反応）する抗体が提供される。この抗体は、その精巣細胞分画の精製、検出などに使用することができる。また、様々な化学物質などの外的要因、加齢などの内的要因による精巣障害性の検出、ＲＮＡの採取を介した精巣細胞分画特異的遺伝子の単離などに有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ラットから単離した精巣細胞を用いたセルソーター解析を示す図である。
Ａ：前方散乱光（ＦＳＣ）のヒストグラムを示す。
Ｂ：ＰＩ蛍光に基づくＤＮＡ含量のヒストグラムを示す。ピークＩは倍数性ｓｕｂ−ｎの精巣細胞を表し、ピークＩＩは一倍体（ｎ）の精巣細胞を表し、ピークＩＩＩは二倍体（２ｎ）の精巣細胞を表し、ピークＩＶは四倍体（４ｎ）の精巣細胞を表す。
Ｃ：前方散乱光−側方散乱光（ＦＳＣ−ＳＳＣ）のプロットを示す。
Ｄ：ＦＳＣ−ＤＮＡ含量のプロットを示す。１〜７は、精巣細胞分画を表す。
【図２】ＦＳＣ−ＤＮＡ含量プロットによる各精巣細胞分画のセルソーティングを示す図である。１〜７は、それぞれ図１Ｄの各分画に対応する。写真は、各分画で分取された細胞（ギムザ染色）を示し、枠で囲った部分は、各分画の代表的な細胞の拡大写真である。
【図３】６Ｆ抗体を用いた精巣細胞のセルソーター解析を示す図である。
Ａ：コントロール１次抗体
Ｂ：６Ｆ抗体
Ｃ〜Ｅ：図２Ｂにおいて枠で囲った各陽性分画部分をセルソーティングした像を示す。
【図４】６Ｆ抗体を用いた精巣組織の免疫組織化学染色を示す図である。Ａはコントロール１次抗体を表し、Ｂは６Ｆ抗体を表す。
【図５】６Ｆ抗体を用いた精巣細胞の免疫染色を示す図である。白い部分が蛍光を示す。Ａは、６Ｆ抗体と反応した細胞の全体像を示し、Ｂ〜Ｄは、それぞれ円形精子細胞、エロンゲイティング精子細胞、及びエロンゲイティッド精子細胞の拡大写真を示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to an antibody against a specific testis cell fraction, a method for producing the antibody, and a use of the antibody.
[0002]
[Prior art]
Accurate understanding of the state of the spermatogenesis process will lead to a sensitive detection of testicular damage due to exposure to environmental endocrine-disrupting substances such as dioxin, and also in the development of pharmaceuticals, testicular cell differentiation or It will help assess the efficacy and safety of growth.
[0003]
The mammalian spermatogenesis process can be roughly classified into 1) proliferation and differentiation of spermatogonia, 2) meiosis of spermatocytes, and 3) morphological change of spermatids. Divided into stages. At present, a culture system for the whole process of mammalian spermatogenesis has not been established, but this is because the mechanism of regulation of paracrine differentiation and proliferation by cytokines and the like in seminiferous tubules is unknown. On the other hand, understanding the process of spermatogenesis, which is important for elucidating the mechanism, is time-consuming and requires experience because it is mainly based on complicated morphological observations.
[0004]
In conventional analysis using testis cells, there is concern about damage to the cell membrane due to the technique used during testis cell isolation, and it is considered difficult to sort testis cells to produce antibodies against the cell membrane surface. I was In addition, no conventional testis-specific antibody has been reported other than an anti-c-kit antibody against spermatogonia as a specific antibody showing a narrow spectrum in testicular cell differentiation lineages (Yoshinaga, K. et. al., Development 113: 689-99, 1991). The testis-specific antibodies obtained so far also have low differentiation lineage specificity (Non-Patent Documents 1 and 2), which is caused by the decrease in screening efficiency due to sensitization of all testis cells. Conceivable.
For the above reasons, it has been desired to produce an antibody specific to the cell membrane surface of the testis cell fraction in a specific differentiation lineage.
[0005]
[Non-patent document 1]
Fenderson, B .; A. et al. , Developmental biology (USA), 1984, Vol. 103, p. 117-128
[Non-patent document 2]
Koshimizu, U.S.A. et al. , Biology of Reproduction (USA), 1993, Vol. 49, p. 875-884
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide an antibody against a specific testis cell fraction and a method for producing the same.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, developed a method of sorting testis cells into a plurality of fractions in an intact state by cell sorter analysis, and using the testis cell fraction as an antigen As a result, the present inventors have found that an antibody specific to a specific testis cell fraction can be obtained, and have completed the present invention.
[0008]
That is, the present invention provides at least one testis cell fraction selected from the group consisting of a subploid fraction, a haploid fraction, a diploid fraction and a tetraploid fraction. Antibodies.
[0009]
The present invention also provides a fraction of ploidy of sub-n, a fraction of a haploid and small and large cell size, and a fraction of a diploid and small cell size and large. And an antibody against at least one testis cell fraction selected from the group consisting of a tetraploid fraction having a small cell size and a large fraction.
[0010]
Here, the antibody is preferably a monoclonal antibody. Examples of the monoclonal antibody include a monoclonal antibody produced by a hybridoma having a deposit number of FERM P-18911.
[0011]
The present invention is also a hybridoma producing the above monoclonal antibody. As the hybridoma, for example, one having a deposit number of FERM P-18911 can be mentioned.
[0012]
The present invention also provides at least one testis cell fraction selected from the group consisting of a subploid fraction, a haploid fraction, a diploid fraction and a tetraploid fraction. This is a method for producing an antibody specific to a testis cell fraction, which is used as an antigen.
[0013]
The present invention also provides a fraction of ploidy of sub-n, a fraction of a haploid and small and large cells, and a fraction of a diploid and small cell size. A testis cell fraction, characterized by using as an antigen at least one testis cell fraction selected from the group consisting of a fraction, and a tetraploid fraction having a small cell size and a large fraction. This is a method for producing a specific antibody.
[0014]
Furthermore, the present invention is a method for purifying a testis cell fraction, which comprises using the above antibody.
Still further, the present invention is a method for detecting a testis cell fraction, which comprises contacting the above-mentioned antibody with a test sample.
[0015]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The present invention relates to an antibody against a specific testis cell fraction (hereinafter, also referred to as “testis cell fraction specific antibody”), and the antibody of the present invention uses the specific testis cell fraction as an antigen. Produced. Therefore, the antibodies of the present invention are used to study testis cell differentiation, to purify testis cell fractions, to detect testis cell fractions, and to use external factors such as various chemical substances, aging, etc. It is useful for detecting testicular disorder due to internal factors, isolating testis cell fraction-specific genes through collection of RNA, and the like.
[0016]
1. Preparation of testis cell fraction
In order to prepare the antibody of the present invention, a testis cell fraction serving as an antigen is prepared. In the present invention, “testis cells” refer to cells contained in testis. In the seminiferous tubules of the testis, during the development process, spermatogonia (2n) pass through spermatocytes (4n) to sperm cells (n), and the sperm cells transform into morphologically altered sperm cells (sub-n) ( Spermatogenesis). Here, “sub-n” represents the ploidy of a sperm cell whose morphology has changed. Both spermatids and spermatids that have changed morphology contain a set of chromosomes and contain the same amount of DNA, but the chromosomes of the spermatids that have changed morphology are more concentrated and present than those of sperm cells. Since the two forms differ from each other, the ploidy of the morphologically altered sperm cell is represented by sub-n, and the ploidy of the sperm cell is represented by n. The term "ploidy" refers to the number of chromosome sets per cell, and is referred to as haploid, diploid, etc. according to the number of chromosome sets.
[0017]
Therefore, the testis contains the following cells.
・ Diploid spermatogonia (Spermatogonia)
Tetraploid spermatocytes, ie, leptoten spermatocytes (Leptotene), Zygoten spermatocytes (Zygotene), pachytene spermatocytes (Pachytene)
Haploid spermatids, ie, elongating spermatids, round spermatids
・ Elongated spermatids with sub-n ploidy (Elongated spermatid)
-Diploid somatic cells, ie, Sertoli cells (Sertoli), Leydig cells (Leydig), myoid cells (Myoid)
In the present invention, the testis cells are preferably fractionated into 4 to 7 fractions, for example, 7 or 4 fractions, using cell sorter analysis, and at least one fraction is used as an antigen. .
[0018]
(1) Isolation of testis cells
Testis cells are obtained by isolation from the testis. Collection of testes from a subject can be performed by methods known in the art. For example, a mammal is exsanguinated to death under anesthesia, the testis is excised using scissors or the like, and after removing fat, the testicular white membrane and the vascular system are removed.
[0019]
Subsequently, testis cells are isolated from the testis. In the present invention, "isolation" of cells refers to extracting only a cell fraction containing testis cells predominantly from testis and separating individual cells. "Predominantly" means that the percentage of testis cells in the isolated cell fraction is at least 90%. At this time, it is important to isolate testis cells so that they can withstand cell sorter analysis. Therefore, the present inventors have developed a technique for isolating testis cells in a state suitable for cell sorter analysis by performing a combination of enzymatic separation and mechanical separation described below.
[0020]
In the present invention, enzymatic separation is performed using collagenase. For example, testes are placed in 0.1-0.5% collagenase, preferably in 0.25% collagenase. The treatment is performed at 30 to 38 ° C., preferably 32.5 ° C., for 15 to 60 minutes, preferably for 20 to 30 minutes. At this time, the mixture is shaken in a water bath at 100 to 200 cycles / min, preferably 150 to 160 cycles / min.
[0021]
Mechanical separation is accomplished by passing the testes stepwise through a reduced mesh, stepwise through a thin needle, or a combination thereof. The mesh may be in the range of 40 μm to 100 μm, for example, 40 μm or 70 μm. An injection needle having a diameter in the range of 18G to 27G, for example, 24G, 26G or 27G can be used.
[0022]
In the present invention, it is preferable that the enzymatic separation is performed using 0.25% collagenase, and the mechanical separation is pipetted on a mesh to isolate testis cells.
[0023]
Subsequently, the isolated testis cells are prepared as a cell suspension for analysis with a cell sorter. The suspension solution is not particularly limited as long as it does not destroy testis cells and is generally used for testis cells. For example, as a suspension solution, Ca 2+ And Mg 2+ Phosphate-buffered saline (PBS-) without 2% bovine serum albumin (BSA) and PBS (-). The optimal cell suspension concentration for cell sorter analysis is 5 × 10 5 ~ 5 × 10 7 Pcs / ml, preferably 1 × 10 6 ~ 3 × 10 6 Pcs / ml.
By the operation as described above, testis cells can be isolated so as to be sufficiently resistant to cell sorter analysis and to maintain the cell morphology after analysis.
[0024]
(2) Staining of testis cell DNA
After the testis cells are isolated, the DNA of the testis cells is stained with a fluorescent dye in order to determine the DNA content of the testis cells by cell sorter analysis.
[0025]
The testis cells are preferably fixed before staining. By the immobilization, the fluorescent dye that binds to DNA passes through the cell membrane for the first time, and the cell and DNA can bind.
Immobilization of cells can be performed by a method known in the art, for example, fixing using methanol, fixing using ethanol, and the like.
[0026]
More specifically, for example, when testis cells are fixed using methanol, the cell suspension is added dropwise to the cell suspension in 60 to 80% methanol, preferably 70% methanol while stirring. (Cells: methanol is added to about 1:30) and maintained at 4 ° C. for 1 hour. Cells can be preserved in this state by centrifuging the alcohol fixative and replacing it with PBS (-).
[0027]
After cell fixation, it is preferable to perform RNase treatment after replacing alcohol with PBS (−) in order to prevent interference of the fluorescent dye with DNA binding by RNA. RNase is used at a concentration of 0.1 to 0.5%, preferably 0.25%, and is used at a temperature of 36 to 38 ° C, preferably 37 ° C, for 10 to 30 minutes, preferably 20 minutes. Incubate.
[0028]
After RNase treatment, the DNA of testis cells is stained. The fluorescent dye for staining DNA is not particularly limited as long as it is commonly used in the art. Examples include iodopropidium (PI), ethidium bromide (EtBr), Hoechst 33342, and the like. PI and EtBr are known to be inserted into the double helix of nucleic acids and to enhance fluorescence intensity. Hoechst 33342 is known to be effective for DNA staining of living cells.
[0029]
For example, when cells are stained with PI, 10 to 100 μg / ml, preferably 50 μg / ml of PI is added to testis cells under light shielding, and the testis cells are incubated at 10 to 1 ° C., preferably 4 ° C. for 10 to 60 minutes. The dyeing is carried out, preferably for 30 minutes.
[0030]
For example, when cells are stained with Hoechst 33342, Hoechst 33342 is added to testis cells at a concentration of 5 to 10 μM, and the cells are stained at 10 to 30 ° C., preferably at room temperature, for 10 to 60 minutes, preferably for 20 minutes. I do.
[0031]
(3) Cell sorter analysis
The testis cells prepared as described above are subjected to cell sorter analysis, and sorted into a testis cell fraction. The cell sorter refers to a device that sorts and sorts cells based on various parameters of the cells.
[0032]
(3.1) Principle of cell sorter
The principle of the cell sorter is to pass cells in a sample one by one through the center of the laser light, detect the fluorescence and scattered light emitted when the cells pass through the laser light, and then use those lights for various electrical pulses. To perform signal analysis, perform histogram analysis and list mode data analysis on the target cells, and sort cells based on the results. Therefore, the cell sorter includes a flow cytometer and a cell sorting device, has a function of displaying a measurement result of signal information of fluorescence or scattered light, for example, as a dot plot, and also has a function of displaying specific signal information. Emitted cells can be sorted by a cell sorter. Such a method is called flow cytometry.
[0033]
Cell sorters are widely used in the art because viable cells can be aseptically sorted with high viability. For a detailed description of the cell sorter analysis, see, for example, "Actual Practice of Animal Cell Culture" (translated by Yuji Mitsui, Maruzen Co., Ltd., 1990), "Introduction to the Principle of Flow Cytometry" (Beckman Coulter, Inc., cytometry group) See homepage, http://www.bc-cytometry.com/add_page/fcmprin.html).
[0034]
The cell sorter that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it has the above-described flow cytometer and cell sorting device. For example, FACSCalibur (manufactured by Becton Dickinson) and EPICS ALTRA (manufactured by Beckman Coulter) Is mentioned. The cell sorter is handled and analyzed according to the manufacturer's instructions.
[0035]
(3.2) Sorting by parameter
In the present invention, two parameters, ie, DNA content and / or cell size of testis cells, are measured using fluorescence and forward scattered light emitted by laser light irradiation of testis cells.
[0036]
Fluorescence is caused by the fact that when a cell contains a fluorescent dye, the fluorescent dye is excited by the energy of laser light, and the cell emits light called fluorescence in all directions. By measuring this fluorescence, the characteristics of the cells can be known. For example, in the present invention, since the DNA of testis cells is stained with a fluorescent dye, the fluorescence intensity is proportional to the DNA amount of testis cells.
[0037]
The wavelength of the fluorescence varies depending on the fluorescent dye. Therefore, it is necessary to change the excitation light to be irradiated according to the fluorescent dye used for staining the DNA. For example, the fluorescent dye PI excites at 488 nm and has a maximum emission spectrum at about 615 nm. The fluorescent dye Hoechst 33342 is excited at 350 to 363 nm and recovered at 450 nm or more.
[0038]
FIG. 1B shows a plot of the DNA amount (PI amount) and the cell number of testis cells as an example of the case where the cell sorter analysis by fluorescence is performed. Testicular cell DNA content is associated with chromosomal ploidy. Therefore, when the DNA amount (PI) is different, the peak of the cell number is different. For example, I to IV shown in FIG. 1B correspond to sub-n, n (haploid), 2n (diploid), and 4n (tetraploid), respectively. Here, the testis cells of sub-n and n each contain a set of chromosomes and contain the same amount of DNA, but the chromosomes of testis cells of sub-n are more concentrated than those of n. Are different from each other in that they exist. Therefore, as shown in FIG. 1B, it is considered that sub-n and n appear as distinguishable peaks. By utilizing such fluorescence, testis cells can be classified by ploidy.
[0039]
Forward scatter (FSC) is the scattering of laser light that mainly occurs on the cell surface and is proportional to the cell surface area. That is, the larger the cells, the stronger the resulting FSC. Therefore, the size of testis cells can be measured using FSC.
[0040]
FIG. 1A shows a plot of FSC of testis cells and the number of cells as an example of a case where cell sorter analysis by FSC is performed. As shown in FIG. 1A, the relationship between testis cell size (FSC) and cell number was not observed and there was no peak. Therefore, testis cells cannot be classified only by measuring the size of testis cells.
[0041]
On the other hand, when fluorescence and FSC are combined, cells can be classified based on two parameters, the DNA amount of testis cells and the cell size. For example, as shown in FIG. 1D, when a plot of DNA amount (PI) -FSC is created, testis cells can be classified into the following seven fractions. That is, (1) a ploidy fraction of sub-n, (2) a haploid, small cell size fraction, and (3) a haploid, large cell size. A fraction, (4) a diploid, small cell size fraction, (5) a diploid, large cell size fraction, (6) a tetraploid , A small cell size fraction, and / or (7) a tetraploid, large cell size fraction. The cell fraction will be collected.
[0042]
Side scattered light (SSC), which is generally used for cell sorter analysis, is light scattered at an angle of 90 ° with respect to the axis of the irradiated laser light, and is mainly used in cells. It represents the complexity of the internal structure of cells such as granules. That is, the more complicated the structure inside the cell, the stronger the SSC that is generated. Therefore, the complexity of the internal structure of testis cells can be measured using SSC. FIG. 1C shows a plot of FSC and SSC of testis cells as an example of the case where the cell sorter analysis by SSC is performed. As shown in FIG. 1C, no association was found between testis cell size (FSC) and complexity of cell internal structure (SSC), and there was no peak. Therefore, testis cells cannot be classified using the complexity of the internal structure of the cells as a parameter.
[0043]
(3.3) Relationship between testis cell type and seven fractions
As described above, by utilizing cell sorter analysis, testis cells can be sorted into four or seven fractions based on DNA content and size. The four and seven testis cell fractions are summarized in Table 1 below. The four fractions have the same DNA content (ploidy) in Table 1.
[0044]
[Table 1]
[0045]
In Table 1, the numbers in the "fraction" column correspond to the numbers shown in the present specification and the drawings, and L and R in the "size" column indicate that cells having the same ploidy This means a small fraction (L) and a large fraction (R) when divided into two fractions based on the above. In the present invention, as shown in FIG. 1D, testis cells having the same ploidy, except for the sub-n cells, can be divided into two fractions based on their size. Here, “large” means that the volume of the cell is larger than that of the others. Also, “small” indicates that the volume of the cell is smaller than the others. In the present invention, the boundary between “large” and “small” is defined at the inflection point of the curve in each fraction of the plot of DNA (PI) -FSC.
FIG. 2 shows cells contained in each testis cell fraction. The cells shown in the frame of the photograph represent representative cells of each fraction.
[0046]
Since the above-mentioned technique does not incorporate a testicular cell membrane-damaging operation, the testis cell fraction can be collected with the cell membrane intact. The testis cell fraction collected in this manner is homogeneous and is sorted without destroying the cells, and thus can be used for production of an antibody described later. In the present invention, the “testis cell fraction” refers to 80 to 100%, preferably 90 to 100%, more preferably 95% or more of all components contained in the cell population, which is characteristic of the fraction. Testis cells having a high DNA content and / or cell size.
[0047]
2. Antibodies of the invention
The antibody of the present invention has a characteristic of reacting specifically with a specific testis cell fraction, and is prepared using the specific testis cell fraction as an antigen. The globulin type of the antibody of the present invention is not particularly limited as long as it has the above characteristics, and may be any of IgG, IgM, IgA, IgE, and IgD, but IgG is preferred.
[0048]
In the present invention, “antibody” means an antibody molecule capable of binding to a specific testis cell fraction that is an antigen, and may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. In the present invention, antibodies (polyclonal antibody and monoclonal antibody) can be produced, for example, by the following method.
[0049]
(1) Preparation of immunogen
In preparing the antibody of the present invention, testis cells to be used as an immunogen (antigen) are prepared. Testis cells for immunogens are sorted as described in the above section “1. Classification of testis cells” and include a specific testis cell fraction. The testis cell fraction contained in the immunogen may contain only cells belonging to one type of fraction, or may contain two or more types of fractional cells.
[0050]
Next, the obtained testis cell fraction is dissolved in a buffer to prepare an immunogen. If necessary, an adjuvant may be added for effective immunization. Examples of the adjuvant include commercially available complete Freund's adjuvant and incomplete Freund's adjuvant, and any of these may be mixed.
[0051]
(2) Monoclonal antibody
(2.1) Immunization and collection of antibody-producing cells
The immunogen obtained as described above is administered to mammals, for example, rats, mice (for example, BALB / c of inbred mice), rabbits and the like. The single dose of the immunogen is appropriately determined depending on the kind of the immunized animal, the administration route, and the like. 6 ~ 1 × 10 7 Cells / animal, preferably 4.9-7.0 × 10 6 Cells / animal. Immunization is performed mainly by injecting the immunogen intravenously, subcutaneously, or intraperitoneally. The interval of immunization is not particularly limited, and after the first immunization, booster immunization is performed 3 to 5 times, preferably 3 to 4 times at intervals of several days to several weeks, preferably at intervals of 2 to 4 weeks. After the first immunization, the antibody titer in the serum of the immunized animal is repeatedly measured by an ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) method or the like. When the antibody titer reaches a plateau, the immunogen is injected intravenously or intraperitoneally. And final immunization. Then, 2 to 5 days, preferably 3 days after the last immunization, antibody-producing cells are collected.
[0052]
Examples of antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, peripheral blood cells, and the like, with spleen cells or local lymph node cells being preferred. To prepare antibody-producing cells from an immunized animal, any technique known in the art can be used. For example, spleen cells may be obtained by aseptically removing the spleen, shredding in, for example, Eagle's minimal basal medium (MEM) or RPMI 1640 medium, loosening with forceps, lightly centrifuging, and discarding the supernatant. The erythrocytes may be removed by treating with an ammonium buffer for 1 to 2 minutes, and finally, they are prepared by washing several times with the above medium. For example, local lymph node cells are prepared by aseptically removing local lymph nodes, shredding them in, for example, an RPMI 1640 medium, crushing them with forceps, and suspending the cells in the medium.
[0053]
(2.2) Cell fusion
To obtain hybridomas, cell fusion between antibody-producing cells obtained from the immunized animal and myeloma cells is performed as described above.
[0054]
As the myeloma cells to be fused with the antibody-producing cells, generally available cell lines of animals such as mice can be used. The cell line used has drug selectivity, cannot survive in a HAT selection medium (including hypoxanthine, aminopterin, and thymine) in an unfused state, but can survive only in a state fused to an antibody-producing cell. Are preferred. The cell line is preferably derived from an animal of the same strain as the immunized animal. Specific examples of myeloma cells include P3X63-Ag., A hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase (HGPRT) -deficient cell line derived from BALB / c mice. 8 strains (ATCC TIB9), P3X63-Ag. 8. U1 strain (Cancer Research Research Source Bank (JCRB) 9085), P3 / NSI / 1-Ag4-1 strain (JCRB 0009), P3X63-Ag8.653 strain (JCRB 0028) or Sp2 / 0-Ag14 strain (JCRB 0029) And the like.
[0055]
Next, the myeloma cells are fused with the antibody-producing cells. Cell fusion is performed by mixing antibody-producing cells and myeloma cells at a ratio of about 1: 1 to 10: 1 in an animal cell culture medium such as DMEM or RPMI1640 medium that does not contain serum. The fusion reaction is performed in the presence. As a cell fusion promoter, polyethylene glycol having an average molecular weight of 1,500 to 4,000 daltons or the like can be used at a concentration of about 10 to 80% (PEG method). In some cases, an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide may be used in combination to increase the fusion efficiency. Furthermore, antibody-producing cells and myeloma cells can be fused using a commercially available cell fusion device utilizing electrical stimulation (eg, electroporation).
[0056]
(2.3) Hybridoma selection and cloning
The target hybridoma is selected from the cells after the cell fusion treatment. For this purpose, the cell suspension is appropriately diluted with, for example, RPMI1640 medium containing fetal bovine serum and then placed on a microtiter plate at 2 × 10 4. 5 Seeding is carried out per cell, and a selective medium is added to each well, and thereafter, the selective medium is exchanged appropriately for culturing. The culturing temperature is 36 to 38 ° C, preferably about 37 ° C. When the myeloma cell is a HGPRT-deficient strain or a thymidine kinase (TK) -deficient strain, a cell having antibody-producing ability and a myeloma-producing cell can be obtained by using a selective medium (HAT medium) containing hypoxanthine / aminopterin / thymidine. Only cell hybridomas can be selectively cultured and expanded. As a result, cells that grow about 14 days after the start of culture in the selection medium can be obtained as hybridomas.
[0057]
Next, hybridomas are screened. Screening is performed for the following three points.
1) Presence or absence of the target antibody in the culture supernatant of the hybridoma
2) Reactivity of antibodies produced by hybridomas to testis cells
3) Presence or absence of reactivity of the antibody produced by the hybridoma to the testis cell fraction used as the antigen
The screening in 1) can be performed according to a method generally used in the art. For example, a part of a culture supernatant contained in a well grown as a hybridoma is collected and subjected to enzyme immunoassay (ELISA, EIA; Enzyme Immuno Assay), radioimmunoassay (RIA; Radio Immuno Assay) and the like.
The screening in 2) can also be performed according to a method generally known in the art. For example, the isolated testis cells are reacted with the fluorescently labeled antibody using an indirect fluorescent antibody method, and observation by a fluorescence microscope is performed. It can be done by doing.
The screening in 3) can also be performed according to a method generally used in the art. For example, the isolated testis cells are reacted with the antibody labeled with fluorescence using a cell sorter, and the reactivity to each fraction is examined. Can be done by doing
[0058]
Cloning of the fused cells is performed by a limiting dilution method or the like, and finally a hybridoma, which is a monoclonal antibody-producing cell, is established. As described later, the hybridoma of the present invention is stable in culture in a basic medium such as GIT, RPMI1640, or DMEM, and produces and secretes a monoclonal antibody that specifically reacts with a specific fraction of testis cells. It is.
[0059]
The hybridoma prepared using the testis cell fraction 3 (that is, circular sperm cells) described in the section “1. Preparation of testis cell fraction” as an antigen is a patented organism of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. Deposited at the Depositary Center (1-1, Higashi 1-1, Tsukuba, Ibaraki Prefecture, Chuo No. 6) on July 2, 2002 as FERM P-18911.
[0060]
(2.5) Collection of monoclonal antibody
As a method for collecting a monoclonal antibody from the established hybridoma, an ordinary cell culture method, an ascites formation method, or the like can be employed.
[0061]
In the cell culture method, the hybridoma is cultured in an animal cell culture medium such as an RPMI 1640 medium containing 10% fetal bovine serum, a MEM medium, or a serum-free medium under ordinary culture conditions (for example, 37 ° C., 5% CO 2). 2 ) For 3 to 5 days, and the antibody is obtained from the culture supernatant.
[0062]
In the case of the ascites formation method, about 2 × 10 5 hybridomas are intraperitoneally injected into a myeloma cell-derived mammal and an allogeneic animal. 6 The individual is administered and the hybridoma is grown in large quantities. Then, ascites or serum is collected 1 to 3 weeks later.
[0063]
In the above antibody collection method, if purification of the antibody is required, a known method such as ammonium sulfate salting out method, ion exchange chromatography, affinity chromatography, gel chromatography, or the like is appropriately selected, or By combining them, a purified monoclonal antibody of the present invention can be obtained.
[0064]
(3) Preparation of polyclonal antibody
When preparing a polyclonal antibody, the animal is immunized in the same manner as described above, and the antibody titer is determined by enzyme immunoassay (ELISA or EIA) or radioimmunoassay (RIA) 6 to 60 days after the final immunization. The blood is measured and blood is collected on the day showing the highest antibody titer to obtain an antiserum. Thereafter, the reactivity of the polyclonal antibody in the antiserum is measured by an ELISA method or the like.
[0065]
(4) Properties of antibody
The antibodies of the present invention prepared in the above (2) and (3) react specifically with the testis cell fraction used for preparing these antibodies. In order to examine the properties of the antibody of the present invention, for example, reactivity with the testis cell fraction, reactivity with the testis and other tissues, specificity for the animal species, and reaction according to the age (day / month age) of the animal species The specific testis cell fraction that reacts with the antibody or the antibody of the present invention is isolated using the antibody of the present invention, and the properties of the cells in the cell fraction, proteins, DNA, RNA, etc., are compared with the antibody of the present invention. Test and understand its properties.
[0066]
The properties of the antibody of the present invention revealed by the above-mentioned test are testicular cell differentiation, detection of testicular damage due to various chemical substances, external and internal factors, and testis cell fractionation specific via RNA collection. It is useful for conducting research and analysis such as gene isolation.
[0067]
3. Uses of the antibody of the present invention
Since the testis cell fraction-specific antibody of the present invention specifically binds (reacts with) a specific testis cell fraction, it can be used for purification and detection of the testis cell fraction. It is also useful for detecting testicular dysfunction due to external factors such as various chemical substances, internal factors such as aging, and isolating testis cell fraction-specific genes through collection of RNA.
[0068]
(1) Method for purifying testis cell fraction
The purification method of the present invention can be performed using a purification method using an antibody. A purification method using an antibody includes, but is not limited to, affinity chromatography and the like.
[0069]
Affinity chromatography refers to chromatography utilizing a specific interaction of a biological substance, and the interaction in the present invention refers to an antigen-antibody reaction. Specifically, a chromatography column is filled with a carrier having the antibody of the present invention immobilized thereon, and when a sample is applied to the column, the immobilized antibody of the present invention and the antigen contained in the sample are applied. (I.e., a specific testis cell fraction) so that the antigen can be separated from the sample.
In the purification method of the present invention, a sample refers to a sample containing a specific testis cell fraction to be separated and purified, and examples include a testis cell suspension.
[0070]
As a carrier for immobilizing the antibody of the present invention, polystyrene, polycarbonate, polyvinyltoluene, polypropylene, polyethylene, polyvinyl chloride, nylon, polymethacrylate, latex, gelatin, agarose, cellulose, sepharose, glass, metal, ceramics or magnetic Beads made of a material such as a body can be used. The immobilization can be performed by binding the carrier and the antibody of the present invention according to a known method such as a physical adsorption method, a chemical bonding method, or a combination thereof. In addition, as a column that can be used in the purification method of the present invention, an appropriate affinity column can be selected depending on the carrier used.
[0071]
The amount of the carrier to be packed into the column can be determined from the ratio of the amount of the immobilized antibody by calculating the amount of the immobilized antibody and estimating the amount of the antigen (specific testis cell fraction) contained in the sample. preferable. Generally, the amount of carrier will be about 0.5-1 ml.
[0072]
Subsequently, the sample is applied to the column. The specific testis cell fraction contained in the sample binds to the solid-phased antibody of the present invention as an antigen and is retained in the column. Therefore, a specific testis cell fraction can be purified by washing the unbound components from the column and then performing an operation of weakening the binding between the antibody of the present invention and the antigen. An operation of weakening the binding includes the use of a known elution solution. Known elution solutions include, for example, 1 M propionic acid (pH 2.5), 0.2 M glycine-HCl (pH 2.5), 0.05 M diethylamine-HCl (pH 11.5), 0.15 M NaCl-ammonia (pH 11 ), Chaotropic ions (pH 7.0-8.0, 3M), 10% dioxane, 50% ethylene glycol, 6M guanidine-HCl (pH 3.1), and 8M urea.
[0073]
By the above operation, a specific testis cell fraction can be separated and purified without damaging the cell and DNA, and the purified testis cell fraction can be used for further applications. For example, it has been suggested that round sperm cells can be used for infertility treatment by fusing with eggs in micro-fertilization, but at that time, testis cells other than round sperm cells may be selected. It has been reported that the results of this technique cannot be predicted (The Ethics Committee of the Japan Infertility Society, "Insemination using human round sperm cells"). Therefore, it is considered that only the circular sperm cells can be obtained by the purification method of the present invention, so that the above-mentioned problems can be solved. However, the purification method of the present invention is not limited to such uses.
[0074]
(2) Method for detecting testis cell fraction
The detection method of the present invention can detect (measure) a specific testis cell fraction that reacts as an antigen with the antibody of the present invention by using the antibody of the present invention in an immunological assay. Examples of the immunoassay include enzyme immunoassay (ELISA, EIA), fluorescence immunoassay, radioimmunoassay (RIA), luminescence immunoassay, immunoturbidimetry, immunoassay and latex agglutination. Reaction, latex nephelometry, hemagglutination, particle agglutination, western blot, and the like.
[0075]
The sample to be tested in the detection method of the present invention is not particularly limited as long as the sample is to detect the presence of a specific testis cell fraction. For example, a testis section, a testis cell suspension, etc. are mentioned.
[0076]
In the detection method of the present invention, in order to easily detect the reaction between the antibody of the present invention and a specific testis cell fraction in a sample, it is necessary to label the antibody of the present invention to directly detect the reaction. Or indirectly by using a labeled secondary antibody. In the detection method of the present invention, it is preferable to use the latter indirect detection (for example, a sandwich method) in terms of sensitivity.
[0077]
As a labeling substance, in the case of enzyme immunoassay, peroxidase (POD), alkaline phosphatase, β-galactosidase, urease, catalase, glucose oxidase, lactate dehydrogenase, amylase or biotin-avidin complex, etc. Fluorescein isothiocyanate, tetramethylrhodamine isothiocyanate, substituted rhodamine isothiocyanate or dichlorotriazine isothiocyanate, etc. in the case of immunoassay, and tritium, I 125 Or I 131 Etc. can be used. In addition, the luminescence immunoassay was performed by NADH-FMNH 2 -Luciferase type, luminol-hydrogen peroxide-POD type, acridinium ester type, dioxetane compound type and the like can be used.
[0078]
The binding method between the labeling substance and the antibody may be a known method such as a glutaraldehyde method, a maleimide method, a pyridyl disulfide method or a periodate method in the case of an enzyme immunoassay, or chloramine T in the case of a radioimmunoassay. A publicly known method such as the Bolton Hunter method can be used.
[0079]
The measurement can be performed by a method known in the art (for example, "Introduction to Antibody Engineering" written by Osamu Kanemitsu, Jinjinshokan Co., Ltd., 1994; "Enzyme Immunoassay" written by P. TIJSSEN, translated by Eiji Ishikawa, stock (See Tokyo Chemical Company, 1989).
[0080]
For example, when the antibody of the present invention is directly labeled, a component in a sample is contacted with the labeled antibody of the present invention to form a complex of antigen (testis cell fraction) -antibody of the present invention. . Then, the unbound labeled antibody is washed and separated, and the amount of antigen in the sample, that is, the amount of testis cell fraction, can be measured from the amount of bound labeled antibody or the amount of unbound labeled antibody.
[0081]
When a labeled secondary antibody is used, for example, the antibody of the present invention is brought into contact with a sample to react (primary reaction), and further reacted with a labeled secondary antibody (secondary reaction). The primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at a different time. By the primary reaction and the secondary reaction, a complex of the antigen-antibody of the present invention-labeled secondary antibody or a complex of the antibody of the present invention-antigen-labeled secondary antibody is formed. Then, the unbound labeled secondary antibody is washed and separated, and the amount of antigen in the sample, that is, the amount of testis cell fraction, can be measured from the amount of bound labeled secondary antibody or the amount of unbound labeled secondary antibody.
[0082]
Specifically, in the case of an enzyme immunoassay, a labeling enzyme is reacted with a substrate under the optimum conditions, and the amount of the reaction product is measured by an optical method or the like. In the case of the fluorescence immunoassay, the fluorescence intensity by the fluorescent substance label is measured, and in the case of the radioimmunoassay, the amount of radioactivity by the radioactive substance label is measured. In the case of a luminescence immunoassay, the amount of luminescence by a luminescence reaction system is measured.
[0083]
The detection method of the present invention uses immunoturbidimetry, latex agglutination, latex turbidimetry, the formation of immune complex aggregates such as hemagglutination or particle agglutination, and the transmitted light or scattered light by an optical method. When the measurement is carried out by a measuring method of measuring or visually measuring, a phosphate buffer, a glycine buffer, a Tris buffer or a Good buffer can be used as a solvent, and a reaction accelerator such as polyethylene glycol or the like can be further used. A non-specific reaction inhibitor may be included.
[0084]
According to the detection method of the present invention, a specific testis cell fraction can be detected. Therefore, the detection method of the present invention can be used for the detection of testicular disorders due to the deficiency of a specific testis cell fraction, and for the study of testis cell differentiation by grasping the spermatogenesis process. For example, by using the testis cell fraction-specific antibody of the present invention and examining changes in the number of cells contained in a specific testis cell fraction, testicular cell differentiation and testicular disorder can be determined. Further, by identifying a protein recognized by the testis cell fraction-specific antibody of the present invention and isolating the gene, it is possible that a testis cell differentiation controlling factor may be specified.
[0085]
Still further, as another use of the testis cell fraction-specific antibody of the present invention, testis cells are reacted with the testis cell fraction-specific antibody of the present invention, and testis cells are transformed into specific testis cells based on their reactivity. Fractions can be collected. The testis cells can be collected using a cell sorter as described in the section “1. Preparation of testis cell fraction”, for example, by labeling the testis cell fraction-specific antibody of the present invention, The antibody is allowed to react with the testis cells, and the testis cells are collected using a cell sorter by labeling.
[0086]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to the following examples.
[0087]
[Example 1] Preparation and sorting of testis cells
Male Sprague-Dawley (SD) rats (13 weeks old; Charles River Japan, Inc.) were excised from both testes and subjected to 0.25% collagenase treatment at 32.5 ° C. for 30 minutes to isolate testis cells. Obtained.
[0088]
After the collagenase treatment, the mixture was filtered through a 70 μm mesh while pipetting first, and then phosphate-buffered saline (PBS-: Ca 2+ , Mg 2+ (Not included). After washing by centrifugation, the solution is filtered through a 40 μm mesh while pipetting, and suspended in PBS (−).
[0089]
For DNA staining, the cells were fixed with 70% cold methanol (4 ° C.) for 1 hour, then subjected to 0.25% RNase treatment at 37 ° C. for 20 minutes, and 50 μg / ml iodopropidium (PI) was added thereto. × 10 6 Added to cells / ml cell suspension. The testis cells prepared as described above were analyzed using a cell sorter (FACSCalibur, Becton Dickinson) to perform cell sorting.
[0090]
As a result of analysis by FSC-DNA plot, at least about 4 hours after orchiectomy, the cells could be sorted into at least seven testis cell fractions (FIG. 1D). The relative proportions of the testis cells collected are shown below (Table 2). In Table 2, the ploidy corresponding to the DNA content is represented by sub-n, n, 2n, and 4n, and among the cells having the same ploidy, the fraction having larger cells is represented by R, and the fraction having smaller cells is represented by L.
[0091]
Furthermore, by observation after cell sorting, the type of testis cells contained in each fraction was common, and the type of testis cells contained in each fraction could be determined (Table 2 and FIG. 2).
[0092]
[Table 2]
[0093]
[Example 2] Preparation of monoclonal antibody
For the cell immunization, the testis cell fraction of fraction 3 (nR) (corresponding to round sperm cells) among the testis cell fractions collected using the cell sorter in Example 1 was used as an immunogen. used. Immunization was performed by immunizing this female with three female BALB / c mice (8 weeks old) at a time of 4.9 to 7.0 x 10 6 This was performed by intraperitoneal administration three or four times, respectively, to obtain cells / mouse. Hybridomas were prepared by cell fusion of mouse myeloma cells (X63-Ag8.653) and spleen cells derived from sensitized animals by the PEG method. As a result, a total of 608 wells of hybridomas were obtained.
[0094]
Subsequently, hybridomas were selected using HAT medium. Hybridoma screening was performed in the following three stages. That is, 1) the presence or absence of antibody production in the cell supernatant using the ELISA method, 2) the presence or absence of reactivity to rat testis cells using the indirect fluorescent antibody method, and 3) the rat circular sperm cells using a cell sorter. Reactivity. GIT medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) was used for culturing the hybridoma during this period.
[0095]
Finally, a total of two clones were selected from one hybridoma (6F03) (6F03-2-1H11-3H6 and 6F03-2-1H11-4C9). Thereafter, for the 6F03-2-1H11-3H6 antibody, an ascites antibody was prepared and purified with a protein A column (hereinafter referred to as 6F antibody). The isoform of this monoclonal antibody was determined using a commercially available detection kit (Isstrip). TM , Boehringer Mannheim) and determined to be IgG1κ.
[0096]
Example 3 Investigation of Reactivity of 6F Antibody (Analysis by Cell Sorter and Cell Sorting) In this example, the reactivity of the 6F antibody prepared in Example 2 was examined using a cell sorter. Testicular cells of various types of experimental animals were analyzed and sorted in the same manner as in Example 1. The antibody reaction was performed before the cell fixation. 6 The cells were reacted, followed by FITC-labeled secondary antibody (FITC polyclonal anti-mouse Ig (pharmingen # 554001)) at 1 μg / 10 6 The cells were reacted.
[0097]
Experimental animals of various strains, ie, three strains of mice (C57BL / 6NCrj, C3H / HeNCrj, Crj: CD-1), two strains of rats (Crj: Wistar, F344 / DuCrj), guinea pigs (Std: Hartley), And hamster (Slc: Syrian) testes were used. Furthermore, testes of Sprague-Dawley rats (Charles River) of each age (7, 14, 21, 28, 35, 42, 49 days and 13 weeks of age) were also used.
[0098]
FIG. 3 shows the results of cell sorter analysis using 13-week-old Sprague-Dawley rats. FIG. 3B shows a DNA content-6F antibody reaction plot showing the testis cell fraction sorted using the 6F antibody, and FIGS. 3C to 3E show cells in the positive fraction boxed in FIG. 3B. The 6F antibody reacted with testis cells of the haploid and sub-n fractions, in particular with the cell population of 24% of round sperm cells and the cell population of 73% of elongating sperm cells ( 3B, and 3C and D). When this reactivity is examined from ploidy, the haploid fraction includes 1) a strong positive fraction, 2) a weak positive fraction, and 3) a negative fraction. The fractions contained 1) a weakly positive fraction and 2) a negative fraction. Thus, round and elongated sperm cells (haploid) and elongated sperm cells (sub-n) are further divided into three and two fractions, respectively, based on their reactivity with the 6F antibody. Pictures.
[0099]
In addition, from the results of cell sorter analysis using testes derived from mice, rats, guinea pigs and hamsters of each strain, the reactivity with the 6F antibody was observed only in rats. Therefore, it can be said that the 6F antibody is specific to the rat from which the cells used as the antigen were collected.
[0100]
Furthermore, from experiments using testes of SD rats of each age (7, 14, 21, 28, 35, 42 and 49 days after birth), the reactivity of the haploid fraction to the 6F antibody was found at 28 days after birth. In the test, only a weakly positive fraction was observed, and no strongly positive fraction was observed. On the other hand, on the 35th day after birth, a strongly positive fraction began to be recognized. From the results of examining the relationship with the time series of differentiation using testes at each age after birth, the haploid testis cell line was divided into a subgroup that reacted with the 6F antibody and a subgroup that did not react. In the responding subgroup, it was suggested that the reactivity of the 6F antibody transiently increased in the haploid fraction according to the time line of cell differentiation. This proved that the antigen molecule that reacts with the 6F antibody was expressed corresponding to the testis maturation stage, and was an important finding in analyzing testis cell differentiation.
[0101]
[Example 4] Examination of reactivity of 6F antibody (immunohistochemical analysis)
Immunohistochemical studies using the 6F antibody prepared in Example 2 were performed on brain, heart, lung, liver, kidney, spleen, thymus, testis, vas deferens, and epididymis of male SD rats (13 weeks old). Was used. Each tissue was used as a frozen section (5 μm) without being fixed. The antibody was labeled with peroxidase and developed using 3,3′-diaminobenzidine (DAB) as a substrate.
[0102]
As shown in FIG. 4, the testis strongly and specifically reacted with the 6F antibody as compared to the control primary antibody (purified mouse IgG1 (Pharmingen # 030010)) (FIG. 4A), and showed a brown color (FIG. 4B). , Arrow part).
[0103]
In testis tissues, some of the seminiferous tubules reacted with the 6F antibody and others did not (FIG. 4B). This is because there are stages in the spermatogenesis cycle that react with the 6F antibody and stages that do not react. Therefore, this 6F antibody is found to be useful in studying the spermatogenesis cycle.
[0104]
[Example 5] Examination of reactivity of 6F antibody (analysis by confocal laser microscope)
The reactivity of the 6F antibody prepared in Example 2 with rat testis cells was examined by an indirect fluorescent antibody method, and analyzed by a confocal laser microscope.
[0105]
As a result, fluorescence was observed only on the cell surfaces of the round sperm cells and the elongating sperm cells (FIG. 5). 5B-D show enlarged views of round sperm cells, elongated sperm cells, and elongated sperm cells. As shown in FIGS. 5B and C, it can be seen that the 6F antibody specifically reacts with the cell surface of round sperm cells and elongating sperm cells. Therefore, it is suggested that the antigen molecules on the testis cell surface differ depending on the type of testis cell fraction.
[0106]
[Example 6] Preparation of testicular disorder model rat and analysis using 6F antibody
(1) Preparation of testicular disorder model rat
Two testicular disorder chemicals, adriamycin (0.1 mg / kg) and ethinyl estradiol (0.3 mg / kg) were administered to 6- and 9-week-old male SD rats, respectively. Oral administration was performed for 4 weeks and 2 weeks.
[0107]
(2) Classification and analysis of testis cells using cell sorter
In the same manner as in Example 1, the isolated testis cells were classified and quantified into seven fractions based on the DNA amount and the cell size, and the 6F antibody positive rate was determined. The total number of testis cells recovered was determined by the ratio of the added fluorescent labeled beads (Flow-Count, Epics) at a known concentration, and testicular toxicity due to drug administration was taken as a change in the cell number of each fraction. evaluated.
[0108]
In the adriamycin administration experiment, a decrease in the number of negative and weakly positive fraction cells in round sperm cells was observed. The number of cells in the strongly positive fraction tended to decrease in the 2 mg / kg group, but was not so large. In elongated sperm cells and elongated sperm cells, both the 6F antibody negative and positive fractions tended to increase in the 2 mg / kg group.
[0109]
In addition, in the ethinylestradiol administration experiment, the number of weakly positive and strongly positive fraction cells in round sperm cells tended to decrease, and the percentage of weak positive fractions and the decrease in strong positive fractions decreased in round sperm cells. It was recognized in.
[0110]
It has been suggested that the use of the 6F antibody may be useful as a function test for identifying the mechanism of action and the site of action of testicular disorder substances. In addition, as a result of examining the usefulness and validity of the method for analyzing the spermatogenesis process, it was suggested that there is a possibility that the disorder can be more accurately and accurately detected than the conventional method.
[0111]
【The invention's effect】
The present invention provides an antibody that specifically binds (reacts with) a specific testis cell fraction. This antibody can be used for purification and detection of the testis cell fraction. It is also useful for detecting testicular dysfunction due to external factors such as various chemical substances, internal factors such as aging, and isolating testis cell fraction-specific genes through collection of RNA.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing cell sorter analysis using testis cells isolated from a rat.
A: A histogram of forward scattered light (FSC) is shown.
B: Histogram of DNA content based on PI fluorescence. Peak I represents ploidy sub-n testis cells, peak II represents haploid (n) testis cells, peak III represents diploid (2n) testis cells, and peak IV represents tetraploid. (4n) represents testis cells.
C: plot of forward scattered light-side scattered light (FSC-SSC).
D: shows a plot of FSC-DNA content. 1 to 7 represent the testis cell fraction.
FIG. 2 is a diagram showing cell sorting of each testis cell fraction by FSC-DNA content plot. 1 to 7 respectively correspond to the respective fractions in FIG. 1D. The photograph shows the cells (Giemsa staining) sorted in each fraction, and the portion surrounded by a frame is an enlarged photograph of a representative cell of each fraction.
FIG. 3 is a diagram showing cell sorter analysis of testis cells using the 6F antibody.
A: Control primary antibody
B: 6F antibody
C to E: images obtained by cell sorting the respective positive fractions surrounded by a frame in FIG. 2B.
FIG. 4 is a diagram showing immunohistochemical staining of testis tissue using a 6F antibody. A represents the control primary antibody, and B represents the 6F antibody.
FIG. 5 shows immunostaining of testis cells using the 6F antibody. The white part shows fluorescence. A shows the whole image of the cells that reacted with the 6F antibody, and BD shows enlarged photographs of round sperm cells, elongating sperm cells, and elongated sperm cells, respectively.
